JP7093954B2

JP7093954B2 - サバ由来のペプチドを有効成分とするｐａｉ－１阻害剤及び組成物

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Publication number: JP7093954B2
Application number: JP2019129041A
Authority: JP
Inventors: 光史伊藤; 誠一山本
Original assignee: FUKUI PREFECTURAL UNIVERSITY
Current assignee: FUKUI PREFECTURAL UNIVERSITY
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: JP2021014419A

Description

本発明は、プラスミノゲンアクチベータインヒビター－１（plasminogen activator inhibitor type 1；以下「ＰＡＩ－１」と称する）の活性を阻害する作用を有するサバ由来のペプチドを有効成分とするＰＡＩ－１阻害剤及び組成物に関する。

血管内では血液外傷時の出血を止めるために血液を凝固させる作用が維持されているが、同時に過剰な血栓（血液凝固塊）が血管を閉塞せずに流動性を維持する必要がある。血液流動性を維持するために、血液凝固系及び線溶系と称する血管内での血栓を溶解する生体調節機構の２つの系の活性に関して偏りが生じないように調節されている。

ＰＡＩ－１は、線溶系に含まれる因子の１つであり、線溶系が過剰に作用しないように血栓に対する溶解酵素を抑制するブレーキとしての役割を担っていることが知られている。そのため、ＰＡＩ－１活性を阻害する物質は、心筋梗塞、脳梗塞といった循環器系疾患の治療において線溶系活性を上昇させる血栓溶解薬として開発、研究が進められている。ＰＡＩ－１阻害剤の開発では、ＰＡＩ－１とがん幹細胞、ＰＡＩ－１と多発性硬化症、ＰＡＩ－１と老化、といった様々な生理作用との関連性が研究されており、幅広い疾患への臨床応用に向けた検討がなされている（非特許文献１参照）。

本発明者は、サバの発酵製品であるへしこ及びなれずしからの水抽出成分溶液（抽出物）がＰＡＩ－１活性に及ぼす影響をラットで調べ、抽出物はインビトロでＰＡＩ－１活性を直接阻害し、阻害活性は抽出物の消化酵素消化後に失われなかったことを報告している（非特許文献２参照）。

こうしたＰＡＩ－１活性に影響を及ぼす物質に関しては、例えば、特許文献１には、ＰＡＩ－１中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ－１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質からなるＰＡＩ－１阻害剤が開示されている。また、特許文献２には、ヒトプラスミノーゲン活性化因子阻害物質１（ＰＡＩ－１）由来のペプチドとして、アミノ酸配列（Ｒ１－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｒ２）を有する単離されたペプチドであって、Ｒ１は、水素、アセチル、アルキル、およびアミノ保護基からなる群から選択され、Ｒ２はカルボキシル、アミド、アルコール、エステル、およびカルボキシル保護基からなる群から選択される単離されたペプチドが開示されている。

特開２０１５－１４７７４４号公報特許第５４２１２５７号公報

段孝外１名、「ＰＡＩ－１阻害薬・そのポテンシャルと臨床への応用」、日本血栓止血学会誌、２０１５、２６（３）、ｐ．３１０－３１７ Koji ITO、 "Inhibitory effect of water extractive components from heshiko and narezushi on plasma PAI-1 activity in rats"、日本血栓止血学会誌、２０１６、２７（３）、ｐ．３４９－３５７

本発明者らは、上述したこれまでの知見に基づいて、サバの魚肉に着目してＰＡＩ－１活性を抑制する成分を特定する研究を進めてきている。こうした食品からＰＡＩ－１活性を抑制する成分を特定することで、有効性とともに安全性が高いＰＡＩ－１阻害剤を得ることができる。

そこで、本発明は、サバ由来のＰＡＩ－１活性を抑制する成分を特定することで、安全性の高いＰＡＩ－１阻害剤及び組成物を提供することを目的とする。

本発明に係るＰＡＩ－１阻害剤は、サバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓの少なくとも１つを有効成分とする。

本発明に係るＰＡＩ－１阻害用組成物は、サバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓの少なくとも１つを有効成分として含有する。

サバ由来のＰＡＩ－１活性を抑制する成分としてサバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓを特定することで、これらのペプチドの少なくとも１つを有効成分とする安全性の高いＰＡＩ－１阻害剤を得ることができる。

抽出液について９時間まで加水分解した場合のペプチド濃度を示すグラフである。加水分解物によるＰＡＩ－１活性抑制作用の変化を示すグラフである。マサバ加水分解物に関するＧＰＣ画分のＲＰＣによるペプチド分布を示すグラフである。加水分解物のＧＰＣ画分におけるＰＡＩ－１活性抑制作用を示すグラフである。マサバ加水分解物の親水性分画による画分のクロマトグラフである。タイセイヨウサバ加水分解物の親水性分画による画分のクロマトグラフである。ペプチドによる血漿の残存ＰＡＩ－１活性を示すグラフである。ペプチドの濃度変化による残存ＰＡＩ－１活性を示すグラフである。

