PT991666E - Preparação de alfa-1-antitripsina e processo para o fabrico da mesma - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PREPARAÇÃO DE ALFA-l-ANTITRIPSINA E PROCESSO PARA O FABRICO DA MESMA" A invenção é relativa a preparações de alfa-l-antitripsina, a processos para o fabrico das mesmas e a utilizações destas preparações. A alfa-l-antitripsina (al-AT) é uma proteína que surge no plasma, que, devido às suas propriedades estruturais e funcionais, se encontra classificada na super família das serpinas (inibidores da serina protease = serine jarotease inhibitors). Devido à sua acção inibidora da serina protease, a al-AT também é conhecida pelo nome de inibidor da al-proteinase. A al-AT é responsável por aproximadamente 90% da capacidade de inibição tríptica do plasma normal, pelo que também é com frequência designada por serpina do plasma principal (major plasma serpin) . Com um significado fisiológico particular, tem-se a actividade inibitória da al-AT em relação à elastase. A al-AT é primariamente uma proteína protectora, pelo que as células deverão ser protegidas de enzimas proteolíticas libertadas. É sintetizada no fígado e segregada para o plasma, tendo um tempo de semivida de aproximadamente 6 dias. A concentração plasmática normal da al-AT é de 1,3 g/L. A al-AT é uma molécula relativamente pequena e polar, que chega rapidamente aos fluidos celulares, podendo aí actuar. A al-AT humana consiste numa única cadeia polipeptídica com 394 radicais aminoácidos com três posições de glicosilação 2 nos radicais de asparagina das posições 46, 83 e 247. Enquanto que na asparagina existem 46 e 247 cadeias laterais de hidratos de carbono sialisadas e tanto biantenais como triantenais, na asparagina 83 encontra-se apenas uma cadeia lateral biantenal sialisada (Carrell et al., "Nature" 298 (1982), 329 - 334). A cadeia proteica da al-AT aparece em duas formas no plasma, em que numa forma se remove um pentapéptido N-terminal.

Devido a estas cadeias laterais de hidratos de carbono, mas também devido à possível remoção de pentapéptidos, surge uma micro-heterogeneidade bem vincada, a qual também poderá variar num mesmo indivíduo. Verifica-se então que acontecem alterações consideráveis nas proporções destas isoformas das moléculas de al-AT durante inflamações ou administrações de estrogénio, o que se deverá provavelmente ao facto de, devido à situação de stress, as formas em parte desialisadas serem com maior preferência decompostas, de modo a voltar-se rapidamente aos níveis normais do plasma (Patterson, "Comp. Biochem. Physiol." 100 B (3) (1991), 439 - 454) . A acção inibidora da serina protease da al-AT deve-se à formação de complexos de 1 : 1 estáveis entre a al-AT e a protease alvo. A al-AT funciona por conseguinte como uma espécie de "substrato suicida", com o qual se suprime a continuação da reacção de protease da serina protease. A acção da al-AT é sobretudo inibida por radicais libertados, que também surgem em virtude de inflamações. A nível fisiológico, esta estabilidade à oxidação serve provavelmente para suprimir a actividade de inibição 3 enzimática da al-AT na directa envolvência da inflamação, de modo a que as proteases, como a elastase ou a catepsina G, possam exercer toda a sua actividade no combate, por exemplo, a bactérias que causam inflamação.

Contudo, a estabilidade de oxidação da al-AT é sobretudo desfavorável onde a al-AT ou o liquido que contém a al-AT é exposta/o, como, por exemplo, nos líquidos do tracto respiratório. Assim, o tecido elástico dos pulmões é protegido de ataques à sua superfície no essencial por dois inibidores: pelo inibidor da protease dos leucócitos secretório humano, que se encontra principalmente no tracto respiratório superior, e pela al-AT, que surge preponderantemente no tracto respiratório inferior. Embora normalmente exista mais do que capacidade inibidora suficiente para a defesa do tracto respiratório inferior, poderão surgir problemas no caso de exposição excessiva a radicais livres, como, por exemplo, no caso de forte tabagismo (a capacidade inibidora da al-AT é de aproximadamente metade nos indivíduos que fumam muito).

Entretanto, conhece-se mais de 70 variantes qualitativas e quantitativas da al-AT humana, que são herdadas na forma de alelos co-dominantes autossómicos, pelo que se parte do princípio que aproximadamente 10% (!) da população europeia sejam portadores de uma variante patológica da al-AT. Também as deficiências de al-AT são conhecidas e estão relativamente bem difundidas. Os estados patológicos mais significativos relacionados com a variação genética da al-AT tratam-se de uma doença pulmonar degenerativa que começa relativamente cedo, assim como de uma doença hepática grave. A par disto, estão contudo também relacionadas com uma variação genética da al-AT: doenças renais, artrite e 4 doenças malignas. Sobretudo na doença pulmonar, é garantido que esta se deve directamente ao respectivo nível no plasma da al-AT, que provoca uma perda da elasticidade pulmonar devido aos danos proteolíticos acumulados. Assim, um forte fumador com uma deficiência de al-AT homozigótica é duplamente ameaçado e corre um grande risco de desenvolver um enfisema grave logo numa idade inferior a 40 anos. Em relação ao homozigoto não fumador, ele tem um tempo de vida reduzido em 20 anos.

