ES2622522T3

ES2622522T3 - Inhibidores de la actividad proteasa de serina y su uso en métodos y composiciones para el tratamiento de infecciones bacterianas

Info

Publication number: ES2622522T3
Application number: ES12003146.3T
Authority: ES
Inventors: Leland Shapiro
Original assignee: University of Colorado
Current assignee: University of Colorado
Priority date: 2003-08-26
Filing date: 2004-08-26
Publication date: 2017-07-06
Anticipated expiration: 2024-08-26
Also published as: US8633305B2; US9695229B2; US20110021416A1; JP2007504144A; EP2520654B1; EP1660094A4; PL2520654T3; WO2005019434A3; EP2520654B8; EP3192872A1; US20120071545A1; WO2005019434A2; US20100137192A1; US20140370036A1; US9499606B2; US7850970B2; US20050106151A1; US20140234310A1; US20200079836A1; US20170240615A1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un vehículo, un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión, en donde la composición farmacéutica es para uso en un método para tratar un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infección bacteriana o que tiene una infección micobacteriana, en donde la proteína de fusión comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mamífero o un fragmento peptídico de la misma, en donde el fragmento peptídico consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una región constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento peptídico de AAT inhibe una actividad proteasa de serina.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DESCRIPCION

Inhibidores de la actividad proteasa de serina y su uso en metodos y composiciones para el tratamiento de infecciones bacterianas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una protema de fusion, para uso en un metodo para tratar a un sujeto; una composicion farmaceutica que comprende un acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso en un metodo para tratar a un sujeto; y un acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso como medicamento.

Antecedentes de la invencion

Proteasas de serina

Las proteasas de serina tienen un papel importante en la fisiologfa humana mediando en la activacion de funciones vitales. Ademas de su funcion fisiologica normal, las proteasas de serina estan implicadas en una serie de afecciones patologicas en los seres humanos. Las proteasas de serina se caracterizan por una tnada catalftica que consiste en acido aspartico, histidina y serina en el sitio activo.

Los inhibidores de proteasas de serina de origen natural son generalmente, pero no siempre, polipeptidos y protemas que se han clasificado en familias, basandose principalmente en el patron de enlaces disulfuro y la homologfa de secuencia del sitio reactivo. Los inhibidores de proteasas de serina que incluyen el grupo conocido como serpinas, se han encontrado en microbios, en tejidos y fluidos de plantas, animales, insectos y otros organismos. Las actividades inhibidoras de proteasas se descubrieron primero en plasma humano por Fermi y Pemossi en 1894. Hasta la fecha, se han identificado al menos nueve protemas distintas, bien caracterizadas, que comparten la capacidad de inhibir la actividad de diversas proteasas. Varios de los inhibidores se han agrupado juntos, a saber el inhibidor de proteasa a-i-antitripsina, antitrombina III, antiquimotripsina, inhibidor de C1 y a2- antiplasmina, que estan dirigidos contra diversas proteasas de serina, es decir, elastasa de leucocitos, trombina, catepsina G, quimotripsina, activadores del plasminogeno y plasmina. Estos inhibidores son miembros de la clase de inhibidores de proteasas a1-antitripsina. La protema a2-macroglobulina inhibe miembros de las cuatro clases catalfticas: serina, cistema, aspartico y metaloproteasas. Sin embargo, otros tipos de inhibidores de proteasas son espedficos de la clase. Por ejemplo, el inhibidor de proteasa a1-antitripsina (tambien conocido como al-antitripsina

0 AAT) y el inhibidor de la inter-alfa-tripsina, inhiben solo proteasas de serina, el inhibidor de proteasa a1-cistema inhibe proteasas de cistema, y la a1-anticolagenasa inhibe enzimas colagenolfticas de la clase metaloenzimas.

La elastasa de neutrofilos humana (NE) es una enzima proteolftica secretada por leucocitos polimorfonucleares como respuesta a una variedad de estfmulos inflamatorios. La capacidad degradativa de NE, en circunstancias normales, esta modulada por concentraciones en plasma relativamente altas de a1-antitripsina. Sin embargo, los neutrofilos estimulados producen una rafaga de metabolitos de oxfgeno activo, y algunos de los cuales (acido hipocloroso, por ejemplo) son capaces de oxidar un residuo de metionina decisivo en la al -antitripsina. Se ha observado que la a1-antitripsina oxidada tiene una potencia limitada como inhibidor de NB y se ha propuesto que la alteracion de este equilibrio proteasa/antiproteasa permite que NE lleve a cabo sus funciones de degradacion en entornos localizados y controlados.

La a-antitripsina es una glucoprotema de PM 51.000 con 417 aminoacidos y 3 cadenas laterales de oligosacaridos. La a1-antitripsina humana se denomino anti-tripsina debido a su capacidad descubierta inicialmente de inactivar la tripsina pancreatica. La a1-antitripsina humana es una unica cadena polipeptfdica sin enlaces disulfuro internos y solo un unico residuo de cistema esta ligado con cistema o glutation, normalmente de forma intermolecular, a traves de un puente disulfuro. El sitio reactivo de la a1-antitripsina contiene un residuo de metionina, que es labil frente a la oxidacion despues de la exposicion al humo de tabaco o a otros contaminantes oxidantes. Tal oxidacion reduce la actividad biologica de la a1-antitripsina; por lo tanto, la sustitucion por otro aminoacido en esa posicion, es decir, alanina, valina, glicina, fenilalanina, arginina o lisina, produce una forma de a1-antitripsina que es mas estable. La a1-antitripsina se puede representar por la siguiente formula:

1 0 101 01 01 0

MPSSVSWGIL LAGLCCLVPV SLAEDPQGDA AQKTDTSHHD QDHPTFNKIT

PNLAEFAFSL YRQLAHQSNS TNIFFSPVSI ATAFAMLSLG TKADTHDEIL 100

EGLNFNLTEI PEAQIHEGFQ BLLRTLNQPD SQLQLTTGNG LFLSEGLKLV

DKFLEDVKKL YHSEAFTVNF GDHEEAKKQI NDYVEKGTQG KIVDLVKELD 200

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RDTVFALVNY IFFKGKWERP NIQHCKKLSS WVLLMKYLGN NEDRRSASLH LPKLSITGTY KLSKAVHKAV LTIDEKGTEA NTKSPLFMGK WNPTQK (SEQ ID NO:61)

Ciliberto, et al., en Cell 1985, 41, 531-540. La secuencia de aminoacidos decisiva cerca del extremo carboxiterminal de la a1-antitripsina se muestra en negrita y subrayada y es relevante para esta invencion (los detalles de la secuencia se pueden encontrar por ejemplo en el documento de Patente de EE.UU. n° 5.470.970).

La concentration plasmatica normal de ATT oscila entre 1,3 a 3,5 mg/ml, a pesar de que puede comportarse como un reactivo de fase aguda y aumenta 3-4 veces durante la respuesta de un hospedador frente a una inflamacion y/o una lesion de los tejidos, como durante el embarazo, infection aguda y tumores. Difunde facilmente a los espacios tisulares y forma un complejo 1:1 con una proteasa diana, principalmente la elastasa de neutrofilos. Otras enzimas tales como tripsina, quimotripsina, catepsina G, plasmina, trombina, calicreina tisular y factor Xa, tambien pueden servir como sustratos. El complejo enzima/inhibidor se retira a continuation de la circulation mediante la union a un receptor del complejo serpina-enzima (SEC) y se cataboliza en el higado y el bazo. Los seres humanos con niveles circulantes de a1-antitripsina inferiores al 15% de lo normal, son susceptibles de desarrollar una enfermedad pulmonar, por ejemplo, enfisema familiar, a una edad temprana. El enfisema familiar se asocia con bajas proporciones de a1-antitripsina frente a proteasas de serina, particularmente elastasa. Por lo tanto, parece que este inhibidor representa una parte importante del mecanismo de defensa contra un ataque de las proteasas de serina.

La a1-antitripsina es uno de los pocos inhibidores de proteasas de serina de mamiferos de origen natural que esta aprobada actualmente para el tratamiento clinico de un desequilibrio de proteasas. La a1-antitripsina terapeutica ha estado disponible comercialmente desde mediados de los anos 80 y se prepara por varios metodos de purification (vease, por ejemplo, Bollen et al., documento de EE.UU. n° 4.629.567; Thompson et al., documentos de Patente de EE.UU. n° 4.760.130; 5.616.693; WO 98/56821). La prolastina es una marca comercial de una variante purificada de a1-antitripsina y actualmente esta comercializada por Bayer Company (documento de Patente de EE.UU. n° 5.610.285 Lebing et al., 11 de marzo 1997). Tambien se conocen variantes recombinantes no modificadas y mutantes de a1-antitripsina producidas por metodos de ingenieria genetica (documento de Patente de EE.UU. n° 4.711.848); tambien se conocen metodos de uso, por ejemplo, terapia genica/entrega de a1-antitripsina (documento de Patente de EE.UU. n° 5.399.346 de French Anderson et al.).

Los dos mecanismos de action celulares conocidos de las proteasas de serina son mediante efectos degradantes directos y mediante una activation de los receptores activados con proteinasa, acoplados a proteina G (PARs). El PAR se activa mediante la union de la proteasa, seguida de hidrolisis de enlaces peptidicos especificos, con el resultado de que las nuevas secuencias N-terminales estimulan al receptor. Las consecuencias de la activacion de PAR dependen del tipo de PAR que se estimula y de la celula o el tejido afectado y pueden incluir la activacion de la fosfolipasa C beta, la activacion de la proteina cinasa C y la inhibition de la adenilato cinasa (Dery, O. y Bunnett, N. W. Biochem Soc Trans 1999, 27, 246-254; Altieri, D. C. J. Leukoc Biol 1995, 58, 120-127; Dery, O. et al Am J. Physiol 1998, 274, C1429-C1452).

TB y MAC

Mycobacterium es un genero de bacterias que son aerobias, en su mayoria de crecimiento lento, bastones ligeramente curvos o rectos, a veces ramificados y filamentosos, y se distinguen por una tincion acido-alcohol resistente. Normalmente, las micobacterias son aerobias obligadas gram positivas. El genero Mycobacterium incluye los organismos altamente patogenos que causan la tuberculosis (M. tuberculosis y algunas veces M. bovis) y la lepra (M. leprae). Sin embargo, existen muchas otras especies de micobacterias tales como M. avium-intracellulare, M. chelonei (tambien conocida como borstelense y abscessus), M. africanum, M. marinium (tambien conocida como balnei y platypoecilus), M. buruli (tambien conocida como ulcerans), M. fortuitum (tambien conocida como giae, minetti y range), M. haemophilum, M. intracellulare, M. kansasii (tambien conocida como luciflavum), M. littorale (tambien conocida como xenopi), M. malmoense, M. marianum (tambien conocida como scrofulaceum y paraffinicum), M. simiae, M. szulgai y M. ulcerans.

Las micobacterias que son patogenas para los animales, pero que no se cree que sean patogenas para los seres humanos, son las siguientes: M. avium-intracellulare (tambien conocida como brunense), M. flavascens, M. lepraemurium, M. microti y M. paratuberculosis (que es el agente causante de la enfermedad de Johne y tal vez de la enfermedad de Crohn). Las siguientes especies del genero Mycobacterium se cree que no son patogenas: M. gordonae (tambien conocida como aquae), M. gastri, M. phlei (tambien conocida como moelleri y bacilo de timothy), M. nonchromogenicum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale y M. vaccae.

FEVKDTEDED FHVDQVTTVK VPMMKRLGMF ATA1FFLPDE GKLQHLENEL THDIITKFLE 300 DLKSVLGQLG ITKVFSNGAD LSGVTEEAPL AGAMFLEAIP MSIPPEVKFN KPFVFLMIEQ 400

417

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ademas, ciertas micobacterias distintas de M. tuberculosis y M. bovis se conocen alternativamente como micobacterias no tuberculosas. Se dividen en cuatro grupos, tambien conocidos como grupos Runyon, basados en la pigmentacion y la tasa de crecimiento. Cada grupo incluye varias especies. El Grupo I se refiere a fotocromogenos de crecimiento lento; el Grupo II se refiere a escotocromogenos de crecimiento lento; el Grupo III se refiere a no fotocromogenos de crecimiento lento; y el Grupo IV se refiere a micobacterias de crecimiento rapido. Las micobacterias no tuberculosas tambien se denominan micobacterias atfpicas o anonimas.

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa aguda o cronica causada por una infeccion con M. tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad importante en los pafses en desarrollo, asf como un problema creciente en areas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes cada ano (vease, Styblo et al., Bull. Int. Union Tuberc. 56: 118-125 (1981). Aunque la infeccion puede ser asintomatica durante un penodo de tiempo considerable, la enfermedad se manifiesta mas comunmente como una inflamacion aguda de los pulmones, lo que produce fiebre y tos no productiva. Si se deja sin tratar, normalmente se producen complicaciones graves y muerte.

Aunque se sabe que la tuberculosis generalmente se puede controlar mediante una terapia prolongada con

antibioticos, un tratamiento de este tipo no es suficiente para prevenir la propagacion de la enfermedad. Los

individuos infectados pueden ser asintomaticos, pero contagiosos durante algun tiempo. Ademas, aunque un cumplimiento del regimen de tratamiento espedfico es decisivo, el comportamiento del paciente frecuentemente es diffcil de controlar. Los regfmenes de tratamiento requieren frecuentemente de seis a doce meses de terapia ininterrumpida. Como resultado, algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que conduce a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a los antibioticos. Es necesaria una vacunacion eficaz y un

diagnostico preciso y precoz de la enfermedad, con el fin de impedir la propagacion de la tuberculosis. La

vacunacion con bacterias vivas sigue siendo el metodo mas eficaz para inducir una inmunidad protectora. La micobacteria empleada de forma mas comun en la vacuna viva es el Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa no virulenta de Mycobacterium bovis. Algunos pafses, tales como los Estados Unidos, sin embargo, no vacunan a la poblacion en general debido a problemas relativos a la seguridad y la eficacia de la vacuna BCG.

M. tuberculosis es un agente patogeno intracelular que infecta los macrofagos y es capaz de sobrevivir en el entorno hostil del fagolisosoma en los macrofagos. La mayona de los bacilos inhalados son destruidos por macrofagos alveolares activados. Sin embargo, los bacilos supervivientes se multiplican en los macrofagos y se liberan despues de la muerte celular, lo que senala la infiltracion de linfocitos, monocitos y macrofagos en el sitio. La estimulacion antigenica de los linfocitos T requiere una presentacion a traves de moleculas del MHC. La lisis de los macrofagos cargados con los bacilos esta mediada por la respuesta inmune mediada por celulas con hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) y da como resultado el desarrollo de una tuberosidad maciza caseosa que rodea el area de las celulas infectadas. Los bacilos de la tuberculosis poseen muchos antfgenos de linfocitos T potenciales y algunos se han identificado ahora [Andersen 1994, Dan. Med. Bull. 41, 205]. Algunos de estos antfgenos son secretados por las bacterias. Una DTH continuada licua la tuberosidad, liberando de este modo los bacilos tuberculosos atrapados. La dosis grande de bacilos de tuberculosis extracelulares provoca mas DTH, causando una lesion en los bronquios y la difusion por via linfatica, hematogena y bronquial y, eventualmente, permitiendo que los bacilos infecciosos se propaguen a traves de la respiracion.

La inmunidad mediada por celulas frente a la tuberculosis consiste en varios tipos de celulas efectoras inmunes. La activacion de macrofagos a traves de citocinas, tales como interferon-gamma, representa un medio eficaz para minimizar la multiplicacion micobacteriana intracelular basada en los macrofagos. Sin embargo, esto no conduce a una erradicacion completa de los bacilos. La adquisicion de proteccion contra la tuberculosis requiere, ademas, linfocitos T. Entre ellos, los linfocitos T tanto de la estirpe CD8+ como CD4+ parecen ser particularmente importantes [Orme et al., 1993, J. Infect. Dis. 167,1481]. Estos linfocitos T secretan interferon-gamma como respuesta a las micobacterias, lo que es indicativo de una respuesta inmune Th 1, y poseen actividad citotoxica contra celulas diana incubadas con micobacterias. En estudios recientes que utilizan ratones que carecen de microglobulina beta-2 y CD8, se ha observado que las respuestas de linfocitos T citotoxicos (CTL) son cruciales para proporcionar una proteccion contra M. tuberculosis [Flynn et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12013; Flynn et al., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249; Cooper et al., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243]. Por el contrario, parece que los linfocitos B no estan involucrados, y una transferencia pasiva de anticuerpos anti-micobacterias no proporciona ninguna inmunidad protectora. Por lo tanto, un regimen de vacuna eficaz contra la tuberculosis debe desencadenar respuestas inmunes mediadas por celulas.

A pesar de que comunmente se identifica solo como una infeccion pulmonar, la TB es bien conocida por afectar a muchas partes del cuerpo. Ademas de la TB pulmonar, ejemplos de otros focos de infeccion tuberculosa incluyen la TB miliar (TB hematogena o linfohematogena generalizada), la TB del sistema nervioso central, la TB pleural, la pericarditis tuberculosa, la TB genitourinaria, la TB del tracto gastrointestinal, la peritonitis tuberculosa, la TB de la glandulas suprarrenales, la TB del hugado, la TB de los huesos y las articulaciones (por ejemplo, la espondilitis tuberculosa o enfermedad de Pott), la linfadenitis tuberculosa y la TB de la boca, ofdo medio, laringe y arbol bronquial.

Una terapia convencional contra la TB incluye un tratamiento con regfmenes que contienen pirazinamida, isoniazida, etambutol, estreptomicina, rifampicina, rifabutina, claritromicina, ciprofloxacino, clofazamina, azitromicina,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

etionamida, amikacina y resorcinomicina A. Para el tratamiento de una infeccion tuberculosa latente (inactiva), la isoniazida se puede utilizar sola. Sin embargo, el tratamiento inicial usual para la tuberculosis pulmonar incluye isoniazida en combinacion con al menos otro farmaco, tal como etambutol, estreptomicina, rifampicina o etionamida. La repeticion de un tratamiento contra la tuberculosis pulmonar, normalmente implica combinaciones de farmacos que incluyen rifampicina y otros farmacos como los que se han indicado anteriormente. El desarrollo de una resistencia del agente causal frente a los farmacos antituberculosos, sobre todo la isoniacida, es bien conocido. La tuberculosis extrapulmonar tambien se trata usualmente con una combinacion que incluye rifampicina y al menos uno de los otros tres farmacos mencionados.

Complejo Mycobacterium Avium (MAC)

M. avium y M. intracellulare son miembros del Complejo Mycobacterium Aavium (MAC). M. paratuberculosis es una subespecie de M. avium y tambien se incluye generalmente en el MAC. Estas especies se han vuelto cada vez mas importantes en los ultimos anos debido a la alta prevalencia de la infeccion con MAC diseminada en pacientes con SIDA. El complejo Mycobacterium avium se compone de 28 serovares (serotipos) que se distinguen basandose en sus caractensticas bioqmmicas y de seroaglutinacion (vease la revision de Inderlied, et al. 1993. Clin. Microbial. Rev. 6, 266-310). Dependiendo del metodo de clasificacion, 10-12 de los 28 serovares estan clasificados como pertenecientes a la especie Mycobacterium avium, y 10-12 pertenecen a la especie Mycobacterium intracellulare. Seis de los serovares de MAC todavfa no se han clasificado definitivamente. Las infecciones con MAC actualmente representan aproximadamente el 50% de los cultivos aislados patogenos, identificados por laboratorios de micobacteriologfa y son mas comunes entre pacientes con SIDA y otros pacientes inmunocomprometidos. Un diagnostico precoz y un tratamiento de las infecciones con MAC pueden mejorar y prolongar la vida de las personas infectadas.

