JPH09503383A

JPH09503383A - プロテグリン

Info

Publication number: JPH09503383A
Application number: JP7505343A
Authority: JP
Inventors: エル．レアラー，ロバート; エス．エル．ハーウィグ，シルビア; エヌ．コクリヤコフ，ブラデミアー
Original assignee: ユニバーシティオブカリフォルニア，ロスアンゼルス
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1994-07-20
Publication date: 1997-04-08
Also published as: AU689487B2; EP0711305A4; CA2166788A1; ES2168354T3; DE69429176T2; PT711305E; EP0711305A1; US5708145A; AU7403394A; DK0711305T3; ATE209215T1; EP0711305B1; WO1995003325A1; DE69429176D1

Abstract

(57)【要約】４個の不変のシステイン残基(２個の分子内ジスルフィド結合を含有するように必要に応じて酸化される)を含有する、ペプチドベースの化合物またはシステインが置換されている修飾形態は、保存剤として、および動物および植物のウイルスまたは微生物感染の予防、治療または改善において、およびエンドトキシンの不活化において有用である。ペプチドの例としては、精製および単離された形態にある下記のものが挙げられる：RGGRLCYCRRRFCVCVGR、RGGRLCYCRRRFCICV、RGGGLCYCRRRFCVCVGR、およびRGGRLCYCRGWICFCVGR。

Description

【発明の詳細な説明】プロテグリン本発明は、NIH助成金No．A122839からの資金供給により行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。技術分野本発明は抗菌性ペプチドの分野に関する。詳細には、本発明は短ペプチド(あるものはブタ白血球から単離される)に関し、このペプチドは広い抗菌活性を有する。背景技術動物および植物両者の感染に対する防衛機構の１つは、抗菌および抗ウイルス活性を有するペプチドの生産である。これらのペプチドの種々のクラスが植物および動物両者の組織から単離されている。このようなペプチドの１つの周知のクラスは、タキプレシン(tachyplesin)であり、これはNakamura，T.らJ Biol Chem （1988）263:16709〜16713により記載の通りカブトガニの血球から最初に単離された。この論文は日本種(Japanese species)から単離された最初のタキプレシンである、タキプレシンＩについて記載していた。タキプレシンＩは17個のアミノ酸のアミド化ペプチドであり、２個の分子内シスチン結合を提供する４つのシステイン残基を含有している。このグループによる後の論文において、Miyata，T. らJ Biochem（1989）106:663〜668は、アメリカ産カブトガニの研究にまで及び、そして第２のタキプレシン、タキプレシンIIを単離した。これはＣ末端がアミド化された17残基を含み、また４個のシステイン残基および２個の分子内ジスルフィド結合を含んでいた。タキプレシンIIに対して高い相同性を有し、そして同位置に４個のシステイン残基を含有する、ポリフェムシン(polyphemusin)と呼ばれる別の２つの18merもまた単離された。ポリフェムシンIおよびポリフェムシン IIは１個のアルギニン残基がリジンに置換されていることのみが互いに異なる。これらの全てのペプチドは、抗菌および抗細菌活性を有することが記載された。 Murakami，T.らChemotherapy（1991）37:327〜334による後の論文は、水泡性口内ウイルス；単純ヘルペスウイルスＩおよびII、アデノウイルスＩ、レオウイルスII、およびポリオウイルスＩに関するタキプレシンの抗ウイルス活性が、タキプレシンIによる不活性化に耐性であることを記載している。Morimoto，M.らChe motherapy （1991）37:206〜211は、タキプレシンＩがヒト免疫不全ウイルスに対して阻害性であることを見出した。この抗HIV活性はポリフェムシンIIの合成アナログにもあることが見出され、Nakashima，H.らAntimicrobial Agents and Ch emotherapy （1992）1249〜1255により記載された。抗ウイルスペプチドはまた、ウサギ白血球においても見出されており、Lehrer，R.I.らJ Virol（1985）54:46 7〜472により記載されている。システインを含有する抗微生物性ペプチドの他の重要なクラスとしては、デフェンシン、β-デフェンシン、および昆虫デフェンシンが挙げられる。デフェンシンは比較的長いペプチドで、６個の不変システインおよび３個の分子内シスチンジスルフィド結合を有することを特徴としている。デフェンシンはLehrer，R. I.らCell（1991）64:229〜230；Lehrer，R.I.らAnn Rev Immunol（1993）11:105 〜128により記載されている。Lehrer，R.I.らによる哺乳類由来のデフェンシンの総説が、Annual Review Immunol（1993）11:105〜128に見られ；３つの特許がデフェンシンに関して発行されている：米国特許第4,705,777号；米国特許第4,6 59,692号；および米国特許第4,543,252号。デフェンシンは、ヒトおよびその他いくつかの動物の多形核化好中球(PMN)、ならびにウサギ肺胞マクロファージ、およびネズミ小腸上皮(Paneth)細胞およびヒトの対応細胞において見出されている。 β-デフェンシンは、ウシ呼吸器上皮細胞、ウシ顆粒球、およびトリ白血球において見出されている。Selsted，M.E.らJ Biol Chem（1993）288:6641〜6648およびDiamond，G.らProc Natl Acad Sci(USA)（1991）88:3952〜3958を参照のこと。昆虫デフェンシンは、Lambert，J.らProc Natl Acad Sci(USA)（1989）88:2 62〜265により報告されている。抗菌性および抗細菌性のペプチドおよびタンパク質はまた、植物においても見出されており(Broekaert，W.F.らBiochemistry（1992）31:4308〜4314)、Corne lissen，B.J.C.らPlant Physiol（1993）101:709〜712により考察されている。このようなペプチドの生産に対する発現系を用いて、例えばHaln，R.らNature（ 1993）361:153〜156により記載されているような感染に対して植物を保護するために植物を形質転換している。本発明は、本明細書において「プロテグリン」と名付けた新規なクラスの抗微生物性および抗ウイルス性ペプチドを提供する。これらの代表的なメンバーはブタ白血球から単離されている。これらのペプチドは植物および動物の両者において抗細菌、抗ウイルス、および抗菌剤として有用である。本発明のプロテグリンペプチドの単離は、Kokryakov，V.N.らFEBS（1993）337 :231〜236（７月発行）による論文において本出願により報告された。このグループの後の公開物は、新規なプロテグリンの存在を記載しており、その配列およびその前駆体の配列はその単離されたcDNAクローンから推定された。Zhao，Cら、FEBS Letters（1994）346:285〜288。ブタ好中球由来のカチオン性ペプチドを開示している別の論文が、Mirgorodskaya，O.A.らFEBS（1993）330:339〜342(９月発行)により公開された。Storici，PらBiochem Biophys Res Comm（1993）196 :1363〜1367は、カテリン(cathelin)様前駆配列を有するブタ白血球抗微生物性ペプチドをコードするDNA配列の回収を報告している。このペプチドは、以下に開示されるプロテグリンの１つであると報告される。本発明のプロテグリンはまた、エンドトキシン(即ちグラム陰性細菌由来のリポ多糖(LPS)組成物でありグラム陰性敗血症の原因と考えられている)と結合することも見出されている。このタイプの敗血症は極めて一般的な状態であるが、しばしば致死的である。他にもLPS/エンドトキシンに結合するタンパク質を設計し、そして研究することが試みられており、そしてこれらの試みに関する例証となる報告が、Rustici，A.らScience（1993）259:361〜364；Matsuzaki，K.らBioch emistry （1993）32:11704〜11710；Hoess,A.らEMBO J（1993）12:3351〜3356；およびElsbach，P.らCurrent Opinion in Immunology（1993）5:103〜107に認められる。本発明のプロテグリンは、LPSを不活化し、そしてその効果を改善する能力を有するさらなる化合物を提供する。前述に加えて、本発明のプロテグリンは性感染症に関連する生物の成長を阻害するのに効果的である。世界中で1,400万人がHIVに感染し、そして毎年数百万人の女性が骨盤炎症疾患を患っていると推定されている。Chlamydia trachomatis およびNeisseria gonorrhoeaeがこの炎症疾患の半数以上を引き起こすが、E．co li、Mycoplasma hominisおよびその他の感染性微生物もまた原因となり得る。病原体として、ウィルス、細菌、真菌、および原生生物病原体が挙げられる。これらの感染症に対処するために用いられる抗生物質は、生理的条件下で効果的であることが特に重要である。本発明のプロテグリンは、これらの特性を提供する。発明の開示１つの実施態様において、本発明は、４個の不変のシステインを有し、そして塩基性および疎水性アミノ酸の特有のパターンおよび/または本発明の方法を用いて動物の白血球から単離可能であることを特徴とする16〜18個のアミノ酸残基のペプチドに関する。第２の実施態様において、本発明は、これらのシステインのうち１〜４個が疎水性または小さなアミノ酸に置換されている上記ペプチドに関する。これらのペプチドは合成により生産され得、そしてあるものは組換えにより生産され得るか、あるいは保存剤としての使用のために、または動物の感染症の治療または予防における薬学的組成物中での使用のために天然供給源から単離され得、そして精製され得る。あるいは、このペプチドは、ウイルスまたは微生物の感染に対して保護するために植物に適用し得る組成物に処方され得る。さらに別のアプローチにおいては、このペプチドをコードするDNAが、感染症に対処するために、動物または好ましくは植物において、インサイチュで発現され得る。このペプチドはまた、抗微生物アッセイおよびエンドトキシンとの結合においても標準物質として有用である。従って、１つの局面において、本発明は、以下のようなペプチドに関し、このペプチドは、式：およびそのＮ末端アシル化および/またはＣ末端アミド化またはエステル化された形態のペプチドであって、これは、必要に応じて-SH安定化された線状形態またはシステイン架橋された形態のいずれかであり、ここで、A₁およびA₉のそれぞれは、独立して、塩基性アミノ酸であり； A₂およびA₃のそれぞれは、独立して、小さなアミノ酸であり； A₅、A₇、A₁₂、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれは、独立して、疎水性アミノ酸であり； A₄およびA₁₀のそれぞれは、独立して、塩基性または小さなアミノ酸であり； A₁₁は、塩基性または疎水性アミノ酸であり； A₁₇は、存在しないか、または存在する場合は小さなアミノ酸であり； A₁₈は、存在しないか、または存在する場合は塩基性アミノ酸であり；あるいは式(１)の修飾形態、およびそのＮ末端アシル化および/またはＣ末端アミド化またはエステル化された形態であって、ここで１〜４個のシステインのそれぞれは独立して疎水性アミノ酸または小さなアミノ酸で置換され、但し該化合物が、アミド化およびジシステイン架橋形態で式である場合に、該化合物が精製および単離されることを条件とする。別の局面においては、本発明は、以下の精製および単離されたペプチドを包含し、このペプチドは、式：およびそのアミド化またはエステル化および/またはＮ末端アシル化された形態のペプチドであって、必要に応じてSH安定化された線状形態、および環状形態を包含し、ここで、A_1-5、A₇、A_9-12およびA₁₄およびA₁₆、ならびにもし存在するならばA₁₇ およびA₁₈(即ちA_n)は、アミノ酸残基を示し、これらのペプチドは、本明細書に記載の方法と類似の方法により動物の白血球から単離可能である。本発明はまた、Ｎ末端が延長された上記のペプチドの前駆体、および該前駆体をコードする組換え物質に関する。さらに別の局面においては、本発明は、本発明のペプチドの生産に対して有用な組換え物質、ならびにこれらのペプチドの生産のための発現系を含むように改変された植物または動物に関する。本発明はまた、活性成分として本発明のペプチドを含有する薬学的組成物および植物に適用するための組成物、またはペプチドの生産またはこれらのペプチドをコードするヌクレオチド配列のインサイチュ発現のための発現系を含む組成物に関する。本発明はまた、本発明のペプチドを合成により調製する方法、これらのペプチドに特異的な抗体、および保存剤としての本ペプチドの使用に関する。別の局面においては、本発明は、抗微生物アッセイの標準物質としての本発明の化合物の使用に関する。