JPH10508576A

JPH10508576A - 抗真菌性ペプチド

Info

Publication number: JPH10508576A
Application number: JP8510173A
Authority: JP
Inventors: ロジャー，ジー．ザセカンドリトル，; エドワードリン，; ミッチェル，ビー．ファデム，
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1995-07-20
Publication date: 1998-08-25
Also published as: AU709738B2; EP0824547B1; WO1996008509A1; ATE256147T1; CA2200069C; CA2200069A1; EP0824547A1; AU3198195A; DE69532302D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質(BPI)のドメインIII（第 142〜 169位のアミノ酸）から誘導あるいは基礎とした抗真菌性ペプチドと、これらペプチドの治療用途での使用に関する。これらペプチドはすべて、７〜12個のアミノ酸を有し、LIQL、IQLF、WLIQL、LIQLF およびWLQLFのコア配列と、末端領域に一つ以上の塩基性アミノ酸を含む。ペプチドは、直鎖状か環状である。

Description

【発明の詳細な説明】抗真菌性ペプチド本願は、いずれも本明細書に参考までに取り入れた、1993年３月12日に出願された米国特許出願 No．08/030,644 の一部継続出願である、1993年７月15日に出願された米国特許出願 No. 08/093,202 の一部継続出願である、1994年１月14日に出願された米国特許出願 No．08/183,222 の一部継続出願である、1994年３月 11日に出願された米国特許出願 No．08/209,762 の一部継続出願である、1994年９月15日に出願された米国特許出願 No．08/306,473 の一部継続出願である、19 95年１月13日に出願された米国特許出願 No．08/372,105 の一部継続出願であり、また、前出の米国特許出願 No．08/209,762 の一部継続出願である、1994年７月11日に出願された米国特許出願 No．08/273,540 の一部継続出願でもある。発明の背景本発明は、一般に、殺菌／浸透性増強タンパク質(BPI)のドメインIII(142〜16 9 位のアミノ酸)から誘導された抗真菌性ペプチド、あるいはそれに基づいた抗真菌性ペプチドと、これらペプチドの治療用途での利用に関する。 BPI は、微生物による侵入に対する防御に必須の血液細胞である哺乳動物の多形核白血球(PMNまたは好中球)の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトBPI タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［Elsbach ら、J．Biol．Chem. ，254,11000 頁、(1979)］または大腸菌アフィニティークロマトグラフィー［We iss ら、Blood，69，652頁、(1987)］のいずれかと、酸抽出とを併用して、PMN から単離されている。このようにして得られたBPI を本明細書では天然型BPI と称するが、これは、広範なグラム陰性細菌に対する強力な殺菌活性を有することが示されている。ヒトBPI の分子量はおよそ55,000ダルトン(55kD)である。ヒトBPI タンパク質全体のアミノ酸配列、及び該タンパク質をコードするDNA の核酸配列は、Glayら、J．Biol．Chem.，264，9505 頁、(1 989)の図１に報告されており、かかる文献を引用することにより、それら配列を本明細書に含むものとする。GrayらのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号：205 と206 に示した。 BPI は、強い陽イオン性を有するタンパク質である。BPIのＮ末端半分は、高い実効電荷の原因となり、一方、分子のＣ末端半分は、-3の実効電荷を有する。［Elsbach およびWeiss(1981)、前出］。約25kDの分子量を有するBPI のタンパク質分解によるＮ末端断片は、疎水性領域と親水性領域とを交互に含み、両親媒性の特徴を有する。ヒトBPI のこのＮ末端断片は、天然に由来する55kDのヒトBP I ホロタンパク質の抗細菌効果を保有している。［Ooi ら、J．Biol．Chem.，26 2，14891〜14894 頁、(1987)］。Ｎ末端部分とは対照的に、単離されたヒトBPI タンパク質のＣ末端領域は、グラム陰性生物に対してほんのわずかに検出可能な抗細菌活性を呈するに過ぎない。［Ooi ら、J．Exp．Med.，174 巻、649頁、(19 91)］。「rBPI₂₃」と称される、およそ23kDのＮ末端BPI 断片が、組換え法により製造されており、これもグラム陰性生物に対して抗細菌活性を保持するものである。［Gazzano-Santoro ら、Infect．Immun．60 巻、4754〜4761頁(1992)］。この文献によれば、組換え発現生成物(rBPI₂₃)をコードするDNA の入手源として発現ベクターが用いられている。このベクターは、 151位のバリンがGTC でなくGTG によって決定され、また、 185位が(AAGによって決定された)リジンでなく(GAGによって決定された)グルタミン酸である以外は前出のGrayらの配列に基づいた配列番号：205 と206 に示した成熟したヒトBPI のＮ末端の31残基のシグナル配列と最初の 199個のアミノ酸をコードするよう調製されている。rBPI₂₃について述べた構造上の例外点を有する前出のGrayらの配列に基づいた配列番号：205と206 に記載の配列を有したrBPIとも称される組換えホロタンパク質も生成されている。rBPI₂₁あるいはrBPI₂₁Δcys と称されるＮ末端断片類似体が、本明細書に参考までに取り入れた、共同所有に係る、係属中の米国特許 No．5,420,019に記載されている。この類似体は、132位の残基がアラニンに置換され、かつrBPI₂₃について述べた構造上の例外点を有する、配列番号：205 と206 に記載のBPI ホロタンパク質の最初の 193個のアミノ酸を含んでいる。 BPI の殺菌効果は、例えばElsbach およびWeiss、Inflammation: Basic Princ iples and Clinical Correlates,eds．Gallin ら編、30章、Raven Press，Ltd.( 1992)におけるごとく、グラム陰性の種に特異性が高いとの報告がなされている。BPI は、酵母を包含する他の微生物や、さらに高等な真核細胞に対して、通常非毒性であると考えられている。Elsbach およびWeiss、(1992)、前出は、10^-8 から10^-9Ｍ程度の低濃度で、BPI が広範囲のグラム陰性細菌に対して抗細菌活性を呈するものの、それより100 から1,000 倍高い濃度のBPI が、同時に調べたグラム陽性細菌種、酵母、及びさらに高等な真核細胞のすべてに対して、非毒性であったことを報告している。グラム陽性生物である黄色ブドウ球菌(Staphylococ cus aureus)(４株)、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermid is）、スタフィロコッカス・ファエカリス（Staphylococcus faecalis）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ミクロコッカス・リソデイクチカス（Micrococcus lysodeikticus）、及びリステリア・モノサイトゲンス（Listeri a monocytogenes）に対して、pH7.0 または5.5 のいずれかで調べた場合、10^-6 Ｍまたは160μg/mlの濃度で、BPI は毒性効果を有しないことが報告された。報告によれば、pH7.0 または5.5 において、BPI は10^-6Ｍにて真菌であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・パラシロシス(Candida par asilosis)に対する毒性効果を有さず、ヒト、ウサギ及びヒツジ赤血球細胞ならびに種々のヒト腫瘍細胞系に対して非毒性であった。やはりElsbach およびWeis s の、Advances in Inflammation Research、G．Weissmann編、２巻、95〜113 頁、Raven Press(1981)を参照されたい。このように報告された標的細胞の特異性は、リポ多糖(LPS)に対するBPI の強い誘引力の結果であると考えられていた。LPS は、グラム陰性生物の外膜（あるいはエンベロープ）に独特のものである。 BPI のグラム陰性細菌殺傷における正確な機構はいまだ完全には解明されていないが、まず、陽イオン性BPI タンパク質とLPS 上の陰性に荷電した部位との間の静電気的相互作用及び疎水性相互作用を通して、細菌の表面にBPI が結合しなければならないと考えられている。LPS は、それが刺激する強い炎症応答（すなわち、回復不能の内毒性ショックを最終的には惹起こしうる宿主炎症細胞によるメディエータの放出）のゆえに、「内毒素」と称されている。BPI はリピドＡに結合するのであるが、これはLPS の最も毒性が強く最も生物学的活性を有する成分であると報告されている。感受性のグラム陰性細菌において、BPI の結合はLPS 構造を崩壊させ、リン脂質及びペプチドグリカンを分解する細菌酵素の活性化を惹起こし、細胞外膜の透過性を変化せしめ、最終的には細胞死へと導く事象を開始させると考えられる。［Elsbach およびWeiss(1992)、前出］。BPI は２段階にて作用すると考えられる。第一は、即時的生育停止、外膜の透過性亢進（permeabili zation）ならびにリン脂質及びペプチドグリカンを加水分解する細菌酵素の選択的な活性化によって特徴付けられる亜致死的段階である。この段階での細菌は、血清アルブミンを追加した培地中で生育させることにより救助できる［Mannion ら、J．Clin．Invest.，85巻、853 〜860 頁、(1990)］。第二段階は、血清アルブミンで回復しえない生長阻害により規定されるものであるが、細菌をさらに長い間BPI に曝した後に起こるものであり、細胞質内膜への明白な損傷を含む、広範囲の生理学的及び構造的変化により特徴付けられる。 BPI がLPS にまず結合して、正常時においてMg⁺⁺およびCa⁺⁺の結合を通して外膜を安定化させる、LPS のKDO 領域中の陰イオン性の基への結合におそらくは起因した、組織的な変化が惹起こされる。グラム陰性細菌の外膜へのBPI の付着によりアクチノマシンＤなどの疎水性物質への外膜の迅速な透過性亢進がなされる。BPI の結合及びそれに続くグラム陰性細菌殺傷は、少なくとも部分的にLPS 多糖の鎖長に依存するものであり、長いO-鎖を持っている「スムーズ」生物は、短いO-鎖を持っている「ラフ」生物よりもBPI の殺菌効果に対して耐性である［We iss ら、J．Clin．Invest.，65巻、619 〜628 頁、(1980)］。このBPI の作用の第一段階であるグラム陰性外側エンベロープの透過性亢進は、BPI の解離に際しては可逆性であり、これは、二価陽イオンの存在及び新規LPS の合成を必要とするプロセスである［Weiss ら、J．Immunol.，132巻、3109 〜3115頁(1984)］。しかしながら、グラム陰性細菌の生育力喪失は、エンベロープの完全性を修復するプロセスによっては回復せず、従って殺菌作用は標的生物に誘導される付加的な障害により媒介されるのであり、それは細胞質膜に位置するかもしれないことが示唆される［Mannion ら、J．Clin．Invest.，86巻、631 〜641 頁、(1990)］。この可能性を特に精査して、モルベースで、BPI は少なくともポリミキシンＢと同等に細胞質膜小胞機能を阻害することが示されている［ In't Veldら、Infection and Immunity、56巻、1203〜1208頁(1988)］ものの、正確な機構ならびに、このような小胞と無傷の生物の研究との関連は、いまだ解明されていない。組換え体の23kDのＮ末端BPI の配列の３つの異なる機能ドメインが発見されている［Littleら、J．Biol．Chem., 269巻、1865頁、(1994)］。BPI のこれら機能ドメインは、タンパク質の生物学的活性に寄与するBPI のアミノ酸配列を指し、15-mer のペプチドおよび他の合成ペプチドと重複するタンパク質分解性開裂断片の活性によって実質的に決定される。ドメインＩは、BPI の約17〜約45位のアミノ酸を含むアミノ酸配列によって決定される。このドメインに基づくペプチドは、LPS-誘発したLAL 活性とヘパリン結合活性双方の阻害において適度の活性を示すが、顕著な殺菌活性は示さない。ドメインIIは、BPI の約65〜約99位のアミノ酸を含むアミノ酸配列によって決定される。このドメインに基づくペプチドは、高いLPS 活性とヘパリン結合活性を示し、また殺菌性である。ドメインIII は、BPI の約 142〜約 169位のアミノ酸を含むアミノ酸配列によって決定される。このドメインに基づくペプチドは、高いLPS 活性とヘパリン結合活性を示し、また殺菌性である。機能ドメインペプチドの生物学的活性には、LPS 結合性、LP S 中和活性、ヘパリン結合性、ヘパリン中和活性、あるいは殺菌活性が含まれる。真菌は、有性生殖または無性生殖可能な真核細胞であり、二相性でありえ、一つの型は天然型であり、感染した宿主において異なる型をなす。真菌性の疾患は、真菌症と称される。ある真菌症は地方病性、すなわちその真菌の天然の生息地である地球上の区域において感染がもたらされる。これらの地方病性の真菌症は、通常自己限定性であり、症候性は極微である。ある真菌症は、主に日和見的であって、臓器移植患者、化学療法を施されているガン患者、火傷患者、AIDS患者、または糖尿病ケトアシドーシスを持つ患者などの、免疫力が低下した(immunoc ompromised)患者に発症する。多くの理由により、真菌の感染は主要な健康上の関心事となってきており、その理由には利用可能な抗真菌剤の数が限定されていること、古い抗真菌剤に耐性を有する種の発生率の増大、ならびに日和見真菌感染に対する危険性のある免疫力が低下した患者数の増加が包含される。全身性の真菌感染症の発生率は、1980 年代に、教育研究病院において 600％、教育研究病院以外の病院において 220％増大している。最も一般的な臨床分離菌は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）であり、これはすべての臨床分離菌の約19％を占める。ある研究では、病院でもたらされた感染による全死亡数のほぼ40％が真菌に起因している。［ Sternberg、Science、266巻、1632〜1634頁、(1994)］。抗真菌剤には３つの主な群が包含される。主要群にはポリエン誘導体が含まれ、これにはアンフォテリシンＢならびに構造的に関連する化合物であるナイスタチン及びピマリシンが包含される。これらは真菌細胞膜の成分であるエルゴステロールに結合して、それにより膜を崩壊せしめる、適用範囲の広い抗真菌剤である。