Antrax y toxina del antrax

La toxina del antrax, producida por la bacteria Bacillus anthracis gram positiva aerobia en forma de bastoncillo, formadora de esporas, es el factor de virulencia toxica secretado por este organismo. B. anthracis es considerada frecuentemente para uso como arma biologica, debido a la potencia de la exotoxina secretada y a la capacidad de la bacteria para formar esporas latentes que resisten unas condiciones ambientales duras. La esporulacion permite un transporte y una distribucion rapida de grandes cantidades de bacterias productoras de toxinas. La toxina es en realidad un material compuesto que consiste en 3 protemas distintas, secretadas desde la bacteria. Las 3 protemas son el antfgeno protector (PA), el factor letal (Lf) y el factor de edema (EF). Mientras que LF y Ef danan directamente las celulas y causan la enfermedad, el PA es el foco de esta descripcion. El PA es crucial para la virulencia de la toxina del antrax, ya que la molecula de PA esta disenada para introducir tanto LF como EF al interior de las membranas de las celulas. En ausencia de un transporte intracelular inducido con PA, la toxina del antrax es incapaz de efectuar la destruccion de los tejidos, ya que LF y EF unicamente actuan desde dentro de la celula. La importancia del PA en la funcion de la toxina del antrax esta subrayada por el uso eficaz del PA como inmunogeno en la vacuna contra el antrax. Mediante la generacion de una respuesta inmune contra PA, la vacuna confiere proteccion contra la toxina del antrax completa (3 componentes).

Un examen mas detallado de la interaccion entre el PA y las celulas hospedadoras atacadas por la toxina del antrax es instructivo. El PA se secreta primero como un polipeptido monomerico de 83 kDa por B. anthracis en una forma grande y funcionalmente inactiva. Este PA inactivo se une a un receptor de mairnfero en la superficie de las celulas hospedadoras. El receptor de PA se ha aislado y secuenciado recientemente, y se ha encontrado que posee regiones similares al factor von Willebrand. Despues del acoplamiento en la superficie de las celulas hospedadoras, el PA interacciona con una proteasa presente en la superficie celular. La proteasa procesa la molecula grande e inactiva de PA en un fragmento mas pequeno y activo de 63 kDa. El fragmento del extremo C-terminal de 63 kDa (PA63) permanece unido a la celula y el extremo N-terminal de 20 kDa (PA20) se disocia de PA63. La identidad de la proteasa ha sido el foco de esfuerzos investigativos limitados, y esta mal caracterizada. Sin embargo, estudios previos han mostrado que la proteasa tiene caractensticas que sugieren que es una proteasa de serina obtenida a partir del hospedador. Un posible candidato de proteasa de serina observado en las publicaciones, se relaciona con furina (en sf misma, una proteasa de serina), pero otras proteasas de serina, tales como la elastasa, la proteinasa-3, la clostripama o la tripsina son posibles alternativas (Molloy, S. S. et al. J Biol Chem 267, 16396-16402 (1992)). Esta escision proteolftica y subsiguiente disociacion de PA20 confieren dos nuevas propiedades a PA63: (1) la capacidad de oligomerizarse en una estructura disociable con SDS, heptamerica en forma de anillo, denominada preporo y (2) la capacidad de unirse a EF y LF. Los oligomeros que contienen PA63-EF, PA63-LF o una combinacion de PA63-EF y PA63-LF son endocitados y transportados a un compartimiento acido, en donde el preporo PA63 se inserta en la membrana y forma un poro. Durante o despues de la formacion del poro, EF y LF se translocan a traves de la membrana endosomica dentro del citoplasma. EF es una adenilato ciclasa dependiente de calmodulina que puede proteger a las bacterias de la destruccion con fagocitos. LF es una metaloproteasa que puede destruir los macrofagos o, a concentraciones mas bajas, inducir a los macrofagos para producir un exceso de citocinas, dando posiblemente como resultado la muerte del hospedador. Estos heptameros actuan como vehmulo de transporte para entregar LF y EF en el interior de la celula. Una vez dentro de la celula, LF y EF inician anomalfas en la funcion celular.

Debido a algunas de las dificultades y deficiencias de la terapia convencional contra la tuberculosis, son deseables

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

nuevas modalidades terapeuticas contra otras infecciones micobacterianas y el antrax.

El inventor da a conocer un nuevo metodo para el uso de inhibidores de proteasas de serina como agentes terapeuticos para el tratamiento de infecciones causadas por tuberculosis (TB) y el complejo Mycobacterium avium (MAC). Estos son agentes patogenos humanos intracelulares que implantan una infeccion y una latencia prolongada mediante infeccion y supervivencia dentro de macrofagos humanos. Por lo tanto, el bloqueo de la internalizacion de TB o MAC dentro de los macrofagos es un nuevo enfoque para la terapia contra estos agentes infecciosos. En un ensayo de infectividad, los inventores han mostrado que la a1-antitripsina inhibe significativamente la infeccion con TB o MAC de macrofagos derivados de monocitos humanos (MDM).

Un enfoque novedoso para anular la accion de la toxina del antrax es bloquear el acceso de la toxina al interior de la celula, al interferir con la accion de la proteasa serina obtenida a partir del hospedador que reside en la superficie celular.

Esta invencion se dirige por tanto, a una necesidad experimentada desde hace tiempo de metodos seguros y eficaces para el tratamiento de la tuberculosis, otras infecciones micobacterianas, otras infecciones bacterianas gram positivas y gram negativas, y el antrax.

El documento de solicitud de patente internacional WO 03/059935 se refiere a un metodo para separar una protema de una o varias otras protemas, usando la cromatograffa con hidroxiapatita.

El documento de patente de EE.UU. 6.287.817 se refiere a un conjugado proteico que comprende un anticuerpo dirigido a pIgR y A2AT que se puede transportar espedficamente desde la superficie basolateral de las celulas epiteliales hasta la superficie apical y que, por tanto, es util en la administracion de una protema terapeutica directamente en la superficie apical del epitelio.

El documento de solicitud de patente internacional WO 92/06706 se refiere a un metodo para la profilaxis o el tratamiento directo de enfermedades o lesiones con mastocitos implicados, que comprende administrar en el sitio de la enfermedad o la lesion, una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de proteasa de serina.

Compendio de la invencion

El problema subyacente de la presente invencion se resuelve por la materia objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas; las realizaciones preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Mas espedficamente, el problema subyacente en la presente invencion se resuelve en un primer aspecto mediante una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable y una protema de fusion, en donde la composicion farmaceutica es para uso en un metodo para tratar a un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infeccion bacteriana o que tiene una infeccion micobacteriana, en donde la protema de fusion comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mairnfero o un fragmento de peptido de la misma, en donde el fragmento de peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una region constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento de peptido de AAT inhibe la actividad de la proteasa de serina.

Mas espedficamente, el problema subyacente en la presente invencion se resuelve en un segundo aspecto mediante una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo, un excipiente o un diluyente farmaceuticamente aceptable y un acido nucleico que codifica una protema de fusion, en donde la composicion farmaceutica es para uso en un metodo para el tratamiento de un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infeccion bacteriana o que tiene una infeccion micobacteriana, en donde la protema de fusion comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero o un fragmento de peptido de la misma, en donde el fragmento de peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una region constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento de peptido de AAT inhibe la actividad de la proteasa de serina.

Mas espedficamente, el problema subyacente en la presente invencion se resuelve en un tercer aspecto mediante un acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso como medicamento, en donde el acido nucleico codifica la protema de fusion que comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero o un fragmento de peptido de la misma, en donde el fragmento de peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una region constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento de peptido de AAT inhibe la actividad de la proteasa de serina.

En una realizacion del primer, del segundo y del tercer aspecto, la alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mam^era de origen natural.

En una realizacion del primer, del segundo y del tercer aspecto, la region constante de inmunoglobulina comprende

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

una region constante de IgG1 humana.

En una realizacion del primer, del segundo y del tercer aspecto, la region constante de IgG1 esta modificada y la region constante de IgG1 modificada no se une al receptor de Fc y/o no inicia reacciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

En una realizacion del primer, del segundo y del tercer aspecto, la alfa-1 antitripsina (AAT) de mairnfero o el fragmento de peptido de la misma se fusiona con el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de una region constante de inmunoglobulina.

En una realizacion del primer, del segundo y del tercer aspecto, la region constante de inmunoglobulina comprende la region Fc.

En una realizacion del primer, del segundo y del tercer aspecto, la region Fc de la inmunoglobulina es Fc de tipo silvestre o Fc mutante.

En una realizacion del tercer aspecto, el acido nucleico es para uso en un metodo para tratar a un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infeccion bacteriana o que tiene una infeccion micobacteriana.

En relacion con las composiciones y el acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso de acuerdo con la invencion, la presente invencion describe metodos para el tratamiento de infecciones bacterianas en un mamffero, que comprenden administrar a un sujeto que lo requiere una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mamffero o de inhibidor de la proteasa de serina o un derivado funcional de la misma; y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion, las infecciones bacterianas que pueden ser tratadas o mejoradas usando las composiciones de la invencion, son aquellas infecciones causadas por organismos bacterianos gram negativos que comprenden N. gonorrhoeae, N. meningitidis, M. catarrhalis, H. influenzae, E. coli, todas las especies de Klebsiela, todas las especies de Enterobacter, todas las especies de Serratia, todas las especies de Salmonella, todas las especies de Shigella, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, todas las especies de Providencia, todas las especies de Morgonella, todas las especies de Citrobacter, todas las especies de Aeromonas, todas las especies de Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, todas las especies de Pasteurella, Pseudomonas cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Y. enterocolitica y otras Yersinoiiosis, todas las especies de Legionella, P. multocida, H. ducreyeii, todas las especies de Chlamyidia, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Bacteroides fragilis, P. melaninogenica, todas las especies de Moraxella, todas las especies de Bordetella o cualquier combinacion de las mismas.

En otra realizacion, las infecciones bacterianas que pueden ser tratadas o mejoradas usando las composiciones y los metodos, son aquellas infecciones causadas por organismos bacterianos gram positivos que comprenden C. tetant, C. botulinum, C. difficile, Grupo A, B, C y G de Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, grupo de Streptococcus milleri, Streptococcus viridans, todas las especies de Listeria, todas las especies de Staphilococcus, S. aureus (MSSA), S. aureus (MRSA), S. epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, todas las especies de Clostridium incluyendo C. diphteriae, C. jeikium, todas las especies de Rhodococcus, todas las especies de Leukonosoc o cualquier combinacion de las mismas.

En todavfa otra realizacion, las infecciones bacterianas que pueden ser tratadas o mejoradas usando las composiciones y los metodos, son aquellas infecciones causadas por bacilos acido-alcohol resistentes que comprenden Mycobacterium tuberculosis y micobacterias atfpicas (M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. chelonei, M. fortuitum, M. scrofulaceum, M. ulceranis, M. leprae, M. xenopi, M. bovis, M. gordonae, M. haemophilum, M. marinum, M. genavense, M. avium e intracellulare y M. simiae) o cualquier combinacion de las mismas.

En relacion con las composiciones y el acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso de acuerdo con la invencion, en este documento se describen metodos para el tratamiento de infecciones micobacterianas en un marnffero, que comprenden administrar a un sujeto que lo requiere una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mamffero o de inhibidor de la proteasa de serina o un derivado funcional de la misma; y un excipiente farmaceuticamente aceptable,.

En una realizacion, la micobacteria que inhibe la infeccion de macrofagos comprende una micobacteria del genero Mycobacterium que incluye M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium-intracellulare, M. chelonei (tambien conocida como borstelense y abscessus), M. africanum, M. Marinium (tambien conocida como balnei y platypoecilus), M. buruli (tambien conocida como ulcerans), M. fortuitum (tambien conocida como giae, minetti y ranae), M. haemophilum, M. intracellulare, M. kansasii (tambien conocida como luciflavum), M. littorale (tambien conocida como xenopi), M. malmoense, M. marianum (tambien conocida como scrofulaceum y paraffinicum), M. simiae, M. szulgai, M. ulcerans, M. avium (tambien conocida como brunense), M. flavascens, M. lepraemurium, M. microti y M. paratuberculosis (que es el agente causante de la enfermedad de Johne), M. gordonae (tambien conocida como aquae), M. gastri, M. phlei (tambien conocida como moelleri y bacilo de timothy), M. nonchromogenicum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale y M. vaccae o cualquier combinacion de las mismas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En otra realizacion, la micobacteria que inhibe la infeccion de macrofagos comprende una micobacteria del genero Mycobacterium que incluye micobacterias no tuberculosas que se dividen en cuatro grupos que comprenden los grupos Runyon, seleccionados a partir del grupo que consiste en el Grupo I (fotocromogenos de crecimiento lento), el Grupo II (escotocromogenos de crecimiento lento), el Grupo III (no fotocromogenos de crecimiento lento) y el Grupo IV (micobacterias de crecimiento rapido) o cualquier combinacion de los mismos.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion describe metodos de tratamiento de enfermedades micobacterianas que dependen de la infeccion de macrofagos, por lo que las composiciones y el acido nucleico de la invencion son para uso en tales metodos.

Tambien se describe un metodo para inhibir una infeccion micobacteriana de los macrofagos, en el que las composiciones y el acido nucleico de la invencion son para uso en tal metodo, que comprende administrar a un mamffero susceptible a una infeccion micobacteriana de los macrofagos, una cantidad eficaz de una sustancia que muestra actividad alfa-1 antitripsina de mairnfero o de inhibidor de la proteasa de serina. Sin estar limitados a la a1- antitripsina, la sustancia puede ser un compuesto que inhibe la proteinasa-3, la catepsina G, la elastasa o cualquier otra proteasa de serina.

En una realizacion preferida, el agente que inhibe la infeccion micobacteriana de macrofagos derivados de monocitos humanos, comprende a1-antitripsina. Ademas, los peptidos de interes son peptidos homologos y analogos. Mientras que los homologos son peptidos naturales con homologfa de secuencia, los analogos seran derivados de peptidilo, por ejemplo, derivados de aldehfdo o cetona de tales peptidos. Ejemplos tfpicos de analogos son TLCK o TPCK. Sin estar limitados a la a1-antitripsina y a derivados peptfdicos de a1-antitripsina, se prefieren compuestos tales como oxadiazol, tiadiazol, CE-2072, UT-77 y peptoides de triazol.

El agente que inhibe la infeccion micobacteriana de macrofagos derivados de monocitos humanos, tambien puede ser un inhibidor de la actividad de la proteasa de serina, un inhibidor de la elastasa o un inhibidor de la proteinasa-3. El inhibidor de la actividad de la proteasa serina puede incluir, pero no esta limitado a, moleculas organicas pequenas, que incluyen moleculas de origen natural, sinteticas y biosinteticas, moleculas inorganicas pequenas que incluyen moleculas sinteticas y de origen natural, productos naturales que incluyen los producidos por plantas y hongos, peptidos, variantes de a1-antitripsina, peptidos modificados qmmicamente y protemas. Un inhibidor de la actividad de la proteasa de serina tiene la capacidad de inhibir la actividad proteolftica de tripsina, elastasa, calicrema y/u otras proteasas de serina.

Tambien se describe un metodo para la prevencion de una carencia de los niveles de alfa-1-antitripsina endogena funcional en un paciente susceptible a una infeccion micobacteriana de los macrofagos, que esta mediada por actividad proteasa de serina o de tipo proteasa de serina endogena del hospedador, mediante el tratamiento con una composicion farmaceutica en un vehmulo farmaceuticamente aceptable que comprende cantidades eficaces de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina. La composicion farmaceutica puede ser un peptido o una molecula pequena, que muestra actividad a1 -antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina.

En aun otro aspecto, la presente invencion describe un metodo para prevenir un smtoma de antrax en un sujeto que se piensa que tiene riesgo de exposicion al Bacillus anthracis, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de marnffero o inhibidora de la proteasa de serina, en donde dicha sustancia con actividad a1-antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina inhibe desde la superficie celular de la proteasa del hospedador, el procesamiento endogeno del PA grande inactivo en la molecula de PA mas pequeno activo, y en donde si el sujeto esta expuesto a Bacillus anthracis, se evita un smtoma de dicha exposicion.

En otro aspecto, la presente invencion describe un metodo para prevenir un smtoma de antrax en un sujeto que se sospecha que ha estado expuesto a Bacillus anthracis, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de marnffero o inhibidora de la proteasa de serina, en donde dicha sustancia con actividad a1-antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina inhibe desde la superficie celular de la proteasa del hospedador, el procesamiento endogeno del PA grande inactivo en la molecula de PA mas pequeno activo, y en donde si el sujeto esta expuesto a Bacillus anthracis, se evita un smtoma de dicha exposicion.

En otro aspecto, la presente invencion describe un metodo para mejorar un smtoma de antrax en un sujeto que requiere dicha mejora, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de marnffero o inhibidora de la proteasa de serina, en donde dicha sustancia con actividad a1-antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina inhibe desde la superficie celular de la proteasa del hospedador, el procesamiento endogeno del PA grande inactivo en la molecula de PA mas pequeno activo.

En los metodos citados anteriormente, el smtoma de antrax que se inhibe o se evita, se selecciona a partir del grupo que consiste en ulceracion cutanea, edema y formacion de escaras, o cualquier combinacion de las mismas.

En una realizacion, los metodos descritos se utilizan para prevenir o mejorar un smtoma de antrax cutaneo,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

gastrointestinal y/o por inhalacion. En una realizacion, los metodos de la presente invencion se usan para prevenir o mejorar un smtoma de antrax, seleccionado a partir del grupo que consiste en malestar general, fiebre, tos seca, mialgias y dolores pectorales, afectacion de las vfas aereas, sudoracion, ensanchamiento del mediastino en estudios radiograficos, edema de cuello y pecho, linfadenitis necrotizante del mediastino, edema no depresible, escaras, nauseas, vomitos, fiebre, dolor abdominal, diarrea con sangre, ulceras en la mucosa, linfadenitis hemorragica mesenterica o cualquier combinacion de los mismos

En aun otro aspecto, la presente invencion describe un metodo para aliviar o mejorar el dolor o los smtomas asociados con una o varias de las enfermedades o indicaciones bacterianas identificadas anteriormente, enfermedades o indicaciones micobacterianas, en un mairnfero que padece una cualquiera o varias de las enfermedades o indicaciones bacterianas identificadas anteriormente, enfermedades o indicaciones micobacterianas, que comprende administrar al marnffero que lo requiere una cantidad terapeuticamente eficaz que reduce el dolor o el smtoma, de una composicion farmaceutica que comprende cantidades eficaces de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina, ya sea sola o en combinacion con uno o varios compuestos antiinflamatorios o agentes inmunomoduladores; y un vehmulo o un excipiente farmaceuticamente aceptable, en donde dicha sustancia con actividad al-antitripsina de mamffero o inhibidora de la proteasa de serina es suficiente para inhibir o mejorar la enfermedad o la indicacion bacteriana, la enfermedad o la indicacion micobacteriana, por lo que las composiciones y el acido nucleico de la invencion son para uso en tal metodo.

