PL166731B1 - Sposób wytwarzania środka do leczenia infekcji wywołanych przez organizmy wrażliwe na antybiotykiβ-laktamowe - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania środka do leczenia infekcji wywołanych przez organizmy wrażliwe na antybiotyki β-laktamowe, opartego na oligopeptydzie i antybiotyku β-laktamowym, znamienny tym, że wyodrębnia się i oczyszcza kationowy amfipatyczny oligopeptyd, tworzący w obecności lipidowo/wodnej granicy faz strukturę α-helikalną o sekwencji reszt aminokwasowych aai-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-aa3-aa4-X, w której aa; oznacza Pro, Ala lub Lys, aa2 oznacza Ile, lub Leu, aa3 oznacza Glu lub Lys, aa4 oznacza Ser, Leu lub Lys, a X oznacza grupę karboksylową albo sekwencję reszt pięciu aminokwasów o strukturze α-helikalnej określoną ogólną sekwencją aminokwasową aa5-Lys-Lys-aa^-Gly, w której aa5 oznacza Ala lub Leu, a aa6 oznacza Leu lub Phe i tak wyodrębniony i oczyszczony oligopeptyd łączy się z antybiotykiem β-laktamowym.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania środka do leczenia infekcji wywołanych przez organizmy wrażliwe na antybiotyki β-laktamowe, opartego na oligopeptydzie i antybiotyku.

Infekcje bakteryjne, przede wszystkim infekcje wywołane przez bakterie Gram-ujemne stanowią główną przyczynę śmierci ciężko chorych pacjentów. (Klatersky i wsp., 1988, Eur. J. Cancer Clinical Oncology, 2451: 535-545). Infekcje występujące u takich pacjentów rozwijają się szybko i często są śmiertelne. Pacjenci poddani chemioterapii mają często niską liczbę granulocytów, to znaczy cierpią na granulocytopenię i są szczególnie narażeni na infekcję bakteryjną (Klatersky, 1986, Am. J. Med. 80: 2-12). Najczęstszymi organizmami infekującymi tych pacjentów są Gram-ujemne pałeczki Escherichia coli (E.Coli), Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa) i Klebsiella pneumoniae (K.pneumoniae) oraz Gram-dodatnie gronkowce Staphylococcus aureus (S.aureus) i Staphylococcus epidermis (S. epidermis).

Innymi pacjentami, którzy są szczególnie wrażliwi zarówno na Gram-ujemne, jak i na Gram-dodatnie infekcje bakteryjne są ci, którzy przeszli operację żołądkowo-jelitową (Bergamini i Polk, 1989, J.Antimicrobiol Chemiotherapy 23: 301-303), a także inni pacjenci po zabiegach chirurgicznych. Obecnie jedynie skuteczne leczenie tych pacjentów polega na podawaniu antybiotyków.

Jedną z grup antybiotyków skutecznych w leczeniu takich pacjentów są antybiotyki β-laktamowe, które hamują wytwarzanie ściany komórkowej u bakterii. Wspólną cechą antybiotyków β-laktamowych jest ich zdolność do zabijania szerokiej gamy różnych bakterii. Jest to bardzo ważna cecha, ponieważ często nie praktykuje się określania rodzaju bakterii powodujących chorobę. Ponadto, leczenie antybiotykami bardzo często rozpoczyna się przed rozpoznaniem organizmu infekującego, ponieważ infekcje bakteryjne u tych pacjentów mogą szybko prowadzić do śmierci. Przykłady antybiotyków β-laktamowych obejmują penicyliny, cefalosporyny, cefamycyny, monobaktamy, pirazydony, penemy i karbapenemy. Zaobserwowano, że niskie stężenia penicylin wywoływały u E.coli rozwłóknianie z rozpęcznianiem i lizą występującą jedynie przy wyższych stężeniach antybiotyku (Waxman i Stominger, 1983, Anmal Rev.Biochem.52: 825-869). Wykazano również, że antybiotyki β-laktamowe działają na transpeptydazy peptydoglikanowe i że szereg białek bakteryjnej błony komórkowej wiąże kowalentnie penicyliny i spokrewnione z nimi antybiotyki β-laktamowe.

Penicylina G jest skuteczna w hamowaniu takich Gram-dodatnich gronkowców jak Pneumococci i Stereptococci oraz Gram-ujemnych takich jak Weisseria meningitidis (Neu, 1987, Medical Clinics of⁷ North America 71: 1051-1064). Pco^^ćą^l^co^o do leczenia infekcji spowodowanych przez Hemophilus influenzae (H.influcnzae), E.coli, Salmonella i Shigella szeroko stosowano aminopenicyliny takie, jak ampicylina i amoksycylina. Jednakże, obserwowano wzrost wskaźnika rozpowszechnienia występowania u tych organizmów beta-laktamaz powstających przy udziale plazmidów. Okazało się, że cefalosporyny wykazują działanie przeciwko Pseudomonas aeruginosa, zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych wywołanemu przez zwykłe patogeny i przeciwko infekcjom wywołanym przez drobnoustroje wielooporne, chociaż oporność na te środki również zwiększa się. Inna grupa β-laktamin obejmuje środki karbapenemowe takie, jak imipenem, który hamuje bakterie Gram-dodatnie' i Gram-ujemne tlenowe i beztlenowe. Zauważono, że karbapenemy wykazują wysokie powinowactwo do białek wiążących penicyliny.

Z uwagi na wzrost oporności na antybiotyki β-laktamowe podawano pacjentom różne kombinacje tych antybiotyków. Aminopenicyliny łączono z klawulamianem, inhibitorem β-laktamazy, aby przeciwdziałać obecności β-laktamazy kodowanej przez plazmid obecnej w H.influenzae, E.coli, Salmonella i Shigella (Neu, 1987, Medical Clinics of North America 71: 1051-1064). β-laktaminy łączono również z aminoglikozydami (Klastersky, 1986, Am.J.Med.80:2-13). Takie połączenia były skuteczne, jednakże ich skuteczność różniła się w zależności od rodzaju bakterii, przeciwko którym je stosowano. Okazało się, że połączenia β-laktamin z innymi antybiotykami mogą powodować antagonizm pomiędzy dwoma związkami.

Coraz większa liczba doniesień wskazuje na to, że antybiotyki mogą ujemnie wpływać na bakterie w inny sposób, niż przewidywane działanie bakteriobójcze (Darvacan i wsp., 1990,

J.Infect.Dis. 162: 914-921; Essig i wsp., 1982, Arch.Microbiol. 132: 245-250; Kadurug-Amuwa

166 731 i wsp., 1988, Antimicrob.Agents and Chemother. 32: 364-368;'Leying i wsp., 1986, Antimicrob.Agents and Chemother.30:475-480; Raponi i wsp., 1989, Antimicrob.Chemother.23: 565-576; Sauerbaum i wsp., 1987, Antimicrob.Agents and Chemother. 31:1106-1110; Taylor i wsp., 1981, Antimicrob.Agents and Chemother.19: 786-788; Taylor i wsp., 1982, Drugs Exptl.Clin.Res.8: 625-631 i Veringa i wsp., 1988, Drugs Exptl.Clin.Res. 14: 1-8).

Przykłady niektórych takich działań obejmują hamowanie wytwarzania egzoenzymu (Grimwood i wsp., 1989, Antimicrob.Agents and Chemother.33: 41-47), zmiany w strukturze peptydoglikanu (Garcia-Bustos i Dougherty, 1987, Antimicrob.Agents and Chemother.31: 178-182) i utrata zdolności przyczepności oraz zdolności do wtargnięcia (Schifferli i Beachey, 1988, Antimicrob.Agents and Chemother.32: 1603-1608 i Vosbeck i wsp., 1979, Rev.Inf.Dis. 1: 845-851). Skutki takich działań obserwuje się, gdy bakterie inkubuje się z antybiotykami o stężeniu niższym niż minimalne stężenia hamujące (MIC). Działanie antybiotyków w stężeniach niższych, niż stężenie hamujące może pomagać gospodarzowi w niszczeniu bakterii. Szczególnie dotyczy to antybiotyków β-laktamowych, o których wiadomo, że na pojawienie się objawów działania bakteriobójczego tych antybiotyków trzeba stosunkowo dużo czasu.

Na ogół, antybiotyki dawkuje się tak, aby podczas leczenia osiągać wyższe stężenia, niż minimalne stężenie hamujące. Jednakże, z uwagi na to, że zarówno czynniki gospodarza jak i bakteryjne takie, jak β-laktamazy mogą wpływać na ilość czynnego antybiotyku w miejscu infekcji, dawkowanie ilości ponad minimalne stężenie hamujące nie zapewnia odpowiednich stężeń antybiotyków dla każdego organizmu.

Z ludzkich i zwierzęcych źródeł wyizolowano szereg oligopeptydów kationowych o działaniu przeciwbakteryjnym. Obejmują one magaininy (Zasloff i wsp., 1987, Proc.Natl..Acad.Sci.USA 84: 5449-5453; Zasloff i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci USA 85: 910-913; i Zasloff, 1989, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 810 777); cekropiny (Christensen i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5072-5076 i Stein i wsp., 1981, Nature /Londyn/ 292: 246-248); Sarkotoksyny (Nakajima i wsp., 1987, J.Biol. Chem. 262: 1665-1669 i Okada i Natori, 1985, Biochem,J. 229: 453-458); oraz defensyny (Selsted i wsp., 1985, J.Clin,Investig 76: 1436-1439 i Lehrer i wsp., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 543 252, 4 659 692 i 4 705 777).

Magaininy znaleziono w wydzielinach skóry Xenopus laevis, południowo-afrykańskiej żaby. Wyizolowano dwa rodzaje magaininy: magaininę-1 i magaininę-2 (Zasloff i wsp., 1987, Proc.Nad.Acad.Sci.USA 84:5449-5453). Magainina-1 i magainina-2 są ze sobą blisko spokrewnione, każda ma długość 23 aminokwasów, różnią się tylko dwoma podstawieniami aminokwasowymi. Peptydy te są rozpuszczalne w wodzie, w skutecznych stężeniach przeciwbakteryjnych, nie powodują hemolizy i są potencjalnie amfililowe. Okazało się, że skuteczne stężenie przeciwbakteryjne magaininy potrzebne do zadziałania w środowisku nie zawierającym surowicy lub w buforze, zależy od rodzaju magaininy i od drobnoustroju. Zbadano również aktywność przeciwbakteryjną różnych syntetycznych analogów magaininy (Coervo i wsp., 1988, Peptide Research 81: 81-86; Zasloff i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 910-913; i Chen i wsp., 1988, Antimicrobiol Peptides and Processes for Making the Same, opis zgłoszenia patentowego w Stanach Zjednoczonych Ameryki nr 7-280363, National Technical Information Service). Okazało się, że usunięcie trzech N-końcowych aminokwasów z magaininy-2 nie wpływa ujemnie na jej aktywność przeciwbakteryjną (Zasloff i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 910913). Jednakże, usunięcie czwartego aminokwasu znacznie zmniejsza aktywność przeciwbakteryjną. W przypadku magaininy-1 okazało się, że cały region N-końcowy jest konieczny (Cuerco i wsp., 1988, Peptide Research 1: 81-86). Jednakże, analogi z usunięciami w regiomeC-końcowym, zwłaszcza reszt: alaninowee-15, glicynowee-18 lub kwasu glutaminowego-19 wykazywały taką samą lub zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną w porównaniu z postaciami oryginalnej magaminy-1 lub magaininy-2, ale jednocześnie wykazywały różną aktywność hemolityczną (Coervo i wsp., 1988, Peptide Research 1: 81-86). Ujawniono analogi peptydów magaininowych, w których reszty aminokwasowe o małej skłonności do struktury helikalnej są zastąpione resztami aminokwasowymi o dużej skłonności do struktury helikalnej, a więc wykazujące niższą wrażliwość na działanie egzopeptydazy i wzmocnione właściwości amfililowe i przeciwbakteryjne (Chen i wsp., 1988, Antimicrobiol Peptides and Processes for Making the Same, opis

166 731 zgłoszenia patentowego w Stanach Zjednoczonych Ameryki nr 7-280363, National Technical Information Service). Z owadów wyizolowano dwie grupy oligopeptydów kationowych cekropiny i sarkotoksyny. Cekropiny wyizolowano z różnych owadów (Christensen i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5072-5076 i Stein i wsp., 1981, Nature (Londyn) 292: 246-248). Główne wyizolowane cekropiny to: cekropina A, B i D o, odpowiednio, 37, 36 i 36 resztach, każda o charakterze amfipatycznym. Okazało się, że do działania prowadzącego do rozrywania błony potrzebny jest N-końcowy region tego peptydu. Trzy sarkototoksyny powstają w hemolimfie Sarcophaga peregrina.