No plasma a al-AT surge tanto na forma activa como na forma inactiva (ver, por exemplo, Pajdak W. et al., "Folia Histochemica et Cytobiologica", vol. 24 (1986), páginas 169 - 172) .

Conhece-se uma série de processos de fabrico da al-AT, que abrange a precipitação fraccionada de plasma com polietilenoglicol 4000, mas também a preparação de diversas fracções de plasma (precipitado de fracção de Cohn IV-1 ou resíduo de Kistler e Nitschmann A ou A + 1) (Feldman e Winkelman, "Blood Separation and Plasma Fractionation" (1991), Wiley-Liss, Inc., pág. 341 - 383).

Em conformidade com o WO 95/35306 A, purifica-se al-AT por meio de precipitação pelo PEG, tratamento com permutador aniónico e meio de quelato metálico.

No caso de maiores purificações, purificou-se as fracções de sangue em causa com, por exemplo, DEAE-celulose ("Vopr. Med. Khim." 33 (1) (1987), 54 - 59); Chan et al. ("FEBS Lett." 35(1) (1973), 79 - 82)), com materiais de cromatografia de afinidade ou com materiais de cromatografia de permuta catiónica (EP 0 698 615 Al) . 5

Basis et al. descrevem um processo para a purificação de al-AT por meio de precipitação com sulfato de amónio de plasma, e posterior cromatografia em DEAE-celulose e cromatografia em hidroxilapatita. Este processo foi continuamente levado a cabo na presença de mercaptoetanol, que deverá proteger a proteína da oxidação de grupos contendo S. A al-AT é, depois da cromatografia em hidroxilapatita, obtida em duas fracções, mas, contudo, as duas proteínas, al-AT e albumina, não são separadas totalmente em contínuo.

Em virtude dos trabalhos preparatórios da presente invenção, verificou-se então que, com todos os processos de fabrico convencionais, mas também sobretudo nos processos de acordo com Basis et al. e de acordo com o EP 0 698 615 Al, não se consegue separar totalmente a al-AT inactiva que aparece como constituinte no plasma com a al-AT activa, ou fabricar uma preparação mantendo isómeros activos.

Por conseguinte, a presente invenção tem por objectivo arranjar um processo, como qual seja possível obter uma preparação de al-AT, na qual se melhore a relação de al-AT activa para al-AT inactiva a favor da al-AT activa, ou seja, com o qual a al-AT inactiva possa ser separada de forma selectiva da al-AT activa.

Outro objectivo da presente invenção consiste em disponibilizar uma preparação de al-AT melhorada em relação aos preparados convencionais. 0 objecto da presente invenção consiste assim numa preparação à base de al-AT nativa purificada por 6 cromatografia, que contenha pelo menos o isómero com um valor de pi entre 4,3 e 4,4, apresente uma pureza de pelo menos 1,0 PE/mg de proteína e uma actividade relativa de al-AT plasmática de pelo menos 120%. A actividade relativa de al-AT plasmática é definida pela relação de al-AT activa para al-AT inactiva, em que esta relação no plasma é considerada com 100% de actividade relativa da al-AT plasmática. Para as preparações colocadas à disposição em conformidade com a invenção, esta actividade relativa da al-AT plasmática encontra-se de preferência acima de 130%, com mais preferência acima de 140%, em particular acima de 150%. Em casos particulares, a actividade relativa da al-AT plasmática também se encontra acima de 160%. Nos produtos segundo a invenção devido à sua pureza, a proteína contida deverá ser aproximadamente equiparada à proteína al-AT, pelo que deverá ser calculada de forma simples a actividade relativa da al-AT plasmática. A al-AT encontra-se no sangue ou no soro também sempre num certo teor na forma inactiva, ou seja, não tem praticamente actividade inibidora de elastase, mas continua contudo a ser imunorreactiva. A quantidade total de al-AT (activa e inactiva) pode ser determinada com todos os métodos correntes, como, por exemplo, métodos imunológicos quantificadores de antigénio, como ELISA.

As causas da existência de al-AT inactiva podem ser diversas; por exemplo, a al-AT pode ser inactiva devido a uma dissociação da molécula ou devido a problemas na conformação.

