WO2011007612A1 - 経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド - Google Patents

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昌久 伊吹
芳則 長谷川
芳徳 峯
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide having an anti-inflammatory function.
  • the present invention also relates to novel tripeptides such as Phe-Leu-Val and Val-Pro-Tyr having an anti-inflammatory function.
  • Patent document 1 exists as an application regarding the peptide which has an anti-inflammatory function.
  • This application describes a great variety of di- and tripeptides including Arg, and also describes a number of physiological effects besides anti-inflammatory function. However, these are premised on the production by synthesis, and it is difficult to say that safety is sufficiently established. In addition, no description about Phe-Leu-Val and Val-Pro-Tyr is found.
  • Patent Document 2 discloses an application for an effect on gastrointestinal ulcer that is not directly related to an anti-inflammatory function but is an ingredient derived from food and is also effective in the present invention. However, this is only a description of the effect on the enzyme degradation product of cheese, and no description of a specific active substance is found.
  • cheese has a strong palatability due to its unique flavor, and it is highly possible that it has a stronger flavor by enzymatic degradation.
  • milk protein is originally a protein that tends to have a bitter taste due to enzymatic degradation. Therefore, there is a limit when the use as a food material is also assumed.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition or food having an anti-inflammatory function, which is effective for inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease, and a treatment method using the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a material having an anti-inflammatory function, which is effective for inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease, and a therapeutic method using the material. It is particularly desirable if it can be used as a general-purpose food material.
  • the present inventor in earnest examination in view of the above situation, orally administered soy peptide prepared to have a certain molecular weight distribution by enzymatic degradation to pigs in which intestinal inflammation was induced with dextran sulfate.
  • intestinal inflammation is suppressed and have reached the present invention.
  • the secretion of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-6, IL-17
  • the soybean peptide of the present invention has a function of suppressing the secretion of these inflammatory cytokines, thereby suppressing inflammation.
  • the tripeptides with the amino acid sequence of phenylalanine-leucine-valine or valine-proline-tyrosine were found. It has been found that those having the sequence are absorbed from intestinal epithelial cells and the like, stimulate the immune system, and express the anti-inflammatory cytokine secretion inhibitory function described above. That is, the present inventors have found that a tripeptide having an amino acid sequence of phenylalanine-leucine-valine or valine-proline-tyrosine can be expected as an effective material for alleviating inflammatory bowel disease and the like.
  • the present invention is a soy peptide having a certain molecular weight distribution and having an anti-inflammatory function, which is an oral anti-inflammatory composition, a pharmaceutical product, a food, and a feed comprising these as active ingredients, and the peptide is used. It relates to the treatment of inflammatory diseases. Furthermore, the present invention is a novel tripeptide having an anti-inflammatory function consisting of an amino acid sequence of phenylalanine-leucine-valine or valine-proline-tyrosine, which is used as an active ingredient in oral anti-inflammatory compositions, pharmaceuticals, and feeds. And a method for treating inflammatory diseases using the tripeptide or the like.
  • the present invention (1) An oral anti-inflammatory functional agent which is a soy peptide having a molecular weight fraction of 500 or less excluding free amino acids of 40% by weight or more and a free amino acid content of 7% by weight or less. (2) A method for treating inflammation using the anti-inflammatory functional agent according to (1). (3) The oral anti-inflammatory functional agent according to (1), wherein the target disease is intestinal inflammation. (4) A tripeptide represented by the amino acid sequence Phe-Leu-Val. (5) A tripeptide represented by the amino acid sequence Val-Pro-Tyr. (6) An anti-inflammatory functional agent comprising one or more of the tripeptides according to (4) and (5) as an active ingredient.
  • a method for treating inflammation comprising one or more of the tripeptides according to (4) and (5) as an active ingredient.
  • An inflammatory cytokine secretion inhibitor comprising one or more of the tripeptides according to (4) and (5) as an active ingredient. It is about.
  • peptides that are effective for inflammatory diseases such as inflammatory bowel diseases, foods, medicines and feeds containing the peptides.
  • the anti-inflammatory composition effective in inflammatory diseases such as an inflammatory bowel disease, and the foodstuff, medicine, and feed containing the said composition are provided.
  • the inflammation treatment method using the said tripeptide is provided.
  • the molecular weight distribution of the soybean peptide of the present invention requires that 40% by weight or more (excluding free amino acids) be a molecular weight of 500 or less and a free amino acid content be 7% by weight or less. More desirably, 43% by weight or more (excluding free amino acids) is made to have a molecular weight of 500 or less, and the free amino acid content is made to be 6% by weight or less.
  • the molecular weight is measured by gel filtration. More specifically, it was measured using a UV detector using a gel filtration column manufactured by TSK. More specifically, the molecular weight was measured by the following method.
  • soybean peptide of the present invention when the ratio of the molecular weight of 500 or less is less than 40% by weight or the free amino acid content exceeds 7% by weight, the remarkable effect may be lost.
  • a conventionally known method such as enzymatic degradation or acid degradation can be employed.
  • enzymatic degradation is more desirable for the safety of manufacturing workers because the reaction can be performed under milder conditions.
  • the protease used may be a commercially available one, regardless of animal origin, plant origin, or microbial origin. Specifically, serine protease (animal-derived trypsin, chymotrypsin, microbial-derived subtilisin, carboxypeptidase, etc.), thiol peptidase (plant-derived papain, bromelain, etc.), carboxyprotease (animal-derived pepsin, etc.), metalloprotease (thermolysin) ) Etc. can be used.
  • serine protease animal-derived trypsin, chymotrypsin, microbial-derived subtilisin, carboxypeptidase, etc.
  • thiol peptidase plant-derived papain, bromelain, etc.
  • carboxyprotease animal-derived pepsin, etc.
  • metalloprotease thermolysin
  • “Samoase” (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), “Biolase” (manufactured by Nagase Chemtech Co., Ltd.), “Sumiteam FP” (manufactured by Shin Nippon Chemical Co., Ltd.) and the like derived from microorganisms.