Oligopeptydy kationowe o działaniu przeciwbakteryjnym wyizolowane ze źródeł ludzkich znane są jako defensyny (Selsted i wsp., 1985, J. Clin. Investig. 76: 1436-1439 i Lehrer i wsp., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr: 4 543 252, 4 659 692 i 4 705 777). Takie peptydy znaleziono w makrofagach i w granulocytach. Mają one dużą zawartość cysteiny i argininy. Sześć takich białek zidentyfikowano.

Okazało się również, że fragmenty białkowych prekursorów mitochondrialnych wykazują działanie przeciwko bakteriom Gram-dodatnim (Lee i wsp., 1986, Biochem, Biphys. Acta 862: 211-219). Widmo CD tych peptydów w obecności lipozomów fosfolipidowych wykazywało, że ich aktywność przeciwbakteryjna na ogół szła w parze z zawartością α-helikalnej struktury amfifilowej.

Przeciwbakteryjne polipeptydy kationowe przebadane do chwili obecnej wykazują wspólne cechy. Są one peptydami kationowymi, które zabijają szeroką gamę bakterii, co stwierdzono w standardowych próbach in vitro. Istnieją silne dowody na to, że mechanizm ich działania polega na wnikaniu do wewnętrznej błony bakteryjnej, co powoduje tworzenie małego kanalika, przez który mogą przechodzić małe jony (Christensen i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5072-5076); Nąjikama i wsp., 1987, J.Biol.Chem. 262: 1665-1669; Okada i Natori, 1985, Biochem. J.229:453-458 i Westerhoff i wsp., 1989, Biochem.Biophys.Acta975:361-369). Takie wprowadzenie jonów blokuje powstawanie ATP przez hamowanie tworzenia gradientu protonowego, który jest ważny dla tlenowej fosforylacji (Okada i Natori, 1985, Biochem.J. 229: 453-458 i Westerhoff i wsp., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 6597-6601). Wykazano, że niektóre z tych peptydów mają w organicznych rozpuszczalnikach strukturę alfa-helikalną, co zgodne jest z takim mechanizmem ich działania (Lehrer i wsp., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr: 4 543 252, 4 659 692 i 4 707 777; Westerhoff i wsp., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 6597-6601; i Marion i wsp., 1988, FEBS Letters 227: 21-26), i że tworzą kanaliki w nienaturalnych (sztucznych) układach błonowych (Christensen i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5072-5076 i Cruciani i wsp., 1988, Biophysical J.53: 9a).

Aby magaininy lub podobne związki były leczniczo użyteczne do leczenia infekcji bakteryjnych, które mogą prowadzić do bakteremii, związki te muszą być zdolne do działania bakteriobójczego w obecności ludzkiej surowicy. Stanowi to ogromny problem, ponieważ wykazano, że ludzka surowica całkowicie inaktywuje co najmniej jedną ludzką defensynę (Daher i wsp., 1986, J.Virol. 60: 1068-1074).

Świeża surowica zabija dużą liczbę bakterii, zwłaszcza bakterii Gram-dodatnich (Feingold, 1969, J.Infections Dis. 120: 437-444). Rozpatruje się dwie główne drogi aktywacji dopełniacza: (Joiner i wsp., 1984, Ann.Rev.Immunol. 2: 461-491). Droga klasyczna to aktywowacja przez wzajemne oddziaływanie przeciwciała z powierzchnią antygenu. Pierwszy etap aktywacji obejmuje łączenie się białka C1 dopełniacza z regionem Fc przeciwciała wiążącego antygen, z następującą po nim aktywacją cząsteczki C1. Kolejne etapy drogi klasycznej obejmują wykorzystanie wszystkich białek dopełniacza: C1-C9. Droga alternatywna to aktywacja przez łączenie się innych białek surowicy z bakterią, z następującą po tym aktywacją białka C3 dopełniacza. Od tego etapu droga ta jest podobna do drogi klasycznej, aż do białka C9 dopełniacza.

Zaobserwowano zabijanie bakterii przez końcowe składniki C5b-9 dopełniacza w nieobecności wcześniejszych składników. Przy zastosowaniu oczyszczonych składników dopełniacza C5, C6, C7,C8 i C9 obserwowano log liczby zabitych Salmonella minnesota (S.minnesota) Re 595 równy około 3 i log liczby zabitych E.coli wynoszący 1 (Joiner i wsp., 1984, Ann.Rev.Immunol.2: 461-491). Wykazano, że uszkodzenie błony przy udziale dopełniacza oraz cytolizę wywołuje samotworzenie się kompleksów C5b-9 na docelowych błonach. Błony mają charakter

166 731 amfifilowy i powstają w nich kanaliki (Podack i Tschopp, 1984, Mol.Immunol.21: 589-603). Wydaje się, że C5b-9 tworzy funkcjonalne pory w zewnętrznej i wewnętrznej błonie bakteryjnej (Born i Bhadki, 1986, Immunology 59: 139-145). Utworzone pory lub kanaliki umożliwiają szybki wypływ K+, czego wynikiem jest śmierć komórki na skutek zaniku napięcia błony.

Ewentualne środki bakteriobójcze poddaje się rutynowemu skriningowi in vitro stan dardowymi metodami Metody te są podobne do opisanych w Mannual of Clinical Microbiology, wyd. IV„ Lennette, E.H.Chief, American Society for Microbiology, 1985, 959-987. Jedyna modyfikacja dotyczy preferencji dla niektórych środowisk, wytwarzania buforu itd. Wybór odpowiedniego środka przeciwbakteryjnego do leczenia infekcji obejmuje szereg względów, między innymi: (1) wrażliwość in vitro innych organizmów docelowych i (2) zależność wrażliwości szczepu docelowego od wrażliwości innych członków tego samego gatunku. Przedmiotem pomiarów wykonywanych w laboratorium jest zarówno stężenie środka przeciwbakteryjnego potrzebne do zahamowania lub zabicia organizmów in vitro jak i stężenie potrzebne do zahamowania lub zabicia tych organizmów, które znajdują się w płynach ustrojowych podczas leczenia in vivo.

Standardowe testy wrażliwości obejmują dyfuzję krążkową rozcieńczanie w cieczy i rozcieńczanie w agarze. Żadna z tych trzech metod nie uwzględnia składników biorących udział w kaskadowej aktywacji dopełniacza. Dlatego aktywność bakteriobójcza odnosi się tylko do zdolności środka przeciwbakteryjnego do zabijania organizmu docelowego. Odkryto, że niektóre peptydy charakteryzujące się aktywnością bakteriobójczą in vitro zawodzą w przypadku testów in vitro w obecności ludzkiej surowicy oraz w testach in vivo. Przykładem tego zjawiska są magaininy. Ponadto, pożądany jest każdy środek, który może nie wykazywać działania bakteriobójczego lub ma ograniczoną aktywność bakteriobójczą jako taki, lecz wzmacnia zdolność dopełniacza surowicy do zabijania bakterii.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania środka do leczenia infekcji wywołanych prze organizmy wrażliwe na antybiotyki β-laktamowe opartego na oligopeptydzie i antybiotyku β-laktamowym. Organizmy te obejmująbakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie. Sposób według wynalazku polega na tym, że wyodrębnia się i oczyszcza kationowy, amfipatyczny oligopeptyd, tworzący w obecności lipidowo/wodnej granicy faz strukturę α-helikalną o sekwencji reszt aminokwasowych aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-aa3-aa4-X, w której aat oznacza Pro, Ala lub Lys, aa2 oznacza Ile lub Leu, aa3 oznacza Glu lub Lys, aa4 oznacza Ser, Leu lub Lys, a X oznacza grupę karboksylową, albo sekwencję reszt pięciu aminokwasów o strukturze α-helikalnej określoną ogólną sekwencją aminokwasową aa5-Lys-Lys-aa6-Gly, w której aa5 oznacza Ala lub Leu, a aa6 oznacza Leu lub Phe i tak wyodrębniony i oczyszczony oligopeptyd łączy się z antybiotykiem β-laktamowym.

Środek wytworzony sposobem według wynalazku zawiera co najmniej dwa składniki, które in vivo działają synergicznie. Jednym ze składników środka jest antybiotyk β-laktamowy. Jako antybiotyki β-laktamowe stosuje się penicylinę, cefalosporynę, karbopenem, monobaktam, cefalocynę, pirazydon lub penem. Jako cefalosporynę stosuje się cefepimę, cefotaksynę lub ceftazydynę; jako karbapenem stosuje się imipenem, a jako monobaktam stosuje się aztreonam.

Drugim składnikiem środka wytwarzanego sposobem według wynalazku jest kationowy oligopeptyd. Kationowe oligopeptydy stosowane w połączeniu z antybiotykiem β-laktamowym w celu uzyskania efektu synergicznego obejmują magaininy, cekropiny, sarkotoksyny, prekursorowe białka mitochondrialne oraz fragmenty, analogi bądź pochodne tych peptydów. Ponadto, kationowe polipeptydy stosowane w sposobie według wynalazku obejmują ludziki czynnik płytkowy-4 (PF-4) oraz jego fragmenty, analogi i pochodne, włącznie z fragmentem C-13 PF-4. Kationowe oligopeptydy tworzą w obecności styku powierzchni lipidowo/wodnej amfipatyczne α-heliksy. Bardziej szczegółowo, oligopeptydy mają długość co najmniej jedenastu aminokwasów i mają następującą ogólną sekwencję reszt aminokwasowych: aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-aa3-aa4-X, w której aa1 oznacza Pro, Ala, lub Lys, aa2 oznacza Ile lub Leu, aa3 oznacza Glu lub Lys, aa4 oznacza Ser, Leu lub Lys, a X oznacza grupę karboksylową albo sekwencję pięciu aminokwasów o strukturze α-helikalnej określoną ogólną sekwencją aminokwasową aa5-Lys-Lys-aa6-Gly, w której aa5 oznacza Ala lub Leu, a aa6 oznacza Leu lub Phe.

166 731

Przykładowe sekwencje oligopeptydów obejmują:

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ieu—Leu-Glu-Sei>.llaLys-Lys-Leu-Cily,

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Lys-lys-Leu-Leu-Lys-Łys-Ieu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Ieu-Lιeu-Orn—Orn-Leu-leu-Jm-Ser-AlaOrn-)rn-Ieu-lly,

Ala-Leu-Tyr-Łys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-leu-:Lys-lys-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Leu-ryr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-AlaLya-Lys-Phe-lly,

Lys-Trp-Lys-Leu-Pyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-LysSer-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly oraz

Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Łys—Leu-Tyr—Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-LysLeu-Leu-Lys-Se r-ALa-Lys-Lys-Leu-] ly.

Kationowy oligopeptyd może również zawierać sekwencję: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-LeuLeu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly i sekwencje podobne, w których reszty aminokwasowe mogą stanowić reszty d-aminokwasów.

Sposobem według wynalazku wytwarza się środki do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie Enterobacteriaceae, zwłaszcza Escherichia coli, Enterobacter clocae i Klebsiella pneumoniae. Środki te są również skuteczne w leczeniu infekcji spowodowanych przez Pseudomonas aeruginosa. W środkach wytwarzanych sposobem według wynalazku antybiotyki β-laktamowe opisane wyżej współdziałają w połączeniu z substancją powierzchniowo-czynną. Substancje powierzchniowo-czynne zakłócają zasadnicze funkcje błony komórkowej, polegające przykładowo na powodowaniu przepływu protonu dla tlenowej fosforylacji, lub na ważnym dla komórki transporcie i podobnych. Substancje powierzchniowo-czynne obejmują kationowe oligopeptydy opisane wyżej i niżej.

Kliniczne sposoby leczenia polegają na podawaniu pacjentom leczniczo skutecznej ilości środków wytworzonych sposobem według wynalazku w ciągu okresu czasu wystarczającego do zahamowania wzrostu bakterii. Środki do leczenia infekcji bakteryjnych powodowanych przez Escherichia coli obejmują środki zawierające cefepimę z magaininą 2, peptydem C-13 czynnika płytkowego-4 i z kationowymi peptydami o następujących sekwencjach reszt aminokwasowych:

Ala-Leu-Tyi-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-OrnOrn-Leu-Gly, dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dlLeudLys-dSer-dAla-dLys-dLys-cdLeu-Gly.

166 731

Środek do leczenia infekcji otrzymany sposobem według wynalazku możnapoddawać skriningowi, który polega na tym, że środek łączy się z bakterią docelową oraz z aktywnymi składnikami kaskady dopełniacza w standardowym środowisku i po upływie wystarczającego okresu czasu oznacza się aktywność przeciwbakteryjną środka. Aktywne składniki dopełniacza wprowadza się w postaci surowicy, bądź też składniki kaskady dopełniacza wprowadza się indywidualnie. Korzystnie stosuje się ludzką surowicę.