本化合物は、コンタクトレンズ溶液のようなアイケア (eye care)に有用な溶液中の抗微生物剤、および性感染症(STD)の治療のための局所またはその他の薬学的組成物中の抗微生物剤として使用され得る。本発明はまた、食品またはその他の腐敗しやすい物のための保存剤としての本発明の化合物の使用に関する。本発明のペプチドはエンドトキシンを不活化し得ることから、本発明はまた、本発明の化合物を用いるエンドトキシンを不活化する方法、およびこの特性を利用することによってグラム陰性敗血症を治療する方法に関する。図面の簡単な説明図１は、Biogel P10カラムに供したブタ白血球の限外濾過物の濃縮物の溶出パターンを示す。図２は、図１に示されたカラムの溶出から得られたP10の画分の抗細菌活性を示す。図３は、図１のBiogel P10カラムの画分76〜78をHPLCに供したときに得られた溶出パターンを示す。図４は、本発明の精製ブタプロテグリンの抗微生物活性を示す：図4aは、E．Coliに対する抗細菌活性を示す；図4bは、Listeria monocytogenesに対する抗細菌活性を示す；図4cは、Candida albicansに対する抗菌活性を示す；図4dは、S．aureusに対する抗細菌活性を示す；図4eは、K．pneumoneaeに対する抗細菌活性を示す。図５は、抗微生物活性に対する種々の試験条件の効果を示す：図5aは、100μM NaCl中のCandida albicansに対する活性を示す；図5bは、100μM NaCl中のE．Coliに対する活性を示す；図5cは、90%ウシ胎児血清中のCandida albicansに対する活性を示す。図６は、種々の試験条件下におけるプロテグリン線状形態の抗微生物活性を示す：図6aは、10mMリン酸-クエン酸緩衝液、pH6.5中のE．coliに対する活性を示す；図6bは、100mM NaClを含む同緩衝液中のE．coliに対する活性を示す；図6cは、図6a〜図6bの緩衝液中のL．monocytogenesに対する活性を示す；図6dは、100mM NaClを添加した同緩衝液中のL．monocytogenesに対する活性を示す；図6eは、10mM リン酸存在下におけるC．albicansに対する活性を示す；そして図6fは、10mM リン酸＋100mM NaCl存在下におけるC．albicansに対する活性を示す。図７は、PG-1、PG-2、PG-3、およびPG-4の前駆体をコードするcDNAの合成物を示す。図８は、図７のプロテグリンのアミノ酸配列を示す。図9a〜9dは、種々の標的微生物に対する種々のプロテグリンの効果を示す。発明の実施態様本発明のペプチドは以下の式およびその規定の修飾形態により表される：天然に存在するこれらのペプチドは、精製および単離された形態でなければならない。それぞれの場合において、符号A_nがペプチドの特定の位置におけるアミノ酸を表す。A₁₇およびA₁₈が存在してもしなくても良いので、本発明のペプチドは16、 17、または18個のアミノ酸を含有する。式(1)中のCとして示されているシステイン残基の位置は、本発明のペプチドでは不変である；しかし、式(1)のペプチドの修飾形態もまた本発明の範囲内に包含され、これらのシステインの１〜４個が疎水性または小さなアミノ酸で置換され得る。ペプチドのアミノ末端は、遊離アミノ形態であり得るか、または式RCO-の基（ここで、Rが1〜6Cのヒドロカルビル基を表す）によりアシル化され得る。このヒドロカルビル基は飽和または不飽和であり、そして典型的には、例えば、メチル、エチル、i-プロピル、t-ブチル、n-ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセン-2-イル、ヘキセン-3-イル、ヘキシン-4-イルなどである。本発明のペプチドのＣ末端は、遊離酸あるいはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウムのような受容可能な塩、もしくは無機イオンまたはカフェインのような有機イオンの他の塩のいずれかの誘導体化されていないカルボキシル基の形態であり得る。カルボキシル末端はまた、式ROHのアルコールとエステルを形成することにより誘導体化され得るか、もしくは式NH₃、またはRNH₂、またはR₂NHのアミン（ここで、各Rは、独立して、先に定義されている1〜6Cのヒドロカルビルである）によりアミド化され得る。C末端が式CONH₂を有するペプチドのアミド化された形態が好ましい。本発明のペプチドがかなりの数の塩基性アミノ酸を含有するので、本発明のペプチドは酸付加塩の形態で供給され得る。代表的な酸付加塩は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物など、硫酸塩、硝酸塩、またはリン酸塩のような無機イオンの酸付加塩を包含し、もしくは酢酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩などのような有機アニオンの塩であり得る。このような塩のそれぞれの受容性は、通常理解されるように、意図される用途に依存する。少なくとも２個のシステインを含有する本発明のペプチドは、線形態または環式形態であり得る。線形態は環式形態に変換可能であり、逆の場合にも同じである。ジスルフィド結合を形成して環状ペプチドを作る方法は当該分野で周知であり、ジスルフィドを還元して線状化合物を形成する方法も同様である。線状化合物は、適切なアルキル化試薬、例えば、ヨードアセトアミドの添加により安定化され得る。環式形態は、４個の不変なシステイン残基の全部または一部のうちにおける、シスチン結合の形成の結果である。本発明の環式形態は、シスチン結合形成の全ての可能な変更（permutation）を包含する；これらのシステインに、C₆、C₈、C₁₃ 、およびC₁₅として、Ｎ末端で起始するこれらの存在の順番で番号をつける場合は、これらの変更は以下を包含する：１〜４個のシステインが置換されるこれらのペプチドの修飾形態では、２〜３個のシステインが存在するときに、同様の変更が行われ得る。天然状態のプロテグリンは２つのシスチン結合を含有し、一方は、６位のシステインと15位のシステインとの間にあり、そして他方は８位のシステインと13位のシステインとの間にある。従って、２つのシスチン結合を有するこれらの実施態様では、C₆−C₁₅、C₈−C₁₃形態が好ましい。しかし、１つのシスチン結合だけを含有するプロテグリン形態が活性であり、そして容易に調製されることが本出願人によって見出された。１つのシスチン結合だけを有する実施態様の中で好ましいのは、C₆−C₁₅だけおよびC₈−C₁₃だけにより表されるものである。天然の環状ペプチドの線状化された形態が価値のある活性を有するので、例えばヨードアセトアミドとの反応により化学的に安定化されてシステインのスルフヒドリル形態を保存する場合にも、本発明の化合物はまた、適切な試薬で安定化される線状化の形態を包含する。本明細書で定義されるように、本発明のペプチドの「SH-安定化された」形態は、標準試薬と反応してジスルフィド結合への再形成を防止するスルフヒドリル基を含有する。本発明のプロテグリンの線状形態を提供する他のアプローチは、システイン残基がシスチン結合を形成しないアミノ酸で置換されているペプチドの修飾形態の使用を包含する。 A_nで表されるアミノ酸は、遺伝子またはそのアナログによりコードされるものであり得、そしてまたそれらのD-異性体であり得る。本発明のペプチドの１つの好ましい実施態様は、全ての残基がD-配置であり、それゆえ、抗菌または抗ウイルスの特性を保持しながら、プロテアーゼ活性に耐性を与える形態である。得られるプロテグリン自身が天然のL-アミノ酸含有形態のエナンチオマーである。本明細書で使用されるアミノ酸の記号は慣用のものであり、そして以下である：遺伝コードされないアミノ酸は、以下の議論で示されるように省略される。本出願で示される特定のペプチドでは、D-型が短剣符の上付き(⁺)により表現的に示される場合を除き、光学異性体を有するいずれのアミノ酸残基のL-型も意図される。本発明の化合物は、指定されたクラスのアミノ酸残基によって部分的に定義されるペプチドである。アミノ酸残基は、一般に、以下のように主なサブクラスに下位分類され得る：酸性残基：この残基が生理的pHでHイオンの喪失によって負電荷を有し、そしてこの残基は、ペプチドが生理的pHの水性媒体中に存在するときに、それが含有されるペプチドのコンホメーションの表面位置を探し出すように、水溶液によって引きつけられる。塩基性残基：この残基が生理的pHでHイオンとの結合によって正電荷を有し、そしてこの残基は、ペプチドが生理的pHの水性媒体中に存在するときに、それが含有されるペプチドのコンホメーションの表面位置を探し出すように、水溶液によって引きつけられる。疎水性残基：この残基は生理的pHで荷電されず、そしてこの残基は、ペプチドが水性媒体中に存在するときに、それが含有されるペプチドのコンホメーションの内部位置を探し出すように、水溶液によって反発される。中性／極性残基：この残基は生理的pHで荷電されないが、この残基は、ペプチドが水性媒体中に存在するときに、それが含有されるペプチドのコンホメーションの内部位置を探し出すであろうが、水溶液によって充分に反発されない。この説明はまた、特定のアミノ酸を「小さな」アミノ酸として特徴づける。なぜなら、これらの側鎖は、極性の基が欠ける場合にも、疎水性を与えるには充分に大きくはないからである。「小さな」アミノ酸は、少なくとも１個の極性基が側鎖にあるとき、４個またはそれ以下の炭素を有するものであり、そして側鎖に極性基がないとき、３個またはそれ以下の炭素を有するものである。もちろん、個々の残基分子の統計的な集合においては、いくつかの分子が荷電され、いくかの分子が荷電されず、そして水性媒体に対してより大きいまたはより小さい範囲の吸引力、あるいは水性媒体からより大きいまたはより小さい範囲の斥力が存在することが理解される。「荷電される」の定義に合うには、個々の分子の有意の割合（少なくとも約25％）が生理的pHで荷電される。極性または非極性としての分類に必要とされる吸引力または斥力の程度は任意であり、従って、本発明により具体的に意図されるアミノ酸は、その一方または他方として分類されている。具体的に命名されていないほとんどのアミノ酸は、公知の挙動に基づいて分類され得る。アミノ酸残基は、さらに環状または非環状、および芳香族または非芳香族、残基の側鎖の置換基に対して自明の分類、および小さいまたは大きいとして下位分類され得る。残基がカルボキシル炭素を含めて全体で４個またはそれ以下の炭素原子を含有する場合（但し、付加極性置換基が存在する場合）；残基が全体で３個またはそれ以下の炭素原子を含有する場合（但し、付加極性置換基が存在しない場合）、この残基は小さいと考えられる。もちろん、小さな残基は常に非芳香族である。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、上記のスキームに従う下位分類は以下である。酸性残基：アスパラギン酸およびグルタミン酸；塩基性残基：非環式：アルギニン、リジン；環式：ヒスチジン；小さな残基：グリシン、セリン、アラニン、トレオニン；極性／大きな残基：アスパラギン、グルタミン；疎水性残基：チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン。遺伝子でコードされた二次アミノ酸のプロリンは、ペプチド鎖の二次構造におけるその周知の効果のため、特殊の例となり、それゆえ、１グループに含まれない。システイン残基もまたこれらの分類に包含されない。なぜなら、それらがジスルフィド結合を形成して二次構造を与える能力が、本発明の化合物において決定的であるからである。遺伝コードによりコードされない特定の通常遭遇するアミノ酸は、例えば、β -アラニン(β-Ala)、または他のω-アミノ酸（例えば、3-アミノプロピオン酸、 2,3-ジアミノプロピオン酸(2,3-diaP)、4-アミノ酪酸など）、α-アミンイソ酪酸(Aib)、サルコシン(Sar)、オルニチン(Orn)、シトルリン(Cit)、t-ブチルアラニン(t-BuA)、ｔ-ブチルグリシン(t-BuG)、N-メチルイソロイシン(N-MeIle)、フェニルグリシン(Phg)、およびシクロヘキシルアラニン(Cha)、ノルロイシン(Nle )、2-ナフチルアラニン(2-Nal)；1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic)；β-2-チエニルアラニン(Thi)；メチオニンスルホキシド(MSO)；およびホモアルギニン(Har)を包含する。これらもまた便宜上特定のカテゴリに収まる。上記の定義に基づくと、Sar、β-Ala、2,3-diaP、およびAibは小さく；t-BuA 、t-BuG、N-MeIle、Nle、Mvl、Cha、Phg、Nal、Thi、およびTicは疎水性であり；OrnおよびHarは塩基性であり；Cit、アセチルLys、およびMSOは中性／極性である。種々のω-アミノ酸は、その大きさに基づいて、小さい（β-ALaおよび3-アミノプロピオン酸）または大きいかつ疎水性（その他の全て）に分類される。遺伝子でコードされたアミノ酸の他のアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内のペプチド化合物に包含され、そしてそれらの構造に従ってこの一般のスキーム内で分類され得る。本発明の全てのペプチドでは、１つまたはそれ以上のアミド結合（-CO-NH-）が、必要に応じて、同配体（例えば、-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-、および-CH₂SO-）である他の結合で置換され得る。この置換は当該分野で公知の方法により行われ得る。以下の参考文献は、その代わる結合部分を含むペプチドアナログの調製を記載している：Sp atola，A.F.