Visto que a al-AT inactiva pode normalmente estar no sangue 7 ou no soro até 20% e não pode ser separada por métodos tradicionais, a preparação em conformidade com a invenção representa um avanço essencial em relação aos preparados de al-AT convencionais, nos quais até à data o teor inactivo era sempre "arrastado em conjunto". Como mencionado, a concentração de al-AT no plasma normal é de 1,3 g/L, do que resulta uma actividade especifica de 0,77 PE (unidades de plasma, determinadas no teste de inibição de elastase, ver o exemplo 3)/mg. O preparado de al-AT segundo a invenção contém preferencialmente pelo menos o isómero com um valor de pi entre 4,3 e 4,4.

Verificou-se de forma surpreendente que, logo devido à presença deste isómero, a actividade da al-AT é muito grande. Visto que o isómero foi separado da fracção de al-AT a ser obtida, com um valor de pi entre 4,3 e 4,4 devido à sua natureza ácida, até à data não se encontram teores mencionáveis deste isómero num preparado de al-AT nos processos descritos no estado da técnica para obter a al-AT sempre em conjunto com albumina. Em virtude da presente invenção, reconheceu-se contudo a relevância deste isómero em termos do rendimento de actividade e, assim, prevê-se preferencialmente, em conformidade com a invenção no processo de fabrico, apenas etapas que não permitam uma separação deste isómero da restante al-AT ou apenas a separação do mesmo em parte desprezível, para que também o grosso deste isómero ácido esteja presente no preparado final. A distribuição isomérica da preparação preferida corresponde portanto à da proteína nativa, em particular à da proteína que pode ser obtida de um pool de plasma. Em particular, a distribuição isomérica da preparação de al-AT de acordo com a invenção corresponde, no caso de visualização por meio de focagem isoelécrica (IEF IsoElectric Focusing) , a um modelo de bandas quádruplo. A IEF é sobretudo realizada com o gel obtido da Pharmacia Ampholine PAG plate IEF™ (pH de 4,0 - 6,5 ou de 4,0 - 5,0) em conformidade com as instruções dadas pela Pharmacia, mediante a utilização de marcadores de IEF da empresa Sigma (IEF Mix 3,6 - 6,6). O isómero com um valor de pl entre 4,3 e 4,4 corresponde ao da banda mais ácida. No entanto, este isómero já não existe na totalidade nas preparações puras ou altamente puras ou está presente apenas em baixa proporção abaixo do limite de detecção. A preparação de al-AT de acordo com a invenção apresenta em particular uma grande pureza, por exemplo uma pureza superior a 1 PE/mg. Verificou-se até mesmo que se pode atingir, segundo a invenção, niveis de pureza superiores a 1,1 PE/mg, em particular superiores a 1,2 PE/mg.

Neste caso, a preparação segundo a invenção contém usualmente menos de 10%, de preferência menos de 5%, em particular menos de 2%, de al-AT inactiva.

Em conformidade com a presente invenção, também é possível disponibilizar um preparado de al-AT que esteja essencialmente isento de al-AT inactiva. A relação de al-AT activa para al-AT inactiva está 9 aumentada na preparação segundo a invenção, sendo em particular superior a qualquer uma do plasma normal humano. Portanto, em conformidade com a presente invenção, é possivel obter uma al-AT hiperactiva ou que pode ser denominada nascente.

Em conformidade com a presente invenção, o plasma normal trata-se de uma plasma padronizado em termos de teor de al-AT activa. A padronização, portanto a determinação de al-AT activa, pode ser feita com métodos correntes para esse fim. Por exemplo, por meio de inibição da actividade da elastase ou da tripsina.

Neste caso, a preparação em conformidade com a invenção tem, em relação às preparações de acordo com o estado da técnica, a vantagem fundamental de o preparado sobretudo previsto para administração farmacêutica, estar, devido ao baixo teor de al-AT inactiva, muito mais definido em termos da sua eficácia do que os preparados conhecidos, o que se traduz sobretudo numa enorme vantagem no caso da utilização médica.

Em termos preferenciais, é colocada à disposição uma al-AT conservante, na qual se pode evitar a utilização de estabilizadores de oxidação, como o β-mercaptoetanol. Por conseguinte, "conservante" significa no âmbito da presente invenção, que a al-AT também é suficientemente estável sem a presença de estabilizadores de oxidação, como ο β-mercaptoetanol, o que foi em particular surpreendente face à grande instabilidade à oxidação conhecida da al-AT. A preparação em conformidade com a invenção pode ser produzida a partir de sangue, de plasma, de soro ou de 10 fracções destes, mas também a partir de culturas de células, em particular de culturas de células recombinantes, ou de resíduos de culturas de células.

