KR100451266B1

KR100451266B1 - 새로운크로마토그래피분리조건을이용한α-1프로테이나제억제제의정제방법

Info

Publication number: KR100451266B1
Application number: KR1019950026050A
Authority: KR
Inventors: 와이톨드알.레빙; 샤론엑스.첸
Original assignee: 바이엘 코포레이션
Priority date: 1994-08-24
Filing date: 1995-08-23
Publication date: 2004-12-23
Also published as: AU700638B2; HK1072372A1; ES2139794T3; CA2156007A1; US5610285A; DE69513751T2; ATE187462T1; PT698615E; KR960007617A; JPH08176198A; GR3032728T3; AU3011195A; CN1125231A; CA2692337A1; EP0698615B1; JP3770414B2; EP0698615A1; DK0698615T3; CA2156007C; CN1572321A

Abstract

본 발명은 6.0 미만의 pH 및 낮은 이온강도를 갖는 용액을 사용한 양이온 크로마토그래피법을, 혈장과 혈장분획을 포함하는 생물학적 체액으로부터 사람 α-1 프로테이나제 억제제(α-1 PI)를 정제하는데 활용하는 것에 관한 것이다. 양이온 크로마토그래피법은 활성 α-1 PI이 상기의 조건하에서는 양이온 컬럼과는 결합하지 않으나, 변성된 α-1 PI 및 알부민을 포함한 다른 단백질과는 결합한다는 사실을 이용하는 것이다. 이같은 방법의 효과는 크로마토그래피 컬럼을 통과해간 활성 α-1 PI이 오염된 단백질을 남긴다는 점이다. α-1 PI의 회수는 고수율이며 순도의 개선은 뚜렷하다.

Description

새로운 크로마토그래피 분리조건을 이용한 α-1 프로테이나제 억제제의 정제 방법

본 발명은 단백질 정제방법에 관한 것이며, 특히 활성 α-1 PI는 컬럼과 결합하지 않으나 오염된 단백질은 컬럼과 결합하는 조건하에서 양이온 교환방법을 이용하여 혈장 분획으로부터 α-1 프로테이나제 억제제를 정제하는 방법에 관한 것이다.

α-1 프로테이나제 억제제(α-1 PI)는 분자량이 약 55,000 Dalton인 당단백질이다. α-1 PI는 트립신, 카이모트립신, 췌장 엘라스타제, 피부 콜라겐 분해효소, 레닌, 유로키나제 및 다형핵성 임파구의 프로테아제와 같은 프로테아제의 억제제이다. α-1 PI의 전통적인 치료 용도는 폐에서의 임파구 엘라스타제의 억제이다. 이러한 프로테아제는 외래 단백질을 분해시키는 기능을 한다. 엘라스타제 활성을 조절하기 위한 α-1 PI가 충분량 존재하지 않는 경우 엘라스타제는 폐 조직을 손상시킨다. 한동안의 이러한 불균형은 만성 폐조직 손상 및 폐기종을 초래한다. α-1 PI 보충은 이러한 형태의 폐기종 치료에 성공적으로 사용되었다.

현재, α-1 PI에 대한 수요는 공급을 초과하고 있다. α-1 PI 유전자는 미생물, 세포주 및 양(sheep)으로 전달 및 발현시킨 바 있다. 그러나, 여전히 만족할 만한 재조합물은 제조된 바 없다. 사람 혈장은 지금까지 치료적 α-1 PI에 대해 유일하게 허용되고 있는 공급원이다. α-1 PI는 대체요법을 위해 사용되며 장기간에 걸쳐 표준-기준으로 환자에게 투여된다. 미량의 불순물이 환자에게서는 면역반응을 촉발시킬 수 있으므로, 성공적인 치료를 위해서는 생성물의 고순도가 특히 중요하다. α-1 PI의 공급원인 혈장은 한정되어 있고, 따라서 α-1 PI를 고수율로 정제하는 방법이 요구된다. 현재까지, 고수율 및 고순도의 α-1 PI를 제공하는 실질적인 방법은 활용되지 못했었다.