En una realizacion, la reduccion o la inhibicion del dolor y/o los smtomas asociados con una o varias de cada una de las indicaciones micobacterianas, infecciones bacterianas citadas anteriormente, es del orden de aproximadamente 10-20% de reduccion o de inhibicion. En otra realizacion, la reduccion o la inhibicion del dolor es del orden de 3040%. En otra realizacion, la reduccion o la inhibicion del dolor es del orden de 50-60%. En aun otra realizacion, la reduccion o la inhibicion del dolor asociado con cada una de las indicaciones citadas, es del orden de 75-100%. Se entiende en el presente documento que los intervalos citados tambien incluyen todas aquellas cantidades porcentuales espedficas dentro del intervalo citado. Por ejemplo, el intervalo desde aproximadamente 75 a 100% tambien incluye desde 76 hasta 99%, 77 a 98%, etc., sin enumerar de hecho cada intervalo espedfico dentro del mismo.

Por consiguiente, el aspecto general de la presente descripcion es proporcionar compuestos que muestran actividad inhibidora frente a proteasas de serina. Por lo tanto, se debe reconocer que esta invencion se puede aplicar al control de la actividad catalttica de las proteasas de serina, en cualquier situacion adecuada, incluyendo, pero no necesariamente limitada a, medicina, biologfa, agricultura y fermentacion microbiana.

Un aspecto es proporcionar inhibidores de proteasas de serina clmicamente aceptables, con utilidad reconocida y que muestran una actividad relativamente alta a concentraciones relativamente bajas.

En una realizacion, la a1-antitripsina utilizada en los metodos y las composiciones de la presente invencion, ® 1 ® J ® 1 ® 1 ® comprende Aralast (Baxter), Zemaira (Aventis Behring), Prolastin (Bayer), Aprotonin o Trasilol (Bayer

Pharmaceutical Corporation) y Ulinistatin® (Ono Pharmaceuticals, Inc.) o cualquier combinacion de los mismos.

La presente invencion proporciona metodos para tratar terapeutica o profilacticamente infecciones bacterianas en un sujeto, por lo que las composiciones y el acido nucleico de la invencion son para uso en tales metodos.

El metodo para tratar terapeuticamente infecciones bacterianas o micobacterianas comprende la etapa de administrar cantidades farmaceuticamente eficaces de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de marnffero o de inhibidor de la proteasa de serina o un derivado de la misma, al sujeto despues de la aparicion de la enfermedad bacteriana o micobacteriana.

El metodo para tratar profilacticamente infecciones bacterianas o micobacterianas comprende la etapa de administrar cantidades farmaceuticamente eficaces de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mamffero o de inhibidor de la proteasa de serina o un derivado de la misma, al sujeto antes de la aparicion de la enfermedad bacteriana o micobacteriana.

La metodologfa inhibe la infeccion bacteriana o la infeccion micobacteriana de macrofagos.

Para cada uno de los metodos citados anteriormente, la cantidad terapeuticamente eficaz de una o varias sustancias que muestran actividad a1-antitripsina de mam^era o inhibidora de la proteasa de serina o un derivado funcional de la misma, se puede administrar a un sujeto que la requiere en combinacion con una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o varios farmacos antimicobacterianos y/o compuestos antiinflamatorios y/o una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o varios agentes inmunomoduladores.

En ciertas realizaciones del metodo, el compuesto antiinflamatorio o el farmaco inmunomodulador comprende interferon; derivados de interferon que comprenden betaseron, beta-interferon; derivados de prostano que comprenden iloprost, cicaprost; glucocorticoides que comprenden cortisol, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona; inmunosupresores que comprenden ciclosporina A, FK-506, metoxsaleno, talidomida, sulfasalazina, azatioprina, metotrexato; inhibidores de lipoxigenasa que comprenden zileuton, MK-886, WY-50295, SC-45662, SC-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

41661A, BI-L-357; antagonistas de leucotrieno; derivados de peptidos que comprenden ACTH y analogos de los mismos; receptores solubles de TNF; anticuerpos de TNF; receptores solubles de interleucinas, otras citocinas, protemas de linfocitos T; anticuerpos contra receptores de interleucinas, otras citocinas, protemas de linfocitos T; y calcipotrioles y analogos de los mismos tornados solos o en combinacion.

La presente invencion tambien describe el uso combinado de la composicion farmaceutica que muestra actividad a1- antitripsina de mamfero o inhibidora de la proteasa de serina, en combinacion con una o varias composiciones antibacterianas o antivirales o cualquier combinacion de las mismas, para el tratamiento de una cualquiera de las enfermedades bacterianas o micobacterianas mencionadas anteriormente o cualquier combinacion de las mismas.

En cada uno de los metodos citados anteriormente, la sustancia con actividad a1-antitripsina de mamfero o inhibidora de la proteasa de serina puede formar parte de un polipeptido de fusion, en donde dicho polipeptido de fusion comprende a1-antitripsina de mamfero o una sustancia con actividad inhibidora de la proteasa de serina y una secuencia de aminoacidos heterologa a dicha a1-antitripsina de mamfero o sustancia inhibidora de la actividad proteasa de serina.

En ciertas realizaciones, el polipeptido de fusion contemplado para uso en los metodos comprende una region constante de inmunoglobulina humana, tal como, por ejemplo, una region constante de IgG1 humana, que incluye una region constante modificada de IgG1 humana, en donde la region constante de IgG1 no se une al receptor de Fc y/o no inicia reacciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

En aun otras realizaciones, el polipeptido de fusion contemplado para uso en los metodos, puede comprender adicionalmente una secuencia de aminoacidos que es util para la identificacion, el seguimiento o la purificacion del polipeptido de fusion, por ejemplo, el polipeptido de fusion puede comprender ademas una secuencia marcadora FLAG o HIS. El polipeptido de fusion puede comprender ademas un sitio de escision proteolftica que se puede utilizar para eliminar la secuencia de aminoacidos heterologa de la a1-antitripsina de mamfero o la sustancia con actividad inhibidora de proteasa de serina. En cada una de las composiciones y metodos citados anteriormente de la invencion, el agente que inhibe la infeccion bacteriana, la infeccion micobacteriana de macrofagos derivados de monocitos humanos o el antrax, comprende a1-antitripsina. Ademas, los peptidos de interes son peptidos homologos y analogos. Mientras que los homologos son peptidos naturales con homologfa de secuencia, los analogos seran derivados de peptidilo, por ejemplo, derivados de aldehfdos o cetonas de tales peptidos. Ejemplos tfpicos de analogos son TLCK o TPCK. Sin limitarse a la a1-antitripsina y los derivados peptfdicos de a1-antitripsina, se prefieren compuestos tales como oxadiazol, tiadiazol, CE-2072, uT-77 y peptoides de triazol.

En otras realizaciones, el agente que inhibe la infeccion bacteriana, la infeccion micobacteriana de macrofagos derivados de monocitos humanos y/o el antrax, tambien puede ser un inhibidor de la actividad proteasa de serina, un inhibidor de la elastasa o un inhibidor de la proteinasa-3. El inhibidor de la actividad proteasa de serina puede incluir, pero no esta limitado a las mismas, moleculas organicas pequenas, incluyendo moleculas de origen natural, sinteticas y biosinteticas, moleculas inorganicas pequenas que incluyen moleculas sinteticas y de origen natural, productos naturales que incluyen los producidos por plantas y hongos, peptidos, variantes de a1-antitripsina, peptidos modificados qmmicamente y protemas. Un inhibidor de la actividad proteasa de serina tiene la capacidad de inhibir la actividad proteolftica de tripsina, elastasa, calicrema y/u otras proteasas de serina.

En una realizacion, el peptido puede estar protegido o derivatizado de diversas maneras, por ejemplo, mediante acilacion N-terminal, amidacion C-terminal, ciclacion, etc. En una realizacion espedfica, el extremo N-terminal del peptido esta acetilado.

Los peptidos de interes son peptidos homologos y analogos. Si bien los homologos son peptidos naturales con homologfa de secuencia, los analogos seran derivados de peptidilo, por ejemplo, derivados de aldehfdo o cetona de tales peptidos. Sin limitarse a AAT y a derivados peptfdicos de AAT, se prefieren compuestos tales como oxadiazol, tiadiazol y triazol y sustancias que comprenden ciertos esteres de fenilendialcanoato.

En cada uno de los metodos mencionados anteriormente, la sustancia con actividad al-antitripsina de mamfero o inhibidora de la proteasa de serina contemplada para uso dentro de los metodos, comprende adicionalmente una serie de peptidos que comprenden peptidos de aminoacidos carboxiterminales correspondientes a AAT. Estos pentapeptidos pueden estar representados por una formula general (I): I-A-B-C-D-E-F-G-H-II, en la que I es Cys o esta ausente; A es Ala, Gly, Val o esta ausente; B es Ala, Gly, Val, Ser o esta ausente; C es Ser, Thr o esta ausente; D es Ser, Thr, Ans, Glu, Arg, Ile, Leu o esta ausente; E es Ser, Thr, Asp o esta ausente; F es Thr, Ser, Asn, Gln, Lys, Trp o esta ausente; G es Tyr o esta ausente; H es Thr, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr o Gly; y II es Cys, un grupo amida, un grupo amida sustituido, un grupo ester o esta ausente, en donde los peptidos comprenden al menos 4 aminoacidos y sales fisiologicamente aceptables de los mismos. Entre esta serie de peptidos, varios son igualmente aceptables incluyendo FVFLM (SECUENCIA ID NO. 1), FVFAM (SECUENCIA ID NO. 2), FVALM (SECUENCIA ID NO. 3), FVFLA (SECUENCIA ID NO. 4), FLVFI (SECUENCIA ID NO. 5), FLMII (SECUENCIA ID NO. 6), FLFVL (SECUENCIA ID NO. 7), FLFVV (SECUENCIA ID NO. 8), FLFLI (SECUENCIA ID NO. 9), FLFFI (SECUENCIA ID NO. 10), FLMFI (SECUENCIA ID NO. 11), FMLLI (SECUENCIA ID NO.12), FIIMI (SECUENCIA ID NO. 13), FLFCI (SECUENCIA ID NO. 14), FLFAV (SECUENCIA ID NO. 15), FVYLI (SECUENCIA ID NO. 16), FAFLM (SECUENCIA ID NO. 17), AVFLM (SECUENCIA ID NO. 18) y cualquier combinacion de los mismos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En aun otra realizacion, estos peptidos pueden estar representados por una formula general (II): NT-X1-X2-X3-X4- X5-CT o una sal fisiologicamente aceptable de la misma, en donde NT comprende un residuo de aminoacido situado en el extremo N-terminal del peptido, incluyendo C, un grupo acetilo o un grupo succinilo, siempre que NT tambien pueda estar ausente; X1 comprende un residuo de aminoacido, incluyendo F o A; X2 comprende un residuo de aminoacido, incluyendo C, V, L, M, I, A, Co S; X3 comprende un residuo de aminoacido, incluyendo F, A, V, M, L, I, Y o C; X4 comprende un residuo de aminoacido, incluyendo L, A, F, I, V, M, C, G o S; X5 comprende un residuo de aminoacido, incluyendo M, A, I, L, V, F o G; y CT comprende un residuo de aminoacido situado en el extremo C- terminal del peptido, incluyendo C, un grupo amida, un grupo amida sustituido o un grupo ester, siempre que CT tambien pueda estar ausente, y en donde el residuo de aminoacido puede tener una configuracion L- estereoisomerica o D-estereoisomerica. Estos peptidos comprenden al menos 5 aminoacidos y sales fisiologicamente aceptables de los mismos. Los aminoacidos en la formula estan abreviados con el codigo de 1 letra y el correspondiente de 3 letras, del modo siguiente: Alanina es A o Ala; Arginina R o Arg, Asparagina N o Asn; Acido aspartico D o Asp; Cistema C o Cys; Glutamina Q o Gln; Acido glutamico E o Glu; Glicina G o Gly; Histidina H o His; Isoleucina I o Ile; Leucina L o Leu; Lisina K o Lys; Metionina M o Met; Fenilalanina F o Phe; Prolina P o Pro; Serina S o Ser; Treonina T o Thr; Triptofano W o Tip; Tirosina Y o Tyr; y Valina V o Val.

En cada uno de los metodos citados anteriormente, la sustancia con actividad a1-antitripsina de mairnfero o inhibidora de la proteasa de serina contemplada para uso en los metodos, comprende adicionalmente una serie de peptidos que comprenden peptidos de aminoacidos correspondientes a porciones o fragmentos de AAT. Por ejemplo, y no a modo de limitacion, los peptidos de aminoacidos correspondientes a 10 fragmentos de aminoacidos de AAT se contemplan espedficamente para uso en la composicion y los metodos de la presente invencion. En particular, los peptidos de aminoacidos MPSSVSWGIL (SECUENCIA ID NO. 19); LAGLCCLVPV (SECUENCIA ID NO. 20) SLAEDPQGDA (SECUENCIA ID NO. 21); AQKTDTSHHD (SECUENCIA ID NO. 22); QDHPTFNKIT (SECUENCIA ID NO. 23); PNLAEFAFSL (SECUENCIA ID NO. 24); YRQLAHQSNS (SECUENCIA ID NO: 25); TNIFFSPVSI (SECUENCIA ID NO. 26); ATAFAMLSLG (SECUENCIA ID NO. 27); TKADTHDEIL (SECUENCIA ID NO. 28); EGLNFNLTEI (SECUENCIA ID NO. 29); PEAQIHEGFQ (SECUENCIA ID NO. 30); ELLRTLNQPD (SECUENCIA ID NO. 31); SQLQLTTGNG (SECUENCIA ID NO. 32); LFLSEGLKLV (SECUENCIA ID NO. 33); DKFLEDVKKL (SECUENCIA ID NO. 34); YHSEAFTVNF (SECUENCIA ID NO. 35); GDHEEAKKQI (SECUENCIA ID NO. 36); NDYVEKGTQG (SECUENCIA ID NO. 37); KIVDLVKELD (SECUENCIA ID NO. 38); RDTVFALVNY (SECUENCIA ID NO. 39); IFFKGKWERP (SECUENCIA ID NO. 40); FEVKDTEDED (SECUENCIA ID NO. 41); FHVDQVTTVK (SECUENCIA ID NO. 42); VPMMKRLGMF (SECUENCIA ID NO. 43); NIQHCKKLSS (SECUENCIA ID NO. 44); WVLLMKYLGN (SECUENCIA ID NO. 45); ATAIFFLPDE (SECUENCIA ID NO. 46); GKLQHLENEL (SECUENCIA ID NO. 47); THDITTKFLE (SECUENCIA ID NO. 48); NEDRRSASLH (SECUENCIA ID NO. 49); LPKLSITGTY (SECUENCIA ID NO. 50); DLKSVLGQLG (SECUENCIA ID NO. 51); ITKVFSNGAD (SECUENCIA ID NO. 52); LSGVTEEAPL (SECUENCIA ID NO. 53); KLSKAVHKAV (SECUENCIA ID NO. 54); LTIDEKGTEA (SECUENCIA ID NO. 55); AGAMFLEAIP (SECUENCIA ID NO. 56); MSIPPEVKFN (SECUENCIA ID NO. 57); KPFVFLMIEQ (SECUENCIA ID NO. 58); NTKSPLFMGK (SECUENCIA ID NO. 59); VVNPTQK (SECUENCIA ID NO. 60) o cualquier combinacion de los mismos. Se pretende espedficamente que los peptidos de AAT citados, contemplados para uso en las composiciones y los metodos, tambien incluyan cualquiera y todos los peptidos de AAT espedficos, distintos de los peptidos de AAT de 10 aminoacidos de SEQ ID NO: 61, representados anteriormente. Por ejemplo, aunque los aminoacidos 1-10, los aminoacidos 11-20, los aminoacidos 21-30, etc. de los peptidos de AAT de SEQ ID NO: 61 se han mencionado en el presente documento, se entiende que el alcance de las composiciones y los metodos de uso de los mismos, incluye de forma espedfica todas las combinaciones posibles de peptidos de AAT, tales como los aminoacidos 2-12, los aminoacidos 3-13, 4-14, etc. de SEQ ID NO: 61, asf como cualquiera y todos los fragmentos de peptidos de AAT correspondientes para seleccionar aminoacidos de SEQ ID NO: 61, sin citar realmente para ello cada peptido espedfico de AAT de SEQ ID NO: 61. Por tanto, a modo de ilustracion, y no a modo de limitacion, los solicitantes en el presente documento tienen derecho de posesion de las composiciones basadas en cualquiera y todas las variantes de peptidos de AAT, basandose en la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 61 y el uso de tales composiciones en el metodo de la presente invencion.

La AAT y los compuestos activos similares, contemplados para uso en las composiciones y los metodos se pueden identificar por una serie de ensayos en los que un compuesto (AAT) mostrara actividad inhibidora frente a un control en un ensayo. Uno de estos ensayos comprende bloquear la infeccion de macrofagos derivados de monocitos humanos en un modelo in vitro de infeccion, tal y como se describe con detalle en el Ejemplo 1 de la explicacion detallada de esta descripcion.

En una realizacion, con respecto al uso de las composiciones y los metodos para prevenir o mejorar un smtoma causado por Bacillus anthracis, Corynebacterium diphteriae o Pseudomonas aeruginosa, estan excluidos espedficamente del alcance de la presente invencion aquellos inhibidores de endoproteasa de furina que comprenden una variante de a1-antitripsina que tiene una secuencia de aminoacidos que comprende los aminoacidos de la molecula de a1-antitripsina natural, excepto que la secuencia en la posicion 355-358 de la protema natural (-Ala-Ile-Pro-Met-) se cambia a la nueva secuencia -Arg-X-X-Arg-, en la que X es cualquier aminoacido, en las posiciones 355-358 de la secuencia de aminoacidos de a1-antitripsina natural, como se describe en los documentos de Patentes de EE.UU. n° 5.604.201 y 6.022.855.

Tambien se excluyen espedficamente del alcance de las composiciones y los metodos para prevenir o mejorar un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

smtoma causado por Bacillus anthracis, Corynebacterium diphteriae o Pseudomonas aeruginosa, las variantes Portland de a1-antitripsina, en donde la secuencia de aminoacidos en las posiciones 355-358 de la secuencia de aminoacidos de Portland de a1-antitripsina es -Arg-Ile-Pro-Arg-, tal y como se describe en los documentos de Patentes de EE.UU. n° 5.604.201. Y 6.022.855.

Tambien se excluyen espedficamente del alcance de las composiciones y los metodos para prevenir o mejorar un smtoma causado por Bacillus anthracis, Corynebacterium diphteriae o Pseudomonas aeruginosa, los peptidos que tienen secuencias de aminoacidos de aproximadamente 4 a aproximadamente 100 aminoacidos de longitud que comprenden la secuencia de aminoacidos -Arg-Xaa-Xaa-Arg-, en donde cada Xaa es cualquier aminoacido, tal y como se describe en los documentos de Patentes de EE.UU. n° 5.604.201 y 6.022.855.

En aun otra realizacion, con respecto al uso de las composiciones y los metodos para prevenir o mejorar un smtoma del antrax, se excluyen espedficamente del alcance de la presente invencion aquellos inhibidores de la endoproteasa de furina que comprenden HexArg, tal y como se describe en Miroslav S. Sarac et al. (Infection and Immunity, enero de 2004, pag. 602-605, vol. 72, n° 1 Protection against Anthrax Toxemia by Hexa-D-Arginine In Vitro and In Vivo).

La invencion describe ademas composiciones farmaceuticas que comprenden tales agentes.