アンフォテリシンＢは通常、全身性の真菌症に対して有効であるが、発熱、腎障害、ならびに貧血、低血圧、頭痛、悪心、嘔吐及び静脈炎などの他の併発する副作用を包含する毒性作用により、その投与は限定される。類縁性のない抗真菌剤であるフルシトシン（5-フルオロシトシン）は、経口的に吸収される薬剤であるが、ある型のカンジダ症及びクリプトコッカス性髄膜炎(cryptococcal meningit is)に対するアンフォテリシンＢ処置の佐剤としてしばしば使用される。その副作用には、白血球減少症及び血小板減少症を伴う骨髄抑制が包含される。抗真菌剤の第２の主要群には、エルゴステロールの合成の損傷を起こし、真菌の膜結合性酵素系（例えばシトクロムP450）の機能を破壊する代謝物の蓄積を導き、そして真菌の生長を阻害するアゾール誘導体が包含される。哺乳動物のP450 を有意に阻害すると、有意な薬剤の相互作用が惹起こされる。この群の抗真菌剤には、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、サルコナゾール、ターコナゾール、フルコナゾールおよびイトラコナゾールが包含される。これらの薬品は、全身性の真菌症を治療するために投与することができる。経口投与されるイミダゾールであるケトコナゾールは、免疫力が低下していない患者における非髄膜性のブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症及びパラコクシジオイデス症を治療するために使用され、また、口腔及び食道のカンジダ症に対しても有用である。副作用には、まれに起こる薬剤誘導性肝炎があり、ケトコナゾールは、妊娠に禁忌でもある。イトラコナゾールは、ケトコナゾールよりは副作用が少ないようであり、前記と同様の症候ほとんどに対して用いられる。フルコナゾールもまた、ケトコナゾールよりも副作用が少なく、口腔及び食道のカンジダ症及びクリプトコッカス性髄膜炎に対して使用される。ミコナゾールは、コクシジウム症及び種々の他の真菌症において有効性を持つ腸管外用のイミダゾールであるが、高脂血症及び低ナトリウム血症を含む副作用を有する。抗真菌剤の第３の主要群には、皮膚の感染を治療するために通常使用されるアリルアミン−チオカーバメート類が包含される。この群には、トルナフテート（ tolnaftate）及びナフチフィン(naftifine)が包含される。他の抗真菌剤としては、局所的な処置に呼応しない皮膚、毛髪または爪の真菌感染のために経口的に投与される静真菌剤である、グリセオフルビンがある。大抵の地方病性真菌症は、呼吸経路によりもたらされ、症候性は極微であり、咳、発熱、頭痛、及び胸膜痛が認められるかもしれない。場合によっては、地方病性の真菌症は進行性の肺疾患または全身性の感染を惹起こすかもしれない。ヒストプラスマ(Histoplasma)により惹起こされるヒストプラスマ症は、米国において最も一般的な地方病性の呼吸器系真菌症であり、4000万人を越える人々が感染している。かかる疾患は非伝染性であり、大抵は自己限定性であるが、慢性の肺感染及び播種性（disseminated）感染が生じる可能性がある。肺感染は滅多に治療を要しないが、播種性の感染は、アンフォテリシンＢを用いて治療されうる。コクシジオイデス(Coccidioides)によって惹起こされるコクシジオイデス症は、米国南西部において広く普及した非伝染性の呼吸器系真菌症である。これもやはり、通常は自己限定性であるものの、慢性の肺感染または播種性の感染を惹起こすかもしれない。治療のために、アンフォテリシンＢまたはミコナゾールが投与されうる。ブラストミセス(Blast omyces)によって惹起こされるブラストミセス症は、非伝染性、亜急性または慢性の地方病性真菌症であり、米国南東部において最も広く認められる。大抵の肺感染は、おそらくは自己限定性である。進行性の肺疾患または播種性の疾患を持つ患者、および免疫力が低下した患者は、アンフォテリシンＢを用いて全身性の治療が行われるとよい。パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）によって惹起こされるパラコクシジオイデス症は、非伝染性の呼吸器系真菌症であり、南米において最も一般的な全身性の真菌症である。これは急性且つ自己限定性でありえ、あるいは、進行性の肺疾患または肺外の播種を生じるかもしれない。播種性の疾患は、概して、治療を施さなければ命に関わるものである。スルホンアミド類が使用されうるが、成功率は低い。アンフォテリシンＢが応答の率は高いが、それでも再発が起こるかもしれない。クリプトコッカス症は、非伝染性で、しばしば日和見性の真菌症である。これは、しばしば髄膜炎を伴う、呼吸困難(involvement)または血行性の播種により特徴付けられる。主たる病因学的物質は、クリプトコッカス・ネオフォーマンス (C．neoformans)である。大抵の肺感染はおそらく見落とされているが、クリプトコッカス性髄膜炎は、報告されている疾患のうち90％に相当し、劇的であり滅多に見落とされることはない。クリプトコッカス症は免疫力が低下した患者において特に問題であって、AIDS患者の７〜10％にクリプトコッカス性髄膜炎が発症している。髄膜炎の主な症候は頭痛であり、付随する所見には、精神的な変化、眼の症候、聴覚減退、悪心、嘔吐、及び急発作が包含される。治療しなければ、２年以内に80％の患者が死亡する。髄膜炎において、脳脊髄液沈渣のインディアインク調製物中にクリプトコッカスを観察することができ、脳脊髄液から培養できる。通常、治療にはフルコナゾールまたは、アンフォテリシンＢとフルシトシンの組合せが用いられるが、アンフォテリシンＢは血液−脳関門を通過しない。アスペルギルス症は、アスペルギルス(Aspergillus、コウジカビ)種によって惹起こされる多様な疾患プロセスを網羅する語である。アスペルギルス種は遍在性であり、その胞子は定常的に吸入されている。既知の300 を越える種のうち、以下のわずか数種のみが通常ヒトに対して病原となる：アスペルギルス・フミガタス（A．fumigatus）、アスペルギルス・フラバス(A．flavus)、アスペルギルス・ニガー（A．niger）、アスペルギルス・ニドゥランス(A．nidulans)、アスペルギルス・テレウス（A．terreus）、アスペルギルス・シドウイ(A．sydowi) 、アスペルギルス・フラバタス(A．flavatus)、およびアスペルギルス・グラウカス（A．glaucus）。アスペルギルス症の罹患率は上昇しており、特に慢性の呼吸器疾患を持つ患者または免疫力が低下した患者の間で問題になっている。免疫力が低下した患者の間において、アスペルギルス症は、最も一般的に日和見性の真菌症としてカンジダ症に次ぐものであり、この群の全身性真菌症の約15％に相当する。日和見性の肺アスペルギルス症は、広範な気管支びらん及び潰瘍形成、それに続く、血栓症、閉塞及び梗塞形成を伴う、肺血管の浸潤によりその特徴が示される。臨床的には、感染により壊死性の斑状気管支肺炎が現れ、時に出血性の肺梗塞を伴う。症例のうち40％で、他の部位への血行性の伝播がある。アスペルギルス症も稀少ではあるが、火傷創の悪化を圧倒的なものにし、療治のためにしばしば切断を施す必要がある。侵入性のアスペルギルス症は、一般に致命的であり、しかして果敢なる診断及び治療が必要である。血液、尿及び脳脊髄液の培養では滅多に陽性にならないが、塗沫標本及び生検において、真菌を認めることができる。治療のためにアンフォテリシンＢが投与可能である。ムコール症は、急性であり化膿性の日和見性真菌症で、免疫力が低下した患者に鼻脳、肺または播種性の疾患を起こし、火傷または開放創を持った患者に局所性または播種性の疾患を起こす。この感染は、接合菌類のクラスの真菌によって惹起こされ該真菌には、バシジオボラス（Basidiobolus）、コニジオボラス（Co nidiobolus）、リゾプス（Rhizopus）、ムコール（Mucor）、アブシジア(Absidi a)、モーチエレラ(Mortierella)、クニンガメラ（Cunninghamella）、およびサクセナエ(Saksenaea)が包含される。鼻脳ムコール症は、ムコール症の全症例のうち約半分に相当する。これは最も速やかなる致死性を持つ真菌性疾患のひとつであり、治療されない患者は２〜10日以内で死に至る。初期の臨床的所見には、鼻詰まり、鼻からの血液分泌、顔面膨化及び顔面痛が挙げられる。次いで、感染は眼、頭蓋神経及び脳に伝藩する。肺のムコール症は鼻脳疾患とほぼ同様に一般的なものであり、アスペルギルス症と同様の壊死及び梗塞形成を惹起こす。真菌は事実上決して見出されず、あるいは血液、痰または脳脊髄液から培養もされない。播種性のムコール症は、肺または火傷創の感染を伴う。治療にはアンフォテリシンＢが用いられる。カンジダ症は、酵母であるカンジダの種による宿主における転移増殖または感染によって惹起こされる局所または全身性の多様なプロセスを称する概括的な用語である。カンジダ症は全世界において広く発生しており、皮膚、口腔及び他の粘膜の表面感染が一般的である。例えばガン治療に際して、正常な細菌性フローラを破壊する抗生物質、免疫抑制剤、及び骨髄に対して毒性を有する薬剤を高い投与量にて使用することに起因して、侵入性の全身性疾患が問題になってきている。カンジダの播種については、好中球減少が主たる危険因子である。カンジダ症はまた、AIDS患者、臓器移植患者、腸管外栄養を摂取している患者、ならびに放射線治療及び化学療法を行っているガン患者などといった免疫力が低下している個体にも見出される。カンジダ症は、世界中で最も一般的な日和見性の真菌症である。最も一般的な病原学的物質は、カンジダ・アルビカンスである。他の感染性を持つ種には、カンジダ・トロピカリス(C．tropicalis)、カンジダ・パラシロシス(C．parapsilosis)、カンジダ・ステラトイデア(C．stellatoidea)、カンジダ・クルセイ(C．krusei)、カンジダ・パラクルセイ(C．parakrusei)、カンジダ・ルシタナエ(C．lusitaniae)、カンジダ・シュードトロピカリス(C．pseudotropi calis)、カンジダ・ギリエルモンディ（C．guilliermondi）およびカンジダ・グラブラータ(C．glabrata)が包含される。カンジダ・アルビカンスは、通常、ヒトの口腔、咽喉、胃腸管及び膣に見出される。アルビカンス以外の種は、よく皮膚にコロニー形成している。カンジダ種は、温度または宿主に依存せず、２つの型で存在する。通常のコロニー形成型は、特に組織侵入に際して偽菌糸体の形態に見せかけた酵母類である。偽菌糸体は、伸長した生物体の分岐鎖の中に酵母が連続的に出芽して生じる。カンジダ・アルビカンスは、酵母細胞の特定の宿主組織に対する接着を担うと考えられる、細胞壁マンノタンパク質を含んでいる。かかるマンノタンパク質のタンパク質部分よりもむしろマンナン部分が、マウスにおける脾臓及びリンパ節への真菌細胞の接着に寄与しているとの報告がなされている。［Kanbeら、Infection I mmunity、61巻、2578〜2584頁、(1993)］。カンジダ・アルビカンスは、フィブロネクチン、ラミニン、ならびにＩ型及び IV型コラーゲンなどの細胞外マトリックス(ECM)タンパク質（これらはすべて、ヘパリン結合ドメインを含んでいる）にも強固に結合する。このことは、カンジダ・アルビカンスが、ヘパリン様表面分子を発現しているかもしれないことを示唆している。播種性のカンジダ症の病原論において、カンジダ・アルビカンスの ECM への接着が重要であるかもしれない。ヘパリン、ヘパラン硫酸およびデキストラン硫酸グリコサミノグリカン(GAG)は、おそらくはGAG のECM タンパク質への結合が関与する機構によって、カンジダ・アルビカンスのECM およびECM タンパク質に対する接着を阻害し、しかしてこれらの選択的なリガンドをマスキングしていることが立証されている。［Klotz ら、FEMS Microbiology Letters，78 巻、205〜208 頁、(1992)。］臨床的には、カンジダは、表在性の粘膜皮膚感染、慢性の粘膜皮膚カンジダ症、または全身性感染として現れる。表在性の粘膜皮膚感染は、皮膚または粘膜のいかなる領域にも生じうる。AIDS患者において一般に認められる口瘡は、舌、口腔、または他の中咽頭表面を覆う斑状または連続的な、クリーム色から灰色の偽膜により特徴付けられ、潰瘍または壊死を伴う可能性がある。喉頭が冒されると、嗄声が惹起こされる。時として、中咽頭の疾患が拡張して食道炎になる場合があり、胸骨後痛及び嚥下困難の症候を示すかもしれない。腸管のカンジダ症は、通常は非症候性であるものの、免疫力が低下した個体における血液原性の侵入の主因となる。間擦疹は、腋窩、そ径部、乳腺下の襞、及びその他の暖かく湿った領域を冒し、また、赤く侵出性の、または乾燥して鱗状の障害として現れるかもしれない。感染は他の領域で生じる可能性もあり、それら領域には、肛門周囲や生殖器の領域が含まれる。爪の感染である爪囲炎は、手または足が湿気に慢性的に曝されることに伴うことが多い。限定的なＴ−細胞免疫免疫不全を持ついくらかの患者は、慢性的な粘膜皮膚のカンジダ症を併発する。これらの患者は、皮膚、頭皮、爪及び粘膜の、頑固な表面性カンジダ感染に罹患する。全身性カンジダ症のほとんどの症例は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、および増加傾向にあるカンジダ・グラバラータによって惹起こされる。カンジダの感染による臨床的な明示は、眼、腎臓及び皮膚に、主として現れる。眼では、単一または複数の、白い綿毛状の脈絡膜と網膜の障害が生じるかもしれない。これらの障害は、視覚消失の潜在的な原因である。腎臓が冒されると、瀰漫性膿瘍、毛細管壊死及び尿管の閉塞が発症する。感染によって、進行性の腎不全が惹起こされることがある。全身性のカンジダ感染はまた、赤変部分で取り囲まれた斑小結節性の皮膚障害としても現れ、これら障害は、ざ瘡に類似した外観を有するが潜在的致死性を呈する疾患の主な端緒となる。全身性のカンジダ症において他に明示されるものに、骨髄炎、関節炎、髄膜炎、及び脳、心臓、肝臓、脾臓及び甲状腺における膿瘍が包含される。肺が冒されることも一般的であるが、肺障害は、通常小さいので、胸部Ｘ線では認められない。最後に、カンジダ心内膜炎は、長期にわたる静脈内治療または心臓弁インプラントを受けている患者において、または静脈内薬剤の乱用者において発症する可能性がある。真菌による障害は、弁に現れ、大血管に梗塞を形成したり閉塞を起こしうる。表面感染は、10％の水酸化カリウムの存在下で、感染した障害の切屑またはスワブを顕微鏡で調べることによって診断される。カンジダ生物は、グラム染色でも見ることができる。心内膜炎は、血液培養または超音波心臓動態診断で肥厚した弁の障害を証明することによって診断される。全身性カンジダ症は、感染の通常部位での移しいコロニー形成の存在により、播種の発症が示唆されるものの、その立証はなされないので、診断が困難であるかもしれない。全身性カンジダ症の最も信頼のおける証拠は、組織侵入のバイオプシーによる立証、または脳脊髄液、肋膜もしくは腹膜液などの閉鎖系の体腔中の液体からの酵母の回収である。同様に、陽性の血液または尿または痰培養により、侵入性の疾患であるか、または、内在するデバイス、例えばカテーテルまたは静脈内ラインの周囲に単に局在するだけの疾患であるかが示されるかもしれない。粘膜皮膚の感染は、ナイスタチン、アンフォテリシンＢ、クロトリマゾール、ミコナゾール、ハロプロジンまたはゲンチアンバイオレットの局所用製剤で治療されうる。