JPH07107078B2 - 新規なペプチドおよび免疫賦活剤 - Google Patents
新規なペプチドおよび免疫賦活剤Info
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- JPH07107078B2 JPH07107078B2 JP3323606A JP32360691A JPH07107078B2 JP H07107078 B2 JPH07107078 B2 JP H07107078B2 JP 3323606 A JP3323606 A JP 3323606A JP 32360691 A JP32360691 A JP 32360691A JP H07107078 B2 JPH07107078 B2 JP H07107078B2
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬として有用性を有
する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプ
チドならびにそのペプチドを有効成分とする免疫賦活剤
に関する。 Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒ （式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学
において慣用の表示法によるものである。）
する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプ
チドならびにそのペプチドを有効成分とする免疫賦活剤
に関する。 Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒ （式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学
において慣用の表示法によるものである。）
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】摂取さ
れた食品は消化管の中で分解、吸収される過程で宿主免
疫系へ種々の影響を与えることが知られている（Ｊ．
Ｌ．Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ
ｎ．Ｍｅｄ．，１０１，８１０−８２４（１９８
４））。宿主の免疫反応は免疫担当細胞であるリンパ球
及びマクロファージから分泌される生理活性物質によっ
て調節、制御されていることが知られているが、一方、
食品成分中にも宿主免疫系を調節する物質の存在が知ら
れている。その中には。食品蛋白質を酵素的に分解した
ペプチドとして、ヒトカゼイン由来Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ，ウシカゼイン由来Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ，ヒト
βカゼイン由来Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒのものが知られておりいずれもマクロファー
ジの活性を上昇させることが見いだされている（Ｆ．Ｐ
ａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１４５，６７７−６８２（１９８４），Ｊ．Ｂｅｒ
ｔ−ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．：ＰＡＢＳ Ｌｅｔｔ．，２
１８，５５−５８（１９８７））。生体内に摂取された
食品蛋白質は、そのままの形かあるいは分解されてペプ
チドの形で免疫応答系細胞と接する。このような食品成
分と免疫応答系細胞との相互作用は、これまで知られて
いるところでは、たとえば免疫系の異常状態である食品
アレルギーを引き起こす場合があり、さらに、免疫系の
賦活あるいは抑制という形となって観察されている。免
疫応答系を調節する本来の生体内物質としてインターロ
イキンをはじめとするサイトカイニンと呼ばれる一群の
ポリペプチドであり、その機能及び構造について多くの
情報が集積しつつある。これに対し、食品たん白質由来
のペプチドで免疫調節機能をもつものは多くはなく、未
だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
れた食品は消化管の中で分解、吸収される過程で宿主免
疫系へ種々の影響を与えることが知られている（Ｊ．
Ｌ．Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ
ｎ．Ｍｅｄ．，１０１，８１０−８２４（１９８
４））。宿主の免疫反応は免疫担当細胞であるリンパ球
及びマクロファージから分泌される生理活性物質によっ
て調節、制御されていることが知られているが、一方、
食品成分中にも宿主免疫系を調節する物質の存在が知ら
れている。その中には。食品蛋白質を酵素的に分解した
ペプチドとして、ヒトカゼイン由来Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ，ウシカゼイン由来Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ，ヒト
βカゼイン由来Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒのものが知られておりいずれもマクロファー
ジの活性を上昇させることが見いだされている（Ｆ．Ｐ
ａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１４５，６７７−６８２（１９８４），Ｊ．Ｂｅｒ
ｔ−ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．：ＰＡＢＳ Ｌｅｔｔ．，２
１８，５５−５８（１９８７））。生体内に摂取された
食品蛋白質は、そのままの形かあるいは分解されてペプ
チドの形で免疫応答系細胞と接する。このような食品成
分と免疫応答系細胞との相互作用は、これまで知られて
いるところでは、たとえば免疫系の異常状態である食品
アレルギーを引き起こす場合があり、さらに、免疫系の
賦活あるいは抑制という形となって観察されている。免
疫応答系を調節する本来の生体内物質としてインターロ
イキンをはじめとするサイトカイニンと呼ばれる一群の
ポリペプチドであり、その機能及び構造について多くの
情報が集積しつつある。これに対し、食品たん白質由来
のペプチドで免疫調節機能をもつものは多くはなく、未
だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者は、大豆のタン
パク質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検
索し、新規な６種のペプチドが強い免疫賦活作用を有す
ることを見出した。そして、これら６種のペプチドを医
薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結
果、この６種のペプチドが免疫賦活作用を有し、天然物
由来の免疫賦活剤としての有用性を見い出した。本発明
は係る知見に基づくものである。以下に、本発明を詳細
に説明する。本発明に係る新規なペプチドは、次式
（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６） （１） Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （２） Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ （３） Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （４） Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ （５） Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ （６） Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ （式中の各記号はペプチド化学におけるアミノ酸配列の
各アミノ酸単位を示す。）の式で示されるＬ体のアミノ
酸の配列を有する新規なペプチドであり、常温における
性状は白色の粉末である。
パク質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検
索し、新規な６種のペプチドが強い免疫賦活作用を有す
ることを見出した。そして、これら６種のペプチドを医
薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結
果、この６種のペプチドが免疫賦活作用を有し、天然物
由来の免疫賦活剤としての有用性を見い出した。本発明
は係る知見に基づくものである。以下に、本発明を詳細
に説明する。本発明に係る新規なペプチドは、次式
