PT698615E - Purificacao do inibidor de proteinases alfa-1 usando novas condicoes de separacao cromatografica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ”PURIFICAÇÃO DO INIBIDOR DE PROTEINASES ALFA-1 USANDO NOVAS CONDIÇÕES DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA"

Fundamentos do Invento 1. Campo

Esta descrição está relacionada com a purificação de proteínas e, especificamente, com um método para a purificação do inibidor de proteinases a-1 a partir de fracções do plasma com permuta catiónica, em condições tais que o IP a-1 activo não se liga à coluna ao contrário das proteínas contaminantes. 2. Técnica Anterior O inibidor de proteinases alfa -1 (IP a-1) é uma glicoproteína com um peso molecular de aproximadamente 55000 daltons. IP alfa-1 é um inibidor de proteases tal como a tripsina, quimiotripsina, elastase pancreática, colagenase da pele, renina, urocinase e proteases dos linfócitos polimorfonucleares. Uma Utilização terapêutica corrente de IP a-1 é a inibição da elastase de linfócitos nos pulmões. Esta protease funciona degradando proteínas estranhas. Quando IP a-1 não está presente, em quantidades suficientes para regular a actividade da elastase, esta degrada tecido pulmonar. Com o tempo, este desequilíbrio resulta na destruição crónica do tecido pulmonar e emfisema. A reposição de IP alfa-1 tem sido usada com êxito no tratamento desta forma de enfisema. -2-

Normalmente os pedidos de IP a-1 excedem a fonte disponível. O gene de a-1 IP foi transferido e expresso em microorganismos, linhas celulares e carneiros. No entanto, ainda não foi produzido um produto recombinante satisfatório. O plasma humano é ainda a única fonte aprovada de IP a-1 terapêutico. IP alfa-1 é usado em terapia de substituição e é dado aos doentes numa base regular durante largos períodos de tempo. Devido à presença de contaminantes que possam estimular uma resposta imune nos doentes, uma pureza elevada do produto é crítica para o êxito do tratamento. O plasma, a fonte de IP a-1, é limitada e portanto é necessário um processo de purificação com um rendimento elevado de IP a-1. Até agora não havia um processo prático que desse IP a-1 com um rendimento e grau de pureza elevados.

Foram descritos vários métodos para a purificação de IP a-1 a partir de plasma humano. Bollen et ai, Patente USA 4,629,567 (1986) usou cinco passos cromatográficos diferentes para purificar o IP a-1 a partir de levedura, E. coli e plasma humano. Os cinco passos envolveram cromatografia de permuta iónica em DEAE, cromatografia de permuta tiol-dissulfido, cromatografia de afinidade com heparina, cromatografia com quelato de zinco e cromatografia de permuta iónica com amino-hexilo. Não foram apresentados resultados acerca do grau de pureza e rendimento.

Novika et al., Gematol. Transfuziol. 34:46-50 (1989) descreveram métodos de isolamento a partir de subprodutos da produção de derivados do sangue. Usaram cromatografias de afinidade, DEAE-celulose e filtração em gel. Os dados sobre pureza e rendimento não estão disponíveis.

Podiarene et al., Vopr. Med. Khim. 35:96-99 (1989) descreveram um processo num só passo para o isolamento de IP a-1 a partir de plasma humano, usando cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais. A -3- actividade de IP alfa-1 foi aumentada 61,1 vezes com um rendimento de 20%.

Bumouf et al, Vox Sang. 52, 291-297 (1987), começando com um sobrenadante de plasma A (equivalente à Fracção II + III de Cohn), usaram cromatografia em DEAE e cromatografia de exclusão por tamanho para produzir um IP a-1 que era 80-90% puro (por SDS-PAGE) com um aumento de 36 vezes da pureza. A recuperação foi de 65-70% a partir do sobrenadante A.

Hein et al., Eur. Respir. J. 9:16s-20s (1990) apresentaram um processo que emprega a Fracção IV-1 de Cohn como material de partida e utilizaram precipitação diferencial com polietilenoglicol, seguido de cromatografia de permuta aniónica em DEAE Sepharose®. O produto final tinha uma pureza de aproximadamente 60% com um rendimento de 45%.

