CN108524907A - 大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途 - Google Patents

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李盘欣
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李晓玲
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Abstract

本发明公开了一种大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途，大豆肽可明显减轻哮喘大鼠气道炎症，缓解肺、支气管组织病理性损伤，对支气管哮喘有一定的防治作用，大豆肽抗炎平喘机制与下调Notch 1、Jagged 1、Hes 1、NF‑κB信号通路有关，本发明发现大豆肽可以作为一种防治气道炎症的潜在药物。

Description

大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途。
背景技术
大豆肽(soybean peptide，SP)，也叫大豆蛋白水解肽，含有人体所需的8种必需氨基酸成分，是由大豆经微生物酵解或酶解而得到的短链小分子肽混合物，相对分子量为500Da～3000Da不等，具有调节免疫、促进肌肉增长、抗肿瘤、降血脂等功效，但关于大豆肽是否还有其他作用则没有报道。
支气管哮喘(Bronchial asthma，BA)简称“哮喘”，是一种常见的呼吸系统炎症性病症，各种炎症因子或介质参与其中，往往伴有巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎性细胞浸润和气道上皮细胞损伤，出现气道平滑肌痉挛，诱发喘息、呼吸困难、气急、剧烈咳嗽等哮喘症状。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途。
优选地，所述的用途是大豆肽在制备防治支气管哮喘药物中的用途。
本发明的积极有益效果：
1.本发明发现，与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞计数明显增多，且HE病理切片观察到气管壁增厚，管腔变窄，可见多量散在炎性细胞浸润，以上结果与哮喘的炎症变化及病理学改变相一致，表明OVA致哮喘大鼠模型成功建立。同时，与哮喘模型组比较，大豆肽600、300mg/kg可明显减少哮喘大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞计数，且肺及肺内支气管组织病理学损伤得到明显改善，说明大豆肽可明显减轻哮喘大鼠气道炎症，缓解肺、支气管组织病理性损伤，对支气管哮喘有一定的防治作用。
2.哮喘的发生发展与炎症细胞释放炎性介质(如IL-1β、IL-6及TNF-α等)激活Notch 1信号通路密切相关。Notch 1信号通路由其相应的配体(Jagged 1)、受体(Notch 1)及上下游信号效应分子(Hes 1、NF-κB)等组成，其调节异常可介导哮喘炎症的发生，参与气道增殖、气管重塑等病理过程。在炎症刺激作用下，Jagged 1与Notch 1相互结合，Notch 1信号通路即被激活，高表达Notch胞内段(Notch intracellular domain，NICD)被释放，其下游Hes 1等关键靶基因被启动，从而上调气道上皮胶原蛋白的表达，诱发气道上皮下增殖和纤维化，引起哮喘气道重塑等病理性损伤。NF-κB是Notch 1信号通路调控巨噬细胞介导的炎症反应主要靶分子之一，Notch 1通路活化后，激活I-κB激酶(I-κB kinase，IKK)，IKK作用于I-κB使其发生磷酸化，使得NF-κB/I-κB二聚体复合物解离，NF-κB发生磷酸化并通过核膜转移进入核内，与DNA特异性结合位点相互作用，快速启动IL-6、IL-5及TNF-α等靶基因的转录，生成相应的炎症因子，促使炎症反应的发生。同时，生成的炎症因子又是Notch 1和NF-κB的活化剂，进一步激活Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF-κB信号通路，如此周而复始使炎症反应持续放大和扩散，使哮喘症状不断加重，诱发气道内皮细胞增殖和气管重塑等病理性损伤。本发明发现，大豆肽600mg/kg可使哮喘大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged1、Hes 1及NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显下降，说明大豆肽抗炎平喘机制与下调Notch1、Jagged 1、Hes 1、NF-κB信号通路有关。
3.本发明发现大豆肽可以作为一种防治气道炎症的潜在药物。
附图说明
图1为本发明大鼠组织的显微镜放大图(200×)：A-正常对照组，B-哮喘模型组，C-大豆肽600mg/kg组；D-大豆肽300mg/kg组；E-大豆肽150mg/kg组；
图2为大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB mRNA的扩增电泳图：1-正常对照组，2-哮喘模型组，3-大豆肽600mg/kg组；
图3为大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB蛋白电泳图：1-正常对照组，2-哮喘模型组，3-大豆肽600mg/kg组。
具体实施方式
下面结合一些具体实施例对本发明进一步说明。
1材料与方法
1.1实验动物
SD大鼠(SPF级)，雄性，8w龄，体重180～200g，将大鼠于动物室适应性饲养5d，4～5只每笼，3～4d更换一次垫料，调整室内温度为22±2℃，湿度为45％～65％，12h明暗光照周期，常规饲料喂养，自由饮水。
1.2主要试剂
大豆肽，戊巴比妥钠卵清蛋白，氢氧化铝，兔抗Notch 1、Jagged 1、Hes 1、NF-κB及β-actin抗体，羊抗兔辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗、增强型RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、彩色预染蛋白质分子量标准(10～180KDa)、PVDF膜及SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，Trizol总RNA抽提试剂、Easy-LoadTM PCR Master Mix(Blue，2×)、BeyoRTTM II cDNA第一链合成试剂盒，Notch 1、Jagged 1、Hes 1、NF-κB及β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计与合成。
1.3实验动物分组及处理
将SD雄性大鼠随机分为5组，每组10只，分别为：正常对照组、哮喘模型组及大豆肽高、中、低剂量组。