（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６） （１） Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （２） Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ （３） Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （４） Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ （５） Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ （６） Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ （式中の各記号はペプチド化学におけるアミノ酸配列の
各アミノ酸単位を示す。）の式で示されるＬ体のアミノ
酸の配列を有する新規なペプチドであり、常温における
性状は白色の粉末である。
【０００４】前記の６種のペプチドは、化学的に合成す
る方法または大豆のタンパク質分解酵素の分解液から分
離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新
規なペプチドを化学的に合成する場合には、液相法また
は固相法等の通常のペプチド合成方法によって行うこと
ができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の
固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端（カルボキシル末端
側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を
順次ペプチド結合によって結合して行くのがよい。そし
て、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフル
オロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー
性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基
を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグ
フイー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）等を用いた通常
の方法で精製することができる。
る方法または大豆のタンパク質分解酵素の分解液から分
離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新
規なペプチドを化学的に合成する場合には、液相法また
は固相法等の通常のペプチド合成方法によって行うこと
ができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の
固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端（カルボキシル末端
側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を
順次ペプチド結合によって結合して行くのがよい。そし
て、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフル
オロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー
性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基
を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグ
フイー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）等を用いた通常
の方法で精製することができる。
【０００５】上記したように、本発明に係る新規なペプ
チドは大豆のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製
することができるが、その場合には、平成３年度日本農
芸化学学会東北支部第１１５回会講演会（山形大学農学
部）講演要旨集Ｂ−１（ｐ１６），Ｂ−２（ｐ１７）の
方法に準拠し、例えば、以下のようにして行うことがで
きる。上記の新規なペプチドを含有している大豆を取り
出して、ホモゲナイザーを用いて適当な溶媒（例えば、
水−トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液
等）中で十分にホモジネイトした後、加水分解する。加
水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等のタン
パク質分解酵素で加水分解する場合は、大豆ホモジネイ
トを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適値に
調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要
に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得
る。その加水分解液を濾紙および／またはセライト等を
用いて瀘過することによって不溶性成分を除去し、得ら
れた濾液をセロフアン等の半透膜を用いて適当な溶媒
（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の
緩衝液等）中で十分に透析し、その瀘液中の成分で半透
膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂
（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０ｗ等）
にかけ、その吸着溶出分画から免疫賦活作用を有する成
分を含有する分画を得、得られた免疫賦活作用を有する
分画をゲル濾過（例えば，ファルマシア社製のＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５等）によって分画し、得られた免疫
賦活作用を有する分画を陽イオン交換ゲル瀘過（例え
ば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−
２５等）によって分画し、得られた免疫賦活作用を有す
る分画を更に逆相 ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ
イー）によって分画する。
チドは大豆のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製
することができるが、その場合には、平成３年度日本農
芸化学学会東北支部第１１５回会講演会（山形大学農学
部）講演要旨集Ｂ−１（ｐ１６），Ｂ−２（ｐ１７）の
方法に準拠し、例えば、以下のようにして行うことがで
きる。上記の新規なペプチドを含有している大豆を取り
出して、ホモゲナイザーを用いて適当な溶媒（例えば、
水−トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液
等）中で十分にホモジネイトした後、加水分解する。加
水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等のタン
パク質分解酵素で加水分解する場合は、大豆ホモジネイ
トを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適値に
調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要
に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得
る。その加水分解液を濾紙および／またはセライト等を
用いて瀘過することによって不溶性成分を除去し、得ら
れた濾液をセロフアン等の半透膜を用いて適当な溶媒
（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の
緩衝液等）中で十分に透析し、その瀘液中の成分で半透
膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂
（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０ｗ等）
にかけ、その吸着溶出分画から免疫賦活作用を有する成
分を含有する分画を得、得られた免疫賦活作用を有する
分画をゲル濾過（例えば，ファルマシア社製のＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５等）によって分画し、得られた免疫
賦活作用を有する分画を陽イオン交換ゲル瀘過（例え
ば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−
２５等）によって分画し、得られた免疫賦活作用を有す