Dalsze zalety i korzyści wynikające ze stosowania niniejszego wynalazku zostaną bliżej wyjaśnione fachowcom w opisie niżej, w przykładach i na rysunku.

Opis figur rysunku.

Figura 1 ilustruje zabijanie za pomocą magaininy 2 bakterii E.coli nietraktowanych cefepimą i zmienionych cefepimą w buforze. E.coli ATCC 25922 hodowano do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu z cefepimą (bakterie zmienione cefepimą) o stężeniu równym 1/4 MIC (0,016 gg/ml cefepimy) i bez cefepimy (bakterie nietraktowane cefepimą>.Komórki rozcieńczono jak opisano w przykładzie I i roztwór dodano do probówek zawierających bufor GVB++ z cefepimą i bez cefepimy, które to próbki zawierały różne stężenia peptydu magaininy 2 (zaznaczone na osi X>. Cefepima była obecna w tych probówkach, w których badano komórki hodowane przedtem z cefepimą. Po 180 minutach, w temperaturze 37°C, oznaczano przeżywalność bakterii przez mierzenie liczby jednostek tworzących kolonie (cfu> każdej probówki, liczbę bakterii oznaczano trójkrotnie, dla każdego stężenia magaininy obliczono:

log liczby komórek zabitych = logio cfu bez magaininy - logio z magaininą.

Figura 2 ilustruje zabijanie za pomocą magaininy 2 bakterii E.coli nietraktowanych cefepimą i zmienionych cefepimą, w ludzkiej surowicy. Komórki przygotowane jak opisano w objaśnieniu do fig. 1 dodano do probówek zawierających 40% ludzką surowicę. Po 180 minutach w temperaturze 37°C, oznaczano przeżywalność bakterii przez mierzenie liczby jednostek tworzących kolonie (cfu> w każdej probówce. Próby wykonywano trójkrotnie, dla każdego stężenia magaininy obliczono:

logio liczby komórek zabitych = logio cfu bez magaininy - logu cfz z magaininą.

Figura 3 ilustruje zabijanie E.coli za pomocą magaininy 2 w aktywnej surowicy i w surowicy inaktywowanej termicznie. Komórki przygotowane jak opisano w objaśnieniu do fig.

dodano do kompletu probówek zawierających albo 40% ludzką surowicę, albo 40% surowicę inaktywowaną termicznie. Cefepima była obecna w tych probówkach, w których badano komórki hodowane przedtem, z tym antybiotykiem. Probówki zawierały także albo 10 gg/ml magaininy 2, albo nie zawierały magaininy. Obliczono logio liczby komórek zabitych zarówno dla bakterii nietraktowanych cefepimą, jak i dla bakterii zmienionych cefepimą w surowicy aktywnej oraz w surowicy inaktywowanej termicznie według następującego wzoru:

logio liczby komórek zabitych = logio cfu bez magaininy - logio cfu z magaininą.

Figura 4 ilustruje hamowanie zabijania przy pomocy magaininy bakterii zmienionych cefepimą, przez inaktywowaną surowicę. Komórki hodowano przedtem z cefepimą, jak opisano w objaśnieniu do fig. 1. Komórki dodano do kompletów probówek zawierających odpowiednio: 0%, 2,5%, 5%, 10%, 20% lub 40% surowicę inaktywowaną termicznie. Probówki z drugiego kompletu z identycznymi ilościami surowicy inaktywowanej termicznie zawierały 200 gg/ml magaininy 2. Obliczono procent hamowania dla każdego stężenia surowicy inaktywowanej termicznie według wzoru:

% hamowania = cfu z magaininą/cfu bez magaininy x 100.

Figura 5 ilustruje rolę, jaką odgrywa ludzki dopełniacz w zabijaniu za pomocą magaininy E.coli nietraktowanych cefepimą i zmienionych cefepimą. E coli ATCC 25922 hodowano z cefepimą (1 /4 MIC) i bez cefepimy. Komórki dodano do kompletu probówek zawierających albo 40% ludzką surowicę pozbawioną ludzkiego dopełniacza C 8 (bez C 8>, albo 40% ludzką surowicę pozbawioną C8, do której z powrotem dodano oczyszczony C8 do stężenia wynoszącego 50 gg/ml (+C8>. Cefepimę, jeśli obecna, dodawano do stężenia 0,016 gg/ml (+cefepima>. Probówki z każdego kompletu zawierały również odpowiednio 0, 6,25, 12,5, 25 i 50 mg/ml magaininy 2. Ilość bakterii zdolnych do życia oznaczono w czasie dodawania bakterii do surowicy. Procent przeżywalności określono po 3 godzinach. Próbkę wykonywano trójkrotnie, standardowe odchylenie +/-1 zaznaczono.

166 731

Figura 6 ilustruje wpływ różnych antybiotyków na zabijanie za pomocą magaininy w zebranej normalnej ludzkiej surowicy. Wyhodowano wstępnie E.coli ATCC 25922 i wykonywano próby bez antybiotyku i z antybiotykiem o stężeniu równym 1/32, 1/16 i 1/8 mIc, dla każdego antybiotyku. Bakterie dodano do dwóch kompletów probówek, z których wszystkie zawierały 40% zebraną normalną ludzką surowicę i albo zawierały 200 gg/ml magaininy 2, albo nie zawierały magaininy 2. Dla każdego stężenia antybiotyku obliczono:

og10 liczby komórek zabitych = 1 ogt0 cfu bez magaininy - 1 og10 cfu z magaininą.

ND = nie określono.

Figura 7 ilustruje zabijanie różnych bakterii za pomocą połączenia magainina/cefepima. Komórki bakteryjne hodowano do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu z cefepimą (1/4 MIC) i bez cefepimy. Bakterie dodano do dwóch kompletów probówek zawierających 40% zebraną normalną ludzką surowicę i albo zawierających 200 gg/ml magaininy 2, albo nie zawierających magaininy. Ponadto, w tych probówkach, w których badano komórki hodowane przedtem z cefepimą obecna była cefepima. Dla każdego szczepu bakterii obliczono 1 ogm liczby komórek zabitych według wzoru:

MGN 2 = 1 og10 liczby komórek zabitych bez magaininy -1 ogm liczby komórek zabitych z magaininą;

cefepima = 1 ogm liczby komórek zabitych bez magaininy - 1 ogm liczby komórek zabitych bez magaininy z cefepimą:

MGN + cefepima = 1 ogm liczby komórek zabitych bez magaininy - 1 ogm liczby komórek zabitych z magaininą i z cefepimą.

Figura 8 ilustruje zabijanie bakterii E.coli za pomocą peptydu C-13 z PF-4 w aktywnej i w inaktywowanej termicznie surowicy. E.coli ATCC 25922 hodowano z cefepimą (1/5 MFC) i bez cefepimy. Komórki dodano do kompletu probówek zawierających albo 40% zebraną normalną ludzką surowicę, albo 40% surowicę inaktywowaną termicznie. Cefepima była obecna w tych probówkach, w których badano komórki hodowane przedtem z tym antybiotykiem. Probówki zawierały także 200 gg/ml peptydu C-13. Obliczono log 10 liczby komórek zabitych dla bakterii nietraktowanych cefepimą i dla bakterii zmienionych cefepimą w aktywnej surowicy i w surowicy inaktywowanej termicznie według wzoru:

og10 liczby komórek zabitych = 1og10 cfu bez C-13 - 1 og10 cfu z C-13.

Uwaga: nie obserwowano zabijania bakterii zmienionych cefepimą w aktywnej surowicy.

Środki wytworzone sposobem według wynalazku zawierają co najmniej dwa składniki, które działają synergicznie. Dzięki temu środki te wykazują in vivo większą skuteczność, niż można osiągnąć przy zastosowaniu każdego składnika oddzielnie. Istnienie takiego synergicznego działania uwidacznia się również w takiej samej, bądź lepszej skuteczności osiąganej przy zastosowaniu mniejszych dawek, lub przy dawkowaniu środka w dłuższych odstępach czasu, niż wymagane dla każdego składnika podawanego oddzielnie. Środki wytworzone sposobem według wynalazku mogą być również użyteczne w traktowaniu szczepów odpornych na antybiotyk. Ponadto, można dokonać skriningu in vitro środków synergicznie działających w połączeniu z antybiotykami β-laktamowymi oraz środków zabijających bakterie w obecności aktywnego dopełniacza o działaniu bakteriobójczym.

Środki wytworzone sposobem według wynalazku zawierające co najmniej dwa lub większą liczbę składników służą do leczenia infekcji wywołanych przez organizmy wrażliwe na antybiotyk β-laktamowy. Organizmy wrażliwe na antybiotyk β-laktamowy to bakterie Gramdodatnie (przykładowo Streptococcus), lub Gram-ujemne, takie jak Enterobacteriaceae (przykładowo Escherichia coli, Klebsiella pneumoaniae i Enterobacter cloacae), Pseudomonadaceae (to jest Pseudomonas aeruginosa) i rodzina Bacteroides. Środek wytworzony sposobem według wynalazku zawiera: (1) antybiotyk β-laktamowy hamujący wzrost bakterii i (2) kationowy oligopeptyd. Antybiotyk β-laktamowy może hamować wzrost bakterii przez zmianę struktury błony bakteryjnej, a oligopeptyd kationowy może tworzyć kanaliki w błonie bakteryjnej. Dlatego antybiotyk β-laktamowy i kationowy oligopeptyd działają synergicznie.

Antybiotyki β-laktamowe opisane wyżej to takie antybiotyki, które hamują wytwarzanie bakteryjnej ściany komórkowej. Antybiotyki takie obejmują penicyliny, cefalosporyny (przykładowo cefepimę, cefotaksymę, ceftazydymę), karbapenemy (przykładowo imipenem), mono10

166 771 baktamy (przykładowo aztreonam), cefamycyny, pirazydony i periemy. Antybiotyki β-laktamowe mogą pochodzić ze źródeł handlowych lub można je wytworzyć przy zastosowaniu powszechnie znanych sposobów.

Określenie kationowy oligopeptyd, stosowane w niniejszym opisie i w zastrzeżeniach odnosi się do amfipatycznych oligopeptydów o działaniu przeciwbakteryjnym, które mogą wnikać do wewnętrznej błony bakteryjnej i które pod warunkiem połączenia z antybiotykiem β-laktamowym zapewniają in vivo synergicznie z tym antybiotykiem zabijanie komórek bakteryjnych.

Kationowe oligopeptydy zawierają regiony, które w obecności lipidowo/wodnej granicy faz mają strukturę α-helikalną. Utworzony heliks może być prawoskrętny lub lewoskrętny i może zawierać nie-białkowe aminokwasy (przykładowo alfa, alfa-dwuaUdlomniokwasy, α-aminokwasy lub pochodne aminokwasów). Ponadto, kationowe oligopeptydy tworzą heliksy amfipatyczne. Niektóre regiony liniowego peptydu mają charakter hydrofobowy, podczas gdy inne mają charakter hydrofilowy, tak, że gdy tworzy się heliks, jedna strona heliksu jest przeważnie hydrofobowa, a druga jest przeważnie hydrofilowa. Chociaż te cechy nie wynikają w sposób oczywisty z badania liniowej sekwencji, można je łatwo rozpoznać przy użyciu siatkowych diagramów heliksu (Crick, 1953, Acta Crystallog.6: 684-697) lub przy zastosowaniu rzutów w kierunku osi heliksu (Schiffer i wsp., 1967, Biophys.J.7: 121-135). Charakter hydrofobowy lub hydrofilowy poszczególnych regionów peptydu nie musi wynikać wyłącznie z obecnych tam reszt aminokwasowych; regiony te muszą być przeważnie hydrofobowe lub hydrofilowe tak długo, jak długo zachowany jest amfipatyczny charakter peptydu. Należy zauważyć, że regiony o podobnych właśnościach fizycznych nie muszą być dokładnie równoległe do osi heliksu, mogą być ukierunkowane pod kątem (nie prostym) do osi. Ponadto, pomiędzy regionami o strukturze helikalnej mogą występować regiony niehelikalne, a wzmocniona aktywność bakteriobójcza peptydu w dalszym ciągu będzie utrzymana w obecności antybiotyków β-laktamowych.