  • the reaction conditions for the enzyme can be appropriately set in consideration of other workability, centering on the optimum reaction conditions for the enzyme to be used.
  • commercially available isolated soy protein is used as a substrate, and about 0.5 to 2.0% by weight of enzyme is added to about 3 to 7% by weight solution (pH 5 to 9), and about 30 to 60 ° C. For example.
  • Inflammation exerted by the present invention. Inflammation is a symptom that occurs in the process of removing the cause of a cell being damaged by some kind of disorder. When you catch a cold or get injured, inflammation is caused by the removal of viruses or necrotic cells. Inflammation is a sign of removing these causative substances. These viruses and bacteria are called exogenous factors. On the other hand, allergic inflammation due to deposition of cells and tissues in immune complexes produced in the body and inflammation due to abnormal metabolites generated in the body (including gout) are called intrinsic factors. .
  • abnormal intestinal immune tolerance which is said to be an abnormality of the intestinal tract immune system related to the immune selection of harmful and innocuous substances (immune tolerance) in the body.
  • IBD Crohn's disease
  • UC ulcerative bowel disease
  • abnormal intestinal immune tolerance is said to be an abnormality of the intestinal tract immune system related to the immune selection of harmful and innocuous substances (immune tolerance) in the body.
  • the above-mentioned Crohn's disease and ulcerative bowel disease are recognized as inflammatory bowel diseases, but mild diarrhea, etc. that occurs occasionally when mental stress becomes stronger, is caused by the same mechanism of action. Is expected. In other words, mental external factors such as stress cause abnormalities in the intestinal tract immune system and cause inflammation in the intestinal tract. In fact, many diagnoses of inflammatory bowel disease are reported to start with mild diarrhea, and begin to feel severe symptoms such as melena when they begin to feel intense stress such as work. There is a case. When describing the malfunction of the intestinal tract immune system in IBD, what is generally called naive T cells differentiates into Th1, Th2, called helper T cells, Th17 recently discovered, and the like by various cytokines.
  • This helper T cell is an important organ that controls the body's immune function, and it is known that allergic symptoms such as hay fever are caused by this differentiation defect.
  • the inflammatory cytokine TNF- ⁇ secreted from this Th1 cell is said to be closely related to CD.
  • Th17 is deeply involved in inflammation and IBD, and inflammatory cytokines involved in this differentiation and the like are IL-6 and IL-17.
  • drugs for inflammatory bowel disease various adrenocortical hormones, azathioprine, which is an immunosuppressive agent, and infliximab, which has an effect of capturing TNF- ⁇ before binding to a receptor, have already been effective. It shows that the treatment is effective.
  • inflammatory bowel disease and the like are symptoms closely related to the immune mechanism, and can be quantitatively grasped by measuring the secretion behavior of TNF- ⁇ , IL-6, IL-17, etc. It is believed that. (International J. of Colorectal Disease, 15, 144-160 (2000)). That is, when secretion of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17 is suppressed, it can be determined that there is an anti-inflammatory effect.
  • the anti-inflammatory effect is large, the absolute value of the secretion amount of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17 per specimen tissue weight was measured, and the average value of each cytokine was compared with the control. In this case, if any one of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17 is suppressed by 20% by weight or more, it can be said to be “effective”.
  • the term “inflammatory disease” refers to all diseases accompanied by general inflammation, and more specifically refers to inflammatory bowel disease (Inflammatory Bowel Disease: IBD). Specific examples thereof include Crohn's disease (CD) and ulcerative bowel disease (UC).
  • IBD Inflammatory Bowel Disease
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative bowel disease
  • the peptide of the present invention is effective even in mild diseases that are not recognized as diseases, such as sudden diarrhea and abdominal pain as subjective symptoms, as long as inflammation is the cause. In this case, these mild diseases are also included in the “inflammatory bowel disease” in the present invention.
  • the peptide of the present invention can be used as a food, medicine or feed, if necessary, mixed with other raw materials as necessary.
  • serving as food it can be used by mixing with solid foods such as biscuits, cakes, breads, etc., dissolved in water as beverages, or fluid, semi-solid foods such as yogurt and pudding There is no problem even if they are mixed.
  • the peptide of the present invention may be denatured by decomposition or the like due to heat during sterilization of food.
  • vitamins, minerals and the like are mixed and used as a supplement.
  • When used as a medicine it may be used in combination with a medicine such as an adrenocortical hormone or an immunosuppressant.
  • the feed application can be used without being limited to land and fishery.
  • the tripeptide having the amino acid sequence of phenylalanine-leucine-valine or valine-proline-tyrosine according to the present invention can be used as a food, pharmaceutical, or feed, if necessary, mixed with other raw materials as necessary.
  • the mode of serving as a food is the same as that described for the “peptide”.
  • Tripeptides having the amino acid sequence of phenylalanine-leucine-valine (abbreviation: Phe-Leu-Val or FLV) or valine-proline-tyrosine (abbreviation: Val-Pro-Tyr or VPY) of the present invention are generally known. It can be synthesized by the method or separated from the food material.
  • FLV has the amino acid sequence at residues 472 to 474 in the 11S globulin A2B1a subunit of soy protein, and can be separated from the soy protein after decomposition by protease treatment or the like.
  • Soybean is a material considered to be highly safe from a long history of eating experience, and when separated from food material, it is preferable to use soybean as a raw material.
  • VPY is present at residues 153-155 in the A5A4B3 subunit of soy protein 11S globulin.
  • the tripeptide having the phenylalanine-leucine-valine or valine-proline-tyrosine sequence of the present invention can be ingested as a peptide mixture containing the tripeptide and exert its effect without being used separately. That is, the anti-inflammatory action possessed by the tripeptide of the present invention exerts its effect even by oral administration.
  • enzymatic degradation is more desirable for the safety of manufacturing workers because the reaction can be performed under milder conditions.