る分画を更に逆相 ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ
イー）によって分画する。
【０００６】この新規な６種のペプチドは、静脈内への
繰返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフ
イラキシーショックを起こさない。また、このペプチド
はＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体
内のプロテアーゼにより徐々に分解される為，毒性は極
めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ
／Ｋｇ：ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチ
ドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射
剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整すること
ができる。投与法としては、通常は、免疫不全症を有し
ている哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射
すること、あるいは経口投与することがあげられる。投
与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当りこのペプチドを
０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常、１
日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調
整することができる。上記の各種製剤において用いられ
る賦形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定されず、
通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤
に用いられるものを使用することができる。
繰返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフ
イラキシーショックを起こさない。また、このペプチド
はＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体
内のプロテアーゼにより徐々に分解される為，毒性は極
めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ
／Ｋｇ：ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチ
ドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射
剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整すること
ができる。投与法としては、通常は、免疫不全症を有し
ている哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射
すること、あるいは経口投与することがあげられる。投
与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当りこのペプチドを
０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常、１
日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調
整することができる。上記の各種製剤において用いられ
る賦形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定されず、
通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤
に用いられるものを使用することができる。
【０００７】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる
添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦
形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール
等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウ
ム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース等；崩壊剤としてはカルボキシメチル
セルロースおよびそのカルウム塩類；滑沢剤としてはス
テアリン酸およびその塩額、タルク、ワックス類を挙げ
ることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要
に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の
矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、
常法により、本発明に係る新規なペプチドを、注射用
水、生理食塩液およびキシリトールやマンニトールなど
の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエ
チレングリコール等のグリコールに溶解または懸濁させ
て注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐
剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができ
る。本発明の新規なペプチドを含有する製剤は凍結乾燥
品または乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例え
ば水または生理食塩液にて溶解して用いることもでき
る。
添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦
形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール
等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウ
ム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース等；崩壊剤としてはカルボキシメチル
セルロースおよびそのカルウム塩類；滑沢剤としてはス
テアリン酸およびその塩額、タルク、ワックス類を挙げ
ることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要
に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の
矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、
常法により、本発明に係る新規なペプチドを、注射用
水、生理食塩液およびキシリトールやマンニトールなど
の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエ
チレングリコール等のグリコールに溶解または懸濁させ
て注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐
剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができ
る。本発明の新規なペプチドを含有する製剤は凍結乾燥
品または乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例え
ば水または生理食塩液にて溶解して用いることもでき
る。
【０００８】本発明に係る新規なペプチドの優れた免疫
賦活作用として、新規なペプチドをウサギに経口投与す
ると、末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ（以下Ｃｏｎ
Ａと略記する。）刺激に対する幼若化反応が有意に上昇
し、又、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに新規なペプチドを経口
投与すると抗体産生能が上昇した。更に、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
Ｎマウスより得た脾細胞に対してマイトージェン活性を
示す。
賦活作用として、新規なペプチドをウサギに経口投与す
ると、末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ（以下Ｃｏｎ
Ａと略記する。）刺激に対する幼若化反応が有意に上昇
し、又、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに新規なペプチドを経口