以下、本発明に係る実施形態について詳述する。上述した非特許文献２に記載されているように、サバの発酵製品であるへしこ及びなれずしからの熱水抽出成分溶液（抽出物）がＰＡＩ－１活性を阻害する作用を有していることが確認されている。そこで、サバから採取した魚肉を酵素により人工的に加水分解してペプチドを含む抽出液を調製した。ここで、サバとしては、マサバ、ゴマサバ及びタイセイヨウサバといった魚種が挙げられる。得られた抽出液のペプチド量を測定し、所定の濃度の希釈液に調製してＰＡＩ－１活性抑制作用を測定した。そして、有効なＰＡＩ－１阻害活性を示す希釈液に関して高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いた分析手法により分子量分画、極性分画及び親水性画分分画を行い、ピークを示す画分について再度ＰＡＩ－１活性抑制作用を測定した。こうして有効成分となる分子量画分のペプチドを絞り込み、有効成分として２種類のジペプチド（Ｇｌｙ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｌｙｓ）を同定した。

同定されたジペプチドを合成してラットに継続投与してＰＡＩ－１阻害能を検証する動物実験を行ったところ、対照群とジペプチド投与群との間に明らかな活性値の差が見られたことから、その有効性を確認することができた。また、合成されたジペプチドを用いて試験管内でのＰＡＩ－１活性の直接阻害能を検証したところ、明確な阻害能を確認することができた。

以上の検証結果に基づいて、サバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓの少なくとも１つを有効成分とするＰＡＩ－１阻害剤を得ることができ、また、サバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓの少なくとも１つを有効成分として含有するＰＡＩ－１阻害用組成物を得ることができる。

以下、実施例について説明する。

［実施例１］
＜試料の調製＞
マサバ及びタイセイヨウサバから採取し細切した魚肉（血合い肉含む；ｐＨは概ね５．５～６）に蒸留水(重量比１．５倍量)を加え、ｐＨ７．５～８になるよう水酸化ナトリウム溶液を加えて原液を調製する。魚肉は内臓酵素の影響を省くため、魚肉のみとしたが、量産する場合には魚体丸ごとで処理しても問題ないと考えられる。

市販プロテアーゼ６種（パパイン、サーモライシン、アルカラーゼ2.4L、アマノＡ、アマノＭ、アマノＮ）をあらかじめｐＨ８に調整した蒸留水に懸濁させておき、各プロテアーゼを重量比１％の量で原液に添加して３７℃で２４時間まで加水分解させた。経時的にサンプリングし、ｐＨを５に調整して活性を大きく低下させた後、さらに１００℃の沸騰水中で１５分間加熱することにより反応停止させ、加水分解物をフィルタ（孔径０．４５μｍ）でろ過して固形物を除去し、試料溶液とした。

＜Ｌｏｗｒｙ法によるペプチド濃度の測定＞
Ｌｏｗｒｙ法に必要な以下の溶液を準備した。
Ａ液:０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（１Ｌ）に対して２０ｇの無水炭酸ナトリウムを溶解させた溶液
Ｂ液:硫酸銅５水和物０．５ｇと酒石酸塩１ｇ（ナトリウム塩又はカリウム塩）を蒸留水に溶かしてｐＨを６．３に調製した後、最終容量を１００ｍＬとした溶液
Ｃ液:Ａ液５０ｍＬに対してＢ液１ｍＬを混合した溶液
Ｄ液:市販のフェノール試薬（Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬）を蒸留水で２倍に希釈した溶液
測定手順は、試料溶液１．０ｍＬに対してＣ液５．０ｍＬを加えてよく撹拌した後、室温で１０分以上静置し、Ｄ液０．５ｍＬを加えて撹拌して３０分後に紫外可視分光光度計（株式会社島津製作所製；UV-1240）により７５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定データを標準タンパク質で作成された検量線と比較することでペプチド濃度を定量的に測定した。

＜加水分解に伴うペプチド濃度の変化について＞
マサバ及びタイセイヨウサバの魚種において原料となる生鮮魚肉では水溶性のペプチドは少なく、３７℃で２４時間静置した場合、マサバ及びタイセイヨウサバでは約４倍に増加した。マサバの魚肉に市販プロテアーゼ６種をそれぞれ添加して加水分解させた結果、１時間後には水溶性ペプチドが大きく増加し、９時間まで漸増した。図１は、９時間まで加水分解した場合のペプチド濃度を示すグラフである。いずれのプロテアーゼを用いても加水分解時間９時間までに水溶性のペプチド量はほぼ最大量に達し、加水分解時間が２４時間ではペプチド量にやや減少傾向が見られた。こうした結果をみると、加水分解時間は９時間とすることが望ましいことが確認された。