사람 혈장으로부터 α-1 PI를 정제하기 위한 여러가지 방법이 기술된 바 있다. 볼렌(Bollen) 등의 미국 특허 제4,629,568호(1986)에서는, 효모, 이.콜라이 및 사람 혈장으로부터 α-1 PI를 정제하기 위한 다섯 가지의 상이한 크로마토그래피 단계를 사용하였다. 이러한 다섯 가지 단계는 DEAE 이온 교환, 티올-디설파이드 교환, 헤파린 친화, 아연-킬레이트 크로마토그래피 및 아미노헥실 이온 교환을 포함한다. 아무런 순도 및 수율 데이터도 나타낸 바 없다.

노비카 등[참조: Novika et al., Gematol. Transfuziol. 34: 46-50 (1989)]은 혈액 제제 제조의 부산물로부터의 분리 방법을 기술하고 있다. 이들은 친화, DEAE 셀룰로즈 및 겔 여과 크로마토그래피법을 사용하고 있다. 순도와 수율 데이터는 그리 만족스럽지 못하다.

포디아렌 등[참조: Podiarene et al., Vopr. Med. Khim. 35: 96-99 (1989)]은, 모노클로날 항체를 사용한 친화 크로마토그래피를 이용하여 사람 혈청으로부터 α-1 PI를 분리하기 위한 1단계 방법을 기술하고 있다. α-1 PI 활성이 20%의 수율로 61.1배 증가하였다.

버나우프 등[참조: Burnouf et al., Vox. Sang. 52, 291-297 (1987)]은 α-1 PI를 제조하기 위해 DEAE 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 혈장 상등액 A[콘 분획(Cohn Fraction) II + III]를 사용하여 출발하였으며 이는 순도에서 36배 증가된 80 내지 90% 순도(SDS-PAGE에 의해)를 갖는다. 상등액 A로부터의 회수율은 65 내지 70%이다.

하인 등[참조: Hein et al., Eur. Respir. J. 9:16s-20s(1990)]은 출발물질로서 콘 분획 IV-1을 사용하고 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 분별 침전시킨 후 DEAE 세파로스(DEAE Sepharose)상에서 음이온 교환 크로마토그래피시키는 방법을 기술하고 있다. 최종 생성물은 약 60% 순도 및 45% 수율을 갖는다.

두빈 등[참조: Dubin et al., Prep. Biochem. 20: 63-70(1990)]은 2단계 크로마토그래피 정제법을 기술하고 있다. 먼저, α-1 PI, CI 억제제, α-1 안티카이모트립신 및 안티 α-1 트립신 억제제를 블루 세파로스(Blue Sepharose)로부터 용출시킨 후, α-1 PI를 겔 여과로 정제한다. 순도와 수율 데이터는 유용하지 못하다.

발리옥스 등[참조: Ballieux, B. E. et al., J. Immunol Methods 159:63-70 (1993)]은 4-페닐부틸아민 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 및 최종적으로 면역 친화 단계를 사용하여 화농성 객담으로부터 α-1 PI 및 프로테이나제-3 복합체를 정제하였다. 양이온 교환 단계에서 사용된 완충액의 pH는 7.0이었다. 사용된 조건하에서, 대부분의 객담 단백질은 수지에 결합하나 α-1 PI 및 프로테이나제-3은 결합없이 통과해버린다.

조단 등[참조: Jordan et al., 미국 특허 제4,749,783호(1988)]은 제제중의 생물학적으로 불활성인 단백질을 바이러스 불활성화 단계후에 친화 크로마토그래피로 제거하는 방법을 기술하고 있다. 천연 단백질과 변성 단백질간의 분리의 기초는 천연 단백질의 친화 수지에 대한 생물학적 활성 때문이지 천연 단백질과 변성 단백질간의 물리적 차이로 인한 것은 아니다.

이들 방법 중 어느 것도 정제 단계로서 낮은 pH, 낮은 염 농도 및 보통의 단백질 농도에서 강한 양이온 수지를 사용하는 통액형 크로마토그래피(flow through chromatography)를 사용하지 않았다. 놀랍게도, 상기와 같은 조건하에서, 단지 활성 α-1 PI만이 컬럼을 통과하였다. 당해 방법은 크로마토그래피 컬럼으로부터 90% 수율 및 2회의 양이온 교환 컬럼을 적용시킨 후 95% 내외의 순도를 얻기 위해 정렬시킬 수 있다. 본 발명은 사람 혈장으로부터 α-1 PI을 대규모로 고순도 및 고수율로 정제하는 개선된 방법을 제공한다.