投与すると抗体産生能が上昇した。更に、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
Ｎマウスより得た脾細胞に対してマイトージェン活性を
示す。
【０００９】
【実施例】以下に実施例として、製造例及び試験例を記
載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例１ 大豆２００ｇに脱イオン水１Ｌを加えホモジナイズした
後、１Ｎ塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン（メ
ルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）１０ｇを添
加し，３７℃で２０時間撹拌しながら加水分解を行っ
た。分解反応液を直ちに限外瀘過膜（アミコン社製、Ｙ
Ｍ１０型、φ７６ｍｍ）に通過させ、通過液を強酸性陽
イオン交換樹脂カラムＤｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４
［Ｈ＋］ （φ４．５ｘ１５ｃｍ）に加えた。カラムを
脱イオン水で十分に洗浄した後、２Ｎ水酸化アンモニウ
ム液２Ｌを用いて溶出した。減圧濃縮によりアンモニア
を除去し、濃縮液４０ｍｌを得た。濃縮液４ｍｌを予め
脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５
カラム（φ２．５ｘ１５０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍ
ｌ／ｈｒ、各分画量８．３ｍｌでゲル濾過した。その結
果は図１に示すとおりである。上記のゲル瀘過を繰り返
して大量分取した免疫賦活作用の高い分画（分画番号１
７〜３７）を集め、凍結乾燥してペプチド粉末とした。
このペプチド粉末を脱イオン水に溶解した後、予め、脱
イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５
［Ｈ＋］（φ１．５ｘ４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオ
ン水１Ｌから３％塩化ナトリウム液１Ｌの濃度勾配法に
より、流速６０ｍｌ／ｈｒ， 各分画量７．８ｍｌでク
ロマトグフィーを行った。その結果は図２に示すとおり
である。
載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例１ 大豆２００ｇに脱イオン水１Ｌを加えホモジナイズした
後、１Ｎ塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン（メ
ルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）１０ｇを添
加し，３７℃で２０時間撹拌しながら加水分解を行っ
た。分解反応液を直ちに限外瀘過膜（アミコン社製、Ｙ
Ｍ１０型、φ７６ｍｍ）に通過させ、通過液を強酸性陽
イオン交換樹脂カラムＤｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４
［Ｈ＋］ （φ４．５ｘ１５ｃｍ）に加えた。カラムを
脱イオン水で十分に洗浄した後、２Ｎ水酸化アンモニウ
ム液２Ｌを用いて溶出した。減圧濃縮によりアンモニア
を除去し、濃縮液４０ｍｌを得た。濃縮液４ｍｌを予め
脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５
カラム（φ２．５ｘ１５０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍ
ｌ／ｈｒ、各分画量８．３ｍｌでゲル濾過した。その結
果は図１に示すとおりである。上記のゲル瀘過を繰り返
して大量分取した免疫賦活作用の高い分画（分画番号１
７〜３７）を集め、凍結乾燥してペプチド粉末とした。
このペプチド粉末を脱イオン水に溶解した後、予め、脱
イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５
［Ｈ＋］（φ１．５ｘ４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオ
ン水１Ｌから３％塩化ナトリウム液１Ｌの濃度勾配法に
より、流速６０ｍｌ／ｈｒ， 各分画量７．８ｍｌでク
ロマトグフィーを行った。その結果は図２に示すとおり
である。
【００１０】上記クロマトグラフ中、分画番号３９〜４
７の免疫賦活作用を有する分画を集めて凍結乾燥して精
製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分））を得た。この
ペプチド粉末を脱イオン水に溶解した後ＨＰＬＣを行っ
た。条件はカラムとして野村化学（株）製Ｄｅｖｅｌｏ
ｓｉｌ ＯＤＳ−５０（φ４．６ｍｍ ＩＤｘ２５ｃｍ
Ｌ）を使用し、移動相として０．０５％トリフルオロ
酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）から２５％アセトニ
トリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法により、流速
１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでクロマトグ
ラフィーを行い、免疫賦活作用を有するペプチドを得
た。その結果は図３に示すとおりである。 ｛溶出時間；（１）のペプチド３１．７分、（２）のペ
プチド３８．３分、（３）のペプチド８２．６分、
（４）のペプチド１２２．３分、（５）のペプチド１２
６．７分、（６）のペプチド１４２．１分 このようにして得られた免疫賦活作用を有するペプチド
のアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム社製のプ
ロテインシーケンサー４７７Ａ型を用いて決定された。
その結果、６種のペプチドは、それぞれ、 次式、（１）Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （２）Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ （３）Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （４）Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ０−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ （５）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ （６）Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸残基からなる配列を有するペ
プチドであることが確認された。
７の免疫賦活作用を有する分画を集めて凍結乾燥して精
製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分））を得た。この
ペプチド粉末を脱イオン水に溶解した後ＨＰＬＣを行っ
た。条件はカラムとして野村化学（株）製Ｄｅｖｅｌｏ
ｓｉｌ ＯＤＳ−５０（φ４．６ｍｍ ＩＤｘ２５ｃｍ
Ｌ）を使用し、移動相として０．０５％トリフルオロ
酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）から２５％アセトニ
トリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法により、流速
１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでクロマトグ
ラフィーを行い、免疫賦活作用を有するペプチドを得
た。その結果は図３に示すとおりである。 ｛溶出時間；（１）のペプチド３１．７分、（２）のペ
プチド３８．３分、（３）のペプチド８２．６分、
（４）のペプチド１２２．３分、（５）のペプチド１２
６．７分、（６）のペプチド１４２．１分 このようにして得られた免疫賦活作用を有するペプチド
のアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム社製のプ
ロテインシーケンサー４７７Ａ型を用いて決定された。
その結果、６種のペプチドは、それぞれ、 次式、（１）Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （２）Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ （３）Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （４）Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ０−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ （５）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ （６）Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸残基からなる配列を有するペ