，Vega Data(1983年3月)、１巻、３版、「ペプチド主骨格の修飾」( 概評)；Spatola，A.F.，「Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptid es and Proteins」にて、B．Weinstein編、Marcel Dekker，New York，第267頁( 1983)（概評）；Morley，J,S.，Trends Pharm Sci(1980)，第463〜468頁(概評) ；Hudson，D.ら、Int J Pept Prot Res（1979）14:177〜185(-CH₂NH-、-CH₂C H₂-)；Spatola，A.F.ら、Life Sci（1986）38:1243〜1249(-CH₂-S)；Hann，M.M. ，J Chem Soc Perkin Trans I（1982）307〜314(-CH-CH-、シスおよびトランス) ；Almquist，R.G.ら、J Med Chem（1980）23:1392〜1398(-COCH₂-)；Jennings-W hite，C.ら、Tetrahedron Lett（1982）23:2533（-COCH₂-）；Szelke，M.ら、ヨーロッパ出願EP45665（1982）CA:97:39405（1982）(-CH(OH)CH₂-)；Holladay，M .W.ら、Tetrahedron Lett（1983）24:4401〜4404(-C(OH)CH₂-)；およびHruby V. J.，Life Sci（1982）31:189〜199(-CH₂-S-)。式(1)の化合物は、一般に、およびそのＮ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化またはエステル化された形態として定義され、これは、必要に応じて-SH安定化された線状形態またはシスチン架橋された形態のいずれかであり、ここで、A₁およびA₉のそれぞれは、独立して、塩基性アミノ酸であり； A₂およびA₃のそれぞれは、独立して、小さなアミノ酸であり； A₅、A₇、A₁₂、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれは、独立して、疎水性アミノ酸であり； A₄およびA₁₀のそれぞれは、独立して、塩基性または小さなアミノ酸であり； A₁₁は塩基性または疎水性アミノ酸であり； A₁₇は存在しないか、または存在するなら、小さなアミノ酸であり； A₁₈は存在しないか、または存在するなら、塩基性アミノ酸であり、あるいは式(1)の修飾形態およびそのＮ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化またはエステル化された形態として定義され、ここで、１〜４個のシステインのそれぞれは、独立して、疎水性アミノ酸または小さなアミノ酸で置換され、但し、この化合物がアミド化およびジシスチン架橋形態で以下の式を有する場合、この化合物が精製および単離されることを条件とする：本発明の化合物の好適な実施態様においては、A₁およびA₉のそれぞれは、独立して、R、K、およびHarからなる群から選択され；より好ましくは、A₁およびA₉ は両方ともRである。好適な実施態様の他のクラスにおいては、A₂およびA₃のそれぞれは、独立して、G、A、S、およびTからなる群から選択され；より好ましくは、A₂およびA₃は両方ともGである。好適な実施態様の他のセットにおいては、A₄は、R、K、Har、G、A、S、および Tからなる群から選択され；より好ましくは、A₄はRまたはGである。好適な実施態様の他のセットにおいては、A₅、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれは、独立して、I、V、L、Nle、およびF；好ましくは、I、V、L、およびFからなる群から選択される。好適な実施態様の他のセットにおいては、A₇およびA₁₂のそれぞれは、独立して、I、V、L、W、Y、およびFからなる群から選択され；好ましくは、A₇はYであり、そしてA₁₂はIまたはFである。好適な実施態様の他のセットにおいては、A₁₀およびA₁₁のそれぞれは、独立して、R、G、またはWである。 A₁₇は、存在する場合、好ましくは、G、A、S、またはTであり、最も好ましくは、Gである。 A₁₈は、存在する場合、好ましくは、R、K、またはHarであり、最も好ましくは、Rである。上記されるように、式(1)の化合物は、環式または非環式（線状化された）形態のいずれかであり、あるいは修飾され得、ここで、１〜４個のシステインは小さなアミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基で置換される。式(1)の化合物の線状化された形態が調製される場合、または少なくとも２つのシステインを含有するそれらの修飾ペプチドの線状化された形態が調製される場合、スルフヒドリル基が適切な試薬の添加により安定化されることが好ましい。システイン残基を置換する疎水性アミノ酸の好適な実施態様は、I、V、L、およびNLeであり、好ましくは、I、V、またはLである。システイン残基を置換する好適な小さなアミノ酸は、G、A、S、およびTであり、最も好ましくはGである。他の実施態様においては、本発明のペプチドは、式(1)で記載されるように定義されるが、ここで、それぞれの場合におけるA_nの定義は、本発明の方法による動物の白血球からのペプチドの単離可能性によって決定される。本発明の方法は、動物の白血球の溶解物の限外濾過物を提供する工程、および16〜18個のアミノ酸のペプチドを単離する工程を包含する。これらのペプチドは、これらをコードするDNAが、本明細書でPG-1、PG-2、PG-3、およびPG-4として例示されるペプチドをコードするDNAに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力によりさらに定義され得る。本発明の特に好適な化合物は、非修飾形態それらの線状形態ならびに単および双環式形態の両方であり、そしてＮ末端アシル化形態およびＣ末端アミド化形態を包含し；修飾形態それらの線状形態および環式形態（可能である場合）の両方であり、そしてＮ末端アシル化形態およびＣ末端アミド化形態を包含する。本発明の化合物の調製本明細書でしばしば「プロテグリン」と称される本発明の化合物は、本質的に、N-またはＣ末端で修飾され得、そして１つまたは２つのシスチンジスルフィド結合をも含有し得るペプチド主骨格である。このペプチドは初めに非環式形態に合成され得る。所望であれば、これらのペプチドは、次いで、シスチン結合形成の標準方法により環式ペプチドに変換され得る。本明細書のプロテグリンに適用されるように、「環式形態」は、ペプチド中のシステイン残基の間にジスルフィド結合の形成によって環式部分を含有するそれらの形態を意味する。線形態が好適である場合、２個またはそれ以上のシステイン残基を含有する本発明のいずれのペプチドに関しても、スルフヒドリル基を安定化することが好ましい。プロテグリンのサイズのペプチド合成の標準方法は公知である。現時点で、最も通常に使用される方法は固相合成法であり；実際に、ペプチド鎖を系統的に構築するための自動装置もまた購入され得る。液相合成もまた用いられ得るが、便宜的にやや劣ると考えられる。これらの標準技法を用いて合成されるとき、遺伝子によってコードされないアミノ酸、およびD-エナンチオマーがこの合成に利用され得る。それゆえ、本発明の化合物を得るための１つの非常に実用的な方法はこれらの標準化学的合成法を利用することである。ペプチド主骨格を提供することに加え、Ｎ末端および／またはＣ末端は、従来の化学的技法を再度使用して誘導体化され得る。本発明の化合物は、必要に応じて、アシル基、好ましくは、アミノ末端におけるアセチル基を含有し得る。Ｎ末端で遊離アミノ基をアセチル化する、またはより一般的に、アシル化する方法は、一般に、当該分野で公知であり；また、Ｎ末端アミノ酸は、合成において、アシル化された形態で供給され得る。カルボキシ末端において、カルボキシル基が、もちろん、塩の形態で存在し得；薬学的組成物の場合では、これは薬学的に受容可能な塩である。適切な塩には、NH₄ ⁺、Na⁺、K⁺、Mg⁺⁺、Ca⁺⁺などのような無機イオンと形成した塩、およびカフェインおよびその他の高度置換アミンの塩のような有機カチオンと形成した塩が包含される。カルボキシ末端はまた、式ROHのアルコール（ここで、Rは先に定義されるように、ヒドロカルビル(1-6C)である）を用いてエステル化され得る。同様に、カルボキシ末端は、式-CONH₂、-CONHR、または-CONR₂(ここで、各Rは、独立して、本明細書で定義されるように、ヒドロカルビル（hydrocarbyl）(1-6C )である）を有するようにアミド化され得る。エステル化およびアミド化ならびに塩基の存在下で中和して塩を形成する技法は全て標準有機化学的技法である。本発明のペプチドが生理的条件下で調製される場合、塩基性アミノ酸の側鎖アミノ基は、関連の酸付加塩の形態である。ジスルフィド結合の形成は、所望であれば、穏和な酸化剤の存在下で行われる。化学酸化剤が使用され得、またはこの化合物が単に空気中の酸素に曝されてこれらの結合を与え得る。種々の方法が当該分野で公知である。ジスルフィド結合形成に有用なプロセスは以下の文献に記載されている：Tam，J.P.ら、Synthesis （1979）955〜957；Stewart，J.M.ら、「Solid Phase Peptide Synthesis」、第２版、Pierce Chemical Company Rockford，IL(1984); AhmedA.K.ら、J Biol Ch em （1975）250:8477〜8482およびPennington M.W.ら、Peptides 1990，E．Giral tら、ESCOM Leiden，The Netherlands（1991）164-166。さらなる他の方法は、K amber，B.らにより、Helv Chim Acta（1980）63:899〜915に記載されている。固相支持体上において行われる方法はAlbericioによりInt J Pept Protein Res(19 85)26:92〜97にて記載されている。特に好適な方法は、分子酸素を用いる液中酸化である。この方法は、本発明者らにより、本明細書中において、合成PG-1、アミドまたは酸形態のPG-3、PG-1のエナンチオマー、および２つのユニスルフィドPG-1化合物（C₆-C₁₅およびC₈-C₁₃ ）を再生するために使用された。回収率は30％程度である。ペプチド主骨格が遺伝子コード化されたアミノ酸から全体的に構成される場合、またはその一部がそのように構成されるときに、このペプチドまたは関連の部分はまた、組み換えDNA技法を用いて合成され得る。本発明のペプチドをコードするDNA自身は、市販の装置を用いて合成され得；コドン選択は、宿主の性質に依存して合成に組み込まれ得る。他方、便宜上やや劣るが、DNAは、少なくとも開始の時点で、本明細書に記載のプロテグリンの配列に基づいたプローブまたは PCRプライマーを用いてブタ白血球から調製されたcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。これにより、本発明のプロテグリンをコードする天然に存在する配列の回収が得られる。この天然の配列の入手は、プロテグリンの合成自体以外の目的に関して重要であり；天然存在の配列の利用可能性は、他の種のプロテグリンをコードする対応のDNAを得るための有用なプローブを提供する。それゆえ、例えば、他の動物に由来する白血球のcDNAライブラリーは、天然のDNAを用いて、好ましくは高ストリンジェント条件下で、スクリーニングされ得る。高ストリンジェントはManiatisらにより、Molecular Cloning: a Laboratory Manual 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)にて定義され、その関連の部分は本明細書中で参考として援用されている。この手順はまた、同じ種からのこれらのペプチドの対立変異体の回収を可能にする。他方、プロテグリンは、ブタプロテグリンの単離について本明細書に開示の技法と同じ技法を用いて、所望の種の白血球からの単離によって調製され得る。一般に、これらの技法には、白血球調製品の溶解物を調製し、透明になった溶解物の上清を限外濾過し、そして限外濾過物を回収することが包含される。限外濾過物は、次いで、クロマトグラフィー分離にかけられる。プロテグリンに相当する、抗菌および抗ウイルス活性を有するフラグメントの位置は、分子量の判断基準を用いること、および本明細書に記載されているように所望の活性について画分をアッセイすることにより評価され得る。これらのペプチドの天然の形態は環式形態であると考えられ；所望であれば、線状化された形態は、還元剤でこのペプチドを処理し、そして生じるスルフヒドリル基を安定化することにより調製され得る。単離形態および組み換え生産形態のプロテグリンは、Ｎ末端および／またはＣ末端を修飾し、そして単離の手順に依存して先に記載されているようにシスチン結合の形成を与えるように、次の誘導を要し得る。組み換え生産のための宿主生物体およびタンパク質が単離される動物供給源に依存して、これらの変換の一部または全てが既に行われ得た。組み換え生産について、本発明のプロテグリンをコードするDNAは、適切なプロモーターおよび意図される宿主細胞と適合性の他の制御配列の制御下にこれらのコーディング配列を配置する発現系に含まれる。入手可能な宿主細胞のタイプは、植物界および動物界のほぼ全体的な範囲に及ぶ。従って、本発明のプロテグリンは、微生物または酵母（これらが非毒性または屈折形態で生産され得る、あるいは耐性株を利用し得る範囲で）、ならびに動物細胞、昆虫細胞および植物細胞において生産され得る。