WO2013133031A1 - ジペプチジルペプチダーゼ－iｖ阻害剤 - Google Patents

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WO2013133031A1
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peptide
val
pro
amino acid
inhibitor
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明男 山田
琢磨 桜井
越智　大介
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森永乳業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor and the like.
  • Dipeptidyl peptidase-IV (di- peptidyl peptidase-IV: hereinafter also referred to as “DPP-4”) is a multifunctional transmembrane glycoprotein having N-terminal dipeptidase activity. It is present on most mammalian cells and is present in various tissues such as the liver, kidney, small intestine, salivary gland, blood cells and plasma, so it is assumed that it has a broad role in vivo and is created. It is an enzyme that has recently attracted attention as a drug target.
  • Dipeptidyl peptidase-IV is known to be a degrading enzyme of glucagon-like peptide 1 (hereinafter referred to as “GLP-1”) and glucose-dependent insulinotropic polypeptide (hereinafter referred to as “GIP”) of incretin. ing.
  • GLP-1 glucagon-like peptide 1
  • GIP glucose-dependent insulinotropic polypeptide
  • the dipeptidyl peptidase-IV inhibitor having an action of inhibiting dipeptidyl peptidase-IV activity is expected to be used as an antidiabetic agent.
  • dipeptidyl peptidase-IV inhibitors are still a new genre of therapeutic agents compared to insulin secretion inhibitors and glucose absorption inhibitors, and many new substances having dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity can be found. It is desired.
  • the first step in the treatment of diabetes is diet therapy and exercise therapy, and when the blood glucose level cannot be controlled even now, pharmaceuticals for treating diabetes are currently used. Therefore, if it is possible to provide a substance having dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity as a supplement or food additive, it is considered that it can contribute widely to the improvement of blood glucose level.
  • Patent Document 1 discloses that a bicyclic pyrimidine is used as a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor for treating or preventing diabetes.
  • casein is subjected to alkaline decomposition by adjusting pH and temperature, and then various peptides such as proteases are further adjusted to separate and purify various peptides from hydrolyzed products.
  • a dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action has been found among them.
  • dipeptidyl peptidase-IV inhibitors derived from food see, for example, Patent Documents 3 to 5).
  • isolated peptides obtained by isolating only one peptide from casein or whey hydrolyzate are IPI, LPL, KVLP, LPVPQK, VPLGTQ, VPYPQ, PLLQ, GPFP, LPVPQ, LPQYL, MPLW, YVPEPF, PQSVLS, PFP, LPVP, EMPFPK, LPLP, GPFPIIV, APFPE, HPIK and AFPPEVF are described, and dipeptidyl peptidase-IV inhibition test results of these isolated peptides are disclosed.
  • dipeptidyl peptidase-IV inhibitors have been disclosed in the past, for example, in Patent Document 1, an organic synthetic compound requires a complicated synthesis process, and future verification is necessary regarding safety. . Any dipeptidyl peptidase-IV inhibitor should be considered, and the current situation is that the search for dipeptidyl peptidase-IV inhibitors is not sufficient.
  • search for novel peptides and various physiological activity of peptides have been conducted.
  • the present invention is to provide an excellent dipeptidyl peptidase-IV inhibitor.
  • peptide having a dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action is contained in a casein hydrolyzate obtained by hydrolyzing casein with a specific enzyme. It has also been found that there are a plurality of them, and that there are novel peptides in them. From this result, the peptide was Val-Pro-X [wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)] (SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as “peptide”). The present invention was completed.
  • this peptide is a food-derived component, it is considered to be highly safe, and this peptide VPX can also be provided as a supplement or food additive. Therefore, it is considered that the peptide VPX of the present disclosure can widely contribute to the improvement of blood glucose level.
  • the peptide VPX of the present disclosure includes a peptide having an angiotensin converting enzyme inhibitory action, it is considered that the peptide VPX of the present disclosure can widely contribute to the improvement of hypertension. From the above, it can be said that the peptide VPX of the present disclosure is a more effective substance with added value.
  • the present invention is a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)).
  • a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor and / or angiotensin converting enzyme comprising a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)) as an active ingredient
  • a blood glucose level-inhibiting agent, hyperglycemia improving agent, antidiabetic comprising a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)) as an active ingredient
  • X is a basic amino acid residue, an aliphatic neutral amino acid residue, a neutral amino acid residue having a hydroxy group, a neutral amino acid residue having an amide group, or a neutral amino acid residue having an aromatic group. Is preferred.
  • Said X is preferably selected from alanine, glutamine, methionine, asparagine, glycine, valine, tyrosine, serine and lysine residues. .
  • L-amino acids are also preferred. It is preferable that the peptide is selected from peptides consisting of any one of the following amino acid sequences (a) to (i).
  • Val-Pro-Ala (VPA: SEQ ID NO: 2)
  • B Val-Pro-Gln (VPQ: SEQ ID NO: 3)
  • C Val-Pro-Met (VPM: SEQ ID NO: 4)
  • D Val-Pro-Asn
  • E Val-Pro-Gly
  • VPG Val ID NO: 6
  • F Val-Pro-Val
  • VV SEQ ID NO: 7
  • G Val-Pro-Tyr
  • H Val-Pro-Ser
  • VK Val-Pro-Lys
  • the present invention can provide a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor, a blood glucose level increase inhibitor, a vascular endothelial disorder inhibitor, and the like. .
  • the peptide of the present disclosure has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) represented by a peptide consisting of Val-Pro-X.
  • Val (V) represents a valine residue
  • Pro (P) represents a proline residue
  • X represents any amino acid residue.
  • These amino acid residues are preferably L-type.
  • the X is not particularly limited, and examples thereof include amino acid residues that can be obtained from milk protein degradation products, and those selected from these amino acid residues are preferable.
  • X is preferably 20 natural amino acids.
  • the free amino acid is generally indicated by “ + H 3 N— (R 1 ) CH—COO ⁇ ”, and the peptide of the present disclosure is referred to as “Val-Pro-HN— (R 1 ) CH—COOH”. It is also possible to show.
  • the amino acid residues represented by X can be classified into acidic amino acid residues, basic amino acid residues, and neutral amino acid residues. Said X can be selected from one or more of the following
  • Examples of the acidic amino acid residue include an aspartic acid residue (Asp (D)) and a glutamic acid residue (Glu (E)). Of these, those having two carbonyl groups are preferred.
  • Examples of the basic amino acid residue include a lysine residue (Lys (K)), an arginine residue (Arg (R)), a histidine residue (His (H)), and the like. Of these, those having 2 to 4 amino groups are preferred.
  • neutral amino acid residues examples include those having R 1 of the amino acid residue X having hydrogen and an alkyl group; a hydroxy group; sulfur; an acid amide; an aromatic group, and the like. Aliphatic neutral amino acid residues; neutral amino acid residues having a hydroxy group; neutral amino acid residues having a sulfur; neutral amino acid residues having an amide group; neutral amino acid residues having an aromatic group is there.
  • the neutral amino acid residues As the aliphatic neutral amino acid residues, alanine residues (Ala (A)), glycine residues (Gly (G)), valine residues (Val (V)), leucine residues (Leu (L)), An isoleucine residue (Ile (I)) and the like can be mentioned.
  • the neutral amino acid residue which has hydrogen or an alkyl group whose R ⁇ 1 > of the said amino acid residue X is hydrogen or an alkyl group is preferable.
  • the alkyl group is preferably a straight chain or branched chain, and more preferably a branched chain.
  • the carbon number of R 1 in the aliphatic neutral amino acid residue is preferably 0-4, more preferably 0-3.
  • R 1 hydrogen, methyl group (—CH 3 ) or isopropyl group (—CH (CH 3 ) 2 ).
  • the neutral amino acid residue having a hydroxy group include a serine residue (Ser (S)) and a threonine residue (Thr (T)).
  • R 1 of the amino acid residue X is preferably a C 1-2 alkyl group having a hydroxy group.
  • the neutral amino acid residue having sulfur include a cysteine residue (Cys (C)) and a methionine residue (Met (M)).
  • Examples of the neutral amino acid residue having the amide group include a glutamine residue (Gln (Q)) and an asparagine residue (Asn (N)).
  • R 1 of the amino acid residue X is preferably an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms having an amide group.
  • the aromatic neutral amino acid residue include phenylalanine residue (Phe (F)), tyrosine residue (Tyr (Y)), tryptophan residue (Trp (W)) and the like.
  • R 1 of the amino acid residue X is preferably a benzyl group (eg, HO—C 6 H 4 —CH 2 — or HC 6 H 4 —CH 2 — etc.) which may have a hydroxy group, The number of hydroxyl groups is preferably 0-1.
  • amino acid residues described above basic amino acid residues and neutral amino acid residues are preferred.
  • neutral amino acid residues an aliphatic neutral amino acid residue, a neutral amino acid residue having a hydroxy group, a neutral amino acid residue having an amide group, and a neutral amino acid residue having an aromatic group are preferred.
  • an aliphatic neutral amino acid residue and a neutral amino acid residue having an amide group are preferred.
  • amino acid residues represented by X those selected from alanine residue, glutamine residue, methionine residue, asparagine residue, glycine residue, valine residue, tyrosine residue, serine residue and lysine residue Is preferred.
  • alanine residues, glutamine residues, asparagine residues, glycine residues, valine residues, tyrosine residues and serine residues are preferred.
  • an alanine residue, a glutamine residue, and a valine residue are preferable in terms of physiological activity.
  • dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity preferably an alanine residue, a glutamine residue, an asparagine residue, a glycine residue, a valine residue, a tyrosine residue, a serine residue and a lysine residue, and an angiotensin Alanine residue and lysine residue are particularly preferable in terms of converting enzyme inhibitory activity.
  • Val-Pro-Ala (VPA: SEQ ID NO: 2) Val-Pro-Gln (VPQ: SEQ ID NO: 3), Val-Pro-Met (VPM: SEQ ID NO: 4), Val-Pro-Asn (VPN: SEQ ID NO: 5) Val-Pro-Gly (VPG: SEQ ID NO: 6), Val-Pro-Val (VPV: SEQ ID NO: 7), Val-Pro-Tyr (VPY: SEQ ID NO: 8), Val-Pro-Ser (VPS: SEQ ID NO: 9), and tripeptides such as Val-Pro-Lys (VPK: SEQ ID NO: 10).
  • the peptide of the present disclosure may be a salt of this peptide.
  • the salts include alkali metals such as potassium and sodium; alkaline earth metals such as calcium and magnesium, and one or more of them may be used as appropriate.
  • the method for producing the peptide VPX of the present disclosure can be performed according to a method described in, for example, International Publication No. 2003/044044 Pamphlet [Reference 1], and the following methods are exemplified. This is not particularly limited.
  • a protein or peptide containing the amino acid sequence represented by Val-Pro-X (SEQ ID NO: 1) or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 to 10 is decomposed by hydrolysis, etc.
  • a method obtained by separating and purifying a method obtained by synthesizing peptide VPX by a peptide chemical synthesis method, and then separating and purifying peptide VPX from the obtained synthesized product; a plant producing peptide VPX and a peptide containing the peptide VPX, Examples include extraction from animals and microorganisms, and separation and purification from the obtained extract.