Las dosis preferidas para administracion pueden estar en cualquier lugar dentro de un intervalo entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 10 mg por ml o mg de la formulacion. La cantidad terapeuticamente eficaz de peptidos o farmacos de AAT que tienen actividades similares a las de AAT se pueden medir tambien en concentraciones molares y pueden oscilar entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 10 mM. La formulacion tambien se contempla en combinacion con un vedculo farmaceutica o cosmeticamente aceptable. Las dosis precisas se pueden establecer mediante ensayos clfnicos de rutina bien conocidos, sin una experimentacion indebida.

En un aspecto de la invencion, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se administran por via oral, sistemica, a traves de un implante, por via intravenosa, topica, intratecal, intracraneal, intraventricular, mediante inhalacion o por via nasal.

En ciertas realizaciones de las composiciones y el acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso de acuerdo con la presente invencion, el sujeto o el mamffero es un ser humano.

En otras realizaciones de las composiciones y del acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso de acuerdo con la presente invencion, el sujeto o el mairnfero es un mamffero veterinario y/o domesticado.

Por tanto se han esbozado, mas bien en terminos generales, las caractensticas importantes de la invencion con el fin de que su descripcion detallada subsiguiente se pueda entender mejor, y con el fin de que la presente contribucion pueda ser mejor apreciada. Hay caractensticas adicionales de la invencion que se describiran a continuacion.

A este respecto, antes de explicar con detalle al menos una realizacion de la invencion, ha de entenderse que la invencion no esta limitada en su aplicacion a los detalles tal como se exponen en la siguiente descripcion y las figuras. La presente invencion puede tener otras realizaciones y se pueden poner en practica y llevar a cabo de varias maneras. Ademas, se debe entender que la terminologfa y la fraseologfa que se emplea en el presente documento tienen el fin de describir y no deben considerarse como limitantes.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 ilustra el efecto de la alfa-1-antitripsina (AAT) y un mimetico de AAT sobre una infeccion con el complejo mycobacterium avium (MAC) de macrofagos derivados de monocitos humanos (n = 4).

La FIG. 2 ilustra el efecto de la alfa-1-antitripsina (AAT) y un mimetico de AAT sobre TNFa inducido con el complejo mycobacterium avium (MAC) en macrofagos derivados de monocitos humanos.

La FIG. 3 ilustra el efecto de la alfa-1-antitripsina (AAT) y un mimetico de AAT sobre TNFa inducido con el complejo mycobacterium avium (MAC) en macrofagos derivados de monocitos humanos: experimento de evolucion temporal (n = 1).

Las FIGs. 4A-4H ilustran el mecanismo de la toxina de Bacillus anthracis y el metodo por el cual los inhibidores de la proteasa de serina neutralizan la toxina.

La FIG. 5 ilustra el efecto de la alfa-1-antitripsina sobre la produccion de interleucina-1 beta estimulada en sangre humana completa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Descripcion detallada de la invencion

Metodos convencionales

De acuerdo con la presente invencion se pueden emplear tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiolog^a y ADN recombinante dentro de la experiencia de la tecnica. Tales tecnicas se explican por completo en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, compilador, 1986).

Metodos terapeuticos

La presente invencion describe metodos para el tratamiento de infecciones micobacterianas, que comprenden administrar a un sujeto que lo requiere una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende una cantidad eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mairnfero o inhibidora de la proteasa de serina o un derivado funcional de la misma; y un excipiente farmaceuticamente aceptable, por lo que las composiciones y el acido nucleico que codifica una protema de fusion son para uso en los mismos.

De acuerdo con los metodos descritos en este documento, se inhibe una infeccion micobacteriana de los macrofagos para obtener beneficios terapeuticos importantes.

Por lo tanto, la administracion de una dosificacion de la composicion de la invencion, es decir, a1-antitripsina o un fragmento, un derivado o un analogo de la misma, puede ser beneficiosa para el tratamiento de enfermedades o trastornos micobacterianos. En un aspecto preferido, el agente es un analogo de a1-antitripsina que puede cruzar la barrera hematoencefalica, lo que permitina una administracion intravenosa u oral. Muchas estrategias estan disponibles para el cruce de la barrera hematoencefalica, incluyendo, pero no limitadas a, incrementar la naturaleza hidrofoba de una molecula; introducir la molecula como un conjugado de un vetuculo, tal como la transferrina, dirigir a un receptor en la barrera hematoencefalica; y similares. En otra realizacion, el agente se puede administrar por via intracraneal o, mas directamente, por via intraventricular. En aun otra realizacion, el agente se puede administrar por medio de inhalacion o por via nasal.

En una realizacion adicional, los metodos y las composiciones son utiles en el tratamiento terapeutico de enfermedades o trastornos micobacterianos del sistema inmune. En aun otra realizacion adicional, las enfermedades se pueden prevenir mediante una administracion a tiempo del agente de la invencion como un agente profilactico, antes de la aparicion de los smtomas o signos, o antes de la aparicion de smtomas o signos graves de una enfermedad micobacteriana. Por lo tanto, un paciente que tiene riesgo de padecer una enfermedad micobacteriana particular, se puede tratar con inhibidores de la proteasa de serina, por ejemplo, (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5- (3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil)carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; como medida de precaucion.

La dosis eficaz del agente y el regimen de tratamiento apropiado pueden variar con la indicacion y el estado del paciente, y la naturaleza de la propia molecula, por ejemplo, su semivida in vivo y el nivel de actividad. Estos parametros son facilmente abordados por un experto ordinario en la tecnica y se pueden determinar con una experimentacion de rutina.

Las dosis preferidas para la administracion pueden ser cualquiera dentro de un intervalo entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 20 mg por ml de lfquido biologico del paciente tratado La cantidad terapeuticamente eficaz de a1-antitripsina, peptidos o farmacos que tienen actividades similares a la a1-antitripsina o a los peptidos, se puede medir tambien en concentraciones molares y puede variar entre aproximadamente 1 nM a aproximadamente 2 mM.

Inhibidores de la proteasa de serina

Se ha de entender que la presente invencion no se limita a los ejemplos descritos en el presente documento, y otras proteasas de serina conocidas en la tecnica se pueden utilizar dentro de las limitaciones de la invencion. Por ejemplo, un experto en la tecnica puede seleccionar facilmente inhibidores tal y como se describe en el documento WO 98/24806, que describe oxadiazol, tiadiazol y triazol sustituidos como inhibidores de la proteasa de serina. El documento de patente de EE.UU. n° 5.874.585 da a conocer compuestos heterodclicos sustituidos, utiles como inhibidores de proteasas de serina; que incluyen: (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-

oxadiazol

l)carbonil)-2-(S)-met

lprop

l]-L-prol

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(2-feniletil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(2-metoxibencil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(trifluorometil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(metil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(difluorometil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(bencil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-metoxibencil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(2,6-difluorobencil)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(trans-estiril)-1,2,4-

namida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(trans-4-trifluorometilstil)-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1.2.4- oxadiazolil)carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(trans-4-metoxiestiril)-

1.2.4- oxadiazolil)cabonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-tienilmetil)-1,2,4-

oxadiazolil)carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(fenil)-1,2,4-

oxadiazolil)carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; y (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-fenilpropil)-1,2,4- oxadiazolil)carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida. El documento de Patente de EE.Uu. n° 5.216.022 describe otras moleculas pequenas utiles para la practica de esta invencion, que incluyen: benciloxicarbonil-L-valil-N-[1-(2-[5- (3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida (tambien conocida como cE-2072), benciloxicarbonil-L-valil-N-[1-(2-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; benciloxicarbonil-L-valil-N-[l-(2-(5-(metil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(2-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(2-(5-(4-dimetilaminobencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(2-(5-(1-naptilenil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-[1-(3-(5-(3,4-metilendioxibencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3,5-dimetilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3,5-dimetoxibencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-prolinamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[l-(3-(5-(3,5-ditrifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L-

prolinamida; prolinamida; prolinamida; prolinamida; prolinamida; prolinamida; prolinamida; metilpropil]-L-prolinamida; metilpropil]-L-prolinamida; metilpropil)-1-prolinamida; metilpropil]-L-prolinamida;

(benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-metilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(bifenilmetilen)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-(1-(3-(5-(4-fenilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)-metilpropil)-L- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-fenilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)-metilpropil]-L- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-fenoxibencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(ciclohexilmetilen)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]-L- (benciloxicarbonil)-valil-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometildimetilmetilen)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(1-naptilmetilen)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3-piridilmetil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(3,5-difenilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)- (benciloxicarbonil)-L-valil-N-[1-(3-(5-(4-dimetilaminobencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2- (S)-metilpropil]-L-prolinamida; 2-(5-[(benciloxicarbonil)amino]-6-oxo-2-(4-fluorofenil)-1,6-dihidro-1-pirimidinil]-N-[1-(3- (5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-(S)-2-metilpropil]acetamida; 2-(5-amino-6-oxo-2-(4-fluorofenil)- 1,6-dihidro-1-pirimidinil]-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 2-(5- [(benciloxicarbonil)amino]-6-oxo-2-(4-fluorofenil)-1,6-dihidro-1-pirimidinil]-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4- oxadiazolil]carbonil)-(S)-2-metilpropil]acetamida; 2-(5-amino-6-oxo-2-(4-fluorofenil)-1,6-dihidro-1-pirimidinil]-N-[1-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-metilpropil]acetamida; (pirrol-2-carbonil)-N-(bencil)glicil-N-[1-(2-(5-(3- metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]amida; (pirrol-2-carbonil)-N-(bencil)glicil-N-[l-(3-(5-(3-

trifluorometilbencil)]-1,2,4-oxadiazolil)-(S)-metilpropil]amida; (2S,5S)-5-amino-1,2,4,5,6,7-hexahidroazepino-[3,2,1]- indol-4-ona-carbonil-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-(R,S)-2-metilpropil]amida; BTD-[1-(2-(5-(3- metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]amida; (R,S)-3-amino-2-oxo-5-fenil-1,4-benzodiazepin-N-[l- (2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; (benciloxicarbonil)-L-valil-2-L-(2,3-dihidro- lH-indol)-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]amida; (benciloxicarbonil)-L-valil-2-L- (2,3-dihidro-lH-indol)-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]amida; acetil-2-L- (2,3-dihidro-1H-indol)-N-[l-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]amida; 3-(S)-

(benciloxicarbonil)amino)-epsilon-lactama-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)- metilpropil]acetamida; sal de acido trifluoroacetico de 3-(S)-(amino)-epsilon-lactama-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4- oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 3-(S)-[(4-morfolino carbonil-butanoil)amino]-epsilon-lactama-N-[1-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(R,S)-metilpropil]acetamida; 6-[4-fluorofenil]-epsilon-lactama-N-[l-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)-metilpropil]acetamida; 2-(2-(R,S)-fenil-4-oxotiazolidin-3-il]-N-[l-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(s)-metilpropil]acetamida; 2-(2-(B,s)-fenil-4-oxotiazolidin-3-il]-N-[l-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]hidroximetil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 2-(2-(R,S)-bencil-4-oxotiazolidin-3-il]-N- [1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 2-(2-(R,S)-bencil-4-oxotiazolidin-3- iloxido]-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(R,S)-metilpropil]acetamida; (1-benzoil-3,8- quinazolindiona)-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; (1-benzoil-3,6- piperazinadiona)-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; (1-fenil-3,6-

piperazinadiona)-N-[l-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; [(1-fenil-3,6-

piperazinadiona)-N-[l-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)]-2-(S)-metilpropil]acetamida; 3-

[(benciloxicarbonil)amino]-quinolin-2-ona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)- metilpropil]acetamida; 3-[(benciloxicarbonil)amino]-7-piperidinil-quinolin-2-ona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-

oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida

3-(carbometoxi-quinolin-2-ona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4- 3-(amino-quinolin-2-ona)-N-[l-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4- 3-[(4-morfolino)aceto]amino-quinolin-2-ona-N-[1-(2-(5-(3- metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 3,4-dihidro-quinolin-2-ona-N-[l-(2-(5-(3-

metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 1-acetil-3-(4-fluorobenciliden)piperazin-2,5-diona- N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 1-acetil-3-(4-dimetilamino

benciliden)piperazin-2,5-diona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 1- acetil-3-(4-carbometoxibenciliden)piperazin-2,5-diona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)- metilpropil]acetamida; 1-acetil-3-[(4-piridil)metilen]piperazin-2,5-diona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-

oxadiazolil]caxbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 4-[1-bencil-3-(R)-bencil-piperazin-2,5-diona]-N-[1-(2-[5-(3-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-metilpropil]acetamida; 4-[1-bencil-3-(S)-bencil-piperazin-2,5,-diona]-N-[1-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 4-[1-bencil-3(R)-bencilpiperazin-2,5-diona]- N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 4-[1-bencil-3-(s)-

bencilpiperazin-2,5,-diona]-N-[1-(3-(5-(3-trifluofometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 4- [1-bencil-3-(S)-bencilpiperazin-2,5,-diona]-N-[1-(3-(5-(2-dimetilaminoetil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)- metilpropil]acetamida; 4-[1-metil-3-(R,S)-fenilpiperazin-2,5,-diona]-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-

oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 4-[[metil-3-(R,S)-fenilpiperazin-2,5,-diona]-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-

1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 4-[1-(4-morfolinoetil)-3-(R)-bencilpiperazin-2,5,-diona]-N-[1-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 5-(R,S)-fenil-2,4-imidazolidindiona-N-[1-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 5-(R)-bencil-2,4-imidazolidindiona-N-(1-(2- (5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida 5-(S)-bencil-2,4-imidazolidindiona-N-[1-(2-(5- (3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 5-(S)-bencil-2,4-imidazolidindiona-N-[1-(3-(5-(3- trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 5-(R)-bencil-2,4-imidazolidindiona-N-[1-(3- (5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; 1-bencil-4-(R)-bencil-2,5-

imidazolidindiona-N-[1-(2-(5-(3-metilbencil)-1,3,4-oxadiazolil]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida; y 1-bencil-4-(R)- bencil-2,S-imidazolidindiona-N-[1-(3-(5-(3-trifluorometilbencil)-1,2,4-oxadiazolilo]carbonil)-2-(S)-metilpropil]acetamida, entre otras.

Del mismo modo, el documento de patente de EE.UU. n° 5.869.455 da a conocer derivados N-sustituidos; el documento de patente de EE.UU. n° 5.861.380 ceto-inhibidores y diceto-inhibidores de proteasas que contienen sistemas de anillos; el documento de patente de EE.UU. n° 5.807.829 analogos tripeptoides de inhibidores de proteasas de serina; el documento de patente de EE.UU. n° 5.801.148 analogos de prolina inhibidores de proteasas de serina; el documento de patente de EE.UU. n° 5.618.792 compuestos heterodclicos sustituidos utiles como inhibidores de proteasas de serina. Se contemplan otras moleculas igualmente ventajosas, que se pueden usar en lugar de a1-antitripsina o en combinacion con a1-antitripsina, tal como en el documento WO 98/20034 que describe inhibidores de proteasa de serina procedentes de pulgas. Sin limitarse a esta sola referencia, un experto en la tecnica puede emplear facilmente y sin experimentacion indebida compuestos tales como los del documento WO98/23565, que describe compuestos de aminoguanidina y alcoxiguanidina utiles para inhibir proteasas de serina; el documento WO98/50342 describe compuestos de bis-aminometilcarbonilo utiles para el tratamiento de trastornos de proteasas de cistema y serina; el documento WO98/50420 derivados de aminoacidos dclicos y de otros, utiles para enfermedades relacionadas con la trombina; el documento WO 97/21690 derivados que contienen D- aminoacidos; el documento WO 97/10231 inhibidores que contienen un grupo cetometileno de proteasas de serina y cistema; el documento WO 97/03679 inhibidores que contienen fosforo de proteasas de serina y cistema; el documento WO 98/21186 inhibidores de benzotiazol y heterodclicos relacionados de proteasas de serina; el documento WO 98/22619 describe una combinacion de inhibidores que se unen al sitio P de proteasas de serina con sitio quelante de cationes divalentes; el documento WO 98/22098 una composicion que inhibe la conversion de la subfamilia de pro-enzimas CPP32 incluyendo la caspasa 3 (CPP32/Yama/Apopain); el documento WO 97/48706 pirrolo-pirazin-dionas; el documento WO 97/33996 bikunina placentaria humana (recombinante) como inhibidor de la proteasa de serina; el documento WO 98/46597 una molecula que contiene un aminoacido complejo para el tratamiento de infecciones y afecciones vmcas descritas anteriormente.

Otros compuestos que tienen actividad inhibidora de proteasa de serina son igualmente adecuados y eficaces para uso en los metodos, incluyendo pero no limitados a: derivados de tetrazol como se describen en el documento WO 97/24339; derivados de acido guanidinobenzoico como se describen en el documento WO 97/37969 y en varios documentos de patente de EE.UU. n° 4.283.418; 4.843.094; 4.310.533; 4.283.418; 4.224.342; 4.021.472; 5.376.655; 5.247.084; y 5.077.428; derivados de fenilsulfonilamida representados por una formula general en el documento WO 97/45402; nuevos derivados de sulfuro, sulfoxido y sulfona representados por una formula general en el documento WO 97/49679; nuevos derivados de amidino representados por una formula general en el documento WO 99/41231; otros derivados de amidinofenol como se describen en los documentos de patente de EE.UU. n° 5.432.178; 5.622.984; 5.614.555; 5.514.713; 5.110.602; 5.004.612; y 4.889.723, entre muchos otros.

Enfermedades micobacterianas abordadas por la invencion

Las enfermedades o trastornos micobacterianos espedficos para los cuales son beneficiosas las composiciones y el acido nucleico que codifica una fusion, asf como los metodos terapeuticos para inhibir la infeccion con micobacterias de macrofagos de la invencion, incluyen, pero no se limitan a, aquellas enfermedades o trastornos micobacterianos causados por micobacterias del genero Mycobacterium, que incluyen M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium- intracellulare, M. chelonei (tambien conocida como borstelense y abscessus), M. africanum, M. Marinium (tambien conocida como balnei y Platypoecilus), M. Buruli (tambien conocida como ulcerans), M. fortuitum (tambien conocida como giae, Minetti y ranae), M. haemophilum, M. intracellulare, M. kansasii (tambien conocida como luciflavum), M. littorale (tambien conocida como xenopi), M. malmoense, M. marianum (tambien conocida como scrofulaceum y paraffinicum), M. simiae, M. szulgai, M. ulcerans, M. avium (tambien conocida como brunense), M. flavascens, M. lepraemurium, M. microti y M. paratuberculosis (que es el agente causante de la enfermedad de Johne y una posible causa de la enfermedad de Crohn), M. gordonae (tambien conocida como aquae), M. gastri, M. phlei (tambien conocida como moelleri y como bacilo de timothy), M. nonchromogenicum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale y M. vaccae.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En otra realizacion, la micobacteria que inhibe la infeccion de macrofagos comprende una micobacteria del genero Mycobacterium que incluye micobacterias no tuberculosas que se dividen en cuatro grupos que comprenden los grupos Runyon, seleccionados a partir del grupo que consiste en el Grupo I (fotocromogenos de crecimiento lento), el Grupo II (escotocromogenos de crecimiento lento), el Grupo III (no fotocromogenos de crecimiento lento) y el Grupo IV (micobacterias de crecimiento rapido).