実際、改変された植物細胞は、得られるトランスジェニック植物がこれらの感染因子に対して自己保護を可能にするように、関連の発現系を含有する植物を再生するために使用され得る。本発明のプロテグリンは、プロテグリンをコードするDNAに適切なシグナルペプチドをコードするDNAを融合することにより宿主細胞からのそれらの分泌を生じる形態で生産され得るか、または細胞内に生産され得る。これらはまた、付加のアミノ酸配列を有する融合タンパク質として生産され得、これらのアミノ酸配列は、抗菌または抗ウイルス剤としてのこれらの化合物の使用の前に、続いて除去されてもされなくても良い。それゆえ、本発明のプロテグリンは、化学合成、組み換え生産、天然の供給源からの単離、またはこれらの技法の組み合わせを含む種々の様式で生産され得る。天然に存在するプロテグリンクラスのそれらのメンバーは、精製および単離された形態で供給される。「精製および単離された」とは、ペプチドが通常存在する環境（天然に存在するペプチドのような場合）にはなく、そして実際に使用され得る形態であると意味する。それゆえ、「精製および単離された」形態とは、ペプチドが実質的に純粋であり、すなわち、純度90％を超える、好ましくは、純度95％を超える、そしてより好ましくは、純度99％を超えること、または完全に別の文脈では薬学的調製品の純度を意味する。抗体本発明のプロテグリンに対する抗体もまた、ポリクローナル抗血清の生産についての標準の免疫学的技法を用いること、および所望であれば、モノクローナル抗体生産の供給源のための免疫宿主の抗体生産細胞を不死化することにより生産され得る。目的とするいずれもの物質に対する抗体を生産する技法は周知である。ハプテンをキャリアにカップリングしてこの物質の免疫原性を増強することは、特に本願におけるように、材料が単なる短いペプチドである場合に、必要であり得る。この目的のための適切なキャリアは、ハプテンキャリア複合体が投与される哺乳類において自身が免疫応答を生じない物質を包含する。一般的に使用されるキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ジフテリアトキソイド、血清アルブミン、およびロタウイルスのウイルスコートタンパク質、VP6 を包含する。キャリアへのハプテンのカップリングは、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような脱水剤の存在下で、またはリンカー（例えば、Pierce Chemcial Company Chicago，ILにより入手できるリンカー）の使用を通じて、キャリアをペプチドと接触させるような標準の技法により、行われる。免疫原性形態の本発明のプロテグリンが、次いで、適切な哺乳類宿主に注射され、そして血清中の抗体力価がモニターされる。しかし、いくつかの形態のプロテグリンは、抗原プロセシングへのそれらの耐性のため、これらが抗体を生じさせ得る前に、修飾を必要とすることに注意すべきである。例えば、２つのシスチン架橋を含有するPG-1の天然の形態は、大きなキャリアにカップリングされずに投与されるとき、非免疫原性であり、そして強力なアジュバントの存在下で、およびグルタルアルデヒドによってまたはKLHにカップリングされたときにも、貧免疫原であった。出願人は、これは、白血球セリンプロテアーゼ（ヒトPMNエラスターゼおよびカテプシンG）による攻撃、およびいくつかのマクロファージカテプシンに類似するアスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン）による攻撃に対するその耐性に起因すると考えている。従って、免疫原性の欠如は、提示細胞の抗原提示ポケットに適合し得る線状形態へのプロセシングに対する耐性から生じ得る。これらの形態のプロテグリンの免疫原性は、ジスルフィド結合を切断することにより増強され得る。ポリクローナル抗血清は、力価が十分に高いときに、採取され得る。他方、膵臓細胞または末梢血液リンパ球のような宿主の抗体生産細胞が採取および不死化され得る。不死化細胞は、次いで、個々のコロニーとしてクローン化され、そして所望のモノクローナル抗体の生産についてスクリーニングされる。本発明の抗体は、もちろん、プロテグリンの量または存在を決定する免疫アッセイに有用である。このようなアッセイは、本発明のプロテグリンを含有する組成物の生産を定性的に制御するには必須である。さらに、この抗体は、プロテグリンの組み換え生産の効率を評価し、そしてプロテグリンコード化遺伝子の存在について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。プロテグリンを含有する組成物および使用方法本発明のプロテグリンは、グラム陽性およびグラム陰性の細菌、酵母、原生動物、およびある種のウイルス株を含む、広範な微生物標的およびウイルス標的を不活性化するに効果的である。従って、これらは、殺菌組成物に使用され得、そして食料品、化粧品、医薬品のような材、または生物栄養素を含有する他の材の保存剤として使用され得る。この文脈における使用のために、プロテグリンは、単一のプロテグリンとして、いくつかの他のプロテグリンとの混合物、またはさらなる抗菌剤との混合物のいずれかで供給される。一般に、これらがこの文脈での保存剤であるとき、これらは、通常、組成物の全重量に対して、５％重量未満、より好ましくは、１％重量未満、さらにより好ましくは、0.1％重量未満の比較的低い量で存在する。本発明のペプチドはまた、抗菌アッセイおよび試験化合物のリポ多糖のようなエンドトキシンとの結合能力を測定するアッセイの標準として有用である。動物被検体の治療用の抗菌剤または抗ウイルス剤として使用される場合は、本発明のプロテグリンは、薬学または獣医学的組成物として処方され得る。治療される被検体、投与の方式、および所望の治療タイプ（例えば、防止、予防、治療）に依存して、プロテグリンは、これらのパラメーターと調和する方法で処方される。このような技法のまとめは、RemingtonのPharmaceutical Sciences、最新版、Mack Publishing Co.，Easton，PAに見出される。これらのプロテグリンは、特に、性感染症（これらには、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、淋菌(Ne isseria gonorrhoeae)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、II型単純ヘルペス、およびHIVにより引き起こされるものが包含される）の治療に有用な薬学的組成物の活性成分として魅力的である。局所処方が好ましく、これには、クリーム、軟膏、オイル、粉末、ゲルなどが包含される。適切な局所賦形剤は当該分野で周知であり、そして特定の用途に応じて当業者によって適合され得る。一般に、STDの治療または予防に使用するために、本発明のプロテグリンは、単独で、またはエリスロマイシン、テトラサイクリン、マクロライド系抗生物質（例えば、アジトロマイシン(azithromycin)、およびセファロスポリン）のような他の抗生物質との組み合わせて使用され得る。投与の方式に依存して、プロテグリンは、罹患部への送達を容易にする適切な組成物に処方される。プロテグリンは、１つまたは２つのジスルフィド架橋を含有する形態で使用され得るか、または線状の形態であり得る。また、全てのD-アミノ酸を含有するエナンチオマー形態の使用は、プロテアーゼ（例えば、トリプシンおよびキモトリプシン）への耐性のような利点を与え得、これらのプロテアーゼに対しては、L-アミノ酸を含有するプロテグリンは耐性が低い。本発明のプロテグリンは、単独で、またはいくつかのプロテグリンの混合物として、または他の薬学的活性成分との組み合わせて投与され得る。処方物は、全身投与、あるいは局所または局部投与に適切な方式で調製され得る。全身投与は、注射用に設計したもの（例えば、筋内、静脈内、または皮下注射）を包含し、あるいは経皮、経粘膜、または経口投与のために調製され得る。処方物は、一般に、希釈剤、および特定の場合では、アジュバント、緩衝液、保存剤などを含有する。プロテグリンは、リポソーム組成物中で、またはマイクロエマルジョンとして投与され得る。投与が経口である場合は、本発明のプロテグリンは、適切な腸溶剤皮を用いて胃における分解から保護されなければならない。これは、D-配置のアミノ酸を利用してプロテアーゼへの耐性を与えることにより、ある程度まで避けられ得る。しかし、このペプチドはなお、胃の酸性条件による加水分解に影響を受けやすく、それゆえ、ある程度の腸溶剤皮がなお必要とされる。以下の実施例に記載されるように、本発明のペプチドは、アイケア製品に通常使用されるホウ酸塩溶液においてそれらの抗菌活性を維持する。ホウ酸塩緩衝化生理食塩水中のリゾチームの存在または非存在下で大腸菌(E.coli)に対する抗菌活性を試験するときに、リゾチームの存在がPG-3の効果を増強することが示された。この効果は、PG-3がオートクレーブにかけられたときに、さらに顕著であり、そして同じ効果が遊離酸形態およびアミドの両方についても得られた。従って、プロテグリンは、このような組成物中の保存剤として、または眼感染症治療用の抗菌剤として使用され得る。特に重要なのは、プロテグリンが生理的条件下（比較的高い生理食塩水および血清の存在下を含む）でそれらの活性を維持することである。また、プロテグリンは、高等生物の細胞に対して細胞毒性ではない。これらの性質は、本明細書の以下の実施例に記載されており、これらのプロテグリンをインビボでおよび治療用途に特に適切にする。本発明のプロテグリンはまた、植物におけるウイルスおよび細菌誘導性の病気を防ぐために、植物またはそれらの環境に適用され得る。この用途のための適切な組成物は、典型的に、希釈剤、および分散剤あるいは植物または環境に有益な他の補助的調和物を含有する。それゆえ、本発明のプロテグリンは、抗菌および／または抗ウイルス作用が必要とされるいかなる場合においても使用され得る。この使用は完全にインビトロでの使用であり得るか、またはこのペプチドは生物体へ投与され得る。また、抗菌または抗ウイルス活性は、本発明のプロテグリンの生産に適切な発現系を投与することにより、インサイチュで生成され得る。このような発現系は、周知の技法を用いて、植物被検体および動物被検体に供給され得る。例えは、動物においては、ポックスベースの発現ベクターが、ペプチドをインサイチュで生成するために使用され得る。同様に、植物細胞は、発現ベクターで形質転換され、次いで、ペプチドの自己生産が可能な植物体に再生され得る。プロテグリンの特に有用な性質は、血清の存在下でのそれらの活性である。デフェンシンとは違って、プロテグリンは血清の存在下でそれらの抗菌効果を発揮することができる。以下に示されように、プロテグリンは、標準のアッセイにおいて、グラム陰性細菌に由来するエンドトキシン（すなわち、リポ多糖(LPS)）を不活性化することができる。従って、プロテグリンは、LPSの不活性化が望まれるいかなる情況下でも使用され得る。このような情況の１つは、グラム陰性敗血症の治療または改善の場合である。従って、本発明のプロテグリンは、以下の特性のために、特に有用なクラスの化合物を代表する： 1) これらは、レトロウイルスを含むウイルス、細菌、真菌、酵母、および原生動物を包含する広域スペクトルの標的微生物系に対して抗菌効果を有する。 2) これらの抗菌活性は、生理的条件下、すなわち、生理食塩水および血清の存在下で効果的である。 3) これらは、高等生物の細胞に対して非毒性である。 4) これらは、非免疫原性形態で調製され得、それゆえ、これらが投与され得る種は多くに及ぶ。 5) これらは、特定のプロテアーゼに対して耐性である形態で調製され得、これらがリソソームにおいても抗菌性であることを示唆する。 6) これらは、オートクレーブにかけられるときに分解を受けない形態で調製され得、それゆえ、薬剤の成分としてのそれらの調製を簡便化する。以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、本発明を限定するものではないと意図される。実施例１ PG-1、PG-2およびPG-3の単離新鮮なブタの血液を、抗凝固剤として５％EDTAを含む標準生理食塩水(pH7.4) の入った15リットル容の容器に採集した(33ml/血液1リットル)。血液細胞を室温で90分間沈降させ、そして白血球リッチな上清を除き、そして200×ｇで5.7分間遠心分離した。ペレットをプールし、0.84％の塩化アンモニウム中で懸濁して、赤血球を溶解させ、そして得られた白血球(70〜75%のPMN、5〜10%の好酸球、15 〜25%のリンパ球および単球)を標準生理食塩水で洗浄し、氷冷した10%酢酸に10⁸ ／mlで再懸濁し、ホモジナイズして一晩４℃で撹拌した。この調製物を４℃で、３時間、25,000×ｇで遠心分離し、この上清を凍結乾燥して重量を計った。 950mg（乾燥重量）の凍結乾燥抽出物は、BCA分析によれば520mgのタンパク質を含み、それを４℃の100mlの10％酢酸中で一晩撹拌し、次いで25,000×ｇで２時間遠心分離した。上清を取り出して、そしてYM-5フィルターを有する50mlの撹拌超遠心セル(stirred ultlacentrifugation cell)(Amicon、Danvers MA)に圧力によって通した。限外濾過物（タンパク質24.5mg、BCAによる）を減圧遠心分離( vacuum centrifugation)(SpeedVac Concentrator、Savant Instruments、Hicksv ille、NY)によって３mlにまで濃縮し、2.5×117cmのBioGel P10カラム(Bio-Rad 、Hercules、CA)にかけ、そして５％酢酸で４℃で溶出した。 6.6mlの画分を得た。画分を280nmでの吸光度によってアッセイし、そして溶出パターンを図１に示す。