  • the peptide VPX of the present disclosure can be produced, for example, by appropriately hydrolyzing a protein such as casein with an acid alkali or an enzyme.
  • a method for obtaining the peptide VPX by hydrolyzing a raw material protein with a hydrolase is exemplified. First, before hydrolyzing a raw material protein with an enzyme, the protein is dissolved, dispersed or suspended in water.
  • the raw material protein is not particularly limited as long as it is a protein containing VPX and can produce the peptide of the present disclosure when appropriately digested with a hydrolase. Examples of the protein include those derived from animals and microorganisms, and casein that is available in large quantities is preferable.
  • the treatment method varies depending on the properties of the raw protein, but if the raw protein is soluble, the raw protein may be dispersed and dissolved in water or warm water, and if it is poorly soluble, the protein will be dissolved in hot water. May be homogenized by mixing and stirring.
  • an alkaline agent or an acid agent may be added to the protein-containing solution to adjust the pH appropriately (eg, pH 7 to 10).
  • This pH is preferably adjusted to the optimum pH of the hydrolase used or in the vicinity thereof.
  • the alkali agent include hydroxides such as sodium hydroxide and calcium hydroxide; carbonates such as potassium carbonate, and the like, and these may be alkali metal salts or alkaline earth metal salts.
  • the acid agent include inorganic acids such as hydrochloric acid and phosphoric acid; organic acids such as citric acid, acetic acid, and formic acid. Of these, one or more may be used as appropriate.
  • a predetermined amount of hydrolase is added to the solution containing the protein and reacted at a temperature of about 10 to 85 ° C. for 0.1 to 48 hours to obtain a hydrolyzate.
  • the solution is maintained at an appropriate temperature according to the type of the enzyme, for example, 30 to 60 ° C., preferably 45 to 55 ° C. to start protein hydrolysis. Is desirable.
  • the hydrolysis reaction time may be continued until the desired decomposition rate is reached while monitoring the decomposition rate of the enzyme reaction.
  • the degradation rate of the starting protein is preferably 20 to 55% in order to obtain the peptide of the present disclosure.
  • the hydrolase reaction is stopped, for example, by deactivation of the enzyme in the hydrolyzate, and can be performed by a heat deactivation treatment by a conventional method.
  • the heating temperature and holding time of the heat deactivation treatment can be appropriately set in consideration of the thermal stability of the enzyme used, and can be set as appropriate under conditions that can be sufficiently deactivated, for example, at a temperature range of 80 to 130 ° C. for 30 minutes. It can be performed with a holding time of ⁇ 2 seconds.
  • the hydrolase is not particularly limited, but is preferably an enzyme that can hydrolyze the raw protein to produce the peptide of the present disclosure.
  • the enzyme that can be produced is preferably an endopeptidase.
  • endopeptidase examples include those derived from microorganisms and animals. Specific examples include proteases derived from bacteria belonging to the genus Bacillus and Aspergillus, and proteases derived from animal pancreas. A commercially available protease can be used. Preferable examples of commercially available proteases include proteases derived from Aspergillus bacteria such as protease A (manufactured by Amano Enzyme); and proteases derived from animal pancreas such as pancreatin (manufactured by Amano Enzyme).
  • a protease derived from Aspergillus when used, it is desirable to add it at a rate of 100 to 5000 active units per gram of protein.
  • a protease derived from animal pancreas when using a protease derived from animal pancreas, it is desirable to add it at a rate of 3000 to 8000 active units per gram of protein.
  • peptide VPX of the present disclosure It is preferable to isolate or purify the peptide VPX of the present disclosure from the hydrolyzate.
  • Purification of the peptide VPX of the present disclosure is usually performed in the same manner as used for purification of oligopeptides, such as ion exchange chromatography, adsorption chromatography, reverse phase chromatography, partition chromatography, gel filtration chromatography and the like. It can be carried out by appropriately combining methods such as various types of chromatography, solvent precipitation, salting out, and partitioning between the two liquid phases.
  • the fraction containing the target substance can be determined using the dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action and / or the angiotensin converting enzyme inhibitory action described below as an index. Moreover, the active ingredient of those fractions can be identified by mass spectrometry.
  • the proteolytic product obtained by hydrolase preferably contains at least VPX, and is more preferably an active ingredient prepared so as to contain the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 2 to 10. It is preferable in that it can be easily recovered.
  • the peptide VPX of this indication can be manufactured also by chemical synthesis.
  • the chemical synthesis of the peptide VPX of the present disclosure can be performed by a liquid phase method or a solid phase method which is usually used for the synthesis of oligopeptides.
  • the synthesized peptide is deprotected as necessary, and unreacted reagents and by-products can be removed to isolate the peptide VPX of the present disclosure.
  • Such peptide synthesis can be performed using a commercially available peptide synthesizer.
  • the fact that the target peptide was obtained can be confirmed using the dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action and / or the angiotensin converting enzyme inhibitory action described below as indicators.
  • the peptide VPX of the present disclosure has a dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action, as shown in Examples below.
  • Dipeptidyl peptidase-IV may cause various diseases and symptoms by decomposing compounds involved in physiological functions in vivo. For this reason, inhibition of dipeptidyl peptidase-IV takes advantage of dipeptidyl peptidase-IV by utilizing the fact that the life span of compounds involved in physiological functions in vivo that have been degraded by dipeptidyl peptidase-IV is extended. Prevention, amelioration, or treatment of the disease or symptom that occurs.
  • Examples of the compound involved in the physiological function include glucagon-like peptide 1 (GLP-1) of incretin and glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP). And by inhibiting the degradation of glucagon-like peptide 1 of this incretin, glucose-induced stimulation of insulin biosynthesis and secretion, glucagon secretion inhibition, regulation of gene expression, nutritional effects on sputum cells, suppression of food intake, In addition, it is possible to achieve various actions such as slowing of gastric emptying. This can contribute to normalization of the elevated blood glucose level and improvement / adjustment of hunger and body weight.
  • GLP-1 glucose-dependent insulinotropic polypeptide
  • dipeptidyl peptidase-IV reduces the function of vascular endothelial cells and damages vascular endothelial cells.
  • This decrease in blood vessel endothelial function or damage causes vascular disorders such as vasoconstriction, arteriosclerosis, and thrombus formation due to increased vascular tension, and these causes cause organ blood flow disorders, organ dysfunction, and diabetes. Complications will be induced.
  • dipeptidyl peptidase-IV inhibitors for example, see References 2 to 5 [Reference 2] Endocrine Journal 2011, 58 (1), 69-73. [Reference 3] J Am Coll Cardiol.
  • dipeptidyl peptidase-IV inhibitors In order to break this vicious circle, a combination of dipeptidyl peptidase-IV inhibitors and angiotensin converting enzyme inhibitors has been tried, and dipeptidyl peptidase-IV inhibitors also play an important role in the treatment of cardiovascular system It is considered a thing.
  • the peptide VPX of the present disclosure has a dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action, it suppresses blood sugar levels, suppresses hyperglycemia, suppresses vascular endothelial function, suppresses vascular endothelial disorders, suppresses vascular disorders, It shows an endothelial cell protective effect and an appetite suppressing effect.
  • the peptide VPX of the present disclosure is capable of suppressing appetite and protecting vascular endothelial cells.
  • “suppressing the increase in blood glucose level” here means including a decrease in blood glucose level, and particularly means “being able to lower a blood glucose level that is higher than a normal value or higher than necessary”.
  • the determination of the normal value of the blood glucose level may be based on the 2010 diagnostic criteria of the Japan Diabetes Society. Furthermore, by inhibiting dipeptidyl peptidase-IV with the peptide VPX of the present disclosure, it is considered possible to prevent, improve, or treat diseases and symptoms caused by dipeptidyl peptidase-IV. Therefore, the peptide VPX of the present disclosure can be used in a method for preventing, ameliorating and / or treating diseases and symptoms caused by dipeptidyl peptidase-IV after ingestion or administration to animals including humans. it can.
  • Examples of various diseases and symptoms caused by dipeptidyl peptidase-IV of the present disclosure include hyperglycemia, diabetes, diabetic complications, vascular endothelial disorder, and vascular disorder.
  • the various diseases caused by dipeptidyl peptidase-IV may be various diseases mediated by dipeptidyl peptidase-IV.
  • various diseases caused by hyperglycemia, diabetes and hyperglycemia conditions include, for example, diabetic microangiopathy (eg retinopathy, nephropathy, neuropathy, etc.) and macrovascular complications (eg angina) Ischemic heart disease such as symptom / myocardial infarction, cerebral infarction, obstructive arteriosclerosis, gangrene, etc.).
  • the dipeptidyl peptidase-IV inhibitor can be used as a prophylactic or therapeutic agent for the above-mentioned various diseases is as disclosed in the aforementioned Patent Documents 1 to 5 and Reference Documents 2 to 5. It goes without saying that the disclosed peptide VPX can also be implemented as a prophylactic or therapeutic agent for the various diseases. Therefore, the peptide VPX of the present disclosure may be used for dipeptidyl peptidase-IV inhibition, suppression of increase in blood glucose level, improvement of hyperglycemia, suppression of vascular endothelial damage, anti-diabetes, etc.
  • angiotensin converting enzyme (hereinafter also referred to as “ACE”) inhibitory action as shown in Examples below.
  • the angiotensin converting enzyme is an enzyme that acts on angiotensin I generated from angiotensinogen by cleavage with renin, liberates two C-terminal amino acids, and converts them into angiotensin II.
  • Angiotensin converting enzyme generates angiotensin II having a strong pressor action and also has an action of inactivating bradykinin having a hypotensive action.
  • Inhibiting angiotensin-converting enzyme in addition to blood pressure lowering action and bradykinin inactivating action, cardiac hypertrophy retraction action, peripheral vasodilation action, renal protection action, substance P degradation inhibition action, etc. are possible, and depending on the hypertension state It is considered that an inhibitory action on vascular endothelial injury, an inhibitory action on vascular injury, and the like are possible. It is also known that an angiotensin converting enzyme inhibitor is effective in improving essential hypertension. Further, by inhibiting angiotensin converting enzyme, it is considered possible to prevent, improve or treat diseases and symptoms caused by angiotensin converting enzyme.
  • diseases and symptoms caused by angiotensin converting enzyme include hypertension, cardiac hypertrophy, and renal hypertrophy.
  • the various diseases caused by angiotensin converting enzyme may be various diseases mediated by angiotensin converting enzyme.
  • diseases and symptoms caused by hypertension or hypertension include cardiovascular diseases and vascular disorders such as cerebral hemorrhage, cerebral infarction, angina pectoris, myocardial infarction, renal failure, visual impairment, and angioedema. .
  • the peptide VPX of the present disclosure has an angiotensin converting enzyme inhibitory action, the blood pressure lowering action, the bradykinin inactivating action, the hypertensive symptom improving action, the vascular endothelial disorder inhibiting action caused by the hypertension state, and the vascular disorder inhibiting action The action etc. are shown. Furthermore, by inhibiting the angiotensin converting enzyme with the peptide VPX of the present disclosure, it is considered possible to prevent, ameliorate, or treat diseases and symptoms caused by the above-mentioned angiotensin converting enzyme.