  • a peptide containing a tripeptide having the sequence phenylalanine-leucine-valine or valine-proline-tyrosine has a molecular weight distribution of 40% by weight or more (excluding free amino acids) and a free amino acid content of 7 or less. It is desirable to make it not more than wt%, more desirably 43 wt% or more (excluding free amino acids) is made to have a molecular weight of 500 or less and the free amino acid content is made to be 6 wt% or less.
  • the molecular weight is measured by gel filtration.
  • soy peptide having a molecular weight distribution it is possible not only to decompose soy protein by enzymes, but also to combine some separation operation thereafter. Specifically, the precipitate generated by the decomposition operation with an enzyme or the like can be removed by centrifugation, or separation with a UF membrane or the like can be performed. In order to efficiently obtain a peptide having a desired molecular weight distribution, it is often advantageous to use these separation means from the viewpoint of yield and the like.
  • a conventionally known method can be used as a method for separating the tripeptide.
  • one or more methods selected from techniques such as pH treatment, microfiltration, centrifugation, and electrophoresis can be combined.
  • Sumiteam FP (source: Aspergillus sp., Shin Nippon Chemical Industry) was added at 1% by weight per protein and allowed to act at pH 7.5, 58 ° C. for 60 minutes. After the above treatment, the reaction was stopped by heating at 85 ° C. for 20 minutes.
  • the resulting insoluble matter was removed by centrifugation and filtration through a membrane filter having a pore size of 1.0 ⁇ m to obtain “Peptide Composition 1”.
  • the fraction having a molecular weight of 500 or less excluding free amino acids was 45% by weight, and the free amino acids were 5% by weight.
  • the tripeptide content represented by phenylalanine-leucine-valine was measured by HPLC using an ODS column and a PAD detector and found to be 3% by weight.
  • Example 1 Comparative Examples 1 and 2
  • Example 1 "Prophylaxis or treatment of ulcerative colitis”
  • Example 2 Fate was given as drinking water for 5 days (DSS treatment), after which Example 1 fed peptide composition 1 at 250 mg / kg body weight for 5 days, and Comparative Example 1 gave peptide composition 2 at 250 mg / kg body weight for 5 days.
  • DSS treatment DSS treatment
  • Comparative Example 1 gave peptide composition 2 at 250 mg / kg body weight for 5 days.
  • Comparative Example 2 alanine corresponding to the nitrogen content of the peptide was fed.
  • Comparative Example 2 corresponds to the control.
  • Extract sulfate is a substance that induces intestinal inflammation. International J. of Colorectal Disease, 15, 144-160 (2000)
  • cytokines by ELISA TNF- ⁇ and IL-6 were measured using a porcine ELISA kit (R & D system Inc. USA).
  • TNF- ⁇ , IL-6, IL-17 The analysis results of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17 are shown in FIGS.
  • the amount of TNF- ⁇ secreted was 96% in Comparative Example 1 and 60% in Example 1 when the amount of secretion in Comparative Example 2 was taken as 100%.
  • the secretion amount of IL-6 was 113% in Comparative Example 1 and 43% in Example 1, assuming that the secretion amount in Comparative Example 2 was 100%.
  • the secretion amount of IL-17 was 86% in Comparative Example 1 and 9% in Example 1 when the secretion amount in Comparative Example 2 was taken as 100%. From the above, in Example 1, both TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17 were inhibited by 20% or more of the secreted amount compared to Comparative Example 2, and it was judged that there was an effect.
  • Example 1 was determined to be significant (risk rate of 5% or less). Comparative Example 1 was not judged significant.
  • -Analysis of peptide in plasma There were three peptide peaks in the plasma of Example 1. The largest peak was analyzed by LC-MS / MS to identify the amino acid sequence of the peptide. As a result, it was a tripeptide having the amino acid sequence of phenylalanine-leucine-valine. Moreover, when the amino acid sequence of the peptide was identified using the same method for the second largest peak, it was a tripeptide having the amino acid sequence of valine-proline-tyrosine.
  • FIGS. 6 The microscope picture of the tissue sample of the large intestine of the pig which provided the sample in Example 1 and Comparative Example 2 is shown in FIGS. As shown in FIG. 6, ulcers were hardly confirmed in Example 1, whereas severe ulcers were confirmed in Comparative Example 2 of FIG. (In Comparative Example 1, a serious ulcer similar to Comparative Example 2 was confirmed).
  • "Inhibition of inflammatory cytokines by cell experiments using synthetic peptides" FLV and VPY synthesis FLV was synthesized using an organic synthetic chemistry method using phenylalanine, leucine, and valine as raw materials and a carbodiimide-based condensing agent as a catalyst. The synthesis of VPY was performed using an organic synthetic chemistry method using valine, proline and tyrosine as raw materials and a carbodiimide-based condensing agent as a catalyst.
  • Example 1 "Discussion" -As in Example 1, in pigs administered with the peptide composition 1, it was confirmed by histological analysis that the occurrence of intestinal ulcers was suppressed or healed. Similarly, in the pig (Comparative Example 1) to which the peptide composition 2 was administered, the same intestinal ulcer as in Comparative Example 2 was confirmed. From this, it was confirmed that the peptide composition 1 contains a component having an inhibitory effect or healing effect on the intestinal ulcer. ⁇ The analysis of swine plasma in Example 1 confirmed that TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17 secretion was suppressed, and the occurrence of intestinal ulcers in swine by the currently assumed anti-inflammatory mechanism It was confirmed that suppression or healing occurred.
  • a safe oral anti-inflammatory composition, food, medicine and feed that suppresses inflammatory cytokines of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17, which are effective for inflammatory diseases such as inflammatory bowel diseases Is provided.
  • an oral anti-inflammatory comprising as an active ingredient a safe food material that suppresses inflammatory cytokines of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-17, which is effective for inflammatory diseases such as inflammatory bowel diseases.
  • Compositions, foods, medicaments and feeds are provided.