各画分のアリコート(66μl)を減圧遠心分離によって乾燥させ、そして6.6μl の0.01％酢酸に再懸濁した。５μlのこの濃縮物サンプルを、Lehrer，R.Iら、J. Immunol Meth （1991）137:167-173)に記載されるように、放射状拡散(radiodiff usion)およびゲル重ね合わせ(gel overlay)技術を用いて、E coli ML-35、L.mon ocytogenes EGD株、およびC.albicans 820株に対する抗菌活性に関してテストした。簡潔に言うと、全生物に用いられる下敷き寒天は、最終pHが6.5であり、９m Mリン酸ナトリウム／1mMクエン酸ナトリウム緩衝液、１％w/vアガロースおよび0 .30μg/mlトリプトカーゼ大豆ブロスパウダー(tryptocase soy broth powder)(B BL Cockeysville、MD)を含んでいた。放射状拡散アッセイの活性単位は、次のように測定した；10単位は、サンプルウェルの周りの直径1mmの透明帯(clear zone )に相当する。種々の画分から得られた活性を図２に示す。活性は、多くの画分中に見出された。活性画分を、酸−尿素PAGE(AU-PAGE)およびSDS-PAGEによってさらに試験した。これらの分析の結果は、適切な分子量の活性抗菌ペプチドが存在し、そして画分76〜78に濃縮されたことを示す。次に、BioGel P10カラムからの画分76〜78をプールし、そして１×25cmのVyda c 218 TP1010カラム上て勾配（緩衝液Ａは、0.1% TFA；緩衝液Ｂは、アセトニトリルに溶かした0.1% TFA）を用いてクロマトグラフィーにかけた。アセトニトリル濃度の増加は、１分間当たり１％であった。結果を280nmおよび225nmにおける吸光度によって評価し、図３に示す。図において、本明細書中に示される３つのペプチドに対応するピークに名称を付けた。この図はまた、プールされた画分と個々のPG種とからなる出発混合物を含み、クマシーブルーで染色した酸−尿素PA GEゲルの結果を示す挿入図を含む。これらは、挿入図中でＭ、１、２、および３と名付けられている。結果は、３つの異なるタンパク質の存在をはっきりと示している。単離されたタンパク質を３つの別々の方法、すなわちEdman分解法、キモトリプシン分解法、および高速原子衝撃質量分析法を用いてアミノ酸分析を行った。「プロテグリン(protegrin)」と名付けられたペプチドは、次のようなアミノ酸配列を有することが示される：そしてＣ末端は、アミド化されている。単離したペプチドのアミド化状態を、PG-3を遊離のカルボキシル形態およびカルボキシアミド化形態の両方に合成することによって確立した。次いで、これらの合成ペプチドを、AU-PAGEを用いて、そしてさらに逆相HPLCを用いて単離したP G-3と比較した。どちらの場合でも、天然の産生物は、合成アミド化形態と一緒に共移動した。単離したプロテグリンのジスルフィド結合の場所もまた、PG-2をモデルとして用いて研究した。測定は、酵素分解（キモトリプシン、続いてサーモリシン）を連続的に用い、得られたフラグメントに関してLC-ESI-MSを用いる直接分析によって行った。これらの分析結果は、２つの分子内ジスルフィド結合がＣ₆−Ｃ₁₅ およびＣ₈−Ｃ₁₃であることを示した。これらの位置でのジスルフィドの場所によると、プロテグリン分子は、全体のコンホメーションにおいてタキプレシン(t achyplesin)と同様の逆平行のβシートとして存在するようである。上記の抗菌性タンパク質は、デフェンシン(defensin)がウサギ顆粒球中の総タンパク質の15％より多くを構成する対応する粗抽出物中のウサギデフェンシンよりもかなり低い濃度で初めの抽出物中に存在する。精製の種々の段階でAU-PAGE 分析法を用いると、ペプチドは、粗抽出物中ではごく僅かに見えるだけであるが、一方、ウサギ顆粒球の対応する粗抽出物は、はっきりとデフェンシンの存在を示す。本発明のペプチドは、限外濾過工程の後にのみはっきりとわかるようになる。上記に構造を示したプロテグリンが、PG-3の位置４〜13のデカペプチド領域中のウサギデフェンシンNP-3aの１〜10残基に対応するデカペプチド領域に対して配列相同性を示すので、プロテグリン、特にPG-3は、副腎皮質細胞(adrenocyte) によるACTH介在性ステロイド合成と競合的に拮抗し得る点においてデフェンシン NP-3aの特性を共有し得る。この特性は、「コルチコスタシス(corticostasis)」と呼ばれ、インビボで用いられる場合、抗感染剤としてプロテグリンの効力に影響を及ぼし得る。実施例２抗菌活性実施例１に記載されたアガロースゲルにおける放射状拡散アッセイを用いて、精製プロテグリンの活性もまたテストした。図4a、4b、および4cは、上記の単位による３つのテスト生物に対する結果を示す。ウサギデフェンシン(NP-1)およびヒトデフェンシン(HNP-1)をコントロールとして用いた。図4aは、PG-1およびPG-3がE.coli ML-35Pに対してHNP-1よりは効果的であり、そしてNP-1よりもほんのわずか効果が劣ることを示す。図4bに示されるように、 PG-1およびPG-3はまた、Listeria monocytogenes EGD株に対しても効果的である。図4cでは、PG-1およびPG-3はまた、Candida albicansに対しても効果的であることが示された。一般に、これらのペプチドは、体重を基準とした場合には、ウサギデフェンシンNP-1とほぼ同じくらい効果的であり、そしてHNP-1よりも効果的である。全ての場合において、PG-2もまた、３つのテストされた生物に対して効果的であったが、他の２つのペプチドほど活性ではなかった。上記の生物の増殖を阻害するその活性に加えて、本発明のPG-1は、Staphyloco ccus aureus（図を参照のこと）およびK.pneumoneae 270（図）の増殖を阻害することが直接的に示された。コントロールとして用いたHNP-1は、S.aureusに対して効果が劣り、そしてK.pneumoneaeに対してはほとんど全く効果がなかった。本発明のプロテグリンはまた、種々の他の生物に対してテストされ、そして広いスペクトル活性を示す。後の実施例９に記載されるように、STDに関連した微生物の増殖または感染の阻害におけるそれらの効果に加えて、このプロテグリンは、上記で試験された微生物に加え、以下の微生物に対しても強い活性を示す： Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Salmonella typhimurium、S taphylococcus aureus、Histoplasma capsulatum、Myobacterium avium-intrace llulare、およびMycobacterium tuberculosis。このプロテグリンは、Vibrio vu lnificusに対して並の活性しか示さず、そしてVibrio choleraeおよびBorrelia burgdorferiに対しては不活性であった。実施例３特定の条件下での活性の保持本発明の化合物の抗菌活性は、上記のようにテストしたが、100μMのNaClの条件下で、かつ90％ウシ胎児血清の存在下で行った。図5aおよび5bは、PG-1および PG-3がそれぞれC．albicansおよびE．coliに関して100mMのNaClの存在下でもそれらの活性を保持することを示す。NP-1もHNP-1もどちらもこの特性を有さない。図5cは、90％ウシ胎児血清存在下ではNP-1およびNHP-2はC．albicansを不活化する能力を失うが、PG-3による不活性化は保持されることを示す。従って、本発明のプロテグリンは、アイケア製品において使用するのに適切な等張性のホウ酸溶液を含む有用な生理学的条件下で、それらの抗菌特性を保持する。さらに、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)および1:100希釈のトリプチカーゼ大豆ブロスのみを含む下敷き層ゲルにおいて、E．coli ML-35（血清感受性）に対する活性に関して2.5％正常ヒト血清（このE．coli株の溶菌濃度より低い）の存在下および非存在下の両方で、合成PG-1をテストした。血清存在下では、最少殺細菌濃度は、約1.0μg/mlから約0.1μg/mlに低下した。このタイプの効果は、カテプシン(cathepsin)Gの線状フラグメントまたはデフェンシンHNP-1のいずれに関しても観察されなかった。同様に、C．albicansを標的生物として用いて、10%正常ヒト血清と共におよびなしで10mMリン酸ナトリウムによって下敷き層を調製した。最少殺真菌濃度は、血清非存在下での約1.3μg/mlから血清存在下での0.14μg/mlに低下した。この濃度での血清自体は、C．albicansに影響を及ぼさなかった。従って、プロテグリンの作用は血清の存在によって阻害されるだけでなく、それによって促進もされる。同様の結果がL．monocytogenesを標的生物として用いても得られた。プロテグリンPG-1およびPG-3を、0.5μg/mlペプシンと共にpH2.0で４時間インキュベートし、次いで中和した。C．albicans、E．coliおよびL．monocytogenes に対する残った抗菌活性を評価し、そして十分に保持されていることを見出した。同様の実験により、これらの化合物は、ヒト白血球エラスターゼ(elastase)またはヒト白血球カテプシンGによって分解されず、たとえ高濃度のこれらの酵素に曝されたり、pHが蛋白分解活性に良好な7.0〜8.0であっても、分解されないことが示される。さらに、合成PG-3アミドおよび合成PG-3酸をオートクレーブし、そしてE．coli、L．monocytogenesおよびC．albicansに対する抗菌活性をテストした；全ての場合において、完全な抗菌活性が保持されていた。これらの化合物のプロテアーゼ分解およびオートクレーブに対する安定性は、ジスルフィド結合の存在によって高めることができる。実施例４エンドトキシンへの結合能本発明のプロテグリンを、それらがグラム陰性細菌E．coli 0.55B5株の脂質多糖(LPS)に結合する能力に関してテストした。アッセイは、テスト化合物の存在下および非存在下で行われたエンドトキシンに対するカブトガニアメーバ様細胞溶解産物(Limulus amebocyte lysate)(LAL)テストであった。このテストは、Sig ma Technical Bulletin No.210（1992年12月改訂、Sigma Chemical Company、St ．Louis、MOから発行）に記載された手順を用いて行った。 LALテストは、LPSが市販の試薬E-Toxate^TM中でのゲル化に影響を及ぼす能力に基づいている。このE-Toxate^TMは、カブトガニ(Horseshoe Crab)Limulus polyph emusの循環するアメーバ様細胞の溶解産物から調製される。専門雑誌に記載されているように、微量のLPSに曝された場合、この溶解産物はその不透明度および粘度を増加させ、そしてエンドトキシンの濃度に応じてゲル化し得る。専門雑誌は、続いて、そのメカニズムが哺乳動物の血液の凝固に類似しているように見え、そしてカルシウムイオン存在下でLPSによりトリプシン様プレ凝固酵素を活性化し、次いで凝固可能なタンパク質を産生させるためにタンパク分解による「コアギュロゲン(coagulogen)」を酵素的に改変する工程を含むことを推測している。これらの工程は、生物学的活性または分子の「発熱性(pyrogenic)」部分に制約されると考えられている。解毒されたLPS（またはエンドトキシン）は、LALテストで陰性を示すことが先に示された。テスト化合物を最終容量0.2ml中に0.25μg〜10μgの種々の濃度で用い、そしてテスト混合物は最終濃度0.05エンドトキシン単位／mlのLPSおよび同じ濃度のE -Toxate^TMを含んだ。このテスト化合物を、0.2mlのE-Toxate^TMを添加した後、最終容量にE-Toxate^TMを加える前にLPSと一緒に15分間インキュベートした。次いで、試験管を37℃で30分間インキュベートし、そしてゲルの形成について試験した。単離した天然プロテグリン(nPG)および合成的に調製されたプロテグリン(sPG) の両方をテストした。sPGをＣ末端にカルボキシル基を用いるか、またはアミド化されたＣ末端を用いて調製した。nPGは、Ｃ末端でアミド化した。６つの異なるウサギデフェンシン(NP)および４つの天然ヒトデフェンシン(HNP)もまたテストした。結果を表１に示す。結果から分かるように、全てのプロテグリンは、合成も天然もどちらも、そしてアミド化形態も非アミド化形態もどちらも、LPSに十分に結合して、2.5μg/0. 2mlという低い濃度でいかなる実質的なゲル形成も妨げることができる。nPG-1およびnPG-2は、やや低い濃度で効果的である。プロテグリンは、実質的に、NPまたはHNPテスト化合物より効果的である；これらのコントロールの中で最も効果的なものは、NP-3aであり、そのペプチドの一次配列は、プロテグリンの一次配列に最も密接に似ている。追跡実験では、LPSの濃度は、0.05〜0.25エンドトキシン単位(E.U.)まで変わり、そして合成PG-3アミドをテスト化合物として用いた。結果を表２に示す。これらの結果は、ゲル化の阻害は、LPS濃度の上昇によって克服できるので、ゲル化酵素カスケードによる妨害というよりも、むしろLPSとの相互作用がゲル化の欠如の原因であることを示している。実施例５線状化形態の活性ジスルフィド結合をスルフヒドリル基に変換するための還元剤を用いて、nPG- 1およびnPG-3を線状化形態に変換した。次いで、それをヨードアセトアミドでアルキル化することにより安定化させた。