W sposobie według wynalazku jako kationowy oligopeptyd stosuje się korzystnie ludzki czynnik płytkowy-4 oraz jego fragmenty, analogi i pochodne. Analogi i pochodne to takie peptydy, które zachowują zarówno charakter amfipatycznego α-heliksu, jak i własności bakteriobójcze. Ludzki czynnik płytkowy-4 (PF-4), który zawiera 70 aminokwasów, jest płytkową α-granulamą proteiną o wysokim powinowactwie do heparyny; czynnik ten hamuje śródbłonkową proliferację komórki stymulowaną czynnikiem wzrostu (Maione i wsp., 1990, Science 247: 77-80), oraz cechuje go aktywność immunoregulacyjna (Zucker i wsp., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 7571-7574). Okazało się, że C-końcowy fragment o długości 13 aminokwasów (aminokwasy 58-70), nazywany tu fragmentem C-13 PF-4 lub peptydem C-13 o sekwencji: Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Sre, zachowuje zarówno aktywność inhibitującą wzrost, jak i aktywność immunoregulacyjną (Maione i wsp., 1990, Science 247: 77-80 i Zucker i wsp., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 7571-7574). Okazało się również, że mniejsze peptydy C-12 (aminokwasy 58-69) i C-11 (aminokwasy 58-68) wykazują mniejszą aktywność inhibitującą (Maione i wsp., 1990, Science 247:77-80). Również małą aktywność inhibitującą obserwowano dla peptydu C-10 (aminokwasy 58-67).

Kationowe oligopeptydy stosowane w sposobie według wynalazku wytwarza się w różny sposób. Przykładowo kationowe oligopeptydy izoluje się u źródeł naturalnych. Jak ujawniono wyżej, magaininy izoluje się z Xenopsus laevis (Zasloff, 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84: 5449-5453, cekropiny i sarkotoksyny izoluje się z owadów (Christensen i wsp., 1988,Proc. • Natl.Acad.Sci. USA 85: 5072-5076 i Nakojima i wsp., 1987, J.Biol.Chem.262: 1655-1669), mitochondrialne białka prekursorowe izoluje się z mitochondriów, a ludzki czynnik płytkowy-4 izoluje się z płytek krwi. Alternatywnie, kationowe oligopeptydy wytwarza się przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA; przykładowo ujawniono sposób wytwarzania magainin (Zasloff, 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84: 5449-5453), cekropin (Christensen i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85; 50 72-5076), sarkotoksyn (Nakajima i wsp., 1987,

J.Biol.Chem.264: 2092-2099). Kationowe oligopeptydy stosowane w sposobie według wynalazku wytwarza się również na drodze chemicznego syntetyzowania sekwencji oligopeptydo166 731 wych w znany sposób, przykładowo przy zastosowaniu dostępnych w handlu syntetyzerów peptydów. Standardowe techniki syntezy polipeptydów ujawniono w takich publikacjach, jak Merrifield, 1963, J.Chem.Soc, 85: 2145-2154 i Hunkapillar i wsp., 1984, Nature (Londyn) 310: 105-111.

Zsyntetyzowano szereg analogów peptydu C-13 ludzkiego czynnika płytkowego-4. Analogi, które zachowują aktywność bakteriobójczą tworzą α-heliksy o skoku wynoszącym w przybliżeniu 3,6 aminokwasów na obrót, mają długość co najmniej od około 11 do około 18 aminokwasów, posiadają występujące na przemian regiony hydrofobowe i hydrofilowe, każdy o długości 2-3 reszt aminokwasowych. Zsyntetyzowane analogi, o uszkodzonej strukturze helikalnej cząsteczki lub o niepełnych własnościach amfipatycznych wykazują znacznie mniejszą aktywność bakteriobójczą lub są jej pozbawione. Ogólnie, sekwencja aminokwasową kationowego, α-helikalnego, amfipatycznego oligopeptydu wchodzącego w skład środka wytworzonego sposobem według wynalazku, który to środek ma działanie przeciwbakteryjne, jest następująca: aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2--aa2-Lys-Lys-Leu-aa3-aa4-X, przy czym aat oznacza Pro, Ala lub Lys, aa2 oznacza Ile lub Leu, aa3 oznacza Glu lub Lys, aa4 oznacza Ser, Leu lub Lys, a X oznacza grupę karboksylową albo następującą sekwencję pięciu aminokwasów: Ala-Lys-LysLeu-Gly.

W szczególności stosuje się oligopeptydy, które mają następujące sekwencje aminokwasowe:

Pro-Leu-'ryr-L y s-Ly e-Ile-Ile-Lys-Lya-Leu-Leu-GJ.u-Ser, Ala-Leu-Tyi—Łys-Iys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Łeu-Gln-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Iieu-Lys-Lya-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu--ly, dAla-dLeu-dTyi-dLys-dIιys-<ILeu-dLeu-dIys-dIys-dIeu-dIeudIys-dSer-dA.l.a-dLys-dLys-dLeu—Gly,

Ala-Leu-Tyr-Orn-Gm-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-AlaOrn_O rn-Leu-Jly,

Ala-Leu-Tyr-Lys-Iy8—Leu-Ieu-Ly3-Ly3-Ieu—Leu-Lys-Lys-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

Ala-Ieu-Tyr-Arg-Arg-Ieu-Leu-Arg-Arg-Ieu—Leu-Arg-Ser—AlaArg-Arg-Leu-Gly,

Ala-Leu-Tyr-Iys-Lys-Leu-Ieu-Lys-Lys-Ieu-Leu-Lys-Phe-AlaLys-Lys-Phe-Gly,

Ly^-Trp-Lys-Leu-Pyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ieu-Leu-Iy8Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly oraz ^Al^a-I^ys-I^ys-Ieu^-Łl^a-I^ys-Ieu-T^yI—^Iys-^Iys-^Leu~^Ieu-^Iy3-^Iy^sLeu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly.

Jeśli znana jest ogólna budowa kationowego, α-helikalnego, amfifilowego peptydu C-13 czynnika płytkowego-4 i szeregu analogów i pochodnych tego peptydu wchodzącego w skład środka bakteriobójczego wytwarzanego sposobem według wynalazku peptydy takie można syntetyzować przy użyciu rutynowych metod, przykładowo w handlowo dostępnych syntetyzerach peptydów.

166 731

Należy zauważyć, że mając daną ogólną budowę środków przeciwbakteryjnych wytworzonych sposobem według wynalazku, jak również znając sposób skriningu środków działających synergicznie z antybiotykami β-laktamowych lub ze składowymi ludzkiego dopełniacza, można łatwo przewidzieć, otrzymać lub wytworzyć szereg innych analogów i pochodnych przy zastosowaniu standardowych, powszechnie znanych sposobów, takich jak na przykład modelowanie komputerowe i podobne.

Środek wytworzony sposobem według wynalazku zawierający: (1) antybiotyk β-laktamowy hamujący wzrost bakterii i (2) substancją powierzchniowo czynną może być stosowany do leczenia infekcji spowodowanej bakteriami. Przykłady antybiotyków β-laktamowych omówiono wyżej. Określenie substancja powierzchniowo czynna stosowane w niniejszym opisie i w zastrzeżeniach oznacza substancję, która zdolna jest do zakłócania niezbędnych funkcji błony. Funkcje te obejmują tlenową fosforylację, ważny dla komórek transport i inne czynności błony związane z siłą poruszającą protony, lecz nie są ograniczone jedynie do wymienionych. Substancjami powierzchniowo czynnymi są kationowe oligopeptydy omówione wyżej (na przykład magainina 1 i magainina 2), cekropiny, sarkotoksyny, prekursorowe białka mitochondrialne, ludzki czynnik płytkowy-4, ich fragmenty, analogi i pochodne.

Środek zawierający (a) cefepimę i (2) magaininę 2 może być stosowany do leczenia infekcji wywołanych przez Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter clocae i Klebsiella pneumoniae. Środek zawierający (a) cefepimę i (b) peptyd C-13 ludzkiego czynnika płytkowego-4 stosuje się do leczenia infekcji powodowanych przez Escherichia coli. Do leczenia takich infekcji można również stosować środek zawierający (a) cefepimę i (b) analogi peptydu C-13. Ponadto, do leczenia infekcji wywołanych przez Escherichia coli stosuje się środki zawierające: (a) ceftazydym, aztreonam lub imipenem oraz magaininę 2 oraz środki zawierające: (a) aztreon nam i (b) analog G peptydu C-13.

Sposób leczenia infekcji wywołanych przez organizm wrażliwy na β-laktaminy polega na podawaniu pacjentowi leczniczo skutecznej ilości środka zawierającego (1) antybiotyk β-laktamowy hamujący wzrost organizmu oraz (2) kationowy oligopeptyd, w ciągu okresu czasu wystarczającego do zahamowania infekcji bakteryjnej. Antybiotyki β-laktamowe i kationowe oligopeptydy omówiono wyżej. W szczególnym przypadku podaje się dawkę β-laktaminy mniejszą niż dawka hamująca.

Sposób leczenia infekcji wywołanej przez Enterobacteriaceae polega na podawaniu pacjentowi środka zawierającego taką ilość antybiotyku β-laktamowego, która hamuje wzrost Enterobacteriaceae oraz co najmniej jeden środek powierzchniowo czynny. Można podawać taką ilość antybiotyku β-laktamowego, że stężenie antybiotyku w miejscu infekcji pacjenta jest mniejsze, niż stężenie hamujące. Substancja powierzchniowo czynna wchodząca w skład środka wytworzonego sposobem według wynalazku, omówiona wyżej, może zawierać surowicę i jej składniki oraz oligopeptydy kationowe.

Środkom wytworzonym sposobem według wynalazku nadaje się różne postacie do podawania na różne sposoby, obejmujące podawanie ogólnoustrojowe, zewnętrzne lub miejscowe. Składniki czynne środka miesza się przed podawaniem. Alternatywnie, składniki czynne można podawać oddzielnie w jednym czasie lub osobno.

Sposoby podawania i postaciowania środków wytworzonych sposobem według wynalazku można znaleźć w Remingtons Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Company, Easton, PA, ostatnie wydanie. Do podawania ogólnoustrojowego korzystnie stosuje się wstrzyknięcia śródmięśniowe, dożylne, dootrzewnowe i podskórne. Środkom przeznaczonym do wstrzykiwania nadaje się postać roztworów, korzystnie roztworów w buforze dopuszczalnym fizjologicznie, takim jak bufor Hanka i Ringera. Ponadto, środkom można nadawać postać ciała stałego, które tuż przed podaniem rozpuszcza się lub zawiesza się w cieczy. Takie postacie obejmują również postacie liofilizowane.

Podawanie ogólnoustrojowe może również obejmować podawanie dośluzówkowe lub poprzez skórę, ewentualnie podawanie doustne. Do podawania dośluzówkowego lub poprzez skórę stosuje się środki przenikające, dobrane odpowiednio do bariery, przez którą mają one wnikać do organizmu. Środki takie są znane i obejmują przykładowo sole żółciowe i pochodne kwasu fusydowego w przypadku podawania dośluzówkowego. Ponadto, w celu ułatwienia

166 731 przenikania stosuje się detergenty. Podawanie dośluzówkowe można realizować przez rozpylanie donosowe, lub przy zastosowaniu czopków. Środkom wytworzonym sposobem według wynalazku do podawania doustnego nadaje się konwencjonalne postacie do podawania doustnego, takie jak kapsułki, tabletki i toniki.

Środki, które mają być podawane zewnętrznie mogą mieć postać maści, maści do wcierania, żeli lub kremów.

Środki o aktywności bakteriobójczej, zwłaszcza środki zawierające kationowe, α-helikalne, amfifilowe peptydy można poddawać skriningowi in vitro, który obejmuje składowe działającej kaskady dopełniacza. W znanych sposobach stosuje się dyfuzję tarczową, rozcieńczanie w agarze oraz mikro- i makrorozcieńczanie bulionu.

Metoda skriningu obejmuje również kaskadę dopełniacza. Włączenie działającej kaskady dopełniacza umożliwia rozpoznanie niektórych środków, które wymagają obecności aktywnego dopełniacza dla działania bakteriobójczego. Te środki, w przypadku stosowania in vivo, łączą się z dopełniaczem po podaniu, ponieważ dopełniacz stanowi część systemu immunologicznego ssaków. Stosowanie znanych ze stanu techniki sposobów skriningu in vitro, które nie obejmują aktywnego dopełniacza, nie pozwala na rozpoznanie takich środków i dlatego uniemożliwia rozpoznanie szeregu nowych, aktywnych środków, włącznie ze środkiem wytworzonym sposobem według wynalazku.

Składowe aktywnego dopełniacza, które stosuje się w metodzie skriningu in vitro dodaje się w postaci surowicy. Wiadomo, że surowice izolowane ze źródeł ludzkich oraz pochodzące od szczurów, świnek morskich, królików i podobnych zawierają wysoki poziom aktywnego dopełniacza. Korzystnie stosuje się dopełniacz ludzki. Ponadto, do standardowego środowiska testu można też dodawać szereg różnych składowych działającej kaskady dopełniacza. Następujące przykłady ilustrują wyżej opisany wynalazek.

Przykład I. Synergiczne działanie cefalosporyn i peptydu kationowego magaininy 2.