Em termos preferenciais, o teor de monómeros da preparação de acordo com a invenção é de pelo menos 95%, de preferência de pelo menos 98%.

Uma forma de execução preferida do preparado segundo a invenção consiste em não só melhorar a preparação em termos do teor de al-AT activa, mas também a que ela se encontre com um grande nível de pureza, por exemplo de pelo menos 90% (mg/mg de proteína). A presente invenção também tem por objecto uma preparação farmacêutica, que contém a preparação de al-AT segundo a invenção, eventualmente com substâncias auxiliares aceitáveis a nível farmacêutico, tais como tampões, estabilizadores, adjuvantes, antioxidantes, sais ou excipientes.

Visto que a presente preparação deve ser principalmente empregue na área farmacêutica, uma forma de execução preferida consiste em a preparação estar tratada com vista à desactivação de agentes patogénicos eventualmente existentes. Favoravelmente, a preparação é disponibilizada numa forma de armazenamento estável, de preferência na forma de liofilizado ou na forma de solução (ultracongelada), em particular na forma de uma solução adequada à administração intravenosa, na forma de aerossol ou na forma de pulverização. A preparação também se pode encontrar associada a lipossomas ou a fosfolípidos ou a outras formas de micropartícuias ou de nanopartícuias, o 11 que constitui uma vantagem em certas formas de aplicação. A presente invenção tem igualmente por objecto um processo para o fabrico do preparado de al-AT em conformidade com a invenção, por meio da purificação de uma fracção contendo al-AT, que pode ser preferencialmente obtida de um pool plasmático humano, por meio de cromatografia de adsorção, de modo a adsorver-se al-AT, a separar-se eventualmente al-AT inactiva e a obter-se al-AT activa, contendo o isómero com um valor de pi entre 4,3 e 4,4, por meio de eluição numa fracção.

Em conformidade com a presente invenção, cromatografia de adsorção trata-se de uma cromatografia em que a al-AT é adsorvida (ligada) ao material cromatográfico. Por fim, é possível obter por eluição a fracção pretendida.

Na cromatografia de adsorção, é possível, por exemplo, empregar um material cromatográfico inorgânico, como, por exemplo, hidroxilapatita, de preferência hidroxilapatita cerâmica. No entanto, a cromatografia de adsorção também pode ser realizada num permutador aniónico, de preferência na presença de um detergente.

Como permutador aniónico, emprega-se de preferência materiais à base de hidratos de carbono ou de polímeros de vinilo, que deram provas no trabalho de laboratório e na aplicação industrial, em particular produtos à venda no mercado, tais como, por exemplo, DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose®, CL6B, DEAE-Sepharose® Fast Flow, QAS-Sephadex®, Q-Sepharose® Fast Flow, Q-Sepharose Big Beats®, Q-Sepharose® High Performance (Pharmacia); DEAE- trisacril, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D® (Sepracor); DEAE- 12

Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Toyopearl Super-Q® (Tosohaas); Fractogel®-EMDT, Fractogel®-TMAE ou outros materiais Fractogel, Licrospher 1000 TMAE®, Licrospher 1000 DEAE® e Licrospher 4000 DMAE® (Merck); Macroprep DEAE®, Macroprep Q® (BioRad); Protein PAK DEAE® (Waters), sendo especialmente preferido o tratamento com um permutador aniónico forte, por exemplo, Q-Sepharose. As condições precisas sob as quais se obtém a al-AT activa, podem variar em função do material de permuta. No entanto, estas podem ser facilmente determinadas ou optimizadas e sem grandes custos pelo especialista para o respectivo material, tendo por base a presente invenção.

Em termos preferenciais, o material de partida não é incubado ou apenas por muito pouco tempo (por exemplo de alguns minutos) na cromatografia de adsorção ou antes desta. A cromatografia de adsorção ou a obtenção da al-AT ocorre sobretudo sob as condições que mantenham o isómero com um valor de pi entre 4,30 e 4,40, em particular entre 4,34 e 4,39/ e com especial preferência que também mantenham o espectro de isómeros activos durante ou depois da purificação ou do tratamento. Estas condições podem ser facilmente optimizadas pelo especialista ao experimentar diversos tampões de eluição para os materiais de adsorção por sua vez utilizados, visto que o isómero com um valor de pi compreendido entre 4,3 e 4,4 ou a fracção em que está contido este isómero é facilmente detectável por IEF. Neste caso, é sobretudo necessário ter em atenção que este isómero ácido não seja separado com albumina. No entanto, isto é logo possivel ao especialista, por exemplo, com electroforese em gel ou verificação de IEF das fracções eluídas (e com a detecção de al-AT ácida e albumina). 13

Noutra forma de execução preferida, não se realiza nenhuma cromatografia num permutador catiónico, em particular nenhuma cromatografia de permuta catiónica com um baixo valor de pH.