＜ＰＡＩ－１活性抑制作用の測定＞
市販の測定キット（ＡＢＣＡＭ社製；PAI-1(SERPINE1)Rat ELISA Kit）を用いて以下の測定手順でＰＡＩ－１活性を測定した。
・測定キットの手順にしたがってＴＢＳ緩衝液に市販のウシ血清アルブミンを溶かして調製した３％溶液を用いて活性量１０ｎｇ／ｍＬのＰＡＩ－１標準液を準備する
・ペプチド濃度を測定した試料溶液（加水分解９時間）を希釈して１０ｎｇ／ｍＬの濃度の試料溶液を準備する
・準備した試料溶液とＰＡＩ－１標準液を等量混合して活性量５ｎｇ／ｍＬの処理液を調製し、室温で１０分間撹拌した後測定キットでＰＡＩ－１活性量を測定する

＜ＰＡＩ－１阻害活性の変化について＞
図２にＰＡＩ－１活性量の測定結果を示す。図２に示すように、いずれの加水分解試料でもＰＡＩ－１活性量は５ｎｇ／ｍＬを大きく下回り、活性の阻害作用が認められた。なお、加水分解１時間の試料溶液でもＰＡＩ－１活性の阻害作用が認められており、酵素の種類及び加水分解時間による明確な差は見られなかった。こうした測定結果をみると、魚肉の加水分解によりＰＡＩ－１阻害活性を有するペプチドが生成されていることを示唆している。

＜試料溶液中のペプチドの分画＞
液体クロマトグラフ装置として、株式会社東ソー製の８０２０ＨＰＬＣシステムを使用した。
（分子量による分画：ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ））
市販のカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製；Superdex 30 Increase）を用い、室温（２５℃）下で０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む３０％アセトニトリル（ＡＣＮ）溶液を溶離液として用いて試料溶液中のペプチドの分離を行った。流速は０．５ｍＬ／分とし、２１４ｎｍの吸光度をモニターして１分ごとに溶出液を採取した。
（極性による分画：逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ））
分子量分画による画分を蒸発乾固させた後、蒸留水に再溶解させて逆相ＨＰＬＣを以下の通り行った。
・カラムにはＯＤＳ－８０Ｔｓ（東ソー株式会社製；ＱＡグレード、φ４．６×２５０ｍｍ）を用いる
・Ａ液（０．１％ＴＦＡを含む１％ＡＣＮ溶液及びＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９５％ＡＣＮ溶液）を準備する
・流速１．０ｍＬ／分とし、２１４ｎｍ及び２３０ｎｍの吸光度をモニターしながら所定の２液グラジェントプログラムにしたがってＡ液及びＢ液の割合を変化させて試料を溶離させる

＜ペプチドの分離とＰＡＩ－１活性抑制作用について＞
加水分解９時間の試料で酵素の種類によるペプチドのＧＰＣ及びＲＰＣによる分子量分布の比較を行ったところ、図３に示すように、アマノＮによるマサバの加水分解物については、明確なペプチドの存在が確認された。アマノＮ以外の加水分解物についてもペプチドの存在が確認されているが、加水分解物でのペプチド量及び分子量分画による低分子量のペプチドの可能性といった観点からアマノＮによる加水分解物について以後の分析を行った。

また、ＧＰＣ画分（Ｆｒ３４～Ｆｒ３７；分子量２００～４５０）についてＰＡＩ－１活性抑制作用の測定を行ったところ、図４に示すように、マサバ及びタイセイヨウサバの画分にＰＡＩ－１活性抑制作用が確認されたが、ニシンでは明確に確認されなかった。

以上の測定結果からみると、サバの抽出液を加水分解したペプチドにＰＡＩ－１活性抑制作用を有するものが含まれていることが確認された。

［実施例２］
次に、サバの抽出液の加水分解物からＰＡＩ－１活性抑制作用を有するペプチドを同定する分析を行った。

＜試料の調製＞
マサバ及びタイセイヨウサバを用いて実施例１と同様に試料溶液を作製した。プロテアーゼとしてアマノＮを用い、加水分解９時間で処理した。

＜試料溶液中のペプチドの分画及び同定＞
実施例１と同様に、試料溶液に対して分子量による分画を行った。実施例１で得られた検証結果からＧＰＣ画分で分子量２００～４５０に絞り込んで分画を行うことになるが、このＧＰＣ画分では親水性が強いピークが量的に多いと考えられることから、以下の親水性画分分画を行った。
・カラムにはＺＩＣ－ＨＩＬＩＣ（Ｍｅｒｃｋ社製；ＳｅＱｕａｎｔ、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いる
・溶離液（３０％ギ酸アンモニウムを含む７０％ＡＣＮ溶液；ｐＨ６．２）を準備する
・流速１．０ｍＬ／分とし、２３０ｎｍの吸光度をモニターしながら所定の２液グラジェントプログラムにしたがって水び溶離液の割合を変化させて試料を溶離させる