  • the peptide VPX of the present disclosure can be used in a method for preventing, ameliorating and / or treating a disease or symptom caused by an angiotensin converting enzyme by ingestion or administration to an animal including a human.
  • an angiotensin converting enzyme inhibitor can be used as a prophylactic or therapeutic agent for the above-mentioned various diseases is as disclosed in Patent Documents 1 and 6 to 8, and the peptide VPX of the present disclosure is also disclosed.
  • the present invention can also be implemented as a prophylactic or therapeutic agent for the various diseases.
  • the peptide VPX of the present disclosure may be used for angiotensin converting enzyme inhibition, blood pressure lowering, hypertension and the like, and uses as described above for angiotensin converting enzyme inhibitor, blood pressure lowering agent, antihypertensive agent and the like.
  • the peptide VPX of the present disclosure can be provided as a more useful compound when it has two effects of suppressing blood glucose level increase and lowering blood pressure.
  • the function of the endothelial cells of the blood vessels decreases and vascular endothelial damage is likely to occur, but high blood pressure that gives a strong load to the blood vessels increases the risk of causing vascular damage.
  • Factors (NO and PGI2) that relax vascular smooth muscle are produced from vascular endothelial cells.
  • NO and PGI2 that relax vascular smooth muscle are produced from vascular endothelial cells.
  • their releasing ability also decreases.
  • diabetics have high blood pressure.
  • high blood pressure falls into a vicious circle that places a load on vascular endothelial cells.
  • a person who is diabetic or a spare group thereof needs to pay attention to hypertension.
  • the spare group is a person who has not yet been diabetic but has a high blood glucose level
  • blood pressure can be lowered even if the blood sugar level is lowered with a hyperglycemic drug
  • blood sugar can be lowered even if the blood pressure is lowered with a blood pressure lowering drug.
  • diabetic and hypertensive humans are often prescribed both hyperglycemia-improving drugs and antihypertensive drugs, and there is a concern of side effects due to the combination of drugs. By having such an effect, it is possible to reduce the amount of drug used, and therefore, side effects can be expected to be reduced.
  • the peptide VPX of the present disclosure can be said to be very effective for improving blood vessels, suppressing vascular endothelial damage and preventing, improving or treating diabetes, and particularly for preventing, improving or treating vascular endothelial damage caused by hyperglycemic conditions. It is considered effective.
  • Specific diseases and symptoms of the vascular endothelial disorder of the present disclosure include, for example, diabetic vascular disorder.
  • the peptide VPX of the present disclosure and the above-mentioned various preparations containing this as an active ingredient are ingested or administered to animals including humans, Prevention, improvement and improvement of hyperglycemia, diabetes (especially type 2 diabetes), hypertension and diabetic complications (for example, diabetic vascular endothelial disorder, nephropathy, hypertension, etc.), vascular endothelial disorder, vascular disorder, etc. And / or can be used in methods for treatment.
  • the above-mentioned various preparations containing the peptide VPX of the present disclosure as an active ingredient are ingested or administered to animals including humans, and the above-mentioned hyperglycemia, diabetes (especially type 2 diabetes) and diabetic complications (for example, , Diabetic vascular endothelial disorder, nephropathy, hypertension, etc.), vascular endothelial disorder, vascular disorder and the like can be used in a method for preventing, improving and / or treating.
  • the peptide VPX of the present disclosure and the above-mentioned various preparations containing the peptide VPX as an active ingredient are humans for the prevention, improvement and / or treatment of hyperglycemia, diabetes, vascular disorders, hypertension and the like as described above. It can be blended and used as an active ingredient of animal drugs, quasi drugs, skin preparations, cosmetics, foods and the like. When blended in a pharmaceutical product, it can be an oral or parenteral agent. In addition, when blended in foods, various diseases caused by the above-mentioned dipeptidyl peptidase-IV and / or various diseases caused by angiotensin converting enzyme, and various diseases caused by hyperglycemia and / or hypertension, etc.
  • peptide VPX of the present disclosure and the above-mentioned various preparations containing this as an active ingredient are human or animal for the prevention, amelioration and / or treatment of hyperglycemia, diabetes, hypertension, vascular disorders and the like as described above.
  • the peptide VPX of the present disclosure and the above-described various preparations containing the peptide VPX as an active ingredient may be either oral administration or parenteral administration, but oral administration is desirable.
  • Parenteral administration includes intravenous injection, rectal administration, inhalation and the like.
  • Examples of the dosage form for oral administration include tablets, capsules, troches, syrups, granules, acid agents, ointments and the like.
  • components such as excipients, pH adjusters, coloring agents, and corrigents that are commonly used for formulation can be used.
  • the peptide VPX of the present disclosure is contained in a food as an active ingredient, and as one aspect of the above-described various preparations containing the peptide VPX of the present disclosure and the active ingredient, dipeptidyl peptidase-IV action and / or angiotensin conversion It can also be processed as a food having an enzyme inhibitory action.
  • examples of such foods include liquids, pastes, solids, powders, etc.
  • liquid foods, feeds (including for pets), etc. for example, flour products, instant foods, processed agricultural products, Processed marine products, processed livestock products, milk / dairy products, fats and oils, basic seasonings, compound seasonings / foods, frozen foods, beverages, and other commercial products.
  • examples of the flour product include bread, macaroni, spaghetti, noodles, cake mix, fried flour, bread crumbs and the like.
  • examples of the instant foods include instant noodles, cup noodles, retort / cooked food, cooking canned food, microwave food, instant soup / stew, instant miso soup / soup, canned soup, freeze-dried food, and other instant foods.
  • examples of the processed agricultural products include canned agricultural products, canned fruits, jams and marmalades, pickles, boiled beans, dried agricultural products, cereals (cereal processed products), and the like.
  • examples of the processed fishery products include canned fishery products, fish hams and sausages, fish paste products, marine delicacies, and tsukudani.
  • Examples of the processed livestock products include canned livestock, pastes, livestock ham, sausages and the like.
  • Examples of the milk / dairy products include processed milk, milk beverages, yogurts, lactic acid bacteria beverages, cheese, ice creams, prepared powdered milks, creams, and other dairy products.
  • Examples of the fats and oils include butter, margarines, and vegetable oils.
  • the basic seasonings include soy sauce, miso, sauces, tomato processed seasonings, mirins, vinegars, etc.
  • the combined seasonings and foods include cooking mixes, curry ingredients, sauces, Examples include dressings, noodle soups, spices, and other complex seasonings.
  • Examples of the frozen food include raw material frozen food, semi-cooked frozen food, cooked frozen food, and the like.
  • the confectionery examples include caramel, candy, chewing gum, chocolate, cookies, biscuits, cakes, pie, snacks, crackers, Japanese confectionery, rice confectionery, bean confectionery, dessert confectionery, and other confectionery.
  • the beverages include carbonated beverages, natural fruit juices, fruit juice beverages, soft drinks with fruit juices, fruit drinks, fruit drinks with fruits, vegetable drinks, soy milk, soy milk drinks, coffee drinks, tea drinks, powdered drinks, concentrated drinks Sports drinks, nutritional drinks, alcoholic drinks, other taste drinks, and the like.
  • examples of commercially available foods other than the above include baby foods, sprinkles, and tea paste.
  • the compounding amount of the peptide VPX of the present disclosure is preferably at least 0.001% by mass with respect to the final composition of the preparation.
  • the dose of the peptide VPX of the present disclosure varies depending on age, symptoms, etc., but is usually 0.001 to 3000 mg / day, preferably 0.01 to 30 mg / day, and is divided into 1 to 3 times a day. It may be administered.
  • Production Example 1 Production of VPX Peptide by Enzymatic Degradation of Casein ⁇ 1> Enzymatic Degradation of Casein 900 g of water was added to 100 g of commercially available casein (manufactured by New Zealand Daily Board), dispersed well, and sodium hydroxide was added to adjust the pH of the solution. Was adjusted to 7.0 to completely dissolve casein. The aqueous casein solution was sterilized by heating at 85 ° C.
  • HPLC condition 1 Column: Cadenza CD-C18 10 mmI. D. ⁇ 250mm (manufactured by Intact Corporation) Detection: UV 215nm Flow rate: 3 ml / min Eluent A: Aqueous solution containing 0.2% FA Eluent B: Acetonitrile solution containing 0.2% FA From 98% of Eluent A, 75% after 30 minutes, 50% after 40 minutes
  • the hydrolyzate was separated under a gradient condition of 20% after 43 minutes, and the eluate was fractionated every 0.75 ml.
  • the ⁇ 1> casein hydrolyzate has dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity, and in the degraded product, VPV (SEQ ID NO: 7), VPY (SEQ ID NO: 8), VPK (SEQ ID NO: 10) ) was also confirmed. All of these amino acid residues were L-type.
  • VPQ SEQ ID NO: 3
  • a spectrum similar to that in the purified fraction (molecular weight (M) by mass spectrometry: 342.2) was obtained.
  • VPM SEQ ID NO: 4
  • VPN SEQ ID NO: 5
  • VPG SEQ ID NO: 6
  • VPV SEQ ID NO: 7
  • VPY SEQ ID NO: 8
  • VPS SEQ ID NO: 9
  • VPK VPK
  • Test Example 1 Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity confirmation test of each peptide The dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity confirmation test of each peptide obtained in Production Example 2 shown in Table 1 was conducted, and the results are shown in Table 1. .
  • Test Example 2 Angiotensin converting enzyme inhibitory activity confirmation test of each peptide
  • VPA SEQ ID NO: 2
  • VPK VPK
  • the 50% inhibitory concentration was 24.8 ⁇ g, respectively. / Ml and 132 ⁇ g / ml. Therefore, since this VPA and VPK have both dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity and angiotensin converting enzyme inhibitory activity, they are very effective for vascular improvement, vascular endothelial disorder suppression and diabetes prevention, improvement or treatment. It can be said.
  • the enzyme degradation product of casein containing at least one of these tripeptides (SEQ ID NOs: 2 to 10) is used as a material or food having a dipeptidyl peptidase-IV inhibitory action, an angiotensin converting enzyme inhibitory action, etc. I think it can be used for food, medicine, etc.
  • VPA was found in the casein degradation products of CU5000 (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), and the 50% inhibitory concentration of these dipeptidyl peptidase-IV inhibitors was 84 ⁇ g / ml. Met.
  • the 50% inhibitory concentration of dipeptidyl peptidase-IV inhibition for C800 is> 1000 ⁇ g / ml, and dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity is not observed even in casein degradation products. was there.
  • DPP-4 dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity
  • the measurement of dipeptidyl peptidase-IV (DPP-4) inhibition was performed according to the method of Kato et al. “Kato, T. et al. Biochem. Med. 19, p351, 1978”. Specifically, the enzyme reaction was performed using Recombinant Human DPPIV / CD26 (R & D Systems, Inc.) as the enzyme (DPP-4) and H-Gly-Pro-AMC (Biomol GmbH) as the substrate.