용어 정의

"활성 α-1 PI" 또는 "천연 α-1 PI"란 시험관내 엘라스타제 분석에서 엘라스타제 활성 억제를 나타내는 α-1 PI를 의미한다.

"불활성 α-1 PI" 또는 "변성된 α-1 PI"은 시험관내 엘라스타제 분석에서 엘라스타제 활성에 전혀 영향을 주지 못하는 α-1 PI를 의미한다.

"고도로 정제된"이란 오염된 단백질을 20% 미만 함유함을 나타낸다.

"불활성 α-1 PI를 실질적으로 함유하지 않는"은 불활성 α-1 PI를 10% 미만 함유함을 나타낸다.

"불활성 바이러스를 실질적으로 함유하지 않는"은 공인된 바이러스 불활성화 단계(예: 저온살균 또는 화학적 처리)로 처리하여 감소된 활성 바이러스 함량을 가짐을 의미한다. 일반적으로, 이것은 약 4로그(log) 단위 이상의 모델 바이러스의 역가 감소를 의미한다.

모든 전도도는 25℃에서 측정한 것이다.

본 발명은, 활성 α-1 PI는 매질(또는 이온 교환 수지)에 결합하지 않으나, 불활성(또는 변성된) α-1 PI를 포함하는 기타 단백질은 매질(또는 이온 교환수지)에 결합하도록 하기에 충분한 pH, 이온강도 및 단백질 농도의 조건하에서 양이온교환 크로마토그래피 매질상의 통액형 크로마토그래피에 의해 수성 단백질-함유 용액으로부터 α-1 PI를 정제하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 당해 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(1) 단백질 용액을 약 10mmho/cm 이하의 이온 강도에 대해 투석시키거나 투석여과시키는 단계;

(2) 용액 pH를 약 6.0 이하로 조정하는 단계;

(3) 단백질 용액의 농도를 약 10mg 단백질/ml 이하로 조정하는 단계;

(4) 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

(5) 크로마토그래피의 통과 분획을 정제된 α-1 PI로서 수거하는 단계.

본 발명은 사람 혈장으로부터 α-1 PI를 정제하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 낮은 이온강도 완충액에서 6.0 이하의 pH하에 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함을 포함한다. 통과 분획을 수거하며 이는 정제된 α-1 PI를 함유한다. 양이온 교환 크로마토그래피는 α-1 PI에 대해 특이적이며 실질적으로 콘 분획 IV-1 현탁액으로부터 직접적으로 2단계 정제방법으로서 사용될 수 있다. 양이온 교환 컬럼 뒤에 제2의 양이온 교환 컬럼이 따른다.

이 방법은 충분히 범용성이 있으므로, 양이온 크로마토그래피는 콘 분획 용출물 II + III, 콘 분획 IV-1 페이스트(현재 바람직한 출발물질) 및 정제 α-1 PI에 이르기까지 각종 임의의 출발물질에 대해 작동할 것이며, 또한 실질적으로 정제된 생성물을 제공한다.

약제학적 제제의 대규모 제조를 위한 선택조항으로서, 수율을 최적화하고 바이러스 안정성을 개선시키며 조절 순응성을 보장하기 위해 바이러스 불활성화를 포함하는 여러가지 추가의 단계를 가할 수 있다. 이러한 단계들에 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는 것으로는 다음을 들 수 있다:

(1) 약한 이온 교환 수지(DEAE)상에서의 개시 크로마토그래피;

(2) 강한 음이온 교환 수지(QAE)상에서의 개시 크로마토그래피;

(3) 건열 또는 용액중 저온살균을 이용한 바이러스 불활성화;

(4) 가능한 바이러스 오염물을 제거하기 위한 바이러스 배제 여과;

(5) 바이러스 불활성화를 위한 용매 세정 처리와 같은 화학 처리; 및

(6) 양이온 크로마토그래피 전에 출발물질을 부분적으로 정제하기 위한 침전 단계.

pH는 단백질상에서 하전된 그룹을 변화시킴으로써 이온 교환 크로마토그래피에 결정적인 역할을 나타낸다. 이는 미결합으로부터 결합에 이르기까지 또는 그 역으로, 크로마토그래피 수지에 대한 단백질의 결합 거동을 변화시킨다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 강한 양이온 수지 리간드는, 직접적으로 또는 짧은 탄소-기본쇄를 통해 연결된 수지 비이드에 결합된 설포네이트(-SO₃) 그룹이다. 이 리간드는 1 내지 14의 pH 범위를 통해 음전하를 갖는다. 소정의 pH에서, 단백질의 순유효 표면이 음전하를 갖는 경우, 단백질은 지체없이 컬럼을 통과할 것이다. 통상적으로, 단백질은 용액의 pH가 이의 pI(등전점) 이상인 경우 음으로 하전된다.

사람 혈장에서 잘 특징화된 두 가지 단백질은 α-1 PI 및 알부민으로서 이는각각 평균 4.8 및 5.3의 pI를 갖는다. 두 단백질은 pH 5.45에서 음으로 하전되어야만 하며 양이온 교환 컬럼을 통과해야 한다. 놀랍게도, 이같은 실험들은 낮은 염 농도 및 pH 5.45에서 알부민 및 변성(또는 불활성) α-1 PI가 수지에 결합하며 단지 천연(또는 활성) α-1 PI만이 컬럼을 통과함을 밝혀내었다. α-1 PI을 사용한 이러한 관찰은, 단백질의 pI 뿐만이 아니라, 이의 3차 구조도 이온 교환에서 중요함을 암시하고 있다. α-1 PI의 천연 형태는 분명히 음으로 하전된 표면을 나타내는 반면, 변성된 형태의 표면은 보다 양으로 하전된다. 따라서, 변성된 단백질은 예기치 않게도 양이온 수지에 결합한다. α-1 PI의 천연 형태는 높은 pH에서 보다 훨썬 안정적이다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 α-1 PI의 안정성 및 순도 모두를 고려할 때, pH 5.45는 실제적으로 가장 낮은 pH 값이다.

이온 교환 수지와 단백질 용액간의 평형은 용액의 이온 강도, 단백질 농도, pH 및 수지에 대한 특정 리간드에 의해 영향을 받는다. 야마모토 등[참조: Yamamoto et al. Biotechnol. Bioeng. 25:1373-1391 (1983)]은 낮은 단백질 농도에서 용액의 이온강도의 함수로서 분포 계수와 관련된 반-실험적 수학식을 발표하였다. 당해 수학식은 다음과 같다:

K = A(I)^B+ K_crt

상기 수학식에서,

K는 분포 계수를 나타내고,

A 및 B는 실험 상수를 나타내며,

I는 용액의 이온 강도를 나타내고,

K_crt는 높은 이온 강도에서의 단백질의 분포 계수를 나타내며, 정전기적 상호작용은 무시하기로 한다.

상이한 단백질에 대한 분포 계수는 소정의 이온 강도에서 다양할 수 있다. 따라서, 다양한 단백질은 동일한 조건하에서 서로 다른 속도로 이동한다. 이점이 바로 상기 크로마토그래피에서 단백질의 분리에 적용되는 점이다. 낮은 염 농도에서, 대부분의 단백질의 이동 속도는 부하단계 동안 수지에 결합함으로써 지연되게 된다. 천연 α-1 PI는 이의 독특한 표면 하전 특성으로 인해 컬럼을 통해 통과해 버린다. 통과하는 완충액의 이온 강도가 증가하면, 다른 단백질과 수지의 상호작용이 변화되고 대부분의 단백질이 컬럼을 통과해 갈 것이다. 따라서, 용액의 이온 강도가 상승하면, 컬럼을 통과하는 α-1 PI의 순도는 감소할 것이다.

염 농도 또한 양이온, 예를 들어, Na⁺를 수지상의 수소 이온으로 가역적으로 대체시킴으로써 용출물의 pH를 변화시킨다. 염 농도가 증가하면, 수지로부터 용출물로 보다 많은 양의 H⁺가 전이되어 용출물의 pH가 감소된다. 그러므로, 평형 완충액에 대해 개시 단백질 용액을 한외여과시킬 때, 부하 용액의 이온 강도는 평형 완충액의 pH와 같거나 이보다 약간 높아야 한다. 그후, pH는 부하(loading) 동안에 동일하게 유지되거나 단지 약간만 감소하게 된다. 부하시킨 후 평형 완충액을 세척액으로서 사용하는 경우, 이는 이온 강도를 감소시킴으로써 pH의 증가를 유발할 것이다. 따라서, pH를 유지하기 위해서는 약간 높은 이온 강도의 완충액이 세척에 사용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 높은 단백질 농도 역시 수지에 대한 결합 단백질의 평형에 영향을 미친다. 단백질 농도가 증가하면, 흡착 등온선은 보통 포화곡선을 나타낸다[참조: Yamamoto et al., "Ion Exchange Chromatography of Proteins", 1988, Chromatographic Science Series]. 그러므로, 결합에 대한 포화 수준이 도달됨에 따라, 결합된 불순물의 순 함량이 최대에 달하게 된다. 이 최대값이 도달된 후, 컬럼을 통과해간 불순물의 상대적인 %값은 샘플의 단백질 농도가 증가함에 따라 증가할 것이다. 따라서, 단백질 농도는, 불순물에 대한 흡착 곡선의 직선 범위내에 포함되도록 충분히 낮을 때 최적이 된다.

단백질이 용액의 pH를 완충시키는 경향이 있기 때문에, 단백질 농도는 또한 용출물의 pH에도 영향을 미친다. 단백질이 크로마토그래피 매질에 결합함으로써 용액으로부터 선택적으로 제거됨에 따라, 용액의 순 완충능(즉, pH)이 변화되게 된다. 크로마토그래피에 대한 영향은 복잡한데, pH 변화가 컬럼상에 흡착될 단백질의 상대적인 %에 의존하기 때문이다. 흡착은 컬럼의 통과 스트림, 용액의 완충능, 단백질 혼합물의 변화된 특성 및 각종 단백질의 경쟁적 결합에 의해 영향을 받는다.

본 발명의 실험들은, 고농도의 단백질을 양이온 교환 컬럼에 부하시키면, 양이온 교환 컬럼의 부하가 진행됨에 따라, 용출물의 pH가 점진적으로 증가함이 입증되었다. 상승된 pH 값은 α-1 PI의 순도를 감소시킨다. 대규모 정제를 위한 양이온 교환 컬럼의 부하를 최대화하기 위해서는, 불순물 곡선의 허용가능한 범위내에서 보다 고농도로 사용될 수 있으며, 일반적 원리상, pH가 영향을 미치더라도, 보다희석된 단백질 용액이 α-1 PI 정제 크로마토그래피용으로 더 바람직한 출발물질이다.

실시예 1

바람직한 양태

본 발명의 바람직한 양태에서, 강한 양이온 교환 컬럼에 부하시키기 전에 콘분획 IV-1 (분획 IV-1)으로부터 α-1 PI를 부분적으로 정제하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피가 사용된다. 콘 분획 IV-1 현탁액은 고유활성이 대략 10% α-1 PI이다. 다른 혈장 분획과 같이, IV-1 현탁액은 여러 가지 단백질을 함유한다: 지단백질, 면역글로불린, 글로불린, 메타프로테인 등. 지단백질의 존재는 특히 문제이다. 만일 이들이 크로마토그래피 수지에 결합하게 되면, 이들은 제거하기 어려울 뿐만 아니라 수지의 세공(pore)을 차단하여 수지 베드를 통해 압력을 증가시킨다. 또한, 수지상에 단백질 잔기가 생겨나게 됨에 따라, 결합능이 손상된다. 콘분획 IV-1 현탁액으로부터 지단백질 및 기타 불순물을 제거하기 위해 강한 양이온 크로마토그래피 대신에 제1단계로 DEAE 이온 교환 크로마토그래피를 사용한다. DEAE 부하 조건은 대부분의 지단백질이 결합하지 않고 컬럼을 통해 통과하도록 하는 것이다. DEAE 이온 교환 크로마토그래피를 위한 α-1 PI 용출 조건은 α-1 PI를 95 내지 100% 회수하는 데 기초하여 선택된다.

IV-1 현탁액을 5mmho/cm 이상의 전도도 및 8.0의 pH로 조정한다. 그 후, 단백질 용액을 DEAE 수지에 부하시킨다. α-1 PI를 20mM 이염기성 인산나트륨 및 95mM의 염화나트륨으로 pH 8.0에서 용출시킨다. DEAE 용출액을 20mM 일염기성 인산나트륨 및 5mM 염화나트륨에 대해 pH 6.5에서 투석여과시킨다. 투석여과시킨 용출물을 pH 5.45로 조정한 후 강한 양이온 수지 상에 부하시킨다. α-1 PI는 컬럼을 통과한다. 통과물을 pH 7.0으로 조정하고, 0.15M 염화나트륨을 가한다.

이때, α-1 PI은 필요에 따라 냉동시킬 수 있다. 바이러스를 불활성화시키기 위해, 필요에 따라 α-1 PI 용액을 해동시키고 60mM 히스티딘 및 5mM 염화칼슘중에서 pH 6.5로 조정하고 동결건조시킨다. 그 후, 동결건조물을 72시간 동안 80℃로 가열시켜 바이러스를 불활성화시킨다. 그 후, 동결 건조물을 정제수에 용해시키고, 안정화제로서 37%(w/v)의 슈크로즈 및 0.38M의 시트레이트를 가한다. 외막을 갖는 바이러스에 대한 용매 세정 처리제로서 0.3%의 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP) 및 0.2%의 콜산나트륨을 가한다. 30℃에서 3시간 동안 배양시킨 후, 투석 여과시켜 TNBP와 콜산염을 제거한다.

바이러스 불활성화시킨 용액을 pH 6.5에서 20mM 일염기성 인산나트륨 및 5mM 염화나트륨에 대해 투석여과시킨다. 투석여과시킨 용액을 pH 5.45로 조정하고 제2의 강한 양이온 수지 컬럼에 부하시켜 잔류하는 모든 오염물 및 바이러스 불활성화 단계에 의해 변성된 α-1 PI를 제거한다. α-1 PI의 천연 형태는 컬럼을 통과해 나간다. 수거된 통과물을 pH 7.0, 0.15M 염화나트륨으로 조정하고 추가의 바이러스 불활성화 단계로서 15μM 필터를 통과시킨다. 실질적으로 다른 단백질이 없는 고도로 정제된 α-1 PI(>95%)이 제조된다. DEAE 크로마토그래피는 지단백질을 제거하며 α-1 PI 순도를 20% 증가시킨다. 제1 양이온 컬럼은 90% 내외의 회수율을 가지는 약 60 내지 70%의 순수한 α-1 PI를 제공한다. 제2 양이온 컬럼은 최종 생성물에대해 95% 순도를 제공한다. 음이온 교환 컬럼을 1M NaCl 및 1M NaOH로 세척하여 결합된 단백질을 제거한다. 두 가지 양이온 교환 컬럼에 결합된 단백질은 1M 염화나트륨에 이어서 1M 수산화나트륨을 사용하여 제거한다.

실시예 2

본 실시예에서는, 콘 분획 II+III 용출물이 출발물질이다. 이를 pH 6.5, 5℃에서 20mM 일염기성 인산나트륨 및 5mM 염화나트륨에 대해 투석여과시켜 알콜을 제거하고 이온강도를 감소시킨다. 그 후, 용액을 pH 5.45로 조정하고 앞서 평형시킨 강한 양이온 교환 컬럼에 부하시킨다. 통과물을 현저하게 농축된 α-1 PI 분획으로서 수거한다. 출발물질내의 오염 물질은 양이온 교환 컬럼에 잔류한다.

양이온 교환 컬럼에 1회 통과시킨 후, α-1 PI는 콘 분획 용출물 II+III 중의 다른 단백질로부터 실질적으로 정제된다. 통과물의 순도는 SDS-PAGE에 의해 82% α-1 PI이다. 고유 활성은 전체 단백질 mg당 0.03mg의 엘라스타제 억제 활성으로부터 단백질 mg당 0.59mg의 엘라스타제 억제 활성으로 20배 증가하였다.

실시예 3

본 실시예에서는 출발물질로서 부분적으로 정제된 시판용 α-1 PI[마일즈, 인코포레이티드사에서 제조된 프롤라스틴(Prolastin)]을 사용한다. 프롤라스틴은 pH 7.0에서 0.1M NaCl 및 0.02M 인산나트륨에 완충시킨다. α-1 PI의 농도는 대략 30mg/ml이며 단백질 농도는 대략 60mg/ml이다. 알부민은 전형적으로 전체 단백질의 12%이며 IgA는 전형적으로 대략 1mg/ml(전체 단백질의 2.5%)으로 존재한다.프롤라스틴은 5mM NaCl 및 20mM 일염기성 인산나트륨으로 투석여과시켜 이온강도를 감소시킨다. 용액의 pH를 5.45까지 감소시키고, 단백질 농도를 5.3mg/ml까지 감소시키며 용액을 강한 양이온 교환 컬럼을 통해 전개시킨다. 통과물을 정제된 α-1 PI로서 수거하고 SDS-PAGE에서 단지 단량체 및 이량체 α-1 PI만을 나타내며 각각 95.4% 및 4.6%의 단백질을 나타낸다. 그 후, 용액을 pH 7.0에서 0.15M NaCl 중에서 안정화시키며 최종 안정된 생성물을 제공하도록 여과 또는 농축 및 동결건조시킬 수 있다.

결합된 단백질 분획을 용출시키고 SDS-PAGE에서 전기 영동시킨다. 쿠마시블루로 가시화시킨 44%의 단백질은 α-1 PI 분자량 범위내에 있다. 이 분획의 엘라스타제 억제분석은 아무런 α-1 PI 활성이 없음을 나타낸다. 이것은 이 밴드내의 단백질이 불활성화된 α-1 PI임을 나타낸다. 상기의 실시예들은 다음의 표중에 요약되어 있다.

실험 데이터의 요약

* 실험실 규모로는 PerSeptive HS 수지도 성공적으로 사용되었다.

** 쿠마시 블루 염색성 단백질을 사용하여 % 순도를 측정하며 이는 웨스턴 블롯에 의해 입증되는 바와 같이 단량체와 이량체의 배합물이다.

*** 전체 수율은 투석여과 후에 나타내었다. α-1 PI 활성은 투석여과 후에 증가하는 것으로 관찰된다.

상기 명세서에 주어진 것에서, 단백질 정제 분야의 숙련가들에게는 변화가 나타날 수 있을 것으로 보인다. 따라서, 상기한 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 본 명세서의 본 발명의 범주는 단지 다음의 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.

제1도는 본 발명에 따라 α-1 프로테이나제 억제제(PI)를 정제하기 위한, 일반적인 콘(Cohn) 분획화 과정, 분획으로부터 유도된 단백질, 및 두 가지 출발물질(콘 분획 IV-1 및 콘 용출액 II 및 III)을 나타내는 흐름도이다.

제2도는 본 발명의 α-1 PI 정제방법의 바람직한 단계를 나타내는 흐름도이다.

제3도는 선행기술과 비교하여 본원의 방법을 사용했을 때의 순도와 고유 활성도의 개선을 입증하는 막대 그래프이다.

Claims

α-1 프로테이나제 억제제는 강한 양이온 교환 수지에 결합하지 않으나 기타 단백질은 강한 양이온 교환 수지에 결합되도록, α-1 프로테이나제 억제제 및 기타 단백질을 포함하는 수용액의 pH를 5.45 내지 6.0으로 조절하고, 이온 강도를 10mmho/cm 이하로 조절하고 단백질 농도를 10mg/mL 이하로 조절하는 단계(A) 및

당해 수용액을 강한 양이온 교환 수지내로 통과시키고 α-1 프로테이나제 억제제를 함유하는 통과물을 수거하는 단계(B)를 포함하여, α-1 프로테이나제 억제제 및 기타 단백질을 포함하는 수용액 중의 α-1 프로테이나제 억제제를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 단계(A)와 단계(B)가 2회 수행되는 방법.
제2항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계가 정제단계 사이에서 당해 용액을 대상으로 하여 수행되는 방법.
제3항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계가, 활성 바이러스를 실질적으로 함유하지 않는 용액을 제공하기에 충분한 온도 및 시간 동안 α-1 프로테이나제 억제제를 가열함을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계가 트리-n-부틸 포스페이트와 콜산나트륨을 용액에 첨가함을 포함하는 방법.
실질적으로 활성 바이러스를 함유하지 않으며, 실질적으로 불활성 α-1 프로테이나제 억제제를 함유하지 않으며, 전체 단백질 1mg당 0.88 내지 0.99mg의 엘라스타제 억제 활성치를 갖는 고도로 정제된 활성 α-1 프로테이나제 억제제를 포함하는, 폐기종 치료용 약제학적 제제.
제6항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체중의 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 강한 양이온 교환 수지가 설포네이트 그룹 리간드를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 수용액이 콘 분획 IV-1로부터 유도되는 방법.
제1항의 방법에 의해 정제된 활성 α-1 프로테이나제 억제제를 포함하는, 폐기종 치료용 약제학적 제제.