Um detergente (agente tensioactivo) trata-se usualmente de uma substância orgânica de actividade superficial, em particular produtos de síntese orgânicos. Em conformidade com a invenção, emprega-se de preferência detergentes não iónicos, tais como poliéteres, em particular éteres alquílicos, fenólicos, poliglicólicos, os produtos da etoxilação de ácidos gordos, amidas de ácidos gordos, aminas gordas, álcoois gordos, aminóxidos, ésteres de ácidos gordos de poliálcoois e ésteres de açúcares. 0 detergente (agente tensioactivo) não tem sobretudo um efeito desnaturante sobre as proteínas. Especialmente preferido para o fim da presente invenção, é um agente tensioactivo do grupo dos polissorbatos (por exemplo, Tween) e um agente tensioactivo do grupo Triton®.

No processo segundo a invenção, de acordo com uma forma de execução preferida, a cromatografia de adsorção pode ter outro tratamento a montante ou a jusante, como, por exemplo, uma precipitação, uma filtração, uma filtração em gel, um tratamento com um material de suporte inorgânico ou uma purificação cromatográfica. Como material de suporte inorgânico preferido deu neste caso provas a hidroxilapatita, sendo dada especial preferência à hidroxilapatita cerâmica. Noutra forma de execução preferida, a cromatografia de adsorção é combinada num permutador aniónico, de preferência na presença de um detergente, com uma adsorção em hidroxilapatita. 14

Em virtude dos trabalhos da presente invenção, evidenciou-se de forma surpreendente que também é possível, em certas circunstâncias, realizar através do tratamento com materiais inorgânicos, como hidroxilapatita, uma separação da al-AT activa da al-AT inactiva. Este efeito surge sobretudo se a al-AT já estiver no essencial separada da albumina.

Assim sendo, também o tratamento de uma preparação de al-AT pré-purificada com o material de suporte inorgânico, em particular com hidroxilapatita, é por si só adequado a produzir uma preparação em conformidade com a invenção. Em termos preferenciais, removeu-se já de antemão em grande percentagem a albumina do material de partida. A separação da al-AT activa foi feita preferencialmente através de eluição fraccionada. 0 tratamento com hidroxilapatita representa de preferência a etapa de purificação terminal.

Verificou-se de forma surpreendente que, embora a al-AT seja de forma conhecida de extrema instabilidade à oxidação, o processo segundo a invenção também pode ser levado a cabo sem a aplicação de β-mercaptoetanol ou de outros inibidores de oxidação, que deverão em especial ser evitados no fabrico de preparados farmacêuticos.

Por conseguinte, o processo segundo a invenção é de preferência levado a cabo na ausência de β-mercaptoetanol ou de outros estabilizadores de oxidação, ou seja, não se emprega tampões que contenham um estabilizador deste tipo. 0 material de partida provem de preferência de um pool plasmático, em particular de um que resulta de sangue doado de indivíduos al-AT-normais. No processo segundo a 15 invenção, emprega-se de preferência plasma ou uma fracção de plasma, em particular uma fracção de partida empobrecida em albumina, de preferência um precipitado de Cohn V, correspondendo no fundamental a uma fracção de Cohn IV A (segundo Cohn, "Review" 28 (1941), 395 - 417). Noutra forma de execução preferida, parte-se de uma fracção pré-purificada, por exemplo, é possível partir-se dum preparado disponível no mercado, como a prolastina.

No processo segundo a invenção, também se realiza de preferência uma etapa para desactivar ou empobrecer agentes patogénicos eventualmente existentes. Este tratamento de desactivação/de empobrecimento é de preferência garantido por um tratamento com agentes tensioactivos e/ou por um tratamento térmico, por exemplo um tratamento térmico no estado sólido, em particular um tratamento com vapor de acordo com o EP 0 159 311 ou com o EP 0 519 901 ou com o EP 0 674 531, mas também com solventes orgânicos e/ou detergentes, como, por exemplo, de acordo com o EP 0 131 740 e o EP 0 050 061.

Outros tratamentos para a desactivação de vírus ou de agentes patogénicos também abrangem o tratamento com métodos químicos ou físico-químicos, como, por exemplo, com substâncias caotrópicas de acordo com o WO 94/13329 ou o DE 44 34 538, ou uma fotodesactivação.