親水性画分分画により、マサバについては、図５に示すように、Ｆｒ３７－４から２画分、タイセイヨウサバについては、図６に示すように、Ｆｒ３７－４から３画分が分画された。溶離液に酢酸アンモニウムが含まれているため、予め脱塩処理してＲＰＣ分画を行った後表れた画分について液体クロマトグラフ質量分析計（Applied Biosystems社製API2000）を用いて分子量解析を行った。

分子量解析の結果複数の成分の集合であることが確認できたため、ピークとなる画分についてアミノ酸配列分析（ABI社製procise491HTを使用）を行うとともに塩酸加水分解後のアミノ酸組成分析（日本電子株式会社製ＪＬＣ－５００／Ｖ２を使用）を行った。その結果、マサバ及びタイセイヨウサバのいずれからも２種類のジペプチド（Ｇｌｙ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｌｙｓ）が同定された。

［実施例３］
＜動物実験によるＰＡＩ－１阻害作用の検証＞
次に、これらのジペプチドのＰＡＩ－１阻害作用を検討するために、同定されたペプチドを合成し、脂質負荷飼育したWistarラット（日本ＳＬＣ株式会社製）に継続投与するとともに、実施例１と同様のＰＡＩ－１活性抑制作用の測定を行ってＰＡＩ－１阻害能を検討した。

まず、動物試験では、９週齢のWistarラットを購入し室温２３±１℃、湿度５５±５％、明暗周期１２時間(明期８・２０時)の環境下で市販餌料（ＣＥ－２、日本クレア株式会社製）を与えて２週間予備飼育を行った後、実験用脂質負荷餌料（QuickFat、日本クレア株式会社製）に切り替えてさらに２日間予備飼育を行った後、ラットを３群に分けて投与試験を開始した。

投与用ペプチド試料は、まず１ｍｇ／ｍＬとなるようにペプチドを蒸留水に溶解して調製した。予備飼育から投与直前まで飲水量と体重を定期的に測定し、１日当たりの飲水量からペプチド投与量が１０ｍｇ／ｋｇとなるように適宜希釈して用いた。１０日間の投与終了後に開腹して採血し、３．２％クエン酸酸ナトリウム溶液を１０％含まれるように添加し、遠心分離して血漿を調製した。得られた血漿について実施例１と同様のＰＡＩ－１活性抑制作用の測定を行った。測定結果を図７に示す。

図７では、対照群に比べてペプチド投与群ではＰＡＩ－１活性の低下が明確に認められており、ペプチドのＰＡＩ－１阻害作用が確認された。

＜invitroでの直接阻害能の検証＞
今回試料として用いたのはいずれもジペプチドであり、このサイズであれば腸管でそのまま吸収されることが知られている。そこで、ＰＡＩ－１活性の直接阻害能について検討した。

まず、ＰＡＩ－１活性量５ｎｇ／ｍＬ対してペプチド含有量が０．０５～５０ｎｇ／ｍＬとなるように混合し、常温で１０分間撹拌した。次に、得られた処理液について残存ＰＡＩ－１活性を実施例１で使用した測定キットを用いて測定した。

図８は測定結果を示すグラフである。図８では、２ｎｇ／ｍＬ以下の濃度でも残存活性値が４ｎｇ／ｍＬ以下となることが示されており、明確な阻害能が確認された。

本発明は、血漿中のＰＡＩ－１活性を低下させ、線溶系の亢進を誘導することにより、血栓形成を抑制させる効果を持つことが確認された。しかしながら、ペプチドとＰＡＩ－１との結合はさほど強くなく、濃度依存性が明確には認められなかったことから、その作用は医薬品ほど強くないものと考えられる。そのため、血栓症発症時の治療薬としての効能は不明であるものの、長期間継続して摂取することにより、血管梗塞の予防として作用することが期待される。

Claims

サバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓの少なくとも１つを有効成分とするＰＡＩ－１阻害剤。
サバ由来のペプチドであるＧｌｙ－Ｌｙｓ及びＰｒｏ－Ｌｙｓの少なくとも１つを有効成分として含有するＰＡＩ－１阻害用組成物。
食品用組成物である請求項２に記載のＰＡＩ－１阻害用組成物。