プチドであることが確認された。
【００１１】製造例２ 本例は、合成法による製造例である。 Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの合成法。 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０ Ａ型用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹
脂を使用した。まず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従
って、常法どおり、そのＣ末端側のグリシンからクロロ
メチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。この
ときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下ｔ−
Ｂｏｃと略記す。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸
を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオ
ールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で
１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、さ
らに１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタ
ンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無
水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、そ
の沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾
燥した。このようにして得られた末精製の合成ペプチド
は蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）
を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）
０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１ｘＴＦＡ含有
アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が２０分間で９
８％→７８％の濃度勾配法により流速１．５ｍｌ／ｍｉ
ｎでクロマトグラィーを行った。紫外部波長２１５ｎｍ
で検出し、最大の吸収を示した溶出分画を分取し、これ
を凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを
得た。
４３０ Ａ型用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹
脂を使用した。まず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従
って、常法どおり、そのＣ末端側のグリシンからクロロ
メチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。この
ときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下ｔ−
Ｂｏｃと略記す。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸
を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオ
ールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で
１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、さ
らに１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタ
ンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無
水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、そ
の沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾
燥した。このようにして得られた末精製の合成ペプチド
は蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μ）
を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）
０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１ｘＴＦＡ含有
アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が２０分間で９
８％→７８％の濃度勾配法により流速１．５ｍｌ／ｍｉ
ｎでクロマトグラィーを行った。紫外部波長２１５ｎｍ
で検出し、最大の吸収を示した溶出分画を分取し、これ
を凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを
得た。
【００１２】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列構造を有するペプチドであ
ることが確認された。このマススペクトルの結果は図４
に示すとおりである。 他の４つのペプチドについても
上記合成方法に準じ固相法によりそれぞれＣ末端側から
反応させ合成した。末精製の合成ペプチドは以下に示す
とおり精製した。 Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９０％→６０％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。
分析した結果、アミノ酸配列構造を有するペプチドであ
ることが確認された。このマススペクトルの結果は図４
に示すとおりである。 他の４つのペプチドについても
上記合成方法に準じ固相法によりそれぞれＣ末端側から
反応させ合成した。末精製の合成ペプチドは以下に示す
とおり精製した。 Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９０％→６０％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。
【００１３】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列およびアミノ酸組成が前記
式で示したアミノ酸配列構造を有するペプチドであるこ
とが確認された。このマススペクトルの結果は図５に示
すとおりである。 Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するペプチドであることが確認された。このマスス
ペクトルの結果は図６に示すとおりである。 Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣに精製
した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、
（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用
し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配法
により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎＢクロマトグラフィーを
行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収を
示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することによ
って目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチド
をマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列お
よびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造を
有するペプチドであることが確認された。このマススペ
クトルの結果は図７に示すとおりである。 Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するペプチドであることが確認された。このマスス