  • Inhibition rate (%) 100% ⁇ [(Yb) / (Xa)] ⁇ 100%
  • X water + enzyme + substrate
  • Y test substance + enzyme + substrate a: water + substrate b: test substance + substrate
  • IC 50 was calculated by calculating back the concentration at which the inhibition rate of the enzyme was 50%.
  • ACE inhibition angiotensin converting enzyme inhibition
  • the peptide VPX of the present invention can be isolated from casein hydrolyzate, it is highly safe and can be used in a wide range of fields such as pharmaceuticals, foods, topical skin preparations and functional foods. It is.
  • a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)).
  • Val-Pro-Ala SEQ ID NO: 2
  • B Val-Pro-Gln
  • C Val-Pro-Met
  • D Val-Pro-Asn
  • E Val-Pro-Gly
  • F Val-Pro-Val
  • G Val-Pro-Tyr
  • H Val-Pro-Ser
  • I Val-Pro-Lys (SEQ ID NO: 10)
  • VPA SEQ ID NO: 2
  • VPQ SEQ ID NO: 3
  • VPN SEQ ID NO: 5
  • VPG SEQ ID NO: 6
  • VPV SEQ ID NO: 7
  • VPY SEQ ID NO: 8
  • VPS SEQ ID NO: 9
  • VPK VPK
  • VPA SEQ ID NO: 2
  • VPQ SEQ ID NO: 3
  • VPV SEQ ID NO: 7
  • VPA angiotensin converting enzyme inhibitory activity
  • VPA SEQ ID NO: 2
  • VPK SEQ ID NO: 10
  • One or more peptides consisting of Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)), or any one of the above-mentioned [2] to [4] Containing the peptide according to item as an active ingredient, A dipeptidyl peptidase-IV inhibitor, a hyperglycemia improving agent, a blood glucose level increase inhibitor, an antidiabetic agent, a vascular endothelial disorder inhibitor, a blood vessel improving agent, an angiotensin converting enzyme inhibitor, an antihypertensive agent or an antihypertensive agent.
  • Dipeptidyl peptidase-IV inhibitor for the manufacture of Use of a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)) or the peptide according to any one of [2] to [4] above.
  • a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)), or a peptide according to any one of [2] to [4] above of, Use for dipeptidyl peptidase-IV inhibitor, hyperglycemia improving agent, blood glucose level increasing inhibitor, antidiabetic agent, vascular endothelial disorder inhibitor, vascular improving agent, angiotensin converting enzyme inhibitor, antihypertensive agent or antihypertensive agent .
  • a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)), or a peptide according to any one of [2] to [4] above of, Use for dipeptidyl peptidase-IV-inhibiting foods, foods for lowering blood sugar, foods for anti-diabetes, foods for suppressing vascular endothelial injury or foods for improving blood vessels.
  • a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)) or a peptide according to any one of [2] to [4] above.
  • a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)), or a peptide according to any one of [2] to [4] above
  • X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)
  • a treatment method Prevention and improvement of diseases caused by dipeptidyl peptidase-IV, diseases caused by hyperglycemic conditions, diabetes, diseases caused by vascular endothelial or vascular disorders, diseases caused by angiotensin converting enzyme, diseases caused by hypertension Or a treatment method.
  • a peptide comprising Val-Pro-X (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)) or a peptide according to any one of [2] to [4] above.
  • the disease and / or symptom caused by the dipeptidyl peptidase-IV is preferably selected from hyperglycemia, diabetes, diabetic complications, vascular endothelial disorder and vascular disorder.
  • the disease and / or symptom caused by the angiotensin converting enzyme is selected from hypertension and cardiovascular disease.
  • a peptide comprising Val-Pro-X obtained by hydrolyzing casein (wherein X represents an amino acid residue (excluding L-proline residue)), or the above-mentioned [2] to [4] The peptide of any one of these, and its manufacturing method.
  • the peptide according to any one of [4] to [4] and a method for producing the peptide.
  • A Performing with a hydrolase (preferably endopeptidase). It is preferably carried out under conditions of 10 to 85 ° C. and 0.1 to 48 hours.
  • B Separating and purifying the hydrolyzate by chromatography.
  • one or two kinds selected from ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, partition chromatography and the like are used.

Abstract

　優れたペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤等を提供すること。　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕；前記Ｘは、塩基性アミノ酸残基、脂肪族中性アミノ酸残基、アミド基を有する中性アミノ酸残基又は芳香族を有する中性アミノ酸残基から選ばれるものであるのが好適である；前記Ｘが、アラニン残基、グルタミン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基、セリン残基及びリシン残基から選ばれるものが好適である；前記ペプチドを有効成分として含有するジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、血管内皮障害抑制剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤。

Description

ジペプチジルペプチダーゼ－IＶ阻害剤
　本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤等に関する。
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（di- peptidyl peptidase-IV：以下、「ＤＰＰ－４」ともいう）は、Ｎ末端ジペプチダーゼ活性を有する多機能性の貫通膜型糖タンパク質である。これは、大部分の哺乳類の細胞上に存在し、肝臓、腎臓、小腸、唾液腺、血液細胞及び血漿等の種々の組織に存在していることから、生体内での幅広い役割が想定され、創薬のターゲットとして近年注目されている酵素である。
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶは、インクレチンのグルカゴン様ペプチド１（以下、「ＧＬＰ－１」という）及びグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（以下、「ＧＩＰ」という）の分解酵素であることが知られている。このＧＬＰ－１は、食後に放出されるものであり、インスリンの生合成及び分泌に対するグルコース誘導性の刺激、グルカゴン分泌抑制、遺伝子発現の調整、Β細胞に対する栄養性の効果、食物摂取の抑制、及び胃内容排出の緩徐化をはじめとする、多面的な作用を有する。そして、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶを阻害することで、インクレチンのＧＬＰ－１及びＧＩＰの分解が抑制され、血中のこれらの濃度が上昇する。その結果、インスリン分泌が促進され、血糖値を低下させることが知られている。このインクレチンによるインスリンの分泌促進は、血糖値が高値であることが作動条件である。このため、２型糖尿病の中でもインスリン分泌低下による糖尿病において、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶを阻害することは、これまでのインスリン分泌促進剤で生じる低血糖症という副作用の危険性が少ないものと言える。
　このように、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ活性を阻害する作用を有するジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤に関して、抗糖尿病剤としての利用が期待されている。しかしながら、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤は、インスリン分泌抑制剤及びブドウ糖吸収阻害剤等と比べて未だ新しいジャンルの治療薬と言え、新たなジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用を有する物質を数多く見出すことが望まれている。さらに、糖尿病の治療の第一歩は食事療法と運動療法であり、それでも血糖値のコントロールが出来ない場合に、糖尿病治療用医薬品が用いられているのが現状である。このようなことから、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を有する物質をサプリメントや食品添加物として提供することが可能であれば、広く血糖値の改善に資することができると考えられる。
　例えば、特許文献１には、二環系ピリミジンが、糖尿病治療用又は予防用のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤として使用されることが開示されている。
　また、例えば、特許文献２には、カゼインを、ｐＨ及び温度を調整してアルカリ分解した後、さらにプロテアーゼ等の各種酵素を調整して酵素加水分解した加水分解物から、種々のペプチドを分離精製し、さらにその中からジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用のあるものを見出したことが開示されている。その他にも食品由来のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害物質についての開示がある（例えば、特許文献３～５参照）。
　また、例えば、特許文献６の表２には、カゼイン又はホエイ加水分解物から１つのペプチドだけを単離した単離ペプチドである、ＩＰＩ、ＬＰＬ、ＫＶＬＰ、ＬＰＶＰＱＫ、ＶＰＬＧＴＱ、ＶＰＹＰＱ、ＰＬＬＱ、ＧＰＦＰ、ＬＰＶＰＱ、ＬＰＱＹＬ、ＭＰＬＷ、ＹＶＰＥＰＦ、ＰＱＳＶＬＳ、ＰＦＰ、ＬＰＶＰ、ＥＭＰＦＰＫ、ＬＰＬＰ、ＧＰＦＰＩＩＶ、ＡＰＦＰＥ、ＨＰＩＫ及びＡＰＦＰＥＶＦが記載され、これら単離ペプチドのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害試験結果が開示されている。
特表２００８－５２７０１１号公報 米国特許出願公開第２００８／００７５９０４号明細書 特開２０１１－１４４１６７号公報 特開２００７－０３９４２４号公報 特開２００８－２８０２９１号公報 国際公開２００６／０６８４８０号パンフレット
　このように、従来よりジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤が開示されているものの、例えば特許文献１においては、有機合成化合物は複雑な合成過程を必要とし、安全性に関しては今後の検証が必要である。いずれのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤も検討すべき点があり、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害物質についての探究は十分ではないのが現状であった。
　また、ペプチドは有益な生理活性作用を有する場合があることから、新規ペプチドの探索及びペプチドの様々な生理活性作用の探求が行われている。しかし、ペプチド中のアミノ酸が増減したりアミノ酸の一部が異なると生理活性作用が低下若しくは消失することがあり、また、カゼイン等の乳由来の蛋白質の加水分解物中であっても無数のペプチドが混在するため、目的とする生理活性作用を有する新規又は既知のペプチドを見出すことは困難である。
　よって、本発明は、優れたジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤を提供することにある。