口腔咽頭または食道のカンジダ症は、ケトコナゾールまたはフルコナゾールなどの全身用薬剤を用いて治療することができる。慢性的な粘膜皮膚カンジダ症症候群は、アンフォテリシンＢまたはケトコナゾールなどの、局所または全身用治療薬に感応するかもしれないが、薬物投与が中断されると、しばしば再発する。膀胱炎は、アンフォテリシンＢを用いた膀胱洗浄、またはフルシトシンを経口投与しつつもしくはこの経口投与をせずに、短期間少量のアンフォテリシンＢを静脈内経路で投与することにより治療されうる。心内膜炎は、６から10週間アンフォテリシンＢ及びフルシトシンを併用して、弁の取替を行わなければ、本質的には治癒不能である。しかしながら、療法を用いても、心内膜炎の完全な治癒は必ずしも可能でない。全身性カンジダ症の死亡率は、約50％である。全身性カンジダ症は、フルコナゾール（静真菌剤）、またはアンフォテリシンＢ（殺真菌剤）を用いて治療することができるが、アンフォテリシンＢを全身に用いることは、その毒性により制限がある。双方の薬剤とも、シクロスポリンＡ（それ自体腎毒性を有する）と併用して用いる場合、実質的な副作用を有する。感染を制御するために、静脈内ラインまたはカテーテルなどの促進的(precipitating)因子を除去することも重要である。特に、免疫力が低下していない患者において、全身性カンジダ症を治療するために、フルシトシン療法をアンフォテリシンＢ療法に追加することができる。しかしながら、免疫力が低下した患者では、これらの感染は問題を孕んでおり、有効な治療に抗するものである。かかる患者では、全身性カンジダ症の死亡率は90％を越える。さらに、慢性の粘膜皮膚カンジダ症及びカンジダ性心内膜炎は、治癒したと言明された後に疾患の証拠が示されることがしばしばある。当該技術分野において、新しい抗真菌方法および材料に対する要求は現存し続けている。特に、全身性の真菌症のために有効な抗真菌療法は限られている。この要求に応じる産物および方法には、理想的には、合成法または組換え法により大量に入手可能な、実質的に非毒性の化合物が包含されよう。理想的な化合物は、唯一の抗真菌剤として投与または適用した場合に種々の異なる真菌種に対して迅速な作用、ならびに広範なる殺真菌または静真菌活性を有するものであろう。理想的な化合物は、他の抗真菌剤との併用療法においても、特に、療法が有効であるために必要とされる抗真菌剤の量をこれらの活性が低減させ、かかる薬剤の効果を増強し、もしくは潜在的な毒性の応答及び治療における価格の高騰を限度あるものにする場合に、有用であろう。発明の要約本発明は、殺菌／浸透性増強タンパク質(BPI)のドメインIII(142〜169 位のアミノ酸)から誘導された、あるいは、それに基づいた新規の抗真菌性ペプチドと、これらペプチドの抗真菌剤としての治療用途での利用に関する。本発明のペプチドの治療的有効量を投与することにより、真菌感染に罹患している被験者を治療する方法において有用である。これは、ドメインIII誘導ペプチドが、殺真菌／静真菌作用を有するという、驚くべき発見に基づくものである。また、これらペプチドが、LPS 中和活性を有していることは、驚きに価する第二の発見である。この活性は、真菌感染の治療において本発明のペプチドを使用する上で有利な点でもある。ドメインIII誘導ペプチドは、単独でも、または既知の抗真菌剤と組み合わせて投与するとよい。被験者に補助的な療法がなされる場合、ドメイン III誘導ペプチドの投与により有効な治療のために必要とされる抗真菌剤の量を減じることができ、しかして、潜在的な毒性応答及び／または治療に要する価格の高騰が限度あるものになる。ドメインIII誘導ペプチドの投与はまた、かかる薬剤の作用を増強し、かかる薬剤の作用を促進し、あるいは、このような薬剤に対する真菌の耐性を無効にするかもしれない。加えて、本発明は、真菌をドメインIII誘導ペプチドに接触させることを含む、殺真菌または真菌生長阻害の方法を提供する。この方法は、in vivo、または液体及び表面の浄化のため、ならびに、補綴用の関節及び内在する侵入デバイスを包含する、外科用及び他の医療用装置及び埋込可能なデバイスを滅菌するための多岐にわたる in vitro 用途などで、実施することができる。本発明のさらなる特徴には、真菌感染の治療のための医薬製造のためのドメインIII誘導ペプチドの使用が包含される。医薬には、ドメインIII誘導ペプチドに加えて、抗真菌剤などの他の化学療法剤が含有されうる。当業者には、本発明の現在好ましい実施態様を記載した、以下の発明の詳細な説明を考慮すれば、本発明の多くの付加的な特徴や利点が明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、カンジダ・アルビカンスに対する様々なペプチドの活性に関するブロスアッセイ試験の結果を示す。図2Aおよび2Bは、カンジダ・アルビカンス SLU-1（図2A）およびカンジダ・アルビカンス SLU-1（図2B）に対する様々なペプチドの活性に関する放射拡散試験の結果を示す。図３は、カンジダ・アルビカンスに対するアンフォテリシンＢとペプチドの組み合わせによる活性に関するブロスアッセイ試験の結果を示す。図４、５および６は、カンジダ・アルビカンスによる攻撃、ならびにペプチドまたは緩衝液を用いた処置後のマウスにおける生存データをグラフにより表す。図７は、カンジダ・アルビカンスによる攻撃、ならびにペプチドまたは緩衝液を用いたシクロスポリン処置後のマウスにおける生存データをグラフにより表す。図８は、様々なペプチドの活性に関するRAW 細胞アッセイ試験の結果を示す。図９は、E．coli 0111: B4 LPSによる攻撃、ならびにペプチドで処置したマウスにおける生存データをグラフにより表す。発明の詳細な説明本発明は、ドメインIII誘導ペプチドが抗真菌活性を有し、また、真菌感染に罹患した被験者を治療するために投与できるという驚くべき発見に関連する。これらペプチドによって、真菌感染を治療する方法も提供するものである。予期せざることに、ドメインIII誘導ペプチドは、in vitro殺菌分析系ならびに真菌感染の in vivoモデルにおいて、例えば真菌による攻撃後の生存が向上することもしくは循環系でのコロニー形成単位が減少することなどによって判定して、双方で抗真菌活性を有することが立証された。アスペルギルスによって惹起こされる感染、クリプトコッカス性髄膜炎などのクリプトコッカスにより惹起こされる感染、ならびにカンジダ種によって惹起こされる粘膜皮膚及び全身性カンジダ症を包含する種々の真菌感染を、本発明によって治療することができる。さらに、予期せざることに、in vitro分析系ならびに真菌感染の in vivoモデルにおいて、ドメインIII誘導ペプチドが、LPS 中和活性を有していることが実証されたのである。この活性は、トランスロケーションあるいは感染拡大に起因する細菌性 L PSが、真菌感染に関連している場合に、真菌感染の治療において有利である。本明細書で使用する「ドメインIII誘導ペプチド」の語は、抗真菌活性を有する、BPI タンパク質の第 142〜 169位のアミノ酸配列、そのサブ配列、およびその配列の変異体あるいはその変異配列のサブ配列を含む。特に意図しているのは、６〜14個のアミノ酸と、BPI タンパク質の約 148〜約 161位のアミノ酸配列、そのサブ配列、およびその配列の変異体あるいはその変異配列のサブ配列を含んだ抗真菌性ペプチドである。好ましいペプチドは、14個のアミノ酸を有し、そして、好ましい変異配列あるいはそのサブ配列は、第 152位のＧに対応するアミノ酸がＫになっている配列である。 14個のアミノ酸を有する好ましいペプチド配列は、LIQL、IQLF、WLIQL、LIQLF およびWLIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列あるいはこれら配列に対して少なくとも75％の相同性を示すコアアミノ酸配列変異体を有しており、配列番号：４(XMP.13)、６〜19(XMP.31-44)、21〜22(XMP.82-83)、23〜25(X MP.85-87)、26〜27(XMP.91-92)、28〜31(XMP.94-97)、32〜33(XMP.100-101)、34 (XMP.104)、35〜40(XMP.106-111)、41(XMP.113)、42(XMP.116)、43〜55(XMP.123 -135)、57〜58(XMP.138-139)、59〜61(XMP.142-144)、62(XMP.146)、66〜78(XMP .222-234)、80〜88(XMP.236-244)、89〜109（XMP.249-269）および116(XMP.283) に記載のペプチドがある。抗真菌性の14mer のペプチドのこのグループは、少なくとも一つのBPI 配列残基が、D-異性体アミノ酸で置換された変異配列ペプチドを含む。例えば、配列番号：46(XMP.126)、48(XMP.128)、86〜87(XMP.242-243) および92〜93(XMP.252-253)を参照のこと。不定型のアミノ酸、例えば、β（1- ナフチル）Ａ、β（2-ナフチル）Ａ、パラ−アミノＦ、シクロヘキシルＡ、α− およびγ−アミノ酪酸、αメチルＡおよびＮメチルＧ、ＶおよびＬによるBPI配列の置換に関与する変異配列もこのグループに属する。７〜12個のアミノ酸を有する本発明の好適なドメインIII誘導抗真菌性ペプチドは、(a)LIQL、IQLF、WLIQL、LIQLF およびWLIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された一つ以上のカチオン性アミノ酸を含む。７〜９個のアミノ酸を有するこのペプチドのサブセットは、(a)LIQL およびIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸を含む。８〜10個のアミノ酸を有するこのペプチドの他のサブセットは、(a)LIQLFおよびWLQLF からなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸を含む。９〜12個のアミノ酸を有するこのペプチドのさらに他のサブセットは、(a)WLQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも三つのカチオン性アミノ酸を含む。これらサブセットの例として、配列番号： 118〜137(XMP.285-304)、140〜144(XMP .307-311)、155〜160(XMP.322-327)、166〜170(XMP.335-339)、174〜177(XMP.34 3-346)、179〜184(XMP.348-353)、186(XMP.355)、188〜190（XMP.357-359）がある。上記したペプチドの構造の考察から明らかな通り、BPI アミノ酸の第 148〜16 1 位にあるドメインIII配列が、上記したコア配列とこのコア部分に作用する複数のカチオン性残基（ＫとＨ）を含む。この部分は、本発明の抗真菌性ペプチドをもたらす第 148〜161 位の配列のサブ配列構造まで移動し、第 148〜161位の抗真菌性変異配列およびそのサブ配列にて保存される。例えば、BPI 配列の第 1 52位に通常は位置するＧ残基がＫ残基で置換され、これによって、支配的な疎水性コア残基の直近にカチオン性残基が到達するように作用する。本発明による抗真菌性ペプチドをもたらす配列と変異サブ配列は、通常はコア配列に作用している一つ以上の非カチオン性残基が、カチオン性残基で置換された配列であって、本発明のペプチドはこの配列を含むペプチドである。このコア配列にて、中性脂肪残基ＬとＩは、中性脂肪残基Ｇ、Ａ、Ｖ、ＩおよびＬによってそれぞれ置換される。同様に、芳香族残基Ｗ(BPIの第 153位)およびＦ(BPIの第 158位)は、異なる芳香族残基あるいは中性脂肪残基Ｇ、Ａ、Ｖ、ＩおよびＬによって置換される。さらに、コア配列Ｑ(BPIの第 156位)は、好ましくは、中性脂肪残基Ｔ、ＳおよびＮによって置換される。上述したように、コア配列に変異作用を及ぼす場合、変異コア配列が、BPI 配列に対して75％の相同性を保持するのが好ましい。本発明の抗真菌性ドメインIIIペプチドは、配列番号： 164(XMP.333)、165(XM P.334)、173(XMP.342)、194(XMP.363)および196(XMP.365)に記載のペプチドに例示したような、一つ以上のD-異性体アミノ酸を有し、また、配列番号：163(XMP. 332)および198(XMP.367)に記載のアミノ酸配列を有するペプチドに例示したような逆方向のD-異性体アミノ酸を有するコアアミノ酸配列を有している。この抗真菌性ペプチドは、配列番号： 162(XMP.331)、185(XMP.354)、187(XMP.356)、195 (XMP.364)、199(XMP.368)および204(XMP.373)に記載のペプチドに例示したような、アセチル化したアミノ末端アミノ酸残基を有することもできる。配列番号： 191〜193(XMP.360-362)に例示したような、環状抗真菌性ペプチドも、本発明の範囲内に含まれる。本発明の他のドメインIII抗真菌性ペプチドは、配列番号：１(XMP.5)、２〜４ (XMP.11-13)、５(XMP.29)、20(XMP.55)、56(XMP.137)、79(XMP.235)、111〜115( XMP.271-275)、117(XMP.284)、132(XMP.299)、138〜139(XMP.305-306)、145〜15 4(XMP.312-321)、200〜203(XMP.369-372)、171〜172(XMP.340-341)に記載のペプチド、および配列番号：206 に記載のBPI残基 145〜159 および 149〜163 を含む。本発明の薬学的組成物は、ドメインIII誘導ペプチドと、薬学的に許容可能な希釈剤、補助剤あるいは担体を含み、局所的、静脈注射的、経口的あるいはエアロゾルにて投与される。本発明の in vitro 法によれば、抗真菌性ペプチドあるいはこれを含む薬学的組成物と真菌を接触させることで、真菌の殺菌あるいは増殖阻害に至る。本発明の真菌感染の治療法は、ドメインIII抗真菌性ペプチドの治療的有効量を、真菌感染の患者に投与することを含み、この治療法は、Candida(特に、C．albicans 、C.glabrata、C．krusei、C．lusitaniae、C．parapsilosisおよびC．tropical is)、Aspergillus および Cryptococcus 種からなるグループから選択された真菌種が関与する感染に対して適用可能である。詳述したように、本発明によって調製した薬剤／薬学的組成物は、非ペプチド性薬剤を含めた他の抗真菌剤を併用することも、あるいは他の薬剤を用いた治療との併用治療においても使用できる。組換え法あるいは合成法によって生成したBPI に由来もしくは基づくペプチド（BPI 誘導ペプチド）は、1994年９月15日出願の米国特許出願第 08/306,473 号に対応する、共有であり係属中の1994年９月15日出願のPCT 出願第US94/010427 号、および、（特に、配列番号：206 に記載のBPI 残基 145〜159 および 149〜163 を有する、重複する15-merペプチドを開示した）1993年３月12日出願の米国特許出願第08/030,644号の一部継続出願である、1993年７月15日出願の米国特許出願第08/093,202号（これに対応する国際出願は、1994年３月11日出願のPCT 出願第US94/02401号である）の一部継続出願である、1994年１月14日出願の米国特許出願第08/183,222号の一部継続出願である、1994年３月11日出願の米国特許出願第08/209,762号に対応する、1994年３月11日出願のPCT 出願第US94/0 2465号（これらはすべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されれている。