  • FIG. 3 is a diagram showing the secretion behavior of TNF- ⁇ in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
  • secretion of TNF- ⁇ was remarkably suppressed.
  • FIG. 3 is a diagram showing IL-6 secretion behavior of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
  • IL-6 secretion was remarkably suppressed.
  • FIG. 3 is a diagram showing the IL-17 secretion behavior of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
  • IL-17 secretion was remarkably suppressed.
  • Comparative Example 1 serious intestinal inflammation similar to Comparative Example 2 was also confirmed.
  • 2 is a photomicrograph of a tissue sample of the large intestine of a pig of Example 1.

Abstract

本発明の目的は、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果がある、抗炎症機能を有する組成物や当該組成物を使用した治療方法の提供にある 。 本発明は、遊離アミノ酸を除く分子量５００以下の画分が４０重量％以上でありかつ、遊離アミノ酸含量が7重量％以下である、大豆ペプチドである経口性抗炎症機能剤および、それを用いた治療法である。そして本発明はフェニルアラニン－ロイシン－バリンもしくはバリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列からなる抗炎症機能をもつ新規トリペプチドであって、それらを有効成分とする、経口性抗炎症組成物、医薬品、飼料であり、かつ、それら新規ペプチドを用いた炎症性腸疾患の治療法に関するものである。

Description

経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド
本発明は、抗炎症機能を有するペプチドに関するものである。また本発明は、抗炎症機能を有するＰｈｅ-Ｌｅｕ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒという新規なトリペプチドに関するものである。
　抗炎症機能を謳うペプチドに関する出願としては、特許文献１が存在する。この出願にはＡｒｇを含むきわめて多種のジ、トリペプチドが記載され、また、抗炎症機能以外にも多数の生理的な効果について記載がある。しかし、これらは合成による製造を前提としており、安全性が十分確立されたものとは言いがたい。また、Ｐｈｅ-Ｌｅｕ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒに関する記述は見られない。
　直接抗炎症機能を謳うものではないが、食品由来の成分で、本願発明でも効果が認められる消化管潰瘍への効果を謳う出願として、特許文献２がある。しかしこれはチーズの酵素分解物に関する効果を記載したものに過ぎず、具体的な作用物質についての記載は見られない。またチーズはその独特の風味から嗜好性が強く、酵素分解を行うことで、より強い風味となっている可能性が高い。さらに、乳蛋白は元々、酵素分解により苦味が出やすい蛋白である。よって、食品素材としての利用も想定した場合、制限がある。
特表2001-500492号公報 特開2009-120519号公報
　本発明の目的は、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果がある、抗炎症機能を有する医薬組成物や食品、および当該組成物を使用した治療方法の提供にある。また、本発明の目的は、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果がある、抗炎症機能を有する素材や、当該素材を用いた治療法の提供にある。特にそれが、汎用的な食品素材としても使えるものであれば、望ましい。
　本発明者は以上の現状に鑑み鋭意検討するなかで、酵素分解により、ある一定の分子量分布となるように調製された大豆ペプチドを、デキストランサルフェイトで腸管炎症を誘導させた豚に経口投与したところ、腸管炎症が抑制されていることを見出し本発明に至った。
　更に詳細に調べてみると、当該大豆ペプチドを経口投与した豚の血漿中の炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-17）の分泌が抑制されていることを見出した。つまり、本発明の大豆ペプチドには、これら炎症性サイトカインの分泌抑制機能があり、これにより、炎症が抑制されていることを見出した。効果の見られた検体に関し、血中のプラズマに存在しているペプチドを分析してみると、フェニルアラニン－ロイシン－バリンないしバリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列をもつトリペプチドが発見され、これらのアミノ酸配列をもつものが腸管上皮細胞等から吸収されて、免疫系を刺激し、前述の抗炎症性サイトカインの分泌抑制機能を発現していることを見出した。すなわちフェニルアラニン－ロイシン－バリンないしバリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列をもつトリペプチドが炎症性腸疾患等の緩和へ有効な素材として期待できることを見出し本発明にいたった。
 本発明は一定の分子量分布を持つ、抗炎症機能をもつ大豆ペプチドであって、それらを有効成分とする、経口性抗炎症組成物、医薬品、食品、飼料であり、かつ、当該ペプチドを用いた炎症性疾患の治療法に関するものである。
 さらに本発明はフェニルアラニン－ロイシン－バリンないしバリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列からなる抗炎症機能をもつ新規トリペプチドであって、それらを有効成分とする、経口性抗炎症組成物、医薬品、飼料であり、かつ、当該トリペプチド等を用いた炎症性疾患の治療法についてのものである。