ペクトルの結果は図８に示すとおりである。 Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎクロマトグラフィーを
行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収を
示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することによ
って目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチド
をマススペクトルにより分祈した結果、アミノ酸配列お
よびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造を
有するペプチドであることが確認された。このマススペ
クトルの結果は図９に示すとおりである。合成によって
得られた本発明の６種のペプチドは、以下に示す試験に
よって薬理効果が確認された。
分析した結果、アミノ酸配列およびアミノ酸組成が前記
式で示したアミノ酸配列構造を有するペプチドであるこ
とが確認された。このマススペクトルの結果は図５に示
すとおりである。 Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するペプチドであることが確認された。このマスス
ペクトルの結果は図６に示すとおりである。 Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣに精製
した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、
（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用
し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配法
により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎＢクロマトグラフィーを
行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収を
示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することによ
って目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチド
をマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列お
よびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造を
有するペプチドであることが確認された。このマススペ
クトルの結果は図７に示すとおりである。 Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するペプチドであることが確認された。このマスス
ペクトルの結果は図８に示すとおりである。 Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒの精製法 逆相系のカラムＣ１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９８％→７８％の濃度勾配
法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎクロマトグラフィーを
行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸収を
示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することによ
って目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチド
をマススペクトルにより分祈した結果、アミノ酸配列お
よびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造を
有するペプチドであることが確認された。このマススペ
クトルの結果は図９に示すとおりである。合成によって
得られた本発明の６種のペプチドは、以下に示す試験に
よって薬理効果が確認された。
【００１４】試験例１ （ウサギ末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ刺激に対す
る幼若化反応の測定）ウサギは成熟雄性日本白色種（Ｋ
ＢＬ：ＪＷ、ＳＰＦ、体重２．０ｋｇ）を（株）北山ラ
ベスより購入し、１週間予備飼育を行った後、健常な動
物を試験に供した。飼育は温度２３±２℃、湿度５５±
１０％に保った飼育室内の金属製個別ゲージで行った。
飼料はオリエンタル酵母（株）製ＲＣ４を１日１２０ｇ
給餌し、水は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由
に摂取させた。１群３例のウサギを用い、製造例１にお
ける精製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）２００ｍ
ｇ／ｋｇ／ｄａｙを体重１ｋｇ当り５ｍｌの割合で３０
日間連続投与した。対照群には同容量の溶媒を投与し
た。体重測定は３日毎に行った。投与開始日並びに最終
投与の翌日、各ウサギの耳静脈からヘパリン処理した注
射器で１０ｍｌの血液を採取し、３時間以内に、リンパ
球分離並びに３Ｈ−サイミジン取り込み能測定法による
幼若化反応を実施した。各リンパ球の取り込んだ放射能
から次式により刺激指数（ＳＩ）を算出した。 ＳＩ＝（ＣｏｎＡを加えた培養系）／（ＣｏｎＡを加え
ない培養系） 大豆ペプチド（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を３０日間
経口投与したウサギの体重変化は表１に示した。体重変
化はペプチド投与群と対照群との間に有意差は認められ
なっかた。又、ウサギ末梢血リンパ球のＣｏｎＡ刺激に
よる幼若化反応（ＳＩ値）を表２に示した。この結果、
大豆ペプチドの投与前５．３±０．６から投与後４４．
８±７．０に上昇し、有意差（ｐ＜０．０１、ｔ検定）
が認められた。
る幼若化反応の測定）ウサギは成熟雄性日本白色種（Ｋ
ＢＬ：ＪＷ、ＳＰＦ、体重２．０ｋｇ）を（株）北山ラ
ベスより購入し、１週間予備飼育を行った後、健常な動
物を試験に供した。飼育は温度２３±２℃、湿度５５±
１０％に保った飼育室内の金属製個別ゲージで行った。
飼料はオリエンタル酵母（株）製ＲＣ４を１日１２０ｇ
給餌し、水は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由
に摂取させた。１群３例のウサギを用い、製造例１にお
ける精製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）２００ｍ
ｇ／ｋｇ／ｄａｙを体重１ｋｇ当り５ｍｌの割合で３０
日間連続投与した。対照群には同容量の溶媒を投与し
た。体重測定は３日毎に行った。投与開始日並びに最終
投与の翌日、各ウサギの耳静脈からヘパリン処理した注
射器で１０ｍｌの血液を採取し、３時間以内に、リンパ
球分離並びに３Ｈ−サイミジン取り込み能測定法による
幼若化反応を実施した。各リンパ球の取り込んだ放射能
から次式により刺激指数（ＳＩ）を算出した。 ＳＩ＝（ＣｏｎＡを加えた培養系）／（ＣｏｎＡを加え
ない培養系） 大豆ペプチド（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を３０日間
経口投与したウサギの体重変化は表１に示した。体重変
化はペプチド投与群と対照群との間に有意差は認められ
なっかた。又、ウサギ末梢血リンパ球のＣｏｎＡ刺激に
よる幼若化反応（ＳＩ値）を表２に示した。この結果、
大豆ペプチドの投与前５．３±０．６から投与後４４．
８±７．０に上昇し、有意差（ｐ＜０．０１、ｔ検定）
が認められた。
【００１５】試験例２ （マウス脾細胞の抗体産生能測定）マウスは雄性、５週
齢（Ｓｌｃ：Ｃ５７ＢＬ／６、ＳＰＦ）を日本エスエル
シー（株）より購入し、１週間予備飼育を行った後、健
常な動物を試験に供した。マウスの飼育は温度２３±２
℃、湿度５５±１０％に保った飼育室内のエアコンケー
ジで行った。餌料はオリエンタル酵母（株）製ＭＦ、水
は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由に摂取させ
た。１群３例のウサギを用い、製造例１における精製ペ
プチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）２００ｍｇ／ｋｇ／
ｄａｙを体重１０ｇ当り０．１ｍｌの割合で１０日間連
続経口投与した。体重は、毎日計測した。大豆ペプチド
の投与開始から５日後、それぞれのマウスの尾静脈にヒ
ツジ赤血球（ＳＲＢＣ、デンカ生研（株））５Ｘ１０８
ｃｅｌｌｓ／ｍｌを０．２ｍｌ投与して免疫した。免疫
の５日後、各群のマウスから脾臓を採取し、Ｅａｇｌ
ｅ’ｓ ｍｎｉｍｌ ｅｓｓｅ−ｎｔｉａｌ ｍｅｄｉ