BPI 抗真菌活性を有する、BPI タンパク質の約 1 42〜 169位のアミノ酸配列、そのサブ配列、およびその配列の変異体あるいはその変異配列のサブ配列を含むBPI-誘導ペプチドは、その開示が本明細書に含まれるものである、1995年１月13日に出願の共同所有に係る係属中の米国優先権出願 No．08/372,105 に開示されている。ドメインIII誘導ペプチドは、全身に、あるいは局所に投与することができる。全身投与の経路には、経口、静脈内、筋肉もしくは皮下注射（長時間放出用のデポ剤に含められる）、眼内または眼球後部、鞘内、腹膜組織内（例えば腹腔組織内灌流による）、エアゾル化または霧状にした薬物を用いた経肺、または経皮経路が包含される。局所経路には、軟膏、眼用滴剤、耳用滴剤、または潅注液（例えば傷の潅注用）剤形での投与が包含される。ドメインIII誘導ペプチドは、現在のところ有効であることが知られている他の抗真菌剤と併用して投与してもよい。この目的のために好ましい抗真菌剤は、アンフォテリシンＢおよびフルコナゾールである。抗真菌剤と共にドメインIII 誘導ペプチドを同時に投与することで、抗真菌剤の治療効果の向上が期待される。このような向上は、例えば複製などの真菌の生長を根絶または阻害するに要する抗真菌剤の濃度を低減することを通して起こるのかもしれない。いくらかの薬剤の使用は、全身性の毒性のためまたはひどく高価格となるために限度があるので、治療効果のために必要な抗真菌剤の濃度を下げることで毒性及び／または治療価格が低減され、しかして、その薬剤をより広範に用いることが許容される。ドメインIII誘導ペプチドと他の抗真菌剤とを同時に投与することで、いずれかの薬剤を単独で用いた場合に達成しうるよりも迅速または完全な殺真菌／静真菌効果が得られるかもしれない。ドメインIII誘導ペプチドの投与は、抗真菌剤に対する真菌の耐性を無効にするかもしれない。ドメインIII誘導ペプチドの投与はまた、静真菌剤を殺真菌剤に変換させるかもしれない。本発明により提供される利点は、現在のところ不治であると考えられている真菌感染、特にカンジダ感染を治療することができることにある。別の利点は、既知の抗真菌剤に対する耐性を有する真菌を処置できることにある。例えば、アンフォテリシンＢなどの望ましくない副作用を有する抗真菌剤と共にドメインIII 誘導ペプチドを同時に投与することのさらなる利点は、有効な治療のために必要な抗真菌剤の量を減じうることにある。本発明は、さらには、例えば、治療期間が短縮され、集中医療ユニットにおける滞在が短縮されまたは、病院全体での滞在が短縮されるために、患者の生活の質における恩典をも提供し、付随的に重大な院内（病院でもたらされる）感染の危険性を減じるものである。本明細書中における「同時投与」には、薬剤を一緒に、または互いに先にもしくは後で投与することが包含される。ドメインIII誘導ペプチドおよび抗真菌剤は、異なる経路によって投与されてもよい。例えば、ドメインIII誘導ペプチドを静脈内投与し、一方抗真菌剤を筋肉、静脈内、皮下、経口または腹膜組織内に投与してもよい。あるいは、ドメインIII誘導ペプチドを腹腔組織内に投与し、一方、抗真菌剤を腹腔組織内もしくは静脈内に投与したり、またはドメインIII誘導ペプチドをエアゾルもしくは霧状の剤形にて投与し、一方、抗真菌剤を例えば静脈内投与してもよい。ドメインIII誘導ペプチドおよび抗真菌剤を、双方とも静脈内投与してもよい。ドメインIII誘導ペプチドおよび抗真菌剤は、同じ静脈内ラインを介して、間に水洗をした後、引き続き与えるか、または異なる静脈内ラインを介して与えてもよい。ドメインIII誘導ペプチドおよび抗真菌剤は、双方の薬剤とも感染の部位において有効濃度に達することを許容するに充分なように与えられる限りにおいて、同時にまたは引き続き投与することができる。ドメインIII誘導ペプチドおよび抗真菌剤の同時投与によって、真菌感染のさらに効果的な治療が提供されると予測される。２つの薬剤の同時投与で、どちらかの薬剤を単独で投与した場合よりも、in vivo において大きな治療効果が提供されるかもしれない。例えば、同時投与によって、同等の治療効果を達成しつつ、一方または双方の薬剤の投与量を低減させることができるかもしれない。あるいは、同時投与によって、いずれかの薬剤を単独で用いた場合に達成可能な効果よりも迅速または完全な殺真菌／静真菌効果が生み出されるかもしれない。治療上の有効性は、首尾良い臨床上の成果に基づくものであり、感染に関わる生物の100 ％を抗真菌剤または薬剤が死滅させることが必要なわけではない。成功は、宿主にとって利となるようにバランスを傾けるよう、真菌を阻害するに充分な、感染部位における抗真菌活性のレベルを達成することに依存している。宿主の防御が高度に効果的である場合には、必要な抗真菌作用は、低くてもよい。１の常用対数（指数10）にまで生物への負荷量を減じてでさえも、感染を制御するための宿主自身の防御が許容されるかもしれない。加えて、初期の殺真菌／静真菌作用を増加させることが、長期間の殺真菌／静真菌作用よりも重要でありうる。これらの初期の成果によって、宿主の防御機構を活性化する時間が与えられるので、かかる成果は重要であり、治療の成功に決定的な部分である。ドメインIII誘導ペプチドは、補体、p15 およびLBP を含む全血または血清、ならびに他の細胞及び免疫系の成分に存在する種々の宿主防御要素と相互作用すると考えられる。このような相互作用は、ペプチドの活性の強化を生じさせるのかもしれない。これらの相互作用のために、ドメインIII誘導ペプチドは、in vi troよりもin vivo でさらに大きな活性を発揮することが期待できる。しかして、in vitro試験でin vivo における実用が予示はされるが、in vitroで活性がないことが必ずしもin vivo において活性がないことを示唆するものではない。例えば、BPI は、旧来の培地を用いたアッセイにおけるよりも、全血または血漿アッセイで、グラム陰性細菌に対してより大きな殺菌効果を呈することが観察されている。［Weiss ら、J．Clin．Invest．90巻、1122〜1130頁(1992)］。これは、旧来のin vitro系が、in vivo におけるBPI の機能を助長するかもしくは強化する血液成分を欠くためか、または、旧来の培地がBPI タンパク質産物の典型的な活性阻害剤であるマグネシウムおよびカルシウムを生理学的濃度よりも多量に含有しているからかもしれない。さらに、宿主において、ドメインIII誘導ペプチドは、グラム陰性細菌の転位を中庸化し、付随する菌体内毒素の放出を無効にするのに役立ち、抗真菌活性のin vitro 試験によって認められないまたは予測されないさらなる臨床上の利益を提供する。ドメインIII誘導ペプチドを、当該ペプチドの抗真菌活性を包含するペプチドの活性を強化する他の産物と共に投与することも意図される。例えば、血清補体は、BPI タンパク質産物の殺グラム陰性細菌活性を強化し、BPI タンパク質産物と血清補体との組合せによって、相乗的な殺細菌／生長阻害効果が提供される。例えば、Ooi ら、J．Biol．Chem.、265巻、15956頁、(1990)、及びBPI殺細菌活性を強化する、天然に存在する15 kDタンパク質について述べられている、Levy ら、J．Biol.Chem.，268 巻、6038〜6083頁(1993)を参照されたい。また、1993 年７月14日出願の米国特許出願第08/093,201号の一部継続出願である、1994年７月11日出願の米国特許出願第 08/274,303 号に対応する、1994年７月13日出願の共有で係属中であるPCT 出願第US94/07834号も参照されたい。これらの出願は、すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものであり、リポ多糖結合タンパク質(LBP)およびLBP タンパク質産物を投与することによってBPI タンパク質産物の殺グラム陰性細菌活性を強化する方法が記載されているものである。CD-14 免疫促進特性を欠いたLBP タンパク質誘導体および誘導体ハイブリッドが、1993年６月17日出願の米国特許出願第 08/079,510 号の一部継続出願である、1994年６月17日出願の、共有で係属中である米国特許出願第08/261,660号に対応する、1994年６月17日出願のPCT 出願第US94/06931号に記載されており、これらの出願は、すべて引用することによってその開示が本明細書に含まれるものである。1995年１月13日出願の、Lambert、米国出願第08/372,104号に記載されているように、ポロキサマー界面活性剤がBPI タンパク質産物の抗細菌活性を増強させることも観察されており、ポロキサマー界面活性剤は、抗真菌剤の活性をも増強するのかもしれない。本発明の理論に拘束されず、ドメインIII誘導ペプチドが種々の作用態様を有するかもしれないと考えられる。このペプチドは、そのヘパリン結合能を通して、細胞外マトリックスへの真菌の結合を妨害するのかもしれない。例えば、カンジダのヘパリン様表面分子が、細胞外マトリックスおよび宿主組織への酵母の接着を媒介すると考えられている。このペプチドは、真菌の細胞質膜上への直接的な作用もしているかもしれない。加えて、このペプチドは、グラム陰性生物のLP S に構造的に類似している、または標的宿主組織への接着の原因である、真菌細胞壁マンノタンパク質に結合し、しかして宿主組織との真菌の相互作用が干渉されるかもしれない。真菌のマンナンへの結合は、ペプチドの細胞質内膜への接近も促進するかもしれない。さらに、真菌感染は腸菌叢(flora)および／またはLPS のストレス誘導性転位を惹起こすかもしれないので、このペプチドは、グラム陰性細菌を殺傷し、LPS を中和することによって有益に作用するかもしれない。最後に、本発明によるドメインIII誘導ペプチドの抗真菌活性は、その独特の構造によるものかもしれない。例えば、ドメインIIIに含まれる６つのアミノ酸(WLIQ LF)の配列と５つと４つのアミノ酸(LIQL、IQLF、 WLIQLおよびLIQLF)の配列は、中性親水性アミノ酸であるグルタミン(Q)を除けば、疎水性のアミノ酸配列を構成する。この疎水性部分は、そのＮ−およびＣ−末端にて高カチオン性の（極性）リシンによって結合されている。この部分は、リーダー／シグナルペプチドならびに膜タンパク質の膜内外部分のように思われる。Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａのような脂肪アミノ酸は、背骨水素結合を形成する能力を持っているので、12〜15個の非極性アミノ酸の配列が形成されれば、疎水性膜環境下では、経膜性のα−フェリック構造をつくる顕著な傾向がある。ＷやＦのような芳香族疎水性アミノ酸も、膜のα−フェリックに取り込まれる。ドメインIIIの疎水性部分の中央にある中性の親水性のグルタミンは、エルゴステロールのような他の真菌膜成分と水素結合に関与し、そして、殺真菌活性において重要な役割を果たす。10個のアミノ酸からなる短鎖(例えば、XMP.293)は、脂質二重層に至るに十分な長さとは言えず、膜崩壊をきたす両親媒性のカチオン性抗生物質ペプチドとは違った多様な作用機序を有しているものと考えられる。６〜12個のアミノ酸とカチオン性アミノ酸で結合した中性アミノ酸のコア部分からなる短鎖部分は、脂質二重層に至るに十分な長さとは言えず、よって、長鎖ペプチドよりも効率善く脂質二重層を横断できると考えられる。細胞内部にまで輸送された場合、カチオン性／中性／カチオン性分子は、細胞壁の炭水化物合成のポリアミン調節による拮抗阻害および／またはポリアミン合成のフィードバック阻害のいずれかによって、内因性ポリアミン（スペルミジン、スペルミン、プトレッシン）の機能を阻害するであろう。加えて、本発明は、真菌をドメインIII誘導ペプチドに接触させることを含む、真菌の殺傷または生長阻害の方法を提供する。この方法は、in vivo または、食物の調製における用途、もしくは液体及び表面の浄化のため、もしくは、補綴用の関節を包含する、外科用及び他の医療用装置及び埋込可能なデバイスを滅菌するための用途など、種々のin vitro用途において、実施することができる。これらの方法は、しばしば感染の病巣である、静脈内ライン及びカテーテルなどの内在する侵入デバイスの in situ滅菌のためにも用いることができる。本発明のさらなる特徴には、真菌感染の治療用医薬の製造のためのドメインII I誘導ペプチドの使用が包含される。医薬には、BPI タンパク質産物に加えて、抗真菌剤などの他の化学療法剤が含まれる。医薬は、製薬的に容認されうる希釈剤、佐剤または担体を随意に含むことができる。抗真菌性ペプチドの投与は、好ましくは、ペプチドおよび製薬的に容認されうる希釈剤、補助剤または担体を含む、医薬組成物を用いて成し遂げられる。このペプチドは、既知の界面活性剤、他の化学療法剤または付加的な既知の抗真菌剤と併用してまたは併用せずに投与することができる。以下の例示的な実施例を考慮して、本発明の他の特徴および利点が理解されるであろう。すなわち、実施例１では、ペプチドの調製と精製が述べられており；実施例２では、ペプチドのin vitro抗真菌性試験についての報告がなされ；実施例３は、カンジダ株と抗生物質耐性株を含む、様々な真菌種に対するペプチドの in vitroとin vivo 試験について述べられており；実施例４には、カンジダに感染したマウスの生存率に関するペプチドのin vivo 効果が示されており；実施例５では、ペプチドの血清安定性について報告がなされ；実施例６は、構造と最小機能配列の分析のための抗真菌ペプチドの設計と分析について報告しており；実施例７では、抗真菌ペプチドのLPS 中和活性が、そして実施例８には、ペプチドの製剤化について言及されている。実施例１ペプチドの調製と精製本実施例は、ドメインIII誘導ペプチドの調製と精製に関する。このペプチドは、様々な合成法によって調製することができる。あるペプチド (例えば、XMP.5)は、親出願の米国特許出願第 08/209,762 号および第 08/183,2 22 号に記載された方法に従い、Applied Biosystems社のModel 432ペプチド合成機を用いて、Merrifield、J．Am．Chem．Soc.,85巻、2149頁(1963)およびMerrif ieldら、Anal．Chem.,38巻、1905〜1914頁(1966)の方法によって、固相ペプチド合成によって調製した。あるいは、これらペプチドは、1-フルオレニルメチル−オキシカルボニル(Fmo c)保護処理を利用する Advanced Chemtech(ACT-Model 357 MPS)合成機にて、N,N -ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)/1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt) および2-(1-H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)/HOBt/ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いたダブルカップリング法による固相ペプチド合成法によって大量に合成される。