Bacillus anthracis y toxina del antrax

La toxina del antrax, producida por la bacteria Bacillus anthracis gram positiva, aerobia en forma de bastoncillo, formadora de esporas, es el factor de virulencia toxica secretado por este organismo. B. anthracis es considerada frecuentemente para uso como arma biologica, debido a la potencia de la exotoxina secretada, y a la capacidad de la bacteria para formar esporas latentes que resisten unas condiciones ambientales duras. La esporulacion permite un transporte y distribucion rapida de grandes cantidades de bacterias productoras de toxinas. La toxina es en realidad un material compuesto que consiste en 3 protemas distintas, secretadas desde la bacteria. Las 3 protemas son el anrtgeno protector (PA), el factor letal (Lf) y el factor de edema (EF). Mientras que LF y EF danan directamente las celulas y se piensa que causan la enfermedad debido a la exposicion de la toxina del antrax, el PA es el foco de esta descripcion. El PA es crucial para la virulencia de la toxina del antrax, ya que la molecula de PA esta disenada para introducir tanto LF como eF al interior de las membranas de las celulas. En ausencia de un transporte intracelular inducido con PA, la toxina del antrax es incapaz de efectuar la destruccion de los tejidos, ya que LF y EF unicamente actuan desde dentro de la celula. La importancia del PA en la funcion de la toxina del antrax esta subrayada por el uso eficaz del PA como inmunogeno en la vacuna contra el antrax. Mediante la generacion de una respuesta inmune contra PA, la vacuna confiere proteccion contra la toxina del antrax completa (3 componentes).

Un examen mas detallado de la interaccion entre el PA y las celulas hospedadoras atacadas por la toxina del antrax es instructivo. El PA se secreta primero por B. anthracis en una forma grande y funcionalmente inactiva. Este PA inactivo se une a un receptor en la superficie de las celulas hospedadoras. El receptor de PA se ha aislado y secuenciado recientemente, y se ha encontrado que posee regiones similares al factor von Willebrand. Despues del acoplamiento en la superficie de las celulas hospedadoras, el PA interacciona con una proteasa presente en la superficie celular. La proteasa corta (procesa) la molecula grande e inactiva de PA en un fragmento mas pequeno y activo. La identidad de esta proteasa ha sido el foco de esfuerzos investigativos limitados, y esta mal caracterizada. Sin embargo, estudios previos han mostrado que la proteasa tiene caractensticas que sugieren que es una proteasa de serina obtenida a partir del hospedador. Un posible candidato de proteasa de serina observado en las publicaciones, se relaciona con furina (en sf misma, una proteasa de serina), pero otras proteasas de serina, tales como la elastasa, la proteinasa-3 o la tripsina son posibles alternativas. Una vez procesada por la accion de la o las proteasas de serina de la superficie celular, las moleculas de PA activadas se autoensamblan en grupos de 7 (heptameros) en la superficie celular. Estos heptameros actuan como un vehmulo de transporte para entregar LF y EF en el interior de la celula. Una vez dentro de la celula, LF y EF inician anomalfas en la funcion celular.

Un enfoque novedoso para anular la accion de la toxina del antrax es bloquear el acceso de la toxina al interior de la celula. El presente inventor ha mostrado, en extensos estudios previos de laboratorio (Leland Shapiro et al. Facet 2000 vol 15:115-122, y datos no publicados del Dr. Leland Shapiro), que las proteasas de serina que residen en la superficie celular se pueden neutralizar por la accion de varios tipos de moleculas que inhiben la funcion de las proteasas de serina. El inhibidor endogeno natural mas importante de las proteasas de serina es alfa-1-antitripsina (AAT). Es de destacar que los niveles de AAT se reducen en los vasos linfaticos, y que la produccion de toxina del antrax y las manifestaciones de la enfermedad se originan desde el interior de los vasos linfaticos. Es posible que la produccion de la toxina se produzca en los tejidos linfaticos, ya que las cantidades reducidas de AAT proporcionan un microambiente favorable para mejorar la funcion de la proteasa de serina. Se espera que tales condiciones aumenten la produccion de toxina del antrax activada. Por lo tanto, administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mairnfero o de inhibidor de la proteasa de serina, sirve para atenuar o abolir la actividad de la toxina del antrax, mediante el bloqueo de la actividad de la proteasa de serina obtenida a partir del hospedador, que reside en la superficie celular. Esto anulara el procesamiento en la superficie celular del PA grande inactivo en el fragmento de PA activo menor. Por lo tanto, al interferir con la actividad de la proteasa de serina del hospedador, se interrumpira la capacidad del heptamero PA63 para formar el preporo y, en ultima instancia, el poro. Al desarmar la toxina del antrax utilizando este enfoque novedoso (veanse las Figuras 4A-4H) se obtienen varias ventajas, en comparacion con enfoques alternativos a modo de ejemplo y no de limitacion:

1. La inhibicion de la proteasa de serina, como una estrategia para tratar una infeccion con antrax, es muy probable que sea resistente a una mutacion bacteriana debido a la presion selectiva. Eligiendo dirigir o inhibir las proteasas de serina originarias de la celula hospedadora, la molecula diana es inalterable.

2. Los inhibidores sinteticos de proteasas de serina (mimeticos de tipo AAT) se pueden desarrollar y han sido desarrollados (vease, infra, CE-2072). Un agente farmaceutico de este tipo se puede formular en forma de pastilla en el ambito de consumo oral o se puede formular como un inhalador para el tratamiento del antrax mediante inhalacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

3. Los agentes disponibles en el mercado, ya aprobados para uso alternativo en el ser humano, funcionaran como un tratamiento para el antrax. Estos agentes se utilizan actualmente para indicaciones distintas de la toxicidad del antrax, e incluyen AAT inyectable, preparaciones de plasma, aprotinina y otros (American J. Of Resp Critical Care Med 1998, VII 158: 49-59). Una posible ejemplificacion de esta invencion puede tener una aplicacion practica inmediata. Los inhibidores de proteasas de serina han sido administrados a los pacientes mediante inhalacion. Dado que la forma mas letal de infeccion con antrax es la invasion pulmonar, un agente inhalado (AAT natural o un mimetico sintetico de tipo AAT/u otro inhibidor de proteasas de serina) puede ser especialmente util debido a las elevadas concentraciones locales, la facilidad de administracion del farmaco y la falta de efectos secundarios (ya que la administracion no es sistemica). Este modo de administracion dirigida de los farmacos puede aumentar la actividad del inhibidor de la proteasa serina dentro de los vasos linfaticos pulmonares y mediastmicos, que son los principales sitios en donde se piensa que el antrax inicia una enfermedad fulminante.

4. Al neutralizar la toxina del antrax, se interrumpe la causa directa de la enfermedad en los individuos infectados. Los antibioticos, por otra parte, no se dirigen a la actividad de la toxina, y no pueden afectar a la toxina producida antes de la destruccion de las bacterias. Esta invencion contempla espedficamente la inhibicion de proteasas de serina de celulas hospedadoras, junto con la administracion de uno o varios antibioticos antibacterianos. Los antibioticos detendran adicionalmente la produccion de toxinas, evitando el crecimiento de las bacterias y/o destruyendo la fuente bacteriana de la toxina.

5. Este enfoque de la terapia del antrax es probablemente seguro. Existe una extensa experiencia clmica en el uso de AAT inyectable para el tratamiento de pacientes con una carencia genetica de AAT. No se han detectado efectos adversos a largo plazo hasta la fecha (American J. Of Resp Critical Care Med 1998, VII 158: 49-59; Wencker et al. Chest 2001 119:737-744). Por otra parte, un inhibidor de molecula pequena de la proteasa de serina del hospedador ha sido administrado a pacientes con la enfermedad de Kawasaki (Ulinistatin, Onto pharmaceuticals), con un excelente historial de seguridad y tolerabilidad. Ademas, la inhibicion de las proteasas de serina del hospedador para el tratamiento de la infeccion con antrax solo requerira un curso de tratamiento corto, minimizando de este modo cualquier problema potencial por una exposicion a largo plazo a la AAT o a mimeticos de tipo AAT/u otros inhibidores de la proteasa serina.

6. Tambien se pueden emplear receptores de antrax solubles (Bradley et al. Nature 2001 vol. 414), lisis con bacteriofagos de organismos de antrax (Schuch et al. Nature 2002 vol. 418 884-889), componentes de la toxina del antrax mutantes dominantes negativo (Sellman et al. Science 2001 VI 292: 695-697) e inhibidores polivalentes (Mourez et al Nature Biotech 2001 Vol. 19:958-961) junto con los metodos basados en el antrax de la presente invencion.

Por lo tanto, de cara a lo anterior, la presente invencion describe metodos para prevenir un smtoma de antrax en un sujeto sospechoso de haber estado expuesto o que se piensa que tiene riesgo de exposicion a Bacillus anthracis, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mairnfero o de inhibidor de la proteasa de serina. La presente invencion tambien describe un metodo para mejorar un smtoma de antrax en un sujeto que requiere dicha mejora, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de mai^ero o de inhibidor de la proteasa de serina.

En cada uno de los metodos citados anteriormente, los smtomas clmicos del antrax se pueden inhibir o prevenir mediante la administracion de una sustancia que muestra actividad a1-antitripsina de marnffero o de inhibidor de la proteasa de serina.

Smtomas clmicos del antrax

El antrax tiene lugar como tres entidades clmicas generales: formas por i) inhalacion, ii) cutanea y iii) gastrointestinal.

i) El antrax por inhalacion es la forma mas mortal de la enfermedad, y es la que tiene mas probabilidad de estar implicada en una disputa o un accidente con armas biologicas. Por lo general, una persona infectada inhala las esporas de antrax por casualidad o durante un ataque con armas biologicas. Despues de un penodo de incubacion de 1-6 dfas, se produce una enfermedad bifasica. Inicialmente, hay malestar/fiebre/tos seca/mialgias y dolores pectorales no espedficos. La segunda fase se produce 2-3 dfas despues de la primera fase, y consiste en una progresion de los hallazgos no espedficos constitucionales mencionados anteriormente, una adicion de compromiso ventilatorio, sudoracion, ampliacion del mediastino en estudios radiograficos y edema del cuello y el pecho. Esta etapa de la enfermedad se caracteriza por una linfadenitis mediastmica necrotizante. Esta segunda etapa de la enfermedad puede progresar rapidamente a un choque y muerte al cabo de 2 dfas, y se han descrito tasas de mortalidad de hasta el 80%. El mecanismo de la muerte en modelos animales parece ser una produccion incrementada de citocinas proinflamatorias, especialmente BL-1. Es de senalar, en relacion con la descripcion de la presente invencion, que el tejido linfatico carece de actividad inhibidora de proteasa de serina en comparacion con otros tejidos del cuerpo. La implicacion es que la toxina del antrax se activa de forma selectiva en regiones del cuerpo (sistema linfatico), en donde hay un desequilibrio en la funcion de la proteasa de serina/anti-proteasa de serina que favorece la actividad de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

proteasa de serina. Una realizacion preferida para el uso de la presente invencion para tratar el antrax por inhalacion, es administrar grandes cantidades de un inhibidor de la proteasa de serina (natural o sintetico) mediante inhalacion. Esto dara lugar a un cambio en el equilibrio de la proteasa de serina/inhibidor de la proteasa de serina en los tejidos linfaticos pulmonares y mediastmicos frente a la actividad antiproteasa. Esto dara como resultado el bloqueo del evento de procesamiento en la superficie celular que se requiere para la actividad de la toxina del antrax.

ii) El antrax cutaneo es la forma mas frecuente (>95%) de infeccion con antrax en los seres humanos. Despues de una exposicion a las esporas del antrax, las regiones de piel denudada (cortes, abrasiones, etc.), presentan un entorno que permite que los organismos del antrax emerjan desde el estado de espora, para crecer y replicarse y producir la toxina del antrax. Al cabo de 1 semana, en la zona de inoculacion del antrax se desarrolla una papula indolora. Las vesmulas se forman despues en o cerca de la papula durante los siguientes 1-2 dfas, seguidas en breve por el desarrollo de fiebre y malestar general, y un edema no de picadura que rodea la lesion de la piel que se debe a la actividad de la toxina. La lesion original (frecuentemente entonces una vesmula) se rompe para formar una ulceracion necrotica y ampliacion, esto da como resultado la formacion de la escara que caracteriza una infeccion por antrax cutaneo. En ausencia de terapia, esta enfermedad tiene un 20% de mortalidad. Para aquellos que se recuperan, la escara se desprende en 1-2 semanas. Una realizacion preferida para el tratamiento del antrax cutaneo, es la administracion de un inhibidor de la proteasa de serina (natural o sintetico en una preparacion topica/crema. La terapia con inhibidor de proteasa de serina parenteral tambien se puede coadministrar en el caso de que surjan smtomas sistemicos, o tal terapia parenteral se puede administrar profilacticamente para el antrax que aparece de forma clmica que esta localizado en la piel.

iii) El antrax gastrointestinal aparece despues de la ingestion de esporas del antrax. Despues de 2-5 dfas, se desarrollan nauseas/vomitos/fiebre y dolor abdominal. Una diarrea con sangre sobreviene rapidamente, y se manifiesta un "abdomen agudo". La patologfa dentro del abdomen incluye ulceras en la mucosa. Tambien se desarrolla una linfadenitis mesenterica hemorragica, y esto es de nuevo compatible con una activacion selectiva de la toxina del antrax en microentornos que carecen de inhibidor de la proteasa de serina. Esta enfermedad tiene una tasa de mortalidad del 50%.

Protemas aisladas para uso en las composiciones y metodos de la invencion

Un aspecto de la invencion se refiere a protemas aisladas y a porciones biologicamente activas de las mismas, asf como a fragmentos polipeptfdicos adecuados para uso como inmunogenos para generar anticuerpos dirigidos contra un polipeptido. En una realizacion, el polipeptido natural se puede aislar a partir de celulas o fuentes de tejido a traves de un esquema de purificacion apropiado, usando tecnicas de purificacion de protemas convencionales. En otra realizacion, los polipeptidos se producen por tecnicas de ADN recombinante. De forma alternativa a la expresion recombinante, un polipeptido de la invencion se puede sintetizar qmmicamente usando tecnicas de smtesis de peptidos convencionales.

Tambien se conocen variantes modificadas y no mutantes recombinantes de alfal-antitripsina, producidas por metodos de ingeniena genetica (documento de Patente de EE.UU. n° 4.711.848). La secuencia de nucleotidos de alfal-antitripsina humana y otras variantes de alfa1-antitripsina humana se han descrito en el documento de solicitud internacional publicada n° WO 86/00.337. Esta secuencia de nucleotidos se puede utilizar como material de partida para generar todas las variantes de aminoacidos de AAT y fragmentos de aminoacidos representados en este documento, empleando tecnicas de ADN recombinante y metodos conocidos por los expertos en la tecnica.

Una protema "aislada" o "purificada" o una porcion biologicamente activa de la misma esta sustancialmente exenta de material celular u otras protemas contaminantes procedentes de la fuente de celulas o tejido, a partir de la cual se obtiene la protema, o esta sustancialmente exenta de precursores qrnmicos u otros productos qrnmicos cuando se sintetiza qmmicamente. La expresion "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de protema en donde la protema se separa de los componentes celulares de las celulas a partir de los cuales se afsla o se produce recombinantemente. Por lo tanto, la protema que esta sustancialmente exenta de material celular incluye preparaciones de protema que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de protema heterologa (tambien referida en esta memoria como "protema contaminante"). Cuando la protema o una porcion biologicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, de forma preferible tambien esta sustancialmente exenta de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparacion de protema. Cuando la protema se produce por smtesis qmmica, de forma preferible esta sustancialmente exenta de precursores qrnmicos u otros productos qrnmicos, es decir, esta separada de los precursores qrnmicos u otros productos qrnmicos que estan implicados en la smtesis de la protema. Por consiguiente, tales preparaciones de la protema tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores o compuestos qrnmicos distintos del polipeptido de interes.

Las porciones biologicamente activas de un polipeptido incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente identicas u obtenidas a partir de la secuencia de aminoacidos de la protema (por ejemplo, la secuencia de aminoacidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60), que incluye menos aminoacidos que la protema de longitud completa, y muestran al menos una actividad de la protema de longitud completa correspondiente. Por lo general, las porciones biologicamente activas comprenden un dominio o un motivo con al menos una actividad de la protema correspondiente. Una porcion biologicamente activa de una protema puede ser un polipeptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o mas aminoacidos de longitud. Ademas, otras porciones biologicamente activas, en las que se delecionan otras regiones de la protema, se pueden preparar por tecnicas recombinantes y se evaluan en relacion con una o varias de las actividades funcionales de la forma natural de un polipeptido.

Los polipeptidos preferidos tienen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60. Otras protemas utiles son sustancialmente identicas (por ejemplo, al menos aproximadamente 45%, preferiblemente 55%, 65%, 75%, 85%, 95% o 99%) a cualquiera de SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,

58, 59 y 60, y conservan la actividad funcional de la protema de origen natural correspondiente, aunque difieren en la secuencia de aminoacidos debido a una variacion alelica natural o mutagenesis.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos acidos nucleicos, las secuencias se alinean con el fin de una comparacion optima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o de acido nucleico para tener una alineacion optima con una segunda secuencia de aminoacidos o de acido nucleico). Los residuos de aminoacidos o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan a continuacion. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que en la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, el % de identidad = n° de posiciones identicas/n° total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes) x 100). En una realizacion, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matematico. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de dos secuencias, es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBlAsT de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las busquedas de nucleotidos en BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleotidos que son homologas a una molecula de acido nucleico. Las busquedas de protemas en BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos que son homologas a una molecula de protema. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, se puede emplear Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Como alternativa, PSI-Blast se puede utilizar para realizar una busqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moleculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar. Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Otro ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias, es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (version 2.0) que es parte del paquete de programas de alineacion de secuencias CGC. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoacidos, se puede utilizar una tabla de residuos en peso PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Algoritmos adicionales para el analisis de secuencias son conocidos en la tecnica e incluyen ADVANCE y ADAM como se describen en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci, 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opcion de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la busqueda. Si ktup = 2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que se estan comparando, examinando parejas de residuos alineados; si ktup = 1, se examinan aminoacidos alineados individuales. ktup se puede ajustar a 2 o 1 para las secuencias de protemas o de 1 a 6 para secuencias de ADN. El valor por defecto, si ktup no se especifica, es 2 para las protemas y 6 para el ADN. Para una descripcion adicional de los parametros de FASTA, vease
http://bioweb.pasteur.fr/docs/Man/man/fasta.1.html#sect2.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando tecnicas similares a las descritas anteriormente, permitiendo huecos o sin permitirlos. Al calcular el porcentaje de identidad, solo se cuentan las coincidencias exactas.

La presente invencion tambien se refiere a variantes de los polipeptidos. Tales variantes tienen una secuencia de aminoacidos alterada que puede actuar como agonista (mimetico) o como antagonista. Las variantes se pueden generar por mutagenesis, por ejemplo, mutacion puntual discreta o truncamiento. Un agonista puede conservar sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades biologicas de la forma natural de la protema. Un antagonista de una protema puede inhibir una o varias de las actividades de la forma natural de la protema, por ejemplo, mediante una union competitiva a un miembro de una cascada de senalizacion celular, aguas abajo o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aguas arriba, que incluye la protema de interes. Por lo tanto, los efectos biologicos espedficos pueden ser provocados por un tratamiento con una variante de funcion limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biologicas de la forma natural de la protema, puede tener menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma natural de la protema.