ｕｍ（ＥＭＥＭ、日水製薬（株））を入れたシャーレ内
で脾細胞を遊離させた。リン酸緩衝液 （ＰＢＳ）で３
回洗浄した後、ＥＭＥＭで２．５Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／
ｍｌに調整した脾細胞と５０％ＳＲＢＣ浮遊液及びモル
モット乾燥補体（デンカ生研（株））を８：１：１の割
合で混合した。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｊ．らの方
法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４，５９９，（１９６
８））に準じて３７℃で９０分反応後、溶血斑（ｐｌａ
ｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＰＦＣ）を計測し
た。 大豆ペプチド（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１
０日間経口投与したマウスの体重変化並びに脾細胞調整
時に測定した脾臓重量を表３に示した。体重変化におい
て大豆ペプチド投与群と対照群との間に有意差は認めら
れなかった。又、大豆ペプチド投与群の脾臓重量は１０
４．７±６．１、対照群のそれは７３．１±１０．９で
両者間に有意差は認められなかった。マウス脾細胞での
抗体産生能を表４に示した。大豆ペプチド投与群の抗体
産生細胞数は１１１２±３０６．６であり、対照群の抗
体産生細胞数４９３．３±１７０．２と比較して有意
（ｐ＜０．０１、ｔ検定）に上昇していた。
齢（Ｓｌｃ：Ｃ５７ＢＬ／６、ＳＰＦ）を日本エスエル
シー（株）より購入し、１週間予備飼育を行った後、健
常な動物を試験に供した。マウスの飼育は温度２３±２
℃、湿度５５±１０％に保った飼育室内のエアコンケー
ジで行った。餌料はオリエンタル酵母（株）製ＭＦ、水
は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由に摂取させ
た。１群３例のウサギを用い、製造例１における精製ペ
プチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）２００ｍｇ／ｋｇ／
ｄａｙを体重１０ｇ当り０．１ｍｌの割合で１０日間連
続経口投与した。体重は、毎日計測した。大豆ペプチド
の投与開始から５日後、それぞれのマウスの尾静脈にヒ
ツジ赤血球（ＳＲＢＣ、デンカ生研（株））５Ｘ１０８
ｃｅｌｌｓ／ｍｌを０．２ｍｌ投与して免疫した。免疫
の５日後、各群のマウスから脾臓を採取し、Ｅａｇｌ
ｅ’ｓ ｍｎｉｍｌ ｅｓｓｅ−ｎｔｉａｌ ｍｅｄｉ
ｕｍ（ＥＭＥＭ、日水製薬（株））を入れたシャーレ内
で脾細胞を遊離させた。リン酸緩衝液 （ＰＢＳ）で３
回洗浄した後、ＥＭＥＭで２．５Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／
ｍｌに調整した脾細胞と５０％ＳＲＢＣ浮遊液及びモル
モット乾燥補体（デンカ生研（株））を８：１：１の割
合で混合した。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｊ．らの方
法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４，５９９，（１９６
８））に準じて３７℃で９０分反応後、溶血斑（ｐｌａ
ｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＰＦＣ）を計測し
た。 大豆ペプチド（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１
０日間経口投与したマウスの体重変化並びに脾細胞調整
時に測定した脾臓重量を表３に示した。体重変化におい
て大豆ペプチド投与群と対照群との間に有意差は認めら
れなかった。又、大豆ペプチド投与群の脾臓重量は１０
４．７±６．１、対照群のそれは７３．１±１０．９で
両者間に有意差は認められなかった。マウス脾細胞での
抗体産生能を表４に示した。大豆ペプチド投与群の抗体
産生細胞数は１１１２±３０６．６であり、対照群の抗
体産生細胞数４９３．３±１７０．２と比較して有意
（ｐ＜０．０１、ｔ検定）に上昇していた。
【００１６】試験例３ （合成ペプチドのマイトージェン活性の測定）藤原らの
方法（栄食誌，Ｖｏｌ４３，Ｎｏ．３，２０３−２０
８，（１９９０））に準じてマイトージェン活性を測定
した。製造例２で合成した新規な６種類のペプチドは、
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に対して
溶解（最大濃度１ｍｇ／ｍｌ）し、０．２μのフイルタ
ー濾過滅菌後、同培地により２倍ごと段階希釈を行った
ものを供試サンプルとした。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６
週、雄）の脾臓を無菌的に摘出し、ワイヤーメッシュ上
で２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地を滴下
しながら穏やかに磨砕し、通過液を更にもう一組のワイ
ヤーメッシュを通すことにより、単一細胞浮遊液を調製
した。脾細胞は同培地にて３回洗浄後、牛胎児血清１０
％を含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地
に浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに５Ｘ１０５
個／１００μι／ウェルとなるように分注した。その
後、前記の供試サンプル１０μιを加え、５％ＣＯ２雰
囲気下、３７℃で培養した。尚、陰性対照には、２５ｍ
Ｍ ＭＨＥＰＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地１０μιを、陽
性対照にはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、終濃度１μｇ
／ｍｌ）並びにリポポリサッカライド（ＬＰＳ、終濃度
１００μｇ／ｍｌ）を供試サンプルの代わりに加えてい
る。その後、０．５％の３−（４，５−ジメチル−２−
チアゾリル）−２，５ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム
ブロマイド（ＭＴＴ） 溶液を１０μι加え、更に３時
間培養を行い、しかる後、生じたＭＴＴ−フォルマザン
を酸−イソプロパナノール溶液（０．０４Ｎ濃度に塩酸
を添加）１００μιを加えて溶解し、ＥＩＡリーダーに
て５９５ｎｍの吸光度を測定した。データは陰性対照の
値を１００とした相対値にて表示している。マイトジェ
ン活性の結果は表５に示すとおりである。以上の試験の
結果、本発明に係わる新規な６種の大豆由来ペプチドよ
り成るＳＰ−ＩＩ分画部分は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて
有意に免疫機能に影響を及ぼすことが確認された。更
に、本発明に係わる新規な６種の合成ペプチドは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて有意にマイトージェン活性を示す
ことが確認され、免疫賦活剤として有用である。尚、本
発明に係わる新規な６種の大豆由来ペプチドは、構造的
にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおい
て、構造中に採用することもできる。
方法（栄食誌，Ｖｏｌ４３，Ｎｏ．３，２０３−２０
８，（１９９０））に準じてマイトージェン活性を測定
した。製造例２で合成した新規な６種類のペプチドは、
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に対して
溶解（最大濃度１ｍｇ／ｍｌ）し、０．２μのフイルタ
ー濾過滅菌後、同培地により２倍ごと段階希釈を行った
ものを供試サンプルとした。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６
週、雄）の脾臓を無菌的に摘出し、ワイヤーメッシュ上
で２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地を滴下
しながら穏やかに磨砕し、通過液を更にもう一組のワイ
ヤーメッシュを通すことにより、単一細胞浮遊液を調製
した。脾細胞は同培地にて３回洗浄後、牛胎児血清１０
％を含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地
に浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに５Ｘ１０５
個／１００μι／ウェルとなるように分注した。その
後、前記の供試サンプル１０μιを加え、５％ＣＯ２雰
囲気下、３７℃で培養した。尚、陰性対照には、２５ｍ
Ｍ ＭＨＥＰＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地１０μιを、陽