使用した固相支持体は、１％ジビニルベンゼン(DVB)架橋剤と0.44 mmol/ｇの置換率の 4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)−フェノキシ（Fmoc- Rink アミド）リンカーを含むポリスチレン樹脂であった。使用したスケールは、出発樹脂の 0.1〜５ｇであった。ジメチルフォルムアルデヒド(DMF)は主たる溶剤であり、ピペリジン/DMFの50/ 50 溶剤は、１、５および10分時点それぞれでのFmoc保護を解消するために使用した。ダブルカップリング法は各サイクルにて、各カップリングにおいて４：１のアミノ酸：ペプチドの比率で用いた。アミノ酸は、0.5Mの濃度にて、Ｎ−メチルピロリディノン(NMP)を含む0.5MのHOBt溶液に溶解した。最初のカップリングのために、（アミノ酸と）等モル量の、NMP を含む0.5Mジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI)の溶液を用い、そして、45分間反応せしめた。DMF を含んだ（アミノ酸と）等モル量の0.5M HBTU 溶液と、NMP を含んだ等量の1M D IEA（2:1、DIEA: アミノ酸）を用いて、第二のカップリング反応を30分間行った。合成が完了次第に、樹脂をメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥し、トリフルオロ酢酸(TFA):チオアニゾール：エタンジオール(EDT):水を、36：２：１：１の比率（体積は樹脂量に応じて調製する）で含むカクテルを用いて、少なくとも２時間、湿氷浴中に置いて最初の15分でアルギニンが認められれば、各アルギニンについて30分追加した（ただし、３時間を超えない）時間にわたって、遊離せしめる。この溶液を10％のTFA 水溶液に溶解し、メチルｔ−ブチルエステル(MTB E)で３回洗浄し、そして、凍結乾燥した。選抜したペプチドのアミノ末端を、固相合成後に、上記したＮ末端 Fmoc 保護法を用いてアセチル化した。ピペリジンによる Fmoc 除去の後で、かつ TFAによるペプチドの遊離の前に、10倍以上のモル濃度の無水酢酸と、ジメチルホルムアルデヒド中の２倍以上のモル濃度のジイソプロピルエチルアミンを用いて、樹脂上のペプチドを１時間誘導した。このペプチドを、上述したTFA 遊離カクテルを用いて樹脂から遊離せしめ、そして後述するようにして精製した。精製したペプチドのＮ末端のアセチル化を、質量分光測定法によって確認した。新たに合成された各ペプチドの純度分析のために、粗製の凍結乾燥したペプチドの希釈液を調製し、150mm×１mm、５μ径、300Å孔径の C-8 Zorbax カラムを備えた Michrom Ultrafast Microprotein 分析機にて分析した。カラム・オーブンを、40℃に設定し、流速を 100μl/分とし、そして、注入量を５〜10μｌとした。移動相Ａを５％アセトニトリル／0.1 ％TFAの水溶液とし、そして、移動相Ｂに80％アセトニトリル/0. 065％TFA を用いたHPLCを行った。溶出物を、214nm にて分光測定法によって観察した。純度（％）を、各ペプチドに関するピーク面積（表１参照）から算出した。選抜したペプチドを、40×10mmの防護カートリッジと40×100mmの Prep Pak カートリッジからなる、15μm、300Å孔径のカートリッジカラムである、デルタ Pak C-18 を備えたWaters Prep LC 2000調製用クロマトグラフィーシステム(Wa ter Corp.,ミルフォード、マサチューセッツ州)を用いて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。このカラムは、移動相Ａを５％アセトニトリル／0.1 ％トリフルオロ酢酸、そして、移動相Ｂに80％アセトニトリル/0.065％トリフルオロ酢酸を用いた、25％の緩衝液Ｂで平衡化した。ペプチドを、緩衝液Ｂに 20mg/ml程度になるまで溶解し、その 200〜 800mgを、LCポンプを介して、８〜17ml／分の流速でカラムに導入した。（ペプチドよっては、23〜33％緩衝液Ｂ／30分の勾配で精製した。）溶出物を、プログラム可能な多波長検出器 Wat ers490Eを用いて、220および／または 280および 300nmにて観察した。画分を回収し、そして、40℃に維持した、150×１mm、５μm、300Å孔径の Zorbax C-8 を備えた Ultrafast Micro-protein 分析機（Michrom BioResources社、プラサントン、カリフォルニア州）にて対象となるペプチドの分析を行った。95％以上の純度のこれらペプチドを含む画分をプールし、そして、凍結乾燥した。復元したペプチドの純度を、分析用逆相HPLCを用いて決定した。実施例２ IN VITRO 抗真菌効果本実施例は、ブロスアッセイおよび／または放射拡散アッセイでの抗真菌活性に関する、ドメインIII誘導ペプチドの in vitroスクリーニングに関する。以下の表１に、BPI のドメインIIIの配列より由来するまたはそれに基づいたペプチドが示されている。これらペプチドは、接頭のXMP またはBPI に伴うペプチド番号（例えば、XMP.1 またはBPI.1、XMP.2 またはBPI.2）によって特定される。表１では、各ペプチドの配列番号、BPI の中での参照位置に基づいたアミノ酸配列ならびにアミノ酸置換及び付加の標記によっても識別される。さらに表１には、それらペプチドのHPLCによる純度の評価についても示した。HPLC純度分析は、実施例１に記載の方法に従った。各ブロスアッセイスクリーニング法において、CA-1と名付けたカンジダ・アルビカンス、SLU#１株は、セントルイス大学病院、セントルイス、ミズーリー州の G.Matuschak および A.Lechnerの研究室から受領したものであり、このコロニーを、５mlのサブローデキストロースブロス（２％デキストロース、１％ネオペプトン）を含有するチューブに接種し、振盪しつつ37℃にて一晩インキュベートした。一晩培養した培養物を５mlの新鮮なブロスにて１：50に希釈し、37℃にて３時間インキュベートした。生物をBeckman J-6M遠心機において3000rpm(1500×ｇ )にて５分間遠心することでペレットとし、そのペレットは５mlのリン酸緩衝性生理食塩水(PBS)に再懸濁して、570nmにおける吸光度を測定した。１OD単位は３ ×10⁷コロニー形成単位/ml に等しいという測定結果に基づいて、酵母細胞をサブローデキストロースブロス中、２×10⁶細胞/mlに希釈した。スクリーニングすべきBPI 由来のドメインIII誘導ペプチドまたはBPI に基づくドメインIII誘導ペプチドは、元はダルベッコ−PBS において構成されていたが、ブロス中 100μg/mlに希釈し、そして、96ウェルの滅菌した、平底の発熱物質不含の組織培養プレート（Costar、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のウェルの中へ連続的に２倍希釈した。すべてのアッセイは、３重検定で実施した。２×10⁵の生物をウェル当たり100 μｌにて添加して、プレートを37℃にて18時間振盪機でインキュベートし、そして各ウェルについての吸光度を、590 nmにて読み取った。本明細書に添付した図１に、５つのペプチド(XMP.13、XMP.138、XM P.139、XMP.142 およびXMP.143)に対する用量曲線をグラフで示す。示した全ペプチドが、培養物の吸光度を約50μg/mlを下回る用量において0.1 を越えない数値にまで減じさせたが、XMP.138 が、示したペプチドのうち低用量で最も良い結果を呈した。最小阻害濃度(MIC)、すなわち、590nmにおける吸光度を0.1 を越えない数値に減じさせるに要する最低濃度によって、ブロスアッセイのデータを表す。図１にある上記した５つのペプチドの各MIC(μg/ml)は、それぞれ、12.5、3 .13、6.25、12.5および25.0であった。放射拡散アッセイ法において、CA-1培養物およびペプチド溶液を、前記のブロスアッセイ法におけると同様に調製した。３％サブローデキストロースブロス、１％アガロース(Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州)、0.02％Tween 2 0、および10mMリン酸ナトリウム、pH 7.4を含む、10mLの融解した下層アガロースをポリスチレンチューブに加え、酵母を添加するまで、56℃の水浴中に保持した。チューブをおよそ45℃にまで冷却し、酵母を添加して１×10⁶CFU/mlの最終濃度となるようにし、チューブを反転させることにより再度混合した。内容物を平坦な四角形のペトリ皿に注加し、平均に分布させた。アガロースは30秒経たないうちに固化し、約１mmの均一の厚みを有していた。固まったアガロースに、真空装置が装着された滅菌した３mmの穿孔器を用いて、一連のウェルを穿孔した。アッセイすべきペプチドは、およそ１mg/mL の濃度から始めて、ダルベッコPB S(D-PBS)で連続的に２倍に希釈していった。各希釈液のうち５μL を、各々のウェルに加えて、プレートを37℃にて３時間インキュベートした。次いで、６％サブローデキストロースブロス、１％アガロース、および10mMリン酸ナトリウム、 pH7.4(およそ45℃)を含む、10mLの融解したアガロース上層を加え、プレートを3 7℃にて一晩インキュベートした。この一晩にわたるインキュベーションに続き、希釈したクーマシー溶液をプレートに注加し、24時間染色させた。各ウェルを取り囲む生長阻害の清澄域を、カリパスを用いて測定した。実際の生長阻害面積(mm²)は、ウェルの面積を引くことで算出した。以下の表１に、PRO BIT分析によって（例えば、log pmolと阻害正規面積の関係を示す濃度用量作用曲線の対数曲線の直線部分からの回帰から）算出した、30 mm²の生長阻害面積をなすために必要なペプチドのピコモル数（pmol）によって、調べたペプチドについての放射拡散アッセイの結果を表す。実施例３様々な真菌種に関する抗真菌性ペプチドの IN VITROおよびIN VIVO での効果本実施例では、カンジダ種および様々な抗真菌剤に対して耐性を有する株を含めた真菌種に対する、放射拡散分析での、様々なドメインIII誘導ペプチドのin vitroおよびin vivo スクリーニングについて述べる。本実施例は、カンジダ株S LU-1 に対する、ペプチドとアンフォテリシンＢとの併用による効果についても述べている。アンフォテリシン耐性カンジダ株に関して、ドメインIII誘導ペプチドの殺真菌活性について試験した。カンジダ株の耐性コロニーを、傾斜プレート法を用いて単離した。スラントのサボローデキストロース寒天をプレートに注ぎ、そして固化せしめた。このプレートを水平に置き、10μg/mlの濃度のナイスタチン(Sig ma社、セントルイス、ミズーリー州、カタログ番号第N-3503)を補充した寒天を足した。実施例２に記載のカンジダアルビカンスSLU-1 株のCA-1コロニーから得た細胞(100μl 中に10⁷個の細胞)をプレートに播き、37℃で、一晩インキュベートした。当初は、微細なコロニーが確認され、野性株のコロニー程度の大きさになるまでインキュベーションが必要であった。11個の各コロニーを、SLU-2AからSLU-2Kと、順次命名した。これらのコロニーは、２μg/mlのアンフォテリシンＢによる最初の馴養の後、アンフォテリシンＢの濃度を高めたサボローデキストロースブロスで連続的に馴養した。20μg/mlのアンフォテリシンＢによる最後の馴養の後、コロニー2G、2H、2Jおよび2Kは生存していたが、野性株SLU-1 株は１ μg/mlのアンフォテリシンＢに対して感受性を有していた。いずれの耐性株にも、胎児ウシ血清での胚管の形成は認められなかった。さらに、これら単離物の成長速度はSLU-1 より格段に遅く、37℃では、菌糸を形成しなかった。放射拡散分析のために、カンジダアルビカンスSLU-1 を上記したようにして成長せしめ、そして、10μg/mlのアンフォテリシンＢと５μg/mlのセフトリアキソンを補充したサボローデキストロースブロスにて、37℃で、一晩成長せしめた。新鮮な、補充物を含まないブロスで、この培養物を１：25に希釈し、37℃で、５時間成長せしめた。４℃で、1,500×ｇ、５分間という遠心条件で、細胞をペレット化した。上清を傾ちょうし、pH 7.4の10mM燐酸緩衝液の５mlと交換した。遠心分離後、OD₅₇₀での計測のために、細胞ペレットを５mlの燐酸緩衝液で再懸濁した。SLU-1 細胞のOD₅₇₀は３×10⁷CFU/mlであり、また、SLU-2G細胞のOD₅₇₀ は５×10⁶CFU/mlであった。 10mlの溶解および冷却（−45℃）した下層アガロースに、１×10⁶/mlの濃度になるまで細胞を添加し、懸濁液を平底ペトリ皿に注ぎ、ゆっくりと揺らしながら均一に分布および固化せしめて、約１mmの厚みになるようにした。ウェルから、真空装置を備えた滅菌した３mm径のパンチで、固化アガロースを切り出した。ペプチドを、D-PBS で、約１mg/ml の濃度から連続的に２倍ずつ希釈した。アンフォテリシンＢとナイスタチンも、それぞれ、100および 225μg/mlの濃度から同様にして希釈した。各ウェルに５μl を添加し、37℃で、1.5〜 2.0時間拡散せしめた。そして、10mlの溶解した上層のアガロースを添加し、プレートを倒立させて、37℃で、一晩インキュベートした。プレートを希釈したクーマシー溶液で染色し、阻害面積をカリパーで計測し、正規面積を算出し、そして、PROBIT 分析によって pmol 値に換算した。各実験の結果を、SLU-1 株については図2Aに、そして、SLU-2G株については図2Bに表した。図2Aと図2Bにて、XMP.13 の抗真菌活性を白抜円で、XMP.37を黒塗円で、XMP.97を白抜三角で、XMP.127 を黒塗三角で、アンフォテリシンＢを白抜四角で、そして、ナイスタチンは黒塗四角でそれぞれ表した。30mm²の阻害領域を形成するpmolは、XMP.13は、SLU-1 に対して689pmol、SLU-2Gに対して129pmol であり；XMP.37は、SLU-1 に対して231 pmol、SLU-2Gに対して75pmolであり；XMP.97は、SLU-1 に対して670pmol、SLU-2 Gに対して161pmol であり；XMP.127 は、SLU-1 に対して935pmol、SLU-2Gに対して116pmol であり；アンフォテリシンＢは、SLU-1 に対して36pmol、SLU-2Gに対して＞541pmol であり；そして、ナイスタチンは、SLU-1 に対して98pmol、SLU- 2Gに対して＞1215pmolであった。図2Aと2Bに示したように、XMP.13、XMP.37、XM P.97およびXMP.127 の各ドメインIII誘導ペプチドは、SLU-1 野性型株とSLU-2G アンフォテリシンＢ耐性株の双方に対して抗真菌活性を示し、これらは、SLU-2G アンフォテリシンＢ耐性株に対して実証された活性より良好であった。対照的に、アンフォテリシンＢは本来のSLU-1 株に対しては効果的であったが、SLU-2G耐性細胞の殺傷には至っていなかった。これら結果は、本発明のドメインIII誘導ペプチドが、アンフォテリシンＢとは異なる作用機構を有した殺真菌剤であることを実証している。