すなわち本発明は、
（１）遊離アミノ酸を除く分子量５００以下の画分が４０重量％以上でありかつ、遊離アミノ酸含量が7重量％以下である、大豆ペプチドである経口性抗炎症機能剤。    
（２）（１）記載の抗炎症機能剤を使用する、炎症治療方法。
（３）対象とする疾病が腸管炎症である、（１）記載の経口性抗炎症機能剤。
（４）アミノ酸配列Ｐｈｅ-Ｌｅｕ－Ｖａｌで示されるトリペプチド。
（５）アミノ酸配列Val-Pro-Tyrで示されるトリペプチド。 
（６）（４），（５）記載のトリペプチドの1種以上を有効成分とする、抗炎症機能剤。
（７）（４），（５）記載のトリペプチドの1種以上を有効成分とする、炎症治療方法。
（８）（４），（５）記載のトリペプチドの1種以上を有効成分とする、炎症性サイトカイン分泌抑制剤。
に関するものである。
　本発明によれば、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果があるペプチド、当該ペプチドを含む食品、医薬及び飼料が提供される。また本発明によれば、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果がある抗炎症組成物、当該組成物を含む食品、医薬及び飼料が提供される。また、当該トリペプチドを用いた炎症治療方法が提供される。
　本発明の大豆ペプチドは、分子量分布において、その４０重量％以上（遊離アミノ酸は除く）を分子量５００以下にしかつ、遊離アミノ酸含量を７重量％以下にすることが必要である。より望ましくは４３重量％以上（遊離アミノ酸は除く）を分子量500以下にしかつ、遊離アミノ酸含量を６重量％以下にする。なお、ここでの分子量はゲルろ過法で測定したものである。より具体的にはTSK社製ゲルろ過カラムを用い、UV検出器を用いて測定したものである。より詳細には、以下の方法で分子量の測定を行った。
○分子量測定方法
　２種のカラム直列接続によってペプチド用ゲルろ過システムを組み、分子量マーカーとなる既知ペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた（表１、図１）。酵素分解した分解物（１％）を10,000×g、10分で遠心した上清を、ゲルろ過用溶媒で２倍希釈し、その5μlをアプライした。各分子量画分の含有量比率％については、全体の吸光度のチャート面積に対する、特定の分子量範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた。（１stカラム：Superdex 75 10/300GL、2ndカラム：Superdex Peptide 7.5/300GL，溶媒：1%SDS/10mMリン酸緩衝液,pH8.0，２５℃，流速：0.25ml/min，検出：OD220nm）
表１　分子量標準物質
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
 

また、遊離アミノ酸含有量は以下の方法にて分析を行った。 
○遊離アミノ酸含量測定    
　試料（4 mg/ml）を等量の3%スルホサリチル酸に加え、室温で15分間振とうした。10,000rpm 10分間遠心し、得られた上澄を0.45 μmフィルターでろ過し、アミノ酸分析器（日本電子製 JLC500V）にて、遊離アミノ酸を測定した。アミノ酸量はケルダール法にて得られた全粗たん白質に対する量として算出した。
本発明の大豆ペプチドでは、分子量５００以下の割合が40重量％未満であったり、また遊離アミノ酸含量が7重量％を超えると、効果の顕著性が失われる場合がある。
　大豆タンパク質を上記のような分子量分布を示すペプチドにするための方法は、酵素分解や酸による分解など、従来から知られている方法を採用することができる。特に酵素による分解では、より温和な条件にて反応を行うことができるため、製造作業者の安全のためなどからより望ましい。
　大豆蛋白の分解において、酵素すなわちプロテアーゼにより分解を行う場合、用いるプロテアーゼは市販のものでよく、動物起源、植物起源、あるいは微生物起源は問わない。
具体的にはセリンプロテアーゼ（動物由来のトリプシン、キモトリプシン、微生物由来のズブチリシン、カルボキシペプチダーゼなど）、チオールペプチダーゼ（植物由来のパパイン、ブロメラインなど）、カルボキシプロテアーゼ（動物由来のペプシンなど）、金属プロテアーゼ（サーモライシン）等を用いることが出来る。より具体的には微生物由来である「サモアーゼ」（大和化成社製）、「ビオプラーゼ」（ナガセケムテック社製）、「スミチームＦＰ」（新日本化学社製）などである。酵素の反応条件は、使用する酵素の最適な反応条件を中心に、その他の作業性などを考慮して適宜設定することができる。たとえば、基質としては市販の分離大豆タンパク質を使用し、この３～７重量%程度の溶液（ｐＨ５～９）に対し、酵素を０．５～２．０重量％程度加え、３０～６０℃程度で反応させる等である。
　目的とする分子量分布を持つペプチドを入手するためには、酵素や酸による分解を行った後、何らかの分離操作を組み合わせることもできる。具体的には、酵素等による分解操作で発生する沈殿物を遠心分離で除いたり、またＵＦ膜などによる分離をあげることができ、これらを適宜組み合わせることができる。効率的に目的とする分子量分布を持つペプチドを得るためには、これらの分離手段を活用したほうが、歩留まり等の点などからも有利な場合が多い。
　ここで本発明が効果を及ぼす「炎症」について説明する。炎症とは、何かの障害により細胞が傷つけられたりした場合に、その原因を取り除く行為の過程に生ずる症状をいう。風邪をひいたとか、怪我をしたとかで、ウイルスの駆除や壊死した細胞の駆除で炎症がおこるのであり、炎症はこれらの要因物質を除去しようとするサインである。これらウイルスや細菌のようなものは外因性要因と呼ばれるものである。反対に、体内で産生された免疫複合体の細胞、組織への沈着によるアレルギー性炎症や、体内に生じた異常代謝産物による炎症（痛風などが挙げられる）などは内因性要因と呼ばれている。