次に、標準的なLALアッセイにおいて、環状および線状の両方のPG-1およびPG- 3がゲル化を阻害する能力を、実施例４に記載のように評価し、そして結果を表３に示す。これらの結果は、プロテグリンの線状化形態および環状形態が、ゲル化の阻害およびエンドトキシンへの結合を等しく行い得ることを示している。線状化形態の抗菌活性を天然プロテグリンの抗菌活性とも比較した。テストしたプロテグリンの線状形態および環状形態の両方とも、抗菌剤としてのこれらのペプチドの効力は、標的生物の性質およびテスト条件に依存するが、抗菌活性を示し続ける。天然PG-1およびその線状化形態(cam-PG-1)、ならびにPG-3およびその線状化形態(cam-PG-3)の抗菌活性を、Lehrer,R.I.ら、J Immunol Meth（1991 ）137:167-173によって記載されるように、実施例１に述べた手順に従ってテストした。結果を図6a〜6fに示す。図6aおよび6bは、10mMのリン酸-クエン酸緩衝液(pH6.5)（図6a）中の、または 100mM NaClを加えたこの緩衝液の存在下（図6b）のいずれかにおいて、E．coli ML-35Pに関して、20μg/ml〜125μg/mlの濃度範囲のこれらのペプチドの抗菌活性を示す。プロテグリンは両方ともこの生物に関して強い抗菌活性を示した；線状形態は緩衝液のみが存在する場合、環状形態より僅かに効力が優れていた；一方、等張条件下では、環状形態の方が線状形態よりも効力が優れていた。図6cおよび6dは、L.monocytogenesに関する抗菌効果を示す。図6cでは、上記の緩衝液のみが用いられ、プロテグリンの環状形態および線状化形態の両方とも強い抗菌活性を示し、そして両方ともテストした濃度範囲（20μg/ml〜125μg/m l）に亘ってほぼ等しい効力であった。図6dは、100mM NaClを加えたこの緩衝液の存在下で同じ濃度範囲に亘ってL.mo nocytogenesに関する効果を示す。環状形態は、僅かに強い濃度依存性によって強い抗菌活性を保持していた。線状化は、高濃度ではなお抗菌効果を示し得るが、活性をかなり低下させるようであった。酵母C.albicansをテストし、その結果を図6eおよび6fに示す。図6eは、これらのプロテグリンのすべての形態が、10mMリン酸緩衝液のみの存在下でテストされた場合には上記濃度範囲に亘って用量依存的に抗菌性であるが、線状化ペプチドは、非常に僅かに効力が劣ることを示す。図6fは、100mM NaClを加えた緩衝液の存在下で行われた同じアッセイの結果を示す。環状形態がほぼ同じレベルの抗菌効果を保持するのに対し、線状化形態の活性は大きく減少し、その結果プロテグリン濃度が100μg/mlより低い濃度であると実質的に抗菌効果は見られなかった。しかし、130μg/mlより高い濃度では、中程度の抗菌効果が観察された。従って、プロテグリンの環状化形態および線状化形態は両方とも、標的微生物および使用条件に依存して、抗菌活性を有する。実施例６眼の処置に適切な条件下での抗菌活性コンタクトレンズ溶液は、典型的には、ホウ酸緩衝化生理食塩水によって処方され、そしてさらにEDTAを含み得るか含み得ない。合成PG-3アミドおよび合成PG 酸の形態のプロテグリンを一般に実施例１に記載のアッセイにおいてテストしたが、ここで、下敷きゲルは全て、25mMホウ酸緩衝液(pH7.4)、1％(v/v)トリプトカーゼ大豆ブロス(0.3μg/ml TSBパウダー)および1％アガロースを含む。添加物は、100mM NaCl、1mM EDTAまたはそれらの組み合わせのいずれかを含んだ。コントロールとして用いた他のテスト化合物は、デフェンシンNP-1およびリゾチームであった。用量応答曲線を決定した。表４は、種々のテスト化合物のμg/ml単位の推定の最少殺菌濃度を示す。表に示されるように、プロテグリンは、25mMリン酸緩衝液中よりも25mMホウ酸緩衝化生理食塩水中の方がやや活性が劣るが、抗菌活性は、生理食塩水の添加によって増大し、そして1mM EDTAによって適度に増大する。同様のテストを標的生物としてCandida albicansを用いて行い、結果を表５に示す。表５もまた最少殺真菌濃度の推定値を示す。表６は、L.monocytogenesを標的として用いて行われた同様の実験の結果を示す。示される結果は、これらの化合物が、アイケア製品に適切な条件に典型的に関連する条件下でそれらの抗菌効果を及ぼし得るということを示す。実施例７ cDNAクローンおよび新規なプロテグリンをコードするcDNAの回収 cDNAの生成およびPCR増幅グアニジニウムチオシアネートを用いて、若い赤色Durocブタの骨髄細胞から全RNAを抽出した。１μgの全RNAを用いて、20pmolのオリゴ(dT)プライマーおよび200Uのモロニーネズミ白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(Clontech Laborator y、Palo Alto、CA)によって、総反応容量20μlにてcDNAの第１鎖を合成した。2 つのPCRプライマーを調製した。センス鎖プライマー(5'-GTCGGAATTCATGGAGACCCA GAG(AまたはG)GCCAG-3')は、PG-2およびPR-39 cDNAの5'領域に対応し、EcoRI制限部位を含んでいた。アンチセンス鎖プライマー(5'-GTCGTCTAGA(CまたはG)GTTT CACAAGAATTTATTT-3')は、PG-2およびPR-39 cDNAの3'末端に相補的であり、それらのすぐ後にポリAテールを有し、そしてXbal制限部位を含んでいた。1/10容量の上記ブタのcDNAを鋳型とし、25pmolのプライマーおよび2.5UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer-Cetus)を用いて、PCRを50μl容量で行った。反応は、１サイクル当たり1分間の変性(94℃)およびアニーリング(60℃)工程および2分間の伸長工程(72℃)を、30サイクル行った。 cDNAクローニングおよび配列決定。増幅されたcDNAを予備的な(preparative) アガロース電気泳動によって分画し、そしてエチジウムブロマイドで染色した。主要な画分を切り出し、EcoRIおよびXbaIエンドヌクレアーゼ(New England Biol abs、Beverly、MA)によって切断し、M13mp18バクテリオファージベクター内にサブクローニングし、そしてE．coli XL1-Blue MRF'コンピテント細胞(Stratagene 、La Jolla、CA)内に形質転換した。DNA配列決定をキット(U．S．Biochemical C orp.、Cleveland、OH)を用いて行った。ヌクレオチドおよびタンパク質の配列は、PC-GENE(Intelligenetics、Palo Alto、CA)によって分析した。ノーザンブロット。10μgの全RNAを50％ホルムアミド中で変性させ、0.62Mのホルムアミド中で1％アガロースゲルによる電気泳動によって分離し、そしてGen eScreen Plusメンブラン(DuPont、Boston、MA)上にキャピラリーで移すことによってブロッティングした。このメンブランを80℃で2時間ベーキングし、そして迅速ハイブリダイゼーション緩衝液(Amersham、Arlington Height、IL)中で³²P 標識化プローブとハイブリダイズさせた。種々のプロテグリンをコードする種々のクローンの配列決定の結果を図７にまとめる。プロテグリンPG-1、PG-3およびPG-4のcDNA配列は、先にPG-2に関してSt orici,P.ら、Biochem Biophys Res Comm（1993）196:1363-1368によって示された691塩基を含む。このcDNAは、すべてのプロテグリンに関して同一であると思われる110個のアミノ酸をコードする上流配列を示す。特性のほんの僅かなさらなる差異を図７に示す。この分析は、式(1)のアミノ酸配列（ここで、A₁₀は、小さなアミノ酸でありそしてA₁₁は、疎水性アミノ酸である）を有するさらなるプロテグリンの存在を示し、このプロテグリンは、これらの残基が塩基性である既知のプロテグリンとは区別される。従って、PG-4のアミノ酸配列は、RGGRLCYCRGWICFCVGRGであり、ここで、Ｎ末端の1、2、または3個のアミノ酸は、欠失され得る。図８は、ブタ白血球においてこれまでに見出された4つのプロテグリンのアミノ酸配列の比較を示す。1〜3、5〜9、13および15〜16位に完全な相同性がある。逆転写されたブタ骨細胞RNAを、PG-2および別のカテリン(cathelin)関連ペプチド、すなわちPR-39(Agerbeth Bら、Eur J Biochem（1991）202:849-854; Stor ici,P.ら、Biochem Biophys Res Com（1993）186:1058-1065)の5'末端に対応する上流プライマー、およびポリA領域の直前にある領域にマッチする下流プライマーを用いて増幅することによって、さらなるクローンを得た。得られた約0.7k bのPCR産物をM13mp18内にサブクローニングし、そして組換えプラークを精製および配列決定用に選択した。このようにして、PG-1、PG-3およびPG-4の前駆体に対する配列を回収した。これらのペプチドは全て、式１の化合物（図７のPG-4に関して示した）のA₁の上流にさらなるアミノ酸配列を含む前駆体をコードするヌクレオチド配列によってコードされている。実施例８エナンチオPG-1の調製標準的な固相技術を用いて、PG-1のアミノ酸配列を有するプロテグリン（全てのアミノ酸はＤ型である）を調製した。この形態のプロテグリンを、プロテアーゼの非存在下または存在下で、そうでなければ実施例１で述べたアガロースゲルにおける放射状拡散アッセイに関して記載したように、E．coli、L．monocytoge nes、C．albicansおよび他の微生物に対してテストした。結果を図9a〜9gに示す。図9aは、プロテアーゼ非存在下では、天然PG-1およびエナンチオPG-1の両方ともE．coliの生育の阻害に等しく効果的であることを示す。図9bは、トリプシンもキモトリプシンもいずれもエネンチオPG-1の抗菌効果を阻害しないことを示す。図9cは、これらのタンパク質分解酵素の存在下では天然PG-1がL．monocytogen esの生育を阻害する能力は逆に作用するが、図9dに示されるように、これらのプロテアーゼ非存在下ではPG-1がエナンチオPG-1と同等に活性であることを示す。実施例９ STD病原体に対するプロテグリンの活性表７は、STD病原体の生育に対するプロテグリンPG-1の活性とデフェンシンHNP -1の活性との比較をまとめたものである。これらの結果において、「活性」とは、ペプチドが10μg/mlより低くても効果的であったということを意味する；中程度に活性とは、10〜25μg/mlで活性であったことを示す；そして僅かに活性とは、 25〜50μg/mlで活性であったことを示す。50〜200μg/mlで効果が得られない場合には、その化合物は不活性であるとみなした。 Chlamydia trachomatis STDに関連する他の細菌とは異なり、Chlamydiaは、代謝活性と二分裂に細胞内生育環境を必要とする。生活環は、以下の通りである：挙動がやや胞子様である代謝的に不活性な粒子である細胞外形態があり、基本小体(elementary body)(EB )と言われる。このEBは、宿主細胞に付着して、そして摂取されて、しばしば「封入体(inclusion)」と呼ばれる内部液胞空間を形成する。この細菌は、繊細な網様体(reticulate body)(RB)を再編成する。この網様体は、非感染性であるが代謝的に活性であり、そして48〜72時間に亘ってEB状態への再構成を受ける。次いで、このEBを細胞から放出する。ペプチドグリカン層よりむしろ、Chlamydia は、EB期における保護のためにシステインリッチなタンパク質中に複数のジスルフィド結合を含む。本発明のプロテグリンを、Clarke,L.M.のClinical Microbiology Procedures Handbook II (1992)、Isenberg,H.T.編、Am．Soc．Microbiol．Washington、D．C .;8.0.1頁〜8.24.3.9頁に記載された臨床標本に関する「ゴールドスタンダード」クラミジア培養システムを用いて、それらのChlamydiaに対する抗菌活性に関してテストした。簡潔に言うと、10％ウシ胎児血清(FES)を有するシクロヘキシミドEMEM中のMcCoy細胞（マウス細胞系）を宿主として用いる。クラミジアの接種前に、維持培地を細胞層を破壊することなく吸引し、そして細胞層を標準バイアル中のカバーガラス上で維持する。次いで、各バイアルに100〜300μLの接種物を接種し、そして3500×gで20℃にて1時間遠心分離する。次いで、流体を吸引し、そして1mlのEMEMを添加する。バイアルにふたをして、37℃で48時間インキュベートする。48時間後、再び培地を吸引し、そしてカバーガラスをPBSで2回リンスし、そして300μLのEtOHで10分間固定した。このEtOHを吸引し、そしてバイアルを乾燥させる；次いで、30μLのSyva Microtrakモノクローナル抗体を加えた1滴のPBSをChlamydiaの主要な外膜タンパク質に染色のために添加する。37 ℃で30分間インキュベートした後、細胞を蒸留水で洗浄し、そして明るいアップルグリーンで染色される細胞質液胞(cytoplasmic vacuoles)として容易に認識される封入体に関して試験した。それらは、標準細菌培養培地上の遊離の生細菌のコロニーと同等なものを示す。以下に行われるアッセイにおいて、Kuo,C.C.ら、Nongynococcal Urethritis a nd Related Infections (1977)、Taylor-Robinson,D.