Dubin et al., Prep. Biochem. 20:63-70 (1990) descreveram uma purificação cromatográfica em dois passos. Primeiro IP a-1, inibidor Cl, antiquimiotripsina a-1 e inibidor da tripsina a-1 foram eluidos de Blue Sepharose® e depois IP α-1 foi purificado por filtração em gel. Os resultados do grau de pureza e rendimento não estão disponíveis.

Ballieux et al. purificaram um IP α-l e o complexo proteinase-3 a partir de espectoração purulenta usando cromatografia de afinidade com 4-fenilbutilamina, permuta catiónica e um passo final de imunoafinidade (Ballieux, B.E. et al., J. Immunol. Methods 159:63-70 (1993)). O pH do tampão usado no passo de permuta catiónica foi de 7,0. Nestas condições, a maior parte das proteínas da espectoração ficaram ligadas à resina mas o IP α-l e a proteinase-3 passaram através da coluna sem se ligarem.

Jordan et al., Patente U.S. N° 4,749,783 (1988) descreveram um -4- método em que proteínas biologicamente inactivas presentes numa preparação foram removidas por cromatografia de afinidade, após um passo de inactivação virai. A base da separação entre as formas nativa e desnaturada da proteína foi a actividade biológica da proteína nativa relativamente à resina de afinidade e não diferenças físicas entre as proteínas nativa e desnaturada. A Patente US 3 293 236 descreve um processo para o isolamento de a^antitripsina através de resinas de permuta catiónica fortes.

Nenhum destes processos usou cromatografia de fluxo com resinas catiónicas fortes a pH baixo, concentração salina baixa e concentração proteica moderada como um passo de purificação. Inesperadamente, nestas condições apenas o a-1 IP activo passa através da coluna. O processo pode ser arranjado de forma a conseguir-se um rendimento de 90% a partir coluna de cromatografia após duas aplicações da coluna de permuta catiónica. O presente invento proporciona um processo melhorado para a purificação de a-1 IP a partir de plasma humano em larga escala com pureza e rendimento elevados.

Definição de Termos "a-1 IP activo" ou "a-1 IP nativo" significa a-1 IP que apresenta inibição da actividade de elastase num ensaio de elastase in vitro. "IP a-1 inactivo" ou "a-1 IP desnaturado" significa IP a-1 que não tem efeito na actividade de elastase num ensaio de elastase in vitro. "Altamente purificado" significa contendo menos de 20% de proteína contaminante. -5- "Substancialmente livre de IP a-1 inactivo" significa contendo menos 10% de IP a-1 inactivo. "Substancialmente livre de vírus inactivo" significa tendo um teor de vírus activo reduzido devido a ter sido sujeito a um passo de inactivação virai reconhecido (e.g., pasteurização ou um tratamento químico). Em geral, isto significa uma redução de um vírus modelo de pelo menos cerca de 4 logs.

Todas as medições de condutividade são determinadas a 25°C.

Sumário do Invento O invento é um processo para a purificação de a-1 IP, a partir de soluções aquosas contendo proteína, por cromatografia de fluxo em meios de cromatografia de permuta catiónica em condições de pH, força iónica e concentração de proteína suficientes para assegurar que o IP a-1 activo não se liga aos meios (ou resina de permuta iónica) enquanto outras proteínas, incluindo IP a-1 inactivo (ou desnaturado) não se liga aos meios (ou resina de permuta iónica). Nas realizações preferidas, o método inclui os seguintes passos: (1) a solução de proteína é dialisada ou diafiltrada contra uma força iónica de aproximadamente <10 mmho/cm; (2) o pH da solução é ajustado a cerca de < 6,0; (3) a solução proteica é ajustada a cerca de < 10 mg de proteína/ml; (4) a solução é passada através de uma resina de permuta catiónica; e -6- (5) a fracção de efluente da cromatografia é colhida como IP a-1 purificada.