Uma radiação ou uma nanofiltração representam processos físicos preferidos para o empobrecimento de vírus no âmbito da presente invenção. O processo segundo a invenção é de preferência concebido de modo a também ser possível a obtenção de outras proteínas, 16 em particular a obtenção de transferrina, albumina, orosomucóide e apolipoproteína, que podem ser depois obtidas noutra fracção dos tratamentos cromatográficos segundo a invenção. As condições precisas podem ser facilmente determinadas ou optimizadas para cada material cromatográfico por um especialista conhecedor da presente invenção. 0 valor de pH na realização do processo segundo a invenção, em particular na eluição, encontra-se de preferência entre 5,5 e 8,0, em particular entre 6,5 e 6,8. Também se mostrou que, na realização do processo segundo a invenção, é favorável a utilização de um tampão com uma força iónica correspondendo a 10 mM de fosfato.

Em conformidade com outro aspecto, a presente invenção é relativa à utilização de um material de suporte para a separação da ofl-AT inactiva da al-AT activa. Como material de suporte sólido para a adsorção e para a separação, emprega-se preferencialmente um material de suporte inorgânico, como a hidroxilapatita, ou um permutador aniónico na presença de um detergente, em particular Q-Sepharose na presença de Tween, noutra forma de execução preferida. A presente invenção é explicada em maior detalhe com base nos exemplos que se seguem, sem que a mesma deva ficar por eles limitada. 17 EXEMPLOS:

Exemplo 1

Purificação de al-AT do precipitado de Cohn V (actualmente, do ponto de vista da autora do pedido, a melhor via para executar a invenção) 0 precipitado de Cohn V é suspenso com o triplo do peso de tampão A (1,2 g/1 de Na2HP04 x 2 H20 = 6, 74 mM, 10 g/1 de NaCl = 171 mM, pH de 7,0 ajustado com 96% de ácido acético), durante 4 a 6 horas nos 4 °C mediante agitação. Em seguida, precipita-se al-AT desta suspensão turva com concentração final de 17,5% de etanol nos 6 °C durante a noite. 0 precipitado separado por centrifugação é agitado com 24 vezes o peso de 10 mM de Tris-HCl, pH de 10,4 (com 6 M de NaoH), durante ^ hora, à temperatura ambiente, e em seguida durante 1,5 horas nos 40 °C. Depois, ajusta-se o pH para um valor de 6,5 e clarifica-se por meio de um filtro CUNO 50SA. Adiciona-se ao filtrado 15% v/v de Tween 80 e agita-se durante 2 horas nos 26 °C. A solução obtida é aplicada sobre uma coluna cromatográfica enchida com Q-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) e é equilibrada com 25 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,5, em conformidade com 10 mg de proteína por ml de gel (cerca de 2 volumes de coluna), e é lavada com 2,5 volumes de coluna de 25 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,5 (elui aí Tween® 80 em grande parte) e ainda com 3 volumes de coluna de 60 mM de cloreto de sódio em 25 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,5 (elui transferrina). 18

Por meio de eluição com 3 volumes de coluna de 100 mM de cloreto de sódio em 25 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,5, obtém-se a fracção contendo al-AT com cerca de 0,40 a 0,60 unidades de plasma (PE) de al-AT por mg de proteína, tendo a actividade sido determinada por inibição de elastase de acordo com o exemplo 3 (1 PE de al-AT corresponde a cerca de 1,3 mg de al-AT pura).

Com 3 volumes de coluna de 125 mM de cloreto de sódio em 25 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,5, é ainda possível eluir principalmente albumina de soro e mais proteínas plasmáticas e, com 1 a 2 M de cloreto de sódio em 25 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,5, al-AT inactiva (praticamente nenhuma inibição de elastase, mas al-AT imunorreactiva) e as restantes impurezas. A fracção contendo al-AT é concentrada cerca de 30 vezes com uma membrana de ultrafiltração (limite de exclusão 30 000 Dalton) e é diafiltrada com 0,15 g/1 de citrato de Na3 x 2 H20 = 0,5 mM. O diafiltrado obtido é em seguida liofilizado. O pó liofilizado é humedecido para um teor de água residual de 7,5 +/- 0,5% e é sujeito ao tratamento S-TIM 4 de acordo com o EP 0 159 311 (10 horas nos 60 °C e 1 hora nos 80 °C). O pó tratado é dissolvido em 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,8, até cerca de 10 mg/ml de proteína e é aplicado sobre uma coluna cromatográfica enchida com hidroxilapatita cerâmica (Macropep tipo I, granulometria de 80 ym, Bio-Rad) e equilibrada com 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,8, correspondendo a 10 mg de proteína por ml de leito de coluna (cerca de 1 volume de 19 coluna).

Por meio de eluição com 5 volumes de coluna de 40 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,8, obtém-se a fracção contendo al-AT com cerca de 0,90 a 1,05 unidades de plasma (PE) de al-AT por mg de proteína.

Com 3 volumes de coluna de 100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,8, é ainda possível eluir principalmente al-AT inactiva, albumina de soro e outras proteínas plasmáticas e, com 500 mM de tampão de fosfato de sódio, pH de 6,8, as restantes impurezas.