ら編、Am．Soc．Microbiol ．Washington，D.C.、322頁〜326頁によって記載されるC.trachomatis血液型亜型(serovar)L2(L2/434Bu)を用いた。この接種物(seed)を、L929マウス繊維芽細胞中の超音波処理された培養物から調製し、そして部分的に遠心分離によって精製する。宿主タンパク質がなお接種物アリコート中に存在しているので、各接種物バッチを系列10倍希釈で2×10^-9まで希釈することにより調製時の力価を測定した。9.2×10⁶ IFU/mlを含む接種物を37℃で素早く解凍し、そして室温でのプレインキュベーションの後、約200のIFUを産生し、そしてバックグラウンドの真核生物タンパク質を希釈するために、ショ糖／リン酸塩／グリシンによって10^-2 まで希釈する。最初のアッセイにおいて、テストされるペプチドは、0.01％の氷酢酸の保存溶液として調製した。100μLの希釈クラミジア接種物を1.5ml用エッペンドルフチューブに分注し、そして1チューブ当たり200μLの抗生物質ペプチドを添加した。保存ペプチド（およびコントロール）のアリコートを接種物と一緒に室温で1時間、2時間、および4時間インキュベートした。各インキュベーション期間の終了約10分前に、標準接種および培養の準備のために維持培地をMcCoyバイアルから吸引した。次いで、培養をこのペプチドの存在下および非存在下で行った；いくつかの場合において、このペプチドは、前培養インキュベーションに加えて、培養培地における最終濃度まで添加された。このテストは、顕微鏡で評価した。１回の添加当たり50μgのプロテグリンを用いた結果は、劇的であった。コントロール培養では、ペプチドは添加せず、222〜460の封入体が計数された。プロテグリンを、Chlamydia接種物を細胞に添加する前、または添加の前と後の両方、に添加した場合の全てのプロトコルにおいて、封入体は見出されなかった。同様な結果が20μgのタキプレシンの添加物についても得られた。デフェンシンNP- 1およびHNP-1の保護的効果は劣っていた。要約すると、テストしたプロテグリンは、Chlamydiaに対して抗菌性であることを示す。次の一連の実験では、種々の濃度のプロテグリン（1μg、12.5μg、25μgおよび50μg）を2時間のプレインキュベーションに用いた。12.5μgという低い濃度は、封入体の数を0に減少させた。1μg/mlという濃度においてさえ、封入体の数は、約110から約30に劇的に減少した。次のセットの実験では、血清の存在の効果をテストした。Chlamydia接種物を1 0％FBSと共にあるいはなしで、さらに25μgのプロテグリンと共にあるいはなしで2時間プレインキュベートした。プロテグリンは、血清が存在しても存在しなくてもどちらでも非常に効果的であったが、ヒトデフェンシンHNP-2をコントロールとして用いると血清の非存在下では適度に効果的であるが、血清の存在下では、ほんの僅かに効果的であった。クラミジア培養の開始１時間後、すなわち遠心分離および最後の培地混合の後、および48時間の培養期間の最初の1時間後に25μgのプロテグリンを添加したほかは、この実験を繰り返した。プロテグリンは、封入体の数を未処理のコントロールから約57％減少させたが、HNP-2は、完全に不活性であった。最後に、プロテグリン（25μg）をクラミジア接種物に添加し、次いで混合物をすぐに培養した。この場合、プレインキュベーションおよび1時間の感染後ギャップが無くても、プロテグリンは血清が存在しても存在しなくても最小限効果的であった。血清の効果は、特に重要である。なぜなら、Chlamydia感染との戦いにおいて効果的な局所剤のため、それは、血清の存在下で作用しなければならないからである。さらに、プロテグリンの効力について評価するのに用いられ得るChlamydia感染に関するいくつかのマウスをベースにしたモデルがある。これらのモデルとしては、Patton,D.L.ら、Chlamydial Infections（1990）Bowie,W.R.ら編、Cambri dge University Press NY 223-231頁；Swenson,C.E.ら、J．Infect．Dis.（1983 ）1101-1107頁、およびBarron,A.L.ら、J．Infect．Dis.（1981）143:63-66によって記載されたモデルが挙げられる。Neisseria gonorrhoeae より詳細には、プロテグリンがN．gonorrhoeaeを阻害する能力を、Miyasakiら、Antimicrob Agent Chemother（1993）37:2710-2715の方法の改変法によってテストした。FA 19株およびF 62株の線毛化されていない透明な変異株(nonpiliate d transparent variants)を、グルコースおよび鉄の補足物を含むGCB寒天プレート上で37℃で3.8％ V/V CO₂下で一晩増殖させた。これらの株をアッセイの適応性に関して選択した。一晩生育させたものを寒天プレートから取り出し、補足物および重炭酸ナトリウムを含むGCBブロス中に懸濁し、そして37℃で振盪しながら、対数期半ばまで増殖させる。培養物をGCBブロスで1:100に希釈して約10⁶ CFU/mlとし、そして系列希釈物をGCB寒天上に接種する。ペプチドを0.01％ v/vの酢酸に溶解して1mg/mlの保存溶液を得、そして系列希釈する。10μlの各希釈物を90μlの希釈細菌を含む滅菌ポリスチレンチューブにに加え、そしてチューブを37℃で45分間振盪する。内容物を1:10に系列希釈し、そしてGCB寒天プレート上に接種して、CO₂インキュベーター中でインキュベートする。CFUを24時間後に計数し、そして殺菌活性の対数を計算する。天然PG-1、合成PG-1、合成PG-3アミドおよびアミド化されていない合成PG-3の全ては、このアッセイにおいて1ml当たりのCFUを5対数以上減少させた。天然PG- 2（16個のアミノ酸を含む）は、2.6倍減少した。さらに、エナンチオPG-1、単一ジスルフィドPG-1(C₆-C₁₅)、および単一スルフィドPG-1(C₈-C₁₃)は、このアッセイにおいて、CFU/mlで5倍対数以上減少した。Treponema pallidum 梅毒の病因因子であるこの生物に対する殺菌活性もまたテストした。ペプチドを90μlの非加熱の正常ウサギ血清中の1.758μgから56.25μgの一連の濃度で評価した。血清は、スピロヘータをインキュベーション中に生存させるために養分として働くだけでなく、補体の供給源をも提供した。約5×10⁷/μlの生物を含む 10μlのT．pallidumの懸濁物を各チューブに加え、そして適切なペプチドを含む混合物を34℃で95％N₂および5％CO₂下でインキュベートした。時間0（インキュベーションの直前）、4時間および16時間の時点で、25個のランダムに選択した生物を運動性の有無に関して試験した。50％が動かなくなるエンドポイント(IE₅ ₀ )を計算して、スピロヘータの50％が動かなくなるのに必要な濃度を示した。PG -1の存在下では、0および4時間の時点でのIE₅₀は、それぞれ2.717μgおよび＜1. 758μgであった。タキプレシンのIE₅₀は、0および4時間の時点で5.231μgおよび 2.539μgであった。このことは、運動性を失わせる能力をほとんど示さなかった HNPおよびNP調製物とは対照的であった。単純ヘルペスウイルス 2％ウシ胎児血清を含む最少必須培地(MEM)中で生育されたVERO細胞中で調製された保存ウイルスを用いて、HSV 1 MacIntyre株、10個の臨床HSV 1単離株のプール、HSV-2G、および10個の臨床HSV 2単離株のプール（これらは全て3μMのアシクロビル(acyclovir)に対して感受性である）に対する種々のペプチドの効果をテストした。2つの繊維芽細胞株、ヒトW138およびウマCCL57を標的として用い、そして直接ウイルス中和および遅延ペプチド添加によってテストを行った。直接中和フォーマットでは、ウイルスを組織培養単層に添加する前に、ペプチドと共にウイルスを90分間プレインキュベートした。遅延ペプチド添加フォーマットでは、ウイルスを添加し、そして標的細胞に吸着させるため50分間おき、次いで単層を洗浄してペプチドを90分間添加した。最後に、単層を洗浄してペプチドを除き、そして細胞をペプチドを含まないMEMによって養分を与え、そして非処理の感染単層が４＋の細胞変性効果(CPE)を示すまで培養した（約60時間）。抗ウイルス活性は、両方のフォーマットにおいて見られたが、遅延ペプチド添加モードの方がより著しかった。直接中和フォーマットにおけるW138およびCCL5 7細胞を用いて行った実験では、PG-1は、50μg/mlおよび25μg/mlの濃度では、H SV-2GがCPEを引き起こすのを完全に妨げたが、これらの濃度は４＋のCPEを生じるHSV-1に対しては何の防御も与えなかった。遅延ペプチド添加フォーマットでは、PG-1は、35μg/mlおよび50μg/mlでは、 HSV-2GによるCPEを完全に妨げ、そしてそれはまた、どちらの濃度でも臨床HSV-2 プールに対して十分に防御した。従って、PG-1は、たとえウイルスが細胞培養物中に導入されてから60分後になってようやくペプチドが添加されたとしても、ヒトおよび動物の細胞をHSV-2の研究室株および臨床株による感染から防御した。Trichomonas vaginallis Trichomonas vaginallis C1株(ATCC 30001)を、Gorrell,T.E.ら、Carlsberg R es Comm （1984）49:259-268によって記載されるように生育させた。RPMI＋1%熱活性化ウシ胎児血清中で行われる実験において、50μg/mlのPG-1に曝した後数分以内にT.vaginallis（これまでは活発に運動していた）は動かなくなった。その後間もなく、この生物は、トリパンブルーに対して透過性となり、そしてその後 15〜30分に亘って溶解した。予想したように、このような生物は、それらの通常の生育培地(Diamond培地)に導入されると生育しなかった。25μg/mlのPG-3に曝された生物は、運動性を保持していた。 T．vaginallisの2つの高度にメトロニダゾール耐性の臨床単離株、すなわちMR 株およびTV株の初期の研究は、両方とも、C₈−C₁₃およびC₆−C₁₅の単一ジスルフィドを含むPG-1およびエナンチオPG-1に対して100および50μg/mlの濃度で感受性であることを示した。実施例10 抗レトロウイルス活性合成および天然のPG-1の両方ならびに天然PG-2を、HIV株に対する抗ウイルス活性に関して、Miles,S.A.ら、Blood（1991）78:3200-3208に記載の方法を用いてテストした。簡単に言うと、単核細胞画分をアメリカ赤十字社の正常ドナーの白血球パック(leukopac)から、Ficoll-hypaque密度勾配を用いて回収する。単核細胞を、20％ウシ胎児血清、ファンギゾン(fungizone)を含む1％ペニシリン(pen n)/ストレプトマイシン(strep)および0.5％のPHAを含むRPMI 1640培地中に1ml当たり1×10⁶細胞で再懸濁し、そして37℃で5％ CO₂中で24時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄し、そして生育培地中で24時間増殖させた。非研究室適合性(non-laboratory adapted)のクローン化されたHIV_JR-CSFおよびHIV_JR-FLを、上記のように調製されたヒト末梢血単核細胞内にエレクトロポレーションした。力価を決定し、そして一般に、1細胞当たり約4,000感染単位の感染多重度(multiplicities of infection)(MOI)を用いた（これは、上清中1ml当たり25〜40pg HIV p24抗原に相当する）。このアッセイにおいて、上記のように調製された保存HIVを正確なMOIにまで希釈し、そしてPBMを1ml当たり2×10⁶の濃度で24ウェルのプレートに添加する。総容量1μlを各ウェルに加える。テストされるペプチドを成長培地に添加し、最終的に所望の濃度を達成する。次いで、適切な数のMOIを添加する。ウイルス増殖をアッセイするために、200μlの上清を第３日目および第７日目に取り出し、そして市販のアッセイ(Coulter Immunology、Hialeah、Florida)を用いてp24抗原の濃度を決定する。コントロールとしては、細胞のみ、５μg/mlのペプチドを加えた細胞、ペプチドではなくてウイルスを有する細胞、および10^-5M〜10^-8MのAZ Tの存在下でのウイルスを有する細胞を含むウェルが２組ずつある。このアッセイを用いて、天然および合成のPG-1は両方とも、1〜5μg/mlの間の濃度では完全にHIV感染を阻害することが示された；IC₉₀は、＜5μg/mlであった。次いで、ペプチドの添加の時間を変化させた。ウイルスの添加の前、ウイルスの添加の時点、または感染の2時間後に２時間前処理された細胞は、ペプチドに対して抗ウイルス活性を示した。しかし、PG-1を感染の24時間後に添加した場合、抗ウイルス活性は無かった。さらに、PG-2は、同様の活性を示すが、約5倍低いレベルである。ヒトデフェンシンおよびウサギデフェンシンのような別の抗生物質は、このアッセイにおいて強力な活性を欠いていた。結果は、非研究室適合性(non-laboratory adapted) 単離株であるHIV_JR-CSFおよびHIV_JR-FLの両方に対しても同様であった(Koyanagi ,Y.Sら、Science（1987）236:819-822)。プロテグリンは、他のレトロウイルスに関しても同様の活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＹ 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/44 ＡＤＺ 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ 9358−4Ｂ 21/08 7/64 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ 16/44 ＡＤＸＣ１２Ｎ 15/02 ＡＤＺＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＤ 21/08 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (31)優先権主張番号０８／１８２，４８３ (32)優先日 1994年１月13日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２４３，８７９ (32)優先日 1994年５月17日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハーウィグ，シルビアエス．エル. アメリカ合衆国カリフォルニア 91364, ウッドランドヒルズ，ウッドランドクレストドライブ 21911 (72)発明者コクリヤコフ，ブラデミアーエヌ. アメリカ合衆国カリフォルニア 90036, ロスアンゼルス，エス．カーソンアベニュー 435，アパートメント３ディー