性対照にはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、終濃度１μｇ
／ｍｌ）並びにリポポリサッカライド（ＬＰＳ、終濃度
１００μｇ／ｍｌ）を供試サンプルの代わりに加えてい
る。その後、０．５％の３−（４，５−ジメチル−２−
チアゾリル）−２，５ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム
ブロマイド（ＭＴＴ） 溶液を１０μι加え、更に３時
間培養を行い、しかる後、生じたＭＴＴ−フォルマザン
を酸−イソプロパナノール溶液（０．０４Ｎ濃度に塩酸
を添加）１００μιを加えて溶解し、ＥＩＡリーダーに
て５９５ｎｍの吸光度を測定した。データは陰性対照の
値を１００とした相対値にて表示している。マイトジェ
ン活性の結果は表５に示すとおりである。以上の試験の
結果、本発明に係わる新規な６種の大豆由来ペプチドよ
り成るＳＰ−ＩＩ分画部分は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて
有意に免疫機能に影響を及ぼすことが確認された。更
に、本発明に係わる新規な６種の合成ペプチドは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて有意にマイトージェン活性を示す
ことが確認され、免疫賦活剤として有用である。尚、本
発明に係わる新規な６種の大豆由来ペプチドは、構造的
にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおい
て、構造中に採用することもできる。
【００１７】
【表１】 大豆ペプチド（ＳＰ−ＩＩ分画部分）投与時の、ウサギ
体重変化。大豆ペプチド（ＳＰ−ＩＩ分画部分）投与時
の、ウサギ体重変化。
体重変化。大豆ペプチド（ＳＰ−ＩＩ分画部分）投与時
の、ウサギ体重変化。
【００１８】
【表２】 大豆ペプチド（ＳＰ−ＩＩ分画部分）投与時の、ウサギ
末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ刺激による幼若化反
応。
末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ刺激による幼若化反
応。
【００１８】
【表３】 大豆ペプチド（ＳＰ−ＩＩ分画部分）投与時の、マウス
体重変化と脾臓重量。
体重変化と脾臓重量。
【００１９】
【表４】 大豆ペプチド（ＳＰ−ＩＩ分画部分）投与時の、マウス
脾細胞での抗体産生能。
脾細胞での抗体産生能。
【００２０】
【表５】 合成ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマイトージェ
ン活性。
ン活性。
【００２１】
【図１】本発明に係る６種のペプチドの、製造例１にお
けるＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラムクロマトグラフィ
ーによる免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図で
ある。
けるＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラムクロマトグラフィ
ーによる免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図で
ある。
【図２】同、製造例１におけるＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｃ−２５［Ｈ＋］カラムクロマトグラフィーによる免
疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
Ｃ−２５［Ｈ＋］カラムクロマトグラフィーによる免
疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図３】同、製造例１における逆相高速液体クロマトグ
ラフィーによる免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示
す図である。
ラフィーによる免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示
す図である。
【図４、図５、図６、図７、図８、図９】同、製造例２
で得られた６種のペプチドのマススペクトルを示す図で
ある。
で得られた６種のペプチドのマススペクトルを示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/06 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 1/12 Ｃ１２Ｐ 21/06 9282−4Ｂ
Claims (12)
- 【請求項１】 次式； Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチド。 - 【請求項２】 次式； Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする免疫賦活剤。 - 【請求項３】 次式； Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチド。 - 【請求項４】 次式； Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする免疫賦活剤。 - 【請求項５】 次式； Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチド。 - 【請求項６】 次式； Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする免疫賦活剤。 - 【請求項７】 次式； Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチド。 - 【請求項８】 次式； Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする免疫賦活剤。 - 【請求項９】 次式； Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−
Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチド。 - 【請求項１０】 次式； Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−
Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする免疫賦活剤。 - 【請求項１１】 次式； Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチド。 - 【請求項１２】 次式； Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする免疫賦活剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3323606A JPH07107078B2 (ja) | 1991-10-02 | 1991-10-02 | 新規なペプチドおよび免疫賦活剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3323606A JPH07107078B2 (ja) | 1991-10-02 | 1991-10-02 | 新規なペプチドおよび免疫賦活剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07138287A JPH07138287A (ja) | 1995-05-30 |
| JPH07107078B2 true JPH07107078B2 (ja) | 1995-11-15 |
Family
ID=18156597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3323606A Expired - Lifetime JPH07107078B2 (ja) | 1991-10-02 | 1991-10-02 | 新規なペプチドおよび免疫賦活剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07107078B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102665749B (zh) * | 2009-07-13 | 2014-09-17 | 不二制油株式会社 | 口服抗炎剂和口服抗炎肽 |
-
1991
- 1991-10-02 JP JP3323606A patent/JPH07107078B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07138287A (ja) | 1995-05-30 |
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