Verificou-se que, com este processo de purificação, é possível obter al-AT com uma maior actividade específica de 1,0 PE/mg (corresponde a 130% de actividade relativa de al-AT plasmática). O resultado está na tabela 1 que se segue:

Tabela 1

Actividade Purificação Rendimento total/ especifica PE/mg % de plasma Plasma 0,014 1,0 100 Após 1,0 70,0 14 hidroxilapatita O produto de al-AT que se encontra no mercado farmacêutico prolastina (Cutter) tem, segundo as informações do fabricante, uma pureza de 45 - 80% e origina, no teste de inibição de elastase, uma actividade específica de 0,60 PE/mg (corresponde a 78% de actividade relativa de al-AT plasmática).

Exemplo 2 20

Purificação de gl-AT (Serva) por meio de hidroxilapatita cerâmica A al-AT da Serva, que apresentava, com pelo menos 95% de pureza (de acordo com os dados do fabricante, determinada com SDS-gel), a maior actividade especifica medida até à data de 0,81 PE/mg, também foi mais tratada com hidroxilapatita cerâmica. As fracções reunidas deram origem a uma actividade especifica de 0,92 PE/mg (corresponde a cerca de 120% de actividade relativa de al-AT plasmática). No SDS-Excelgel redutor vê-se, com a coloração prata das proteínas, uma separação univoca de al-AT inactiva e de outras proteínas que constituem impurezas.

Exemplo 3:

Instruções para a medição da inibição de elastase O teste foi elaborado de acordo com as instruções de J. Bieth, B. Spiess e C. G. Wermuth (1974), "The synthesis and analytical use of a highly sensitive and convenient substrate of elastase", "Biochem. Med." 11(4), 350 - 357, ou J. Travis e D. Johnson (1981), "Human alphal-Proteinase Inhibitor, Methods of Enzymology" 80, 754 - 765.

Tris: 0,2 M de Tris-HCl, pH de 8,0

Tris+: Tris misturado com 0,1% de albumina de soro humana (HSA) pouco antes da utilização.

Elastase: 6% de elastase (de pâncreas de suíno,

Boehringer Mannheim) são diluídos de 1 : 1 000, filtrados de forma estéril e congelados nos -20 °C.

Substrato: 22,5 mg de succinil- (alanina)3-para-nitroanilida (Bachem Feinchemikalien AG, Suíça) são diluídos em 5 ml de dimetilformamida e conservados no 4 °C. 21

As amostras são diluídas com Tris+ até à concentração correspondente. 25 pL de elastase são diluídos com 275 pL de Tris+ (no banho de água temperado para os 25 °C) e são incubados com 100 pL de amostra durante 3 minutos nos 25 °C. Em seguida, o substrato é diluído de 1 : 10 com Tris+; 200 pL daqui são misturados na preparação e mede-se logo o aumento de extinção nos 405 nm e nos 25 °C durante 5 minutos. Como valor em branco da inibição, mistura-se 100 pL de Tris+ na preparação em vez de uma amostra. O valor em branco dá origem na preparação anterior a entre 0,05 e 0,06 dA/min. Como curva padrão, tem-se uma série de diluições de 1 : 100 a 1 : 400 de plasma de referência (Immuno AG, 1A3E). A prolastina (Cutter) é diluída a partir de uma pré-diluição de 1 : 50 (em alíquotas congeladas nos -20 °C) , de 1 : 80 com Tris+ (diluição de 1 : 4 000), e é medida em conjunto com a diluição de 1 : 150 do plasma de referência em cada série de medição. No caso de um desvio demasiado grande em relação à recta padrão, esta série de medições deverá ser descartada ou os resultados deverão ser apenas considerados valores de referência aproximados. A inibição é calculada de acordo com: -S — (1 — (dA/min ) amostra/ (dA/min ) valor em branco) *100. A inibição das amostras deverá encontrar-se entre 20 e 50% de inibição e é depois convertida em unidades de plasma por meio de equipamentos padrão.

Exemplo 4:

Caracterização de diferentes produtos de al-AT por meio de inibição de elastase 22

Caracterização de diversos produtos de otl-AT por meio de inibição de elastase e de IEF

Tabela 2

Produto Proteína/ mg/mL Actividade/ PE/mL Act. Espec./ PE/mg Pureza Purificação Actividade relativa de cxl-AT plasmática Plasma após 70,00 1,00 0,014 1,7% 1,0 100,0% hidroxilapatita 1,21 1,22 1,009 117,8% 70,6 131,1% Serva (# 13694) 0,44 0,36 0,814 95,0% 57,0 105,8% Sigma (# A- 0,49 0,15 0,299 34,9% 20,9 n. c. 9024) Prolastina (Cutter) 41,99 23,95 0,570 66,6% 39,9 n. c.