他の抗真菌剤に対する耐性を有すると考えられる一般に入手可能なカンジダ株、すなわち、ポリエン耐性のカンジダアルビカンス（ATCC受託番号第38247 号）、5-フルオロシトシン耐性のカンジダアルビカンス（ATCC第 44373号）、アゾール耐性のカンジダアルビカンス（ATCC第 62342号）およびケトコナゾール耐性のカンジダアルビカンス（ATCC第 64124号）に関する、ドメインIII誘導ペプチドの抗真菌活性を決定するための試験をさらに行った。試験した上記株に関するXMP.13、XMP.36、XMP.97、XMP. 127 およびXMP.166 という代表的な各ペプチドによる抗真菌活性は低減されず、このことは、これらペプチドが他の殺真菌剤とは異なる作用機構によって活性を呈していることを示すものである。ドメインIII誘導ペプチドの抗真菌活性を、Candida glabrata（カンジダグラブラタ）、Candida krusei（カンジダクルセイ）、Candida lusitaniae（カンジダラシタニエ）、Candida parapsilosis（カンジダパラシロシス）、およびCandida tropicalis（カンジダトロピカリス）を含めた様々な真菌種に対して、in vit roで評価した。実験を行うにあたって、サボローデキストロース寒天(SDA)プレートから上記したカンジダ株それぞれの１コロニーを採取し、そして、５mlのサボローデキストロースブロス(SDB、２％デキストロースおよび１％ネオペプトン)に、Candida kruseiについては、酵母モルトブロス（YM、Becto n Dickenson、コッキースビル、メリーランド州、カタログ番号 BL11405）を収めた12mlのポリプロピレン製の留め蓋式チューブに接種した。チューブでの培養物は、振盪しながら、37℃で、一晩インキュベートした。この培養物の１：10の希釈液のOD₅₇₀での計測が、Candidaglabrataについては 0.083、Candida kruseiについては 0.154、Candida lusitaniaeについては 0.1 17、Candida parapsilosisについては 0.076、およびCandida tropicalisについては0.192と、同等もしくは上回った時に培養物を回収した。3,000rpm（約 1,50 0×ｇ）にて、エッペンドルフマイクロフュージにて、７分間、細胞を遠心分離した。細胞ペレットを１mlの燐酸緩衝液で再懸濁し、約 0.5ml中の約１×10⁷個の細胞を、10mlの冷却した下層寒天（３％SBD、１％寒天、0.02％Tween 20、10 mM燐酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、約５℃）に添加した。この懸濁液を角形ペトリ皿に注いで固化せしめ、そして、上述したようにてウェルを切り出した。ペプチドを、D-PBS で、約１mg/ml の濃度の約20μl から連続的に２倍ずつ希釈した。各ウェルにペプチド希釈液の５μl を添加し、（完全に拡散するように）37℃で、少なくとも約30分間拡散せしめた。そして、10mlの溶解した上層のアガロース（６％SDB、１％寒天、10mM燐酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、約45℃）を添加し、プレートを倒立させて、37℃で、一晩インキュベートした。プレートを希釈したクーマシー溶液で染色し、阻害面積をカリパーで計測し、正規面積を算出し、そして、PROBIT分析によって pmol 値に換算した。各実験の結果を、表２に表した。例えば、ドメインIII誘導ペプチド、XMP.13P、XMP.97P、XMP.127P 、XMP.166P、XMP.286P、XMP.327P、XMP.331P、XMP.332P、XMP.333PおよびXMP.33 7Pは、試験の用いたカンジダ株の少なくとも数種に対して抗真菌活性を示した。これら結果は、本発明のドメインIII誘導ペプチドが、様々なカンジダ種に対する抗真菌剤として広範に効果を及ぼすことを実証するものである。ペプチドとアンフォテリシンＢの組み合わせによる、カンジダ株SLU-1 に対する効果を研究した。この実験を行うにあたって、ペプチド単独、アンフォテリシンＢ単独、あるいはペプチドとアンフォテリシンＢの併用の場合に、試験に用いる真菌細胞と共にインキュベートすることを除けば、カンジダアルビカンス S LU-1を、実施例２と同様にして成長せしめ、そしてブロス希釈分析にて分析を行った。代表的なペプチドXMP.97の単独使用、あるいはアンフォテリシンＢと併用した場合の分析結果を、図３に示した。図３にて、XMP.97とアンフォテリシンＢの併用による殺真菌活性を、XMP.97の濃度と、0.047μg/ml（白抜四角）、0.074μg/ ml（黒塗三角）、0.188μg/ml(白抜三角： 0.375μg/ml(黒塗円))および 0.750 μg/ml（白抜円）のアンフォテリシンＢの濃度によって表示した。XMP.97単独での活性を、黒塗四角で表した。XMP.97とアンフォテリシンＢは共に、それぞれ単独で用いてもある濃度までは、抗真菌剤として効果がある。ペプチドとアンフォテリシンＢとの併用は（これら二つの薬剤が、拮抗薬であるかのように）阻害活性には結びつかないが、むしろ、最大の殺真菌効果を得るに必要な双方の抗真菌剤の量を減少せしめる結果をもたらすものである。特に、ドメインIII誘導ペプチドと、アンフォテリシンＢのような抗真菌剤の同時投与は、真菌の根絶あるいは真菌の成長阻害に必要なアンフォテリシンＢの濃度が低減されることにより、治療効果の改善に寄与するものである。アンフォテリシンＢは、その全身的毒性のためにその使用が制限されていたので、治療効果を得るに必要な抗真菌剤の濃度を低減することは、毒性の低下を招くものであり、結果としてこの抗真菌剤の用途拡大を許容することにもなる。ドメインIII誘導ペプチドの抗真菌活性を、クリプトスポリジウムパルヴム( Cryptosporidium parvum)、クリプトコッカスネオフォルマンス(Cryptococcus n eoformans)およびヒストプラスマカプシラタム(Histoplasma capsilatum)を含めた様々な真菌種に対して、動物モデルにてin vito で評価した。C.parvumに関する動物モデルには、国立アレルギーおよび感染症疾患センター(National Inst itute of Allergy and Infectious Diseases)より契約に基づいて供給された、重度合併免疫不全(SCID)マウスと、初乳欠乏 SPF子ブタのモデルが含まれていた。実施例４全身性のカンジダ感染を有するマウスにおけるペプチドの IN VIVO抗真菌効果本実施例では、カンジダ・アルビカンスを全身に感染させたマウスの総死亡数または死亡率の軽減において、ドメインIII誘導ペプチドのin vivo 抗真菌効果を示す。実施例２に記載した放射拡散およびブロスアッセイで抗真菌活性についてスクリーニングしたペプチドを、実施例１に記載の通りに調製および精製した。６〜８週齢の雄性DBA/2Jマウス（Jackson Laboratory、BarHarbor、メイン州）15匹の５つの群に、尾静脈への静脈注射により1.24×10⁵のカンジダ・アルビカンス（実施例２に記載のSLU-1 株）を接種した。動物への注射のために、以下のようにして細胞を調製した。単一コロニーを選抜し、サボローデキストロースブロスを含有する５mlのチューブび接種した。30℃で通気しながら震盪して、15 〜18時間、インキュベーションを行った。終夜培養物の４mlを、100ml の新鮮サボローデキストロースブロス（1:25に希釈したもの）に添加し、４時間インキュベートした。100ml の培養物を、1500×ｇで５分間遠心してペレット化した。20ml D-PESを添加し、攪拌し、そして再度遠心することで、細胞を２回洗浄した。一つのチューブに細胞を集め、OD₅₇₀(1 OD単位＝３×10⁷CFU/ml)による測定のために、試料を1:25に希釈した。この細胞を、D-PBSで所望の用量になるように希釈し、用時まで４℃で保管した。連続10倍希釈を行い、そして、サボローデキストロース寒天に希釈液50μl を接種することで用量を確認した。37℃で終夜インキュベーションを終えた日にコロニーを計測した。500mlの培養液で、約１×10⁷CFU/mlの細胞数が認められた。このモデルでは、細胞数が約１×10⁵のカンジダを接種した結果、28日で致死量に至った。真菌で攻撃した直後に、尾静脈を介して10mg/kg のXMP.36、５mg/k g のXMP.97、10mg/kg のXMP.102、１mg/kg のアンフォテリシンＢ(Sigma、セントルイス、ミズーリー州)、または対照として0.1ml のリン酸緩衝性生理食塩水( PBS)をマウスに静脈注射した。２日目および４日目に同量のペプチド、アンフォテリシンＢまたはPBS(例外として、XMP.36は第２回目に５mg/kg の投与量にて与えた)を用いた処置を繰り返した。28日目に試験を終了するまで、死亡率につき、１日２回マウスを監視した。図４に表す死亡率のデータで、28日目までに、アンフォテリシンＢで処置したマウスの 100％が生存し、XMP.97で処置したマウスの53％が生存し（対照に比較してp<0.05）、XMP.36で処置したマウスの33％が生存し、XMP.102 で処置したマウスの27％が生存し、そしてPBSで処置したマウスの20％が生存することが示される。図４において、「×」の記号は、アンフォテリシンＢでの処置、白抜きの四角はXMP.97での処置、白抜きの円形はXMP.36での処置、白抜きの菱形はXMP.102 での処置、および白抜きの三角は緩衝液での処置後の生存を表す。Lifetest Survival Curve 分析を用いて統計的有意性を評価した。［Lawless、Statistical Models and Methods for Lifetime Dat a、John Wiley &Sons、New York(1982)。］生存における期間およびほぼ直線的な減衰は、ヒトの日和見性のカンジダ症に類似している。三回投与試験にて、15匹のマウスのグループについて、上述した注射用に調製された、0.5×10⁵個のカンジダ細胞をマウスに注射し、次いで、０日、２日及び５日目に10mg/kg のXMP.127、５mg/kg のXMP.13、５mg/kg のXMP.37、１mg/kg のアンフォテリシンＢ、または対照として0.1ml のPBS を用いて処置した。図５に表す死亡率のデータにより、28日目までに、アンフォテリシンＢで処置したマウスの100 ％が生存し、XMP.127で処置したマウスの67％が生存し（対照に比較してp<0.05）、XMP.37で処置したマウスの33％が生存し、XMP.13で処置したマウスの20％が生存し、そしてPBS で処置したマウスの33％が生存することが示される。図５において、「×」の記号はアンフォテリシンＢでの処置、白抜きの円形はXMP.127 での処置、黒塗りの三角は緩衝液での処置、白抜きの四角はXMP.37での処置、白抜きの三角はXMP.13での処置後の生存を表す。三回投与試験にて、予期されるとおりアンフォテリシンＢには完全に保護能があった。実施例２に記載の放射拡散分析によって決定された抗真菌活性を有しない対照のペプチドであるXMP.102 の効果は、PBS と何ら異なることはなかった。このデータにより、全身をカンジダ・アルビカンスで攻撃したマウスへのペプチドXMP.97およびXMP.127 の投与によって、予期せざることに、緩衝液で処置した対照に比較して死亡率の有意な低下が提供されることが立証される。抗真菌性ペプチドの効果を決定するための試験を、（上記した三回投与でなく、六回投与として）用量を増やしてさらに実施した。９週齢の雄性DBA/2Jマウスのグループに、尾静脈への静脈注射により(上記したように調製した)2.7×10⁵個のカンジダ細胞を接種した。真菌で攻撃した直後に、０日目、２日目、４日目、７日目、９日目および11日目に、10mg/kg のXMP.284、１mg/ kg のアンフォテリシンＢ、または対照としてのPBS の各 0.1mlでマウスを処置した。アンフォテリシンＢで処置したマウスは、すべて保護されていた。XMP.28 4(黒塗円)とPBS 対照（白抜円）の結果を、図６に示した。死亡率を示すデータは、６〜24日目までに、2.7×10⁵個のカンジダ細胞が接種された PBS処置したマウスは一匹だけが生存するに至った（生存率：６％）が、XMP.284 は６日目にして13匹のマウスを生存せしめ（生存率：87％）、24日目には３匹のマウスを生存せしめた（生存率：33％）。カンジダ・アルビカンス SLU-1株で全身的に感染処置されたシクロスポリンＡで免疫抑制したマウスでの、代表的な抗真菌性ペプチドの効果を決定するための試験も行った。９齢の雄性DBA/2Jマウスのグループ（15匹／グループ）に、シクロスポリンＡの10mg/kg を腹膜内注射した（−１日目）。１日後（０日目）、尾静脈への静脈注射により、２×10⁵個のカンジダ細胞をマウスに接種した。真菌で攻撃した直後に、10mg/kg の XMP.284、10mg/kg の XMP.127、または対照としてのPBSの各 0.1mlでマウスを処置した。１日目、３日目、７日目および９日目に、シクロスポリンＡ注射を行った。XMP.284、XMP.127、またはPBS の注射を、２日目、４日目、６日目、８日目および10日目に行った。アンフォテリシンＢで処置したマウスは、すべて保護されていた。XMP.127(黒塗三角)、XMP.284(白抜四角)およびPBS 対照（白抜円）で処置した後の死亡率のデータを示した図７の結果は、予想された通り、免疫抑制されたマウスがカンジダ感染により感受性になっていることを示していた。しかし、XMP.284 と、程度は若干劣るもののXMP.127 は、PBS 対照と比較して、生存数の大きさに反映されているように、感染に対する保護能を有していた。他の抗真菌剤に対して耐性であると考えられるカンジダの株：ポリエン耐性のカンジダアルビカンス（ATCC受託番号第38247号）、5-フルオロシトシン耐性のカンジダアルビカンス（ATCC第 44373号）、アゾール耐性のカンジダアルビカンス（ATCC第 62342号）およびケトコナゾール耐性のカンジダアルビカンス（ATCC第 64124号）に関する、実施例３に記載のペプチドのin vitro抗真菌活性を確認するための、シクロスポリンＡによる免疫抑制を伴う／伴わない in vi vo試験をさらに行った。実施例５血清安定性の分析本実施例では、ドメインIII誘導ペプチドの血清安定性と、バイオアッセイとH PLCを用いた血清の減成の効果について述べる。この血清安定性試験にあたって、実施例１に記載したように、固相ペプチド合成によってペプチドを調製し、94％以上の純度にまで精製した。メタファンで麻酔をかけたラットの大動脈から Vacutainer(登録商標)チューブに採血を行い、約30分かけて室温にて血液を凝固させ、室温にて、10分間、3000rpm(約1000×ｇ )で遠心分離し、そして、血清を吸い出した。加えて、凍結したヒトの血清（Nor th American Biologics社、マイアミ、フロリダ州、カタログ No．2140、ロット No．94115）を室温下で解凍し、そして、用時に先駆けて0.45μm の膜に通して濾過した。試験に用いるXMP ペプチドの１mg/ml の溶液を、等量の上記したラットもしくはヒトの血清に添加し、そして、37℃で維持した。０、１、２および４時間の時点にて、100μｌの試料を除去し、後述するHPLC分析のために固相抽出によって処理した。