Las variantes de una protema que actuan como agonistas (mimeticos) o como antagonistas, se pueden identificar mediante un escrutinio de bancos combinatorios de mutantes, por ejemplo, mutantes por truncamiento, en busca de la protema para la actividad agonista o antagonista. En una realizacion, un banco diversificado de variantes se genera por mutagenesis combinatoria a nivel de acido nucleico y se codifica en una genoteca diversificada. Un banco diversificado de variantes se puede producir, por ejemplo, ligando enzimaticamente una mezcla de oligonucleotidos sinteticos en secuencias de genes, de tal manera que un conjunto degenerado de secuencias de protemas potenciales se puede expresar como polipeptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de protemas de fusion mas grandes (por ejemplo, para la visualizacion en fase). Existe una variedad de metodos que se pueden utilizar para producir bancos de variantes potenciales de los polipeptidos de la invencion, a partir de una secuencia de oligonucleotidos degenerada. Los metodos para sintetizar oligonucleotidos degenerados se conocen en la tecnica (veanse, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res.11:477).

Ademas, los bancos de fragmentos de la secuencia codificante de un polipeptido se pueden utilizar para generar una poblacion diversificada de polipeptidos para escrutar y seleccionar posteriormente las variantes. Por ejemplo, un banco de fragmentos de secuencias codificantes se puede generar mediante el tratamiento de un fragmento de PCR bicatenario de la secuencia codificante de interes, con una nucleasa en condiciones en las que el mellado se produce solo aproximadamente una vez por molecula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir parejas sentido/antisentido de diferentes productos mellados, eliminando porciones monocatenarias de los duplex formados de nuevo mediante tratamiento con nucleasa S1 y ligando el banco de fragmentos resultante en un vector de expresion. Mediante este metodo, se puede obtener un banco de expresion que codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamanos de la protema de interes.

Se conocen varios metodos en la tecnica para escrutar productos genicos de bancos combinatorios preparados por mutaciones puntuales o truncamiento, y para el escrutinio de genotecas de ADNc en busca de productos genicos que tienen una propiedad seleccionada. Las tecnicas empleadas mas ampliamente, que son susceptibles de un analisis de rendimiento elevado, para el escrutinio de genotecas de genes grandes, incluyen tfpicamente la clonacion de la genoteca en vectores de expresion replicables, la transformacion de celulas apropiadas con la genoteca de vectores resultante y la expresion de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la deteccion de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se habfa detectado. La mutagenesis recursiva de conjunto (REM), una tecnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, se puede utilizar en combinacion con los ensayos de escrutinio para identificar variantes de una protema (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Un polipeptido aislado o un fragmento del mismo, se puede utilizar como un inmunogeno para generar anticuerpos usando tecnicas convencionales para la preparacion de anticuerpos monoclonales y policlonales. El polipeptido o la protema de longitud completa se pueden utilizar o, alternativamente, la invencion describe fragmentos de peptidos antigenicos para uso como inmunogenos. El peptido antigenico de una protema comprende al menos 8 (preferiblemente 10, 15, 20 o 30) residuos de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60, e incluye un epttopo de la protema, de tal manera que un anticuerpo generado contra el peptido forma un complejo inmune espedfico con la protema.

Protemas de fusion para uso en las composiciones y los metodos

En cada uno de los aspectos mencionados anteriormente y las realizaciones de la invencion, los polipeptidos de fusion tambien se contemplan espedficamente en el presente documento.

En una realizacion, los polipeptidos de fusion de la invencion se producen mediante tecnicas de ADN recombinante. De forma alternativa a la expresion recombinante, un polipeptido de fusion de la invencion se puede sintetizar qmmicamente usando tecnicas de smtesis de peptidos convencionales. La presente invencion tambien proporciona composiciones que comprenden un polipeptido de fusion de la invencion y un vedculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.

En cada uno de los metodos citados anteriormente, la a1-antitripsina de mamffero o una sustancia inhibidora de la actividad de la proteasa de serina puede formar parte de un polipeptido de fusion, en donde dicho polipeptido de fusion comprende a1-antitripsina de mamffero o una sustancia inhibidora de la actividad de la proteasa de serina y una secuencia de aminoacidos heterologa a dicha a1-antitripsina de mairnfero o sustancia inhibidora de la actividad de la proteasa de serina.

5

10

15

20

25

30

Entre los polipeptidos de fusion particulares de la invention se encuentran, por ejemplo, polipeptidos de fusion que comprenden la secuencia de aminoacidos de la a1-antitripsina representada a continuation en SEQ ID NO: 61.

1 01 01 01 01 0

MPSSVSWGEL LAGLCCLVPV SLAEDPQGDA AQKTDTSHHD

QDHPTFNKIT

PNLAEFAFSL YRQLAHQSNS TNIFFSPVSI ATAFAMLSLG TKADTHDElL 100

EGLNFJSLTEI PEAQIHEGFQ ELLRTLNQPD SQLQLTTGNG LFLSEGLKLV

DKFLEDVKKL YHSEAFTVNF GDHEEAKKQI NDYVEKGTQG

KIVDLVKELD 200

RDTVFALVNY IFFKGKWERP FEVKDTEDED FHVDQVTTVK

VPMMKRLGMF

NIQHCKKLSS WVLLMKYLGN ATAIFFLPDE GKLQHLENEL THDIITKFLE 300

NEDRRSASLH LPKJLSITGTY DLKSVLGQLGITKVFSNGAD LSGVTEEAPL

KLSKAVHKAV LHDEKGTEA AGAMFLEAIP MSIPPEVKFN KPFWLMDBQ 400

NTKSPLFMGK WNPTQK 417

(SEQ ID NO: 61)

Los polipeptidos de fusion de la invencion pueden ser aquellos en los que la secuencia de aminoacidos heterologa comprende una region constante de inmunoglobulina humana, tal como una region constante de IgG1 humana, que incluye una region constante modificada de IgG1 humana, en donde la region constante de IgG1 no se une al receptor de Fc y/o no inicia reacciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

En particular, en una realization, la protema de fusion comprende una secuencia heterologa que es una secuencia obtenida a partir de un miembro de la familia de protemas inmunoglobulinas, por ejemplo, comprende una region constante de inmunoglobulina, por ejemplo, una region constante de inmunoglobulina humana tal como una region constante de IgG1 humana. La protema de fusion, por ejemplo, puede comprender una portion de una a1- antitripsina de mamifero o un polipeptido inhibidor de la actividad proteasa de serina fusionado con el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de una region constante de inmunoglobulina, como se describe, por ejemplo, en el documento de patente de EE.UU. n° 5.714.147, patente de EE.UU. n° 5.116.964, patente de EE.uU. n° 5.514.582, y patente de EE.UU. n° 5.455.165. En aquellas realizaciones en las que todo o una parte de un polipeptido de la invencion se fusiona con secuencias obtenidas a partir de un miembro de la familia de protemas inmunoglobulinas, la region FcR de la inmunoglobulina puede ser de tipo silvestre o mutada. En ciertas realizaciones, es deseable utilizar una protema de fusion de inmunoglobulina que no interaccione con un receptor de Fc y no inicie reacciones de ADCC. En tales casos, la secuencia heterologa de inmunoglobulina de la protema de fusion se puede mutar para inhibir tales reacciones. Veanse, por ejemplo, los documentos de patente de Ee.UU. n° 5.985.279 y WO 98/06248.

La secuencia de aminoacidos heterologa de los polipeptidos de fusion utilizada como parte de la presente invencion, tambien puede comprender una secuencia de aminoacidos util para la identification, el seguimiento o la purification del polipeptido de fusion, por ejemplo, puede comprender una secuencia marcadora FLAG o His. El polipeptido de fusion puede comprender ademas una secuencia de aminoacidos que contiene un sitio de escision proteolrtica que, por ejemplo, puede ser util para la elimination de la secuencia de aminoacidos heterologa de la a1-antitripsina o un inhibidor de un derivado de proteasa de serina o una secuencia mimetica del polipeptido de fusion.

En particular, la secuencia heterologa de aminoacidos de los polipeptidos de fusion de la presente invencion tambien puede comprender una secuencia de aminoacidos util para la identificacion, el seguimiento o la purificacion del polipeptido de fusion, por ejemplo, puede comprender una secuencia marcadora FLAG (vease, por ejemplo, Hoop, T. P. et al., Bio/Technology 6,1204-1210 (1988); Prickett, K. S. et al., BioTechniques 7, 580-589 (1989)) o un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

marcador His (Van Reeth, T. et al., BioTechniques 25, 898-904 (1998)). El polipeptido de fusion puede comprender ademas una secuencia de aminoacidos que contiene un sitio de escision proteolttica que, por ejemplo, puede ser util para la eliminacion de la secuencia de aminoacidos heterologa de la a1-antitripsina de mairnfero o de la secuencia polipeptidica de la actividad de un inhibidor de la proteasa de serina del polipeptido de fusion.

En aun otra realizacion, la a1-antitripsina de mai^ero o la protema de fusion del polipeptido con actividad similar a un inhibidor de la proteasa de serina comprende una protema de fusion GST en donde la a1-antitripsina de mamffero o del polipeptido con actividad de inhibidor de la proteasa de serina se fusiona con el extremo C-terminal de las secuencias de GST. Una protema de fusion de este tipo puede facilitar la purificacion de un polipeptido recombinante de la invencion. En las realizaciones en las que se emplea una estructura artificial de fusion con un marcador GST, FLAG o His en la construccion de la a1-antitripsina de mamffero o las protemas de fusion del polipeptido con actividad de inhibidor de la proteasa de serina, los sitios de escision proteolttica se pueden introducir opcionalmente en la union del resto de fusion y la a1-antitripsina de mamffero o el polipeptido con actividad de inhibidor de la proteasa de serina, para permitir la separacion de la a1-antitripsina de mamffero o el polipeptido con actividad de inhibidor de la proteasa de serina, del resto de fusion, despues de la purificacion de la a1-antitripsina de mamffero o el polipeptido con actividad de inhibidor de la proteasa de serina. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen, por ejemplo, sin limitacion, Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresion de fusion tfpicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith y Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que se pueden usar para fusionar la glutation S-transferasa (GST), la protema que se une a maltosa E o la protema A, respectivamente, con la a1- antitripsina de mamnfero o la protema del polipeptido con actividad de inhibidor de la proteasa de serina diana.

Los vectores de expresion se pueden disenar de forma rutinaria para la expresion de un polipeptido de fusion en celulas procariotas (por ejemplo, E. coli) o celulas eucariotas (por ejemplo, celulas de insecto (utilizando vectores de expresion de baculovirus), celulas de levadura o celulas de marnffero). Las celulas hospedadoras adecuadas se describen adicionalmente en Goeddel, supra. Alternativamente, el vector de expresion recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7.

La expresion de protemas en procariotas se lleva a cabo lo mas frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de protemas de fusion o no fusion. Los vectores de fusion anaden una cantidad de aminoacidos a una protema codificada en ellos, normalmente en el extremo amino-terminal de la protema recombinante. Tales vectores de fusion sirven por regla general para tres fines: 1) aumentar la expresion de la protema recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la protema recombinante; y 3) ayudar en la purificacion de la protema recombinante actuando como ligando en una purificacion por afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresion de fusion, se introduce un sitio de escision proteolftica en la union del resto de fusion y la protema recombinante para permitir una separacion de la protema recombinante desde el resto de fusion, despues de la purificacion de la protema de fusion. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresion de fusion tfpicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Ma) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutation S-transferasa (GST), la protema que se une a maltosa E o la protema A, respectivamente, con la protema recombinante diana.

Ejemplos de vectores de expresion de no fusion de E. coli, adecuados e inducibles, incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresion del gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripcion de una polimerasa de ARN del hospedador a partir de un promotor de fusion trp-lac tnbrido. La expresion del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripcion a partir de un promotor de fusion T7 gn10-lac mediada por una polimerasa de ARN viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresion de la protema recombinante en E. coli, es expresar la protema en una bacteria hospedadora con capacidad alterada para escindir proteoltticamente la protema recombinante (Gottesman, Gene Expression Technology: Metods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de acido nucleico del acido nucleico que se va a insertar en un vector de expresion, de modo que los codones individuales para cada aminoacido sean los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Una alteracion de este tipo de las secuencias de acido nucleico se puede llevar a cabo mediante tecnicas de smtesis de ADN convencionales.

En otra realizacion, el vector de expresion es un vector de expresion de levadura. Ejemplos de vectores para la expresion en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) y pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA).

Alternativamente, el vector de expresion es un vector de expresion de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresion de protemas en celulas de insecto cultivadas (por ejemplo, celulas Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

170:31-39).

En aun otra realizacion, un acido nucleico se expresa en celulas de mairnfero utilizando un vector de expresion de mai^ero. Ejemplos de vectores de expresion de marnfero incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se utiliza en celulas de marnfero, las funciones de control del vector de expresion se proporcionan frecuentemente mediante elementos reguladores vmcos. Por ejemplo, los promotores usados comunmente se obtienen a partir de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresion adecuados tanto para celulas procariotas como eucariotas, veanse los capftulos 16 y 17 de Sambrook et al., supra.

En otra realizacion, el vector de expresion de marnffero recombinante es capaz de dirigir la expresion del acido nucleico, preferentemente en un tipo de celula particular (por ejemplo, los elementos reguladores espedficos de tejido se utilizan para expresar el acido nucleico). Elementos reguladores espedficos de tejido son conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de promotores espedficos de tejido adecuados incluyen el promotor de albumina (espedfico del tngado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores espedficos linfoides (Calame e Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de linfocitos T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983.) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores espedficos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores espedficos del pancreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) y promotores espedficos de la glandula mamaria (por ejemplo, promotor de lactosuero; documento de patente de EE.Uu. n° 4.873.316 y publicacion de Solicitud Europea n° 264.166). Los promotores regulados por el desarrollo estan tambien incluidos, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de alfa-fetoprotema (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Una celula hospedadora puede ser cualquier celula procariota (por ejemplo, E. coli) o eucariota (por ejemplo, celulas de insecto, celulas de levadura o de marnffero).

El ADN del vector se puede introducir en celulas procariotas o eucariotas mediante tecnicas convencionales de transformacion o transfeccion. Tal como se utiliza en esta memoria, los terminos "transformacion" y "transfeccion" se entiende que se refieren a una variedad de metodos reconocidos en la tecnica para introducir acido nucleico extrano en una celula hospedadora, incluyendo la coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfeccion mediada por dextrano DEAE, la lipofeccion o la electroporacion. Los metodos adecuados para transformar o transfectar celulas hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook, et al. (supra), y otros manuales de laboratorio.

Terapias de combinacion para el tratamiento de enfermedades micobacterianas y antrax utilizando las composiciones, el acido nucleico que codifica una protema de fusion y metodos.

En cada uno de los aspectos y realizaciones mencionadas anteriormente, las terapias de combinacion distintas de las enumeradas anteriormente, tambien estan espedficamente contempladas en el presente documento. En particular, las composiciones de la presente invencion se pueden administrar con uno o varios antibioticos macrolidos o no macrolidos, agentes antibacterianos, antifungicidas, agentes antivirales y agentes antiparasitarios, farmacos o agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores.

Ejemplos de antibioticos macrolidos que se pueden utilizar en combinacion con la composicion de la presente invencion incluyen, entre otros, los siguientes compuestos antibioticos microlfdicos sinteticos, semisinteticos o de origen natural: metimicina, neometimicina, YC-17, litorina, eritromicina A a F, oleandomicina, roxitromicina, diritromicina, fluritromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, josamicina, kitasamicina, espiramicina, midecamicina, rokitamicina, miokamicina, lankacidina y los derivados de estos compuestos. Por lo tanto, la eritromicina y los compuestos derivados de eritromicina pertenecen a la clase general de antibioticos conocidos como "macrolidos". Ejemplos de eritromicina y de compuestos de tipo eritromicina preferidos incluyen: eritromicina, claritromicina, azitromicina y troleandomicina.

Antibioticos adicionales, distintos de los antibioticos macrolidos descritos anteriormente, que son adecuados para uso en los metodos descritos en este documento incluyen, por ejemplo, cualquier molecula que tiende a prevenir, inhibir o destruir seres vivos y, como tal y tal como se usa en esta memoria, incluyen agentes antibacterianos, antifungicidas, agentes antivirales y agentes antiparasitarios. Estos agentes se pueden aislar a partir de un organismo que produce el agente o adquirir a partir de una fuente comercial (por ejemplo, una comparMa farmaceutica, como Eli Lilly, Indianapolis, Ind.; Sigma, St. Louis, Mo.).

Por ejemplo, el antibiotico anti-TB isoniacida (hidrazida de acido isonicotmico) es eficaz frecuentemente, pero la isoniazida causa frecuentemente hepatitis grave, a veces mortal. El riesgo de hepatitis se incrementa con la edad del paciente. Ademas, la isoniazida causa neuropatfa periferica en algunos receptores de una manera relacionada con la dosis. La rifampicina, otro antibiotico usado para tratar la TB, se debe utilizar junto con otro farmaco tal como la isoniazida. Este requisito de una terapia de combinacion con rifampicina se aplica al tratamiento inicial, asf como a la repeticion del tratamiento de la TB pulmonar.

Por lo general, la isoniacida, rifampicina, etambutol y etionamida se administran por via oral. La estreptomicina se suele administrar por via intramuscular. La amikacina se administra por via intramuscular o intravenosa. La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

clofazimina, que tambien se utiliza para el tratamiento de la lepra, se administra por via oral.

La amikacina es un antibiotico aminoglucosido semisintetico obtenido a partir de la kanamicina A. Para su preparacion, vease el documento de Patente de EE.UU. n° 3.781.268. Para una revision, vease Kerridge, Pharmacological and Biochemical Properties of Drug Substances 1:125-153, M. E. Goldberg, compilador (1977). La amikacina se administra generalmente por via intramuscular o intravenosa. Para obtener una informacion adicional, incluyendo farmacologfa clmica, indicaciones, efectos secundarios y dosis, consulte Physicians Desk, 42 ed. (1988) en las paginas 744-746 (en lo sucesivo, PDR).

La clofazimina es un agente antibacteriano tambien conocido como LAMPRENE.RTM. Para su preparacion, vease Barry, et al., Nature 179:1013 (1957). Para una revision, vease Karat, et al., Brit. Med. J. 3:175 (1971). La clofazimina se administra en general por via oral. Para obtener una informacion adicional, incluyendo farmacologfa clmica, precauciones y dosificaciones, vease el PDR en la pagina 982.

La etionamida es un agente antibacteriano tambien conocido como AMIDAZINE.RTM. y TRECATOR.RTM. Vease el documento de patente britanica n° 800.250. Este farmaco se suele administrar por via oral. Para mas informacion, incluyendo las precauciones y las dosificaciones, vease el PDR en la pagina 2310.

La ciprofloxacina es un agente antibacteriano sintetico de amplio espectro para uso oral. Tambien se conoce como CIPRO.RTM. Se suele administrar en dosificaciones diarias totales de 500 a 1.000 miligramos que por lo general se administran en 2 dosis iguales en 24 horas. Para mas informacion, vease el PDR (1989) en las paginas 1441-1443. Otro miembro de esta clase de antibioticos fluoroquinolonas incluye ofloxacina, levofloxacina, troveofloxacina, pefloxacina, gatifloxacina y moxifloxacina.