正常对照组于实验第1d和第7d腹腔注射生理盐水0.2ml，其它各组于实验第1d和第7d腹腔注射致敏液(OVA 5mg+氢氧化铝200mg+生理盐水1ml充分混悬)0.2ml。第8d，将正常对照组大鼠置于多功能诱咳引喘仪中用生理盐水进行雾化激发，其它组大鼠用含1％OVA生理盐水溶液进行雾化过敏激发，1次/d，每次30min。从雾化第2d开始，于每次激发前给各组大鼠不同的药物进行干预，正常对照组和哮喘模型组灌胃给予生理盐水，大豆肽高、中、低剂量组大鼠分别灌胃给予大豆肽600、300及150mg/kg，各大鼠灌胃容量均为1ml/100g体重，连续雾化激发和给药7d。末次激发24h后，将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，快速取下大鼠肺组织，从气管注入生理盐水5ml，反复缓慢回抽3～4次，收集肺泡灌洗液(Broncho-alveolar lavge fluid，BALF)，进行白细胞分类计数，然后将肺组织用生理盐水冲洗干净，取右下叶肺组织用于组织学检测，剩余组织冻存于-80℃超低温冰箱中备用。
1.4大鼠肺组织形态学观察
取大鼠右下叶肺组织，置于4％多聚甲醛溶液中固定48h，经系列浓度乙醇脱水处理，然后进行石蜡包埋、切片及常规HE染色，显微镜下观察肺及肺内支气管组织病理学改变及气道重塑变化情况。
1.5RT-PCR法检测大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κBmRNA表达水平
取大鼠左上叶肺组织约50～60mg，PBS缓冲液冲洗干净，迅速置入盛有液氮的研钵中充分研磨至粉末状，然后加入1.5ml Trizol试剂充分混匀裂解消化，12000rpm 4℃离心20min，吸取上清，弃去沉淀，根据试剂盒说明书操作步骤进行RNA抽提和逆转录反应。将逆转录得到的cDNA进行PCR扩增实验，各待测基因引物序列见表1。
表1待测基因引物序列
1.6 Western blot法检测大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB蛋白表达水平
取大鼠左下叶肺组织约80～100mg，组织剪剪碎置于离心管中，加入1.5mlRIPA蛋白裂解液于冰上用电动匀浆器充分匀浆，然后再裂解约30min，4℃12000rpm离心15min，取上清移入1.5ml EP管中，用BCA试剂盒进行蛋白定量，并调整浓度一致。将上清样品与蛋白上样缓冲液等体积混匀后煮沸5min，以25μl/孔上样，进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，依次进行封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色及拍照等步骤，以-actin为内参，分析各待测蛋白浓度相对值。
1.7统计学处理
用SPSS18.0统计软件进行数据处理，计量数据以Mean±SD表示，多组间的两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t检验，检验水准为α＝0.5。
2结果
2.1大豆肽对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的影响
与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞计数明显增多(P<0.01)；与哮喘模型组比较，大豆肽600、300mg/kg组大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞计数显著降低(P<0.05，P<0.01)。结果见表2。
表2大豆肽对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的影响(n＝10)
与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与哮喘模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
2.2大豆肽对哮喘大鼠肺及肺内支气管组织病理学变化的影响
正常对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡无萎缩塌陷，支气管管壁未见增厚，偶见炎性细胞浸润；哮喘模型组大鼠肺组织可见多量、散在的炎性细胞浸润，支气管壁水肿、黏液腺和管壁平滑肌细胞肥大、增生，管腔变窄，黏膜下层有嗜酸性粒细胞、单核及淋巴细胞增多；大豆肽600、300mg/kg组大鼠肺及肺内支气管组织病理损伤较模型组明显改善，炎性细胞浸润明显减少，肺泡结构较为完整；大豆肽150mg/kg组大鼠肺、支气管组织变化与模型组相当，无明显改善。结果见图1。
2.3大豆肽对哮喘大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κBmRNA表达水平的影响
与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes1及NF-κB mRNA表达水平明显上调(P<0.01)；与哮喘模型组比较，大豆肽600mg/kg组大鼠肺、支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。结果见图2、表3。
表3大豆肽对哮喘大鼠肺、支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB mRNA表达水平的影响(n＝10)
与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与哮喘模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
2.4大豆肽对哮喘大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB蛋白表达水平的影响
与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠肺及肺内支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes1及NF-κB蛋白表达水平明显上调(P<0.01)；与哮喘模型组比较，大豆肽600mg/kg组大鼠肺、支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB蛋白表达水平显著下调(P<0.05，P<0.01)。结果见图3、表4。
表4大豆肽对哮喘大鼠肺、支气管组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF-κB蛋白A表达水平的影响(n＝10)
与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与哮喘模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种大豆肽在制备防治气道炎症反应药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的大豆肽在防治气道炎症反应药物中的用途，其特征在于，所述的用途是大豆肽在制备防治支气管哮喘药物中的用途。
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