Claims

【特許請求の範囲】１．式およびそのＮ末端アシル化および/またはＣ末端アミド化またはエステル化された形態のペプチドであって、これは、必要に応じて-SH安定化された線状形態またはシステイン架橋された形態のいずれかであり、ここで、A₁およびA₉のそれぞれは、独立して塩基性アミノ酸であり； A₂およびA₃のそれぞれは、独立して、小さなアミノ酸であり； A₅、A₇、A₁₂、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれは、独立して、疎水性アミノ酸であり； A₄およびA₁₀のそれぞれは、独立して、塩基性または小さなアミノ酸であり； A₁₁は、塩基性または疎水性アミノ酸であり； A₁₇は、存在しないか、または存在する場合は小さなアミノ酸であり； A₁₈は、存在しないか、または存在する場合は塩基性アミノ酸であり；あるいは式(１)の修飾形態、およびそのＮ末端アシル化および/またはＣ末端アミド化またはエステル化された形態であって、ここで、１〜４個のシステインのそれぞれは独立して疎水性アミノ酸または小さなアミノ酸で置換され、但し該化合物が、アミド化およびジシステイン架橋形態で式である場合に、該化合物が精製および単離されることを条件とする、化合物。２．２個のシスチン架橋を含有する請求項１に記載の化合物であって；および/またはここで、Ｃ末端のカルボキシル基が、COOHまたはその塩；COOR 、CONH₂、CONHR、およびCONR₂(ここで、各Rは独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)からなる群から選択される式であり；および/またはここで、Ｎ末端のアミノ基が、式NH₂またはNHCOR(ここで、各R は独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)であり；および/またはここで、A₁およびA₉のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｋ、およびH arからなる群から選択され；および/またはここで、A₂およびA₃のそれぞれが、独立して、Ｇ、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され；および/またはここで、A₄がＲまたはＧであり；および/またはここで、A₅、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、ＮLe、Ｌ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₇およびA₁₂のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₁₀およびA₁₁のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｇ、またはＷである、化合物。３．１個のシスチン架橋を含有する請求項１に記載の化合物であって；および/またはここで、Ｃ末端のカルボキシル基が、COOHまたはその塩；COOR 、CONH₂、CONHR、およびCONR₂(ここで、各Rは独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)からなる群から選択される式であり；および/またはここで、Ｎ末端のアミノ基が、式NH₂またはNHCOR(ここで、各R は独立して炭化水素基(１〜６Ｃ)である)であり；および/またはここで、A₁およびA₉のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｋ、およびH arからなる群から選択され；および/またはここで、A₂およびA₃のそれぞれが、独立して、Ｇ、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され；および/またはここで、A₄が、ＲまたはＧであり；および/またはここで、A₅、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、NLe、Ｌ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₇およびA₁₂のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₁₀およびA₁₁のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｇ、またはＷである、化合物。４．線状形態にある請求項１に記載の化合物であって；および/またはここで、Ｃ末端のカルボキシル基が、COOHまたはその塩；COOR 、CONH₂、CONHR、およびCONR₂(ここで、各Rは独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)からなる群から選択される式であり；および/またはここで、Ｎ末端のアミノ基が、式NH₂またはNHCOR(ここで、各R は独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)であり；および/またはここで、A₁およびA₉のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｋ、およびH arからなる群から選択され；および/またはここで、A₂およびA₃のそれぞれが、独立して、Ｇ、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され；および/またはここで、A₄がＲまたはＧであり；および/またはここで、A₅、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれが、独立して、Ｉ，Ｖ，NLe、Ｌ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₇およびA₁₂のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₁₀およびA₁₁のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｇ、またはＷである、化合物。５．修飾形態にある請求項１に記載の化合物であって；および/またはここで、Ｃ末端のカルボキシル基が、COOHまたはその塩；COOR 、CONH₂、CONHR、およびCONR₂(ここで、各Rは独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)からなる群から選択される式であり；および/またはここで、Ｎ末端のアミノ基が、式NH₂またはNHCOR(ここで、各R は独立してヒドロカルビル基(１〜６Ｃ)である)であり；および/またはここで、A₁およびA₉のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｋ、およびH arからなる群から選択され；および/またはここで、A₂およびA₃のそれぞれが、独立して、Ｇ、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択され；および/またはここで、A₄が、ＲまたはＧであり；および/またはここで、A₅、A₁₄、およびA₁₆のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、NLe、Ｌ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₇およびA₁₂のそれぞれが、独立して、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、およびＦからなる群から選択され；および/またはここで、A₁₀およびA₁₁のそれぞれが、独立して、Ｒ、Ｇ、またはＷである、化合物。６．前記シスチン架橋が、C₆-C₁₅およびC₈-C₁₃で連結する、請求項２に記載の化合物。７．前記シスチン架橋が、C₆-C₁₅またはC₈-C₁₃で連結する、請求項３に記載の化合物。８．前記１〜４個のシステインのそれぞれが、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、またはＬに独立して置換される、請求項５に記載の化合物。９．線状形態またはシスチン架橋形態のいずれかにおいて、およびそのアミド化された形態からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。１０．全てのアミノ酸がD型の配置にある、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。１１．線状化されたまたはシスチン架橋化された形態のいずれかにおいて、式およびそのＮ末端アシル化、Ｃ末端アミド化またはエステル化された形態の精製および単離された化合物であって、ここで各A_nは指定した位置で独立してアミノ酸であり、そして該シスチン架橋化合物が、動物被検体の白血球の溶解物の限外濾過物をクロマトグラフ分離技術に供し、式(1a)の化合物を含む画分を得、そして式(1a)の該化合物を回収するプロセスによって、該白血球から単離可能である、化合物。１２．抗微生物および/または抗ウイルス活性を有する精製および単離された形態のペプチドであって、PG-1、PG-2、PG-3、またはPG-4をコードするブタ白血球のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる、ペプチド。１３．PG-1、PG-2、PG-3、またはPG-4をコードするブタ白血球のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、精製および単離されたDNA。１４．請求項１〜９のいずれかに記載の化合物のアミノ酸配列を有するペプチドの生産に関する組換え発現系であって、発現系が、発現をもたらす制御配列に作動可能に連結された該ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、組換え発現系。１５．請求項１４に記載の発現系を含有するように改変された、組換え宿主細胞。１６．抗微生物または抗ウイルスペプチド、またはその中間のペプチドを生産する方法であって、請求項１５に記載の改変宿主細胞を該ペプチドが生産される条件下で培養する工程、および培養物から該ペプチドを回収する工程を包含する、方法。１７．前記ペプチドのシスチン連結をもたらす工程、および/または該ペプチドのＮ末端および/またはＣ末端を修飾する工程をさらに含有する、請求項１６に記載の方法。１８．抗微生物剤または抗ウイルス剤の使用のための薬学的組成物であって、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を混和する請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物を含有する、薬学的組成物。１９．植物における微生物またはウイルス感染に耐性を与えるために植物または植物環境に適用する組成物であって、少なくとも１つの環境上許容される希釈剤と混和する請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物を含有する、組成物。２０．ウイルスまたは微生物の成長を抑制する方法であって、該ウイルスまたは微生物の成長を支持する組成物を、該成長を抑制するに有効な量の請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。２１．前記組成物がアイケア製品である、請求項２０に記載の方法。２２．性感染症治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物。２３．グラム陰性細菌のエンドトキシンを不活化する方法であって、該エンドトキシンを、該エンドトキシンを不活化するに有効な量の請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。２４．敗血症性ショック治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物。２５．請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物に特異的に反応する抗体。