Otros ejemplos de agentes antibioticos antibacterianos incluyen, pero no se limitan a, penicilinas, cefalosporinas, carbacefems, cefamicinas, carbapenems, monobactamas, aminoglucosidos, glucopeptidos, quinolonas, tetraciclinas, macrolidos, oxazalidinonas y fluoroquinolonas. Ejemplos de agentes antibioticos incluyen, pero no se limitan a, Penicilina G (Registro CAS n°: 61-33-6); Meticilina (Registro CAS n°: 61-32-5); Nafcilina (Registro CAS n°: 147-52-4); Oxacilina (Registro CAS n°: 66-79-5); Cloxacilina (Registro CAS n°: 61-72-3); Dicloxacilina (Registro CAS n°: 311676-5); Ampicilina (Registro CAS n°: 69-53-4); Amoxicilina (Registro CAS n°: 26787-78-0); Ticarcilina (Registro CAS n°: 34787-01-4); Carbenicilina (Registro CaS n°: 4697-36-3); Mezlocilina (Registro CAS n°: 51481-65-3); Azlocilina (Registro CAS n°: 37091-66-0); Piperacilina (Registro CAS n°: 61477-96-1); Imipenem (Registro CAS n°: 74431-235); Aztreonam (Registro CAS n°: 78110-38-0); Cefalotina (Registro CAS n°: 153-61-7); Cefazolina (Registro CAS n°: 25953-19-9); Cefaclor (Registro CAS n°: 70356-03-5); Formiato sodico de cefamandol (Registro CAS n°: 42540-409); Cefoxitina (Registro CAS n°: 35607-66-0); Cefuroxima (Registro CAS n°: 55268-75-2); Cefonicida (Registro CAS n°: 61270-58-4); Cefmetazol (Registro CAS n°: 56796-20-4); Cefotetan (Registro CAS n°: 69712-56-7); Cefprozil (Registro CAS n°: 92665-29-7); Loracarbef (Registro CAS n°: 121961-22-6); Cefetamet (Registro CAS n°: 65052-633); Cefoperazona (Registro CAS n°: 62893-19-0); Cefotaxima (Registro CAS n°: 63527-52-6); Ceftnaxim (Registro CAS n°: 68401-81-0); Ceftriaxona (Registro cAs n°: 73384-59-5); Ceftazidima (Registro CaS n°: 72558-82-8); Cefepima (Registro CAS n°: 88040-23-7); Cefixima (Registro CAS n°: 79350-37-1); Cefpodoxima (Registro CAS n°: 80210-62-4); Cefsulodina (Registro cAs n°: 62587-73-9); Fleroxacina (Registro CAS n°: 79660-72-3); Acido nalidfxico (Registro CAS n°: 389-08-2); Norfloxacina (Registro CAS n°: 70458-96-7); Ciprofloxacina (Registro CAS n°: 85721-33-1); Ofloxacina (Registro cAs n°: 82419-36-1); Enoxacina (Registro CAS n°: 74011-58-8); Lomefloxacina (Registro CAS n°: 98079-51-7); Cinoxacina (Registro cAs n°: 28657-80-9); Doxiciclina (Registro CAS n°: 564-25-0); Minociclina (Registro CAS n°: 10118-90-8); Tetraciclina (Registro CAS n°: 60-54-8); Amikacina (Registro CAS n°: 37517-28-5); Gentamicina (Registro CAS n°: 1403-66-3); Kanamicina (Registro CAS n°: 8063-07-8); Netilmicina (Registro CAS n°: 56391-56-1); Tobramicina (Registro cAs n°: 32986-56-4); Estreptomicina (Registro CAS n°: 5792-1); Azitromicina (Registro CAS n°: 83905-01-5); Claritromicina (Registro CAS n°: 81103-11-9); Eritromicina (Registro CAS n°: 114-07-8); Estolato de eritromicina (Registro CAS n°: 3521-62-8); Succinato etilico de eritromicina (Registro CAS n°: 41342-53-4); Glucoheptonato de eritromicina (Registro CAS n°: 23067-13-2); Lactobionato de eritromicina (Registro CAS n°: 3847-29-8); Estearato de eritromicina (Registro CAS n°: 643-22-1); Vancomicina (Registro CAS n°: 1404-90-6); Teicoplanina (Registro CAS n°: 61036-64-4); Cloranfenicol (Registro CAS n°: 56-757); Clindamicina (Registro cAs n°: 18323-44-9); Trimetoprim (Registro CaS n°: 738-70-5); Sulfametoxazol (Registro CAS n°: 723-46-6); Nitrofurantoma (Registro CAS n°: 67-20-9); Rifampicina (Registro CAS n°: 13292-46-1); Mupirocina (Registro CAS n°: 12650-69-0); Metronidazol (Registro CAS n°: 443-48-1); Cefalexina (Registro CAS n°: 15686-71-2); Roxitromicina (Registro CAS n°: 80214-83-1); Coamoxiclavuanato; combinaciones de Piperacilina y Tazobactam; y sus sales, acidos, bases diversas y otros derivados.

Los agentes antifungicos incluyen, pero no se limitan a, caspofungina, clorhidrato de terbinafina, nistatina, anfotericina B, griseofulvina, ketoconazol, nitrato de miconazol, flucitosina, fluconazol, itraconazol, clotrimazol, acido benzoico, acido salidlico y sulfuro de selenio.

Los agentes anti-virales incluyen, pero no se limitan a, valganciclovir, clorhidrato de amantadina, rimantadina, aciclovir, famciclovir, foscarnet, ganciclovir sodico, idoxuridina, ribavirina, sorivudina, trifluridina, valaciclovir, vidarabina, didanosina, estavudina, zalcitabina, zidovudina, interferon alfa y edoxudina.

Los agentes antiparasitarios incluyen, pero no se limitan a, piretrinas/butoxido de piperonilo, permetrina, iodoquinol,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

metronidazol, citrato de dietilcarbamazina, piperazina, pamoato de pirantel, mebendazol, tiabendazol, praziquantel, albendazol, proguanil, inyeccion de gluconato de quinidina, sulfato de quinina, fosfato de cloroquina, clorhidrato de mefloquina, fosfato de primaquina, atovacuona, cotrimoxazol (sulfametoxazol/trimetoprim) e isetionato de pentamidina.

En otro aspecto, en el metodo descrito en el presente documento, se puede, por ejemplo, complementar la composicion mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o varios farmacos o agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores. Por "farmacos o agentes inmunomoduladores", se entiende, por ejemplo, agentes que actuan sobre el sistema inmune, directa o indirectamente, por ejemplo, mediante una estimulacion o supresion de una actividad celular de una celula en el sistema inmune, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, macrofagos o celulas presentadoras de antfgenos (APC) o que actuan sobre componentes externos del sistema inmune que, a su vez, estimulan, suprimen o modulan el sistema inmune, por ejemplo, hormonas, agonistas o antagonistas de receptores y neurotransmisores; los inmunomoduladores pueden ser, por ejemplo, inmunosupresores o inmunoestimulantes. Por "farmacos antiinflamatorios", se entiende, por ejemplo, agentes que tratan respuestas inflamatorias, es decir, una reaccion tisular frente a una lesion, por ejemplo, agentes que tratan el sistema inmune, vascular o linfatico.

Los farmacos o agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adecuados para uso en esta invencion incluyen, pero no se limitan a, derivados de interferon, por ejemplo, betaseron, interferon beta; derivados de prostano, por ejemplo, compuestos descritos en el documento PCT/DE93/0013, por ejemplo, iloprost, cicaprost; glucocorticoides, por ejemplo, cortisol, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona; inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, FK-506, metoxsaleno, talidomida, sulfasalazina, azatioprina, metotrexato; inhibidores de lipoxigenasa, por ejemplo, zileuton, MK-886, WY-50295, SC-45662, SC-4166lA, BI-L-357; antagonistas de leucotrienos, por ejemplo, compuestos descritos en los documentos DE 40091171 de solicitud de patente alemana P 42 42 390.2; WO 9201675; SC-41930; SC-50605; SC-51146; LY 255283 ((D. K. Herron et al., FASEB J. 2: Abstr. 4729,1988); LY 223982 (D. M. Gapinski et al. J. Med. Chem. 33: 2798-2813, 1990); U-75302 y analogos, por ejemplo, descritos por J. Morris et al., Tetrahedron Lett. 29: 143-146, 1988, C. E. Burgos et al., Tetrahedron Lett. 30: 5081-5084, 1989; B. M. Taylor et al., Prostaglandins 42: 211-224, 1991; compuestos descritos en el documento de Patente de EE.UU. n° 5.019.573; ONO-LB-457 y analogos, por ejemplo, descritos por K. Kishikawa et al., Adv. Prostagl. Thombox. Leukotriene Res. 21:407-410, 1990; M. Konno et al., Adv. Prostagl. Thrombox. Leukotriene Res. 21: 411-414, 1990; WF-11605 y analogos, por ejemplo, descritos en el documento de Patente de EE.UU. n° 4.963.583; compuestos descritos en los documentos WO 9118601, WO 9118879; WO 9118880, WO 9118883, sustancias antiinflamatorias, por ejemplo, NPC 16570, NPC 17923 descritas por L. Noronha-Blab. et al., Gastroenterology 102 (Supl.): A 672,1992; NPC 15669 y analogos descritos por R. M. Burch et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 355-359, 1991; S. Pou et al., Biochem. Pharmacol. 45: 2123-2127, 1993; derivados de peptidos, por ejemplo, ACTH y analogos; receptores solubles de TNF; anticuerpos de TNF; receptores solubles de interleucinas, otras citocinas, protemas de linfocitos T; anticuerpos contra receptores de interleucinas, otras citocinas y protemas de linfocitos T.

Los agentes terapeuticos se pueden usar para el tratamiento de sujetos animales o pacientes y, mas preferiblemente, mairnferos, incluyendo seres humanos, asf como marnfferos tales como primates no humanos, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, cobayas y roedores.

Modos de administracion

Los modos de administracion de los diferentes agentes terapeuticos empleados en la invencion se ejemplifican a continuacion. Sin embargo, los agentes se pueden administrar a traves de cualquiera entre una variedad de vfas que incluyen: mediante inyeccion (por ejemplo, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal), mediante infusion intravenosa continua, de forma cutanea, dental, transdermica, oral (por ejemplo, comprimido, pfldora, medicamento lfquido), por medio de bombas osmoticas implantadas (por ejemplo, Alza Corp.), mediante un supositorio o una pulverizacion de aerosol.

Los inhibidores de la proteasa de serina basados en peptidos se pueden preparar por cualquier metodo de smtesis adecuado, tal como se ha descrito originalmente en Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, p 2149 (1963). Los peptidos sinteticos que presentan una actividad inhibidora frente a las proteasas de serina y los metodos para preparar y usar los mismos, se describen, por ejemplo, en los documentos de patente de EE.UU. n° 4.829.052, 5.157.019 de Glover; patente de EE.UU. n° 5.420.110 de Miller; patente de EE.UU. n° 4.963.654 de Katunuma.

Los expertos en la tecnica de smtesis bioqmmica reconoceran que para cantidades de peptidos a escala comercial, tales peptidos se preparan preferiblemente usando tecnicas de ADN recombinante, tecnicas sinteticas o derivatizacion qmmica de peptidos sintetizados biologica o qmmicamente.

Los compuestos descritos en el presente documento se utilizan como agentes terapeuticos en el tratamiento de un estado fisiologico (especialmente patologico) causado, en su totalidad o en parte, por una actividad excesiva de la proteasa de serina. Los peptidos se pueden administrar como peptidos libres o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los terminos utilizados en el presente documento se ajustan a los encontrados en Budavari, Susan (compilador), "The Merck Index" An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals; Merck & Co., Inc. La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales de adicion de acido o complejos metalicos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de los peptidos que no afectan de manera significativa o adversamente a las propiedades terapeuticas (por ejemplo, eficacia, toxicidad, etc.) de los peptidos. Los peptidos se deben administrar a los individuos como una composicion farmaceutica que, en la mayona de los casos, incluira el peptido y/o sales farmaceuticas del mismo con un vetnculo farmaceuticamente aceptable. La expresion "vetnculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellos vehnculos solidos y Kquidos que no afectan de manera significativa o adversa a las propiedades terapeuticas de los peptidos.

Las composiciones farmaceuticas que contienen peptidos se pueden administrar a individuos, particularmente a seres humanos, ya sea por via intravenosa, subcutanea, intramuscular, intranasal, oral, topica, transdermica, parenteral, gastrointestinal, transbronquial y transalveolar. La administracion topica se lleva a cabo a traves de una crema, gel, enjuague, etc., aplicado topicamente, que contiene cantidades terapeuticamente eficaces de inhibidores de proteasas de serina. La administracion transdermica se lleva a cabo mediante la aplicacion de una crema, enjuague, gel, etc., capaz de permitir que los inhibidores de proteasas de serina penetren a traves de la piel y entren en el torrente sangumeo. Las vfas parenterales de administracion incluyen, pero no se limitan a, inyeccion directa tal como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea. Las rutas gastrointestinales de administracion incluyen, pero no se limitan a, ingestion y rectal. Las vfas de administracion transbronquial y transalveolar incluyen, pero no se limitan a, inhalacion, ya sea a traves de la boca o por via intranasal y la inyeccion directa en una via aerea, tal como mediante traqueotoirna, traqueostoirna, tubo endotraqueal o dosis medida o inhalador continuo. Ademas, se pueden emplear bombas osmoticas para la administracion. La dosificacion necesaria variara con la afeccion particular que se va a tratar, el metodo de administracion y la tasa de aclaramiento de la molecula desde el cuerpo.

Aunque los compuestos descritos en este documento y/o sus derivados se pueden administrar como productos qrnmicos puros, es preferible presentar el ingrediente activo como una composicion farmaceutica. De este modo, la invencion describe adicionalmente el uso de una composicion farmaceutica que comprende uno o varios compuestos y/o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, junto con, por lo tanto, uno o varios vehnculos farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapeuticos y/o profilacticos. El o los vehnculos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composicion y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos.

Las composiciones farmaceuticas incluyen las adecuadas para una administracion oral o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutanea, cutanea, por inhalacion e intravenosa). Las composiciones se pueden presentar convenientemente, en su caso, en formas de dosificacion unitarias discretas y se pueden preparar por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de farmacia. Tales metodos incluyen la etapa de asociar el compuesto activo con vehnculos lfquidos, matrices solidas, vehnculos semisolidos, vehnculos solidos finamente divididos o combinaciones de los mismos, y luego, si es necesario, conformando el producto en el sistema de administracion deseado.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para una administracion oral se pueden presentar como formas de dosificacion unitarias discretas, tales como capsulas de gelatina duras o blandas, sellos o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en forma de polvo o como granulos; como una solucion, una suspension o como una emulsion. El ingrediente activo tambien se puede presentar como un bolo, electuario o pasta. Los comprimidos y las capsulas para administracion oral pueden contener excipientes convencionales, tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, desintegrantes o agentes humectantes. Los comprimidos se pueden revestir de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, con revestimientos entericos.

Las preparaciones lfquidas orales pueden estar en forma, por ejemplo, de una suspension acuosa u oleosa, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar como un producto seco para constituir con agua u otro vetnculo adecuado antes del uso. Tales preparaciones lfquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspension, agentes emulsionantes, vehnculos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles) o conservantes. Los compuestos tambien se pueden formular para una administracion parenteral (por ejemplo, mediante inyeccion, por ejemplo, inyeccion de bolo o infusion continua) y se pueden presentar en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, recipientes de infusion de bolo pequeno o en recipientes de dosis multiples con un conservante anadido. Las composiciones pueden estar en formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehnculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido mediante aislamiento aseptico de un solido esteril o mediante liofilizacion de la solucion, para constituir con un vetnculo adecuado, por ejemplo, agua esteril, exenta de pirogenos, antes del uso.

Para la administracion topica en la epidermis, los compuestos se pueden formular como pomadas, cremas o lociones, o como el ingrediente activo de un parche transdermico. Los sistemas de administracion transdermica adecuados se describen, por ejemplo, en Fisher et al. (documento de Pat. de EE.UU. n° 4.788.603) o Bawas et al. (documentos de Patente de eE.uU. n° 4.931.279, 4.668.504 y 4.713.224). Los unguentos y las cremas se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adicion de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y en general tambien contendran uno o varios agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspension, agentes espesantes o agentes colorantes. El ingrediente activo tambien se puede administrar a traves de iontoforesis, por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ejemplo, como se describe en los documentos de Patente de EE.UU. n° 4.140.122, 4.383.529 o 4.051.842. Son posibles al menos dos tipos de liberacion en estos sistemas. La liberacion mediante difusion tiene lugar cuando la matriz no es porosa. El compuesto farmaceuticamente eficaz se disuelve y difunde a traves de la propia matriz. La liberacion mediante flujo microporoso tiene lugar cuando el compuesto farmaceuticamente eficaz es transportado a traves de una fase lfquida en los poros de la matriz.

Las composiciones adecuadas para una administracion topica en la boca incluyen formas de dosificacion unitarias tales como pastillas para chupar que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; geles mucoadherentes y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vetuculo lfquido adecuado.

Cuando se desea, las composiciones descritas anteriormente se pueden adaptar para proporcionar una liberacion sostenida del ingrediente activo empleado, por ejemplo, mediante una combinacion de las mismas con ciertas matrices de polfmero hidrofilo, por ejemplo, que comprenden geles naturales, geles polimericos sinteticos o mezclas de los mismos.

Las composiciones farmaceuticas tambien pueden contener otros adyuvantes tales como agentes aromatizantes, colorantes, antimicrobianos o conservantes.

Se apreciara ademas que la cantidad del compuesto, o de una sal activa o un derivado del mismo, requerida para uso en el tratamiento, variara no solo con la sal particular seleccionada, sino tambien con la via de administracion, la naturaleza de la afeccion que se esta tratando y la edad y el estado del paciente, y se seleccionara, en ultima instancia, a discrecion del medico encargado.

Una composicion farmaceutica contiene un vetuculo aceptable, farmaceuticamente adecuado como se ha definido anteriormente. Estas composiciones pueden estar en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. Los vehfculos farmaceuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 1990, pags. 1519-1675, Gennaro, A. R., compilador, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Las moleculas inhibidoras de la proteasa de serina de la invencion se pueden administrar en liposomas o polfmeros (vease, Langer, R. Nature 1998, 392, 5). Tales composiciones contendran una cantidad terapeutica eficaz del compuesto activo junto con una cantidad adecuada de vetuculo, con el fin de proporcionar la forma para una administracion apropiada al sujeto.

En general, el compuesto se administra convenientemente en una forma de dosificacion unitaria; por ejemplo, que contiene de 5 a 2000 mg, convenientemente de 10 a 1000 mg, mas convenientemente de 50 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosificacion unitaria.

Los niveles en sangre deseables se pueden mantener mediante una infusion continua para proporcionar aproximadamente 0,01-5,0 mg/kg/h o mediante infusiones intermitentes que contienen aproximadamente 0,4-20 mg/kg del o de los ingredientes activos. Tampones, conservantes, antioxidantes y similares se pueden incorporar segun se requiera.

La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una dosis unica o como dosis divididas, administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, tal como dos, tres, cuatro o mas subdosis al dfa. La subdosis en sf misma se puede dividir adicionalmente, por ejemplo, en una cantidad de administraciones discretas, espaciadas libremente, tales como inhalaciones multiples desde un insuflador o mediante aplicacion de una pluralidad de gotas en el ojo.

Los niveles de dosificacion reales de ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas pueden variar de modo que se obtiene una cantidad del o de los compuestos activos que es eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composiciones y modo de administracion particulares. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de la actividad del compuesto farmaceutico particular o del analogo del mismo, la via de administracion, la gravedad de la afeccion a tratar y el estado y la historia medica previa del paciente que esta siendo tratado. Sin embargo, esta dentro de la experiencia de la tecnica comenzar con dosis del compuesto farmaceutico a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado.