Bandas principais de al-AT no gel de IEF

Produto pi = 4,55-4,58 PI = 4,47-4,51 pi = 4,41-4,45 pi = 4,35-4,39 Plasma + + + +/- Após hidroxilapatita + + + + Serva (# 13694) + + + - Sigma (# A-9024) + + + - Prolastina (Cutter) + + + - + /- dificilmente visivel + existente - não existente n. c. não calculado

Lisboa, 14

Claims (30)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Preparação de al-AT nativa purificada por cromatografia, caracterizada pelo facto de conter pelo menos o isómero com um valor de pi entre 4,3 e 4,4, uma pureza de pelo menos 1,0 PE/mg de proteína e uma actividade relativa de al-AT plasmática de pelo menos 120%.

2. Preparação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se encontrar na forma de uma preparação farmacêutica.

3. Preparação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de ser purificada de um pool plasmático.

4. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de apresentar uma pureza superior a 1,1 PE/mg, de preferência mais de 1,2 PE/mg.

5. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de o teor de al-AT inactiva ser inferior a 10%.

6. Preparação de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de o teor de al-AT inactiva ser inferior a 5%, de preferência inferior a 2%.

7. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de estar isenta de al-AT inactiva. 2

8. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo facto de a al-AT ser conservante.

9. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de a distribuição isomérica da al-AT corresponder à da proteína nativa, em particular a um modelo de bandas quádruplo visível por meio de focagem isoeléctrica.

10. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo facto de ser tratada tendo em vista a desactivação de agentes patogénicos eventualmente existentes.

11. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto de encontrar-se numa forma estável no armazenamento, de preferência como liofilizado ou como solução, em particular na forma de solução adequada à administração intravenosa, na forma de aerossol ou na forma de pulverizador.

12. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo facto de encontrar-se associada a lipossomas, a fosfolípidos ou a outras formas de micropartículas ou de nanopartículas.

13. Processo destinado ao fabrico de uma preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, por meio da purificação de uma fracção contendo al-AT, que pode ser obtida por meio de cromatografia de adsorção, de modo a adsorver-se al-AT e a obter-se al-AT activa, contendo o isómero com um valor de pi compreendido entre 4,3 e 4,4, numa fracção por meio de eluição. 3

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de empregar-se, como material de partida, plasma ou uma fracção de plasma, em particular uma fracção empobrecida em albumina, de preferência precipitado de Cohn V.

15. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo facto de partir-se de uma fracção pré-purifiçada.

16. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo facto de empregar-se na cromatografia de adsorção, um material cromatográfico inorgânico, de preferência hidroxilapatita, com total preferência hidroxilapatita cerâmica.

17. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo facto de empregar-se, na cromatografia de adsorção, um permutador aniónico, de preferência na presença de um detergente.

18. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo facto de o permutador aniónico ser Q-Sepharose.

19. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo facto de a cromatografia de adsorção ser realizada mediante a utilização de uma tampão isento de mercaptoetanol.

20. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo facto de o tampão utilizado na eluiçâo apresentar um valor de pH entre 5,5 e 8,0, de preferência de 6,5 - 6,8. 4

21. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 16 e 20, caracterizado pelo facto de o tampão utilizado na eluição conter um sal com uma força iónica que corresponde a 60 mM, de preferência a 40 mM, de fosfato.

22. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 15 e 17 a 20, caracterizado pelo facto de o tampão utilizado na eluição conter um sal com uma força iónica que corresponde a 50 a 130 mM de cloreto de sódio.

23. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo facto de realizar-se outra etapa escolhida do grupo: precipitação, filtração, filtração em gel, tratamento com um material de suporte inorgânico e purificação cromatográfica.

24. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo facto de a cromatografia de adsorção num permutador aniónico, de preferência na presença de um detergente, ser combinada com uma adsorção em hidroxilapatita.

25. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo facto de ser realizada uma única cromatografia de adsorção.

26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de estar prevista outra etapa de purificação, que não contém cromatografia de adsorção.

27. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 26, caracterizado pelo facto de obter-se uma proteína escolhida do grupo: transferrina, albumina, 5 orosomucóide e apolipoproteína noutra fracção.

28. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 27, caracterizado pelo facto de realizar-se uma etapa para a desactivação de agentes patogénicos eventualmente existentes.

29. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 28, caracterizado pelo facto de realizar-se, como desactivação, um tratamento com detergente, solvente e/ou calor.

30. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 a 29, caracterizado pelo facto de realizar-se a eluição de modo a que a fracção contendo al-AT também contenha o isómero com um valor de pi entre 4,3 e 4,4. Lisboa 14 de Dezembro de 2007