W tym przykładzie wykazano synergiczne działanie różnych typów antybiotyków β-laktamowych i magaininy. Stężenia antybiotyku i magaininy o wartościach niższych niż stężenia hamujące zabijają bakterie, w przypadku połączenia obu tych składników. Gdy podawano każdy z tych środków oddzielnie, obserwowano mały stopień zabijania bakterii lub nie obserwowano zabijania. Drugi rodzaj synergii dotyczy działania tych dwóch środków w ludzkiej surowicy. W obecności ludzkiej surowicy połączenie magainina/antybiotyk powodowało zabijanie bakterii przy niższych stężeniach, niż w przypadku obecności buforu. Te wyniki wykazują, że takie środki mogą być użyteczne in vivo w leczeniu infekcji powodowanych przez bakterie. Dowodzi to istnienia dodatkowego efektu synergicznego. Występowanie synergii w surowicy wymaga obecności czynnika nieodpornego na ciepło. Czynnik taki zidentyfikowano jako dopełniacz surowicy w przeprowadzonych doświadczeniach z surowicą odpowiednio pozbawioną białka C8 dopełniacza.

Materiały i metody. Reagenty i bufory.

Stosowano następujące bufory: bufor żelatyno-weronalowy (GVB++) (Gewortz H. i wsp., 1985, Manual of Clinical Immunology, N.R.Rose i H. Fseedman, ASM, Washington, D.C.). Ponadto do buforu dodawano 0,1% glukozy stanowiącej źródło węgla. Solankę buforowaną fosforanem przygotowano we własnym zakresie. Antybiotyki w postaci liofilizowanej otrzymano od Br. Roberta Kesslera. Bristol-Mylers Squibb Company, Wallingforf, Conn. Mgaininę 2 syntetyzowano we własnym zakresie w oparciu o publikowaną sekwencję aminokwasową (Zasloff i wsp., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84: 5479-5483; Zasloff i wsp., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 910-913 i Zasloff, 1989, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 810 777).

Szczepy bakterii i warunki hodowli.

Escherichia coli ATCC 25922, którą stosowano w większości doświadczeń pochodziła z American Type Culture Collection (ATCC). Inne szczepy E.coli to AO11, pochodzący z Harborview Medical Center, Seattle, WA oraz H16 pochodzący z Walter Reed Army Inst. of Research, Dept, of Bacterial Diseases, Washington, D.C. Ponadto stosowano Klebsiella pneumoniae, szczep ATCC 13883 i Enterobacter cloacae pochodzącą z Veterans Administration Hospital, Seattle, WA. Szczepy zbadano na czystość, odpowiednio zidentyfikowano i przecho14

166 731 wywano w temperaturze -70°C. Szczepy hodowano w AMH (AdjUsted Mueller Hinton) (Jones i wsp., 1985, Manual of Clinical Microbiology, E.H.. Lennette, ASM, Washington, DC).

Surowica

Krew pobrano od pięciu zdrowych ochotników i doprowadzono do zakrzepnięcia w pokojowej temperaturze w ciągu 1 godziny. Po następnych 20 minutach inkubacji w temperaturze 4°C krew odwirowano w ciągu 15 minut (1.500 x g). Surowicę stanowiącą nadsącz, zebrano, dodano kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo/ do stężenia 10 mM i surowicę przechowywano w małych ilościach w temperaturze -70°C tak jak normalną ludzka surowicę(PNHS). Krótko przed użyciem surowicę rozmrażano i dodawano 1 część 0,1 M CaCk do 9 części surowicy, lub alternatywnie, surowicę zamrażano bez dodatku EDTA i stosowano bez dodatku CaCk. Do czasu zmieszania surowicy z bakteriami w celu przeprowadzenia próby na bakteriobójczość surowicy, surowicę trzymano na lodzie. Wszędzie tam, gdzie zaznaczono, dopełniacz surowicy inaktywowano przez ogrzewanie w temperaturze 56°C w ciągu 30 minut.

Określenie minimalnego stężenia hamowania (MIC).

MIC oznacza najniższe stężenie środka przeciwbakteryjnego, przy którym występuje całkowite zahamowanie wzrostu bakterii. MIC oznaczano metodą rozcieńczania na płytkach do mikrorozcieńczalnika przy użyciu AMH (Manual of Clinical Microbiology, IV wydanie, Lennette, E.H. Chief, ASM, 1985, strony: 972-977). Dla każdego szczepu przeprowadzono co najmniej trzy różne oznaczenia z każdym antybiotykiem.

Test na bakteriobójczość surowicy.

Bakterie posiane przedniego wieczoru hodowano do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu z antybiotykiem lub bez antybiotyku. (Absorbcja przy 660 nm pomiędzy 0,35 i 0,5, w przybliżeniu 2-3 x 10⁸ komórek/ml dla komórek hodowanych z cefepimą i 9 x 10⁸ komórek/ml dla komórek hodowanych bez cefepimy). Komórki rozcieńczono do stężenia 1 x 10⁴ komórek/ml bez przemywania w buforze żelatyno-weronalowym (GVB++) i 0,05 ml tego roztworu dodano do surowicy znajdującej się w fiolce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Komórki bakteryjne, które przedtem hodowano z antybiotykiem również rozcieńczono w buforze GVB++ zawierającym takie samo stężenie antybiotyku. Przedtem przygotowano albo połączoną normalną ludzką surowicę (PNHS) albo inaktywowaną termicznie PNHS przez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w 0,2 ml GVB++. Antybiotyki lub magaininę, jeśli obecne, dodano do mieszaniny surowicy przed dodaniem bakterii. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,25 ml. Liczbę bakterii dodanych do surowicy określono przez dodanie 0,05 ml zawiesiny bakteryjnej do probówki zawierającej jedynie GVB++ i rozlanie na płytki na początku próby. Następnie mieszaninę reakcyjną obracano w temperaturze 37°C do trzech godzin. W przerwach pobierano próbki (25 gl) do analizy płytkowej. Liczbę jednostek tworzących kolonie oznaczono po całonocnej inkubacji w agarze sojowym. Liczbę jednostek tworzących kolonie oznaczono trójkrotnie i obliczono wartość średnią.

Wyniki

Badano działanie magaininy 2 (MGN 2) i cefepimy (antybiotyku cefalosporynowego) w buforze. Jak uwidoczniono na rysunku, fig. 1, połączenie cefepimy ze 100 gg/ml mGn 2 dawało logarytm liczby zabitych większy niż 1,5 (1 og10 zabijania). W przypadku, gdy dodawano samą cefepimę obserwowano 1og10 zabijania wynoszący mniej niż 0,3. Ponadto nie obserwowano znaczącego stopnia zabijania z 100 gg/ml samej MGn 2. Jednakże, obserwowano 1og10 zabijania wynoszący więcej niż 3 (99,9%) gdy bakterie inkubowano z 200 gg/ml MGN 2. Obserwacja ta wykracza poza dane Zasloffa, jako że identyfikuje połączenie synergiczne.

Działanie MGN 2 na bakterie nietraktowane (nietraktowane cefepimą) oraz na bakterie zmienione cefepimą badano również w obecności 40% normalnej ludzkiej surowicy (PNHS) - patrz rysunek, fig. 2. Kiedy bakterie nietraktowane dodano do surowicy, nie obserwowano znaczącego stopnia zabijania za pomocą MGN, w przeciwieństwie do poprzednich obserwacji w buforze, gdy 200 gg/ml MGN 2 całkowicie zabiło szczep bakteryjny (porównaj fig. 1 i fig. 2). Wynika z tego, że PNHS blokowała działanie MGN 2 (oraz MGN 1, dane nie uwidocznione), gdy badano stopień zabijania bakterii nietraktowanych cefepimą. Jednakże, gdy badano bakterie zmienione cefepimą, zabijanie za pomocą MGN 2 było wzmocnione przez obecność PNHS. Obserwowano zabijanie

166 731 przy stężeniu MGN 2 wynoszącym 25 gg/ml w PNHS, podczas gdy nie obserwowano zabijania przy takim stężeniu w buforze. Wynika z tego, że PNHS blokuje aktywność bakteriobójczą MGN 2 w stosunku do bakterii nietraktowanych cefepimą, a wzmacnia aktywność bakteriobójczą MGN 2 w stosunku do bakterii zmienionych cefepimą.

W celu określenia, czy czynnik PNHS odporny na działanie nie ciepła czy też czynnik PNHS zmieniający się pod wpływem ciepła był odpowiedzialny za synergię pomiędzy cefepimą a MGN 2, badano zabijanie w PNHS ogrzanej, w ciągu 30 minut do temperatury 55°C w celu inaktywacji dopełniacza surowicy (w inaktywowanej surowicy> i w aktywnej surowicy. Kiedy badano bakterie nietraktowane cefepimą znowu obserwowano mały stopień zabijania lub nie obserwowano zabijania w obecności 100 gg/ml MGN 2 lub bez MGN 2 (patrz rysunek . fig . 3) . Gdy badano bakterie zmienione cefepimą, inaktywacja cieplna surowicy całkowicie zapobiegała zabijaniu bakterii za pomocą MGN/cefepimy, które obserwowano w aktywnej surowicy (patrz fig. 3 i 4>. Doświadczenie to dowodzi, że w przypadku zabijania bakterii w PNHS, do zabijania bakterii zmienionych cefepimą za pomocą MGN konieczna jest obecność w PNHS czynnika nieodpornego na działanie ciepła (prawdopodobnie dopełniacza>.

Czynnik nieodporny na działanie ciepła w surowicy określono jako dopełniacz surowicy. Badano zdolność magainin do zabijania E.coli ATCC 25922 zmienionych cefepimą i nietraktowanych cefepimą w ludzkiej surowicy odpowiednio pozbawionej białka C8 dopełniacza. Kiedy ten składnik kaskady dopełniacza był nieobecny w surowicy, nie obserwowano zabijania bakterii przez magaininę (fig. 5>. Jednakże . gdy z powooeem dodano C8 do stężenia fizjologicznego 550 gg/ml>, obserwowano znaczący stopień zabijania bakterii. Ponadto, następowało zabijanie E.coli zmienionych cefepimą przy znacznie niższych stężeniach magainin, niż te, które były konieczne do zabijania bakterii nietraktowanych cefepimą.

Badano również działanie różnych antybiotyków w zebranej normalnej ludzkiej surowicy. Bakterie hodowano wstępnie i wykonano próby przy stężeniach różnych antybiotyków wynoszących 1/32,1/16 i 1/8 MIC dla każdego antybiotyku. Bakterie dodawano do dwóch kompletów probówek, z których jeden komplet zawierał 200 gg/ml magaininy 2, a drugi nie zawierał magaininy, przy czym wszystkie probówki zawierały 40% zebraną normalną ludzką surowicę. Jak uwidoczniono na rysunku, fig. 6, antybiotyk β-laktamowy imipenen działał synergicznie z magaininą 2, lecz antybiotyki takie jak amikacyna-aminoglikozyd oraz i cyproflaksacyna i chinolina nie działały synergicznie. Ponadto, cefepima, aztreonam i ceftazydym - antybiotyki β-laktamowe, działały synergicznie z magaininami.

Badano stopień zabijania szeregu bakterii przez połączenie magainina/cefepima. Badane bakterie obejmowały: szczep A 645 E.coli, szczep AO11 E.coli, szczep H16 E.coli, E.clocae i

K.pneumoniae. Komórki bakterii hodowano do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu z cefepimą w stężeniu wynoszącym 1/4 MIC i bez cefepimy. Bakterie dodano do dwóch kompletów probówek, z których jeden zawierał 200 gg/ml magaininy 2, a drugi nie zawierał magaininy, przy czym wszystkie probówki zawierały 40% normalną ludzką surowicę. Jak uwidoczniono na rysunku, fig. 7, wszystkie szczepy bakteryjne (pięć> wykazywały działanie synergiczne magainin. W przypadku obecności MGN obok antybiotyku obserwowano znaczny wzrost stopnia zabijania bakterii w porównaniu z tym, który obserwowano przy zastosowaniu MGN lub cefepimy oddzielnie. Wzrost w porównaniu z zabijaniem bakterii przez cefepimę wynosi w przybliżeniu 1 log.

Badano również działanie połączenia magainina/cefepima na Pseudomonas aeruginosa. Jak w doświadczeniach opisanych wyżej, w przypadku obecności magaininy obok antybiotyku, obserwowano znaczny wzrost stopnia zabijania w porównaniu z zabijaniem przez MGN lub cefepimę oddzielnie.

Przykład II. Synergiczne działanie cefalosporyn i peptydu kationowego C-13 ludzkiego czynnika płytkowego-4.