C-18 Sep-Pakカートリッジ（100mgの溶剤を含む１mlカートリッジ、W aters社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を利用したHPLCのための血清試料を調製した。100μl の血清試料を、等量の１％ TFAに添加し、Vortexミキサーで30秒間混合した。１mlのメタノールと１mlのミリＱ水で洗浄して調整したC- 18 Sep-Pakカートリッジに、この試料を適用した。１mlの 0.1％ TFAで洗浄することで、弱く保持された成分を溶出した。２倍量の250μl の80％アセトニトリル／0.065 ％TFA で、結合したペプチドを溶出した。 Sep-Pak カートリッジから溶出した物質を、150mm×１mm、５μ径、300Å孔径の C-8 Zorbax カラムを備えた Michrom Ultrafast Microprotein 分析機にて分析した。カラムオーブンを40℃に、流速を 100μl/分に、そして一般的な注入量を５〜10μl に設定した。移動相Ａとして５％アセトニトリル／ 0.1％ TFAの溶液、そして移動相Ｂとして80％アセトニトリル／ 0.065％ TFAを用いたHPLCを実施した。溶出物を、214nmの波長にて分光光度的に測定した。標準ペプチドを、0 .1mg/ml の濃度にて移動相Ａに溶解した。勾配を25〜35％Ｂ／10分とし、次いで、100％Ｂによる５分間の洗浄工程、そして、25％Ｂによる10分間の再平衡化を行った。上記したように血清のインキュベーションの後に同定され、そして精製されたペプチドを、Applied Biosystems社のModel 477A/120A 配列解析機でのＮ末端のペプチド配列の決定と、VGBiotech Bio-Q 質量分光器を用いた電子噴射イオン化質量分光分析(ESI/MS)に適用した。さらに、上記したように血清のインキュベーションの後に同定され、そして精製されたペプチドを、実施例２に記載したようにカンジダアルビカンス SLU-1 を用いた放射拡散バイオアッセイにてその抗真菌活性についても試験した。これらの実験では、ドメインIII誘導ペプチド、XMP.97、XMP.327、XMP.332 およびXMP.333 を使用した。それぞれの血清安定性は、実質的に相違していた。例えば、XMP.97は所定のアッセイ条件下で、59分の半減期で血清中で減成した。XM P.97からの二つの代謝産物が検出され、このものが、アミノ末端の開裂によって生じた一つもしくは二つのアミノ酸だけ少ないペプチドである開裂産物であることが判明した。この開裂産物と反応速度は、市販の血清あるいは新たに調製したラットの血清と同様であった。XMP.97の他の代謝産物の存在が推定されるが、検出限界を下回る濃度であると思われる。ペプチドの血清インキュベーションの後に認められた化学変化は、カンジダを用いた放射拡散アッセイにて決定された活性の損失を伴うのが一般的である。例えば、例えば、XMP.327 は所定のHPLC条件下で、40分の半減期で血清中で減成した。放射拡散アッセイでの抗真菌活性によって決定されたXMP.327 の血清半減期は、43分であった。他のケースの場合、抗真菌活性の消失速度とペプチドの消失速度とは相違しており、このことは、ある産物が活性を有していることを示唆している。ペプチドの減成に関与する酵素は、これらの実験では同定されていない。しかしながら、血清中のアミノペプチドは、ペプチドのＮ末端から一つ以上の残基を除去できる。〔例えば、Hooper，N.M.，Ectopeptidases，Biological Barriers to Protein Delivery，pp.25-30，Audus and Raub編、Plenum Press，New York，1993 を参照。〕例えば、アミノペプチダーゼ(E.C．3.4.11 .2)は、広範な基質特異性を有しており、ブロックされていないペプチドからＮ末端アミノ酸を放出する。加水分解部位に基づいて、減成経路を封じるようにデザインすることができる。ペプチド中の特定のアミノ酸での血清の変質は、D-アミノ酸あるいは他の不定型のアミノ酸の導入、および／またはプロテアーゼ認識を防ぐための環状化によって解消される。他の研究にて、血清安定性が向上したペプチドをデザインした。例えば、一つ以上のD-アミノ酸を用いてペプチドを合成した。実施例１に記載されたようにペプチドを合成し、そして、そのＮ末端をアセチル化した。例えば、XMP.333 は、合成のために用いたアミノ末端のリジン残基をD-アミノ酸とした以外は、XMP.32 7 と同じアミノ酸配列を有するように合成した。XMP.333 を試験したところ、放射拡散アッセイにて決定された半減期は 130分であった（XMP.327 は43分であった）。これら結果は、Ｎ末端の単一のD-アミノ酸が、ある部分の消失を防ぎ、ペプチドの半減期を延長することを示唆するものである。半減期が長くなったペプチドの調製は可能であるが、同じin vitro 活性は維持できないであろう。例えば、XMP.327 の半減期は43分であり、また、放射拡散アッセイでの活性は353pmolであった（表１参照）。XMP.327 と同じアミノ酸配列を有するものの、Ｎ末端はアセチル化されていないXMP.331 は、HPLC分析によって検出された 280分という延長された血清半減期を有するが、アセチル化されていないXMP.327 よりも劣る＞3493pmol（表１参照）の活性しか保持していなかった。しかしながら、in vitro活性が落ちてはいるものの、このペプチドは、その改善された安定性が故にin vivo での効果の改善は期待できる。顕著な安定性の改善のみならず、放射拡散アッセイで検出される抗真菌活性も維持した、他のペプチドの調製も可能である。例えば、XMP.332 はすべてD-アミノ酸を用いて合成されており、XMP.327 の逆配列を有している。かような「逆D- 」ペプチドは、Ｌアミノ酸の間にあるペプチド結合を認識して加水分解する血清酵素に対して耐性とすべきである。実際のところ、XMP.332 は、６時間にわたる血清のインキュベーションの後でも、活性の低下あるいはペプチド濃度の低下は認められなかった。Ｌアミノ酸ペプチドに対してin vitroにて等モル濃度の活性を維持し、そして、血清半減期を増大せしめるこのようなペプチドは、in vivo でも改善された効果が期待される。実施例６構造／機能の研究本実施例は、抗真菌性ペプチドの構造面および最小機能配列の解析のための、ペプチドのデザインと分析に関する。上記実施例２、３および４に記したように、XMP.97は、カンジダアルビカンスに対して顕著なin vitro活性を有しており、また、マウスの全身系カンジダモデルに対して顕著なin vivo活性を有していることが明らかとなった。この配列は、BPI配列の第 152位のグリシンをリジンで置換して得られた XMP.13から誘導されたものである。実施例５にて示したように、XMP.97を含むペプチドを血清と共にインキュベートすることで、Ｎ末端アミノ酸配列が除去されることが観察されている。13個のアミノ酸からなるペプチドXMP.284(SKVKWLIQLFHKK-アミド：配列番号：117)が合成され、（97％にまで）精製され、そして、抗真菌活性について試験を行った。in vitro活性は、はっきりと確認はできないが、驚くほど消失した（表１参照）。この配列を基にして、35個の欠失ペプチドを調製した。以下の表３に記したような、ＮおよびＣ末端を 12merから６mer だけ削除したペプチド(XMP.285〜XMP.319)を合成した。粗製のペプチドについて、実施例１に記載したようにして当初の純度と、実施例２に記載したようにして放射拡散アッセイによってin vitro活性を分析した。表３に記載のnmol値は、このアッセイにて30mm²の阻害面積を得るに必要なnmol 数について計算された数値（対数滴定曲線）である。XMP.97とXMP.284 の精製において、精製時にpmol値に大きな変化が認められた。この変化の大きさは、他の粗製ペプチドの場合と比べて大きなものであり、これは不活性なペプチド不純物が除去されたことによるものと思われる。よって、実施例１に記載したようにして精製したペプチドを用いて最終比較を行い、好ましくは、同日に分析を行った。最も活性のある粗製のペプチドをHPLCによって精製し、そして再分析を行った。その結果を、表３に示した。この分析から、表３にて実証されているように、ペプチドXMP.97に対して、XMP.293 がモル活性の増大を伴う最も小さなペプチドであった。XMP.297 は、活性に関して言えば、XMP.284 と同等であった。興味深いことに、XMP.298 の活性は、XMP.297 の二倍以内であった。XMP.315 のような、わずか６つのアミノ酸からなるペプチドでも活性が認められたが、この活性レベルは、出発配列の活性の大きさからして、約３ケタ程度低いものであった。これらデータは、本発明のドメインIII誘導ペプチドのあるグループが開示されていること、そして、４〜６個のアミノ酸、好ましくは５〜６個のアミノ酸の、疎水性アミノ酸の中央分に一つの中性親水性残基を有し、そして、カチオン性アミノ酸によってＮおよび／またはＣ末端に結合あるいは接するコア部分からなる構造によって定義されることを実証するものである。好ましいコア配列として、LIQL、IQLF、WLIQF、LIQLF およびWLIQLFがある。好ましいカチオン性アミノ酸として、Ｋ（最も好ましい）、Ｒ、Ｈ、ルニチン(ORN)およびジアミノ酪酸(DAB)がある。かような構造のペプチドは、至適な活性を有する。カチオン性残基のすべてをコア部分のＣ末端に有するペプチド(例えば、XMP.298)あるいはコア部分のＮ末端に有するペプチド( 例えば、XMP.300)の場合、活性はあるものの、ある程度の活性の消失も認められる。ペプチドXMP.320 〜XMP.368 を設計し、所定の構造を有するように調製を行ったところ、本発明の抗真菌性ペプチドの構造面および特徴的な最小機能配列を裏付ける結果が得られた。実施例７抗真菌性ペプチドのLPS 中和活性本実施例では、ドメインIII誘導ペプチドのin vitroおよびin vivo でのLPS 中和活性について述べる。ドメインIII誘導ペプチドの評価のためのin vivo でのLPS 中和活性のスクリーニング分析法は、（共同所有に係る、係属中の米国特許出願 No．08/306,473 に記載されたような）各ペプチドの効果(EC₅₀)と、各ペプチドによる毒性／成長阻害の効果(IC₅₀)の双方の測定ができるようにしてある。LPS で処置されたマウス細胞の増殖阻害に関するこの敏感な分析法は、標準曲線があれば、ヒトの血漿中のLPS レベルの定量に用いることができる。この分析において、10mM HEPES緩衝液(pH 7.4)、２mM L−グルタミン、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、0.075 ％重炭酸ナトリウム、 0.15M 2-メルカプトエタノールおよび10％胎児ウシ血清(Hyclone社、ローガン、ユタ州)を補充したRPMI 1640 培地(GIBCO)で維持されたマウス RAW264.7 細胞(A TCC 受託 No．T1B71)を、まず、50U/mlの組換えマウスγ−インターフェロン(Ge nzyme、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)の存在下で、分析に先行して、24時間インキュベーシンして誘発を行った。そして、誘発した細胞を機械的に回収し、４℃で、500×ｇにて遠心し、50mlのRPMI1640培地（補充物無し）で再懸濁し、再遠心し、そして、RPMI1640培地（補充物無し）でさらに懸濁した。細胞の数を計測し、２×10⁵細胞/ml の濃度に調製された 100μl の画分を、96ウェルマイクロ滴定用プレートの各ウェルに添加した。１ng/ml の濃度（LPS 濃度を50〜 100ng/mlの間で変化させる滴定試験で得られた濃度である）で 100μl/ウェルの量の血清を含まない RPMI 1640 培地が添加されたウェルにて、E．coli 0111 LPS（Control Standard Assoc．of Cape Cod、ウッズホール、マサチューセッツ州）と共に約15時間にわたって細胞をインキュベートした。このインキュベーションは、25〜50μg/ml の濃度のペプチドと共に、あるいはペプチド無しに実施した。第 132位のシステインをアラニンで置換したrBPI 1-193であり、rBPI₂₁Δcys とも称される、組換えrBPI₂₁〔共同所有に係る米国特許 No．5,420,019を参照〕を、１μg/mlの濃度で正の対照として用いた。分析を開始してから５時間にわたって、経時的に、１ μCi／ウェルの[³H]-チミジンを添加して細胞の増殖を観察した。15時間のインキュベーションの後に、標識付けした細胞を、細胞回収材（Inotech Biosystems ，INB-384，Sample Processing and Filter Counting System、ランシング、ミシガン州）と共にガラス繊維フィルター上に置いた。 RAW 264.7 細胞増殖のLPS-媒介阻害は、血清成分もしくは組換えLBP(１μg/ml の濃度)として反応混合物に添加することにより、LBP の存在に依存する。この分析にて、ペプチドの挙動は異なるパターンを示した。本発明によるLPS 中和活性を有するドメインIII誘導ペプチドは、共同所有に係る、係属中の米国特許出願 Nos．08/209,762と 08/306,473 に記載された、抗真菌活性を持たないLPS 中和活性を有する他のXMP ペプチドとは異なり、試験した濃度にあっては、IC₅₀は示されなかった。例えば、XMP.5 は 5.3± 0.6μg/mlのEC₅₀（すなわち、LPS による50％の成長阻害効果をもたらすペプチド濃度）を示すが、試験で用いた濃度にあっては、IC₅₀（すなわち、LPS もしくはペプチドを用いない場合に、50％の RAW 細胞の成長阻害をもたらすペプチド濃度）は認められなかった。代表的なドメインIII誘導抗真菌性ペプチドの分析結果を、図８に示した。精製した抗真菌性ペプチド XMP.327（白抜四角）、XMP.332(黒塗四角)、XMP.333(白抜三角)およびXMP.337(黒塗三角)のLPS 中和活性を、図８に示した。正の対照として、rBPI₂₁の活性を示した。この分析で試験した代表的なペプチドの結果を、表４に示した。マウスの内毒素血症in vivo モデルにおけるドメインIII誘導ペプチドの LPS 中和効果に関する試験も行った。15匹のマウスからなるグループに、LD₉₀が20mg /kg の内毒素（E．coli 0111：B4、Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリー州）を静脈注射した。次いで、試験対象たるペプチドを同じく静脈注射した。負の対照マウスには、生理食塩水を注射した。マウスを７日間にわたって観察し、死亡数を記録した。ペプチドの効果を、ペプチドを投与したマウスにおける内毒素血症に関連した死亡数との対比において、対照マウスの死亡数からの減少分によって測定した。XMP.284 が、このマウスモデルにおいて活性を呈した代表的なペプチドである。図７に示したように、0.5mg/kgの用量のXMP.284 にて顕著な保護効果が認められ、１mg/kg の用量では15匹の内14匹が生存し、そして、３mg /kg の用量ではすべてのマウスに対して効果が認められた（生存率 100％）。生理食塩水を用いた対照グループでは、生存したマウスは無かった。