　本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、カゼインを特定の酵素で加水分解して得られたカゼイン加水分解物中に、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用を有するペプチドが複数存在し、またその中に新規なペプチドが存在することも見出した。この結果から、ペプチドがＶａｌ－Ｐｒｏ－Ｘ〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕（配列番号１）で表される配列を有するペプチド（以下、「ペプチドＶＰＸ」ともいう）を見出し、本発明を完成するに至った。
　しかも、このペプチドは食品由来の成分であったため安全性が高いと考えられ、このペプチドＶＰＸはサプリメントや食品添加物として提供することも可能である。よって、本開示のペプチドＶＰＸは、広く血糖値の改善に資することができると考えられる。また、本開示のペプチドＶＰＸにはアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドも存在するので、本開示のペプチドＶＰＸは広く高血圧の改善に資することができると考えられる。
　以上のことから、本開示のペプチドＶＰＸは、より付加価値のある有効な物質と言える。
　すなわち、本発明は、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕である。
　また、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕を有効成分として含有するジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤及び／又はアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。
　また、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤、高血糖改善剤、抗糖尿病剤、血圧降下剤、抗高血圧剤又は血管内皮障害抑制剤である。
　前記Ｘは、塩基性アミノ酸残基、脂肪族中性アミノ酸残基、ヒドロキシ基を有する中性アミノ酸残基、アミド基を有する中性アミノ酸残基又は芳香族を有する中性アミノ酸残基であるのが好適である。
　前記Ｘは、アラニン残基、グルタミン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基、セリン残基及びリシン残基から選ばれるものであるのが好適である。また、Ｌ－アミノ酸が好適である。
　前記ペプチドが、下記の（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるものであるのが、好適である。
　（ａ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（ＶＰＡ：配列番号２）
　（ｂ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ（ＶＰＱ：配列番号３）
　（ｃ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ（ＶＰＭ：配列番号４）
　（ｄ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ（ＶＰＮ：配列番号５）
　（ｅ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（ＶＰＧ：配列番号６）
　（ｆ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ（ＶＰＶ：配列番号７）
　（ｇ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ（ＶＰＹ：配列番号８）
　（ｈ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ＶＰＳ：配列番号９）
　（ｉ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ（ＶＰＫ：配列番号１０）
　本発明は、本発明のペプチドＶＰＸが優れたジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用を有することから、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤及び血管内皮障害抑制剤等を提供することができる。
本開示のペプチドＶＰＡのＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。 本開示のペプチドＶＰＱのＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
　本開示のペプチドは、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチドで表されるアミノ酸配列（配列番号１）を有する。
　本開示において、Ｖａｌ（Ｖ）はバリン残基、Ｐｒｏ（Ｐ）はプロリン残基、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。これらアミノ酸残基はＬ型であるのが好ましい。
　前記Ｘは、特に限定されないが、例えば、乳蛋白質分解物から得ることができるアミノ酸残基を挙げることができ、これらアミノ酸残基から選ばれるものが好ましい。また、前記Ｘは、２０種の天然アミノ酸が好ましい。なお、遊離アミノ酸は、一般的に「+Ｈ３Ｎ－（Ｒ１）ＣＨ－ＣＯＯ－」で示され、本開示のペプチドは、「Ｖａｌ－Ｐｒｏ－ＨＮ－（Ｒ１）ＣＨ－ＣＯＯＨ」と示すことも可能である。
　前記Ｘで示されるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基、中性アミノ酸残基に分類することが可能である。前記Ｘは、以下のアミノ酸残基の例示から１種又は２種以上選択することが可能である。
　前記酸性アミノ酸残基として、例えば、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ（Ｄ））及びグルタミン酸残基（Ｇｌｕ（Ｅ））等が挙げられる。このうち、好ましくはカルボニル基を２つもつものである。
　前記塩基性アミノ酸残基として、例えば、リシン残基（Ｌｙｓ（Ｋ））、アルギニン残基（Ａｒｇ（Ｒ））、ヒスチジン残基（Ｈｉｓ（Ｈ））等が挙げられる。このうち、好ましくはアミノ基を２～４つもつものである。
　前記中性アミノ酸残基として、例えば、前記アミノ酸残基ＸのＲ１に、水素及びアルキル基；ヒドロキシ基；硫黄；酸性アミド；芳香族を有するもの等が挙げられ、これらそれぞれを一般的に、脂肪族中性アミノ酸残基；ヒドロキシ基を有する中性アミノ酸残基；硫黄を有する中性アミノ酸残基；アミド基を有する中性アミノ酸残基；芳香族を有する中性アミノ酸残基と呼ぶことがある。
　前記脂肪族中性アミノ酸残基として、アラニン残基（Ａｌａ（Ａ））、グリシン残基（Ｇｌｙ（Ｇ））、バリン残基（Ｖａｌ（Ｖ））、ロイシン残基（Ｌｅｕ（Ｌ））、イソロイシン残基（Ｉｌｅ（Ｉ））等が挙げられる。このうち、前記アミノ酸残基ＸのＲ１が水素又はアルキル基である、水素又はアルキル基を有する中性アミノ酸残基が好ましい。このアルキル基は、直鎖及び分岐鎖が好ましく、分岐鎖がより好ましい。また、前記脂肪族中性アミノ酸残基におけるＲ１の炭素数は、好ましくは０～４であり、より好ましくは０～３である。さらに好ましくは、Ｒ１＝水素、メチル基（－ＣＨ３）又はイソプロピル基（－ＣＨ（ＣＨ３）２）である。
　前記ヒドロキシ基を有する中性アミノ酸残基として、セリン残基（Ｓｅｒ（Ｓ））、トレオニン残基（Ｔｈｒ（Ｔ））等が挙げられる。前記アミノ酸残基ＸのＲ１が、ヒドロキシ基を有する炭素数１～２のアルキル基が好ましい。
　前記硫黄を有する中性アミノ酸残基として、システイン残基（Ｃｙｓ（Ｃ））及びメチオニン残基（Ｍｅｔ（Ｍ））等が挙げられる。
　前記アミド基を有する中性アミノ酸残基として、グルタミン残基（Ｇｌｎ（Ｑ））、アスパラギン残基（Ａｓｎ（Ｎ））等が挙げられる。このうち、好ましくはアミノ基を２つもつものである。また、前記アミノ酸残基ＸのＲ１がアミド基を有する炭素数１～２のアルキル基が好ましい。
　前記芳香族を有する中性アミノ酸残基として、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ（Ｆ））、チロシン残基（Ｔｙｒ（Ｙ））、トリプトファン残基（Ｔｒｐ（Ｗ））等が挙げられる。前記アミノ酸残基ＸのＲ１は、ヒドロキシ基を有していてもよいベンジル基（例えば、ＨＯ－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－又はＨ－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－等）が好ましく、この水酸基の数は０～１が好ましい。
　上述のアミノ酸残基のうち、塩基性アミノ酸残基及び中性アミノ酸残基が好ましい。前記中性アミノ酸残基のうち、さらに脂肪族中性アミノ酸残基、ヒドロキシ基を有する中性アミノ酸残基、アミド基を有する中性アミノ酸残基及び芳香族を有する中性アミノ酸残基が好ましい。さらに、脂肪族中性アミノ酸残基、アミド基を有する中性アミノ酸残基が好ましい。
　前記Ｘで示されるアミノ酸残基のうち、アラニン残基、グルタミン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基、セリン残基及びリシン残基から選ばれるものが好適である。このうち、アラニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基及びセリン残基が好ましい。さらに、生理活性の点で、アラニン残基、グルタミン残基及びバリン残基が好ましい。
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性の点で、好ましくは、アラニン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基、セリン残基及びリシン残基であり、またアンジオテンシン変換酵素阻害活性の点で特に好ましくは、アラニン残基及びリシン残基である。
　また、本開示の新規なペプチドの具体的なものとして、以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（ＶＰＡ：配列番号２）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ（ＶＰＱ：配列番号３）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ（ＶＰＭ：配列番号４）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ（ＶＰＮ：配列番号５）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（ＶＰＧ：配列番号６）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ（ＶＰＶ：配列番号７）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ（ＶＰＹ：配列番号８）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ＶＰＳ：配列番号９）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ（ＶＰＫ：配列番号１０）等のトリペプチドが挙げられる。
　また、本開示のペプチドは、このペプチドの塩類であってもよい。当該塩類としては、例えば、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属類；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属類等が挙げられ、このうち適宜１種又は２種以上を使用すればよい。
　本開示のペプチドＶＰＸの製造方法については、例えば国際公開２００３／０４４０４４号パンフレット〔参考文献１〕等に記載されるような方法に準じて行うことが可能であり、以下の方法が例示されるが、これに特に限定されない。
　例えば、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列又は配列番号２～１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質やペプチドを加水分解等にて分解し、得られた分解物から分離精製して得る方法；ペプチドの化学合成方法にてペプチドＶＰＸを合成した後、得られた合成物からペプチドＶＰＸを分離精製して得る方法；ペプチドＶＰＸ及びこれを含むペプチド等を生産する植物、動物や微生物から抽出し、得られた抽出物から分離精製する方法等が挙げられる。
　本開示のペプチドＶＰＸは、例えばカゼイン等の蛋白質を、適宜、酸アルカリや酵素等にて加水分解することで、製造することが可能である。
　原料蛋白質を加水分解酵素で加水分解して前記ペプチドＶＰＸを得る方法を例示する。
　まず、原料蛋白質を酵素で加水分解する前に、蛋白質を水に溶解、分散又は懸濁させる。
　前記原料蛋白質は、ＶＰＸを含む蛋白質であって、適宜加水分解酵素で消化したときに本開示のペプチドが生成可能なものであれば、特に限定されない。前記蛋白質として、例えば、動物由来や微生物由来のもの等が挙げられ、大量に入手可能なカゼインが好適である。
　このとき、原料蛋白質の性状により処法は異なるが、原料蛋白質が可溶性の場合には、原料蛋白質を水又は温水に分散し、溶解すればよく、また、難溶性の場合には熱水に蛋白質を混合撹拌にてホモジナイズすればよい。
　そして、前記蛋白質を含有する溶液に、アルカリ剤又は酸剤を添加し、ｐＨを適宜（例えばｐＨ７～１０）に調整してもよい。このｐＨは使用する加水分解酵素の至適ｐＨ又はその付近に調整することが好ましい。
　前記アルカリ剤又は酸剤として、特に限定されず、食品又は医薬品に許容されるものを使用すればよい。アルカリ剤として、例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カルシウム等の水酸化物；炭酸カリウム等の炭酸塩などが挙げられ、これらはアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩でもよい。また、酸剤として、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸；クエン酸、酢酸、ギ酸等の有機酸などが挙げられる。これらのうち、適宜１種又は２種以上を使用すればよい。
　また、前記蛋白質を含有する溶液を７０～９０℃で１５秒～１０分間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。
　次に、前記蛋白質を含有する溶液に、所定量の加水分解酵素を加え、温度１０～８５℃程度で０．１～４８時間反応を行い、加水分解物を得る。
　このとき、前記加水分解酵素を添加した後、当該溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば３０～６０℃、望ましくは４５～５５℃に保持して、蛋白質の加水分解を開始するのが望ましい。
　また、加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ければよい。前記原料蛋白質の分解率は２０～５５％が、本開示のペプチドを得るためには、望ましい。
　前記加水分解酵素反応の停止は、例えば、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、８０～１３０℃の温度範囲で３０分間～２秒間の保持時間で行うことができる。
　前記加水分解酵素は、特に限定されないが、前記原料蛋白質を加水分解して本開示のペプチドを生成させ得る酵素であるのが好ましく、当該生成させ得る酵素として、具体的にはエンドペプチダーゼが好ましい。
　前記エンドペプチダーゼとして、例えば、微生物由来や動物由来のものがあるが、具体的には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属やアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属細菌由来のプロテアーゼ、及び動物膵臓由来のプロテアーゼ等が挙げられる。前記プロテアーゼは市販されているものを利用することが可能である。市販品のプロテアーゼとして、例えば、プロテアーゼＡ（天野エンザイム社製）等のアスペルギルス属細菌由来のプロテアーゼ；パンクレアチン(天野エンザイム社製)等の動物膵臓由来のプロテアーゼ等が好ましいものとして例示できる。
　例えば、アスペルギルス属細菌由来のプロテアーゼを使用する際には、蛋白質１ｇ当たり１００～５０００活性単位の割合で添加するのが望ましい。また、動物膵臓由来のプロテアーゼを使用する際には、蛋白質１ｇ当たり３０００～８０００活性単位の割合で添加するのが望ましい。
　本開示において用いる加水分解酵素は、単独で又は２種以上組み合わせて使用してもよい。２種以上の酵素を用いる場合には、それぞれの酵素反応は同時に又は別々に行ってもよい。
　本開示において、パンクレアチン及びプロテアーゼを併用するのが好ましく、これら２酵素を混合して使用することが特に好ましい。
　なお、原料蛋白質の分解率の算出方法は、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２頁、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７ページ、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出する。