Ainda, o invento está relacionado com uma preparação do inibidor de proteinases alfa-1 altamente purificado compreendendo o inibidor de proteinases alfa-1 activo substancialmente livre de vírus activos, substancialmente livre de inibidor de proteinases alfa-1 inactivo e tendo uma actividade de pelo menos cerca de 0,9 mg de actividade de inibição de elastase por mg de proteína total, em que a pureza do inibidor de proteinases alfa-1 é preferencialmente superior a 90%. O invento também está relacionado com uma composição compreendendo a preparação de inibidor de proteinases alfa-1 altamente purificado e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um fluxograma demonstrando o processo geral de fraccionamento de Cohn, as proteínas derivadas das fracções e dois materiais de partida (Fracção IV-1 de Cohn e Efluente II & III de Cohn) para a purificação de IP a-1 de acordo com este invento. A Figura 2 é um fluxograma mostrando os passos preferidos do nosso processo de purificação de IP a-1. A Figura 3 é um gráfico de barras demonstrando os melhoramentos na pureza e actividade específica com o método descrito neste pedido comparado com trabalhos anteriores. -7-

Descrição Detalhada do Invento ' O presente invento é um processo melhorado para a purificação de IP a-1 a partir de plasma humana. O processo envolve a cromatografia de permuta catiónica a pH <6,0 num tampão de força iónica baixa. A fracção do efluente foi colhida e contem IP a-1 purificado. A cromatografia de permuta catiónica é específica para IP a-1 e pode de facto ser usada como um processo de purificação de dois passos directamente a partir da suspensão da Fracção IV-I de Cohn: uma coluna de permuta catiónica seguido de uma segunda coluna de permuta catiónica. O processo é suficientemente versátil para que a cromatografia catiónica funcione com qualquer um de uma série de materiais de partida diferentes, variando entre Fracção Efluente II+III de Cohem, pasta da Fracção IV-1 de Cohn (presentemente um material de partida preferido) e IP a-1 purificado, dando ainda um produto substancialmente purificado.

Facultativamente para a produção em larga escala do produto farmacêutico, pode-se adicionar uma variedade de outros passos, incluindo inactivação virai, para optimizar o rendimento, aumentar a segurança virai e assegurar as normas regulamentares. Estes passos podem incluir mas não estão limitados a: (1) Cromatografia inicial numa resina de permuta iónica fraca (DEAE); (2) Cromatografia inicial numa resina de permuta aniónica forte (QAE); -8- (3) Inactivação virai utilizando calor seco ou pasteurização em solução; (4) Filtração para exclusão virai para remover possíveis contaminantes virais; (5) Tratamento químico, como seja tratamento com detergente solvente para inactivação virai; e (6) Passos de precilPtação para purificar parcialmente o material de partida antes da cromatografia catiónica. O pH desempenha um papel chave na cromatografia de permuta iónica ao alterar os grupos carregados das proteínas. Ele altera o comportamento de ligação das proteínas à resina de cromatografia, de não ligado para ligado e vice-versa. O ligando forte da resina catiónica preferencialmente usado neste invento é um grupo sulfonato (-S03) ligado às esferas de resina directamente ou através de uma cadeia curta baseada em carbonos. O ligando é portador de uma carga negativa numa gama de pH de 1-14. Se a carga efectiva global na superfície de uma proteína for negativa a um dado pH, a proteína passará através da coluna sem ser retardada. Como regra geral, a proteína tem um carga negativa se o pH da solução for acima do seu pi.