実施例８ペプチドの調剤本実施例では、ペプチドの調剤について述べる。ドメインIII誘導ペプチドの一つである XMP.284を、これらペプチドが通常保持している分解機構、もしあれば、を明らかにするために、緩衝化した生理食塩水を含む液剤での安定性についての評価を行った。凍結乾燥したペプチドを、３つの個別の緩衝液に１mg/ml の濃度にそれぞれ溶解した。使用する３つの緩衝液とは、(a)10mM酢酸液、150mM 塩化ナトリウム、p H４、(b)10mM酢酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH５、および(c)10mM酢酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH６の３タイプであった。調剤したペプチド試料を、４℃と37℃でインキュベートした。所定の時間にて、各バイアルから試料を採取し、C18 逆相HPLC、280nmでの吸光度およびSDS-PAGEで分析を行った。この研究は、50日間にわたって継続した。 0.46×25cmのVydac C18 カラム（カタログ No．218TP54）を、島津 HPLC システムに用いた。このカラムを、二重勾配移動相Ａ＝水と0.05％ TFA、Ｂ＝アセトニトリル＋0.05％ TFAに適用した。クトマトグラフィーの条件は、以下の通りであった。波長＝229nm ；流速＝１ml／分；注入量＝50μl ；適用時間＝37分；勾配＝20分間に20〜40％Ｂ；AUFS＝XMP.284 に関しては0.1 ；試料濃度＝3.5μg/ 注入量50μl。C18 分析のための試料調製において、バイアルから採取した試料は、水に溶解した0.05％ TFAで16倍に希釈する。分析に先行して、すべての試料をAcrodisc４で濾過した。 Novex 10〜20％のトリシンを予め混ぜたゲル(Novax、ラヨラ、カリフォルニア州、EC6625)を用いたSDS ポリアクリルアミドゲルによって、試料を分析した。非還元試料を載せた緩衝液（Novex LC1676、２×）と試料を混合し、95℃で、２分間加熱した。冷却した後に、試料をゲルに置き、クーマシーブルーでゲルを染色した。さらに、試料を分光測定法によって分析した。この試料について、各時点で採取した試料をミリポワ水で６倍に希釈し、280nm で吸光度を測定し、そして、島津UV160 分光光度計を用いて 210〜 340nmにて走査した。吸光度測定に先行して、すべての試料を濾過した。 XMP.284 は、水と非緩衝化生理食塩水に対して可溶性である。XMP.284 は、10 mM酢酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH７に対しても可溶性である。このペプチドは、40℃で１時間、次いで、55℃で１時間の条件下で燐酸緩衝液中においても可溶性を保っている。 pH４、５もしくは６にて、10mM酢酸で緩衝化した0.15M の生理食塩水において、 280nm の吸光度を測定したところ、生成物の損失はほとんど無かった。４℃での経時安定性の試験では、生成物濃度の変化は認められなかった。37℃での安定性試験においてさえも、95％以上の生成物濃度は維持され、低レベル（50日目で 0 .5％以下）の新たに生じたHPLCピークが、酢酸で緩衝化した生理食塩水において時間と共に蓄積されたに過ぎなかった。試験したドメインIII誘導ペプチドによって発現した実質的な安定性を考慮すれば、他の賦形剤は不要となるが、さらに長期間持続する安定性および／または活性を得るための改善が必要とされるであろう。当業者であれば、本明細書における本発明の好ましい実施態様に関するこれまでの記載を考慮して、本発明を実施する上での多くの修正や変更を想起することが予測される。よって、本発明の範囲は、添付の請求の範囲に記載に従った限定のみが付加されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年４月５日【補正内容】好ましいペプチドは、14個のアミノ酸を有し、そして、好ましい変異配列あるいはそのサブ配列は、第 152位のＧに対応するアミノ酸がＫになっている配列である。14個のアミノ酸を有する好ましいペプチド配列は、LIQL、IQLF、WLIQL、L IQLFおよびWLIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列あるいはこれら配列に対して少なくとも75％の相同性を示すコアアミノ酸配列変異体を有しており、配列番号：４(XMP.13)、６〜19(XMP.31-44)、21〜22(XMP.82-83)、23〜 25（XMP.85-87）、26〜27(XMP.91-92)、28〜31(XMP.94-97)、32〜33(XMP.100-10 1)、34(XMP.104)、35〜40(XMP.106-111)、41(XMP.113)、42(XMP.116)、43〜55(X MP.123-135)、57〜58(XMP.138-139)、59〜61(XMP.142-144)、62(XMP.146)、66〜 78(XMP.222-234)、80〜88(XMP.236-244)、89〜109(XMP.249-269)および116（XMP .283）に記載のペプチドがある。抗真菌性の14mer のペプチドのこのグループは、少なくとも一つのBPI 配列残基が、D-異性体アミノ酸で置換された変異配列ペプチドを含む。例えば、配列番号：46(XMP.126)、48(XMP.128)、86〜87(XMP.242 -243)および92〜93(XMP.252-253)を参照のこと。不定型のアミノ酸、例えば、β （1-ナフチル）Ａ、β（2-ナフチル）Ａ、パラ−アミノＦ、シクロヘキシルＡ、 α−およびγ−アミノ酪酸、αメチルＡおよびＮメチルＧ、ＶおよびＬによるBPI 配列の置換に関与する変異配列もこのグループに属する。７〜12個のアミノ酸を有する本発明の好適なドメインIII誘導抗真菌性ペプチドは、(a)LIQL、IQLF、WLIQL、LIQLF およびWLIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された一つ以上のカチオン性アミノ酸を含む。７〜９個のアミノ酸を有するこのペプチドのサブセットは、(a)LIQLおよびIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸を含む。８〜10個のアミノ酸を有するこのペプチドの他のサブセットは、(a)LIQLFおよびWLIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸を含む。９〜12個のアミノ酸を有するこのペプチドのさらに他のサブセットは、(a)WLIQLFからなるグループから選択されたコアアミノ酸配列；および(b)このコアアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも三つのカチオン性アミノ酸を含む。これらサブセットの例として、配列番号： 118〜137(XMP.285-304)、140〜144(XMP.307-311)、155〜160(XM P.322-327)、166〜170(XMP.335-339)、174〜177(XMP.343-346)、179〜184(XMP. 348-353)、186(XMP.355)、188〜190（XMP.357-359）がある。上記したペプチドの構造の考察から明らかな通り、BPI アミノ酸の第 148〜16 1 位にあるドメインIII配列が、上記したコア配列とこのコア部分に作用する複数のカチオン性残基（ＫとＨ）を含む。この部分は、本発明の抗真菌性ペプチドをもたらす第 148〜161 位の配列のサブ配列構造まで移動し、第 148〜161位の抗真菌性変異配列およびそのサブ配列にて保存される。例えば、BPI 配列の第 1 52位に通常は位置するＧ残基がＫ残基で置換され、これによって、支配的な疎水性コア残基の直近にカチオン性残基が到達するように作用する。本発明による抗真菌性ペプチドをもたらす配列と変異サブ配列は、通常はコア配列に作用している一つ以上の非カチオン性残基が、カチオン性残基で置換された配列であって、本発明のペプチドはこの配列を含むペプチドである。請求の範囲１．７〜12個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) LIQL、IQLF、WLIQL、LIQLF およびWLIQLFからなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された一つ以上のカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。２．７〜９個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) LIQLおよびIQLFからなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。３．８〜10個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) LIQLF およびWLIQLFからなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。４．９〜12個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) WLIQLFからなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファデム，ミッチェル，ビー. アメリカ合衆国 94707 カリフォルニアバークレイコルサアベニュー 716

Claims

【特許請求の範囲】１．７〜12個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) LIQL、IQLF、WLIQL、LIQLF およびWLQLF からなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された一つ以上のカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。２．７〜９個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) LIQLおよびIQLFからなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。３．８〜10個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) LIQLF およびWLQLF からなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも二つのカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。４．９〜12個のアミノ酸を含む抗真菌性ペプチドであって、 (a) WLQLF からなるグループから選択されたアミノ酸のコア配列、および (b) そのアミノ末端部分および／またはカルボキシ末端部分に、Ｋ、Ｒ、Ｈ、オルニチンおよびジアミノ酪酸からなるグループから選択された少なくとも三つのカチオン性アミノ酸、を含む抗真菌性ペプチド。５．前記ペプチドが、配列番号； 118〜 137(XMP.285 〜304)、140〜 144(XMP.3 07 〜311)、155〜 160(XMP.322 〜327)、166〜 170(XMP.335 〜339)、174〜 177 (XMP.343 〜346)、179〜 184(XMP.348 〜353)、186(XMP.355)および 188〜190(X MP.357 〜359)に記載のペプチドからなるグループから選択される、請求の範囲第１項、第２項、第３項もしくは第４項に記載の抗真菌性ペプチド。６．一つ以上のＤ−異性体アミノ酸を含む、請求の範囲第１項、第２項、第３項もしくは第４項に記載の抗真菌性ペプチド。７．前記ペプチドが、配列番号： 164(XMP.333)、165(XMP.334)、173(XMP.342) 、194(XMP.363)および196(XMP.365)に記載のペプチドからなるグループから選択される、請求の範囲第６項に記載の抗真菌性ペプチド。８．前記コア配列アミノ酸が、逆配列順にてＤ−異性体アミノ酸を含む、請求の範囲第６項に記載の抗真菌性ペプチド。９．前記ペプチドが、配列番号： 163(XMP.332)および 198(XMP.367)に記載のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第８項に記載の抗真菌性ペプチド。 10．前記アミノ末端アミノ酸残基が、アセチル化されている請求の範囲第１項、第２項、第３項もしくは第４項に記載の抗真菌性ペプチド。 11．前記ペプチドが、配列番号： 162(XMP.331)、185(XMP.354)、187(XMP.356) 、195(XMP.364)、199(XMP.368)および204(XMP.373)に記載のペプチドからなるグループから選択される、請求の範囲第10項に記載の抗真菌性ペプチド。 12．環状抗真菌性ペプチドである、請求の範囲第１項、第３項もしくは第４項に記載の抗真菌性ペプチド。 13．前記ペプチドが、配列番号： 191、192および 193に記載のペプチドからなるグループから選択される、請求の範囲第８項に記載の環状抗真菌性ペプチド。 14．配列番号： 116〜117(XMP.283〜284)、132(XMP.299)、138〜139(XMP.305〜3 06)、145〜154(XMP.312〜321)および 200〜203(XMP.369〜372)に記載のペプチドからなるグループから選択される、抗真菌性ペプチド。 15．請求の範囲第１項〜第14項のいずれかに記載の抗真菌性ペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、佐剤あるいは担体を含む薬剤組成物。 16．真菌感染症を治療する薬剤の製造用途での、請求の範囲第１項〜第14項のいずれかに記載の抗真菌性ペプチドの使用。 17．他の抗真菌剤との併用による請求の範囲第１項〜第14項のいずれかに記載の抗真菌性ペプチドの使用。 18．請求の範囲第１項〜第14項のいずれかに記載の抗真菌性ペプチドを真菌と接触することを含む、真菌を死滅あるいは真菌の複製阻害のためのin vitro方法。 19．真菌感染した対象に、請求の範囲第１項〜第14項のいずれかに記載のペプチドの治療的有効量を投与することを含む、真菌感染を治療する方法。 20．前記真菌感染が、Candida(カンジダ)、Aspergillosis(アスペルギロシス)および Cryptococcus(クリプトコッカス)種からなるグループから選択された真菌種が関与する感染である、範囲第19項に記載の方法。 21．前記Candida 種が、C．albicans(カンジダアルビカンス)、C．glabrata（カンジダグラブラタ）、C．krusei(カンジダクルセイ)、C．lustianiae(カンジダラスティアニエ)、C．parapsilosis(カンジダパラプシロシッス)および C．tropicalis(カンジダトロピカリス)からなるグループから選択される、範囲第20項に記載の方法。 22．前記ペプチドが、局所的、静脈注射的、経口的、あるいはエアロゾルとして投与される、範囲第19項に記載の方法。 23．非ペプチド性抗真菌剤を投与する工程をさらに含む、範囲第19項に記載の方法。