しかしながら、要因がわからない炎症性疾患も見られる。例えば、炎症性腸疾患（Inflammatory Bowel Disease:IBD）のクローン病（ＣＤ）や、潰瘍性腸疾患（ＵＣ）などはその例であり、いまだ要因は特定されていないようである。現在の有力な説は、腸管免疫寛容異常とよばれるもので、腸管内で行われている体にとって有害物質と無害物質の免疫的な選別（免疫寛容）に関する腸管免疫システムの異常といわれている。つまり本来、免疫システムを作動させなくてもいい体の状態なのに、なぜか腸管粘膜において有害物質が存在すると誤認してしまい、過剰な炎症性サイトカインの分泌や白血球の過剰遊走が起こり、体が炎症のコントロールができずに、ひいては健全な細胞までも傷つけてしまう。  
　炎症性腸疾患として認定されているのは上述のクローン病や潰瘍性腸疾患であるが、精神的なストレスが強くなった場合にたまにおこる軽度の下痢等も、同じ作用機構で起こっていることが予想されている。つまりストレスのような精神的外的要因により、腸管免疫システムに異常を起こし、腸管内に炎症を起こしてしまうのである。事実、炎症性腸疾患と診断された多くは、初期症状は軽度の下痢から始まり、仕事等のストレスを強く感じ始めると、下血等の重篤な症状が見られるようになったと報告される場合がある。もう少し、ＩＢＤにおける腸管免疫システムの不具合について述べると、一般にナイーブＴ細胞と呼ばれるものが、種々のサイトカインによりヘルパーＴ細胞と呼ばれるＴｈ１、Ｔｈ２、最近発見されたＴｈ１７等に分化していく。
　このヘルパーＴ細胞は、体の免疫機能をつかさどる重要な器官であって、この分化の不具合によって花粉症などのアレルギー症状なども引き起こすことが知られている。このＴｈ１細胞から分泌される炎症性サイトカインＴＮＦ－αがＣＤと深く関係しているといわれている。さらにＴｈ１７は炎症とIBDに深くかかわっているとされており、この分化等に関与する炎症性サイトカインはＩＬ－６、ＩＬ－１７である。炎症性腸疾患に対する医薬としては、各種副腎皮質ホルモンや、免疫抑制剤であるアザチオプリン、ＴＮＦ－αをレセプターに結合する前に捕捉する効果をもつインフリキシマブ等がすでに効果を示しており、免疫的な処置が効果的であることを示している。
　以上のように炎症性腸疾患等は、免疫機構に密接に関連した症状であり、TNF-α、IL-6,IL－17等の分泌挙動を測定することで量的に把握することができると考えられている。（International J. of Colorectal Disease, 15 , 144-160(2000)）。すなわち、TNF-α、IL-6,IL－17の分泌が抑制された場合、抗炎症効果があると判断することができる。ここで抗炎症効果は、その効果が大きい場合は、検体組織重量当たりのTNF-α、IL-6,IL－17の分泌量の絶対値を測定し、各サイトカインの平均値をコントロールと比較した場合、TNF-α、IL-6,IL－17のうち一つでも、２０重量％以上の分泌抑制が見られた場合は、「効果あり」ということができる。
　もちろん、２５％重量以上の分泌抑制が見られれば、効果はより強いと言え、３０重量％以上の分泌抑制が見られれば、効果は更に強いといえる。ただし、分泌抑制が２０重量％未満であっても、Tukey-Kramer比較検定において、危険率５％以下で「有意」と判断されれば、効果ありと判断することができる。現実には、各サイトカイン分泌の抑制量が小さくとも、Tukey-Kramer比較検定において「有意」と判断される場合に、患者において抗炎症作用が知覚される場合も多く、Tukey-Kramer比較検定による判断は重要である。
　なお本願発明においては、一般的な炎症性疾患の中でも、特に炎症性腸疾患に着目した。すなわち、本願発明においては、炎症性疾患という場合は一般的な炎症を伴う疾患すべてを指すが、より具体的には炎症性腸疾患（Inflammatory Bowel Disease:IBD）を指す。その具体例としてはクローン病（ＣＤ）や、潰瘍性腸疾患（ＵＣ）をあげることができる。また、疾病とは認識されないような軽度の疾患、例えば、自覚症状として急な下痢、腹痛においても、炎症が原因であれば、本発明のペプチドは効果を有する。この場合、これら軽度の疾患も、本発明においては「炎症性腸疾患」に含まれる。
　本発明のペプチドは、食品、医薬、飼料として、必要により適宜その他の原材料と混合して使用することができる。食品として供する場合は、ビスケット、ケーキ、パン等の固形状食品に混合して使用しても差し支えなく、水に溶解して飲料として、または、ヨーグルト、プリンのような流動状、半固形状食品に混合しても問題ない。ただし、食品の殺菌の際の熱により本発明のペプチドが分解等の変性する可能性もあり、好ましくは、ビタミン、ミネラル等を混合してサプリメントとして利用するのがよい。医薬品として供する場合は、副腎皮質ホルモンや免疫抑制剤等の医薬品と混合して使用しても差し支えない。飼料用途は、陸産、水産に限定されることなく使用することができる。 
　本発明におけるフェニルアラニン－ロイシン－バリンないしバリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列をもつトリペプチドは、食品、医薬、飼料として、必要により適宜その他の原材料と混合して使用することができる。食品として供する場合の態様は、前記「ペプチド」に関し記載したものと同様である。
 本発明のフェニルアラニン－ロイシン－バリン（略号：Ｐｈｅ-Ｌｅｕ－ValないしFLV)もしくはバリンープロリンーチロシン（略号：Val-Pro-TyrないしVPY)のアミノ酸配列をもつトリペプチドは一般的に知られた方法により合成することも、また食品素材から分離することもできる。ただ、安全性の点などから、食品から分離したほうが有利な場合もある。食品としては、たとえば、FLVは大豆蛋白質の１１SグロブリンのA2B1aサブユニット中の４７２－４７４残基に当該アミノ酸配列が存在しており、分離大豆蛋白質からプロテアーゼ処理等により分解後、分離することができる。大豆は長い食経験の歴史から安全性が高いと考えられる素材であり、食品素材から分離する場合も、好ましくは大豆を原料としたほうがよい。同様に、VPYは大豆蛋白質１１SグロブリンのＡ５Ａ４Ｂ３サブユニット中の153-155残基に存在する。
　本発明のフェニルアラニン－ロイシン－バリンもしくはバリンープロリンーチロシンの配列を持つトリペプチドは、分離して用いずとも、当該トリペプチドを含むペプチド混合物として摂取し、効果を発揮することができる。すなわち、本願発明のトリペプチドの持つ抗炎症作用は、経口投与によっても、その効果を発揮する。    
　大豆蛋白から当該トリペプチドを得ようとする場合、まず大豆蛋白を酵素や酸など、従来から知られている方法により、分解する必要がある。特に酵素による分解では、より温和な条件にて反応を行うことができるため、製造作業者の安全のためなどからより望ましい。