　分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
　前記加水分解液物から、本開示のペプチドＶＰＸを単離又は精製するのが好適である。
　本開示のペプチドＶＰＸの精製は、通常、オリゴペプチドの精製に用いられているのと同様の手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶媒沈殿、塩析、２種の液相間での分配等の方法を適宜組み合わせることによって、行うことができる。
　本開示のペプチドＶＰＸの単離又は精製に際しては、目的物質を含む画分は、後述するジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用及び／又はアンジオテンシン変換酵素阻害作用を指標として決定することができる。また、それらの画分の活性成分は質量分析法により同定することができる。
　また、加水分解酵素によって得られる蛋白質分解物は、少なくともＶＰＸが含まれるものが好ましく、さらに配列番号２～１０で表されるアミノ酸配列を含有するように調製されたものが、より良好な活性成分の回収が容易な点で好ましい。
　また、本開示のペプチドＶＰＸは、化学合成によっても製造することができる。
　本開示のペプチドＶＰＸの化学合成は、オリゴペプチドの合成に通常用いられている液相法または固相法によって行うことができる。合成されたペプチドは必要に応じて脱保護され、未反応試薬や副生物等を除去して、本開示のペプチドＶＰＸを単離することが可能である。
　このようなペプチドの合成は、市販のペプチド合成装置を用いて行うことができる。目的とするペプチドが得られたことは、後述するジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用及び／又はアンジオテンシン変換酵素阻害作用を指標として確認することができる。
　本開示のペプチドＶＰＸは、後記実施例に示すとおり、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用を有する。
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶが、生体内の生理機能に関与している化合物を分解することで、種々の疾患や症状が生じる場合がある。このため、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶを阻害すると、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶによって分解されていた生体内の生理機能に関与している化合物の寿命が延びることを利用して、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善又は治療が可能となる。
　前記生理機能に関与する化合物として、例えば、インクレチンのグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）及びグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）が挙げられる。そして、このインクレチンのグルカゴン様ペプチド１の分解抑制によって、インスリンの生合成及び分泌に対するグルコース誘導性の刺激、グルカゴン分泌抑制、遺伝子発現の調整、Β細胞に対する栄養性の効果、食物摂取の抑制、及び胃内容排出の緩徐化などの各作用を奏することが可能である。
　これによって、上昇した血糖値の正常化、並びに空腹感及び体重の改善・調整に寄与することが可能である。
　また、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶの作用によって、血管の内皮細胞の機能が低下したり、血管の内皮細胞が障害されることが知られている。この血管の内皮細胞の機能低下や障害によって、血管の緊張増加による血管収縮、動脈硬化、血栓形成等の血管障害が生じ、これらの原因によって臓器の血流障害が生じ、臓器機能不全となり、糖尿病の合併症が誘発されることとなる。
　近年、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害薬の投与による内皮細胞の機能改善効果が多数報告されている（例えば、参考文献２～５参照〔参考文献２〕Endocrine Journal 2011, 58 (1), 69-73；〔参考文献３〕J Am Coll Cardiol. 2012, 59(3), 265-76；〔参考文献４〕Diabetes Care. 2011, 34(9), 2072-7；〔参考文献５〕Cardiovascular Diabetology 2011, 10(85) (http://www.cardiab.com/content/10/1/85)）。
　これらの効果は単に血糖値を下げることによる改善の他に、インクレチンによる血管の保護作用を介していると考えられている。高血糖により内皮細胞の機能が低下し、血管のしなやかさが失われると、血圧が上昇し、上昇した血圧がさらに血管を傷めるという悪循環が、心臓・腎臓・脳といった臓器への悪影響となって現れる。この悪循環を断ち切るために、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害薬とアンジオテンシン変換酵素阻害薬の併用も試みられており、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶの阻害剤は循環器系の治療においても、重要な役割を果たすものと考えられている。
　すなわち、本開示のペプチドＶＰＸは、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用を有するので、血糖値上昇抑制作用、高血糖改善作用、血管内皮機能低下抑制作用、血管内皮障害抑制作用、血管障害抑制作用、血管内皮細胞の保護作用及び食欲抑制作用等を示す。また、本開示のペプチドＶＰＸは、食欲抑制及び血管内皮細胞の保護等も可能と考える。なお、ここでいう「血糖値上昇抑制」とは、血糖値低下を含む意味であるが、特に「正常値以上又は必要以上に上昇した血糖値を下げることができること」を意味するものである。血糖値の正常値の判断は、日本糖尿病学会の2010年の診断基準を参考にすればよい。
　さらに、本開示のペプチドＶＰＸにより、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶを阻害することで、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考えられる。よって、本開示のペプチドＶＰＸは、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患や症状等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法に使用することができる。
　本開示のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する各種疾患や症状として、例えば、高血糖症、糖尿病、糖尿病合併症、血管内皮障害、血管障害等が挙げられる。なお、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する各種疾患等は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶが介在する各種疾患等であってもよい。
　さらに、高血糖症、糖尿病及び高血糖状態によって引き起こされる種々の疾患として、例えば、糖尿病性の細小血管症（例えば、網膜症、腎症、神経障害等）及び大血管合併症（例えば、狭心症・心筋梗塞等の虚血性心疾患、脳梗塞、閉塞性動脈硬化、壊疽等）等が挙げられる。
　なお、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤が前記種々の疾患の予防剤や治療剤として利用できることについては、前記の特許文献１～５及び参考文献２～５にも開示されているとおりであり、本開示のペプチドＶＰＸについても同様に前記種々の疾患の予防剤や治療剤としても実施できることについては言うまでもない。
　よって、本開示のペプチドＶＰＸは、上述のような、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害、血糖値上昇抑制、高血糖改善、血管内皮障害抑制、及び抗糖尿病等のために使用してもよく、また、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、血管内皮障害抑制剤及び抗糖尿病剤等の上述のような使用を目的とした各種製剤に使用することができ、これら各種製剤を製造するために使用することができる。
　また、本開示のペプチドＶＰＸには、後記実施例に示すようにアンジオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」ともいう）阻害作用を有するものもある。
　ここで、アンジオテンシン変換酵素は、レニンによる切断によりアンジオテンシノーゲンから生じるアンジオテンシンIに働き、Ｃ末端の２個のアミノ酸を遊離させて、アンジオテンシンIIに変換する酵素である。
　アンジオテンシン変換酵素は強い昇圧作用を有するアンジオテンシンIIを生成させるとともに、降圧作用を有するブラジキニンを不活性化する作用も有している。このため、既にアンジオテンシン変換酵素阻害剤は高血圧の治療薬として使用されており、カプトプリル及びレニベースなどが医薬品に使用されている。しかしながら、副作用として、カプトプリル及びレニベースでは過度の降圧作用や腎機能障害が見られることがある。このようなことから、サプリメントや食品添加物として提供しても安全性が高いものが望まれ、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する物質の探索が多数報告されている（参考文献１、６～８参照。〔参考文献１〕国際公開２００３／０４４０４４号パンフレット；〔参考文献６〕特開平６－４０９４４号号公報；〔特許文献７〕特開２００１－１３６９９５号号公報：〔参考文献８〕特開平７－１０１９８２号公報）。
　例えば、参考文献６及び７には、カゼイン等を乳酸菌又はプロテイナーゼとペプチダーゼの組み合わせにより分解して得たＶａｌ－Ｐｒｏ－ＰｒｏとＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏにアンジオテンシン変換酵素阻害作用があることが知られている。この他、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するトリペプチドとして、例えば、参考文献８にはＬｅｕ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐが知られ、また参考文献１にはＭｅｔ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏが知られている。
　アンジオテンシン変換酵素を阻害することで、血圧降下作用及びブラジキニン不活性化作用の他、心肥大退縮作用、末梢血管拡張作用、腎保護作用、サブスタンスＰ分解抑制作用等が可能であり、また高血圧状態による血管内皮障害の抑制作用及び血管障害の抑制作用等が可能であると考えられている。また、アンジオテンシン変換酵素阻害剤によって、本態性高血圧症の改善等に効果があることも知られている。
　さらに、アンジオテンシン変換酵素を阻害することで、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患や症状予防、改善又は治療が可能と考えられる。
　アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患や症状として、例えば、高血圧症、心臓肥大、腎臓肥大等が挙げられる。なお、アンジオテンシン変換酵素に起因する各種疾患等は、アンジオテンシン変換酵素が介在する各種疾患等であってもよい。
　また、高血圧症又は高血圧状態によって引き起こされる種々の疾患や症状は、例えば、脳出血、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞、腎不全、視力障害、血管浮腫等の心血管疾患や血管障害が挙げられる。
　すなわち、本開示のペプチドＶＰＸは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するので、上述の血圧降下作用、ブラジキニン不活性化作用、高血圧症状の改善作用、高血圧状態による血管内皮障害の抑制作用及び血管障害の抑制作用等を示す。さらに、本開示のペプチドＶＰＸにより、アンジオテンシン変換酵素を阻害することで、上述のアンジオテンシン変換酵素に起因する疾患や症状等も予防、改善又は治療が可能と考えられる。よって、本開示のペプチドＶＰＸは、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患や症状等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法に使用することができる。
　なお、アンジオテンシン変換酵素阻害剤が前記種々の疾患の予防剤や治療剤として利用できることについては、前記の特許文献１及び６～８にも開示されているとおりであり、本開示のペプチドＶＰＸについても同様に前記種々の疾患の予防剤や治療剤としても実施できることについては言うまでもない。
　よって、本開示のペプチドＶＰＸは、アンジオテンシン変換酵素阻害、血圧降下及び高血圧症等のために使用してもよく、またアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び抗高血圧剤等の上述のような使用を目的とした各種製剤に使用することができ、これら各種製剤を製造するために使用することができる。
　また、本開示のべプチドＶＰＸは、血糖値上昇抑制作用及び血圧降下作用の２つの効能を併せ持った際に、さらに有益な化合物として提供することが可能である。
　ところで、高血糖値状態が続くと、血管の内皮細胞の機能が低下し、血管内皮障害が生じやすいが、さらにその血管に強い負荷を与えるような高血圧は血管障害を引き起こす危険性を高めることで知られている。血管内皮細胞からは、血管平滑筋を弛緩させる因子（ＮＯやＰＧＩ２）が産生されている。そして、高血糖により血管内皮細胞の機能が低下するとそれらの遊離能力も低下する。結果として、糖尿病患者は高血圧を併発する。さらに、高い血圧が血管内皮細胞に負荷をかける悪循環に陥る。
　そして、糖尿病のヒト又はその予備群（この予備群とは、糖尿病には至っていないが、高血糖値状態のヒトをいう）のヒトは、高血圧に留意する必要性がある。しかし、一般的に、高血糖改善薬で血糖値を低下させても血圧を降下させることはできるとは言えず、一方、血圧降下薬で血圧を降下させても血糖が低下させることはできるとは言えない。このため、糖尿病かつ高血圧のヒトは、高血糖改善薬と血圧降下薬の両方を処方されることが多く、薬の組み合わせによる副作用の懸念もある。
　このような効能を併せ持つことにより、薬剤の使用量も減らすことが可能となるので、副作用の低減が期待できる。
　すなわち、本開示のペプチドＶＰＸは、血管改善、血管内皮障害抑制及び糖尿病の予防、改善又は治療に非常に有効なものと言え、特に高血糖状態によって引き起こされる血管内皮障害の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。
　本開示の血管内皮障害の具体的な疾患及び症状として、例えば、糖尿病性の血管障害などが挙げられる。
　以上従って、本開示のペプチドＶＰＸ及びこれを有効成分として含有する上述の各種製剤（以下、「前記ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤等」とする）は、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、上述の、高血糖症、糖尿病（特に２型糖尿病）、高血圧症及び糖尿病合併症（例えば、糖尿病性の血管内皮障害や腎症、高血圧等）、血管内皮障害、血管障害等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法に使用することができる。
　また、本開示のペプチドＶＰＸを有効成分として含有する上述の各種製剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、上述の、高血糖症、糖尿病（特に２型糖尿病）及び糖尿病合併症（例えば、糖尿病性の血管内皮障害や腎症、高血圧等）、血管内皮障害、血管障害等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法に使用することができる。
　また、本開示のペプチドＶＰＸ及びこれを有効成分として含有する上述の各種製剤は、上述のような高血糖症、糖尿病、血管障害、高血圧症等の予防、改善及び／又は治療のためのヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧品及び食品等の有効成分としてこれらに配合して使用可能である。