Duas proteínas bem caracterizadas do plasma humano são IP a-1 e albumina que têm pis médios de 4,8 e 5,3 respectivamente. Ambas as proteínas deverão ter cargas negativas a pH 5,45 e deverão passar sem retenção através da coluna de permuta catiónica. Inesperadamente, estas experiências mostraram que a baixa concentração salina e pH 5,45, a albumina e IP a-1 desnaturado (ou inactivo) se ligam à resina e apenas IP a-1 nativo (ou activo) passa através da -9- coluna sem retenção. Esta observação com IP a-1 sugere que não só o IP da proteína mas também a sua estrutura terciária são importantes na permuta iónica. A forma nativa de IP a-1 aparentemente apresenta uma superfície carregada negativamente enquanto a superfície da forma desnaturada poderá estar carregada mais positivamente. Assim, a proteína desnaturada fica ligada à resina catiónica. A forma nativa de IP a-1 é muito mais estável a pHs mais altos. Um pH de 5,45 é o pH mais baixo praticável quando se considera a estabilidade e a purificação de IP a-1 por cromatografia de permuta catiónica. O equilíbrio entre as resinas de permuta iónica e as soluções de proteína é influenciado pela força iónica da solução, concentração proteica, pH e ligando específico na resina. Yamamoto et al., Biotechnol. Bioeng. 25:1373-1391 (1983) apresentou equações semi-empíricas que relacionavam o coeficiente de distribuição com a função da força iónica da solução numa concentração proteica baixa. A equação é: K = A(I)B + Kcn em que K representa o coeficiente de distribuição, A e B representam constantes empíricas, I representa força iónica da solução e Kcn representa coeficiente de distribuição da proteína a força iónica elevada em que a interacção electrostática pode ser ignorada. Os coeficientes de distribuição para as diferentes proteínas variam para uma determinada força iónica. Assim, várias proteínas migram a diferente velocidade nas mesmas condições. Isto aplica-se à separação de proteínas nesta cromatografia. Na concentração salina baixa, as velocidades de migração da maior parte das proteínas são retardadas através da ligação à resina durante o passo de aplicação. IP a-1 nativa passa através da coluna devido às suas características únicas de carga de superfície. Se a força iónica do tampão efluente for aumentada, a interacção de outras proteínas com a resina é - 10- modificada e uma percentagem maior das proteínas não será retida na coluna. Assim, aumentar a força iónica da solução reduzirá a pureza do IP a-1 que flui através da coluna. A concentração salina também altera o pH do eluato permutando o ião positivo, e.g. Na+, com iões hidrogénio na resina. O aumento da concentração salina provoca mais transferência de H+ da resina para o eluato, o que resulta no decréscimo do pH do eluente. Assim, quando a solução proteica inicial é ultrafiltrada contra tampão de equilíbrio, a força iónica da solução de aplicação deverá ser igual ou ligeiramente acima da do tampão de equilíbrio. O pH deverá então permanecer igual ou ligeiramente acima do do tampão de equilíbrio. Se o tampão de equilíbrio for aplicado como tampão de lavagem após aplicação, poderá causar um aumento do pH devido à diminuição da força iónica. Assim, um tampão de força iónica ligeiramente superior poderá ser usado na lavagem para manter o pH.

Conforme referido anteriormente, a concentração proteica elevada também afecta o equilíbrio da proteína ligada à resina. Quando a concentração proteica aumenta, a adsorção isotérmica geralmente apresenta uma curva de saturação (Yamamoto et al.," Ion Exchange Chromatography of Proteins", 1988, Chromatographic Science Series). Assim, à medida que o nível de saturação da ligação se aproxima, a quantidade global de impurezas ligadas atinge um máximo. Após atingido o máximo, a percentagem relativa de impurezas que passa através da coluna aumentará à medida que a concentração proteica da amostra aumenta. Assim, a concentração proteica é óptima quando suficientemente baixa para cair na gama linear da curva de adsorção das impurezas.

Devido às proteínas tenderem a tamponar o pH da solução, a - 11 - concentração proteica também afecta o pH do eluato. Como as proteínas são selectivamente removidas da solução através da ligação aos meios de cromatografia, a tamponação global (i.e. pH) da solução é alterada. O efeito na cromatografia é complexo porque a alteração do pH dependerá das percentagens relativas das proteínas a serem adsorvidas à coluna. A adsorção é afectada pelo fluxo de efluente da coluna, capacidade de tamponação da solução, natureza alterada da mistura de proteínas e ligação competitiva das várias proteínas.