　酵素すなわちプロテアーゼにより分解を行う場合の条件は、前記「ペプチド」の場合と同様である。
　フェニルアラニン－ロイシン－バリンもしくはバリンープロリンーチロシンの配列を持つトリペプチドを含むペプチドとしては、分子量分布において、その４０重量％以上（遊離アミノ酸は除く）を分子量５００以下にしかつ、遊離アミノ酸含量を７重量％以下にすることが望ましく、より望ましくは４３重量％以上（遊離アミノ酸は除く）を分子量500以下にしかつ、遊離アミノ酸含量を６重量％以下にする。なお、ここでの分子量はゲルろ過法で測定したものである。より具体的にはTSK社製ゲルろ過カラムを用い、UV検出器を用いて測定したものである。分子量５００以下の割合が40重量％未満であったり、また遊離アミノ酸含量が7重量％を超えると、フェニルアラニン－ロイシン－バリンもしくはバリンープロリンーチロシンの配列を持つトリペプチドの含有量が大きく低下してしまう場合がある。
　大豆ペプチドを上記のような分子量分布にするためには、大豆蛋白の酵素による分解だけではなく、その後何らかの分離操作を組み合わせることもできる。具体的には、酵素等による分解操作で発生する沈殿物を遠心分離で除いたり、またＵＦ膜などによる分離をあげることができる。効率的に目的とする分子量分布を持つペプチドを得るためには、これらの分離手段を活用したほうが、歩留まり等の点などからも有利な場合が多い。
　当該トリペプチドの分離方法としては、従来から知られている方法を使用することができる。たとえば、ｐH処理、マイクロフィルトレーション、遠心分離、電気泳動等の手法から選ばれる１以上の方法を組み合わせることができる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
「ペプチドの調製」     
分離大豆蛋白（不二製油株式会社製「フジプロR」）の5重量％溶液に対し、サモアーゼ（起源；Bacillus thermoproteolyticus，大和化成）を対たん白質あたり2重量％加え、pH9.0，58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Bacillus sp.，ナガセケムテック）を対たん白質あたり１重量％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。スミチームFP（起源；Aspergillus sp.，新日本化学工業）を対たん白質あたり１重量％加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。以上の処理の後、85℃，20分間加熱することで反応を停止した。
　以上の処理の後、生じた不溶物を遠心分離および孔径1.0μｍのメンブレンフィルターによるろ過で除去し、「ペプチド組成物１」を得た。このペプチド組成物の、ゲルろ過法で測定した分子量分布では、遊離アミノ酸を除く分子量５００以下の画分が４５重量％であり、遊離アミノ酸が5重量％であった。
また、このペプチド組成物１中、フェニルアラニン－ロイシン－バリンで示されるトリペプチド含量をＯＤＳカラムとPAD検出器を用いてHPLＣにて測定したところ、３重量％であった。
　比較対照として上記と同じ５重量％分離大豆たん白質溶液に対して、ビオプラーゼ（起源；Bacillus sp.，ナガセケムテック）を対たん白質あたり4重量％加え、pH7.5，58℃で60分間作用させた。以上の処理の後、85℃，20分間加熱することで反応を停止した後、生じた不溶物を遠心分離および孔径1.0μｍのメンブレンフィルターによるろ過で除去し、「ペプチド組成物２」を得た。このペプチド組成物の、ゲルろ過法で測定した分子量分布では、遊離アミノ酸を除く分子量５００以下の画分が２１重量％であり、遊離アミノ酸が１重量％であった。各ペプチドの組成を表２に示す。
表２　調製されたペプチド組成物の組成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
「実施例１、比較例１、２」
 「潰瘍性大腸炎予防ないし治療試験」
 ３－５日齢の豚１８頭を３群に分けて、３日間飼育した後、試験群（実施例１、比較例１）、対照群（比較例２）として体重1ｋｇあたり1.25ｇのデキストランサルフェイトを飲料水として５日間与えて（DSS処理）、その後実施例１は、ペプチド組成物１を体重１kg当たり、250ｍｇ５日給餌し、比較例１は、ペプチド組成物２を体重１kg当たり、250ｍｇ５日給餌し、比較例２はペプチドの窒素含量に相当するアラニンを給餌した。その後解剖を行い、腸管細胞を採取し、サイトカインを測定した。なお、ここでは比較例２がコントロールに相当する。（デキストランサルフェイトは腸管炎症を誘発する物質である。International J. of Colorectal Disease, 15 , 144-160(2000)）
 「ELISA法によるサイトカイン測定」 
TNF－α、IL-6は豚のELISAキット（R&D system Inc.USA）を用いて測定した。

「ＲＴ－ＰＣＲ法によりサイトカインの測定」
ＩＬ－１7の測定は、ｍＲＮＡをＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ （Bio-Rad Lab. Inc.)で抽出後cDNA合成キット（Bio-Rad Lab.Inc.)によりcDNAを合 成したのちＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｐｅｒｍｉｘ（Bio-Rad Lab.  Inc.)を用いて測定した。  

「吸収されたペプチドの同定」
解剖時において血液を採取し、血漿を分離し、PDA-HPLCにおいて得られたピークをLC-MS/MSにより構造解析を行ってペプチドのアミノ酸配列を同定した。

「優位差検定」
優位差検定はGraphPad Software(USA)を用いて、Tukey-Kramer比較検定を用いた。
 「試験結果」 
・TNF－α、IL-6、IL-17の分析
TNF－α、IL-6、IL-17の分析結果をそれぞれ図２～４に示す。TNF－αの分泌量は、比較例２における分泌量を１００％とした場合、比較例１では９６%、実施例１では６０％であった。またIL-6の分泌量は、比較例２における分泌量を１００％とした場合、比較例１では１１３%、実施例１では４３％であった。IL-17の分泌量は、比較例２における分泌量を１００％とした場合、比較例１では８６%、実施例１では９％であった。以上より、実施例１はTNF－α、IL-6,IL-17とも、比較例２に対し分泌量は２０％以上抑制されており、効果ありと判断された。