　医薬品に配合する場合、経口投与剤や非経口投与剤などとすることができる。また、食品に配合する場合には、上述のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する各種疾患及び／又はアンジオテンシン変換酵素に起因する各種疾患、並びに高血糖状態及び／又は高血圧症によって引き起こされる各種疾患などの予防、改善又は治療、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害、血糖値上昇抑制、高血糖改善、アンジオテンシン変換酵素阻害及び血圧降下等の生理機能をコンセプトとする機能性食品、病者用食品、特定保健用食品などに応用できる。
　本開示のペプチドＶＰＸ及びこれを有効成分として含有する上述の各種製剤は、上述のような、高血糖症、糖尿病、高血圧症、血管障害等の予防、改善及び／又は治療のためのヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧品及び食品等の有効成分としてこれらに配合して使用可能である。
　本開示のペプチドＶＰＸ及びこれを有効成分として含有する上述の各種製剤は、経口投与及び非経口投与の何れでもよいが、経口投与が望ましい。非経口投与として、静注、直腸投与、吸入等が挙げられる。経口投与の剤形として、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、顆粒剤、酸剤、軟膏等が挙げられる。
　製剤化に際しては、乳蛋白加水分解物や本開示のペプチドＶＰＸの他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、公知の又は将来的に見出されるジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用及び／又はアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する薬、抗糖尿病薬、高血糖改善薬、血圧降下薬などを併用することも可能である。
　また、本開示のペプチドＶＰＸを有効成分として食品中に含有させ、本開示のペプチドＶＰＸ及びこれを有効成分として含有する上述の各種製剤の一態様として、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ作用及び／又はアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する食品として加工することも可能である。
　このような食品として、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、飲料、これら以外の市販品等が挙げられる。
　例えば、前記小麦粉製品として、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。前記即席食品類として、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
　例えば、前記農産加工品として、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。前記水産加工品として、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。前記畜産加工品として、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
　例えば、前記乳・乳製品として、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。前記油脂類として、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
　例えば、前記基礎調味料として、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
　例えば、前記冷凍食品として、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
　例えば、前記菓子類として、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
　例えば、前記飲料類として、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
　例えば、上記以外の市販食品として、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
　本開示のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤等において、本開示のペプチドＶＰＸの配合量は、製剤の最終組成物に対し、少なくとも０．００１質量％であることが好ましい。
　本開示のペプチドＶＰＸの投与量は、年齢、症状等により異なるが、通常、０．００１～３０００ｍｇ／日、好ましくは０．０１～３０ｍｇ／日であり、１日１回から３回に分けて投与してもよい。
　以下に、具体的な実施例等を説明するが、本発明（本開示）はこれに限定されるものではない。
製造例１：カゼインの酵素分解によるＶＰＸペプチドの製造
＜１＞カゼインの酵素分解
　市販のカゼイン（ニュージーランドデーリーボード製）１００ｇに水９００ｇを加え、よく分散させ、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解した。該カゼイン水溶液を８５℃で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．０に調整した後、パンクレアチンを２ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＡを４ｇ（天野エンザイム社製）それぞれ添加して、加水分解反応を開始した。カゼインの分解率が５４．９％に達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活させて酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。この加水分解液を珪藻土ろ過し、濃縮後凍結乾燥し、凍結乾燥品８０ｇを得た。
＜２＞ＨＰＬＣによるペプチドの分離
　逆相ＨＰＬＣで上記カゼイン加水分解物の分離を行った。このＨＰＬＣ条件は下記ＨＰＬＣ条件１に示した。
〔ＨＰＬＣ条件１〕
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ　ＣＤ－Ｃ１８
１０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ　（インタクト（株）製）
検出：ＵＶ　２１５ｎｍ
流速：３ｍｌ／分
溶離液Ａ：０．２％　ＦＡを含む水溶液
溶離液Ｂ：０．２％　ＦＡを含むアセトニトリル溶液
　溶離液Ａの割合９８％から、３０分後に７５％、４０分後に５０％、４３分後に２０％、になるようなグラジエント条件で、加水分解物を分離し、溶出液を０．７５ｍｌ毎に分画した。溶出画分について、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害能を測定したところリテンションタイム１６．５分に溶出された画分（画分１）に強い阻害活性能が認められた。
　さらに、精製するため、別条件のＨＰＬＣで精製した。このときの条件を下記ＨＰＬＣ条件２に示した。このとき、条件１の溶離液Ａ、Ｂを、それぞれ条件２の溶離液Ａ、Ｂに変更し、その他の条件は条件１と同様に行った。
〔ＨＰＬＣ条件２〕
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ　ＣＤ－Ｃ１８
１０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ　（インタクト（株）製）
検出：ＵＶ　２１５ｎｍ
流速：３ｍｌ／分
溶離液Ａ：０．１％　ＴＦＡを含む水溶液
溶離液Ｂ：０．１％　ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液
　同グラジエント条件で、加水分解物を分離し、溶出液を０．７５ｍｌ毎に分画した。溶出画分について、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害能を測定したところリテンションタイム２３．０分に溶出された画分２及びリテンションタイム２２．０分に溶出された画分３に強い阻害活性能が認められた。画分２における酵素活性の５０％阻害濃度は、２．０μｇ／ｍｌであった。
　上記活性ピークの画分２の化合物を、島津製作所製のプロテイン・シーケンサー（ＰＰＳＱ－２３Ａ）で同定した。その結果、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（配列番号２）という新規な構造をもつことがわかった。なお、これらアミノ酸残基はＬ－型であった。
　更に、サーモクエスト社製質量分析計ＬＴＱにより、分子量は２８５．２、ｍ／ｚ＝２８６．２（ＭＨ＋）をプリカーサーイオンとするＭＳ／ＭＳ分析により、図１に示す通り、ｍ／ｚ＝１６９．３，１８７．２，１９７．１等のプロダクトイオンが検出された。
　こうして、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害能を有するペプチドの構造は、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａであることが明らかとなった
　また、後述の製造例２で得られた合成ペプチドＶＰＡ（配列番号２）での５０％阻止濃度は、１．９μｇ／ｍｌであり、精製フラクションの値と一致した。
　また、上記活性ピークの画分３の化合物も同様に同定した結果、図２に示すように、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ（配列番号３）という新規な構造（分子量３４２．２）をもつことがわかった。なお、これらアミノ酸残基は全てＬ－型であった。
　よって、上記＜１＞カゼイン酵素分解物中には、ＶＰＡ（配列番号２）及びＶＰＱ（配列番号３）がジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を持つ新規なペプチドとして含まれることが確認できた。
　さらに、上記＜１＞カゼイン加水分解物には、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性が認められ、その分解物中には、ＶＰＶ（配列番号７）、ＶＰＹ（配列番号８）、ＶＰＫ（配列番号１０）が含まれていたことも確認できた。なお、これらアミノ酸残基は全てＬ－型であった。
製造例２：ＶＰＸペプチドの化学合成
　ペプチドシンセサイザー（Ｍｏｄｅｌ　４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ社）を使用し、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ（（株）ペプチド研究所））、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ（（株）ペプチド研究所）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｗａｎｇ－ＰＥＧ　Ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業（株））を原料に用いて、固相合成法によりトリペプチドＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａを合成した。
　操作はアプライドバイオシステムズ社のマニュアルに従って行った後、脱保護した。このペプチドは、上記ＨＰＬＣ条件１で精製した。
　得られたトリペプチドは、質量分析により分子量（Ｍ）は２８５．２と測定され、ｍ／ｚ＝２８６．２（ＭＨ＋）をプリカーサーイオンとするＭＳ／ＭＳ分析により、精製フラクションでのスペクトルと同様のスペクトルが得られた。また、ＶＰＱ（配列番号３）も同様に作成し、これは精製フラクションでのスペクトルと同様のスペクトル（質量分析による分子量（Ｍ）は３４２．２）が得られた。
　さらに、ＶＰＭ（配列番号４）、ＶＰＮ（配列番号５）、ＶＰＧ（配列番号６）、ＶＰＶ（配列番号７）、ＶＰＹ（配列番号８）、ＶＰＳ（配列番号９）及びＶＰＫ（配列番号１０）についても製造例２に準じて操作することで、これらペプチドを化学合成した。
　試験例１：各ペプチドのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性確認試験
　表１に示す、製造例２で得た各ペプチドのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性確認試験を行い、その結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　試験例２：各ペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性確認試験
　また、ＶＰＡ（配列番号２）及びＶＰＫ（配列番号１０）のＡＣＥ阻害活性確認試験を行った結果、５０％阻止濃度は、それぞれ２４．８μｇ／ｍｌ及び１３２μｇ／ｍｌであった。よって、このＶＰＡ及びＶＰＫは、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用及びアンジオテンシン変換酵素阻害作用の両方の性質を有するため、血管改善、血管内皮障害抑制及び糖尿病の予防、改善又は治療に非常に有効なものと言える。
　このことから、これらトリペプチド（配列番号２～１０）の少なくともいずれか１つを含むカゼインの酵素分解物は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害作用やアンジオテンシン変換酵素阻害作用等を有する素材又は食材として、食品、医薬品等に利用可能であると考える。
　ＶＰＡを少なくとも含む市販品のカゼイン分解物を検索したところ、ＣＵ５０００（森永乳業社製）のカゼイン分解物にＶＰＡが認められ、これらのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害の５０％阻止濃度は、８４μｇ／ｍｌであった。なお、Ｃ８００（森永乳業社製）についてのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害の５０％阻止濃度は、＞１０００μｇ／ｍｌであり、カゼイン分解物であってもジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性が認められないものがあった。
＜ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性の測定方法＞
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－４）阻害の測定は、カトウらの方法「Kato, T. et al. Biochem. Med. 19, p351, 1978」に準じて行った。
　具体的には、酵素（DPP-4）は Recombinant Human DPPIV/CD26 （R&D Systems, Inc.）、基質はH-Gly-Pro-AMC （Biomol GmbH） を用いて、酵素反応を行なった。
　９６穴マイクロプレート（nunc 137101）の各ウエルに、水又は各濃度の試験物質の水溶液または、ＨＰＬＣの分画フラクションを添加し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（０．２５Ｍ，ｐＨ８．０）を２０μｌ添加して全量を８０μｌに調製した。撹拌の後プレートを３７℃のインキュベーターで約１０分程度温め、ＤＰＰ－４溶液１０μｌと、基質溶液１０μｌを添加し（全液量１００μｌ）、撹拌して反応を開始した。酵素の代わりに水を添加したウエルをコントロールとした。
　酵素反応の測定はマイクロプレートリーダー（SH-9000,コロナ電気（株））を用い、庫内温度を３７℃に保った条件下で測定した（５分間隔、ex360nm/em460nm）。
　蛍光強度の経時的な増加が直線的な期間（反応開始から３０分以内）の蛍光強度の値から、下式により阻害活性を算出した陽性対象として Vildagliptin （JS Research Chemicals Trading 社）を用いた。
　　　阻害率（％）＝１００％－［（Ｙ－ｂ）／（Ｘ－ａ）］×１００％
　Ｘ：水＋酵素＋基質
　Ｙ：試験物質＋酵素＋基質
　ａ：水＋基質
　ｂ：試験物質＋基質
　＜ＩＣ５０の濃度の求め方＞
　試験物質の濃度を段階的に希釈し（１０～２０００μｇ／ｍｌ）、その阻害率を求めた。その結果を基に試験物質の添加濃度の対数（log10）と阻害率の間の関係式を求めた。
そしてこの関係式から酵素の阻害率が５０％になる濃度を逆算することで、ＩＣ５０を算出した。
＜アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定方法＞
　アンジオテンシン変換酵素阻害（ＡＣＥ阻害）の測定は、Araujoらの方法〔Araujo, M.C., et al., Biochemistry 39, 8519, 2000〕に準じて行った。
　酵素（ACE）は Angiotensin Converting Enzyme, from rabbit lung （SIGMA）、基質は Abz-FRK(Dnp)-P （Enzo Life Sciences International, Inc.）を用いて、酵素反応を行なった（Araujo, M.C., et al., Biochemistry 39, 8519, 2000）。