W tym przykładzie wykazano synergiczne działanie antybiotyku β-laktamowego - cefalosporyny i peptydu C-13 ludzkiego czynnika płytkowego-4 (HPF - 4>. Stężenia cefalosporyny i peptydu C-13 ludzkiego czynnika płytkowego o wartościach niższych, niż stężenia hamujące zabijają bakterie w przypadku połączenia obu tych składników. Gdy podawano każdy z tych środków oddzielnie, obserwowano mały stopień zabijania bakterii lub nie obserwowano zabija66

666 736 nia. Doświadczenia przeprowadzano w 40% normalnej ludzkiej surowicy. Występowanie synergii w surowicy wymaga obecności czynnika nieodpornego na ciepło, ponieważ łagodna inaktywacja termiczna surowicy całkowicie niweluje jakiekolwiek działanie synergiczne.

Materiały i metody. Reagenty i bufory.

Stosowano następujące bufory: bufor żelatyno-weronalowy (GVB++) (Gewartz H. i wsp., 1985, Manual of Clinical Immunology, N.R. Rose i H. Freedman, ASM, Washington, D.C. Ponadto, do buforu dodawano 0,1% glukozy, stanowiącej źródło węgla. Solankę buforową fosforanem przygotowano we własnym zakresie. Antybiotyki w postaci liofilizowanej otrzymano jak opisano w poprzednim przykładzie. Peptyd C-13 PF-4 syntetyzowano we własnym zakresie w oparciu o publikowaną sekwencję aminokwasową (Maione i wsp., 1990, Science 247: 77-80). Zmodyfikowany peptyd C-13 PF-4 syntetyzowano również we własnym zakresie stosując standardowe techniki stałej fazy.

Szczepy bakterii i warunki hodowli.

Stosowano Escherichia coli ATCC 25922 pochodzącą z American Typy Culture Collection (ATCC). Szczep zbadano na czystość, odpowiednio zidentyfikowano i przechowywano w temperaturze -70°C. Hodowano w AMH.

Surowica

Krew pobrano od pięciu zdrowych ochotników i doprowadzono do zakrzepnięcia w pokojowej temperaturze w ciągu 1 godziny. Po następnych 20 minutach inkubacji w temperaturze 4°C krew odwirowano w ciągu 15 minut (1.500 x g). Surowicę stanowiąca nadsącz zebrano i przechowywano w temperaturze -70°C w małych ilościach (PNHS). Krótko przed użyciem surowicę rozmrażano i do czasu zmieszania jej z bakteriami w celu przeprowadzenia próby na bakteriobójczość, surowicę trzymano na lodzie. Wszędzie tam, gdzie zaznaczono, dopełniacz surowicy inaktywowano termicznie przez ogrzewanie do temperatury 56°C w ciągu 30 minut.

Określenie minimalnego stężenia hamowania (MIC)

MIC oznaczano metodą rozcieńczania na płytkach do mikrorozcieńczania przy użyciu AMH (Manual of Clinical Microbiology, IV Wydanie, Lennette, E.H., Chief, ASM, 1985, strony 972- 977). Dla każdego szczepu przeprowadzono co najmniej trzy różne oznaczenia z każdym antybiotykiem.

Test na bakteriobójczość surowicy.

Bakterie posiane uprzedniego wieczoru hodowano do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu, z antybiotykiem lub bez antybiotyku. (Absorbancja przy 660 nm pomiędzy 0,35 i 0,5, w przybliżeniu 2-3 x 10⁸ komórek/ml dla komórek hodowanych z cefepimą i 9 x 10⁸ komórek/ml dla komórek hodowanych bez cefepimy). Komórki rozcieńczono do stężenia 1 x 10⁴ komórek/ml bez przemywania w buforze żelatyno-weronalowym (GVB++) i 0,05 ml tego roztworu dodano do surowicy znajdującej się w fiolce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Komórki bakteryjne, które przedtem hodowano z antybiotykiem również rozcieńczono w buforze GVB++ zawierającym takie samo stężenie antybiotyku. Przedtem przygotowano albo zebraną normalną ludzką surowicę (PNHS) albo inaktywowaną termicznie PNHS przez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w 0,2 ml GVB++. Antybiotyki lub peptyd C-13, jeśli obecne, dodano do mieszaniny surowicy przed dodaniem bakterii. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,25 ml. Liczbę bakterii dodanych do surowicy określono przez dodanie 0,05 ml zawiesiny bakteryjnej do probówki zawierającej jedynieGVB-++i rozlanie na płytki na początku próby. Następnie mieszaninę reakcyjną obracano w temperaturze 37°C do trzech godzin. W przerwach pobierano próbki (25 gl) do analizy płytkowej. Liczbę jednostek tworzących kolonie oznaczono po całonocnej inkubacji w agarze sojowym. Liczbę jednostek tworzących kolonie oznaczono trójkrotnie i obliczono wartość średnią.

Wyniki.

Badano działanie bakteriobójcze peptydu C-13 otrzymanego z ludzkiego czynnika płytkowego-4. Na podstawie sekwencji aminokwasowej tego peptydu kationowego, powinien on tworzyć w środowiskach hydrofobowych amfililowy α-heliks. Zdolność tego peptydu do zabijania E.coli badano w normalnej ludzkiej surowicy (fig.8). Komórki bakteryjne hodowane bez cefepimy i z cefepimą o stężeniu równym 1/5 MIC dodano do aktywnej i do inaktywowanej termicznie 40% normalnej ludzkiej surowicy. Jak uwidoczniono na rysunku, fig. 8, peptyd ten

166 731 był zdolny do zabijania w znaczącym stopniu bakterii zmienionych cefepimą w przypadku, gdy surowica nie była inaktywowana termicznie. Peptyd nie był zdolny do zabijania bakterii, które hodowano bez cefepimy. Ponadto, nie zabijał on bakterii zmienionych cefepimą gdy surowica była inaktywowana termicznie. Dane te dowodzą, że omawiany peptyd zabija bakterie działając synergicznie z antybiotykiem β-laktamowym i aktywną surowicą.

Badano również działanie bakteriobójcze zmodyfikowanego peptydu C-13 otrzymanego z ludzkiego czynnika płytkowego-4 o sekwencji:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Pro-Lys-Ile-ne-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (sekwencja nr 2, aminokwasowa, o długości 15 aminokwasów, liniowa, typ cząsteczki: peptyd). Gdy ten związek dodano do bakterii razem z cefepimą w obecności normalnej ludzkiej surowicy, obserwowano mniejszy efekt synergiczny, lub nie obserwowano tego efektu. Jest to spowodowane tym, że struktura zmodyfikowanego peptydu C-13 jest w mniejszym stopniu α-helikalna, ponieważ wiadomo, że prolina rozrywa strukturę α-haliksów.

Przykład III. Uodporniając działanie połączeń magaininy z cefepimą in vivo

Badano zdolność połączeń magaininy z cefepimą do uodporniania myszy na śmiertelną infekcję wywołaną E.coli. Wywołano neutropenię u myszy przez wstrzyknięcie Cytoxanu, a następnie wprowadzono E.coli. Myszy podzielono na cztery różne grupy: (1) myszy, którym dalej nic nie podawano, (2) myszy, którym podawano jedynie magaininę 2 lub peptyd C-13, (3) myszy, którym podano jedynie cefepimę, (4) myszy, którym podawano cefepimę z magaininą 2 lub cefepimę z peptydem C-13.

Myszy obserwowano w ciągu 10 dni po infekcji i notowano liczbę zgonów. Wyniki tych badań wykazują, że leczenie myszy samą magaininą lub peptydem C-13 lub cefepimą było nieskuteczne, nie zapobiegało śmierci. Zastosowanie cefepimy w połączeniu z magaininą lub z peptydem C-13 uodparniało myszy w znacznym stopniu. W przypadku przeprowadzenia takich samych doświadczeń z aminoglikozydem-amikacynąnie obserwowano żadnego działania bakteriobójczego in vitro, ani też działania uodparniającego in vivo.

Materiały i metody. Reagenty i bufory.

Solankę buforowaną fosforanem przygotowano we własnym zakresie. Cefepimę w postaci liofilizowanej otrzymano, jak opisano wyżej. Peptyd C-13 i magaininę 2 syntetyzowano we własnym zakresie w oparciu o publikowane sekwencje aminokwasowe.

Szczepy bakterii i warunki hodowli.

E.coli H 16 otrzymano z Walter Reed Army Institute of Research, Department of Bacterial Diseases, Washongton, D.C. Szczep zbadano na czystość, odpowiednio zidentyfikowano i przechowywano w temperaturze -70°C. Bakterię hodowano w bulionie AMH.

Doświadczenia in vivo

Na pięć dni przed wprowadzeniem bakterii u myszy wywołano neutropenię. Neutropenię wywołano przez podskórne wstrzyknięcie 250mg/kg Cytoxanu (cyklofosfamidu). Myszom wprowadzono 2 x 10⁴ E.coli H16 przez wstrzyknięcie śródotrzewnowe. Następnie myszy podzielono na cztery grupy: (1) myszy, którym wstrzyknięto PBS po 1 i po 3,5 godzinach po wprowadzeniu bakterii, (2) myszy, którym podano 2 mg/mysz magaininy 2, przez dwa wstrzyknięcia po 1i po 3,5 godzinach po wprowadzeniu bakterii po 1 mg/mysz magaininy 2 w PBS, (3) myszy, którym podano 0,2 mg/kg cefepimy przez dwa wstrzyknięcia po 1 i po 3,5 godzinach po wprowadzeniu bakterii po 0,1 mg/kg cefepimy w PBS, (4) myszy, którym podano 2 mg/mysz magaininy 2 i 0,2 mg/kg cefepimy przez dwa wstrzyknięcia po 1 i 3,5 godzinach po wprowadzeniu bakterii po 1 mg/mysz magaininy 2 i po 0,1 mg/kg cefepimy. Wszystkich wstrzyknięć magaininy i cefepimy dokonano domięśniowo. Monitorowano przeżywalność myszy w ciągu okresu co najmniej 10 dni.

Wyniki

Podczas badania przeżywalności myszy po wprowadzeniu bakterii otrzymano następujące wyniki: w grupie (1), której podawano jedynie PBS przeżyła 1 mysz na 15; w grupie (2), której podawano jedynie magaininę 2 przeżyła 1 mysz na 15; w grupie (3), której podawano jedynie cefepimę, przeżyła 1 mysz na 20; w grupie (4), której podawano cefepimę w połączeniu z magaininą 2 przeżyło 11 mysz na 20. Wzrost przeżywalności myszy, którym podawano cefepimę w połączeniu z magaininą stanowi znaczny wzrost (p<0,05 test Fishe Exact) uodpornienia w

166 731 porównaniu z myszami, którym nie podawano wcale, lub podawano albo samą cefepimę, albo samą magaininę 2.

Ponadto, przeprowadzono podobne doświadczenia na uodpornianie zwierząt z peptydem C-13 z PF-4. W tych doświadczeniach grupy (1) i (3) były takie, jak opisano wyżej, grupie (2) - podawano peptyd C-13 zamiast magaininy 2, a grupie (4) podawano cefepimę w połączeniu z C-13. Uzyskano następujące wyniki: w grupie (1) i (3) - jak opisano wyżej; w grupie (2), której podawano jedynie C-13 przeżyła 1 mysz na 10; w grupę (4), której podawano cefepimę w połączeniu z peptydem C-13 przeżyły 4 myszy na 10. Świadczy to o wzroście przeżywalności tych myszy, którym podawano cefepimę w połączeniu z peptydem C-13.

Badano również in vivo działanie aminoglikozydu - amikacyny i magaininy 2.

Po oznaczeniu MIC dla amikacyny i po podzieleniu myszy na 4 grupy, analogiczne do wyżej opisanych, otrzymano następujące wyniki: (1) - jedynie PBS - nie przeżyła żadna mysz spośród 8; (2) - magainina 2 (dwa wstrzyknięcia po 1 mg/mysz) - nie przeżyła żadna mysz spośród 9; (3) - amikacyna (dwa wstrzyknięcia po 3 mg/kg) - przeżyły 3 myszy z 10; (4) magainina 2 i amikacyna (dawki - jak wyżej) - przeżyła 1 mysz z 10.

Przykład IV. Synteza analogów peptydu C-13

Wytworzono szereg analogów peptydu C-13 (tabela 1) technikami syntezy na nośnikach stałych. Analogi wybrano tak, aby w różny sposób zmieniały się fizyczne parametry peptydu C-13. Niektóre zmiany fizycznych parametrów wpływały na wzajemne oddziaływanie analogu peptydu z błoną bakteryjną. Okazało się, że przedłużenie cząsteczki do osiągnięcia dodatkowego skrętu a-helixu i zmiana gęstości dodatniego ładunku elektrycznego wzdłuż helixow powodowała zmiany w synergicznym działaniu z cefepimą.

Materiały i metody. Reagenty i metody.