Las composiciones farmaceuticas se pueden usar tanto en medicina veterinaria como en terapia humana. La magnitud de una dosis profilactica o terapeutica de la composicion farmaceutica en el tratamiento agudo o cronico del dolor asociado con las enfermedades o indicaciones mencionadas anteriormente, variara con la gravedad de la afeccion a tratar y la via de administracion. La dosis y quizas la frecuencia de la dosis, tambien variaran segun la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. En general, el intervalo de dosis diaria total de la composicion farmaceutica esta generalmente entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg, preferiblemente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg, y mas preferiblemente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg de compuesto activo por kilogramo de peso corporal por dfa, administrados a un paciente mamffero. Si se desea, la dosis diaria eficaz se puede dividir en multiples dosis para fines de administracion, por ejemplo, de dos a cuatro dosis separadas al dfa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Alternativamente, el intervalo de dosis diaria total del ingrediente activo de esta invencion se mantiene para que sea suficiente para aumentar la concentracion serica del inhibidor de proteasas en 10-100 micromolar.

En este documento se entiende que, al mencionar tales rangos especificados, los rangos citados tambien incluyen todas aquellas cantidades del intervalo de la dosis entre el intervalo citado. Por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 a 100, se entiende que incluye 2 a 99, 3-98, etc., sin mencionar realmente cada intervalo espedfico. Las cantidades reales preferidas del ingrediente activo variaran con cada caso, de acuerdo con la especie de mairnfero, la naturaleza y la gravedad de la afeccion particular que se va a tratar, y el metodo de administracion.

Tambien se entiende que las dosis dentro de esos intervalos, pero que no se mencionan explfcitamente, tales como 30 mg, 50 mg, 75 mg, etc., estan incluidas en los intervalos establecidos, ya que son cantidades ligeramente fuera de los lfmites indicados del intervalo.

Las cantidades reales preferidas del ingrediente activo variaran con cada caso, de acuerdo con la especie de mamffero, la naturaleza y la gravedad de la afeccion particular que se va a tratar, y el metodo de administracion.

En general, las composiciones farmaceuticas se administran periodicamente a un paciente individual segun sea necesario para mejorar los smtomas de la enfermedad particular que se esta tratando. La duracion del tiempo durante el cual se administran las composiciones y la dosificacion total, variaran necesariamente con cada caso, de acuerdo con la naturaleza y la gravedad de la afeccion particular que se va a tratar y el estado ffsico del sujeto o del paciente que recibe tal tratamiento.

Se recomienda ademas que los ninos, los pacientes mayores de 65 anos y aquellos con una funcion renal o hepatica deteriorada, reciban inicialmente dosis bajas, y que luego se valoren basandose en la o las respuestas individuales o niveles en sangre. En algunos casos, puede ser necesario emplear dosificaciones fuera de estos intervalos, como sera evidente para los expertos ordinarios en la tecnica. Ademas, se observa que el especialista o el medico del tratamiento sabra, solo con una experimentacion rutinaria, como y cuando interrumpir, ajustar o terminar la terapia conjuntamente con la respuesta individual del paciente.

Las dosificaciones utiles de los compuestos de la presente invencion se pueden determinar mediante la comparacion de su actividad in vitro y su actividad in vivo en modelos animales. Los metodos para la extrapolacion de las dosificaciones eficaces en ratones y otros animales, en los seres humanos son conocidos en la tecnica; por ejemplo, vease el documento de Patente de EE.UU. n° 4.938.949.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos espedficos se proporcionan para auxiliar mejor al lector en relacion con varios aspectos de la practica de la presente invencion. Ya que estos ejemplos espedficos son meramente ilustrativos, no se debe interpretar en modo alguno que nada de las siguientes descripciones sea limitante de la invencion. Tales limitaciones se definen, por supuesto, unicamente por las reivindicaciones acompanantes.

Ejemplo Uno

Efecto de a1-antitripsina sobre una infeccion con Complejo Mycobacterium Avium (MAC) de macrofagos derivados de monocitos humanos

1. Los organismos con TB o MAC se suspendieron a una concentracion de un estandar de McFarland. Un McFarland se define como un grado de turbidez de organismos suspendidos en un lfquido que coincide con el de una parte aKcuota estandar. Laturbidez de una muestra que es equivalente a la del estandar de McFarland representa aproximadamente 10 bacilos/ml. La duracion optima de un cultivo de prueba es de aproximadamente 10-12 dfas de bacilos cultivados en medio Middlebrook 7H9 (= medio micobacteriano).

2. Infeccion de las celulas. Las celulas infectadas eran macrofagos humanos derivados de monocitos (MDM). Los MDM se aislaron a partir de celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) que se obtuvieron a partir de sangre heparinizada de voluntarios sanos, mediante centrifugacion de la sangre heparinizada sobre una almohadilla de Ficol-Hypaque. Las PBMC aisladas se dividieron en partes alfcuotas en placas de cultivo tisular de poliestireno y se permitio que los monocitos se adhirieran X 2 horas (0,5 X 106 PBMC se anadieron a cada pocillo, de las cuales aproximadamente 10 a 20% eran monocitos). Los experimentos se realizaron en placas con o sin cubreobjetos de vidrio esteriles, redondos en el fondo de los pocillos (vease a continuacion). Solo la poblacion de monocitos dentro de las PBMC se adhiere a las placas en estas condiciones. A continuacion, se lavaron los pocillos (para eliminar los linfocitos no adherentes) y se incubaron en medio de nuevo aporte X 10-12 dfas (medio = RPMI + 10% de suero de ternera fetal + 100 unidades/ml de penicilina G), lo que permite la maduracion de los monocitos en macrofagos. El volumen de medio en cada pocillo era de 1,0 ml. Despues el medio se retiro de cada pocillo de MDM, y los pocillos se rellenaron con medio solo (control), con AAT o con ala-ala-pro-val-clorometil cetona (un inhibidor sintetico de la proteasa de serina similar a AAT) (Bachem, Inc.), y los pocillos se incubaron durante 3,0 h. A continuacion, los MDM en cada pocillo se infectaron con MAC (cepa de Mycobacterium avium 9141) o TB (cepa H37RV) en una

5

10

15

20

25

30

35

40

proporcion de bacilos micobacterianos/celula de 1 X 106. Despues de 1 h de incubacion (para permitir que las micobacterias se unan a las superficies de MDM), se retiro el material sobrenadante y se guardo para ensayos de citocinas. Los pocillos se lavaron despues dos veces (con una solucion 1:1 de RPMl y solucion salina),

A continuacion, se realizaron dos ensayos independientes para cuantificar la infeccion micobacteriana de los macrofagos derivados de monocitos humanos:

a. Observacion directa y recuento del numero de celulas infectadas en cada pocillo

Para estos experimented, los MDM infectados con micobacterias se cultivaron en pocillos de una placa de cultivo tisular de poliestireno que tema cubreobjetos de vidrio redondos esteriles, insertados en el fondo de los pocillos. Ya que los MDM se habfan sembrado inicialmente sobre estos cubreobjetos, los MDM se adhenan a las superficies de los cubreobjetos. Despues de la incubacion con MAC o TB, los pocillos se lavaron dos veces (como se ha indicado anteriormente) y despues se fijaron X 1 h utilizando glutaraldetedo. Las micobacterias se tineron despues, utilizando una tincion de micobacterias (Zeihl-Nielsson) sin danar las celulas. El numero de celulas infectadas se cuantifico opticamente y los datos se expresaron como un porcentaje del numero total de MDM en cada pocillo.

b. Recuento de colonias

Despues de lavar dos veces las celulas infectadas (vease arriba), las celulas en pocillos paralelos que no conteman cubreobjetos se lisaron usando 1,0 ml de tampon de lisis por pocillo durante 5,0 min (0,25% de tampon de lisis sDKF).

Despues de lisar los MDM infectados (vease mas arriba), el fluido del lisado se diluyo 1:1 con 1,0 ml de medio 7H9. La suspension de micobacterias se diluyo en serie 1:10 en 1% (vol/vol) de medio 7H9 y agua esteril. Las suspensiones micobacterianas diluidas se agitaron en vortice y despues 0,5 ml de la suspension de cada parte alteuota se sembro en placas sobre medio de micobacterias (medio 7H9 solido). Este Uquido que contema micobacterias se cultivo a continuacion. Las placas se incubaron durante 10-12 dfas para MAC y durante 21-24 dfas para la tuberculosis, y se hizo un recuento del numero de colonias de micobacterias.

Resultados:

Tuberculosis

Datos de la observacion directa

Control de MDM (sin AAT)a MDM expuestos a AAT (5,0 mg/ml) Experimento 1 20% 4%

Experimento 2 17% 6%

a porcentaje de celulas infectadas con m. tuberculosis.

Datos del recuento de colonias

En un experimento distinto, se cultivo TB asociada a celulas para confirmar de forma independiente el efecto inhibidor de AAT. Los recuentos de TB por ml eran 1,6 x 105 por ml en los cultivos de control de MDM y 0,57 X 105 por ml en los cultivos expuestos a AAT, un efecto inhibidor del 64% debido a la presencia de AAT.

Complejo Mycobacterium Avium

Se utilizaron los organismos micobacterianos relacionadas, conocido como Complejo Mycobacterium Avium (MAC). MAC es importante porque es la causa principal de enfermedades infecciosas en pacientes con SIDA. Tambien es un problema complicado en las personas normales que contraen esta infeccion; es muy difteil de tratar y a veces es imposible de tratar con farmacos antimicrobianos actuales. El uso de AAT o de una molecula de similar a AAT puede representar un nuevo medio para una terapia de estas infecciones.

Datos de la observacion directa

MDM de control (sin AAT)a MDM expuestos a AAT (5,0 mg/ml) Experimento 1 17% 10%

a porcentaje de celulas infectadas con m. tuberculosis.

Datos del recuento de colonias

La Figura 1 muestra los resultados de 4 experimentos distintos que muestran que AAT bloquea significativamente la

10

15

20

25

30

35

infeccion de MDM con MAC, con un efecto medio de aproximadamente 55% de inhibicion. Estos experimentos se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. El mimetico de AAT se refiere a ala-ala-pro-val-clorometil cetona (un inhibidor sintetico de la proteasa de serina similar a AAT) (Proveedor: Bachem). Los resultados con el mimetico de AAT confirman los datos de AAT utilizando una especie independiente, y proporcionan una prueba de que el concepto de inhibir las proteasas de serina para el tratamiento de infecciones micobacterianas, se extiende a los inhibidores de molecula pequena que hacen que los farmacos candidatos sean atractivos.

En los mismos cultivos descritos anteriormente, se midio la concentracion de la citocina pro-inflamatoria TNFa. Como se muestra en la figura 2 y la figura 3, AAT y el mimetico de AAT inhibfan significativamente la produccion de TNFa en los cultivos de MDM hasta en un 100%. El bloqueo de la produccion de citocinas proinflamatorias puede representar un mecanismo adicional a traves del cual los inhibidores de la proteasa de serina bloquean la infeccion con TB y con MAC.

Ejemplo Dos

Estudio clinico en la infeccion con MAC

Los datos in vitro descritos anteriormente usando MAC se han complementado con un estudio clmico. En esta investigacion clmica, fenotipos AAT (formas alternativas de la protema AAT) se evaluaron en pacientes con infeccion pulmonar documentada con MAC y que teman enfermedad pulmonar. Estos pacientes se compararon con un grupo de control que consistfa en pacientes con la enfermedad pulmonar bronquiectasia (con el fin de mostrar que la presencia de una enfermedad pulmonar por sf sola no contaba para la presencia de una infeccion con MAC).

N = 134 sujetos: Infeccion con MAC (pulmones) Bronquiectasia (enfermedad pulmonar) Valor de P

Sexo

Masculino: 8,97% 23,21%

Femenino: 91,3% 76,79%

Edad (media): 64,5 anos 64,0 anos

Fenotipo AAT (% de anormal): 0,006

Si: 27,7% 5,3%

NO: 72,3% 94,7%

Observese en esta tabla que en el grupo de control (bronquiectasia), la proporcion de pacientes con moleculas anormales de AAT es 5,3%. Esto contrasta notoriamente con el caso en el grupo infectado con MAC, en donde la proporcion es de 27,7%, un aumento de 5,2 veces. Los pacientes infectados con MAC eran 5,2 veces mas propensos que el grupo de control a albergar una forma anormal de AAT. Esto establece una relacion clmica entre las moleculas de AAT anormales y la infeccion con MAC. Por tanto, el papel inhibitorio de AAT normal que descubrimos in vitro, se confirma en los pacientes.

Ejemplo Tres

Efecto de la alfa-1-antitripsina sobre la produccion de interleucina-1 beta estimulada en sangre humana completa

Diseno: la venopuncion se realizo en 3 voluntarios sanos utilizando una aguja de calibre 21, y la sangre venosa se aspiro en un tubo heparinizado. A continuacion, la sangre se dividio en partes almuotas en tubos de polipropileno de 6 mililitros y se diluyo 1:4 con medio de cultivo tisular RPMI esteril solo (control), se diluyo 1:4 en medio que contema Staphilococcus epidermidis destruidos termicamente en una concentracion final de 1:1000 como estfmulo (Staph) o en tubos que conteman Staphilococcus epidermidis y alfa-1-antitripsina (AAT, Aralast® de Baxter). Todos los cultivos se incubaron despues 24 horas a 37°C/5% de CO2). Despues de la incubacion, las muestras se centrifugaron X 1.500 g, y se recogio el material sobrenadante. El material sobrenadante se sometio ensayo con respecto a la concentracion de interleucina-1 beta, usando un aparato electroquimioluminiscente validado que cuantifica las protemas citocinas.

RESULTADOS: Los datos se presentan como la media ± SEM de produccion de interleucina-1 beta, y los valores se muestran en el eje vertical. Como se muestra, AAT inhibia significativamente la produccion de interleucina-1 beta estimulada con Staph de forma dependiente de la dosis, y se observo inhibicion con todas las concentraciones sometidas a ensayo (Vease la Figura 5).

DISCUSION: Los inventores han mostrado en el presente documento por primera vez, que AAT bloquea la produccion de IL-1 beta como un ejemplo de produccion de citocinas proinflamatorias. La IL-1 beta es crucial para el desarrollo de los smtomas y/o las manifestaciones de la enfermedad del antrax. Los resultados presentados en este ejemplo complementan el mecanismo ya supuesto por el cual AAT se puede emplear

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo, un excipiente o un diluyente farmaceuticamente aceptable y una protema de fusion, en donde la composicion farmaceutica es para uso en un metodo para tratar un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infeccion bacteriana o que tiene una infeccion micobacteriana, en donde la protema de fusion comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mairnfero o un fragmento peptidico de la misma, en donde el fragmento peptfdico consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una region constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento peptfdico de AAT inhibe una actividad proteasa de serina.
2. Una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo, un excipiente o un diluyente farmaceuticamente aceptable y un acido nucleico que codifica una protema de fusion, en donde la composicion farmaceutica es para uso en un metodo para tratar un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infeccion bacteriana o que tiene una infeccion micobacteriana, en donde la protema de fusion comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero o un fragmento peptfdico de la misma, en donde el fragmento peptfdico consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SeQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una region constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento peptfdico de AAT inhibe una actividad proteasa de serina.
3. Un acido nucleico que codifica una protema de fusion para uso como un medicamento, en donde el acido nucleico codifica la protema de fusion que comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero o un fragmento peptfdico de la misma, en donde el fragmento peptfdico consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59, y una region constante de inmunoglobulina, en donde el fragmento peptfdico de AAT inhibe una actividad proteasa de serina.
4. La composicion farmaceutica para uso segun las reivindicaciones 1 y 2, y el acido nucleico para uso segun la reivindicacion 3, en donde la alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero comprende alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero de origen natural.
5. La composicion farmaceutica para uso segun las reivindicaciones 1 y 2, y el acido nucleico para uso segun la reivindicacion 3, en donde la region constante de inmunoglobulina comprende una region constante de IgG1 humana.
6. La composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 5, y el acido nucleico para uso segun la reivindicacion 5, en donde la region constante de IgG1 esta modificada y en donde la region constante de IgG1 modificada no se une al receptor de Fc y/o no inicia reacciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
7. La composicion farmaceutica para uso segun las reivindicaciones 1 y 2, y el acido nucleico para uso segun la reivindicacion 3, en donde la alfa-1 antitripsina (AAT) de mamffero o el fragmento peptfdico de la misma se fusiona con el extremo amino-terminal o el extremo carboxilo-terminal de una region constante de inmunoglobulina.
8. La composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 7, y el acido nucleico para uso segun la reivindicacion 7, en donde la region constante de inmunoglobulina comprende la region Fc.
9. La composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 8, y el acido nucleico para uso segun la reivindicacion 8, en donde la region Fc de inmunoglobulina es Fc de tipo silvestre o una Fc mutante.
10. El acido nucleico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en donde el acido nucleico es para uso en un metodo para tratar a un sujeto que requiere una terapia con AAT o que tiene una infeccion bacteriana o que tiene una infeccion micobacteriana.

imagen1

imagen2

FIGURA 2: EFECTO DE ALFA-1 -ANTITRIPSINA (AAT) Y MIMETICO

DE AAT SOBRE TNFa NDUC DO CON COMPLEJO

MYCOBACTERIUM AVIUM (MAC) EN MACROFAGOS HUMANOS DERIVADOS

DE MONOCITOS P < 0,05 en comparacion con cultivos infectados con MAC

N=5

Control MAC MAC MAC

+ AAT + Mimetico

(5 mg/ml) (50 uM)

imagen3

FIGURA 3: EFECTO DE ALFA-1 -ANTITRIPSINA (AAT) Y MIMETICO

DE AAT SOBRE TNFa INDUCIDO CON COMPLEJO

MYCOBACTERIUM AVIUM MAC EN MACROFAGOS HUMANOS DERIVADOS

DE MONOCITOS: EXPERIMENTO DE EVOLUCION TEMPORAL (N=1)

300

Control

200-

MAC ♦ AAT (5 mg/mt)

150

MAC + Mimetico (50 uM)

Mimetico (50 pM)

100

Tiempo (dias)

imagen4

imagen5

Una proteasa de senna en la superficie celular

Proteasa de senna de la superficie celular

ise acopla con el antigeno protector unido.

F GURA4C

El antigeno protector, que tiene una masa de

83 kDa, es procesado por la proteasa de

Fragmento de 20 kDa

senna sobre la superficie celular. Esto da

como resultado la produccion de

fragmentos de 20 kDa y 63 kDa de antigeno

protector. El fragmento de 63 kDa se inserta

en la superficie celular.

Fragmento de 63 kDa

F GURA4D

imagen6

JllUxj

Procesamiento repetido de moleculas de antigeno protector intactas

de 83 kDa que da como resultado la formacion de complejos de

transportador heptamero (7 miembros) compuesto de 7 moleculas de

antigeno protector (63 kDa) procesadas

Complejos de transportador heptamero (7 miembros).

FIGURA 4E

imagen7

causar

Los heptameros de antigeno protector

sobre

superficie

ceuar

forman

"complejos de transporte que se unen al

factor letal o al factor de edema. Esto

viene seguido por el transporte de estos

factores en el interior de la celula, en

donde

activan

se

para

enfermedad.

F GURA4F

imagen8

El transporte del factor letal y el factor de

edema dentro de a ce u a da como

resu tado a a teracion de a funcion

celular.

FIGURA 4G

imagen9

FIGURA 4H

Inhibidor de proteasas de senna

El inhibidor de proteasas de senna bloquea el

procesamiento del antigeno protector en la

Inhibidor de proteasas de senna

superficie celular. No se pueden formar los

complejos de transportador de 7 miembros, por

lo que se neutraliza la toxina del antrax.

imagen10