　９６穴マイクロプレート（nunc 137101）の各ウエルに、水または各濃度の試験物質の水溶液または、HPLC の分画フラクションを添加し、Tris-HCl（0.25M, pH 8.0）を２０μｌ添加して全量を８０μｌに調製した。撹拌の後プレートを３７℃のインキュベーターで約１０分程度温め、ＡＣＥ溶液１０μｌと、基質溶液１０μｌを添加し（全液量１００μｌ）、撹拌して反応を開始した。酵素の代わりに水を添加したウエルをコントロールとした。
　酵素反応の測定はマイクロプレートリーダー（SH-9000, コロナ電気（株））を用い、庫内温度を３７℃に保った条件下で測定した（５分間隔、ex320nm/em420nm）。
　蛍光強度の経時的な増加が直線的な期間（反応開始から３０分以内）の蛍光強度の値から、下式により阻害活性を算出した。
　　　阻害率（％）＝１００％－[（Ｙ－ｂ）／（Ｘ－ａ）]×１００％
Ｘ：水＋酵素＋基質
Ｙ：試験物質＋酵素＋基質
ａ：水＋基質
ｂ：試験物質＋基質
　＜ＩＣ５０の濃度の求め方＞
　試験物質の濃度を段階的に希釈し（１０～２０００μｇ／ｍｌ）、その阻害率を求める。その結果を基に試験物質の添加濃度の対数（ｌｏｇ１０）と阻害率の間の関係式を求めた。そしてこの関係式から酵素の阻害率が５０％になる濃度を逆算することで、ＩＣ５０を算出した。
　本発明のペプチドＶＰＸは、カゼイン加水分解物から単離することが可能なものであるので、安全性が高く、医薬品、食品、皮膚外用剤及び機能性食品等の幅広い分野に利用することが可能である。
　また、本技術は、以下の構成をとることも可能である。
〔１〕Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕。
〔２〕前記Ｘは、塩基性アミノ酸残基、脂肪族中性アミノ酸残基、アミド基を有する中性アミノ酸残基又は芳香族を有する中性アミノ酸残基である前記〔１〕記載のペプチド。
〔３〕前記Ｘは、アラニン残基、グルタミン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基、セリン残基及びリシン残基から選ばれる前記〔１〕又は〔２〕記載のペプチド。
〔４〕前記ペプチドが、下記の（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種又は２種以上のものである前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のペプチド。
　　　（ａ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（配列番号２）
　　　（ｂ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ（配列番号３）
　　　（ｃ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ（配列番号４）
　　　（ｄ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ（配列番号５）
　　　（ｅ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号６）
　　　（ｆ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ（配列番号７）
　　　（ｇ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ（配列番号８）
　　　（ｈ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号９）
　　　（ｉ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ（配列番号１０）
　生理活性の点で好適には、ＶＰＡ（配列番号２）、ＶＰＱ（配列番号３）、ＶＰＮ（配列番号５）、ＶＰＧ（配列番号６）、ＶＰＶ（配列番号７）、ＶＰＹ（配列番号８）、ＶＰＳ（配列番号９）、ＶＰＫ（配列番号１０）である。
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性の点で、ＶＰＡ（配列番号２）、ＶＰＱ（配列番号３）、ＶＰＶ（配列番号７）であるのが好適である。
　アンジオテンシン変換酵素阻害活性の点で、ＶＰＡ（配列番号２）、ＶＰＫ（配列番号１０）であるのが好適である。
〔５〕Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕の単数又は複数、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドを有効成分として含有する、
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、高血糖改善剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤、血管内皮障害抑制剤、血管改善剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤又は抗高血圧症剤。
〔６〕ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、高血糖改善剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤、血管内皮障害抑制剤、血管改善剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤又は抗高血圧症剤の製造のための、
　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドの使用。
〔７〕ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害用食品、高血糖改善剤、血糖値上昇抑制用食品、抗糖尿病用食品、血管内皮障害抑制用食品、血管改善用食品、アンジオテンシン変換酵素阻害用食品、血圧降下用食品の製造のための、
　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドの使用。
〔８〕Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドの、
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、高血糖改善剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤、血管内皮障害抑制剤、血管改善剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤又は抗高血圧症剤への使用。
〔９〕Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドの、
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害用食品、血糖低下用食品、抗糖尿病用食品、血管内皮障害抑制用食品又は血管改善用食品への使用。
〔１０〕ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患、高血糖状態に起因する疾患、糖尿病、血管内皮障害若しくは血管障害に起因する疾患、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患、高血圧状態に起因する疾患の、予防、改善又は治療のための、
　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチド。
〔１１〕Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドを有効成分として、
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患、高血糖状態に起因する疾患、糖尿病、血管内皮障害若しくは血管障害に起因する疾患、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患、高血圧状態に起因する疾患の、予防、改善又は治療方法。
〔１２〕ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患、高血糖状態に起因する疾患、糖尿病、血管内皮障害若しくは血管障害に起因する疾患、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患、高血圧状態に起因する疾患の、予防、改善又は治療における使用のための、
　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチド。
〔１３〕ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患、高血糖状態に起因する疾患、糖尿病、血管内皮障害若しくは血管障害に起因する疾患、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患、高血圧状態に起因する疾患の、予防、改善又は治療のための、
　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチドの使用。
〔１４〕前記ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患及び／又は症状が、高血糖症、糖尿病、糖尿病合併症、血管内皮障害及び血管障害から選ばれるものであるのが好適である。
〔１５〕前記アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患及び／又は症状が、高血圧症、心血管疾患から選ばれるものであるのが好適である。
〔１６〕カゼインを加水分解して得られるＶａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチド及びその製造方法。
〔１７〕カゼインを以下の工程にて分離精製して得られる、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕又は前記〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載のペプチド及びその製造方法。
　　（ａ）加水分解酵素（好適にはエンドペプチダーゼ）にて行うこと。好適には１０～８５℃、０．１～４８時間の条件下にて行う。
　　（ｂ）その加水分解分解物を、クロマトグラフィーにて分離精製すること。好適にはイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー等から選ばれる１種又は２種のものを使用。

Claims (18)

  1. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕。
  2. 　前記Ｘは、塩基性アミノ酸残基、脂肪族中性アミノ酸残基、ヒドロキシ基を有する中性アミノ酸残基、アミド基を有する中性アミノ酸残基及び芳香族を有する中性アミノ酸残基から選ばれるものである請求項１記載のペプチド。
  3. 　前記Ｘが、アラニン残基、グルタミン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、バリン残基、チロシン残基、セリン残基及びリシン残基から選ばれるものである請求項１又は２記載のペプチド。
  4. 　前記ペプチドが、下記の（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるものである請求項１～３の何れか１項記載のペプチド。
    　（ａ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（配列番号２）
    　（ｂ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ（配列番号３）
    　（ｃ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ（配列番号４）
    　（ｄ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ（配列番号５）
    　（ｅ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号６）
    　（ｆ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ（配列番号７）
    　（ｇ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ（配列番号８）
    　（ｈ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号９）
    　（ｉ）Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ（配列番号１０）
  5. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕を有効成分として含有するジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤。
  6. 　前記ペプチドが、請求項２～４の何れか１項記載のペプチドである請求項５記載のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤。
  7. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕を有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤。
  8. 　前記ペプチドが、請求項２～４の何れか１項記載のペプチドである請求項７記載の血糖値上昇抑制剤。
  9. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕を有効成分として含有する血管内皮障害抑制剤。
  10. 　前記ペプチドが、請求項２～４の何れか１項記載のペプチドである請求項９記載の血管内皮障害抑制剤。
  11. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
  12. 　前記ペプチドが、請求項２～４の何れか１項記載のペプチドである請求項１１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
  13. 　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、血管内皮障害抑制剤、又はアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造のための、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕の使用。
  14. 　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害用食品、血糖値上昇抑制用食品、血管内皮障害抑制用食品、アンジオテンシン変換酵素阻害用食品の製造のための、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕の使用。
  15. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕の、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、血管内皮障害抑制剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤への使用。
  16. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕の、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害用食品、血糖値上昇抑制用食品、血管内皮障害抑制用食品、アンジオテンシン変換酵素阻害用食品への使用。
  17. 　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患、高血糖状態に起因する疾患、糖尿病、血管内皮障害若しくは血管障害に起因する疾患、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患、高血圧状態に起因する疾患の、予防、改善又は治療における使用のための、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は請求項２～４のいずれか１項記載のペプチド。
  18. 　Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｘからなるペプチド〔式中、Ｘはアミノ酸残基（Ｌ－プロリン残基を除く）を示す〕、又は請求項２～４のいずれか１項記載のペプチドを有効成分として、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶに起因する疾患、高血糖状態に起因する疾患、糖尿病、血管内皮障害若しくは血管障害に起因する疾患、アンジオテンシン変換酵素に起因する疾患、高血圧状態に起因する疾患の、予防、改善又は治療方法。
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