Magaininę 2, cekropinę i analogi peptydu C-13 syntetyzowano przy użyciu technik syntezy na nośnikach stałych (Merrifield, R.B. 1963, J.Am.Chem.Soc. 85: 2149-2154) w syntezatorze Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A przy zastosowaniu ochrony typu Boc-benzyl. Powstałą żywicę peptydową poddano działaniu rozcieńczonego/stężonego HF (Tam, J.P. i wsp., 1983, J.Am.Chem.Soc. 105: 6402-6405) lub działaniu stężonego HF - 90%HF/10% anizolu i odszczepiano. Peptyd oczyszczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub na kolumnie Dynamax C-8 (Rainin). Oczyszczone peptydy identyfikowano standardowymi metodami analitycznymi przy użyciu HPLC i analizy aminokwasów.

Tabela 1

r	--------r------	1 1 J Sekwencja aminokwasowa i
Analog peptydu C-13	numer sekwenc j
r	1	2	! 3
i—	C-13	1	j Pro-Leu-'fyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lya-Lys-Leu! Leu-Glu-Ser
	B	3	! Pro-Leu-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ile-Ls-Lys-GluJ Leu-Leu-Ser
	W	4	i Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Pro-Ile-Łys-Lys-Pro* Leu-Glu-Ser
	H	5	1 , Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu1 Leu-Glu-Ser-Ala-Lya-Lys-Leu-Gly
	F	6	J Ala-Leu-Tyr-Iiys-Iiy3-Leu-I,eu-Lys-Lys-I,eu i Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly
	G	7	j Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu- ! Leu-Lys-Ser-Ala-Lya-Lys-Leu-Gly 1

166 731

c.d. tabeli 1

	1	! 2	1 1 ; 3 !
	X	t 1 1 1 1 1 1 1	' dAla-dLeusdTyΓ-dLy3-dLys-dLeu-dIιeusdIιyss J dLy^-dLeu-dLeUsdLyB-dSeΓ-dAlasd]LrB,dLyBt dLeu-Gly	i
	II	1 1 1 1	Ala-Leu-TyT-Orn-Orn, Leu-Leu-Orn-Orn-Leu• Leu-Orn-se:ruAlauOrnu(Orn,Iιee-Gly
	KK	! 8 1 1	i AlauLeuuTyruI,y3uLy3eleeuI,eeuLys-I.ySuI1eeu i LeeuLysuLys-AlauLy3uLy3uLeeuGly
	HH	! 9 I 1	{ AlauLeuuT·yr·uArguΛrg_IJeueLeUuArguAr·guLeeu i LeuuArguSe:ruAlauAr·guArguLeeuGly
	P	J 10 1 1	j AlauLeeuTy:ruLysuLys-Leι.leLee-Ly3-Ly3uLeeu i LeuuLysuPhe-Alau¾y3uLy3up]neuGly
	N	i 11 1 1	J I,ys-T:rp-LysuLeeuTy:ruly8-Lys-Lee-LeeuI,ygu ! LysuLeeuLeeuLysuSer·uAlauLysuIιysuLeeuGIy
	J	! 12 1 1 1 1	J ΛlauLy3uLysuTJeeuAla-Ly^-LeeuTyruLy8uLyau i LeeuLeuuLysuLysuLeeuLeuuLy8useruAlauIιysu 1 Lys-Leu-Gly

Przykład V. Skrining in vitro analogów peptydu C-13 pod względem własności bakteriobójczych i hemolitycznych.

Zsyntetyzowane analogi peptydu C-13 czynnika płytkowego-4 testowano na działanie synergiczne i cefepimą w testach in vitro na bakteriobójczość i własności hemolityczne.

Peptydy o długości co najmniej około 11 do 18 aminokwasów, tworzące około 4 do 5 α-helikalnych skrętów, obniżały 8 do 80 krotnie ilość peptydu potrzebną do zabicia 1/2 liczby komórek bakteryjnych. Analogi peptydu z uszkodzoną strukturą α-helikalną lub pozbawione amfifilowych własności wykazywały zmniejszoną aktywność bakteriobójczą lub nie wykazywały takiej aktywności. Dodanie aminokwasów tworzących 5 pętlę α-heliksu polepszało własności bakteriobójcze. Aktywność bakteriobójcza wzrastała również w wyniku zmiany gęstości ładunków dodatnich wzdłuż heliksu. Okazało się, że analogi peptydu C-13 oznaczone w tabeli 1 llterami H,F oraz (w mnieeszym stopniu) G,X,L, dawały zwiększoną 1 lczbę zabitych komórek, jeśli stosowano je razem z antybiotykiem. Analogi H, F, G, X, II, KK, N i J wymagały obecności dopełniacza lub wykazywały lepsze własności bakteriobójcze, gdy dopełniacz obecny był w środowisku, w którym przeprowadzano skrining. Wzrosty hemolitycznej aktywności analogów peptydu C-13 obserwowano w przypadku zwiększonej długości w kierunku N-końca, lub jeśli arginina zastępowała lizynę w pozycjach 4, 5, 8, 9, 12, 15 i 16.

Materiały i metody. Reagenty i bufory.

Stosowano następujące bufory: bufor żelatynoweronalowy (GVB++jak opisano wyżej). Dodatkowo, do buforu dodawano 0,1% glukozy stanowiącej źródło węgla. Solankę buforowaną fosforanem przygotowano we własnym zakresie. Antybiotyki, to jest cefepimę otrzymano w postaci liofilizowanej, jak opisano wyżej.

Szczepy bakterii i warunki hodowli.

W większości doświadczeń stosowano Escherichia coli, szczep ATCC 25922 pochodzący z American Type Culture Collection. Inne stosowane szczepy E.coli to AO11 pochodzący z Harboview Medical Center, Seattle, WA, izolat otoczki K1z H16 z Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C. E.coli A645AP wytworzona we własnym zakresie jest przejściową wersją ATCC 25922, E.coli A645AP (pBR322) jest E.coli A645AP zawierającą plazmid pBR322 zapewniający odporność na antybiotyki β-laktamowe, wytworzono ją we własnym zakresie. Klebsiella pneumaniae C329 (ATCC B883) pochodziła z American Type Culture Collection, tak jak i Pseudomonas aeruginosa, szczep A366 (ATCC 273 17). Staphylococcus

166 731 aureus, szczep A546 otrzymano z Harboview Medical Center, Seattle, WA. Enterobacteraerogenis, szczep G438 otrzymano z Veterans Administration Hospital, Seattle, WA, a Streptococcus agarlactiae, szczep I334 otrzymano z Childrens Orthopedic Hospital, Seattle, WA. Pseudomonas aeruginosa, szczep M990 odporny na antybiotyk pochodził z kolekcji własnej. Szczepy badano na czystość, odpowiednio zidentyfikowano i przechowywano w temperaturze -70°C. W każdym tygodniu wytwarzano nowe hodowle z każdego zamrożonego szczepu muzealnego w celu uniknięcia repetytywnych podhodowli. Wszystkie szczepy hodowano w bulionie AMH (Adjusted Mueller Hinton> zawierającym 50 gg/litr CaCl2 i 25 mg/litr MgCh.

Test na bakteriobójczość surowicy

Wszystkie szczepy bakterii posiane poprzedniego wieczoru hodowano do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu bez cefepimy lub z cefepimą w stężeniu wynoszącym 1/4 lub 1/5 MIC (Absorbancja przy 660 nm pomiędzy 0,35 i 0,5, w przybliżeniu 2-3 x 10⁸ komórek/ml dla komórek hodowanych z cefepimą i 9 x 10⁸ komórek/ml dla komórek hodowanych bez cefepimy}. Komórki rozcieńczono do stężenia 1 x 10⁴ komórek/ml bez przemywania w buforze żelatyno-weronalowym (GVB++> i 0,05 ml tego roztworu dodano do surowicy (patrz przykład II> znajdującej się w fiolce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. W przypadku komórek bakteryjnych hodowanych przedtem z cefepimą, zarówno do preparatu, jak i do badania aktywności bakteriobójczej, dodano taką samą ilość cefepimy,jaka była obecna podczas hodowania. Przedtem przygotowano albo zebraną normalną ludzką surowicę, albo surowicę inaktywowaną termicznie przez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w 0,2 ml GVB++. Cefepimę, jeśli obecna, dodano do mieszaniny surowicy przed dodaniem komórek bakteryjnych. Peptydy rozcieńczono w zdemineralizowanej wodzie wytwarzając wzorcowy roztwór o stężeniu 2 mg/ml i dodano do fiolki reakcyjnej uzyskując odpowiednie stężenie. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0,25 ml. Liczbę bakterii dodanych do surowicy określono przez dodanie 0,05 ml zawiesiny bakteryjnej do probówki zawierającej jedynie GVB++ i rozlanie na płytki na początku próby. Następnie mieszaninę reakcyjną obracano w temperaturze 37°C w ciągu trzech godzin. W przerwach pobierano próbki (25 gl> do analizy płytkowej. Liczbę jednostek tworzących kolonie oznaczono po całonocnej inkubacji w agarze sojowym. Liczbę jednostek tworzących kolonie oznaczono trójkrotnie i obliczono wartość średnią.

Próba hemologiczna

Całą krew pobraną od zdrowych ochotników rozcieńczono w PBS do uzyskania stężenia czerwonych krwinek wynoszącego w przybliżeniu 6 x 108 komórek/ml. Peptydy zawieszono w PBS wytwarzając wzorcowy roztwór o stężeniu 2 mg/ml i 10 gl tego roztworu dodano do 900 gl rozcieńczonych czerwonych krwinek. Próbki inkubowano w temperaturze 38°C w ciągu 45 minut, odwirowano (1000 x g> w ciągu 5 minut i usunięto supernatant. Supernatanty badano spektrofotometrycznie przy 541 nm. Procent hemolizy odczytywano z krzywej wzorcowej, otrzymanej w wyniku przeprowadzenia serii rozcieńczeń krwi rozcieńczonej w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej. Rozcieńczenie w wodzie destylowanej w stosunku 1:10 oznaczało 100% hemolizy.

Tabela 2

Bakteriobójcza i hemolityczna aktywność (ID50)¹ kationowych oligopeptydów z E.coli A645 (ATCC 25922>

Peptyd	Bez cefepimy	Z cefepimą-1/4 MIC	Liza czerwonych krwinek (%>
NHS	NI-NHS	NHS	NI-NHS
1	2	3	4	5	6
MGN 2	>200	>200	85	>200	1
C-13	>200	>200	80	>200	<1
B	>200	>200	>200	>200	ND3
W1	>200	>200	>200	>200	ND
H	>100	>100	10	>100	1,5

166 731

c.d. tabeli 2

1	2	3	4	5	6
F	70	>200	10	90	<1
G	4	>200	1	>200	<1
X	4	>50	<1	>50	<1
HH2	>50	>50	>50	>50	3
II2	1	47	<1	43	<1
KK	1	>50	<1	>50	<1
P	10	10	10	10	21
L	46	40	11	40	3
N	1	10	1	>2	7,5
J	1	>8	1	4	2,5
Cekropina	1	1	,25	,5	<1

ID50 - oznacza ilość peptydu (gg/ml) potrzebną do zmniejszenia początkowej liczby bakterii o 50% ² - stęzeeieceeeeimy wynoszzcc 11/ MIC ³ - ND - oznacza nie określono

NHS - normalna ludzka surowica

HI-NHS - normalna ludzka surowica inaktywowana termicznie

Wyniki

Testowano bakteriobójczą aktywność szeregu różnych oligopeptydów kationowych z antybiotykiem i bez antybiotyku oraz z aktywnym dopełniaczem i bez niego. Testy obejmowały maga^by, eekropinz, peptyd C-13 HPF-4 i różne jego analogii i pochodne (tabela 2). Ponadto monitorowano potencjalną toksyczność przez badanie zdolności peptydów do wywoływania lizy czerwonych krwinek. Początkowo badano dwa różne aspekty struktury drugorzędowej. Peptydy zawierające podstawienia aminokwasówe, które niszczą albo charakter amfipatnezny (analog B), albo strukturę α-helikalną cząsteczki (analog W), były nieaktywne we wszystkich testach. Ponieważ zarówno ittoienie struktury α-helikalnej jak i charakter ameipatyczny peptydu były konieczne dla jego aktywności, wszystkie następne modyfikacje peptydu zachowują te dwie powyższe cechy. Zbadano modyfikację peptydu, która zawierała następny skręt α-heliksu, dzięki dodaniu pięciu aminokwasów i zachowywało charakter amfipatyczny (analog H). Ten analog szczególnie skutecznie zabijał bakterie w normalnej ludzkiej surowicy (NHS). Obserwowano tu 8-krotny wzrost aktywności bakteriobójczej (analog H) w stosunku do bakterii zmienionych ceeepimc w NHS, jednakże nie obserwowano odpowiedniego wzrostu aktywności ani w normalnej ludzkiej surowicy inaktywowanej termicznie (HI-NHS), ani w stosunku do bakterii nietraktowanych antybiotykiem. Wynikiem małej zmiany w analogu H dwóch hydrofobowych aminokwasów (analog F) był lekki wzrost aktywności bakteriobójczej. Obserwowano 10-krotny wzrost aktywności w stosunku do bakterii zmienionych cefepimą w NHS, gdy resztę kwasu glutaminowego w analogu F zastąpiono lizyną (analog G). Nie obserwowano natomiast odpowiedniego wzrostu aktywności przeciwbakteryjnej tego peptydu ani w HI-NHS, ani przeciwko bakteriom nietraktowanym antybiotykiem. Ponadto nie obserwowano wzrostu poziomu lizy czerwonych krwinek. Analog G wykazuje, że nawet pojedyncza zmiana może mieć duży wpływ na aktywność.