As nossas experiências mostraram que o carregamento da coluna de permuta catiónica com concentrações de proteína mais elevadas resulta num aumento progressivo do pH no eluato à medida que prossegue o carregamento da coluna de permuta catiónica. O pH elevado resulta num decréscimo da pureza de IP a-1. Para aumentar o carregamento da coluna de permuta catiónica para uma purificação em larga escala, podem ser usadas concentração mais altas dentro da gama aceitável da curva de impurezas e efeito de pH, como princípio geral, soluções mais diluídas das proteínas são melhores materiais de partida para a cromatografia de purificação de a-1 IP

Exemplo 1

Realização preferida

Na nossa realização actualmente preferida, a cromatografia de permuta iónica é usada para purificar parcialmente o IP a-1 a partir de uma suspensão da Fracção IV-1 (Fr. IV-1) de Cohn antes da aplicação na coluna de permuta catiónica forte. A suspensão da Fracção IV-1 é aproximadamente 10% de IP a-1 pela actividade específica. A suspensão IV-1, tal como outras fracções do plasma, contem várias proteínas: lipoproteína, imunoglobulinas, globulina, metaproteína, etc. As lipoproteínas representam um problema especial. Se se - 12- ligarem à resina de cromatografia, elas são difíceis de remover e podem bloquear os poros da resina provocando um aumento da pressão através da resina. Também, à medida que os resíduos proteicos se fixam à resina, perde-se capacidade de ligação. Para remover a lipoproteína e outras impurezas da suspensão da Fracção IV-1, emprega-se cromatografia de permuta iónica com DEAE como um primeiro passo em vez da cromatografia catiónica forte. As condições de aplicação em DEAE são tais que uma fracção importante das lipoproteínas passa através da coluna sem se ligar. As condições de eluição de IP alfa-1 para a cromatografia de permuta iónica em DEAE são escolhidas com base na obtenção de uma recuperação de 95-100% de IP a-1. A suspensão IV-1 é ajustada à condutividade > 5 mmho/cm e pH 8,0. A solução de proteína é então aplicada na resina de DEAE. O IP a-1 é eluido com fosfato de sódio dibásico 20 mM e cloreto de sódio monobásico 20 mM e cloreto de sódio 5 mM a pH 6,5. O eluente diafiltrado é ajustado a pH 5,45 e depois aplicado numa resina catiónica forte. IP alfa-1 passa através da coluna. O efluente é ajustado a pH 7,0 e adicionado cloreto de sódio para 0,15 M.

Nesta altura, o IP a-1 pode ser congelado caso se pretenda. Para inactivação virai, a solução de IP a-1 é descongelada caso necessário, ajustada a pH 6,5 em histidina 60 mM e cloreto de sódio 5 mM e depois liofilizado. O liofilizado é então aquecido a 80°C durante 72 horas para inactivar os vírus. O liofilizado é então dissolvido em água pura, e adicionados 37% (p/v) de sucrose e citrato 0,38M como estabilizadores. Adiciona-se 0,3% de tri-n-butil fosfato (TNBF) e 0,2% de colato de sódio como detergente solvente dirigido para vírus com invólucro. Após 3 horas de incubação a 30°C, o TNBP e o colato são removidos por diafiltração. A solução com os vírus inactivados é diafiltrada contra fosfato de - 13- sódio monobásico 20 mM e cloreto de sódio 5 mM a pH 6,5. A solução diafiltrada é ajustada a pH 5,45 e aplicada numa coluna de resina catiónica forte para remover quaisquer contaminantes residuais e IP a-1 desnaturado pelos passo de inactivação virai. A forma nativa de a-1 IP passa através da coluna não sendo retida. O efluente colhido é ajustado a pH 7,0, cloreto de sódio 0,15 M e é passado através de um filtro de 15 μΜ como um passo adicional de inactivação virai. Obtem-se um IP a-1 altamente purificado (>95%) substancialmente livre de proteínas. A cromatografia em DEAE remove as lipoproteínas e aumenta a pureza de IP a-1 para 20%. A primeira coluna catiónica dá IP a-1 cerca de 60-70% puro com uma recuperação de cerca de 90%. A segunda coluna catiónica atinge 95% de pureza para o produto final. A coluna de permuta iónica é lavada com NaCl 1M e NaOH 1M para remover as proteínas ligadas. As proteínas ligadas às duas colunas de permuta catiónica são removidas com cloreto de sódio 1M, seguido de hidróxido de sódio 1M.