・有意差検定
Tukey-Kramer比較検定による、比較例２との比較の結果、実施例１は有意と判断された（危険率５%以下）。比較例１は有意とは判断されなかった。
・血漿中のペプチドの分析
実施例１の血漿中にはペプチドのピークが３つ存在した。そのうちの最も大きなピークをLC-MS/MSにより構造解析を行ってペプチドのアミノ酸配列を同定したところ、フェニルアラニン－ロイシン－バリンのアミノ酸配列を持つトリペプチドであった。
また、2番目に大きなピークを同様の方法を使ってペプチドのアミノ酸配列を同定したところ、バリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列を持つトリペプチドであった。
・組織分析
実施例１、比較例２で、サンプルを供した豚の大腸の組織サンプルの顕微鏡写真を図６，５に示す。図６に示すように、実施例１においては潰瘍がほとんど確認できなかったのに対し、図５の比較例２においては重篤な潰瘍を確認することができた。（比較例１においても比較例２同様の重篤な潰瘍が確認された）。
「合成ペプチドを用いた、細胞実験による炎症性サイトカイン抑制実験」
FLVおよびVPYの合成
FLVの合成は、フェニルアラニン、ロイシン、バリンを原料として、カルボジイミド系の縮合剤を触媒とした有機合成化学的手法を用いて行った。
VPYの合成は、バリン、プロリン、チロシンを原料として、カルボジイミド系の縮合剤を触媒とした有機合成化学的手法を用いて行った。
細胞実験による炎症性サイトカイン抑制検討
培養されたCaco-2細胞を３ｍMのFLVもしくはVPYが存在する5% FBS-DMEM/F12倍地に分散させ、2時間培養した。その後、TNF－αを添加し、4時間培養を行い炎症状態を作りだした。計6時間後に上澄みを取り出し、-80度で一端凍結し、解凍後、炎症性サイトカインIL-8の分析を通常のELISA法によって行った。操作は3回繰り返し、平均値を算出し評価した。
結果を表３に示す。
表３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
 
以上の通り、合成されたトリペプチドFLVおよびVPYは、TNF－αで誘導される、炎症性サイトカインのIL-8の分泌を抑制することがわかった。
「考察」
・実施例１のように、ペプチド組成物１を投与した豚においては、組織分析によって腸管潰瘍の発生が抑制ないし治癒していることが確認された。同様に、ペプチド組成物２を投与した豚（比較例１）においては、比較例２同様の腸管潰瘍が確認された。このことから、ペプチド組成物１には腸管潰瘍の発生抑制ないし治癒効果を有する成分が存在することが確認された。
・実施例１の豚血漿の分析により、TNF－α、IL-6、IL-17の分泌が抑制されていることが確認され、現在想定されている炎症抑制機構により、豚の腸管潰瘍の発生が抑制、ないし治癒が起こっていることが確認された。
・本実験においては豚における腸管炎症をモデルに実験を行ったが、炎症の抑制および、その際のTNF－α、IL-6、IL-17分泌の挙動は、一般的な抗炎症作用におけるものと同様であった。このことから、本実験で見られた腸管炎症抑制作用は、他の一般的な抗炎症へ適用可能である。
・実施例１の血漿中に存在するペプチドを分析したところ、３種類のペプチドの存在が確認され、これらが、抗炎症の有効成分であると推定された。そのうちのひとつのアミノ酸組成を分析したところ、フェニルアラニン－ロイシン－バリンのアミノ酸配列を持つトリペプチドであることが確認され、このトリペプチドが、抗炎症の有効成分であると推定された。
上記3種類のペプチドのうちのもう一つの組成を分析したところ、バリンープロリンーチロシンのアミノ酸配列を持つトリペプチドであることが確認され、このトリペプチドも、抗炎症の有効成分であると推定された。
・合成ペプチドFLVおよびVPYにおける細胞実験による炎症性サイトカイン抑制実験においても、FLVおよびVPYは、TNF－αで誘導される、炎症性サイトカインのIL-8の分泌を抑制した。この結果は、実施例１の結果を強く支持するものである。
本発明により、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果がある、TNF－α、IL－６、IL-17の炎症性サイトカインを抑制する安全な経口性抗炎症組成物、食品、医薬及び飼料が提供される。また本発明により、炎症性腸管疾患等の炎症性疾患に効果がある、TNF－α、IL－６、IL-17の炎症性サイトカインを抑制する安全な食品素材を有効成分とする経口性抗炎症組成物、食品、医薬及び飼料が提供される。 
分子量測定法における、分子量標準物質を用いた検量線である。 実施例１、比較例１，２のＴＮＦ－αの分泌挙動を示した図である。実施例１ではTNF-αの分泌が顕著に抑制されていた。 実施例１、比較例１，２のＩＬ－６の分泌挙動を示した図である。実施例１ではIL-6の分泌が顕著に抑制されていた。 実施例１、比較例１，２のＩＬ－１７の分泌挙動を示した図である。実施例１ではIL-17の分泌が顕著に抑制されていた。 比較例２の豚の大腸の組織サンプルの顕微鏡写真の図である。なお、比較例１においても比較例２同様の重篤な腸管炎症が確認された。 実施例１の豚の大腸の組織サンプルの顕微鏡写真の図である。実施例１においては、炎症は確認されなかった。

Claims (8)

  1. 遊離アミノ酸を除く分子量５００以下の画分が４０重量％以上でありかつ、遊離アミノ酸含量が7重量％以下である、大豆ペプチドである経口性抗炎症機能剤。    
  2. 請求項１記載の抗炎症機能剤を使用する、炎症治療方法。
  3. 対象とする疾病が腸管炎症である、請求項１記載の経口性抗炎症機能剤。
  4. アミノ酸配列Ｐｈｅ-Ｌｅｕ－Ｖａｌで示されるトリペプチド。
  5. アミノ酸配列Val-Pro-Tyrで示されるトリペプチド。 
  6. 請求項４，５記載のトリペプチドの1種以上を有効成分とする、抗炎症機能剤。
  7. 請求項４，５記載のトリペプチドの1種以上を有効成分とする、炎症治療方法。
  8. 請求項４，５記載のトリペプチドの1種以上を有効成分とする、炎症性サイトカイン分泌抑制剤。
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