Przedłużenie heliksu o następny skręt przez dodanie pięciu aminokwasów na N-końcu (analog J) nie powoduje dodatkowego wzrostu aktywności przeciwhakteryjnej. Modyfikacja ta zwiększa stopień lizy czerwonych krwinek. Może to wskazywać na to, że peptydy o większej liczbie skrętów heliksu są toksyczne. Analiza in vitro aktywności przeciwbakteryjnej w NHS z cefepimą wykazała, że peptyd (analog G) charakteryzuje się 80-krotnym wzrostem aktywności przeciwbakteryjnej. W przeciwieństwie do powyższego nie obserwowano antybakteryjnej aktywności ani w HI-NHS, ani w stosunku do bakterii nietraktowanych antybiotykiem. Dalsze badania analogu G ujawniły, że aktywność bakteriobójcza zależy od NHS z innymi szczepami bakteryjnymi (tabela 3). Te dane również wskazują na to, że aktywność bakteriobójcza analogu

166 731

G w obecności normalnej ludzkiej surowicy może być wzmocniona przez antybiotyk w różnym stopniu, w zależności od szczepu bakteryjnego.

Tabela 3

Bakteriobójcza aktywność in vitro (ID50)¹ analogu G peptydu C-13 w stosunku do różnych szczepów bakteryjnych

Szczep	Bez cefepimy	Z cefepimą-1/4 MIC	% surowica	MIC
NHS	MI-NHS	NHS	HI-NHS
H16	200	200	15	10O	40	1/4
C329	1	80	1	50	10	1/8
G438	1	45	1	45	10	1/4
A366	25	40	25	40	10	1/8
A011	2	80	2	80	10	1/4
A586	200	200	200	200	40	SL3
I334	200	45	80	25	40	1/4
A645AP	1	70	1	80	10	1/4
A645AP2	1	70	ND	80	10	1/8
(pBR322) M0092	2	120	ND	ND	20	1/8

¹ ID5 - oznacza ilość peptydu (gg/ml) potrzebną do zmniejszenia początkowej liczby bakterii o 50% ² - Szczepy odporne na antybiotyk: A645AP (pBR322), MIC 1 gg/ml, MOO9, MIC 64 gg/ml

SL - subtelne stężenie cefepimy oznaczano przez rozcieńczenie antybiotyku w bulionie 1 badanie wzrostu po trzech godzinach

Przykład VI. Działanie uodporniające analogów peptydu C-13 i ich połączeń z cefepimą.

Badano zdolność analogów peptydu C-13 i ich połączeń z cefepimą do uodporniania myszy na śmiertelne infekcje wywołane E.coli. Wywołano neutropenię u myszy przez wstrzyknięcie cyklofosfamidu, a następnie wprowadzono E.coli. Myszy podzielono na cztery grupy:

(1) myszy, którym podawano PBS;

(2) myszy, którym podawano jedynie analogi peptydu C-13;

(3) myszy, którym podawano jedynie cefepimę;

(4) myszy, którym podawano połączenia cefepimy i analogów peptydu C-13.

Myszy obserwowano w ciągu 10 dni po infekcji i notowano liczbę zgonów. Wyniki tych doświadczeń wskazują na to, że zarówno brak leczenia jak i leczenie samą cefepimą, lub samymi analogami G, X, II i F peptydu C-13 było nieskuteczne, nie zapobiegało śmierci. Zastosowanie połączenia analogów peptydu C-13 z cefepimą uodporniało myszy w znacznym stopniu.

Materiały i metody. Reagenty i bufory.

Solankę buforowaną fosforanem przygotowano we własnym zakresie. Cefepimę w postaci liofilizowanej otrzymano od Dr.Roberta Kesslera, Bristol - Myers Squibb Company, Wallingford, Conn. Cekropinę zsyntetyzowano we własnym zakresie na podstawie opublikowanej sekwencji. Cyklofosfamid o nazwie handlowej Cytoxan zakupiono od Mead Johnson.

Szczepy bakterii i warunki hodowli.

E. coli H16 otrzymano z Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C., a E.coli A645AP wytworzono we własnym zakresie przez pasażowanie E.coli ATCC 25922. Szczepy zbadano na czystość, odpowiednio zidentyfikowano i przechowywano w temperaturze -70°C. W każdym tygodniu wytwarzano nowe hodowle z zamrożonych szczepów w celu uniknięcia repetytywnych podhodowli. Wszystkie szczepy hodowano w bulionie AMH zawierającym 50 mg/litr CaCl2 i 25 mg/litr MgCk.

Doświadczenia in vivo.

U samców CrL : CF1 myszy wywołano neutropenię na pięć dni przed wprowadzeniem bakterii. Neutropinę wywołano przez podskórne wstrzyknięcie 250 mg/kg Cytoxanu (cyklofo666 731 sfamidu). Myszom wprowadzono albo 2 x 1 (/E.coli H16 (tabela 4), albo 5 x 1()4 A645AP przez wstrzyknięcie śródotrzewnowe. Myszy podzielono na cztery grupy, które traktowano odpowiednio:

(1) PBS;

(2) analogiam peptydu C-13 (15 mg/kg);

(3) cefepimą (0,1 mg/kg);

(4) połączeniem cefepimy i analogu peptydu C-13 (0,1 mg/kg cefepimy i 15 mg/kg analogu peptydu C-13, które to składniki połączono przed wstrzykiwaniem. Wszystkich wstrzyknięć dokonywano w roztworze PBS (0,2 ml), domięśniowo, do osobnych kończyn, po 1 i po 3,5 godzinach po wprowadzeniu bakterii. Monitorowano przeżywalność myszy w ciągu 10 dni, a wynik analizowano testem Fisher Exact.

Wyniki

Badano działanie uodporniające myszy na ogólnoustrojową infekcję wywołaną E.coli H.16, analogów peptydu C-13 i cefepimy (tabela 4). Gdy podawano PBS, cefepimę lub analogi G, X, II i F peptydu C-13 oddzielnie, nie obserwowano znaczącego poziomu uodpornienia. W przeciwieństwie do tego obserwowano znaczny wzrost przeżywalności myszy, którym podawano cefepimę wraz z analogiem G lub F peptydu C-13 w porównaniu z brakiem leczenia, lub z leczeniem albo samą cefepimą, albo samym analogiem C-13 (p < 0,05, test Fisher Exact). Podobne doświadczenia przeprowadzono z cekropiną. W tych doświadczeniach nie obserwowano znacznego wzrostu odporności, gdy stosowano cekropinę samą lub w połączeniu z cefepimą.

Ponadto, w podobnych doświadczeniach testowano inny antybiotyk - aztreonam. Ten antybiotyk β-laktamowy w połączeniu z analogiem G peptydy C-13 dawał statystycznie znaczne uodpornienie (p<0,05,, test Fisher Exact). Wyniki doświadczeń są następujące:

- PBS podawany sam - nie przeżyła żadna mysz spośród 9;

- aztreonam sam - przeżyła 1 mysz na 20;

- analog G peptydu C-13 - nie przeżyła żadna mysz spośród 10;

- aztreonam + analog G peptydu C-13- przeżyło 11 myszy spośród 20.

Analog G peptydu C-13 badano również przy użyciu neutropenicznych myszy, którym wprowadzono non K1 E.coli, szczep A645AP (5,0 x 10 organizmów). Badanie przeżywalności myszy po wprowadzeniu bakterii dało następujące wyniki:

- grupa (1) - w której podawano jedynie PBS - przeżyły 3 myszy z 20;

- grupa (2) - w której podawano jedynie analog G - nie przeżyła żadna mysz spośród 15;

- grupa (3) - w której podawano cefepimę - przeżyły 3 myszy z 20;

- grupa (4) - w której podawano zarówno cefepimę jak i analog G - przeżyło 8 myszy z 15.

Wzrost przeżywalności myszy, którym podawano połączenie składników był znowu znaczny (p < 0,05, test Fisher Exact). Dowodzi to zwiększenia przeżywalności w przypadku podawania połączenia peptydu z antybiotykiem w porównaniu z przypadkami podawania samego peptydu lub samego antybiotyku.

Tabela 4

Działanie analogów peptydu C-13 i cefepimy na ogólnoustrojową infekcję E.coli

Leczenie	Liczba myszy, które przeżyły/liczba myszy w doświadczeniu	Przeżywalność %
1	2	3
PBS	2/25	8
cefepimą	3/25	12
G		6,7
cefepimą + G	11/20	55
X	1/18	5,6
cefepimą + X	15,/20	75
II	0/5

166 731

c.d. tabeli4

1	2	3
cefepima + II	3/10	30
F	0/10
cefepima + F	3/10	30
Cekropina	2/20	20
Cefepima + Cekropina	2/10	20

166 731 log₁₀ liczby zabitych

Fig.2.

166 731 log₁₀liczby ! ₅ zabitych

B surowica aktywna

O

O 5

B surowica nieaktywna

Bakterie Zmienione metraktawane cefepimą

Wszystkie próbki zawierały 100jug/ml MGN 2

Fig.3

166 731

% surowicy inaktywowanej termicznej

Fig.4

166 731

Fig.5,

166 731 log₁₀ liczby zabitych

4

ci'

Fig. 6.

166 731 tog_1Q liczby zabitych

Fig. 7

166 731

B surowica aktywna surowica nieaktywna

Bakterie Zmienione nietraktowane cefepimą

IOB₁₀Uczby zabitych

2.5

O

5

1.0

O 5

O

Wszystkie próbki zawierały 200 ug/ml peptydu C 13

Fig.8

166 731 log_1Q liczby zabitych

O 25 50 100 200

MGN 2 bjg/ml)

Fig.1.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania środka do leczenia infekcji wywołanych przez organizmy wrażliwe na antybiotyki (β-laktamowe, opartego na oligopeptydzie i antybiotyku β-laktamowym, znamienny tym, że wyodrębnia się i oczyszcza kationowy amfipatyczny oligopeptyd, tworzący w obecności lipidowo/wodnej granicy faz strukturę α-helikalną o sekwencji reszt aminokwasowych aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa₂-aa2-Lys-Lys-Leu-aa3-aa4-X, w której aa1 oznacza Pro, Ala lub Lys, aa₂ oznacza Ile, lub Leu, —3 oznacza Glu lub Lys, aa* oznacza Ser, Leu lub Lys, a X oznacza grupę karboksylową albo sekwencję reszt pięciu aminokwasów o strukturze α-helikalnej określoną ogólną sekwencją aminokwasową —5- Lys-Lys-aa^-Gly, w której aas oznacza Ala lub Leu, a aa6 oznacza Leu lub Phe i tak wyodrębniony i oczyszczony oligopeptyd łączy się z antybiotykiem β-laktamowym.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się oligopeptyd wytworzony przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się oligopeptyd wytwarzany na drodze syntezy chemicznej.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się oligopeptyd o sekwencji reszt aminokwasowych:

   Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

   Ala-Leu- Ty--Lys-Lys-Le--Lu--Ly--Lu--Leu-Glu-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly,

   Ala-Leu-TyrsLys-LyssLeu-Leu-LyssLys-Leu-Leu-LyssSer-AlaLys-Lys-Leu-Gly,

   AlasLeu-TyrsLyssLyssLeu-Leu-Lys-Lys-LeusLeu-LyssLysAla-Lys-Lys-Leu-Gly,

   Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-AlaLys-Lys-Phe-Gly,

   Lys-Trp-LyssLeusTyrsLyssLys-Leu-LeusLyssLys-LeusLeusLysSer-AlasLyssLyssLeu-Gly lub

   Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-L ¢5 u-Ttyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-LysLeu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się kationowy oligopeptyd o sekwencji reszt aminokwasowych: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Łeu-ŁeuLys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly, w której reszty aminokwasowe mogą stanowić reszty d-aminokwasów.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się kationowy oligopeptyd o sekwencji reszt aminokwasowych Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-LeuOrn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.

   * * *

   166 731