Exemplo 2

Neste exemplo o efluente da Fracção II + III de Cohn foi o material de partida. Ele foi diafiltrado contra fosfato de sódio monobásico 20 mM e cloreto de sódio 5 mM, pH 6,5 a 5°C para remover o álcool e reduzir a força iónica. A solução foi então ajustada a pH 5,45 e aplicada numa coluna de permuta catiónica forte previamente equilibrada. O efluente foi colhido como uma fracção de a-1 IP significativamente enriquecida. As proteínas contaminantes no material de partida foram retidas na coluna de permuta catiónica.

Após um único passo na coluna de permuta catiónica, IP a-1 ficou substancialmente purificado relativamente a outras proteínas no efluente da Fracção II +III de Cohn. A pureza do efluente foi de 82% para IP a-1 conforme - 14- determinado por SDS-PAGE. A actividade específica foi aumentada 20 vezes de 0,03 mg de actividade inibidora de elastase por mg de proteína total para 0,59 mg de actividade inibidora de elastase por mg de proteína.

Exemplo 3

Este exemplo usou IP a-1 comercial parcialmente purificado (Prolastin®, Miles, Inc.) como material de partida. Prolastin® é tamponado em NaCl 0,1M e fosfato de sódio 0,02M a pH 7,0. A concentração de IP a-1 é de aproximadamente 30 mg/ml e a concentração proteica de aproximadamente 60 mg/ml. A albumina é tipicamente 12% da proteína total e IgA está tipicamente presente a aproximadamente 1 mg/ml (2,5% da proteína total). A Prolastin® foi diafiltrada com NaCl 5 mM e fosfato de sódio monobásico 20 mM para reduzir a força iónica. O pH da solução foi baixado para 5,45, a concentração proteica reduzida para 5,3 mg/ml e a solução foi passada numa coluna de permuta catiónica forte. O efluente foi colhido como IP a-1 purificado e apresentou apenas monómeros e dímeros de a-1 IP em SDS-PAGE, 95,4% e 4,6% da proteína respectivamente. A solução foi então estabilizada a pH 7,0 em NaCl 0,15M e pode ser filtrada ou concentrada e liofilizada para dar um produto final estável. A fracção proteica ligada foi eluida e sujeita a electroforese em SDS-PAGE. 44% da proteína visualizada com azul Coomassie estava na gama de peso molecular de IP a-1. O ensaio de inibição de elastase desta fracção não revelou actividade de IP a-1. isto indica que a proteína nesta banda é IP a-1 inactivado. Os Exemplos descritos estão resumidos na Tabela abaixo.

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Sumário dos resultados experimentais

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Feita a descrição, pensa-se que possam ocorrer variações para os familiarizados com o campo da purificação de proteínas. Assim, pretende-se que os Exemplos atrás referidos devam ser pensados apenas como ilustrativos e que o âmbito do invento deva ser limitado apenas às reivindicações que se seguem.

Lisboa, 17 de Fevereiro de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA yiCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (1)

1. - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um método de purificação do inibidor de proteinases alfa-1 numa solução aquosa contendo o inibidor de proteinase-alfa-1 e outras proteínas, compreendendo os passos de (A) ajustamento do pH a cerca de < 6, da força iónica a cerca de <10 mmho/cm e da concentração proteica da solução aquosa, de forma a que o inibidor de proteinases alfa-1 não se ligue a uma resina de permuta iónica forte mas permita a ligação das outras proteínas na solução; e (B) passagem da solução através de uma resina de permuta iónica e colheita do efluente, contendo o inibidor de proteinases alfa-1, em que os passos (A) e (B) são realizados mais de uma vez e em que um passo de inactivação virai é realizado na solução antes do passo final (A), o passo de inactivação virai caracterizando-se pelo aquecimento do inibidor de proteinases alfa-1 a uma temperatura igual ou superior a cerca de 60°C durante 10 ou mais horas. Lisboa, 17 de Fevereiro de 2000

   JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA