CZ159198A3 - Peptid s antimikrobiálním účinkem a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález spadá do oblasti antimikrobiálních peptidů. Vynález zvláště zahrnuje krátké peptidy, které se označují jako protegriny, což jsou peptidy vykazující široké rozmezí antimikrobiálních aktivit.

Dosavadní stav techniky ...... Jeden z obraných mechanizmů při infekci, který se objevuje jak u zvířat tak i u rostlin, je produkce peptidů, které vykazují antimikrobialní a antivirovou aktivitu. Různé třídy těchto peptidů se izolovaly z tkání rostlin i zvířat. Přihláška PCT WO 95/03325 (publikována 2. února 1995) obsahuje přehled literatury, kde se popisuje tento problém. Mezi takové peptidy patří tachyplaziny, které obsahují 17 až 18 aminokyselin z toho čtyři neměnné cysteiny, defenziny, βdefenziny a insekticidové defenziny, které jsou o něco delší peptidy a jsou charakterizovány šesti neměnnými cysteiny, dále antifungicidní a antibakteriální peptidy a proteiny, které se našly v rostlinách.

Vynález popisuje novou třídu antimikrobiálních peptidů, označených jako protegriny. Reprezentanti této třídy se izolovaly s prasečích leukocytů. Protegrinové peptidy, které jsou obecně v přírodě amfifilní, vykazují rozsáhlé spektrum antimikrobiálni aktivity. Pak jsou tyto peptidy použitelné jako antibakteriální, antihoubové a antivirové činidla u rostlin a zvířat.

Izolace některých protegrinových peptidů podle vynálezu se zmiňuje publikace Kokryakov, V.N. et al., 1993, FEBS Lett 337: 231-236 (červencové číslo). Pozdější publikace této skupiny popisovala přítomnost nové protegrinové sekvence a sekvence jeho prekurzoru se odvodila z izolovaného klonu cDNA

(Zhao, C. et al., 1994, FEBS Lett 346: 285-288). Další článek (Mirgorodskaya, O.A. et al., 1993, FEBS Lett 330: 339-342) popisuje kationtové peptidy z prasečích neutrofilů. Publikace Storici et al., 1993, Biochem Biophys Res Comm 196: 1363-1367 popisuje izolaci sekvence DNA, která kóduje antimikrobiální peptid prasečích leukocytů prosekvencí, která je podobná kathelinu. Uvádí se, že tento peptid je jeden z protegrinů popsaných dále v textu. Další publikace, které se týkají protegrinů jsou Harwing, S.S.L., et al., 1995,- J- Peptide Sci 3:207, Zhao,C. et al., 1995, FEBS Lett 376: 130-134; Zhao, C. et al., 1995, FEBS Lett 368: 197-202; Miyakawa, Y et al., 1996, Infect Immun 64: 926-932; Yasin, B et al., 1996, Infect Immun 64: 709-713; Qu, X-D et al., 1996, Infect Immun 64: 1240-1245; Aumels, A et al., 1996, Eur J. Biochem 237: 575583; Mangoni, M.E. et al., 1996, FEBS Lett 383: 93-98; Steinberg et al., 1996, Protegrins: Fast Acting Bacterial Peptides, předneseno na 8^th Intl. Symposium on Staphylococci a Staphylococcal Infections,, Aix les Bains, France, červen 23 až 26, 1996; Steinberg et al., 1996, Broad Spectrum Antimicrobial Activity of Protegrin Peptides, přednesené na 36^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemoterapy, New Orelans, LA, September 15-18, 1996; Kung et al., 1996, Protegrins Protects Míce from Systemic Infection By Antibiotic-Resistant Pathogens, uveřejněno na 36^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemoterapy, New Orelans, LA, September 15-18, 1996; a Steinberg et al., 1996, In Vitro Efficacy of Protegrins Against Helicobacter Pylori, uveřejněno na 36^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemoterapy, New Orelans, LA, September 15-18, 1996;

Zjstilo se, že protegriny se váží na endotoxiny, to je lipopolysacharidové kompozice (LPS) odvozené od gram negativních bakterií, které jsou pravděpodobně odpovědné za

gram-negativní sepsi. Protegriny jsou také účinné při

inhibici růstu organizmů,	které	jsou spojené s	pohlavně
přenosnými nemocemi, jako	je	Chlamydia	trachomatis a
Neisseria gonorrhoeae. Vynález popisuje novou	sadu	protegrinů,	které	nabízej i

vlastnosti rychle působících mikrobicidů s širokým spektrem aktivity a s málo pravděpodobnou rezistencí. Třída protegrinů podle vynálezu nabízí možnost nastavení spektra aktivity s ohledem na nejúčinější inhibici typu mikroba - nebo viru a s ohledem na podmínky, při kterých tato inhibice probíhá. Protegriny se v tomto případě liší od protegrinů předchozích přihlášek buď delecí nejméně jedné ze čtyř aminokyselin Nkonce nebo delecí jiných označených zbytků a/nebo nahrazením určitých aminokyselin aminokyselinami z jiných tříd.

Podstata vynálezu

Vynález přibližně 10 charakterizovány tím, elementy: reverzní ohyb popisuje antimikrobiální až 30 aminokyselinových že struktura peptidy zbytků, core má uzavřený dvěmi řetězci, antiparalelní β-list obsahuj ící které jsou dva hlavní které tvoří molekuly je hydrofobni a obsahuj i aminokyselinový fyziologického pH peptidu může být amidován nebo esterifikován amfifilická, jeden povrch má charakter čistě druhý má charakter čistě hydrofilní.

v oblasti reverzního ohybu nejméně jeden zbytek a jejich náboj při je nejméně +1. N-konec antimikrobiálních acylován a/nebo C-konec peptidu může být a může obsahovat žádný, jeden

Peptidy bazický hodnotě nebo dva disulfidové můstky.

V jednom názorném provedení vynálezu se popisují antimikrobiální peptidy, které obsahují přibližně 10 až 30 aminokyselinových zbytků a obsahují aminokyselinovou sekvenci:

(i) Xi x₂ x₃ x₄

X₅ C₆ X₇ C₈ X₉ X₁₀ X11 X12

C13 X14 C15 X16 X17 X18 nebo farmaceuticky přijatelnou sůl nebo jejich formu s acetylovaným N-koncem nebo amidovaným nebo estrifikovaným Ckoncem, kde:

každý z C₈ a C13 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle podobný cysteinu, je bazický, malý, polární/velký nebo hydrofóbní;

každý z C₆ a C_i5 je nezávisle aminokyselina podobná cysteinu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbní;

každý z Xi až X₅ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, polární/velká nebo malá aminokyselina;

každý z X₇ a Xi₄ je nezávisle hydrofóbní nebo malá aminokyselina;

každý z X₉ a X₁₂ je nezávisle přítomen nebo není přítomen;

X₉ až X12 dohromady jsou schopny vytvořit reverzní ohyb, jstliže jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I) a nejméně jeden z X₉ až X₁₂ musí být bazická aminokyselina;

každý z X_i6 až X_i8 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, hydrofóbní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

a kde nejméně okolo 15% až 50% aminokyselin, které jsou obsaženy v antimikrobiálním peptidu, je bazických, přičemž antimikrobiální peptid má při hodnotě fyziologického pH čistý náboj nejméně +1.

Peptidy podle vynálezu vykazují široké spektrum antimikrobiální aktivity. Působí jako biocid vůči velkému množství mikrobiálních cílů, mezi něž patří gram-pozitivní bakterie, gram-negativní bakterie, kvasinky, houby a protozoa. Peptidy v podstatě mají široký rozsah aplikace jako antibakteriální činidla. Peptidy se například mohou použít k • ·· ·· · · · · ·· • · · · · ·· · · · · · ··· ···· ···· ·· · · · · · · · ···· · ··· ···· ··· • · · · · ·· ·· ·« ·· ochraně a dezinfekci řady materiálů, které zahrnuji lékařské nástroje, potraviny, kosmetiku, roztoky pro kontaktní čočky, léky nebo jiné materiály, které obsahují nutrienty. Peptidy je možné také použít za účelem profylaxe nebo léčby mikrobiálních infekcí nebo onemocnění rostlin a zvířat.

Vynález dále popisuje rekombinantni materiály použitelné při produkci jistých peptidů podle vynálezu, podobně jsou použitelné při produkci rostlin nebo zvířat, které jsou modifikovány tak, že obsahují, expresivní systémy vhodné pro produkci těchto peptidů.

Vynález dále uvádí farmaceutické kompozice a kompozice vhodné pro aplikaci na rostliny, které obsahují jako aktivní ingredience peptidy podle vynálezu, nebo kompozice, které obsahují expresivní systémy vhodné pro produkci peptidů nebo pro in sítu expresi nukleotidové sekvence kódující tyto peptidy.

Vynález dále popisuje způsoby syntetické přípravy peptidů podle vynálezu, protilátky specifiké k těmto peptidům a použití peptidů jako konzervačních činidel.

Vynález dále popisuje způsoby použití shora popsaných peptidů nebo jejich kompozic za účelem inhibice mikrobiálního růstu. Způsob obecně zahrnuje kontakt mikroba s antimikrobiálně účinným množstvím jednoho nebo více peptidů nebo kompozic podle vynálezu. V preferovaném provedení vynálezu je bakterie v kontaktu s bakteriocidně účinným množstvím peptidu nebo kompozice.

K takovým onemocněním nebo infekcím patří infekce očí, jako je zánět spojivek a keratitida, korneální vředy, žaludeční vředy, které se spojují s bakteriemi H. pylori, pohlavně přenosné nemoci (STD) a gram negativní sepse. Klinicky relevantní infekce, kterým se může předcházet nebo se mohou léčit peptidy podle vynálezu zahrnují systematické infekce, které jsou způsobeny patogeny rezistentními na

několik léků, jako jsou bakterie Enterococcos faecium s rezistenci na vankomycín, Staphylococcus aureus s rezistenci na methicilin a Sterptococcus pneumonia s rezistenci na penicilín.

Definice

Termín sekundární struktura znamená pravidelnoulokální strukturu segmentů polypeptidových řetězců. Zahrnuje, ale není omezena na dvoušroubovice, jako jsou a-hělixyprodloužené řetězce, jako jsou β-řetězce a listy prodloužených řetězců, jako jsou β-listy.

Termín antiparalelní β-list znamená sekundární strukturu polypeptidového řetězce charakterizovanou intermolekulárním vodíkovým spojením hlavních antiparalelních řetězců peptidů. Antiparalelní β-list může obsahovat jedno nebo dva vnitrořetěřetězová disulfidová spojení.

Termín amfifilický antiparalelní β-list znamená antiparalelní β-list, kde jeden povrch má čistě hydrofóbní charakter a druhý povrch má čistě hydrofilní charakter.

Termín reverzní ohyb charakterizuje sekundární strukturu, kde jsou spojeny přilehlé řetězce antiparalelního β-listu. Reverzní ohyb je tvořen segmentem, který obsahuje dva až čtyři aminokyselinové zbytky a který obrací směr polypeptidového řetězce, což umožňuje jednotlivému polypeptidovému řetězci, aby přijmul antiparalelní konformaci β-listu. Takové peptidové segmenty jsou v oboru dobře známy a zahrnují například γ-ohyby tvořené třemi aminokyselinovými zbytky (Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12: 189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221-232; Sibanda et al., 1989, J.Mol.Biol. 206: 759-777; Tramontano et al., 1989, • · ··· · · · · · · · · · • · · ···· · · · · • · ··· ·· · · ···· · • · · ···· ··· • · · · · ·· · · · · ··

Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382-394) a β-ohyby tvořené čtyřmi aminokyselinovými zbytky, jak se popisuje dále v textu.

Termín β-ohyb znamená podtřídu reverzních ohybů, βohyb je peptidový segment tvořený čtyřmi aminokyselinovými zbytky, který obrací směr polypeptidového řetězce tak, že umožňuje jednotlivému polypeptidovému řetězci přijmout sekundární strukturu β-listu. Dva vnitřní aminokyselinové zbytky β-ohybu nejsou zahrnuty do vodíkového spojení β-listu; Dva aminokyselinové zbytky na kzždé straně interních zbytků jsou zahrnuty do vodíkového spojení β-listu. Termín β-ohyb Zahrnuje všechny tytpy peptidových β-ohybů, které jsou běžně známy v oboru např. typ-I, typ-II, typ-III, typ-I', typ-II' a typ-III' β-ohybů (Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12: 189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206: 759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382-394).

Termín antimikrobiálně účinné množství znamená množství peptidu (nebo jeho kompozice), které působí biostaticky nebo biocidně proti cílovému mikrobu. Lépe řečeno Termín antimikrobiálně účinné množství peptidu znamená množství peptidu, které inhibuje růst cílového mikrobu nebo je pro něj smrtící.

Termín terapeuticky účinné množství znamená množství peptidu (nebo jeho kompozice), které je účinné pro zlepšení symptomů mikrobiální infekce nebo pro léčbu či prevenci mikrobiálních infekcí nebo onemocnění u rostlin i zvířat.

Termín farmaceuticky přijatelná sůl znamená ty sole, které v podstatě udržují antimikrobiální aktivitu volných bází a které se získaly reakcí s anorganickými kyselinami.

• · · · · ·· · · ·· • · · ···· · · • · · · · ·· · · ···· · ··· · · · · · · · ····* ·· · · ·· ♦♦

Popis preferovaných provedeni vynálezu

Vynález popisuje protegrinové peptidy, které mají antimikrobiálni aktivitu, kompozice, které obsahuji tyto peptidy, způsoby použiti peptidů (nebo jejich kompozic) při inhibici širokého škály mikrobiálních cílů nebo při jejich usmrcení, způsoby použití peptidů (nebo jejich kompozic) při léčbě nebo prevenci mikrobiálních infekcí a nemocí rostlin a zvířat.

Peptidy podle vynálezu vykazují široké spektrum antimikrobiálni aktivity, působí biostaticky a biocidně proti širokému škále mikrobiálních cílů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na gram-pozitivní bakterie, jako jsou L. monocytogenes, B. subtilis, E. faecalis (zahrnujíc kmeny citlivé (VSEF) a rezistentní (VREF) na vankomycin), E. faecium (zahrnujíc kmeny citlivé (VSEF) a rezistentní (VREF) na vankomycin), S.aureus (zahrnujíc kmeny citlivé (MSSA) a rezistentní (MRSA) na methicilin), S. epidermis zahrnujíc kmeny citlivé (MSSE) a rezistentní (MRŠE) na methicilin), S. salivarius, C. minutissium, C. pseudodiptheriate, C. stratium, Corynebacterium skupina Gl, Corynebacterium skupina G2, S. pneumaniae (zahrnujíc kmeny rezistentní (MRSA) na penicilín), S. mitis a S. sanguis; na gram-negativní bakterie zahrnujíc A. calcoaceticus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. marcescens, H. influenza, Moraxella sp. , N. meningitidis, S. typhimurium, H. pylori, H. felis a C. jejuni; na protozoa, kvasinky a jisté kmeny virů a retrovirů. V podstatě zde popsané peptidy působí biostaticky nebo biocidně na klinicky relevantní patogeny, které vykazují rezistenci na řadu léků. Mezi jinými do této skupiny patří na vankmycín rezistentní Enterococcus faecalis nebo faecium (VRE), na penicilín rezistentní Streptococcus pneumoniae ·· · · ·· · · ·· • · ···· · · · · • 9 · · · · ···· • · · ♦ ·· · · · · · ·9

9 9 9 9 9 9 99

99 99 99 9999 (PRSP) a na methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA).

Peptidy podle vynálezu (nebo jejich kompozice) se mohou použít jako biocidní nebo biostatická činidla při různých aplikacích. Například peptidy se mohou použít pro dezinfekci nebo prevenci různých materiálů které zahrnují lékařské nástroje, potraviny, kosmetiku, roztoky pro kontaktní čočky léky nebo jiné materiály, podle vynálezu se mohou bakteriocidní činidla pro řadu léků. Jsou to například VRE, MRSA a MSSE.

Peptidy podle vynálezu nebo jejich kompozice použitelné pro pofylaxi nebo léčbu mikrobiálních onemocnění u /

které obsahují nutrienty. Peptidy použít jako bakteriostatické nebo patogeny, které jsou rezistentní na jsou také infekcí a rostlin a zvířat. Taková onemocnění ale nejsou bakteriální omezena respiračni kandidóza,

Zde infekce, infekce, zahrnují, na gram-negativní a gram-pozitivní endokarditidy, pneumonie a jiné infekce močových cest, orální mukositida, atd.

popsané peptidy s tradičními systémová srovnáni antimikrobiálními peptidy. příbuzné zvířat.

antimikrobiálním vykazují podstatné antibiotiky a/nebo Například zde popsané peptidům, tradiční

Určitá výhoda zvláště mini-protegrinové aminokyselin, produkce je distribuovány je méně tkání výhody ve s jinými peptidy jsou které byly nalezeny u relativně vysoký výskyt rezistence na nebude aktuální pro zde popsané peptidy. některých protegrinů podle vynálezu, formy, které mají méně než 18 v jejich redukované velikosti. Jejich nákladná, očekává se, že budou lépe a j sou méně imonogenní.

Peptidy

Protegrinové peptidy podle vynálezu obecně zahrnují aminokyselinovou sekvenci:

4 44

44

4444

a její definované modifikované formy. Tyto peptidy, které se mohou náhodně objevit v přírodě, musí být v čištěné a/nebo izolované formě nebo synteticky nebo rekombinantně připravené.

Označení X_n v každém případě znamená aminokyselinu se specifikovanou pozicí v peptidů. Podobně označení C_n znamená aminokyselinu se specifickovanou pozicí a dále reprezentuje tyto pozice v v aminokyselinové sekvenci vzorce (I), která může obsahovat aminokyselinové zbytky schopné tvořit disulfidové vnitřní spojení.

Aminokyselinovými zbytky označenými X_n nebo C_n mohou být geneticky kódované L-aminokyseliny, přirozeně se vyskytující negeneticky kódované L-aminokyseliny, syntetické Laminokyseliny nebo D-enantioméry všech shora uvedených aminokyselin. Označení dvaceti geneticky kódovaných Laminokyselin a běžných nekódovaných aminokyslin je běžné a následuj e:

• ·· ·· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · · • · · · · ·*» · · ·· • · · · · · · · · · ··· ·« ·· ·· ·· ··

Zkratky běžných aminokyselin

aminokyselina	jednopismený symbol	běžně užívaná zkratka
alanin	A	Ala
arginin	R	Arg
asparagin	N	Asn
aspartová kyselina	D	Asp
cystein	C	Cys
glutamin	Q	Gin
glutamová kyslina	E	Glu
glycin	G	Gly
histidin	H	His
izoleucin	I	Ile
leucin	L	Leu
lyzin	K	Lys
metionin	M	Met
fenylalanin	F	Phe
prolin	P	Pro
serin	S	Ser
treonin	T	Thr
tryptofan	w	Trp
tyrozin	Y	Tyr
valin	v	Val
ornitin	0	Orn
β-alanin		bAla
2, 3-diaminopropionová kyselina		Dpr
oc-aminoizobutyrová kyselina		Aib
N-metylglycin (sarkozin)		MeGly
citrulin		Cit
t-butylalanin		t-BuA

• ·· ·· ·· ·999 ·· 9 · 9 · · * · 9 99 • · · · · ·· 9999

999 99 99 99999 • 99 · 9 9 9·99 ··· 9· ·· 99 ··99

t-butylglycin		t-BuG
N-metylizoleucin		Melle
fenylglycin		Phg
cyklohexylalanin		Cha
norleucin		Nle
1-naftylalanin		1-Nal
2-naftylalanin		2-Nal
4-chlorofenylalanin		Phe(4-Cl)
2-fluorofenylalanin		-- Phe (2-F)
3-fluorofenylalanin		Phe (3-F)
4-fluorofenylalanin		Phe (4-F)
penicilamin		Pen
1,2,3,4-tetrahydroizoquinolin3-karboxylová kyselina		Tic
β-2-tienylalanin		Thi
metioninsulfoxid		MSO
homoarginin		Har
N-acetyllyzin		AcLys
2,4-diaminobutyrová kyselina		Dbu
p-aminofenylalanin		Phe (pNH2)
N-metylvalin		MeVal
homocystein		hCys
homoserin		hSer
ε-aminohexanová kyselina		Aha
δ-aminovalerová kyselina		Ava
2,3-diaminobutyrová kyselina		Dab
hydroxyprolin		Hyp
parabenzylfenylalanin		Pba
homofenylalanin		hPhe
N-metylfenylalanin		MePhe

Látky podle vynálezu jsou peptidy, které jsou částečně definovány terminem aminokyselinové zbytky určených tříd.

• · · · · · · · · · · ♦ · · · · · · · · · · · • · · ···· ···· ·· ··· ·· ·· ···· · • · · · · · · · « · ····· ·· ·· · · ··

Aminokyselinové zbytky se mohou obecně klasifikovat do hlavních podtříd:

Kyselé: zbytek má negativní náboj, což je způsobeno ztrátou iontu H⁺ při hodnotě fyziologického pH a zbytek je přitahován vodným roztokem tak, že hledá povrchové pozice v konformaci peptidů, ve kterém je obsažen, jestliže peptid je ve vodném médiu při fyziologickém pH.

Bazické: zbytek má pozitivní náboj, což je způsobeno asocicací s iontem H⁺ při fyziologické hodnotě pH a zbytek je přitahován vodným roztokem tak, že hledá povrchové pozice v konformaci peptidů, ve kterém je obsažen, jestliže je peptid ve vodném médiu při fyziologickém pH.

Hyrofóbni: Zbytky nejsou při hodnotě fyziologického pH nabity a zbytek je odpuzován vodným roztokem tak, že hledá vnitřní pozice v konformaci peptidů, ve kterém je obsažen, jestliže je peptid ve vodném médiu.

Polární/velké: zbytky nejsou nabity při hodnotě fyziologického pH, ale zbytek není dostatečně odpuzován vodnými roztoky tak, že musí hledat vnitřní pozici v konformaci peptidů, ve kterém je obsažen, jestliže peptid je ve vodném médiu. V závislosti na podmínkách a zbývajících aminokyselinách v sekvenci zbytek může ležet ve vnitřním prostoru nebo na povrchu proteinu.

Podobné cysteinu: zbytky mají postranní řetězec, který je schopný participovat na disulfidickém spojení. Pak aminokyseliny podobné cysteinu mají obecně postranní řetězec, který obsahuje nejméně jednu thiolovou skupinu (SH), jako je cystein, homocystein, penicilinamin, atd, preferuje se cystein.

Malé: jisté neutrální aminokyseliny mají postranní řetězce, které nejsou dostatečně velké, dokonce jestliže chybí polární skupina, aby byly hydrofóbní. Malé aminokyseliny jsou ty, které obsahují čtyři nebo méně uhlíků • φφ φφ ·· ·· φφ • · · · · φ · φ φ φφ φ φφφ φφφφ φφφφ • φ φφφ φφ φφ φφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φ φφ φφ φφ φφ φφ v případě, že postranní řetězec obsahuje nejméně jednu polární skupinu, a tři a méně uhlíků, jstliže polární skupiny nejsou přítomny.

Genem kódovaná sekundární aminokyselina prolin (stejně jako iminokyseliny podobné prolinu, jako jsou 3-hydroxyprolin a 4-hydroxyprolin), je známa, že působí na sekundární konformaci peptidových řetězců a není ptoro zahrnuta do skupiny.

Samozřejmě se rozumí,. že ve statistické sbírce jednotlivých zbytků některé molekuly budou vykazovat náboj a některé tento náboj mít nebudou a budou v menším nebo větším rozsahu existovat přitažlivé nebo odpudivé síly vůči vodnému médiu. Pojem nabitý se definuje jako podstatné procento (nejméně okolo 25%) jednotlivých molekul, které nesou náboj ve fyziologickém pH. Stupeň přitahování a odpuzování je nutný pro klasifikaci polarity a proto speciálně aminokyseliny, které jsou zahrnuty ve vynálezu se klasifikují jako polární nebo nepolární. Většina aminokyselin, které nejsou specificky pojmenovány, se mohou klasifikovat na základě chování.

Aminokyselinové zbytky se mohou dále rozdělovat do podskupinjako cyklické nebo necyklické a aromatické nebo nearomatické, samovysvětlující klasifikace s ohledem na substituční skupiny zbytků vedlejšího řetězce.

Jisté běžné aminokyseliny, které může obsahovat peptid podle vynálezu, nejsou geneticky kódovány. Mezi tyto aminokyseliny patří, ale nejsou na ně omezeny β-alanin (bAla) a jiné omega.aminokyseliny, jako 3-aminopropionová kyselina, 2,3-diaminopropionová kyselina (Dpr), 4aminobutanová kyselina a další; α-aminoizobutylová kyselina (Aib); ε-aminohexanová kyselina (Aha); óaminovalerová kyselina (Ava); N-metylaglycin nebo sarkozin (MeGly); ornitin (Orn); citrulin (Cit) ; t-butylalanin (t-BuA); t-butylglycin (t-BuG); N-metylizoleucin (Melle); fenylglycin (Phg);

cyklohexylalanin (Cha); norleucin (Nle); 1-naftylalanin (1Nal); 2-naftylalanin (2-Nal); 4-chlorofenylalanin (Phe(4Cl) ) ; 2-fluorofenylalanin (Phe (2-F)); 3-fluorofenylalanin (Phe(3F)); 4-fluorofenylalanin (Phe(4F)); penicilamin (Pen);

1,2, 3, 4-tetrahydroizoquinolin-3-karboxylová kyselina (Tic); β-2-thienylalanin (Thi); sulfoxid methioninu (MSO);

homoarginin (Har); N-acetyllyzin (AcLys); 2,3-diaminobutylová kyselina (Dab); aminofenylalanin homocystein

2,4-diaminobutylová kyselina (Dbu); p(Phe(pNH₂)); N-metylvalin (MeVal); (hCys); hydroxyprolin (Hyp);

parabenzylfenylalanin (Pba);

Homofenylalanin (hPhe); Nmetylfenylalanin (MePhe); a homoserin (hSer). Tyto aminokyseliny také spadají do shora definovaných kategorií.

Klasifikace shora popsaných geneticky kódovaných a nekódovaných aminokyselin je uvedena v tabulce č. 1 dále v textu. Rozumí se, že je zde uvedena pouze pro názornost a neznamená seznam vešech kyselin, které jsou obsaženy ve zde popsaných peptidech.

Tabulka č. 1

Klasifiakce aminokyselin

klasifikace	geneticky kódované	nejsou geneticky kódované
hydrofóbní kyselé	T, V, I, L, M, F, W D, E	Phg, 1-Nal, 2-Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe (2-F), Phe (3-F), Phe(4-F), t-BuA, tBuG, Melle, Nle, MeVal, Cha, hPhe, MePhe, Pba Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), Dbu, Dab

• ·

bazické	Η, K, R	Cit, AcLys, MSO
		bAla, MeGly, Aib,
polární/velké	Q, N	hSer
malé	G, S, A, T	Pen, hCys
podobné cysteinu	C

V peptidu vzorce (I) symbol mezi aminokyselinovými zbytky

X_n a/nebo C_n obecně označuje interspojeni hlavního řetězce. Symbol obvykle značí amidové spojení (-C(0)-NH).Rozumí se, že ve všech peptidech podle vynálezu se může jeden nebo více amidových spojení nahradit spojením, které je jiné než amidové. Mezi taková spojení patří, ale nejsou omezena CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂ CH₂, -CH=CH- (cis a trans forma) , C(O)CH₂-, -CH(OH)CH₂- a -CH₂SO-.

Peptidy mající takové spojení a způsoby přípravy takových peptidu jsoudobře známa v oboru (Spatola, 1983, Vega Data 1(3)(obecné review); Spatola, 1983, Peptide Backbone Modifications In: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids and Proteins (Weinstein, ed.), Marcel Dekker, New York, p. 267 (obecné review); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1: 463468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14: 177-185 (CH₂NH-, - CH₂ CH₂-); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38: 12431249 (-CH₂-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1: 307-314 (-CH=CH-, cis a trans forma); Almguist., et al.,

1980, J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (-COCH₂-) ; Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23: 2533 (-COCH₂-) ; Europan Patent Application EP 45665 (1982) CA:97: 39405 (-CH(OH)CH₂-) ;

Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24: 4401-4404 (C(OH)CH₂); a Hrubý, 1982, Life Sci. 31: 189-199 (-CH₂-S-) .

Peptidy podle vynálezu obsahují okolo 10 až 30 aminokyselinových zbytků. Rozumí se, že ačkoli vzorec (I)

• w *		··	··	··
• · · ·	• ·	• ·	• ·	•	•
• · ·	• ·		• ·	··
• · ·	• · ·	• ·	t ···	•	•
• · ·	• ·	• ·	..·· ·	•	•
··· ··	• ·	··		1*·

znázorňuje 18 specifikovaných pozic aminokyselin obsahující peptidovou strukturu core, peptidy podle vynálezu mohou obsahovat více nebo méně aminokyselin bez působení delece a v některých případech to dokonce zesiluje antimikrobiální nebo jiné použitelné vlastnosti peptidu. V případě peptidu, které obsahují méně než 18 aminokyselinových zbytků, se v peptidové sekvenci nenachází jisté specifikované aminokyseliny, jak se diskutuje detalněji dále v textu.

V případě peptidu, které obsahují více než 18 aminokyselinových zbytků, aminokyselinová skevence, která je zobrazena vzorcem (I), může obsahovat prodloužení na Na/nebo C-konci o aminokyselinové zbytky nebo peptidové sekvence. Rozumí se, že takové přidané aminokyselinové zbytky nebo peptidové sekvence neinterferuji v tom, že budou poškozovat antimikrobiální aktivitu peptidu, což se srovnává s přirozeně se vyskytujícími protegriny.

Peptidy podle vynálezu jsou charakterizovány strukturou core, která obsahuje dva hlavní elementy nebo motivy: oblast reverzní smyčky, která je vymezena dvěma řetězci, které tvoří antiparalelní β-list. Věří se, že antimikrobiální aktivita látek vzorce (I) je částečně spojena s takovou jadernou strukturou.

Oblast β-listu peptidů obsahuej N-řetězec (zbytky Xi až Cg) a C-řetězec (zbytky C_i3 až X_J8) . Řetězce N a C jsou navzájem uspořádány antiparalelně jsou k sobě spojeny kovalentně přes vodíkové můstky hlavních řetězců (v publikaci Creighton, 1993, Protein Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., NY a v jiné zde citované literatuře se detailně popisuje struktura β-listů). Věří se, že většina důležitých zbytků, které jsou obsaženy v oblasti β-listu jsou zbytky X₅ až C₈ a X_i3 až C₁₆.

Oblast β-listu peptidů je přednostně amfifilická, to znamená na povrchu β-listu má čistě hydrofóbni chrakter a jiný povrch má čistě hydrofóbni charakter. S odvoláním na strukturu β-listu zobrazeného na obrázku č. 6vedlejší řetězce L-aminokyselinových zbytků, které leží jeden těsně vedle druhého (zbytky n, n+1, n+2, atd) uvnitř řetězce v opačných směrech tak, že jsou umístěny na opačných površích β-listu. Boční řetězce l-aminokyselinových zbytků, které leží uvnitř řetězce jeden vedle druhého (zbytky n ac, n+1 a c+1, atd) ve stejném směru tak, že se nacházejí na stejném povrcu β-listu. Používajíc tento obecný strukturální motiv amfifilického antiparalelního β-listu se získalo selekcí aminokyselin v každé pozici zbytku, což vede k β-listu, který má hydrofóbni vedlejší řetězce umístěny na jednom povrchu listu a hydrofilní boční řetězce jsou umístěné na druhém povrchu listu.

Samozřejmě je vhodné, aby povrchy amfifilické antiparalelní oblasti β-listu měly pouze čistě hydrofóbni nebo čistě hydrofilní charakter, každý vedeljší řetězec obsahující určitý povrch nepotřebuje být hydrofóbni nebo hydrofilní. Povrchy mohou obsahovat vedlejší řetězce, které podstatně nemění charakter povrchu. Například hydrofóbni nebo hydrofilní povrchy mohou obsahovat malé aminokyselinové boční řetězce, přičemž tyto vedlejší řetězce podstatně neovlivňují chrakter povrchu.

Oblast β-listu peptidů vzorce (I) může obsahovat od jednoho do čtyř aminokyselin podobných cysteinu, které jsou označeny C₆, C_e, C_í3 a C₁₅, které se mohou podílet disulfidických vazbách mezi řetězci. Peptidy podle vynálezu obsahují nejméně dva aminokyselinové zbytky podobné cysteinu, které mohou být ve formě rovného řetězce nebo ve formě kruhu v závislosti na rozsahu formace disulfidických vazeb.

• · • · ···· ···· ···· ··· ···· · · ·· • · ··· · · · · ···· · ··· 9 · · · · · · • · · · · · · · » · · ·♦

Cyklické formy jsou výsledkem formace disulfidických spojeni mezi všemi nebo několika ze čtyř variant aminokyselin podobných cysteinu. Cyklické formy podle vynálezu zahrnují všechny možné permutace formací disulfidových vazeb. Formy přímého řetězce mohou přejít na cyklickou formu a obráceně. Způsoby tvorby disulfidových můstků za účelem vytvoření cyklických forem jsou dobře známy v oboru stejně jako způsoby redukce disulfidů za účelem vytvoření lineárních látek.

Přirozeně se vyskytující protegriny (PG-1 až PG-5) obsahují dvě disulfidové vazby; jedna je mezi cysteiny C₆-Ci₅ a další je mezi cysteiny C₈-C₁₃ (Harwing et al., 1995, J. Peptide Sci. 3: 207). V tomto provedení vynálezu, které má dva disulfidové můstky, se preferuje forma cysteiny C₆-Ci₅ a C₈-Ci3· Takové peptidy se označují jako nativní formy. Zjsitilo se však, že formy protegrinů obsahující pouze jednu disulfidovou vazbu jsou aktivní a jednoduše se připravují. Preferovaná provedení mají pouze jednu disulfidickou vazbu a jsou to ta, která jsou reprezentována samotným C₆~Ci₅ a samotným C₈-Ci₃.

Formy obsahující disulf id C₆-Ci₅, jako jediné disulfidické spojení jsou obecně označeny bullet formy protegrinů; ty formy, kde jediný disulf id je C₈-Ci₃ jsou označeny jako kite formy. Formy bullet a kite se většinou běžně připravují záměnou každého aminokyselinovému zbytku podobnému cysteinu v pozicích, které nejsou zahrnuty v disulfidickém spojení s aminokyselinami, které se nepodílí na disulfidických vazbách, přednostně s malými aminokyselinami, jako je glycin, serin, alanin nebo treonin. V jiném případě nemusí být přítomen C₈ a/nebo C_i3.

Jako linearizované nebo snake formy nativních peptidů mají významné aktivity peptidy podle vynálezu, které zahrnují linearizované formy, přičemž sulfylhydrylové skupiny (SH) jsou chemicky stabilizovány vhodnými činidly. Termín SH20

stabilizované formy peptidů podle vynálezu obsahuji sulfhydrylové skupiny, které reaguji se standardními činidly za účelem prevence znovu vytvoření disulfidových vazeb nebo jsou to formy, kde aminokyselinové zbytky podobné cysteinu jsou nahrazeny jinými aminokyselinami, jak se uvádí shora v textu. Preferuje se, aby se všechny čtyři aminokyselinové zbytky podobné cysteinu nahradily nebo se SH-stabilizovaly za účelem minimalizace pravděpodobnosti tvoření intermolekulárních disulfidových spojení.

Atomy síry, které se podílejí na vnitrořetězcovém disulfidovém můstku v β-listu nejsou umístěny v rovině, kterou definují vnitrořetězcové vodíkové vazby; atomy síry svírají úhel s ohledem na β-uhlíky spojených aminokyselinových zbytků tak, že jsou umístěny na povrchu βlistu. Atomy síry disulfidového spojení přizpívá k hydrifilicitě povrchu β-listu. Rozumí se, že v peptidech vzorce I oblast β-listu, která je definována následujícím vzorcem, spadá do definice zde popsaného amfifilického antiparalelního listu:

C₆ - X₇ - C₈

C15 X14 - C13 kde C₆, C₈, C_i3 a C15 jsou každý nezávisle aminokyselina podobná cysteinu, X₇ a X_i4 jsou každý nezávisle hydrofobní nebo malá aminokyselina a // disulfidická vazba. Ve zvláště preferovaném provedení C₆, C₈, C13 a C_i5 jsou každý cystein a X₇ a X14 jsou každý nezávisle hydrofobní aminokyseliny.

Sekundární struktura β-listu zobrazená na obrázku č. 6 je celá tvořena L-aminokyselinami. Odborníci dokáží rozeznat, že substituce L-aminokyseliny s jejím odpovídajícím D21

enantiomérem ve specifické pozici zbytku může poškodit stabilitu struktury nebo amfifilicitu amfifilické antiparalelni oblasti β-listu. Stupeň poškození strukturální stability nebo amfifilicity substitucí určitými enantioméry částečně závisí na velikosti aminokyselinového vedlejšího řetězce a pozici zbytku v β-listu. Upřednostňuje se, aby oblast β-listu peptidů vzorce I obsahovala směsy L- a Daminokyselin, které neovlivňují podstatně . stabilitu a amfifilicitu oblasto β-listu, což se srovnává s peptidy, které obsahují odpovídající všechny D- nebo všechny Lenantiomérové formy listu. Odborníkovi jsou zřejmé enantiomérové substituce, které neovlivňují podstatně stabilitu nebo amfifilicitu oblasti β-listu.

V preferovaném provedení vynálezu hydrofobní, bazické, polární/velké a cysteinu podobné aminokyseliny, které obsahují oblast β-listu jsou buď všechny L-enantioméry nebo všechny jsou D-enantioméry. Malé aminokyseliny obsahující oblast β-listu mohou být buď L-enantioméry nebo Denantioméry.

Oblast reverzního ohybu peptidů vzorce I (zbytky X₉-Xio X11-X12 berou-li se v úvahu dohromady) váží řetězce antiparalelního β-listu. Oblast reverzního ohybu obsahuje strukturu, která obrací směr polypeptidového řetězce tak, že umožňuje oblasti peptidu přijmout antiparalelni sekundární strukturu β-listu.

Oblast reverzního ohybu molekuly obecně obsahuje dvě, tři nebo čtyři aminokyselinové zbytky (zbytek X₉ a/nebo X₁₂ nemusí být přítomny). Důležitý rys peptidů podle vynálezu je přítomnost pozitivního náboje v oblasti ohybu molekuly. Pak jeden z X₉-Xi2 a přednostně X₉-X₁₂, musí být bazická aminokyselina. Takové dva, tři a čtyři aminokyselinové segmenty schopné působit ohyb v peptidu jsou dobře známy a jsou odborníkovi zřejmé.

V preferovaném provedení vynálezu reverzní ohyb je γohyb, který obsahuje tři aminokyselinové zbytky. Ve skutečnosti libovolná sekvence γ-ohybu je známá v oboru a může se použít v peptidech podle vynálezu. Mezi tyto sekvence patří ty, které se popisují v publikacích Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12: 189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203; 221-232; Sibanda et al., 1989, J.Mol.Biol. 206: 759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382-394.

V jiném preferovaném provedení podle vynálezu reverzní ohyb je β-ohyb, který je tvořen čtyřmi aminokyselinovými zbytky. V

takových strukturách	nejsou dva vnitřní aminokyselinové
zbytky ohybu obvykle	zahrnuty do vodíkových vazeb anti-
paralelního β-listu ;	dva aminokyselinové zbytky na každé

straně vnitřních zbytků jsou obvykle zahrnuty do vodíkových vazeb β-listu. Věří se, že takové vodíkové vazby pomáhají stabilizovat oblast β-listu molekuly.

Konformace a sekvence mnoha peptidu β-ohybů jsou v oboru dobře popsány a zahrnují například tytp-I, typ-I', typ-II, typ-II', tup-III, typ-III', typ-IV, typ V, typ-V', typ-Via, typ-Vib, typ-VII a typ-VIII (Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34: 167-339; Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12: 189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221-232; Sibanda et al., 1989, J.Mol.Biol. 206: 759-777; Tramontano et al·., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382-394). Všechny tyto typy peptidové struktury β-ohybu a jejich odpovídající sekvence stejně jako později objevené peptidové

struktury β-ohybu a sekvence jsou specificky popsány ve vynálezu.

Specifické konformace krátkých peptidových ohybů, jako jsou β-ohyby, primárně závisí na poloházh jistých aminokyselinových zbytků v ohybu (obvykle Gly, Asn nebo Pro). Obecně β-ohyb typ-I je kompatibilní s libovolným aminokyselinovým zbytkem v polohách X₉ až Xi₂, mimo skutečnost, že Pro se nemůže vyskytovat v poloze X_xl. U obouch typů ohybů typ-I a typ-II převládá výskyt Gly v poloze X12 a Pro převládá v poloze Xi₀. Zbytky Asp, Asn, Ser a Cys se často vyskytují v poloze X₉, kde jejich vedlejší řetězec často tvoří vodíkovou vazbu s NH zbytku Xn.

V ohybu typu-II se Gly a Asn objevuje více často v poloze Xn, jak daleko jednodušeji přijímají úhly hlavního řetězce. V ideálním případě ohyb typ-I'má Gly v poloze Χ_χ0 a X_u a ohyby typ-II'mají Gly v pozici X₁₀. Ohyby typu-III obecně mohou mít většinu aminokyselinových zbytků, ale ohyby typ-III'obvykle požaduje, aby Gly bylo v polohách Χ_χ0 a Xn ·

Ohyby typ-Via a Vib obecně mají vázaný cis peptid a Pro jako vnitřní zbytek. V publikaci Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221-232 je uveden přehled různých typů a sekvencí β-ohybů v proteinecha v peptidech.

Preferované sekvence β-ohybu jsou následující (uvedené v pořadí X₉ až X₁₂) : ZZZG, ZZZF, ZZSG, ZZAL, ZGZL, ZFZL, ZPZV, ZPZF, ZGZY, IZGY, LZZF, YZGZ, YZGZ, kde každé Z je nazávisle L- nebo D-enantiomér R, K, Dbu nebo Orn.

Preferované β-ohyby zahrnují ty, kde v pozici X_xo a/nebo Xn jsou Tic nebo Hyp. Je známo, že tyto zbytky ovlivňují nebo indukují v peptidech nebo proteinech struktury β-ohybu.

Peptidy podle vynálezu jesou obecně bazické, to znamená, že mají čistě pozitivní náboj ve fyziologickém pH. Věří se, že přítomnost pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků zvláště oblasti ohybu v molekule je důležitá v případě antimikrobiální aktivity.

Rozumí se, že statisticky hodnoceném celku jsou některé jednotlivé aminokyselinové zbytky ve struktuře takového peptidu pozitivně nabité, jiné jsou negativně nabité a některé nenesou žádný náboj. Pak některé peptidy budou vykazovat náboj a některý budou bez náboje. Aby se vyhovělo definici zásaditá většina aminokyselinových zbytků v molekule peptidu jepozitivně nabitá ve fyziologickém pH. Pk přibližně 15%, ale ne více než okolo 50% aminokyselin musí být bazických a látky musí mít čistý náboj nejméně +1 při fyziologickém pH. Upřednostňuje se, aby peptidy podle vynálezu měly ve fyziologickém pH čistý náboj nejméně +3.

V případě provedení vynálezu, které obsahuje 10 aminokyselin, zde může existovat pouze jeden bazický aminokyselinový zbytek ; avšak dokonce I v tak krátkém řetězci se prferuje přítomnost nejméně dvou bazických zbytků. Jestliže protegrinový peptid obsahuje 15 aminokyselinových zbytků, jsou nutné dva bazické zbytky. Preferuje se, aby nejméně 20% aminokyselin v sekvenci bylo bazických, zvláště se prferuje, aby v sekvenci bylo 30% bazických aminokyselin.

N-konec peptidu podle vynálezu může být ve volné amino formě nebo může být acylován skupinou vzorce RCO-, kde R je hydrokarbylová skupina 1-25C, s výhodou 1-10C, nejvýhodnější je 1-8C. Hydrokarbylová skupina se může být saturovaná nebo nesaturovaná, s přímým řetězcem, větvená nebo cyklická a je to například metyl, etyl, izopropyl, t-butyl, n-pentyl, cyklohexyl, cyklohexane-2-yl, hexene-3-yl, hexyne-4-yl, oktyl, decyl, eikanosyl a podobně, přičemž se preferuje oktyl.

V jiném případě N-konec může obsahovat aromatické skupiny, jako je nafatlen atd. Takové skupiny se mohou běžně začlenit do peptidu podle vynálezu za použití aminokyselin, jako jsou 1-naftylalanin nebo 2-naftylalanin jako aminokyselinový zbytek N-konce.

N-konec peptidů může také být substituován a za použiti specifických transmembránových tunelů může vstupovat do bakteriální periplazmy. Například N-konec může být běžně modifikován katecholem za použití esteru aktivovaného katecholem NHS.

C-konec peptidů podle vynálezu může být ve formě nederivatizované karboxylové skupiny, buď jako volná kyselina nebo přijatelná sůl, jako je draslík, sodík, vápník, hořčík nebo jiné sole anorganického iontu nebo organického iontu, jako je kofein. V některých provedeních vynálezu je obtížné připravit sole, protože zbytek molekuly nese pozitivní náboj, který může odpuzovat relevantní kationt. Kerboxylový konec může také být derivatizován tvorbou esteru s alkoholem vzorce ROH nebo může být amidován aminem vzorce NH₃ nebo RNH₂ nbeo R₂NH, kde každé R je nezávisle hydrokarbyl s 1-25C, jak se definuje v předchozím provedení vynálezu. Preferují se amidované formy peptidů, kde C-konec má vzorec CONH₂.

Adice lipofilických skupin na C- a/nebo N-konec umožňuje průchod peptidů membránou cílového mikrobu a penetraci do míst infekce. Volba optimální substituce je určena hodnocením s ohledem na obsah lipidů cílového mikroba.

Pak v jednom názorném provedení vynálezu se popisují antimikrobiálni peptidy, které obsahují okolo 10 až 30 aminokyselinových zbytků a aminokyselinovou sekvenci:

(I) X1 X₂ X3 X₄ X5 Οβ X7 Cg X9 Χίο Xll X12 C13 X14 C15 X16 X17 X]_g nebo farmaceuticky přijatelnou sůl nebo jejich formu s acylovaným N-koncem nebo amidovaným C-koncem nebo jejich esterifikovanou formu, • «· · ♦ · · · · · · ··· · · ·· · · ·· · ··· · · ·· · · ·· • · ··· · · · · ··· · · • · · · · · ♦ · · · ··· « ·· ·· ·· ·· kde každý z C₈ a C13 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle podobný cysteinu, je bazický, malý, polární/velký nebo hydrofóbní;

každý z C₆ a C15 je nezávisle aminokyselina podobná cysteinu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbní;

každý z X1-X5 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, polární/velká nebo malá aminokyselina;

každý z X·? a Χχ₄ je nezávisle hydrofóbní nebo malá aminokyselina;

každý z X₉ a X_i2 je nezávisle přítomen nebo není přítomen;

X9-X12 dohromady jsou schopny vytvořit reverzní ohyb, jstliže jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I) a nejméně jeden z X₉-X₁₂ musí být bazická aminokyselina;

každý z Χι₆-Χχ₈ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, hydrofóbní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

a kde nejméně okolo 15% až 50% aminokyselin, které jsou obsaženy v antimikrobiálním peptidů, je bazických, přičemž antimikrobiální peptid má při hodnotě fyziologického pH čistý náboj nejméně +1.

V jedné zde popsané třídě protegrinů jsou buď hydrofóbní aminokyseliny nalezené vpřirozeně se vyskytujícíchprotegrinech v X₅ jsou nahrazeny bazickou aminokyselinou a/nebo nejméně jedna X1-X4 je hydrofóbní a/nebo nejméně jedna a s výhodou všechny čtyři aminokyseliny Xx a X₄ nalezené v nativních formách jsou deletovány; a/nebo jedna nebo více X₅, C₈, X₉, X12, C_i3 a X_i6 jsou nepřítomny.

Vhodnou manipulací těchto a jiných rysů rozmezí podmínek, při kterých třída protegrinů podle venálezu je účinná, se může měnit. Spektrum mikrobů, proti kterým působí, se může také modifikovat.

V jiné třídě peptidů podle vynálezu je obsaženo 10 až 14 aminokyselinových zbytků a každý z C₈ a Ci₃ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbni aminokyselina nebo cystein;

každý z C₆ a C_i5 je nezávisle aminokyselina malá, polární/velká nebo hydrofóbni nebo cystein;

každý z Xj až X₅ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo malá aminokyselina a libovelné dvě z X_T až X₅ z X7 a X14 aminokyselinou; je je nezávisle hydrofóbni aminokyselina; nezávisle přítomen nebo není přítomen pak každý je nezávisle bazická nebo z Xg a X12 je přítomen, aminokyselina;

bazická, hydrofóbni nebo malá aminokyselina nebo nezávisle přítomen nebo není přítomen je bazická, hydrofóbni, a jestliže nebo malá

X18 je je nezávisle přítomen, pak přítomen každý je nebo není nezávisle mohou být hydrofóbni každý každý a jestliže hydrofóbni

X10 je prolin.

Xi6 je je přítomen, pak aminokyselina;

každý z X_n a přítomen a jestliže bazická nebo malá aminokyselina;

každý z X₁₆ až Χ_ΐ8 je nezávisle přítomen a jestliže je přítomen, pak bazická, malá,

Peptidy v jene třídě aminokyselinovýcyh zbytků a přítomen nebo není přítomen a je nezávisle malá, aminokyselina nebo cystein;

nebo není přítomen každý je hydrofóbni nebo polární/velká aminokyselina;

obsahuj i každý z j estliže polární/velká přibližně a Ci₃ je přítomen, nebo

C₈ je nezávisle až 18 nezávisle pak každý hydrofóbni • ·· ·· ·· ·· ·· «··· ···· · · · · • Z í.í í.·*.«*..1·**» * * · ···· ··· ···«« ·« ·· ·· ·· každý z C₆ a C15 je nezávisle malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina nebo cystein;

každý z X_x až X₄ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo malá aminokyselina a jedna libovolná z Xi~X₄ může být hydrofobní aminokyselina;

každý z X₅ a Χ_χ6 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo hydrofobní aminokyselina;

každý z X₇ a X_i4 je nezávisle hydrofobní aminokyselina;

X₉ je přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak je bazická nebo hydrofobní aminokyselina;

X₁₀ je bazická nebo malá aminokyselina nebo prolin;

Xn je bazická nebo hydrofobní aminokyselina;

X12	je	přítomen nebo není přítomen a	jestliže	je
přítomen,	pak	je hydrofobní aminokyselina;
X17	je	přítomen nebo není přítomen a	jestliže	je
přítomen,	pak	je nezávisle malá aminokyselina; a
Xi8	je	přítomen nebo není přítomen a	j estliže	je

přítomen, pak je nezávisle bazická aminokyselina;

Peptidy podle vynálezu se mohou dále zobrazovat způsobem preferovaných provedení vynálezu. V jednom preferovaném provedeni vynálezu všechny aminokyselinové zbytky podobné cysteinu v polohách C₆, C₈, C13, C_i5 jsou přítomny, jestliže se vyskytují X₉ a X_i2.

V jiném preferovaném provedení vynálezu všechny Χχ-Χ₄ nejsou přítomny. V dalších preferovaných provedeních vynálezu nejméně jedno nebo s výhodou dva z X1-X4 je hydrofobní aminokyselina, upřednostňuje se I, V, L, Y, F nebo W.

V jiných preferovaných provedeních vynálezu X5-X12 obsahuje nejméně jeden hydrofobní aminokyselinový zbytek, s výhodou Phe, Tyr nebo Trp.

• φ φ φ φ ···· ··

ΦΦΦ φ φ ΦΦ · ♦ · ··

ΦΦΦ ΦΦΦΦΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ · · · φ * ·· • ΦΦ ΦΦΦΦΦΦΦ φ φ φ φ φ φ · ·· ····

Jiná preferovaná provedeni vynálezu zahrnuji tyto peptidy, kde každý Xi a X₉ je nezávisle vybrán ze skupiny obsahující R,K, Orn, Dab a Har nebo hydrofóbní aminokyselinu; s výhodou Xi je R, K, Har a X₉ je R, K, Har nebo hydrofóbní aminokyselina, zvláště I, V, L, W, F nebo Y. Avšak každé Xi a X₉ nemusí být přítomno.

V jiné třídě preferovaných provedení každé X₂ a X₃ je nazávisle vybráno ze skupiny obsahující G, A, S, T, I, V, L,

F, Y a W; upřednostňuje se, aby X₂ a X₃ byly .G, W, F, Y, L nebo V; avšak X₂ a/nebo X₃ nemusí být přítomny.

V jiném preferovaném provedení vynálezu je X₄ vybráno ze skupiny obsahující R, K, H, Orn, Har, Dab, G, A, S, T, F, Y a W; X₄ je s výhodou R, K, Orn, Dab, G nebo W; avšak X₄ nemusí být přítomen.

V jiném preferovaném provedení vynálezu každý X₅ a X_i6 je nazávisle vybráno ze skupiny obsahující I, V, Nle, W, Y a F; upřednostňuje se I, V, L, W, F a Y; avšak X₅ a/nebo Χ₃₆ nemusí být přítomen.

V jiném preferovaném provedení vynálezu každý X7 a X_i4 je nazávisle vybráno ze skupiny obsahující I, V, L, W, Y a F; upřednostňuje se, aby X7 bylo I, F, Y nebo W a X_i4 bylo I, V, L, W, Y nebo F.

V jiném preferovaném provedení vynálezu X₉ je R, K, H, Orn, Har, Dab, I, V, L, Nle, W, Y a F; X_i2 je I, V, L, W, F nebo Y; více se upřednostňují aromatické aminokyseliny, jako jsou Y, W nebo F.

V jiném preferovaném provedení vynálezu Χ₄₀ je R, Orn, Dab, G, W nebo P.

V jiném preferovaném provedení vynálezu Xu je R, K, Orn, Dab, G, W nebo P.

V jiném preferovaném provedení vynálezu X_i7 není s výhodou přítomen, ale jestliže je přítomen pak je s výhodou

G, A, S nebo T;

• Φ · Φ ·»·· · φ · φ * · · 9 · Φ· · 9·· *· · · · · ♦ ·· ··♦ · Φ • « · · · Φ ···· ··· ΦΦ ·· ·· ·*··

V jiném preferovaném provedeni vynálezu Χιθ není s výhodou přítomen, ale jestliže je přítomen pak je s výhodou R, K, H, Orn, Har nebo Dab.

Také se upřednostňuje, jestliže čtyři aminokyseliny X_xX₄ jsou přítomny, Xi a X₄ jsou přednostně bazické aminokyseliny a X₂ a X₃ jsou malé nebo hydrofóbní aminokyseliny. Preferovaná provedení Xi-X₄ zahrnují R-G-G-R, R-G-W-R, R-L-L-R a podobně.

V prferovaném provedení vynálezu se preferují tyto bazické aminokyseliny vhodné pro záměnu zbytků podobných cysteinu: R, K, H, Orn, Dab a Har, více se upřednostňují R, K, nebo Orn. Preferované malé aminokyseliny vhodné pro záměnu zbytků podobných cysteinu jsou G, A, S a T, více se upřednostňují A a T.

Zvláště preferované peptidy podle vynálezu zahrnují nativní formy, ' formy křte, bullet a/nebo snake následujících peptidů:

Forma-21:

R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V R-G-G-R-R—Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V—Z—V R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z -V-Z-R R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V

Forma-22

R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-V r-g-g-r-r-z-y-z-r-r-r-f-z-i-z-v R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-f-Z-I-Z-R r-g-g-r-r-z-y-z-r-r-r-f-z-i-z-r r-z-y-z-r-r-r-f-z-i-z-v L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-R

• φ φ φ φ φ φ · φ ···

Φφφ φ· φ φ· φφ φφ

R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-R L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-V

Forma-23

R-G-G-G-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V R-G-G-G-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V R-G-G-G-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R R-G-G-G-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R R-Z-Υ-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V ₍L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z -V-Z-R R-Z-Υ-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V

Forma-24

R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V R-G-G-R-R-Ζ-Υ-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V

Forma-25

R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V R-G-G-R-L-z-y-z-r-p-r-f-z-v-z-r R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V a jejich N-acetylované esterifikované formy, kde každé malá nebo bazická aminokyselina a/nebo C-amidované nebo Z je nezávisle hydrofóbni, nebo cystein, stejně jako • 9 ·· ··99 • · · · · 9 *· • · · · · 99 9 •9 99 · · 99999

9 9 9 9 9· ·· ·· 9 999 předcházející formy, kde X₇ je W a/nebo X_i2 je W a /nebo kde X₁₄ je W a/nebo X_i6 je W a/nebo X_i7 je G a X_i6 je R; a/nebo kde nejméně jedno z X₅, X₉, X₁₂ a X_x6 není přítomno. Ve všech těchto provedeních se upřednostňuje, aby Z bylo S, A, T nebo G, více se upřednostňuje A nebo T.

Předcházející peptidy, protegrin forma 21 obsahuje látky, které jsou charakteristické pro uvedenou třídu, ale které jsou jinak podobné protegrinu (PG-1); forma 22obsahuje charakteristiky uvedené třídy, ale je jinak podobná protegrinu-2 (PG-2); formy 23 až 25 jsou podobně příbuzné protegrinům -3, -4 a -5 (PG-3, PG-4 a PG-5) (Obr. č. 5).

Jiné preferované látky zahrnují nativní formy, formy kite, bullet a/nebo snake následujících peptidů:

kód sekvence

RGGRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:1)
WLCFCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:2)
FLCFCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:3)
WYCYCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:4)
WXCYCRRRFCVCV (X=Cha)	(SEQ ID NO:5)
WLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:6)
WXCYCRRRFCVCVGR (X=Cha)	(SEQ ID NO:7)
RLLRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:8)
RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVal)	(SEQ ID NO:9)
RGVCVCFRRRCYCLW	(SEQ ID NO:10)
RGVCVCFRRRCYCLW	(SEQ ID NO:11)

• · kód sekvence

VCVCFRRRCYCLW	(SEQ ID NO:12)
FCVCFRRRCFCLF	(SEQ ID NO:13)
RGVCVCFRRRCYCRGGR	(SEQ ID NO:14)
RGVCVCFRRRCYCLRGGR (all D)	(SEQ ID NO:15)
RGVCVCFRRRCYCLW	(SEQ ID NO:16)
RGVCVCYRXRCYCLW (X=MeGly)	(SEQ ID NO:17)
WLCYCRXZYCVCVGR (X=MeGly) (Z=D-Arg)	(SEQ ID NO:18)
RGFCVCFRRVCYCLW	(SEQ ID NO:19)
WLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:20)
WLCYCRRXFCVCVR (X=D-Arg)	(SEQ ID NO:21)
WLCYCKKKFCVCVGK	(SEQ ID NO:22)
Oc tyl -WLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:23)
XLCYCRRRFCVCV (X=l-Nal)	(SEQ ID NO:24)
WLC RGRF CVR	(SEQ ID NO:25)
WLC RC-RF CFR	(SEQ ID NO:26)
WLCY RR VCVR	(SEQ ID NO:27)
WLCYCOOOFCVCV	(SEQ ID NO:28)
WLCYCXXXFCVCV (X=Dab)	(SEQ ID NO:29)
WLCYCRRRFCVCV (all D)	(SEQ ID NO:30)
HWRLCYCRPKFCVCV	(SEQ ID NO:31)
KWRLCYCRPKFCVCV	(SEQ ID NO:32)
OWRLCYCRPKFCVCV	(SEQ ID NO:33)
XWRLCYCRPKFCVCV (X=Dbu)	(SEQ ID NO:34)
RWHLCYCRPKFCVCV	(SEQ ID NO:35)
RWKLCYCRPKFCVCV	(SEQ ID NO-.36)
RWOLCYCRPKFCVCV	(SEQ ID NO:37)
RWXLCYCRPKFCVCV (X=Dbu)	(SEQ ID NO:38)
WLCYCKXKFCVCVGR (X=Tic)	(SEQ ID NO:39)
FCYCKXKFCYCV (X=Hyp)	(SEQ ID NO:40)
WLXYXRRRFXVXV (X=hCys)	(SEQ ID NO:41)
WOLCYCOXOFCVCVO (X=Tic)	(SEQ ID NO:42)
OFCVCVOXOFCVCVO (X=Tic)	(SEQ ID NO:43)
OWOLCYCOXOFCVCV (X=Tic)	(SEQ ID NO:44)
OFCVCXOLCYCFO (X=Tíc)	(SEQ ID NO:45)

kód sekvence ·· ·· ·· • · · · · · • · · · ·· • · · · · · • ·♦ ·· ♦ ·

	WLCYCKKKFCVCV OWOLCYCOXOFCVCV (X=Hyp) WLCYCOXOFCVCVO (X=Pba) WLCYCOOOFCVCV (all D)	(SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ	ID NO:46) ID NO:47) ID NO:48) ID NO:49)
XFCYCLRXFCVCVR WLCYCRRXFCVCVZX	(X=D-Arg) (X=D-Arg) (Z=MeGly)	ID ID	N0:50)
NO:	51)
PC11	LCYCRRRFCVCVGR		(SEQ	ID	NO	52)
PC12	RCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	53)
PC15	RGGRLCYCRRRFCVCR		(SEQ	ID	NO	54)
PC16	RCYCRRRFCVCR		(SEQ	ID	NO	55)
PC17	LCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	56)
PC18	LCYARRRFAVCV		(SEQ	ID	NO	57)
PC19	RCYARRRFAVCR		(SEQ	ID	NO	58)
PC20	LAYCRRRFCVAV		(SEQ	ID	NO	59)
PC21	RAYCRRRFCVAR		(SEQ	ID	NO	60)
PC22	RGGRLCY RR VCV		(SEQ ID	NO	61)
PC31	GGRLCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	62)
PC32	RGRLCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	63)
PC33	GRLCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	64)
PC34	RRLCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	65)
PC35	RLCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	66)
PC36	RRCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	67)
PC37	CYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	68)
PC44	RGGRLCYCRRRFCVC		(SEQ	ID	NO	69)
PC47	RGGRLCY RRRF VCV		(SEQ	ID	NO	70)
PC48	RGWRLCYCRRRFCVCV		(SEQ	ID	NO	71)
PC37a	CYCRRRFCVCVGR		(SEQ	ID	NO	72)
PC45	RGGRLCYCRRRFCV		(SEQ	ID	NO	73)
PC72	LCYCRRRFCVC		(SEQ	ID	NO	74)
PC64	LCYTRRRFTVCV		(SEQ	ID	NO	75)
PC64a	LTYCRRRFCVTV		(SEQ	ID	NO	76)
PC31a	GGRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	77)
PC32a	RGRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	78)

• ·· ·♦ ·· ·♦ ·· ·· · · · · ♦ · 9 9 9 9

999 9 9 99 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

999 99 99 99 9999

kód	sekvence
PC33a	GRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	79)
PC34a	RRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	80)
PC35a	RLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	81)
PC36a	RRCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	82)
PC44a	RGGRLCYCRRRFCVCR	' (SEQ	ID	NO	83)
PC47a	RGGRLCY RRRF VCVGR	(SEQ	ID	NO	84)
PC48a	RGWRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	85)
PC54	RGWRLAYCRRRFCVAVGR	(SEQ	ID	NO	86)
PC61	RCYCRRRFCVCV	(SEQ	ID	NO	87)
PC62	LCYCRRRFCVCR	(SEQ	ID	NO	88)
PC63	VCYCFRRFCYCV	(SEQ	ID	NO	89)
PC65	LCYTRPRFTVCV	(SEQ	ID	NO	90)
PC66	LCYTRGRFTVCV	(SEQ	ID	NO	91)
PC67	LCYFRRRFIVCV	(SEQ	ID	NO	92)
PC68	LCYFRPRFIVCV	(SEQ	ID	NO	93)
PC69	LCYTFRPRFVCV	(SEQ	ID	NO	94)
PC70	LCYTFRGRFVCV	(SEQ	ID	NO	95)
PC74	CYCFRRFCVC	(SEQ	ID	NO	96)
PC77	LCYCRRRRCVCV	(SEQ	ID	NO	97)
PČ78	LCYCFRRRCVCV	(SEQ	ID	NO	98)
PC79	LCYCRFRRCVCV	(SEQ	ID	NO	99)
PC80	LCYCRRFRCVCV	(SEQ	ID	NO	100)
PC81	LCYCRRFFCVCV	(SEQ	ID	NO	101)
PC82	LCYCRFFRCVCV	(SEQ	ID	NO	102)
PC83	LCYCFFRRCVCV	(SEQ	ID	NO	103)
PC84	LCYCFRRFCVCV	(SEQ	ID	NO	104)
PC85	LCYCFRFRCVCV	(SEQ	ID	NO	105)
PC86	LCYCRFRFCVCV	(SEQ	ID	NO	106)
PC87	LCYCFRFFCVCV	(SEQ	ID	NO	107)
PC88	LCYCFFRFCVCV	(SEQ	ID	NO	108)
PC89	LCYCFFFRCVCV	(SEQ	ID	NO	109)
PC90	LCYCRFFFCVCV	(SEQ	ID	NO	100)
	RGGRLCY RR VCVGR	(SEQ	ID	NO	ni)
PC91	YCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO	112)

kód sekvence

PC95 PC96	ICYCRRRFCVCVGR FCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:113) (SEQ ID NO:114)
PC97	WCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:115)
PC99	RCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:116)
PC109	RLCYTRGRFTVCV	(SEQ ID NO:117)
PC110	LCYTRGRFTVCVR	(SEQ ID NO:118)
PC111	RLCYTRGRFTVCVR	(SEQ ID NO:119)
PC112	LCYCHHHFCVCV	(SEQ ID NO:120)
PC113	LCYTHHHFTVCV	(SEQ ID NO:121)
	RGGLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:122)
	RGGRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO: 123.)
	RGGGLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:124)
	RGGGLCYCRRGFCVCFGR	(SEQ ID NO:125)
	RGGGLCYCRRPFCVCVGR	(SEQ ID NO:126)
	RGGGLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:127)
	RGGRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	(SEQ ID NO:128)
	RGGLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:129)
	RGGRLCYCXGRFCVCVGR (X=Cít)	(SEQ ID NO:130)
	XGGRLCYCRGRFCVCVGR (X=Cít)	(SEQ ID NO:131)
	RGGRVCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:132)
	RGGGLCYCFPKFCVCVGR	(SEQ ID NO:133)
	RGWGLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:134)
	RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	(SEQ ID NO:135)
	RGWRLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:136)
	RGWRLCYCXPRFCVCVGR (X=CÍt)	(SEQ ID NO:137)
	RWRLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:138)
	RGWRLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:139)
	RGWRACYCRPRFCACVGR	(SEQ ID NO:140)
	GWRLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:141)
	RWRLCYCKGKFCVCVGR	(SEQ ID NO:142)
	RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	(SEQ ID NO:143)
	GGWRLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:144)
	RGGWLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:145)
	RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	(SEQ ID NO:146)

kód sekvence

RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	(SEQ ID NO:147)
RLLRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:148)
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha)	(SEQ ID NO:149)
RGGRLCYCRXRZCVCWGR (X=MeGly) (Z=Cha)	(SEQ ID NO:150)
RGGRWCVCRXRZCYCVGR (X=MeGly) (Z=Cha)	(SEQ ID NO:151)
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha)	(SEQ ID NO:152)
RGGRWCVCRGRXCYCVGR (X=Cha)	(SEQ ID NO:153)
RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVal)	(SEQ ID NO:154)
LCYCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:155)
LCYCRRCFCVCV	(SEQ ID NO:156)
LCYCRRRFCVCF	(SEQ ID NO:157)
LCACRRRACVCV	(SEQ ID NO:158)
LCYCRXRFCVCV (X=D-Arg)	(SEQ ID NO:159)
LCWCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:160)
WCYCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:161)
LCYCRRRXCVCV (X=hPhe)	(SEQ ID NO:162)
LCYCRRRXCVCV (X=Phe(4-Cl))	(SEQ ID NO:163)
XCYCRRRFCVCV(X=Cha)	(SEQ ID NO:164)
LCYCRRRFCXCV (X=D-His)	(SEQ ID NO:165)
LCYCRRRXCVCV (X=MeGly)	(SEQ ID NO:166)
LCYCRRRXCVCV (X=MePhe)	(SEQ ID NO:167)
LCYCRRRFCXCV (X=MeVal)	(SEQ ID NO:168)
LCXCRRRXCVCV (X=Cha)	(SEQ ID NO:169)
LCGCRRRGCVCV	(SEQ ID NO:170)
LCACRGRACVCV	(SEQ ID NO:171)
RACYCRPRFCACV	(SEQ ID NO:172)
RLCYCRPRFCVCF	(SEQ ID NO.-173)
RLCYCRPRFCVCV	(SEQ ID NO:174)
KLCYCKPKFCVCV	(SEQ-ID NO:175)
RLCACRGRACVCV	(SEQ ID NO:176)
RLCYCRXRFCVCV (X=MeGly)	(SEQ ID NO:177)
RXCFCRPRFCVCV (X=Cha)	(SEQ ID NO:178)
RWCFCRPRFCVCV	(SEQ ID NO:179)

kód sekvence

WLCYCRRRFCVCV	(SEQ ID NO: 180)
WLCFCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:181)
FLCFCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:182)
WLCFCRRRXCVCV (X=MePhe)	(SEQ ID NO:183)
WYCYCRRRFCVCV	(SEQ ID NO:.184)
WXCYCRRRFCVCV (X=Cha)	(SEQ ID NO:185)
RXCFCRGRZCVCV (X=Cha) (Z=MePhe)	(SEQ ID NO:186)
XLCFCRRRZCVCV (X=Cha) (Z=MePhe)	(SEQ ID NO:187)
RLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:188)
WLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ ID NO:189)
WXCYCRRRFCVCVGR (X=Cha)	(SEQ ID NO:190)
RLCYCRGPFCVCR	(SEQ ID NO:191)
RRWCFVCYAGFCYRCR	(SEQ ID NO:192)
RRCYCRGRFCGCVGR	(SEQ ID NO:193)
RWRCYCGRRFCGCVGR	(SEQ ID NO:194)
RARCYCGRRFCGCVGR	(SEQ ID NO:195)
GWRCYCRGRFCGC	(SEQ ID NO:196)
RGWACYCRGRFCVC	(SEQ ID NO:197)
RRCYGRRRFGVCVGR	(SEQ ID NO:198)
RGWRLCYGRGRFKVC	(SEQ ID NO:199)
RGWRLCYCRGRFCVC	(SEQ ID NO:200)
CYCRRRFCVCF	(SEQ ID NO:201)
RGWRLCYCRXRFCVC (X=MeGly)	(SEQ ID NO:202)
RGWRGCYCRXRFCGC (X=MeGly)	(SEQ ID NO:203)
LCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:204)
LCYCKPKFCVCVGK	(SEQ ID NO:205)
LCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:206)
LCYCRPRFCVCVGRGR	(SEQ ID NO:207)
RRWCYCRPRFCVCVR	(SEQ ID N0:208)
WRLCYCRPRFCVCVGR	(SEQ ID NO:209)
GWLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:210)
RWLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:211)
RLLCYCRGRFCVCVGR	(SEQ ID NO:212)

kód sekvence

• «4		• a		··	44		44
44 ·	•	•	4	4 4	•	4	4	4
• ·	•	♦	•	• 4	•	•	«4
							4	4
• ·	•	•	4	4 4		4	4	4
444 ··		ee		44	44		«4

RWRLCYCRPRFCVCV	(SEQ	ID	NO:213)
RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha) (Z=MeGly)	(SEQ	ID	NO:214)
RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha)	(SEQ	ID	NO:215)
RGGRVCYCRGRFCVCV	(SEQ	ID	NO:216)
LCYCRXRFCVCV (X=D-Ala)	(SEQ	ID	NO:217)
LCYCKPKFCVCV	(SEQ	ID	NO:218)
VCYCRPRFCVCV	(SEQ	ID	NO:219)
LCYCRPRFCVCW	(SEQ	ID	NO:220)
LCYRRPRFRVCV	(SEQ	ID	NO:221)
RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha)	(SEQ	ID	NO:222)
RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha) (Z=MeGly)	(SEQ	ID	NO:223)
RXRLCYCRGRFCVCV (X=Cha)	(SEQ	ID	NO:224)
RGGGLCYARGWIAFCVGR	(SEQ	ID	NO:225)
RGGGLCYARGFIAVCFGR	(SEQ	ID	NO:226)
RGGGLCYARPRFAVCVGR	(SEQ	ID	NO:227)
RGGGLCYTRPRFTVCVGR	(SEQ	ID	NO:228)
RGGGLCYARKGFAVCVGR	(SEQ	ID	NO:229)
RGGRLCYARRRFAVCVGR	(SEQ	ID	NO:230)
RGGGLCYKRGFIKVCFGR	(SEQ	ID	NO:231)
RGGGLCYKRGWIKFCVGR	(SEQ	ID	NO:232)
RGGGLCYRLPKFRVCVGR	(SEQ	ID	NO:233)
RGGGLCYRLPGFRVCVGR	(SEQ	ID	NO:234)
RGWRGCYKRGRFKGCVGR	(SEQ	ID	NO:235)
LCYKRGRFKVCV	(SEQ	ID	NO:236)
ICYRPRFVCVGR	(SEQ	ID	NO:237)
WLCYCRRRFCVCV	(SEQ	ID	NO:238)
RLCYCRRRFCVCV	(SEQ	ID	NO:240)
RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR	(SEQ	ID	NO:241)
RRRLCYCRRRFCVCVGR	(SEQ	ID	NO:242)

φ φ φ φ φ · «« φ · ···· ···· φ · φ φ · · ···· • · φ · · · · β · · · ·· • · ♦ φ φ φ··· • · · · φφ·· ·· a jejich N-acetylované a/nebo C-amidované nebo esterifikované formy.

Příprava látek

Látky podle vynálezu, které se zde často označují jako protegriny, jsou v podstatě peptidové hlavní řetězce, které se mohou modifikovat na N- nebo C-konci a také mohou obsahovat jeden nebo dva disulfidové můstky. Peptidy se mohou nejdříve syntetizovat v necyklických fomách. Tyto peptidy se pak mohou přeměnit na cyklické peptidy, jestliže standardní způsob vyžaduje tvorbu disulfidového můstku. Termín cyklické formy zde znamená ty formy, které obsahují cyklické části na základě tvoření disulfidických můstků mezi aminokyselinovými zbytky, které jsou podobné cysteinu, v peptidů. Jestliže se preferují necyklické formy, je výhodné v případě peptidů podle vynálezu, které obsahují dva nebo více zbytků, které jsou podobné cysteinu, stabilizovat sulfohydrylové skupiny.

Standardní způsoby syntézy peptidů, ketré mají zde popsanou velikost, jsou známy v oboru. V současné době nejběžněji používané metody jsou syntéza pevné fáze; přičemž se používají přístroje pro systematickou konstrukci peptidových řetězců, což je výhodné při produkci ve velkém měřítku. Jestliže k syntéze dochází za použití standardních metod, mohou se použít aminokyseliny, které nejsou kódované genem, nebo D-enantioméry. Jeden velmi praktický způsob získání látek podle vynálezu je použití těchto standardních chemických syntetických metod.

Za účelem získání pepidového hlavního řetězce se může Nkonec a/nebo C-konec derivatizovat opět použitím běžných chemických metod. Látky podle vynálezu mohou obsahovat acylovou skupinu na aminokonci. Způsoby acetylace nebo obecněji acylace volné amino skupiny na N-konci jsou v oboru

obecně známy; navíc aminokyselina N-konce se může účastnit syntézy v acetylované formě.

Na C-konci může být samozřejmě přítomna karboxylová skupina ve formě soli; v případě farmaceutických kompozic to bude farmaceuticky přijatelná sůl. Mezi vhodné sole patří ty, které se tvoří s anorganickými ionty, jako jsou NH₄ ⁺, Na⁺, K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ a podobně, stejně jako sole tvořené organickými kationty, jako jsou ty vytvořené s kofeinem a s jinými vysoce substituovanými aminy. Avšak, jestliže látka vzorce (I) obsahuje řadu bazických zbytků, tvorba solí může být obtížná nebo nemožná. Karboxylový konec se může také esterifikovat použitím alkoholů vzorce ROH, kde R je hydrokarbyl, jak se definuje dříve v textu. Podobně C-konec se může amidovat tak, že má vzorec -CONH₂, -CONHR nebo -CONHR₂, kde každé R je nezávisle hydrokarbyl. Metody esterifikace a amidace stejně jako neutralizace za přítomnosti báze pro tvorbu solí jsou standardní organické chemické metody.

Jestliže peptidy podle vynálezu se připravily za fyziologických podmínek, pak aminoskupiny vedlejšího řetězce bazických aminokyselin jsou ve formě relevantních kyselích adičních solí.

Při syntéze lineárního peptidu s amidem na C-konci se peptidová sekvence běžně syntetizuje na Fmoc Rink amidové pevné pryskyřici (Bachem) za použití Fmoc chemie na automatizovaném peptidovém syntetizéru ABI 433 (ABD, Perkin Elmer, Foster City, CA) podle standardního protokolu doporučeného výrobcem. Štěpení probíhá ve směsi thioanizol/EDTA/TFA (v poměru 1/1/9) v objemu 10 ml po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Produkt štěpení se precipituje s t-butylmetyleterem, filtruje se a suší se.

Tvorba disulfidických můstků se provádí v přítomnosti slabě oxidačních činidel. Mohou se použít chemická oxidační činidla nebo se mohou látky jednoduše vystavit působení • ·

kyslíku ve vzduchu, čímž se ovlivní tyto můstky. V oboru jsou známy různé metody. Proces použittelný pro vznik disulfidické vazby je popsán v publikacích Tam, J.P etal., Synthesis (1979) 955-957; Stewart, J.M. et al., Solid Phase Peptid Synthesis, 2d Ed. Pierce Chemical Company Rockford, IL (1984); Ahmed A.K. et al., J. Biol Chem (1975) 250: 8477-8482 a Pennington M.W. et al., Peptides 1990, E. Giralt et al., ESCOM Leiden, The Netherlands (1991) 164-166. Další alternativy se popisují v publikaci Kamber, B. et al, Helv Chim Acta (1980) 63: 899-915. Způsob, který využívá pevné podpory, je popsán v publikaci Albericio, Int. J Pept Protein Res (1985) 26: 92-97.

Zvláště preferoavným způsobem je oxidace v roztoku za použití molekulového kyslíku. Tato metoda se používá při znovu zabalení syntetického PG-1, PG-3 v jeho amidové nebo kyselé formě, enantio PG-1 a dvou unidisulfidových látek (C₆Ci5 a C3-C13) . Získá se 65 až 90% látky.

Při použití této preferované metody za účelem tvorby disulfidových můstků se surový peptid rozpustí v DMSO a přidá se 20mM pufr acetát amonný pH7. Konečná koncentrace peptidů v roztoku je mezi 1 až 8 mg/ml, rozmezí pH je 7,0 až 7,2 a rozmezí koncentrace DMSO je 5 až 20%. Peptidový roztok se míchá přes noc při teplotě místnosti.

PH roztoku je upraveno koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 5 a vzorek se čistí na Prep LC. Po nanesení je kolona promyta 10% acetonitrilem ve vodě (0,1% TFA) až hodnota UV absorbance dosáhne základní linie. Pak je spuštěn gradient.

Kolona: Vydac Cat#218TP101522, 2,2x25 cm, peptidy a proteiny s 18 uhlíky; υνλ: 235 nm; rychlost vymývání: lOml/min.

Rozpouštědlo A je 100% 0,1% TFA/H₂O; Rozpouštědlo B je 100% 0,08% TFA/CAN. Gradient je následující.

T (min)	%B (lineární gradient)
0	10
10	18
80	32
95	95

Frakce se analyzuji analytickou HPLC a hromadí se ta, co obsahuje požadovaný peptid. výsledný vodný roztok se obsahující sulfidové vazby

Acetonitril je stripován a lyofilyzuje. Výsledný amid se potvrdil ve hmotnostním spektru.

Jestliže peptidový hlavní řetězec obsahuje celkově genem kódované aminokyseliny nebo jestliže některá jeho část je také setavena, peptid nebo jeho relevantní část se může také syntetizovat metodami rekombinace DNA. Samotná DNA kódující peptidy podle vynálezu se může syntetizovat za použití komerčně dostupného zařízení; volba kodónu se může začlenit do syntézy v závislosti na původu hostitele.

Rekombinantně produkované formy protegrinů mohou za účelem modifikace N- a/nebo C-konce a v závislsti na metodě izolace, za účelem tvoření disulfidových můstků, jak se popisuje dříve v textu, vyžadovat podstatnou derivatizaci. V závislosti na hostitelském organizmu, který se užívá při rekombinantní produkci, a v závislosti na zdroji zvířete, ze kterého se protein izoloval, se mohou ovlivnit některé nebo všechny tyto konverze.

Při rekombinantní produkci je DNA kódující protegriny podle vynálezu zahrnuta do expresního systému, kde jsou tyto kódující sekvence řízeny vhodným promotorem a jinými kontrolními · sekvencemi, které jsou kompatibilní s hostitelskou buňkou. Do vhodných typů hostitelských buněk spadá celý rozsah rostlin a zvířat. Tak se protegriny podle vynálezu mohou produkovat v bakteriích nebo v kvasinkách • toto toto • · · · · ·· · · to ·· • to · to to to to · toto to ·· ··· ·· toto · · · ·to ··· to to to to to toto ·· · ·· · · · · · ♦ toto (mohou se produkovat v netoxické nebo refraktilové formě nebo se využívají rezistentní kmeny), ve zvířecích buňkách, v hmyzích buňkách a v rostlinných buňkách. Modifikované rostlinné buňky se mohou využívat při regeneraci rostlin, které obsahují relevantní expresivní systémy tak, že výsledná transgenní rostlina je schopna se sama ochránit před infekčními činidly.

Protegriny podle vynálezu mohou vznikat ve formě, která bude výsledkem sekrece hostitelské buňky na základě fúze DNA kódující protegriny a DNA kódující vhodný signální peptid nebo může být produkována intracelulárně. Mohou také vznikat jako fúzní proteiny s aminokyselinovou sekvncí, která může nebo nemusí být odstraněna před použitím těchto látek proti bakteriím a virům.

Protegriny podle vynálezu se mohou produkovat v různých modalitách zahrnující chemickou syntézu a rekombinantní produkci nebo některé kombinace těchto metod.

Libovolní členi třídy protegrinů, kteří se vyskytují v přírodě se získávají v čištěných a/nebo izolovaných formách. Termín čištěná a/nebo izolovaná forma znamená formu zbavenou prostředí, ve kterém se peptid normálně vyskytuje (v případě takovým přirozeně se vyskytujících peptidů) a je to forma, která se může prakticky použít. Termín čištěná a/nebo izolovaná forma znamená, že peptid je v podstatě čistý, to je čistý z více jak 90%, upřednostňuje se čistota vyšší jak 95% a ještě výhodnější je čistota vyšší jak 99% a nebo v cela odlišném kontextu jde o čistotu farmaceutických přípravků.

Protilátky

Protilátky proti protegrinům podle vynálezu se mohou také produkovat použitím standardních imunologických metod vhodných pro produkci polyklonálního antiséra a jestliže je to nutné, používá se způsob imortalizace buněk imunizovaného

hostitele, které produkují monoklonální protilátky. V oboru jsou dobře známy způsoby produkce protilátek proti libovolné substanci. Může být nezbytné zvýšit imunogenicitu substance zvláště tam, kde materiálem je pouze krátký peptid, spojením haptenu s nosičem. Vhodnými nosiči pro tento účel jsou látky, které sami v savcích nevyvolávají imunní odezvu a aplikují se jako konjugát hapten-nosič. Mezi běžně užívané nosiče patří hemocyanin kuželnatky (KLH), toxoid difterie, sérumalbumin a virový obalový protein rotaviru VP6. Spojování haptenu s

nosičem	se provádí použitím standardní metody, jako je
kontakt	nosiče s peptidem za přítomnosti dehydratačního
činidla,	jako je dicyklohexylkarbodiimid nebo použitím
linkerů,	jako jsou ty dostupné u firmy Pierce Chemical
Company,	Chicago, IL.

Protegriny v imunogenní formě podle vynálezu jsou pak zavedeny injekcí do vhodného savčího hostitele a monitorují se titry protilátek. Je nutné poznamenat, že některé formy protegrinů než vyvolají tvorbu protilátek je nutné modifikovat, což způsobuje jejich rezistence vůči zpracování antigenu. Například nativní forma PG-1, která obsahuje dva sulfidové můstky není imunogenní v případě, že se aplikuje bez připojení k většímu nosiči je velmi málo imunogenní dokonce v přítomnosti silného adjuvans a když je spojena pomocí glutaraldehydu nebo k KLH. Věří se, že tato skutečnost je způsobena rezistencí k leukocytové serinové proteáze (lidská PMN elastáza a cathepsin G) stejně jako rezistencí k působení aspartové proteázy (pepsin), která je podobná několika makrofágovým kathepsinům. Chybějící imunogenecita může proto může vést od rezistence ke zpracování lineární formy, která může zapadat do antigenové kapsy na buňkách. Imunogenicita těchto forem protegrinů se může zvýšit štěpením disulfidových vazeb. Avšak imunogenicita se může zvýšit

použitím metody MAPS, která se popisuje v publikaci Huang, W et al., Mol Immunol (1994) 15: 1191-1199.

Polyklonální antiséra se mohou získávat, jestliže titry jsou dostatečně vysoké. V jiném případě se mohou získat a imortalizovat buňky hostitele produkující protilátky, jako jsou buňky sleziny nebo periférní krevní lymfocyty. Imortalizované buňkyse pak klonují jako jednotlivé kolonie a testuje se produkce požadovaných monoklonálních protilátek.

Při produkci protilátek je také možné použít metody rekombinace a tak protilátky podle vynálezu zahrnují ty protilátky, které se mohou připravovat genovým inženýrstvím. Standardními metodami se mohou tvořit například jednořetězcové formy, jako jsou formy F_vz chimérické protilátky a protilátky, které se modifikují tak, aby napodobovaly ty z určitých druhů, jako jsou lidské. Protilátky podle vynálezu se mohou připravovat izolací nebo modifikací genů kódujících požadované protilátky a a tyto geny se mohou exprimovat v rekombinantních hostitelských buňkách, jako jsou CHO buňky.

Protilátky podle vynálezu jsou samoyřejmě použitelné v imunotestech vhodných pro určeni množství nebo přítomnosti protegrinů. Takové testy jsou podstatné při kontrole kvality produkce kompozic, které obsahují protegriny podle vynálezu. Protilátky se mohou použít při odhadu účinnosti rekombinanntí produkce protegrinů, stejně jako pro testování přítomnosti genů, které kódují protegrin, v expresivních knihovnách.

Protilátky podle vynálezu jsou samozřejmě použitelné v imunotestech, které určují množství nebo přítomnost protegrinů. Takové testy jsou podstatné při kontrole kvality produkce protegrinů podle vynálezu. Navíc protilátky se mohou využívat k odhadu účinnosti rekombinantní produkce protegrinů, stejně jako při testování expresivních knihoven, zda jsou přítomny geny kódující protegriny.

Kompozice obsahující protegriny a metody použití

Protegriny podle vynálezu jsou účinné při inaktivaci velkého rozmezí mikrobiálních a virových cílů, které zahrnují gram-pozitivní a gram-negativní bakterie, kvasinky, protozoa a jisté kmeny virů. Vzhledem k jejich širokému spektru aktivit protegriny podle vynálezu se mohou použít jako konzerveční činidla, dále při léčbě nebo z profylaktických důvodů.

Působí bakteriocidně proti gram-pozitivním bakteriím, které zahrnují hlavní patogeny, jako je Staphylococcus aureus, zahrnujíc MRSA (verzi rezistentní na methicilin) a MSSA (verzi citlivou na methicilin) a Enterococcus faecium a E. faecalis (zahrnujíc VREF nebo E. faecalis rezistentní na vankomycin) a VSEF nebo E. faecalis citlivý na vankomycin). Z lékařského hlediska toto jsou velmi běžné patogeny. Jiné gram-pozitivní bakterie, které jsou také vhodnými cíly, zahrnují Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumonia (zahrnujíc formu rezistentní na penicilín), S. mitis, S. sanguis, Staphylococcus epidermis (zahrnujíc MSSE kmen citlivý na meticilin) , S. salivarius, Corynebacterium minutissium, C pseudodiphteriae, C. striatum, Corynebacterium skupiny G1 a G2 a Bacilus subtilis. PRSP je také světově rozšířená životu nebezpečná bakterie.

Mezi gram-negativní organizmy, proti kterým jsou protegriny účinné, patří Escherichia coli, Pseudomonas aeruginasa, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Acinetobacter calocoaceticus, C. pneumoniae a Neisseria meningitidus, a jiné shora popsané rody. Například Neisseria gonorrhoeae je spojená s pohlavně přenosnými nemocemi (STD), jako je Chlamydia trachomatis. Mezi gram-negativní organizmy jsou • · • · · · · ·· · ♦ · · · • · · · · · · · · 9 · » ♦ · ···· · * · • ·· ·· ·· ·· · · ·» také patogeny trávicího ústrojí Helicobacter pyroli, H. felis a Campylobacter jejuni.

Vedle gram-pozitivních a gram-negativních bakterií protegriny podle vynálezu také účinně působí na růst a infekci mykobakterií, jako jsou M. tuberculosis a M avium (zahrnujíc MAC); houby, jako je Candida albicans a příbuzné patogeny, C. parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis a C. glabrata, stejně jako Aspargillus niger. Mezi na protegriny citlivé viry patří Herpes simplex I a II a HIV.

Shora uvedený seznam organizmů není úplný, jde pouze o seznam reprezentantů.

Jak se uvádí shora v textu, protegriny se také používají jako dezinfekční činidla a jako konzervační činidla v případě materiálů, jako jsou potraviny, kosmetika, léky nebo jiné materiály, které obsahují nutrienty vhodné pro organizmy. V případě použití za těmito účely se protegriny aplikují buď jako jednotlivý protegrin, ve směsi více protegrinů nebo ve směsi s několika dalšími antimikrobiálními činidly. Jestliže se protegriny používají jako konzervační činidla, obvykle jsou přítomny v relativně nízkém množství, méně než 5% váhy celkové kompozice, upřednostňuje se méně než 1%, výhodněji méně než 0,1%.

Peptidy podle vynálezu se také používají jako standardy v antimikrobiálních testech a v testech při určení schopnosti testovací látky vázat endotoxiny, jako jsou lipopolysacharidy.

Jestliže se uvedené látky použijí proti mikrobům nebo virům při léčbě zvířat, protegriny podle vynálezu se mohou připravit ve formě léku nebo jako veterinářské kompozice. V závislosti na objektu, který se léčí, způsob požadované aplikace např. prevence, profylaxe, terapie; jsou protegriny připravovány způsoby v souladu s těmito parametry. Shrnutí takových metod přípravy je uvedeno v publikaci Remington's

Pharmaceutical Sciences, poslední vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Protegriny se mohou použít na zvířatech jak pro terapeutické tak i profylaktické účely. Termín léčba infekce znamená buď prevenci před nákazou nebo utlumení symptomů, inhibici růstu mikrobů v léčeném objektu a jiné negativné působení na mikroba, což je přínosem pro léčený subjekt. Takové léčení nebo léčba má profylaktické a terapeutické aspekty.

Protegriny jsou zvláště vhodné jako aktivní látky do farmaceutických kompozic, které jsou použitelné při léčbě pohlavně přenosných nemocí, mezi něž patří ty, které způsobují Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Herpes simplex typ 2 a HIV. Preferují se povrchové formulace, které zahrnují krémy, masti, oleje, pudry, gely a podobně. Vhodné povrchové ekcipienty jsou v oboru dobře známy a mohou se přispůsobit pro určité použití.

Při profylaxi nebo léčbě STD se mohou protegriny podle vynálezu použít samotné nebo v kombinaci s jinými antibiotiky, jako jsou erytromycín, tetracyklín, makrolidy např. azitromycín a cefalosporiny. V závislosti na způsobu aplikace se protegriny připravují ve formě vhodných kompozic, což umožňuje zavedení do oblasti působení.

Protegriny se mohou použít ve formách, obsahujících jeden nebo dva sulfidové můstky a nebo mohou být v lineární formě. Použití forem enantiomérů, které obsahují všechny Daminokyseliny, přináší výhody, jako je rezistence na proteázy např. trypsin a chymotrypsin, na které jsou protegriny obsahujcící L-aminokyseliny méně rezistentní.

Protegriny podle vynálezu se mohou aplikovat samostatně nebo ve směsích několika protegrinů nebo v kombinaci s jinými faramceuticky aktivnímy komponenty. Formulace se mohou ·· ·· • · · · · • · ·· • · ··· · · · · ···· ·

4·· · · · · ·*· ··· ·· ·· ·· 4* připravovat způsobem vhodným pro systémovou aplikaci nebo povrchovou nebo lokální aplikaci. Systémové formulace zahrnují ty, které se mohou použít jako injekce (např. intramuskulární, intravenózní, intraperitonální nebo podkožní) nebo se mohou připravovat pro transdermální, transmokozální nebo orální aplikaci. Formulace bude obecně zahrnovat ředidlo, v některých případech adjuvans, pufry, konzervační činidla a podobně. Protegriny se mohou také aplikovat v kompozicích s lipozómy nebo jako mikroemulze.

Jestliže se aplikace provede orálně, protegriny podle vynálezu by se měly chránit proti degradaci v trávicím ústrojí použitím vhodných potahů. Tomuto působení se může částečně předejít použitím aminokyselin v D-konfiguraci, které vykazují rezistenci na proteázy. Protegriny jsou relativně stabilní vůči kyselému prostředí, ale vyžaduje se určitý stupeň potažení.

Protegriny podle vynálezu si udržují svou antimikrobiální aktivitu i v borátových roztocích, které se běžně používají v produktech vhodných pro ošetření očí. Také se zjistilo, že když se testovala antimikrobiální aktivita proti E. coli v přítomnosti a při absenci lysozymu ve fyziologickém roztoku pufrovaném boráty, že přítomnost lysozymu zvyšuje účinnost PG-3. Tento účinek se zesílil, jestliže PG-3 se autoklávoval a podobný patern se získal pro formu bez kyselin a v případě amidu. Protegriny se mohou v podstatě v takových kompozicích používat jako konzervační činidla nebo jako antibakteriální přípravek pro léčbu očních infekcí, jako jsou konjuktivitidy a vředy na rohovce.

Je zvláště důležité, že protegriny si uchovávají svou aktivitu za fyziologických podmínek, což znamená relativně vysoký obsah solí a přítomnost séra. Protegriny jsou navíc daleko méně cytotoxické vůči buňkám vyšších organizmů ve srovnání s toxicitou vůči mikrobům. Tyto vlastnosti popsané • · · · · · · · « · · · *·· ···· ···· • · · · · ·· · · ···· · • · · · · · · 9 9 9 •99 99 99 99 99 99 dále v příkladech jim umožňují použití in vivo a terapeutické použití.

Jak ukazují příklady, u vhodně vybraného člena třídy protegrinů podle vynálezu lze uzpůsobit antimikrobiální aktivitu a tak dosáhnout maximální účinnost s ohledem na určitý cílový mikrob· Termín mikrob nezahrnuje pouze kvasinky, bakterie a jiné jednobuněčné organizmy, ale také viry. Například PC-19 je za určitých podmínek zvláště účinný ve srovnání s PG-1. Určitý protegrin se také může s výhodou použít za určitých podmínek, jako je nízký obsah solí nebo fyziologický obsah solí, přítomnost lidského séra nebo podmínek, které napodobují podmínky v krvi a v tkáňových roztocích.

Protegriny podle vynálezu se mohou také aplikovat na rostliny nebo do prostředí, ve kterém rostou, za účelem prevence virových a bakteriálních onemocněni rostlin. Vhodné kompozice pro tyto účely typicky obsahují ředidlo, rozprašovací činidlo nebo jiné činidla, která jsou pro rostliny nebo prostředí, ve kterém rostou, výhodná.

Protegriny podle vynálezu se tak mohou použít tam, kde se vyžaduje jejich antimikrobiální a/nebo antivirový účinek. Mohou se použít zcela in vitro a nebo se peptidy mohou zavést do organizmů.

Navíc antimikrobiální nebo antivirové aktivity se mohou generovat in sítu aplikací expresivního systému vhodného pro produkci protegrinů podle vynálezu. Takové expresivni systémy se mohou aplikovat na rostliny a zvířata za použití známých metod. Například u zvířat se mohou využívat expresivni vektory založené na neštovicích při tvorbě peptidů in šitu. Podobně rostlinné buňky se mohou transformovat expresivními vektory a pak se regeneruje celá rostlina, která je schopna sama produkovat peptidy.

99 99 99

9 9 9 9 9 9

99 9 9 99

9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 99

Protegriny jsou schopny ve standardních testech inaktivovat endotoxiny získané z gram-negativnich bakterií, jako jsou lipopolysacharidy (LPS) . Protegriny se mohou v podstatě používat za jakýchkoliv okolností, kde se vyžaduj deaktivace LPS. Jedna taková situace je při léčbě nebo zmírnění gram-negativnich sepsí.

Podmínky relevantní pro antimikrobiální/antivirovou aktivitu.

Jak je shora uvedeno termín antimikrobiální aktivita znamená inhibici s ohledem na tradiční mikroorganizmy a viry, ačkoli termíny antimikrobiální a antivirový jsou oba specificky označeny.

Zvláště použitelnou vlastností protegrinů je jejich aktivita v přítomnosti séra. Podobně jako defenziny, protegriny jsou schopny uplatnit své antimikrobiální účinky v přítomnosti séra.

Pro testování antimikrobiální aktivity se mohou připravit média, která napodobuji jisté specifické podmínky. Standardní pufrované médium, označené jako médium A, používá se s přelitým agarem a má následující složení: 0,3 mg/ml prášku tryptikázové sojové pudy, 1% (m/v) agarózy a 10 mM pufr fosforečnanu sodného (konečné pH je 7,4). Tato směs se označuje buď jako médium A nebo jako standardní in vitro podmínky.

Všechny ostatní média obsahují stejné komponenty. Navíc však:

Druhé médium obsahuje 100 mM NaCl za účelem napodobovat koncentrace solí v krvi a tkáňových roztocích. Toto médium bude označené jako médium B nebo slané médium.

Třetí médium je doplněno 2,5% normálním lidským sérem; avšak má nízkou iontovou sílu a tak nenahrazuje tělní tekutiny. Toto médium se označuje jako médium C nebo médium obsahující sérum.

·· ·· ·· ·♦ • · · · · · · · · • · · · · · ··· • · · ♦ · · · ··· · · • ···«* · · · ·· ·· ·· ··

Čtvrté médium obsahuje 80% RPMI-1640, jde o standardní médium tkáňových kultur, které obsahuje základní ionty a aminokyseliny, které se nachází v krvi a v tělních tekutinách. Navíc obsahuje 2,5% normální lidské sérum. Toto médium se označilo jako médium D nebo fyziologické médium.

Jiná média použitelná při testování antimikrobiálních vlastností se popisují v příkladech.

Specifická označení

Zjistilo se, že jisté protegriny podle vynálezu jsou částečně účinné při léčbě jistých indikací. Například při léčbě mikrobiálních infekcí, kde infekční agents je Staphylococcus aureus, zvláště kmen s rezistencí na meticilín, jsou amidy vzorců:

RGWRLCYCRPRFCVCVGR GWRLCYCRPRFCVCVGR XCYCRRRFCVCVGR (X » Cha) WLCYCRRRFCVCV

(SEQ ID NO:139) (SEQ ID NO:141) (SEQ ID NO:164) (SEQ ID NO:180)

zvláště účinné. Preferuje se také forma volných kyselin WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:180).

Při léčbě infekcí způsobených bakteriemi Pseudomonas původci zjistily, že následující amidy jsou účinné:

RGGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:1)

RGGRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:239)

RGGGLCYTRPRFTVCVGR (SEQ ID NO:228)

Efektivní je také forma volné kyseliny peptidu RLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:66).

Při léčbě infekcí způsobených bakteriemi H. pylori se zjistilo, že následující sloučeniny ve formě amidů jsou částečně účinné:

• ·· ·· · · ·· ·· ·· · · · ♦ · · · · · · • · · · · 99 · ··· • · ♦·· ♦ · ·· ··· · · • · · · · 9 9 9 99

999 99 99 99 9999

WLCYCRRRFCVCV RXCFCRPRFCVCV (X=Cha) RGGRLCYCRRRFCVCVGR RGWGLCYCRPRFCVCVGR RLCYCRPRFCVCVGR RGWRLCYCRGRFCVCVGR RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR

RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha) GWRLCYCRPRFCVCVGR RLCYCRRRFCVCV WLCYCXXXFCVCV (X=Dab) OWRLCYCRPKFCVCV RWOLCYCRPKFCVCV RRCYCRRRFCVCVGR XCYCRRRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

NO:180)

NO:178)

NO:1)

NO:134)

NO:138)

NO:136)

NO:241)

NO:149)

NO:139)

NO:66)

NO:29)

NO:33)

NO:37)

NO:82)

NO :.164)

Účinné jsou také enantiomérové (všechny D-) formy formy volných kyselin peptidů RRRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO: 240).

Účinné dávky

Peptidy podle vynálezu nebo jejich kompozice se obecně používaly v množství, které je účinné pro dosažení danného účelu. Samozřejmě je jasné, že použité množství závisí na určité aplikaci.

Jestliže se uvedené peptidy používají jako dezinfekce nebo konzervační činidlo, pak antimikrobiálně účinné množství peptidů nebo jeho kompozice se aplikuje nebo se přidá k materiálu, který se dezinfikuje nebo je chráněn. Antimikrobiálně účinné množství je množství peptidů nebo kompozice, které inhibuje růst nebo usmrcuje populaci mikrobu. Zatímco aktuální antimikrobiálně účinné množství závisí na určité aplikaci, při použití peptidů nebo jeho kompozice jako dezinfekční nebo konzervační činidlo se tyto látky obvykle přidají k nebo se aplikují na materiál, který se má dezinfikovat nebo konzervovat v relativně malém množství. Je typické, že peptid obsahuje méně než 5% váhy dezinfekčního roztoku nebo chráněného materiálu, s výhodou obsahuje méně než 1% váhy a preferuje se méně než okolo 0,1% váhy. Odborník je schopen určit antimikrobiálně účinné ···· ♦ · · · ···· • · · · · ·· ···· ♦ · · · · ·· · · 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 99 množství určitého peptidu pro určité použití bez nutnosti provedení experimentů za použití například in vitro testu, které se popisuje v příkladech.

Při použití k léčbě nebo prevenci mikrobiálních infekcí nebo onemocnění se peptidy nebo jejich kompozice aplikují v terapeuticky účinném množství. Terapeuticky účinné množství je množství, které účinně tlumí symptomy, léčí nebo zabraňuje mikrobiálním infekcím nebo onemocnění. Pro odborníka je stanovení terapeuticky účinného množství jednoduché.

V případě, že se peptidy použijí jako dezinfekční nebo konzervační činidlo pro povrchovou aplikaci při léčbě nebo prevenci bakteriálních, kvasinkových, plísňových nebo jiných infekcí, se terapeuticky účinná dávka stanoví například v in vitro testech, které se popisují v příkladech. Léčba se zavádí v případech, kdy infekce je zřejmá nebo dokonce v případech, kdy infekce není patrná. Odborník je schopen určit terapeuticky účinné množství pro léčbu povrchových infekcí bez experimentů.

Při systémové aplikaci terapeuticky účinná dávka se může odhadnout z in vitro testů. Například dávka se může určit ve zvířecích modelech za účelem dosažení rozmezí koncentrace cirkulujícího peptidu, které zahrnuje IC₅₀ určené v buněčné kultuře (to je koncentrace testované látky, která je smrtelná pro 50% buněčné kultury), MIC určené v buněčné kultuře (to je minimální inhibiční koncentrace růstu) nebo ICioo určené v buněčné kultuře (to je koncentrace peptidu, která je smrtelná pro 100% buněčné kultury). Takové informace se mohou použít k upřesnění stanovení dávky vhodné pro aplikaci lidem.

Počáteční dávky se mohou také odhadnout z dat získaných in vivo, např. zvířecí modely, použité metody jsou dobře známy v oboru. Odborník může snadno optimalizovat dávku pro lidi na základě dat získaných na zvířatech.

Dávka a interval se může stanovit jednotlivě tak, aby se dosáhlo koncentrace aktivního peptidů, jako je v plazmě, která je dostatečná pro udržení terapeutického účinku. Obvykle dávka vhodná pro aplikaci injekcí kolísá od 0,1 do 5 mg/kg/den, s výhodou se pohybuje v rozmezí 0,5 až 1 mg/kg/den. Terapeuticky účinné koncentrace séra se dosáhne aplikací více dávek každý den.

V případě lokální aplikace nebo selektivního pohlcení nemůže být účinná lokální koncentrace peptidů spojena s koncentrací plazmy. Odborník je schopný optimalizovat terapeuticky účinné lokální dávky bez provedení experimentů.

Množství aplikovaného peptidů samozřejmě závisí na léčeném subjektu, na hmotnosti subjektu, na vážnosti onemocnění, na způsobu aplikace a úsudku lékaře.

Antimikrobiální terapie se může nesouvisle opakovat, zatímco infekce jsou detekovatelné nebo dokonce v případě, že nejso zřejmé. Léčba probíhá pouze s uvedenými látkami nebo v kombinaci s jinými léky, jako jsou například antibiotika nebo jiné antimikrobiální peptidy.

Toxicita

Upřednostňuje se terapeuticky účinná dávka zde popsaných peptidů, která bude mít terapeutický účinek, aniž způsobí podstatnou toxicitu.

Toxicita zde popsaných peptidů se stanovila v buněčných kulturách standardními farmaceutickými postupy nebo experimenty na zvířatech, např. stanovením LD₅₀ (dávka smrtelná pro 50% populace) nebo LDioo (dávka smrtelná pro 100% populace). Dávkový poměr mezi toxickým a terapeutickým účinkem je terapeutický index. Preferují se látky, které vykazují vysoké terapeutické indexy. Data získaná z uvedených testů na buněčných kulturách a na zvířatech se používají při stanovení rozmezí dávky, které není toxické pro lidi. Dávka ·· • · • · • · ·· ·· ·· • « ···· · v e · · · · · · · • · · · · ♦ · · ·· · • « · · · · · ·· ·· ·· ·· zde popsaných peptidů leží přednostně v rozmezí cirkulující koncentrace, která zahrnuje účinnou dávku s malou toxicitou nebo dávku, která není toxická. Dávka může kolísat v tomto rozmezí v závislosti na použité dávkové formě a použitém

Lékař vybírá skutečnou formulaci, způsob podmínkách pacienta (např. Pharmacological Basis of aplikace.

a dávku v závislosti na způsobu aplikace Fingl et al., 1975, In: The Therapeutics, Ch.l, p.l).

Souhrn

Protegriny proto výlučně reprezentují třídu použitelných na základě následujících vlastností:

Mají antimikrobiální účinek s ohledem na spektrum cílových mikrobiálníc zahrnují viry, retroviry, bakterie, protozoa.

Jejich antimikrobiální aktivita fyziologických fyziologickém

Jsou znatelně látek

1) široké systémů, houby, kvasinky a které ve srovnání s je účinná znamená při to ve séra.

podmínkách, roztoku a v přítomnosti méně toxické k buňkám vyšších organizmů mikroby.

Mohou se připravovat v neimunogenních formách a tak se rozšiřuje množství živočišných druhů, kterým je možné je aplikovat.

Mohou se připravovat ve rezistentní na jisté proteázy, antimikrobiální účinky dokonce

Jejich aminokyselinová sekvence čímž se optimalizuje organi.zmus.

Může se modifikovat specifita formách, které jsou což naznačuje, že máji lysozymu.

se může modifikovat, s ohledem na cílový akomodaci podmínek, jejich struktura vzhledem k při kterých vykazují svou antimikrobiální aktivitu.

7) ·* ·· • · · · • · ·· • · ·· ·· · · · ·· · • · * · ··· • · ··· · · · · • · · · ·· · ··· ·β ···· ··· · · • · ·

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 zobrazuje nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci genomové DNA, která kóduje prekurzor proteinu antimukrobiálnich látek PG-1, PG3 a PG-5.

Obrázek č. 2 ukazuje organizaci genomové DNA protegrinů.

Obrázky č. 3a až 3c znázorňují antimikrobiální aktivitu synteticky připraveného PG-5 ve srovnání se synteticky připraveným PG-1.

Obrázek č. 4 je grafické znázornění účinku přenosu bakterií do média, které obsahuje antibiotikum, na vývoj rezistence u bakterií Staphylococcus aureus (MRSA) a Pseudomonas aeruginosa s rezistencí na methicilin.

Obrázek č. 5 znázorňuje sekvence protwegrínů PG-1 až PGObrázek č. 6 znázorňuje sekundární peptidovou strukturu β-listu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Izolace a aktivita PG-1, PG-2 a PG-3

Jak se popisuje v PCT/US94/08305 z prasečích leukocytů se izolují tři antimikrobiální peptidy, které mají aminokyselinové sekvence:

PG-1: rggrlcycrrrfcvcvgr

PG-2: RGGRLCYCRRRFCICV

PG-3: RGGGLCYCRRRFCVCVGR, které jsou amidovány na C-konci.

U těchto určitých protegrinů se testovala antimikrobiální aktivita.

⁵⁹

Zjistilo se, že PG-1 a PG-3 jsou účinnější proti E.coli ML-35P ve srovnání s lidským neutrofilním peptidem HNP-1 a pouze trochu méně účinné než králičí defenzin NP-1. PG-1 a PG-3 jsou také účinné proti Listeria monocytogenes kmen EGD a proti Candida albicans. Obecně lze říct, že tyto peptidy jsou přibližně stejně účinné jako králičí defenzin NP-1 na základě váhy a účinnější než HNP-1. Ve všech případech PG-2 byl také účinný na tři testované organizmy, ale nebyl tak aktivní jako druhé dva peptidy.

Zistilo se, že PG-1 přímo inhibuje růst Staphylococcus aureus a K. pneumoneae 270. HNP-1, který se používal jako kontrola, byl méně účinný v případě Staphylococcus aureus a skoro zcela neúčinný v případě K. pneumoneae.

Protegriny se také testovaly proti různým organizmům a vykazují široké spektrum aktivity. Navíc vedle jejich účinku při inhibici růstu nebo infekci organizmů spojených s STD vykazují silnou aktivitu proti následujícím organizmům Pseudomonas aeruginasa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Histoplasma capsulatum, Myobacterium avium-intracellulare a Mycobacterium tuberculosis. Protegriny vykazují pouze nízkou aktivitu proti Vibrio vulnificus a nejsou aktivní proti Vibrio cholerae a Borrelia burgdorferi.

Shora popsané tři protegriny si uchovávají svou aktivitu v kontextu s různými reakčními podmínkami, které zahrnují přítomnost 100 mM NaCl a přítomnost 90% fetálního telecího séra.

Protegriny mají spektrum retence antimikrobiálních vlastností při fyziologických podmínkách, které zahrnují izotonické a borátové roztoky, které jsou vhodné pro použití v produktech pro ošetření očí.

PG-1 a PG-3 udržují svou aktivitu s ohledem na C. albicans a E. coli v přítomnosti 100 mM NaCl. Ani NP-1 ani • ·· · · · · · · ·· • · · · · ·· · · · · · • · · ···· ···· • · · · · ·· · · ···· · • · · ···· ··· • · · · · ·· · · ·· · ·

HNP-1 nemá tuto vlastnost. Ačkoli NP-1 a HNP-2 ztrácí svou schopnost inhibovat C. albicans v 90% fetálním telecím séru, PG-3 si udržel své inhibiční schopnosti.

Jestliže se mění reakční podmínky protegriny vykazují kolísavé paterny aktivity. Syntetický PG-1 se testoval v přítomnosti E. coli ML-35 (citlivý na sérum) v přelitém gelu, který obsahoval pouze 10 mM pufr fosforečnanu sodného pH 7,4 a triptikázovou sojovou půdu v ředění 1:100, v přítomnosti a za nepřítomnosti 2,5% normálního lidského séra. Uvedená koncentrace leží pod lytickou koncentrací, při které dochází k lyži tohoto kmene. Jestliže sérum bylo přítomno, normální bakteriocidní koncentrace se redukovala z přibližné hodnoty 1,0 μς/ιηΐ na přibližnou hodnotu 0,1 μg/ml. Tento typ účinku se nepozoroval ani u lineárního fragmentu katepsinu G ani u defenzin HNP-1.

Podobně v případě, že se použil jako cílový organizmus C. albicans, se připravily přelité půdy s lOmM fosforečnanem sodným a s nebo bez 10% normálního lidského séra. Minimální fungicidní koncentrace spadla s hodnoty okolo 1,3 μg/ml v nepřítomnosti séra na hodnoru 0,14 μς/ιηΐ za přítomnosti séra. Samotné sérum v této koncentraci nemá žádný účinek na C. albicans. Podobné výsledky se získaly při použití L. monocytogenes jako cílového organizmu.

Protegriny PG-1 a PG-3 se inkubovaly 4 hodiny při pH 2,0 s pepsinem o koncentraci 0,5 μg/ml a pak se neutralizovaly. Odhadla se zbytková antimikrobiálni aktivita proti na C. albicans, E. coli a L. monocytogenes a zjistilo se , že je plně zachována.Podobné experimenty ukazují, .že tyto látky nejsou degradovány lidskou leukocytovou elastázou nebo lidským leukocytovým katepsinem G, dokonce když jsou vystaveny vysokým koncentracím těchto enzymů a při pH 7,0 až 8,0, což je pH optimální pro proteulytickou aktivitu.

··· · · · · · · ·· · • « « · ··· · ··· • · · 9 · ·· · · · · · · · ··· · · · · · · · ····· ·· · · ·· ··

Syntetický amid PG-3 a syntetická kyselina PG-3 se atoklávovaly a testovala se jejich antimikrobiálni aktivita proti E.coli, L. monocytogenes a C. albicans. Zmíněné formy si uchovaly plnou antimikrobiálni aktivitu ve všech případech. Je možné, že stabilita těchto látek vůči proteázové degradaci a vůči autoklávování je zesílena přítomností disulfidových můstků.

Dále se testovala schopnost protegrinů vázat lipidové polysacharidy (LPS) gram-negativních bakterií E.coli kmen 0.55B5.

Syntetické i nativní PG-1, PG-2 a PG-3 amidované a neamidované formy jsou schopny vázat LPS při koncentraci 2,5 pg/ml. nPG-1 a nPG-2 jsou účinné I při nižších koncentracích. Protegriny byly podstatně účinější ve srovnání s NP nebp HNP látkami; nejúčinnější mezi těmito kontrolami byl NP-3a, což je peptid, jehož primární sekvence je nejblíže sekvenci protegrinů.

Inhibici gelatinizace se může předejít zvýšením koncentrace LPS, protože interakce s LPS je odpovědná za to, že ke gelatinizaci nedochází, spíše než interference s enzymovou kaskádou gelatinizace.

nPG-1 a nPG-3 se přeměnily na lineární formu za použití redukčního činidla, které přeměnilo disulfidové spojení na sulfyhydrylové skupiny, které se pak stabilizovaly alkylací s jodoacetamidem.

Linearizované formy protegrinů jsou v inhibici gelatinizace v endotoxinovém testu a ve shopnosti vázat endotoxin ekvivalentní cyklickým formám.

Linearizované a cyklické formy testovaných protegrinů vykazují antimikrobiálni aktivitu, ačkoli účinnost antimikrobiálního působení těchto peptidů závisí na podstatě cílpvého organizmu a na testovacích podmínkách.

• ·

Antimikrobiálni aktivita cyklických a linearizovaných forem PG-1 a PG-3 v koncentračním rozmezí 20 μ9/πι1 až 125 μg/ml s ohledem na kmen E.coli ML-35P se měřila za přítomnosti nebo bez 100 mM NaCl. Lineární forma byla trochu účinnější ve srovnání s cyklickou formou v přítomnosti samotného pufru; na druhé straně cyklická forma byla účinnější ve srovnání s lineární formou za izotonických podmínek.

V případě L. monocytogenes obě formy protegrinů, jak cyklická tak linearizovaná, vykazují silnou antimikrobiálni aktivitu v nepřítomnosti solí a obě formy byly prakticky stejně účinné v testovaném rozmezí koncentrací (20 gg/ml až 125 μg/ml) . Cyklická forma si v přítomnosti 100 mM NaCl si udržela v závislosti na slabě vyšší koncentraci silnou antimikrobiálni aktivitu. Linearizace se projevila nižší aktivitou, ačkoli vysoké koncentrace stále vykazují antimikrobiálni účinek.

Všechny formy těchto protegrinů přítomnosti samotného v případě C. albicans v v danném koncentračním fosfátového pufru závislosti rozmezí, jsou účinné na způsobu dávkování linearizované ačkoli účinnost.

Zatímco peptidy udržuj i stejnou cyklické formy úroveň antimikrobiálního vykázaly nižší ve 100 mM NaCl přibližně linearizovaných forem se značně účinku, aktivita snížila tak, že při koncentraci protegrinů pod 100 μg/ml žádný antimikrobiálni účinek.

Při koncentracích nad 130 μg/ml nebyl prakticky zjevný se pozoroval pozměněný antibakteriální účinek.

V závislosti na cílovém organizmu a používaných podmínkách obě formy, jak cyklická tak linearizovaná, PG-1 a PG-3 mají antimikrobiálni aktivitu.

• ·

Roztoky pro kontaktní čočky se typicky připravují z fyziologického roztoku pufrovaného borátem a mohou obsahovat EDTA. Protegriny ve formě syntetického PG-3 amidu a syntetické PG kyseliny se testovaly za podmínek, kdy přelité gely obsahovaly 25 mM boratového pufru pH 7,4, 1% (o/o) tryptokázové sojové půdy (0,3 μg/ml TBS prášku) a 1% agarózy. Navíc zahrnuje buď 100 mM NaCl, 1 mM EDTA nebo jejich kombinaci. Jiné testované látky, které se používaly jako kontroly, jsou defenzin NP-1 a lysozym. Stanovila se křivka odpovědí na dávku.

Ačkoli tyto protegriny vykazují nižší aktivitu v 25 mM fyziologickém roztoku pufrovaném borátem ve srovnání s 25 mM fosfátovým pufrem, antimikrobiální aktivita se zvýší přidáním fyziologického roztoku a lmM EDTA.

Testy provedené na L. monocytogenes a C. albicans indikují, že protegriny jsou schopny uplatnit své antimikrobiální účinky za podmínek, které jsou vhodné pro produkty pro ošetření očí.

Příklad 2: Získání klonů cDNA

Jak se popisuje v WO 95/03325, cDNA kódující PG-1, PG-2, PG-3 a PG-4 se připravily z prasečích leukocytů a sekvence DNA kódující tyto protegriny jsou uvedeny na obrázku č. 7 publikované přihlášky.

Příklad 3: Získání genomové DNA kódující PG-1, PG-3 a PG-5

Pomocí kitu QIAGEN blood DNA (QIAGEN, Chatsworth, CA) se izolovala z bílých krvinek vepřů genomové DNA o vysoké molekulové váze. Při amplifikaci protegrinových genů (PG) se používá PCR, kde jako templát slouží genomová DNA.

Sense primer se sekvencí 5'-GTCGGAATTCATGGAGACCCAGAG(A nebo G)GCCAG-3' odpovídá 5'oblastem PG cDNA příkladu 2 a poskytuje restrikční místo EcoRI. Antisense primer se • · to ·· · • to toto to • · ·· · · ·· · · · ♦ · ··to· • · to • toto sekvencí 5'-GTCGTCTAGA(C nebo G)GTTTCACAAGAATTTATTT-3' je komplementární s 3'konci PG cDNA a bezprostředně předchází póly(A) ocasu a poskytuje restrikční místo Xbal. Reakce proběhlav celkovém objemu 50 μΐ, kde je obsaženo 200 ng čištěné prasečí genomové DNA, 25 pmolů každého primeru, 1 μg mM dNTP, 5 μg lOx koncentrovaného PCR pufru (200 mM TrisHC1, 100 mM (NH₄)₂, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, 0,1% BSA) a 2,5 j ednotky

Proběhlo 30

Pfu DNA polymerázy (Stratagen, cyklů, každý zhrnoval 1 min min pro navázání primerů při

La Jolla, CA) .

denaturace při

55°C, 2 teplotě extenze enzymy teplotě 94°C, min extenze primerů při teplotě 72°C a konečný krok při teplotě 72°C pod obu 10 min.

Amplifikovaný produkt PCR štěpený restrikčními

EcoRI a Xbal, se izoloval z agarózového gelu, čistil se a ligoval se do vektoru pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) , který se štěpil restrikčními enzymy EcoRI a Xbal a pak se izoloval.

za použití Biochemical, pBluescript na PG

Oba řetězce DNA se sekvenovaly dideoxy metodou kitu Sequenase verze 2.0 (United States Cleveland, OH) , univerzálních primerů pro specifických oligomérových primerů založených genomových a cDNA sekvencích. Počítačová analýza sekvencí DNA se uskutečnila za použití programu PG-Gen (Intelligenetics, Palo Alto, CA).

Hybridizací s oligonukleotidovou sondou specifickou pro protegriny, která je komplementární s úsekem nt. 403-429 protegrinových cDNA sekvencí, se potvrdilo, že produkt PCR o velikosti 1,85 kb je odvozený od protegrinů. Produkt PCR se pak subklónoval do vektoru pBluescript a izolovala se a sekvenovala se DNA rekombinantních plazmidů. se genové sekvence třech různých 5. Nukleotidové sekvence a

Identifikovaly protegrinů PG-1, PG-3 a PGdedukované aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obrázku

č. 1.

Srovnáním protegrinové cDNA a genů protegrinů naznačuji, že kódující oblasti protegrinových genů obsahují čtyři exony a jsou přerušeny třemi introny (obrázek č. 2) . První exon obsahuje 5'nekódující oblast a kodony prvních 66 aminokyselin protegrinového prepropeptidu, zahrnuje 29 zbytků signálního peptidu a prvních 37 zbytků katelinu. Exony I a II jsou relativně malé, velikost je 108 a 72 bp, a dohromady obsahují dalších 60 zbytků katelinu. Exon IV obsahuje dva katelinové zbytky a pak násaledují protegrinové sekvence. Sekvence místa sestřihu exonu a intronu jsou uvedeny v tabulce č. 1 a odpovídají umluveným pravidlům: všechny intorny končí dvojicí AG, pak následuje protažení 8 až 12 baží bohatých na T/C, zatímco všechny introny začínají na GT a po nich následuje sekvence, kde převažují A/G A/G G.

Tabulka č. 1

Struktura exon-intron genu PG-1

exon	velikost	5'sestřih donoru	intron	velikost	3' sestřih akceptoru
1	?+198	AAGGCCgtgagtcg	1	405	ttgaccagGACGAG
2	108	AACGGGgtgaggct	2	152	ccttccagCGGGTG
3	72	AATGAgtgagtgg	3	596	ggtcacagGTTCAA
4	313

Vysoce konzervativní katelinová oblast exonů I až IV a exonu IV obsahuje úplnou sekvenci hotového protegrinového peptidu následovaného amidační sekvencí a 3' nepřekládanou oblastí a putativním polyadenylačním místem. Oblast tří intronů . má rozsah 152 až 596 bp. Zjistilo se, že, jestliže protegrinové geny reprezentují geny podobné katelinovým genům, pak třetí intron peptidů spojených s katelinem odděluje oba poslední zbytky vysoce konzervativní oblasti katelinu od variabilních antimikrobiálních peptidů kódovaných v exonu IV. To je vhodný rekombinantní mechanizmus zahrnující asociaci diverzního exonu IV s prvními třemi exony, které specifikují katelin obsahující prepro-oblasti.

Rodina přirozeně se vyskytujících protegrinů pak obsahuje nejméně 5 členů. Obrázek č. 5 znázorňuje srovnání aminokyselinových sekvencí pěti protegrinů, které se nacházejí v prasečích leukocytech. Existuje úplná homologie v pozicích 1 až 3, 5 až 9, 13 a 15 až 16.

Srovnání protegrinových genů s EMBL/GenBank identifikoval nepodstatně homologní geny. Struktura genů a nukleotidové sekvence protegrinů jsou velmi odlišné od sekvencí defenzinú, které obsahují tři exony v genech myelodních defenzinú a dva exony v genech enterických defenzinú. Jak se očekávalo srovnání odhalilo velkou rodinu cDNA odpovídající s katelinem-asociovaných telecích, prasečích a králičích peptidu.

Za účelem zjištění genů příbuzných s protegriny se testovaly prasečí genomové knihovny přibližně 2,3 x 10⁵ klonů v EMBL-3 SP6/T7 s ³²P-značenou protegrinovou cDNA a identifikovalo se 45 hybridizujících klónú.

Genomová knihovna prasečích jater ve fágách EMBL3 SP6/T7 se získala z Clontech (Palo Alto, CA) . Kmen E. coli K803 se použil jako hostitel a DNA z phágových plaků se přenesla na nylonové membrány (DuPont, Boston, MA). Filtry se hybridizovaly s prasečí 691 PG-3 cDNA značenou ³²P. Filtry se několikrát promyly, poslední lázeň obsahovala 0,lx SSC a 0,1% SDS a proběhla při teplotě 60°C, pak se exponoval film pro xzáření při teplotě -70°C. Pozitivní klony se podrobily plakovému čištění ve dvouch cyklech při nízké hustotě.

DNA izolovaná z hybridizujících klónú se štěpila různými restrikčními endonukleázami (New England Biolabs, Beverly, MA) , rozdělila se na fragmenty na 0,8% agarózovém gelu a přenesla se na GeneScreen Plus membránu (DuPont, Boston, MA) .

Hybridizačni proby byly značeny pomocí ³²P a zahrnovaly cDNA prasečího PG-3 a protegrinový specifický oligonukleotid značený na 5'konci, který je komplementární s nt. 403 až 429 cDNA PG-1, 2 a 3. V případě cDNA sond hybridizace a promývání proběhlo stejně jako při testování knihovny. V případě oligonukleotidové sondy se membrány promývaly při teplotě 42°C v pufru obsahujícím 0,lx SSC a 0,1% SDS.

Analýza Southernovým přenosem proběhla hybridizací izolované DNA získané z pozitivních klonů s protegrinovou cDNA a s protegrinovými specifickým oligonukleotidem, který je komplementární s nt. 403 až 429 sekvence protegrinové cDNA. Ačkoli všechny klony hybridizovaly s celou cDNA sondou, pouze přibližně polovina z nich hybridizovala s protegrinovou specifickou sondou. Specifická oligonukleotidová sonda pro prasečí propenin, což je další katelin-asociovaný antimikrobiální peptid získaný z prasečích leukocytů, hybridizovala z několika neprotegrinovými klony. Tyto výsledky potvrzují a) že konzervovaná prooblast homologní s katelinem je přítomna ve stejném genu jako antimikrobiální peptidy a není přidaná posttranskripčními kroky a b) že za protegrinové se považuje u prasat zhruba polovina genů příbuzných katelinu.

Syntetický peptid odpovídající aminokyselinové sekvenci PG-5 se připravil a testoval se s ohledem na antimikrobiální aktivitu proti E.coli, L. monocytogenes a C. albicans. Výsledky se porovnaly s těmi získanými se synteticky připraveným PG-1. Výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 3a až 3c. Jak je zobrazeno na grafickém znázornění výsledků, PG-5 má srovnatelnou antimikrobiální aktivitu proti všem třem testovaným organizmům s PG-1.

Příklad 4: Příprava enantio-PG-1 • ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · ·· · · · · · • · · · · ·· · · ·· ·· · · · · · ·· ··· · · • · · ···· ··· ····· ·· ·· ·· ··

Za použiti standardních metod pevné fáze se připravil protegrin, který má aminokyselinovou sekvenci PG-1, ale kde každá aminokyselina je v D-formě. Tato forma protegrinů se testovala proti E.coli, L. monocytogenes a C. albicans a proti jiným organizmům za nepřítomnosi a přítomnosti proteázy a v jiném případě se prováděla radiodifúzní test v agarózových gelech, jak se popisuje v publikaci Lehrer, R.I. et al., J. Immunol. Meth (1991) 137: 167-173. Výsledky ukazují, že jak nativní PG-1 tak enantio-PG-l v nepřítomnosti proteázy je stejně účinný v inhibici růstu E.coli. Ani trypsin nebo chymotrypsin neinhibují antibakteriální účinek enantio-PG-1. V přítomnosti těchto proteolytických enzymů schopnost nativního PG-1 inhibovat růst L. monocytogenes je negativně ovlivněna, ačkoli v přítomnosti těchto proteáz je PG-1 sravnatelně aktivní jako enantio-PG-1.

Za použití stejných metod se syntetizují enantio-formy PG-2, PG-3, PG-4 a PG-5. Podobně se připravují enantio-formy látek, které se popisují dříve v textu.

Příklad 5: Aktivita protegrinů proti STD patogenům

Jak se uvádí v WO 95/03325 PG-1 se testoval proti různým organizmům, které odpovídají za infekce spojené s pohlavně přenosnými nemocemi (STD).PG-1 je vysoce aktivní proti HIV-1, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidium, Neisseria gonorrhoeaea a je slabě aktivní proti Trachimonas vaginalis a Herpes simplex typ 2. PG-1 není aktivní proti Herpes simplex typ 1, avšak další protegriny např. amidová forma RGGLVYVRGRFCVCVGR je aktivní proti Herpes simplex typ 1.

Příklad 6: Antiretrovirová aktivita

Synttická a nativní PG-1 a nativní PG-2 vykazují antivirovou aktivitu proti různým kmenům HIV za použití • ·« ·· ·· ·· ·9 ·· · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · ·· ··· · 9 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 9 9 9 9 9 9 metody popsané v publikací Miles, S.A. et al., Blood (1991)

78: 3200-3208, ajak se uvádí shora vtextu v WO 95/03325.

Protegriny vykazují podobnou aktivitu s ohledem na jiné retroviry.

Příklad 7: Příprava modifikovaných protegrinů: formy kite a bullet

Formy kite a bullet PG-1, kde všechny Z jsou alanin, se syntetizovaly použitím běžně Fmoc chemie. Surový syntetický peptid se syntetizoval přidáním stejného váhového množství dithiotritolu (DTT) k syntetickému peptidů, který se ropustil v koncentraci 10 mg peptidů v ml roztoku a který obsahoval 6M quanidin HC1, 05 M Tris pufr a 2 mM EDTA, pH 8,05 a inkuboval se po dobu dvou hodin při teplotě 52°C v atmosféře dusíku. Směs se filtrovala skrz filtr s póry o velikosti 0,45 μπι, okyselil se 1/20 (o/o) kyseliny octové a izoloval se běžnou RP-HPLC na koloně C-18. Takto izolované redukované formy kite a bullet PG-1 se částečně koncentrovaly na vakuové centrifuze na zařízení speed vac a nechaly se zavinout po dobu 24 hodin při teplotě místnosti, v prostředí okolního vzduchu, v 0,1 M Tris pH7,7 při nízké koncentraci (0,1 mg peptidů na ml), aby se minimalizovalo tvoření meziřetězových disulfidových můstků. Směs se pak koncentrovala a okyselila HOAC na konečnou koncentraci 5% a čistila se RP-HPLC.

Čistota konečného produktu forem kite a bullet PG-1 se ověřila AU-PAGE, analytickou HPLC a FAM hmotnostní spektroskopií. AU-PAGE v každém případě vykazuje jeden pruh pro konečný produkt. Pozorovaná hodnota MH+ v obou případech byla 2093.

Příklad 8: Antimikrobiální aktivita forem kite a bullet

99 ·· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · · • · · ♦ ♦ ♦· ·>·· ·· · · · ·· ·· · · · · · • · · ··«· ··· ··« ·· ·· ·· ·· ··

ΊΟ

U látek forem křte a bullet PG-1 připravené podle příkladu 7 se testovala antimikrobiální aktivita za použití radiálního difúzního testu, jak se popisuje v publikaci Lehrer,R.I. et al., J Immunol Meth (1991) 137: 167-173 s výjimkou, že spodní agary obsahují lOmM pufr fosforečnanu sodného s konečným pH7,4. Jak se popisuje v přikladu 1, Iv případě spodního agaru se použilo 0,3 mg/ml tryptikázové sojové půdy a 1% agaróza, V některých případech se do agaru přidal 100 mM NaCl nebo RPMI plus 2,5% normální lidské sérum (NHS).

V první sadě stanovení se testovala antimikrobiální aktivita forem kite a bullet PG-1 proti L. monocytogen.es, E. faecium (VR) nebo S. aureus za uvedených podmínek.

Formy kite a bullet PG-1 jsou shruba stejně účinné proti uvedeným třen bakteriím za standardních podmínek testu. Když se do agaru přidalo 100 mM NaCl, formy kite jsou méně aktivní ve srovnání s formami bullet, které vykazují za uvedených podmínek slabě zvýšenou antimikrobiální aktivitu proti všem třem kmenům mimo S. aureus. Podobně, když se přidá RPMI plus 2,5% NHS, formy bullet jsou opět účinější než formy kite. Aktivita formy kite proti E. faecium je za uvedených podmínek podstatně nižší-.

Tyto formy PG-1 se také testovaly proti E. coli, K. pneumoniae a P. aeruginosa. Za standardních podmínek formy kite a bullet PG-1 inhibovaly všechny tři organizmy. Tato antimikrobiální aktivita se udržela také v přítomnosti 100 mM NaCl a RPMI plus NHS.

Příklad 9:. Syntéza formy snake PG-1

Forma snake PG-1, kde všechny Z jsou alanin, se připravila za použití standardní metody podle Synpep lne., Dublin, CA a hodnota MH+ na FAB hmotnostním spektroskoupu je φ · · φφ φ ⁷¹

2031,3, což se očekávalo. Forma snake PG-1 se čistila až do dosažení homogenity na RP-HPLC.

Příklad 10: Antimikrobiálni aktivita formy snake PG-1

Forma snake PG-1 se testovala s použitím stejných šesti organizmů a za stejných podmínek, jak se uvádí v příkladu 8, s ohledem na formy kite a bullet PG-1. V tomto případě se jako kontrola používala nativní dvoudisulfidová forma PG-1. Zatímco forma snake vykazuje silnou aktivitu proti proti L. monocytogenes, E. faecium a Saureus za standardních podmínek, musí se poznamenat, že je méně aktivní ve srovnání s nativní formou v přítomnosti buď 100 mM NaCl nebo RPMI plus NHS. Podle stejného paternu se postupuje, když testovanými organizmy jsou E. coli, K. pneumoniae a P. aeruginosa.

Příklad 11: Příprava miniprotegrinů a protegrinů se zvýšenou bazicitou

Připravila se série protegrinů, která zahrnuje formy kite a bullet, kde jeden nebo oba X₅ a Xi₆ jsou bazické, jako protiklad hydrofóbní aminokyselině a/nebo Xi~X₄ nejsou přítomny. Připravené peptidy jsou uvedeny v tabulce č. 2, kde se také porovnávají s aminokyselinovou sekvencí PG-1.

Tabulka č. 2

Sekvence vybraných miniprotegrinů

kód	sekvence	hmotnost
PG-1 PC-11 PC-12 PC-13 PC-14 PC-15	RGGRLCYCRRRFCVCVGR LCYCRRRFCVCVGR RCYCRRRFCVCVGR RGGRLCYCRRRFCVCV RGGRLCYCRRRFCICV RGGRLCYCRRRFCVCR	2154,04 1730,11 1773,14 1943,35 1957,38 2000,41

PC-16	RCYCRRRFCVCR	1616,96
PC-17	LCYCRRRFCVCV	1516,87
PC-18	LCYCRRRFAVCV	1454,77
PC-19	RCYARRRFAVCR	1554,85
PC-20	LAYCRRRFCVAV	1454,77
PC-21	RAYCRRRFCVAR	1554,85
PC-22	RGGRLCY RR VCVGR*	1648,97
PC-31a	GGRLCYCRRRFCVCVGR	1999,40
PC-32a	RGRLCYCRRRFCVCVGR	2098,54
PC-33a	GRLCYCRRRFCVCVGR	1942,35
PC-34a	RRLCYCRRRFCVCVGR	2041,49
PC-35a	RLCYCRRRFCVCVGR	1885,30
PC-36a	RRCYCRRRFCVCVGR	1928,33
PC-37a	CYCRRRFCVCVGR	1615,95
PC-44a	RGGRLCYCRRRFCVCR*	2000,41
PC-45	RGGRLCYCRRRFCVC	1843,22
PC-46	RGGRLCYCRRRFCVC *	1844,22
PC-47a	RGGRLCY RRRF VCVGR	1951,33
PC-48	RGWRLCYCRRRFCVCVGR	2284,75

Hvězdička (*) v tabulce č. 2 označuje volnou kyselinu Ckonce; všechny další jsou amidy C-konce.

Napodobeniny protegrinů se testovaly za použití radiálního difúzního testu, v kterém se používají organizmy ve střední logaritmické fázi, mimo testů s C. albicans, kde se používá celonoční kultura. Jak se popisuje shora v textu všechny spodní agary obsahují 0,3 mg/ml tryptikázové sojové půdy na jeden mililitr, 1% hm/o agarózy, lOmM pufr fosforečnanu sodného pH7,4 a agary se inokulovaly 4xl0⁶ bakterí nebo fungálními CFU na lOml. Standardní sodní agar, médium A, se popisuje shora v textu; Médium B je stejné mimo to, že také obsahuje 100 mM NaCl; médium C obsahuje ·· ·· • · · 9

9 99

999 Ο ·

9 9

99 • ·· ·· · · • · · ·»·4» •♦ c · ··· • · · ·>·· ·· • · ♦ · ·· ·· standardní médium plus 2,5% normální lidské sérum; a médium D obsahuje 80% RPMI-1640 plus 2,5% normální lidské sérum.

Testované peptidy se rospustily v koncentraci 500 μg/ml v roztoku 0,01% kyseliny octové a připravilo se sériové ředění ve stejném rozpouštědle buď jako dvounásobné ředění nebo poloviční logaritmické ředění (poloviční logaritmické ředění jsou od 500 μg/ml, 250, 78, 25, 7,8, 2,5, 0,78, 0,25 a 0,078 gg/ml).

Ředění se připravovala denně v množství dostatečném pro experimenty provedené v tomto dni; testy se provedly tak, že 5 μg objemů roztoku se přidalo do vypíchnutých děr (o průměru 3mm) v bakteriálních spodních gelech. Přelité gely (2xkoncentrovaný běžný tryptikázový sojový agar) se nalil po třech hodinách. Velikosti zón se měřily nejblíže 0,1 mm po celonoční inkubaci. Velikosti zón vyjádřené v jednotkách vyčeření (10 jednotek = lmm v průměru) se vynesl do grafu proti logw koncentrace peptidů za použití programu pro sigma grafy. Úsek na ose X koresponduje s minimální mikrobicidní koncentrací a určil se regresní analýzou nejmenších středních řtverců. Do výpočtu se zahrnuly pouze nejvyšší koncentrace peptidů, které nevykazují vyčeření agaru.

Výsledky Výsledky poskytují minimální mikrobicidní koncentrace v pg/ml a relativní molekulární sílu, která je vsouladu s molekulovou váhou.

V počátečních experimentech se testovaly PC-11 a PC-12 a výsledky se srovnávaly s výsledky s PG-1. Výsledky se uvádí v tabulkách č. 3 a 4.

Tabulka č. 3

Minimální mikrobicidní koncentrace (gg/ml)

ředění série 1	lOmM fosforečnanový pufr	lOmM pufr + 100 mM NaCl
organizmus	protegr	PC-11	PC-12	protegr	PC-11	PC-12

• ·

	PG-1			PG-1
E.coli ML-35p	5,3	2,3	3,8	2,8	1,3	1,9
i.mono, EGD	5,8	4,8	5,1	3, 6	3,7	5, 5
C.albicans 820	6,1	7,1	4,3	7,9	11,6	20,5
S.aureus 930918-3	7,0+0,54	3,7	3,3	4,5+0,26	3,3	3,9
MRSA 30371	n. t.	n. t.	n.t.	4,0±0,18	3,2	1,1
MRSA 28841	n.t.	n.t.	n.t.	3,1+0,03	2,1	2,6

Tabulka č. 4

Relativní molární síla (PG-l=l,00)

	lOmM fosforečnanový pufr	pufr +100 mM NaCl
organizmus	PC-11	PC-12	PC-11	PC-12
E.coli ML-35p L.mono, EGD C.albicans 820 S.aureus 930918-3 MRSA 30371 MRSA 28841	1,85 0, 97 0, 69 1,52 n.t. n.t.	1,15 0, 99 0, 71 1,75 n.t. n.t.	1,73 0, 78 0, 55 1,09 1, 00 1, 19	1, 65 0, 80 0,47 0,95 1,06 0, 98

Jak je uvedeno v tabulce č. 4 zkrácené formy protegrinů jsou trochu účinější proti E.coli a S.aureus ve srovnání s PG-1 a srovnatelně účinné proti zbývajícím testovaným organizmům s výjimkou C. albicans, kde účinnost se pohybuje ve stejném řádu.

Tabulky č. 5 a 6 ukazují minimální mikrobicidní koncentrace a relativní molární sílu provedení PC-15, de X_i6 je bazická aminokyselina. PC-13 je identický s PG-1 s výjimkou, že neobsahuje X_i7 a Xi₈. Jak je uvedeno v této tabulce záměna Xi₆ bazickou aminokyselinou zvyšuje sílu proti většině organizmů, ale mění odezvu na přidané sole.

Tabulka č. 5 • ·

Minimální mikrobicidní koncentrace (μς/ιηΐ)

ředění série 1	lOmM fosforečnanový pufr	10mM pufr + 100 mM NaCl
organizmus	PG-1	PC-13	PG-2	PC-15	PG-1	PC13	PG-2	PC15
E.coli ML-35p	6,1	3,4	4,7	3,7	3,4	2,3	2,9	1,5
L.mono, EGD	6, 5	4, 6	5,2	2, 8	4,0	2,7	3,2	2,4
C.albicans 820	5, 5	4,0	4,8	2, 6	7,5	10,2	10, 1	8, 8
E.faecium (kliň, izolát)	10, 7	6, 6	10, 8	4,3	2, 6	3,4	4,0	6,2
VREF CDC21 (E.faecalís)	n. t.	n. t.	n. t.	n. t.	3,1	4,6	3, 6	5, 6
VREF 94.132 (E. faecium)	n. t.	n. t.	n. t.	n. t.	3,0	2,0	2,3	0, 8
S.aureus 930918-3	6, 0	6,1	7,5	5, 3	4,7	3,4	3, 6	5,7
MRSA 30371	n. t.	n. t.	n. t.	n. t.	4,1	3,4	3, 6	4,4
MRSA 28841	n. t.	n. t.	n. t.	n. t.	3,2	2, 6	2,1	2,3

Tabulka č. 6

Relativní molární síla (PG-l=l,00)

	lOmM fosforečnanový pufr	pufr +100 mM NaCl
organizmus	PC-13	PG-2	PC-15	PC	-13	PG-2	PC-15
E.coli ML-35p	1,62	1, 18	1,53	1,	33	1,06	2,1
L.mono, EGD	1,27	1,14	2, 15	1,	33	1,14	1,55
C. albicans 820	1,24	1,04	1,96	0,	66	0, 67	0,79
E. faecium (kliň, izolát)	0, 89	0,90	2,31	0,	69	0, 59	0, 39
VREF CDC21 (E.faecalis)	n. t.	n. t.	n.t.	0,	61	0,78	0, 51
VREF 94.132 (E. faecium)	n. t.	n. t.	n.t.	1,	35	1, 18	3, 48
S.aureus 930918-3	0, 89	0, 75	1,05	1,	25	1,19	0, 77
MRSA 30371	n. t.	n.t.	n.t.	1,	09	1,03	0, 86
MRSA 28841	n. t.	n. t.	n.t.	1,	11	1,38	0, 85

Tabulky 7 až 10 ukazuji zýsledky PC-16 a PC-17, kde chybí Xi-X₄; PC-16 také obsahuje bazické aminokyseliny v pozicích X₅ a Xi₆. Tabulky 8 a 10 se vztahují na minimální mikrobicidní koncentrace a liší se pouze v pozměněné metodě ředění. V tabulkách 8 a 9 se použilo dvojnásobné ředění a v tabulce č 10 až 11 se použilo poloviční logaritmické ředění. Data v těchto tabulkách ukazují, že účinnost ve srovnání s PG-1 kolísá v závislosti na cílovém organizmu a na testovacích podmínkách. Jak ukazuje tabulka č. 9 například PC-17 (a PC-16) jsou většinou srovnatelně méně aktivní, než PG-1 v přítomnosti sole; Jak se ukázalo v tabulce č. 11 přítomnost séra je také problematická zvláště v případě PC16.

Tabulka č. 7

Minimální mikrobicidní koncentrace (gg/ml)

ředění série 1	lOmM fosforečnanový pufr	10mM pufr + 100 mM NaCl
organizmus	PG-1	PC-16	PC-17	PG-1	PC-16	PC-17
E.coli ML-35p	4,4	1,1	2,0	3,2	0,9	2,7
L.mono, EGD	4,0	1,1	2,2	2, 6	4,1	5, 0
C. albicans 820	5,2	1,9	5, 5	CO ·> o	29, 3	32, 6
E.faecium	6, 6	3,4	4,8	3, 3	3, 8	5,7
VREF CDC21	n. t.	n. t.	n.t.	i—1	16, 7	6,4
(E.faecalis)
VREF 94.132	n. t.	n. t.	n. t.	3, 3	1,2	3,7
(E. faecium)
S.aureus 930918-3	7, 6	3, 8	5,2	4,7	27,5*	6,4
MRSA 30371	n. t.	n. t.	n.t.	4,3	12,3*	5,7
MRSA 28841	n. t.	n. t.	n.t.	3,1	5, 3*	4,0

Tabulka č. 8

Relativní molární síla (PG-l=l,00)

ředěni série 1	10mM fosforečnanový pufr	pufr +100 mM NaCl
organizmus	PC-16	PC-17	PC-16	PC-17
E.coli ML-35p	3,00	1,55	2,50	0,78
L.mono, EGD	2,73	1,28	0,48	0, 37
C.albicans 820	2,05	0, 67	0, 20	0, 17
E.faecium	1,46	0, 97	0, 65	0,41
VREF CDC21 (E.faecalis)	n. t.	n. t.	0, 18	0, 45
VREF 94.132 (E. faecium) S.aureus 930918-3	n. t.	n. t.	2,06 0, 13*	0, 63 0, 13
MRSA 30371	n. t.	n. t.	0,26*	0,26
MRSA 28841	n. t.	n. t.	0, 66*	0, 55

Tabulka č. 9

Minimální mikrobicidní koncentrace (μς/ηΐ)

ředěni série 1	pufr + 100 mM NaCl	RPMI +2,5% NHS
organizmus	PG-1	PC-16	PC-17	PG-1	PC-16	PC-17
E.coli ML-35p	1,4	0, 59*	1,0	0,36	0,49	0, 42
L.mono, EGD	0,7	1,5	0,7	0, 35	0, 61	0, 42
C.albicans 820	8, 6	25,5	10,5	7,1	24,1*	29, 8*
E.faecium	1,2	10, 0	0, 63	0, 42	31,1	0, 40
VREF CDC21	1,5	11,3	1,6	0, 5	28,4	0, 90
(E.faecalis)
VREF 94.132	0, 67	0, 44	0, 56	0,37	00 co	0, 39
(E. faecium)
P.aurginosa	1,3	0,41	1,2	0, 96	8,8	0, 80
MR 2330
P.aurginosa
SBI-N	1,4	1,2	1,1	0,81	2,8	0, 83
P.aurginosa	1,3	0, 80	0, 60	1,1	8,9	0, 88
MR 3007
P.aurginosa	1,4	0, 85	0, 59	0, 91	3,9	0, 81

• ·

MR 2133 S.aureus	3,3	>250	3,9	0,44	0, 82*	0, 35
930918-3
MRSA 30371	1,5	>250	1,6	0, 32	0,1*	0, 30
MRSA 28841	1,3	7, 9*	1,6	0, 6	2,5	0,20

Tabulka č. 10

Relativní molární sila (PG-l=l,00)

ředění série 2	pufr + 100 mM NaCl	RPMI +2,5% NHS
organizmus	PC-16	PC-17	PC-16	PC-17
E.coli ML-35p	1, 78	0, 99	0,35	0, 60
L.mono, EGD	0, 35	0, 70	0, 43	0,59
C. albicans 820	0, 25	0, 58	0,22	0, 17
E. faecium	0, 09	1, 34	0, 01	0, 74
VREF CDC21 (E.faecalis)	0, 10	0, 66	0, 01	0, 39
VREF 94.132 (E. faecium)	1, 14	0, 84	0, 03	0, 67
P. aurginosa MR 2330 .	2,38	0,76	0, 08	0,85
P.aurginosa SBI-N	0, 88	0,90	0,22	0, 69
P.aurginosa MR 3007	1,22	1,53	0,09	0, 88
P. aurginosa MR 2133 S.aureus	1,24	1, 67	0, 18	0, 79
930918-3	<0, 03	0, 60	0, 40	0, 89
MRSA 30371	<0, 03	0, 66	0,24	0, 75
MRSA 28841	0, 12	0, 57	0, 05	2,11

Tabulka č. 11 až 14 ukazují výsledky pro formy protegrinů kite podle vynálezu. Opět je zřejmé, že spektrum cílových organizmů, které jsou citlivé a spketrum podmínek, za kterých je citlivost prokázána, jsou variabilní. Obecně lze říci, že více kationická forma PC-19 je méně účinná ve srovnání s nemodifikovanou formou, která chybí zbytky Xi~X₄. PC-19 není při fyziologických podmínkách aktivní.

Tabulka 11

Minimální mikrobicidní koncentrace (μς/ιηΐ)

ředění série 1	lOmM fosforečnanový pufr	pufr + lOOmM NaCl
organizmus	PG-1	PC-18	PC-19	PG-1	PC-18	PC-19
E. faecium	7,7	1,7	17,7	4,2	2,9	>250
VREF CDC21 (E.faecalis)	n. t.	n. t.	n. t.	4,6	5, 3	>250
VREF 94.132 (E. faecium)	n. t.	n. t.	n. t.	3, 6	1,4	5, 6
S.aureus 930918-3	7,3	3,9	7,3	5, 0	2,1	10, 4
MRSA 30371	n. t.	n. t.	n. t.	4,1	6, 5	68, 6
MRSA 28841	n. t.	n. t.	n. t.	3, 6	3,9	17,4

Tabulka č. 12

Relativní molární síla (PG-l=l,00)

ředění série 2	lOmM fosforečnanový pufr	pufr + lOOmM NaCl
organizmus	PC-18	PC-19	PC-18	PC	-19
E.faecium	3, 06	0,31	0, 98	0,	01
VREF CDC21 (E.faecalis)	n. t.	n. t.	0, 59	0,	01
VREF 94.132 (E. faecium)	n. t.	n. t.	1,74	0,	46
S.aureus 930918-3	1,26	0,72	1, 61	0,	35
MRSA 30371	n. t.	n. t.	0,43	0,	04
MRSA 28841	n. t.	n.t.	0, 62	0,	15

Tabulka č. 13 • · • · • ·

Minimální mikrobicidní koncentrace ^g/ml)

ředění série 2	lOmM pufr + 100 mM NaCl	RPMI +2,5% NHS
organizmus	PG-1	PC-18	PC-19	PG-1	PC-18	PC-19
E.faecium	1, 5	3,2	>250		2,9	>250
VREF CDC21	i—1	3,4	>250		10,0	>250
(E.faecalis)
VREF 94.132 (E. faecium)	0, 61	0,50	2,9	0, 30	1,2	30, 2
P. aurginosa MR 2330	1,3	1,1	3, 0	0,7	3, 0	29,2
P.aurginosa SBI-N	1,3	1,2	2,1	0, 85	4,6	>250
P. aurginosa MR 3007	1,3	1,1	1,1	0, 72	3, 89	>250
P.aurginosa MR 2133	1,2	2,4	2,5	0,9	3,9	>250

Tabulka č. 14

Relativní molární síla (PG-l=l,00)

ředění série 2	lOmM pufr +	100 mM NaCl	RPMI +2,5%	NHS
organizmus	PC-18	PC-19	PC-18	PC-19
E. feacium	0, 32	<0, 01	0, 98	0, 01
VREF CDC21
(E.faecalis)	0,28	<0, 01	0,03	<0, 01
VREF 94.132 (E. faecium)	0, 81	0, 15	0, 17	<0, 01
P.aurginosa MR 2330	0,8	0, 31	0, 16	0,02
P.aurginosa	0, 73	0, 45	0, 12	<0, 01
SBI-N
P.aurginosa
MR 3007	0,80	0, 85	0, 13	<0, 01
P. aurginosa MR 2133	0, 34	0, 35	0, 16	<0, 01

Tabulky č. 15 a 16 ukazuji výsledky získané pro formy protegrinů podle vynálezu. Více kationické formy jsou obecně za vysoké koncentrace soli nebo séra méně účinné ve srovnání s PG-l. Jsou však srovnatelně účinné proti E.coli.

Tabulka č. 15

Minimální mikrobicidní koncentrace (gg/ml)

ředěni série 1	lOmM fosfor.	pufr	pufr + lOOmM NaCl	pufr + 2,5%	NHS
organizmus	PG-l	PC-20	PC-21	PG-l	PC-20	PC-21	PG-l	PC-20	PC-21
E.coli ML-35p	4,6	0,75	0,36	2,0	1,9	1,8	0,34	0,27	0,28
L.mono, EGD	4,8	3,3	1,4	3,4	21,7	36,3	1,3	5,5	5,6
C. albicans 820	6,1	5,3	8,5	6, 8	67,5	>250	8,1	30,1	59,7
E.faecium	6,7	6,7	18,0	3,9	6, 90	>250
VREF CDC21	n. t	n. t.	n.t.	4,9	>250	>250
(E.faecalis)
VREF 94.132	n. t	n. t.	n. t.	2,5	3,3	28,3
(E. faecium) S.aureus 930918-3 MRSA 30371 MRSA 28841	10,3 n. t. n.t.	5,8 n. t. n.t.	7,2 n. t. n. t.	5.1 4.2 3.3	30,3 29,9 8,4	64,6 64,6 8,4

Tabulka č. 16

Relativní molární síla (PG-l=l,00)

ředěni série 1	10mM fosfor, pufr	pufr + lOOmM NaCl	pufr + NHS	2,5%
organizmus	PC-20	PC-21	PC-20	PC-21	PC-20	PC-21
E.coli ML~35p	4, 14	9,21	0,71	CO o	4,50	0, 88
L.mono, EGD	0, 98	2,47	0, 09	0, 07	0, 16	0, 17
C.albicans 820	0,78	0,52	0, 07	<0, 02	0, 18	0, 10
E.faecium	0, 68	0,27	0, 03	0, 01
VREF CDC21 (E.faecalis)	n.t.	n.t.	0, 01	0, 01
VREF 94.132 (E. faecium)	n.t.	n.t.	0, 20	0, 06
S.aureus 930918-3	1,20	1,03	0, 11	<0, 06

MRSA 30371 MRSA 28841

n. t. n. t.

n. t. n. t.

0, 09 0,26

<0, 05 0,28

Přiklad 12: Minimální bioaktivní konformace PG-1 nezbytná pro aktivitu proti Neisseria gonorrhoeae

Citlivost Neisseria gonorrhoeae k různým variantám protegrinů PG-1 se určila za použití radiálního difúzního testu popsaného v publikaci Lehrer et al., 1991, J Immunol Methods 137:167.Nativní protegrin PG-1 se izoloval z prasečích leukocytů způsobem popsaném v publikaci Kokryakov V.N. et al., FEBS Lett (1993) 327: 231-236. Všechny jiné protegriny se připravily synteticky za použití F-moc chemie a čistily se HPLC s reverzními fázemi.

Testovaly se následující kmeny Neisseria gonorrhoeae FA19 (sac-1, sac-3; rezistentní na sérum (Sac^R) , JS-1 (rezistentní na sérum; sac-1, sac-3; (Sac^R) ) a F62 (sac-1*, sac-3; citlivé na sérum (Sac^s) , které se popisují v publikaci Cannon te al., Infect Immun (1981) 32:547-552) a Judd, R.C. Infect Immun (1982) 37:632-641). Kmeny FA628 (sac-1*, sac-3) a FA899 (sac-1, sac-3*) jsou (Sac^s) transformanti kmene FA19 (Shafer, W.M. et al., Infect Immun (1982) 35:764-769). Kmeny FA5101 a WS1 jsou mutanti kmene FA19 rezistentní na pycin, které produkují zkrácený LOS (Lucas, C.E. et al., Molec Microbiol (1995) 16:1001-1009). Bakterie se rozetřely na NGTM médium, inkubovaly se přes noc při teplotě 37°C v atmosféře 5% C0₂/okolní vzduch a denně se pasážovaly. Bakterie z ploten se umístily do 25ml GC půdy a inkubovaly se při teplotě 37°C za stálého míchání po dobu 3 hodin až se získaly gonococci v mid-log fázi.

Spodní a přelité agary se připravily stejným způso bem jak popisuje v případě radiálního difúzního testu v publikaci Qu, X.D. et al.. Peptidy se rozpustily a sériově se naředily

v 0,01% kyselině octové a testovaly se 5ml alikvóty. Plotny se inkubovaly v inkubátoru s atmosférou CO₂ při teplotě 37°C po dobu 3 hodin, pak se přelily gelem, což umožňuje peptidům difúzi pronikat do spodních gelů. Po celonočni inkubaci se určily z úseku na ose X křivky minimální inhibiční koncentrace, jak popisuje Qu et al.. Každý kmen vykazuje citlivost na protegrin (tabulky 17 až 19).

Tabulka č. 17

Aktivita proti Neísseria gonorrhoeae

	aminokys.	minim, inhibič. Koncentrace (μς/πιΐ)
protegrin	sekvence	n	F62	JS-1	FA19

PG-1	RGGRLCYCRRRFCVCVGR	18	1.3*0.1	1.2*0.1	1.9*0.1
PC-13	RGGRLCYCRRRFCVCV--	15	0.6*0.2	1;4±0.04	2.3*0.8
PC-11	----LCYCRRRFCVCVGR	14	1.0*0.1	1.6*0.3	2.8*0.1
PC-17	----LCYCRRRFCVCV--	12	0.6*0.1	1.3*0.2	1.7*0.1
PC-37	-----CYCRRRFCVCVGR	13	4.2*1.1	1.8*0.2	10.7+0.5
PC-45	RGGRLCYCRRRFCVC---	15	1.1*0.3	2.9*0.03	7.6+2.1
PC-71	.....CYCRRRFCVCV--	11	4.5*0.8	4.7*1.0	16.1+0.9
PC-72	- - - - LCYCRRP.FCVC- - -	11	2.7*0.2	2.3*0.8	12.8+0.0
PC-73	.....CYCRRRFCVC---	10	29.8*1.5	48.3*22.5	104.4+7.4
PC-8	RGGR1AYARRRFAVAVGR	18	21.4*5.8	46.0*7.0	431*13
PC-9	RGGRLAYCRRRFCVAVGR	18	1.0+0.3	1.1*0.2	7.3+2.3
PC-10	RGGRLCYARRRFAVCVGR	18	0.7*0.1	0.8*0.1	1.6+0.0
pc-ia	----LCYARRRFAVCV--	12	0.7*0.1	2.1*0.4	8.3*2.0
PC-64	----LCYTRRRFTVCV--	12	0.7*0.1	1.4*0.2	4.5+0.3
PC-20	----LAYCRRRFCVAV--	12	1.1*0.2	8.5*2.5	32.4+5.7
PC-64a	----LTYCRRRFCVTV--	12	0.7*0.1	0.7*0.1	2.1+0.1

Všechny peptidy uvedené v tabulce jsou amidy C-konce.

Protegriny PC-13, PC-11 a PC-17 ukazují, že aminokyselinové zbytky X_x až X₄ a X_i7 až X₁₈ mohou být z PG-1 deletovány, aniž dojde ke strátě inhibični aktivity (tabulka č. 17). Určil se účinek dvou intramolekulových disulfidových vazeb PG-1 na inhibici Neisseria gonorrhoeae. Eliminace obou disulfidových vazeb (protegrin (C-8) redukuje inhibični účinek na všechny tetsované kmeny (tabulka č. 17). Naopak protegrin PC-10, kterému chybí cys₈:cysi₃ disulfidová vazba vykazuje zvýšenou aktivitu proti kmenům F62, JS-1 a FA19. Variantě PG-1, kterému chybí cys₆:cysi₅ disulfidová vazba (PC9), vykazuje úplnou aktivitu proti kmenům F62 a JS-1 a vykazuje 3,8 násobnou redukci aktivity proti kmenu FA19. Zkrácené 12-mérové varienty PG-1, které mají jednu disulfidovou vazbu, také vykazují silnou inhibični aktivitu (protegriny PC-18, PC-64, PC-20 a PC-64a v tabulce č. 18).

Inhibični aktivita protegrinových variant se také určila v případě kmenů citlivých na sérum FA628 (sac-1*) a FA899 (sac-1*) , které se odvodily z kmene FA19 rezistentního na sérum. PG-1 vykazuje podobnou aktivitu proti divokému typu kmene FA19 rezistentního na sérum a na sérum citlivých kmenů odvozených od FA628 a FA899 (tabulka č. 18). Kmeny senzitivní na sérum byly dvakrát až čtyřikrát citlivější na PC-8 vesrovnání s kmenem, který je rezistentní na sérum. Varianty PC-9 a PC-10, které mají jednu disulfidovou vazbu vykazují silnou inhibični aktivitu.

Tabulka č. 18

Účinek protegrinů proti kmenu Neisseria gonorrhoeae citlivému na sérum.

	Aminokyseliny	minimální inib. koncentrace (μς/τηΐ)
protegrin	n	FA19	FA628	FA899
PG-1	18	2,l±0,1	1,6±0,1	1,6±0,1
PC-8	18	420,8±24,2	150,9+14,0	263,5±10,3
PC-9	18	11,2±1,8	4,0±0,1	3,9±0,2
PC-10	18	1,7±0,1	l,2±0,1	1,3±0,1

Protože zkráceni LOS zvyšuje citlivost gonokoků na antibakteriální proteiny lidského PMN (Shafer, W.M. et al., 1986, J Infect Dis 86:910-917), protegriny PG-1, PC-8, PC-9 a PC10 se testovaly proti LOS mutantům FA5101 WS1 kmeni divokého typu FA19 (tabulka č. 19) . Zkrácení LOS vede ke zvýšení citlivosti N. gonorrhoeae na linearizovaný protegrin PC-8, ale má malý účinek v případě citlivosti na PG-1 nebo PC-10.

Tabulka č. 19

Účinek protegrinů proti LOS mutantům Neisseria gonorrhoeae.

	Aminokyseliny	minimální inib. koncentrace (μς/ηϋ.)
protegrin	n	FA19	FA5101	WS1
PG-1	18	2,l±0,1	1,5+0, 2	1,4±0,2
PC-8	18	420,8±24,2	23,1±9,3	29,7 + 12,8
PC-9	18	11,2±1,8	• 2,7±0,4	2,6+0,1
PC-10	18	1,7±0, 1	l,2±0,1	1,l±0,1

Příklad 13: Elektronová mikroskopie Neisseria gonorrhoeae, na něž se aplikovaly protegriny

Určil se účinek aplikace 50 gg/ml PG-1 nebo zkráceného derivátu PC-17 na Neisseria gonorrhoeae. Transmise elektronovou mikroskopií bakterií po 60 minutách aplikace PG1 vykazuje centrální vakuolaci a s membránou asociované struktury s vysokou hustotou elektronů. Skenování bakterií po aplikaci Pg-1 nebo PC-17 elektronovou mikroskopií vykazuje léze na povrchu s průměrem přibližně lOOnm.

Příklad 14: Účinek slin na antimikrobiální aktivitu ·· »t

9 9 9

9 99

9999 9 » · ·· ··

Použil se radiální difúzní test popsaný v publikaci Lehrer et al., 1991, J. Immunol. Meth. 137: 167 s výjimkou, že médium ve spodním agaru obsahuje fosforečnanový pufr v koncentraci lOmM, pH6,5, lOOmM NaCl, 1% TSB, 1% agaróza. Médium v přelité vrstvě obsahuje lOmM fosforečnanový pufr, pH6,5, lOOmM NaCl, 2x koncentrovaný TSB a 1% agarózu. Peptidy se ředily z lOx koncentrovaného zásobního roztoku v 0,01% kyselině octové (AA), buď lOmM acetátového pufru pH5 nebo se slinami.

Výsledky se vykazují jako minimální koncentrace pro produkci detekovatelné zóny vyčeření nebo MCZ, což je extrapolovaná hodnota k ose x, kdy koncentrace peptidu se vynese proti hodnotě průměru zóny. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č.20.

Tabulka č. 20

Účinek ředění na MCZ (gg/ml) proti E.coli 004

sekvence	acetátový pufr	sliny
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	0, 48	1, 14
RGGRLCYARGWIAFCVGR	4,16	38,30
RGGRLCYKRGWIKFCVGR	2,71	0,56
RGWGLCYCRPRFCVCVGR	0,39	12, 6
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	0, 59	1,450
LCYCRRRFCVCF	4,14	6, 11
RLCYCRPRFCVCV	3, 36	6, 83
LCYCRGRFCVCVGR	2,37	5, 68
RLCYCRPRFCVCVGR	1, 60	6, 86
RWRLCYCRPRFCVCV	1,04	39, 00
RGWRACYCRPRFCACVGR	0, 71	1,84
GWRLCYCRPRFCVCVGR	0, 86	47,50
RLCACRGRACVCV	13, 70	9, 76
WLCYCRRRFCVCV*	5, 05	36, 00
RLCYCRXRFCVCV (X=MeGly)	2,43	2,54

RLCYCRPRFCVCVGR*	3, 65	12, 80
RGGGLCYCRPRFCVCVGR*	3, 51	11,90
RRCYCRRRFCVCVGR	3, 02	8,07

Peptidy označené (*) jsou, kyselé formy; všechny ostatní jsou amidové formy.

Velké množství testovaných peptidů vykazuje srovnatelnou nebo dokonce zdokonalenou aktivitu v přítomnosti slin.

Příklad 15: Antimikrobiální aktivita protegrinů

Následující příklad popisuje testy za účelem měření antimikrobiální aktivity, které se používají při testování protegrinů podle vynálezu popsaných dále v textu. Následující činidla, zásobní rozroky a kultury se používají v tetsech, které následují.

Mikroorganizmy:

Escherichia coli ML-35p a

Enterococcus faecium rezistentní na vankomycín (VRE) se získaly od Dr.

Roberta

Lehrera (UCLA, Lehrer et al.,

1988,

J. Immunol.

Mtehods

108:153) a Dr. Gary Schoolnik (Stanford) , Pseudomonas aurginosa (ATCC 9027), Candid a albicans (ATCC 1023) a Staphylococcus aureus (ATCC 33591) se získaly z instituce Amarican Type Culture Collection, Rockwille, MD.

Mikroorganizmy z jiných zdrojů, jako jsou například klinické izoláty se mohou zaměňovat s mikroorganizmy, které se popisují shora v textu.

Média a činidla:

tryptikázový sojový agar (TSA; Becton-Dickinson,

Cockeysville, MD, BBL #4311768): rozpustí se 40 g v 11 deionizované vody, autoklávuje se při teplotě 121°C po dobu 20 minut.

• ·· tryptikázová sojová půda (TSB; Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, BBL #4311768): rozpustí se 30g v 11 deion izované vody, autoklávuje se při teplotě 121°C po dobu 20 minut a uchovává se při pokojové teplotě.

2x koncentrovaná tryptikázová sojová půda (2xTSB): rozpustí se 60g v 11 deionizované vody, autoklávuje se při teplotě 121°C po dobu 20 minut a uchovává se při pokojové teplotě.

Glycerol (20% o/o) : smísí se 20 ml glycerolu s 80 ml deionizované vody, filtruje se sterilizací přws filtr s póry o velikosti 0,20pm a uchovává se při teplotě místnosti.

Monobazický fosforečnanový pufr (lOOmM): rozpustí se 13,7 g monobazického fosforečnanu sodného (Fisher #S368-500) v jednom litru deionizované vody. Sterilizuje se filtrací na filtru s póry o velikosti 0,20 μ a uchovává se při teplotě místnosti.

Dibazický fosforečnanový pufr (100 mM): rozpustí se 14,2g dibazického fosforečnanu sodného (Fisher #S374-500) v 11 deinoizované vody. Sterilizuje se filtrací na filtru s póry o velikosti 0,45 μ a uchovává se při teplotě místnosti.

Fosforečnanem pufrovný fyziologický roztok (PBS; lOmM fosforečnan, lOOmM NaCl, pH7,4): smísí se 15 ml dibazického fosforečnanového pufru (lOOmM) , 4ml NaCl (5M) a 176ml deionizované vody. Jestliže je nezbytné upraví se pH, sterilizuje se filtrací na filtru s póry o velikosti 0,45 μ a uchovává se při teplotě místnosti.

• · · · • ·

• · · · • · ·· • · ·· ·♦

Fosforečnanový pufr (lOOmM, pH6,5): smíchá se 40ml dibazického fosforečnanového pufru (lOOmM) s 160 ml monobazického fosforečnanového pufru (lOOmM). Jestliže je nezbytné upraví se pH, sterilizuje se filtrací na filtru s póry o velikosti 0,45 μ a uchovává se při teplotě místnosti.

Kapalné testovací médium (LTM) : asepticky se smíchá následující sterilní činidla: lOml fosofrečnanového pufru (lOOmM, pH6,5), lml TSB, 2ml NaCl (5M) a 87ml deionizované vody. Uchovává se při teplotě místnosti.

Kyselina octová (0,01% o/o) : smísí se 10μ1 kyseliny octové s 10 ml sterilní deionizované vody.

agaróza: smísí se lg agarózy (Sigma #S6013) s 80ml deionizované vody, autoklávuje se při teplotě 121°C po dobu 20 minut.

Agarózové spodní médium: kombinuje se fosforečnanový pufr (lOOmM, pH6,5), lml TSB, 2ml NaCl (5M) a 7ml deionizované vody s 80ml temperované (50°C) agarózy.

2xTSB agarózové horní médium: rozpustí se 60g TSB a lOg agarózy v 11 deionizované vody, alikvót lOOml v jedné lahvi se autoklávuje při teplotě 121°C po dobu 20 minut a skalduje se při teplotě místnosti.

příprava šikmých agarů s mikroorganizmy: Každý kmen se kultivoval na TSA. Izolované kolonie se přenesly na TSB (lOml do sterilní Erlenmeyerovy láhve) za použití sterilní kličky na jedno použití a inkubovaly se při teplotě 37°C (bakterie) • · · • · ··

• · ·· • ·· • · · ·· • · ·· ·♦ ··· · · • · · nebp 30°C kvasinky za stálého míchání (200 RPM) po dobu 16 až 18 hodin.

Kultury se naředily 1:1 20% sterilním glycerolem a uchovávaly se jako alikvóty o objemu lml při teplotě -80°C. Při inokulaci se kapalina přenesla z rozmražené zkumavky za použití sterilní kličky a pak se rozetřela na povrch TSA šikmého agaru. Zkumavky se šroubovacím uzávěrem se inkubovaly přes noc a skladovaly se při teplotě 4°C po dobu až jeden měsíc.

Příprava inokula:

1. Ze zkumavky se odstranila zátka a sterilní klička se lehce dotkla silně porostlé oblasti TSA šikmého agaru.

2. Inokulovalo se lOml TSB (v 50ml lahvi) a inkubovalal se za stálého míchání ve vodní lázni po dobu 18 hodin (přes noc) při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) při 200 ot/min.

3. V kyvetě se naředilo 50μ1 celonoční kultury 1:20 s TSB a měřila se absorbance při vlnové délce 600nm (A₆oo) za použití TSB. A_ÍOo ředěné kultury by mělo být 0,1 až 0,4.

4. V Erlenmayerových lahvích o objemu 250ml se naředilo 50μ1 celonoční kultury 1:1000 s TSB (bakterie) nebo 1:100 s TSB (kvasinky).

5. Kultura se inkubuje ve vodní lázni za stálého míchání při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) při 200 ot/min. po dobu přibližně 2 až 3 hodiny až se dosáhne logaritmické fáze, to je až hodnota A₆₀₀ kultury je mezi 0,200 a 0,400 bez dalšího ředění.

6. 25ml kultury v logaritmické fázi se přenese do sterilní centrifugační zkumavky a centrifugace při 2000 ot/min a při teplotě 4°C po dobu 10 minut.

• ·

Supernatant se vylije a přidá se 25ml sterilního PBS a pelet se resuspenduje na vortexu.

7. Centrifugace suspenze při 2000 ot/min a při teplotě 4°C po dobu 10 minut. Supernatant se vylije a pelet se resuspenduje v 5ml sterilního PBS.

8. Měří se A₆oo neředěné suspenze. Jestliže hodnota absorbance je okolo 0,5, pak se suspenze ředí sterilním PBS až absorbance dosáhne hodnoty mezi 0,1 a 0,5.

9. Stanovení počtu jednotek tvořících kolonie na mililitr suspenze (CFU/ml) se provedlo připravením 10-ti násobného sériového ředění ve fyziologickém roztoku (0,87%) a nanesením 100 μΐ ΙΟ⁴-, 10⁵- a 10⁶ředěni na plotny s TSA, vždy jedno ředění na jednu plotnu. Plotny se inkubovaly přes noc, zpočítal se počet kolonií a určil se počet CFU na jeden mililitr (přesné stanovení vyžaduje přibližně 30 až 300 kolonií na plotnu).

V případě uvedených kmenů počet CFU na mililitr suspenze, která má hodnotu A_6Oo=0,2, je uvedený v tabulce níže v textu:

CFU/ml suspenze (A₆oo=0,2)

kmen	CFU/ml
E.coli	8,0 x 10'
P. aeuruginosa	7, 8 x 107
MRSA	2,0 x 107
VRE	3,8 x 107
C. albicans	9,7 x 105

Příprava zásobních roztoků peptidu

1. Přibližně 1 mg každého testovaného peptidu se navážilo do cryo-zkumavky (l,8ml). Přidalo se dostatek kyseliny octové (0,01%), aby se připravil zásobní roztok, který má koncentraci 1280μg/ml. Zásobní roztok se rozdělil do několika zkumavek, ΙΟΟμΙ na jednu zkumavku a alikvóty se uchovávaly pevně uzavřeny při teplotě -80°C.

Radiální difúzní test (MCZ)

MCZ test se použil ke stanovení citlivosti mikroorganizmů k různým antimikrobiálním látkám za použití minimálního množství testovaných materiálů. Buňky se kultivovaly přibližně do dosažení mid-logaritmické fáze a resuspendovaly se v pufrované agaróze s minimálním množství nutrientů. Za účelem zabránit elektrostatickým interakcím mezi antimikrobiálními peptidy a polyaniontovými komponenty standardního agaru se v tomto gelu použila agaróza (ne agar). Peptidy radiálně pronikají difúzí z malých prohlubní do gelů a průměr zóny inhibice růstu je úměrný koncentraci peptidu v roztoku (Lehrer et al., J. Immunol. Methods 108:153; Lehrer et al., 1991, J. Immunol. Methods 137:167).

Příprava ploten na MCZ test

1. Pro každou petriho misky, která se má nalít, se připraví do polypropylénové zkumavky (15ml) lOml temperovaného (50°C) agarózového spodního média. Přidá se 4xl0⁶ CFU, dobře se třikrát promýchá. Bezprostředně se roztátá agaróza nalije na petriho misku.

2. Po té co agaróza ztuhne použije se sterilní kanyla k vytvoření 16 prohlubní v agaróze (průměr 3mm) (4x4). Agarózové zátky se odstraní pasterovou pipetou ado lahve, která má postraní rameno připojeno na vákuum.

3. Ze zásobního roztoku peptidu se připraví dvounásobné ředění (od 128 μg/ml do 0,06 μg/ml) za použití

4	44	• 4		44	4«		44
• 4 4	•	4 ·	•	•	4 4	4	4
• ·		• ·		44	• 4		44
• ·	•	4 4 4	4	4	4 444	4	4
• ·	•	4 4	4	4	4	4	4
···	44	44		44	44		>4

kyseliny octové (0,01%) jako ředidla nebo v případě, že koncentrace peptidů jsou nižší než 50μς/πι1 použije se jako ředidlo acetát sodný (lOmM pH5), který obsahuje albumin lidského séra (HAS; 0,1% m/o).

4. 5μ1 každého sérového ředění se přenese do agarózové j amky.

5. Samotné ředidlo se použitje jako negativní kontrola a protegrin-1 (U.S. patent č. 5,464,823; v koncentraci 32μρ/πι1, 8μρ/πι1 a 2μρ/ιη1) se nanese do jamek jako pozitivní kontrola.

6. Plotny se inkubijí při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dobu 3 hodin.

7. Na povrch každé plotny se nalije 2xTSB agarózového horního média (lOml) a agar se nechá ztuhnout a plotny se inkubují dnem vzhůru při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dobu 16 až 18 hodin.

8. Plotny se prohlédnou a změří se (v mm) průměr zóny inhibice růstu (oblast vyčeření okolo každé prohlubně).

9. Do grafu se vynese zóna inhibice růstu na osu Y a koncentrace peptidů v prohlubni (osa X) a za použití lineární regresní analýzy se získá čára nejvhodnější koncentrace. Úsek na ose x, který vymezuje přímka nej vhodnější koncentrace, je minimální koncentrace pro zónu inhibice růstu (MCZ) pro každou koncentraci peptidů.

Test ředění rnivkropůdy

Metoda ředění mikropůdy akomoduje velký počet vzorků a ve srovnání s MCZ testem je přístupnější automatizaci a analýza dat je přímá a jednoduchá. Klíčovým krokem v tomto testu je kombinování mikroorganizmů a peptidů v definovaném

systému pufru s minimem nutrientů, který minimalizuje interferenci biologické aktivity peptidu. Navíc přítomnost 0,1% (m/o) albuminu lidského séra (HSA) nebo albuminu boviního séra (BSA) v ředidle peptidu minimalizuje adsorpci peptidu na povrch nádoby.

Příprava ploten pro MCB test

1. Do každé prohlubně sterilní mikrotitrační destičky se přenese ΙΟΟμΙ buněk v mid-logaritmické fázi v. LTM (MCB-5 je 4xl0⁵ CFU/ml; MCB-3 je 4xl0³ CFU/ml).

2. Ze zásobního roztoku peptidu se připraví sériové dvounásobné ředění (od koncentrace 1280 μς/ιηΐ do 0,625 μg/ml) za použití kyseliny octové (0,01%) jako ředidla nebo v případě, že koncentrace peptidu je nižší než 50μg/ml se použije jako ředidlo acetát sodný (lOmM, pH5), který obsahuje HAS nebo BSA (0,1% m/o) .

3. Do třech prohlubní mikrotitračních destiček se nanese alikvót (11μ1) každého sériového dvounásobného ředění.

4. Destičky se inkubují při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dobu 3 hodin.

5. Do každé prohlubně se přidá ΙΟΟμΙ 2x koncentrovaného TSB, promýchá se a směs se inkubuje při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dalších 16 až 18 hodin.

6. Destičky se prohlédnou a v každé prohlubni se vyhodnotí turbidita (růst buněk). Kmen MRSA často tvoří pelet a usedá na dno prohlubně. MRSA se může hodnotit umístěním mikrotitrační destičky na oporu a dno prohlubní se hodnotí za použití nakloněného zrcadla.

··· · · ·· · · ·· · ··· · · · · ···· ·· ··· ·· · · ··· · · ··· · · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ··

7. Minimální koncentrace v médiu pro inhibici růstu (MCB) se definuje jako nejnižší koncentrace peptidů, která inhibuje všechen viditelný růst. Jestliže se MCB hodnoty u třech stejných vzorků liší, výsledná hodnota MCB se získá zprůměrizováním výsledků tři vzorků.

8. Minimální koncentrace peptidů vykazující nejméně 99,9% biocidní aktivity (nejméně 3 log zvýšení z počátečního inokula) se určí inkubací 50μ1 alikvótu z každé prohlubně na TSA plotně po dobu 24 hodin při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) (v případě nanesení na plotnu l,5ml TSA v každé prohlubni destičky se 24 prohlubněma minimalizuje křížovou kontaminaci).

Modifikovaný NCCLS test minimální inhibiční koncentrace (MIC)

Instituce National Committee of Clinical Standards (NCCLS) vyžaduje, aby se testované látky připravovaly jako zásobní roztoky v Mueller-Hiltonově půdě (MHB) v koncentraci 512 μg/ml. Zásobní roztoky se sériově ředí (dvojnásobné ředění) v médiu a každé sériové ředění přidané v poměru 1:1 do média, které obsahuje lxlO⁶ CFU/ml bakterie (National Committee on Clinical Laboratory Standards, December 1994, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLS Document M100-S5 Vol. 14, No. 16; Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria that Grow Aerobically, 3d Ed., Approved Standard M7-A3, National Comettee for Clinical Standards, Villanova, PA) .

Zjistilo se, že peptidy podle vynálezu precipitují v MHB při koncentraci vyšší než 128 μρ/ιηΐ. Jestliže se bude postupovat podle protokolu NCCLS, výsledkem bude sériové • ·

dvounásobné ředěni, které obsahuje méně peptidů, než se vypočítalo, což vede k vysoké hodnotě MIC.

K překonání tohoto problému je následující modifikovaný NCCLS test preferovanou metodou pro stanovení MIC peptidů podle vynálezu. Při této metodě se precipitaci předejde, jestliže se připraví koncentrované (lOx) zásobní roztoky testovaného peptidů v pufru, který je vhodný pro peptid a který nevykazuje nežádoucí účinky na mikroorganizmy (0,01% o/o kyseliny octové, 0,1% m/o HAS) a ředění zásobního roztoku 1:10 v MHB, který obsahuje mikroorganizmy.

Příprava ploten pro MIC test

1. Připraví se celonoční čerstvá kultura testovacího organizmu v Meuller-Hintonově půdě (MHB; BectonDickinson, Cockysville, MD, BB2#11443).

2. Kultura se naředila přibližně nakoncentraci 4xl0⁵ CFU/ml čerstvým MHB a do každé prohlubně sterilní mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi se přenesly alikvóty o objemu 100 μΐ.

3. Ze zásobního roztoku peptidů se připravila sériová dvojnásobná ředění (od 1280 pg/ml do 0, 625 μς/ιηΐ), kde se použije jako ředidlo kyselina octová (0,01%) nebo jestliže jsou koncentrace peptidů nižší než δΟμς/ιηΙ, pak se jako ředidlo použije acetát sodný (lOmM pH5), který obsahuej albumin lidského séra (HSA) ; 0, 1% m/o) .

4. Do třech prohlubní mikrotitračních destiček se nanese alikvót (11μ1) každého sériového dvounásobného ředění.

5. Destičky se inkubují při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dobu 3 hodin.

• ·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · · · ··· · · · · ···· • · ··· 99 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 99

6. Do každé prohlubně se přidá ΙΟΟμΙ 2x koncentrovaného TSB, promýchá se a směs se inkubuje při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dalších 16 až 18 hodin.

7. Destičky se prohlédnou a v každé prohlubni se vyhodnotí turbidita (růst buněk). Kmen MRSA často tvoří pelet a usedá na dno prohlubně. MRSA se může hodnotit umístěním mikrotitrační destičky na oporu a dno prohlubní se hodnotí za použití nakloněného zrcadla.

8. Minimální koncentrace v médiu pro inhibici růstu (MCB) se definuje jako nejnižší koncentrace peptidů, která inhibuje všechen viditelný růst. Jestliže se MCB hodnoty u třech stejných vzorků liší, výsledná hodnota MCB se získá zprůměrizováním výsledků tří vzorků.

9. Minimální koncentrace peptidů vykazující nejméně 99,9% biocidní aktivity (nejméně 3 log zvýšení z počátečního inokula) se určí inkubací 50μ1 alikvótu z každé prohlubně na TSA plotně po dobu 24 hodin při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) (v případě nanesení na plotnu l,5ml TSA v každé prohlubni destičky se 24 prohlubněma minimalizuje křížovou kontaminaci).

Kinetický baktericidní test

Následující test se používá při stanovení rychlosti, při které peptid usmrcuje cílový organizmus a zárověň umožňuje stanovit, zda je peptid baktericidní nebo bakteriostatický.

Test • ·

1. Do každé prohlubně mikrotitračni destičky s 96 prohlubněmi se přenese 200μ1 buněk v logaritmické fázi v LTM (4xl0⁵ CFU/ml).

2. V čase T=0 minut se přidá do prohlubně Al 22 μΐ peptidu o koncentraci 1280 gg/ml a směs se třikrát promýchá.

3. Počká se 30 vteřin a do prohlubně A2 se přidá 22μ1 druhé koncentrace peptidu a opět se se třikrát promýchá.

4. Postup se opakuje peptid se přidává v intervalu 30 vteřin až se přidaly všechny koncentrace peptidu. V typickém případě čtyřnásobné sériové ředění zásobního roztoku (to je 1280, 320, 80, 20 a 5 μg/ml peptidu ředěného v poměru 1:10 do každé prohlubně) poskytuje dobře srovnatelné křivky usmrcení. Do jedné prohlubně se přidá 22 μΐ 0,01% kyseliny octové, která slouží jako kontrola.

5. V čase T=15 minut prohlubeň Al se třikrát promýchá a 20μ1 se přenese do sterilní prázdné petriho misky (lOOmm x 15mm).

6. Rychle se přidá 20ml temperovaného (50°C) TSA a lehce se promýchá.

7. Opakují se kroky 5 až 6, až se na plotny nanesou všechny koncentrace.

8. V případě kontrolní prohlubně se vzorek naředí 1:100 s LTM a na plotnu se nanese 50μ1 ředění, aby se dosáhlo přesného stanovení CFU.

9. Po té, co došlo ke stuhnuti agaru, plotny se inkubovaly při teplotě 37°C (bakterie) nebo 30°C (kvasinky) po dobu 18 až 24 hodin.

10. Kroky 5 až 9 se opakují pro všechny koncentrace peptidu a kontrolních vzorků v časech T=30, 60, 120 a 240 minut.

11. Pro každou plotnu se spočítal počet CFU na plotnu a pro každou koncentraci peptidu se odhadla redukce CFU. Zá účelem stanovení účinku použití tohoto testu peptid musí redukovat CFU nejméně jeden log (to je nejméně 800 CFU na plotnu). Ačkoli tato čísla jsou vyšší než doporučená (30 až 300 CFU/plotnu) změny v logaritmickém měřítku v obnovitelných CFU indikuje podstatnou bakteriocidní účinnost.

12. Za účelem získání srovnávacích křivek usmrcení se vynesly do grafu logaritmy zanedbatelného množství organizmů, které přežily proti koncentraci peptidu.

Tabulka č. 21 ukazuje antimikrobiální aktivitu řady látek podle vynálezu proti různým cílovým organizmům za použití MCB-3 testu popsaného shora v textu (to je při 10³ CFU). Výsledky se uvádějí jako minimální koncentrace pro inhibici růstu v půdě (MCB), které jsou nejnižší koncentrace, jenž nevedou k viditelné turbiditě. Minimální baktericidní koncentrace (MBC) na TSA je ekvivalentní k MCB. Jednotkami koncentrace jsou gg/ml. Jak je uvedeno v tabulce č. 21v peptidovém řetězci se mohou provést různé substituce za účelem optimalizovat spektrum antimikrobiální aktivity. Hvězdička na C-konci indikuje, že peptid je ve formě volné kyseliny; jinak se v testu používala amidová forma.

100

Tabulka č. 21

Hodnocení antimikrobiálních peptidů v MCB-3 (μς/πιΐ)

	sekvence	MRSA	Psa	VREF	Candida	E.colí
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	1.5	0.11	1.2	0.6
RGGGLCYCRRRFCVCVGR*			3.29	0.4
RGGGLCYCRRGFCVCFGR	1.93	0.14	1.62
RGGGLCYCRRPFCVCVGR	3.1	0.06	7.69	0.15
RGGGLCYCRPRFCVCVGR*			17.7	3.51

RGGRLCYCRXRFCVCVGR* (X=MeGly)	5.33	2	1
RGGRLCYCRXRFCVCVGR	(X=MeGly)	4	1.67	0.83
RGGLCYCRGRFCVCVGR RGGRLCYCXGRFCVCVGR	(X=Cit)	10.6	0.83
XGGRLCYCRGRFCVCVGR RGGRVCYCRGRFCVCVGR RGGRVCYCRGRFCVCVGR *	(X=Cit)	8	1
RGGGLCYCFPKFCVCVGR		3.48	1.2		15.96
RGWGLCYCRPRFCVCVGR		1.55	0.27	0.09	5.68	0.1
RGWRLCYCRXRFCVCVGR*	(X=MeGly)	26.7	10.6
RGWRLCYCRGRFCVCVGR		5.3	0.5
RGWRLCYCXPRFCVCVGR	(X=Cit)
RWRLCYCRPRFCVCVGR		4.7	3.3		1.7
RGWRLCYCRPRFCVCVGR		4.7	5.3		6.1
RGWRACYCRPRFCACVGR		4.7	1.3	2	4.7	0.34
GWRLCYCRPRFCVCVGR		4.7	4		2.7	0.86
RWRLCYCKGKFCVCVGR RGWRLCYCRXRFCVCVGR GGWRLCYCRGRFCVCVGR	(X=MeGly)	16	9.3
RGGWLCYCRGRFCVCVGR		32	5.3
RLLRLCYCRXRFCVCVGR	(X=MeGly)	4	3.3
RLLRACYCRXRFCVCVGR RLLRLCYCRRRFCVCVGR	(X=MeGly)	10.6	3
RGLRXCYCRGRFCVCVGR	(X=Cha)	6.7	2.3
RGGRLCYCRXRZCVCWGR	(X=MeGly) (Z«Cha)
RGGRWCVCRXRZCYCVGR	(X=MeGly) (Z=Cha)
RGLRXCYCRGRFCVCVGR*	' (X=Cha)	16	8
RGGRWCVCRGRXCYCVGR	(X=Cha)
RGGRLCYCRRRFCXCVGR	(X=MaVal)
LCYCRRRFCVCV		16	4	4	5.9	1.9
LCYCRRRFCVCV*		32	8
LCYCRPCFCVCV		64	5.3	3.33		>64
LCYCRRRFCVCF		4	2	2		3
LCACRRRACVCV		>64	13.3
LCYCRXRFCVCV (X=D-Arg)	4	2	1.32	5.72	1.18
LCWCRRRFCVCV		5.3	2	4	8.91	0.76
WCYCRRRFCVCV		5.3	2.7	2	4.7	2.3
LCYCRRRXCVCV (X»hPhe)	8(64)	6.7	2.7
LCYCRRRXCVCV (X=Phe(4-Cl)) XCYCRRRFCVCV (X=Cha) LCYCRRRFCXCV (X=D-His)	4	2	1.3

101

LCYCRRRXCVCV	(X=MeGly)	2.67	2.67	1.33
LCYCRRRXCVCV	(X=MePhe)	>64	10.7		>64
LCYCRRRFCXCV	(X=MeVal)	>64	13.3	42.7
LCXCRRRXCVCV	(X=Cha)	18.7	16	8	3.98	u. j i
LCGCRRRGCVCV		>32	>16	>128
LCACRGRACVCV		>32	6.7	21.3
RLCYCRRRFCVCV		8	4
RACYCRPRFCACV		>64	2.7
RLCYCRPRFCVCF
RLCYCRPRFCVCV		5.3	2.7	2
KLCYCKPKFCVCV		16	2	2.67		2.07
RLCACRGRACVCV		>32	2.7	10.7	9.51	3.93
RLCYCRXRFCVCV	(X=MeGly)	5.3	2	2	6	2.54
RXCFCRPRFCVCV	(X=Cha)	2.67	2.67	0.83
RWCFCRPRFCVCV		3.3	2	2	5.2	2.2
WLCYCRRRFCVCV		5.3	1.3
WLCFCRRRFCVCV
FLCFCRRRFCVCV
WLCFCRRRXCVCV	(X=MePhe)
WLCYCRRRFCVCV*		8	4	2	7.14	0.99
RLCYCRRRFCVCV*		8	1.67	2
WYCYCRRRFCVCV*

WXCYCRRRFCVCV* (X=Cha) RXCFCRGRZCVCV (X=Cha) (Z=MePhe) XLCFCRRRZCVCV (X=Cha) (Z=MePhe)

RLCYCRPRFCVCVGR	0.65	0.1	0.89	0.05
RLCYCRPRFCVCVGR	3.3	0.7	1.3	3.3	0.98
RLCYCRPRFCVCVGR*	8	2.7	2	12.1	1.6
WLCYCRRRFCVCVGR*
WXCYCRRRFCVCVGR* (X=Cha)
RLCYCRGPFCVCR	16.6	1.1		7.73
RRWCFVCYAGFCYRCR	64	8	4
RGGRLCYCRRRFCVC	>32	1.6*	2.7
RRCYCRRRFCVCVGR	>64	1.3	2		8.07

(32)

RRCYCRGRFCGCVGR

RWRCYCGRRFCGCVGR

RARCYCGRRFCGCVGR

GWRCYCRGRFCGC

RGWACYCRGRFCVC

RRCYGRRRFGVCVGR

RGWRLCYGRGRFKVC

RGWRLCYCRGRFCVC

CYCRRRFCVCF	53.3	4	3.33
CYCRRRFCVCVGR	>64	2	21.3
RGWRLCYCRXRFCVC (X=MeGly)
RGWRGCYCRXRFCGC (X=MeGly)	>64	10.7
LCYCRRRFCVCVGR	8	2	5.8
LCYCRPRFCVCVGR	13.3	4
LCYCKPKFCVCVGK	64	2
LCYCRGRFCVCVGR	8.	2	2

2.14

LCYCRPRFCVCVGRGR	102 8	2
RRWCYCRPRFCVCVR	2.87	0.18		2.98
WRLCYCRPRFCVCVGR	S.3	4		5
GWLCYCRGRFCVCVGR	21	16
RWLCYCRGRFCVCVGR	16	5.3
RLLCYCRGRFCVCVGR .	6.6	1.3
RWRLCYCRPRFCVCV	8	4		5
RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha)	16	5.3
(Z=MeGly)
RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha)	32	13.3
RGGRVCYCRGRFCVCV	8	2
RGGRVCYCRGRFCVCV*	64	1
LCYCRXRFCVCV (X=D-Ala)	32	9.3	3.33		>64
LCYCKPKFCVCV	64	3	6.7		>64
VCYCRPRFCVCV	26.7	5.2			5.26
LCYCRPRFCVCW	53.3	42.3
LCYRRPRFRVCV	>64	4	16		>64
RGWRLCYCRGRXCVCV* (X=Cha)	>32	>16
RXRLCYCRZRFCVCV* (X=Cha)	>32	21
(Z=MeGly)
RXRLCYCRGRFCVCV (X=Cha)
RGGGLCYARGWIAFCVGR	2.1	0.59		32.6	0.81
RGGGLCYARGFIAVCFGR	19	14		65.8	3.27
RGGGLCYARPRFAVCVGR
RGGGLCYTRPRFTVCVGR	8.7	0.07		>128	1.53
RGGGLCYARKGFAVCVGR	>128	0.01		>128	2.65
RGGRX.CYARRRFAVCVGR*		0.05		1.6	0.4
RGGRLCYARRRFAVCVGR		0.01		3	0.08
RGGGLCYKRGFIKVCFGR	17	0.19		7.73	3.27
RGGGLCYKRGWIKFCVGR	2.07	0.15		2.72	3.56
RGGGLCYRLPKFRVCVGR	34.77	0.22		15.09	0.56
RGGGtCYRLPGFRVCVGR	30.76	0.53		31.4	8.95
RGWRGCYKRGRFKGCVGR	>64	9.3
RGWRGCYKRGRFKGCVGR*	>32	8*
LCYARRRFAVCV	>64	2	10.7
LCYTRRRFTVCV	>64	4	16
LCYKRGRFKVCV
ICYRPRFVCVGR	>128	6.9		>128	10.78
* označuje formu volné	kyše	líny;	všechny další jsou

amidové formy. MRSA je kmen S.aureus rezistentní na mtycilin; Psa je P. aeruginosa; VREF je kmen E.faecium rezistentní na vankomycín

Tabulky 22 až 25 ukazují aktivitu ve shora popsaném kinetickém baktericidním testu . Výsledkem jsou logaritmické redukce CFU pro různé peptidy podle vynálezu proti MRSA, Pseudomonas aeruginosa a endogenní floře ve slinách.

103 • ·· ·· ·· ·· ·· ··· ♦ · · · * · · · · • · · · · ·· ···· • · · · · · · · · ··· · · • · · · · · · ··· • · · ·· · · ·· ·· ··

Tabulka č. 22

Sníženi CFU MRSA (ATCC 33591) po působeni peptidů (2 μς/πιΐ) po dobu 15 minut v LTM médiu při teplotě 37°C

sekvence	Log redukce CFU
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	2,44
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	1,83
RGGRLCYCRRRFAVCVGR*	0,29
RWRLCYCRRRFCVCV	1,41
RGWRLCYCRRRFCVCVGR	2,06
GWRLCYCRRR FCVCVGR	>3,19
XCYCRRRFCVCV (X=Cha)	1,32
LCXCRRRXCVCVGR (X=Cha)	>3,19
RLCYCRRRFCVCV*	<0, 90
RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha)	1,13
(Z=MeGly)
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha)	2,48
RWLCYCRGRFCVCVGR
GGWRLCYCRGRFCVCVGR	1,58
RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	2,47
RGGRLCYCRGRFCVCVGR*	1, 66
RXRLCYCRZRFCVCWGR (X=Cha)	<0, 90
(Z=MeGly)	1, 38
RGWRLCYCRGRFCVCVGR
WLCYCRRRFCVCV	2, 12
RLLRLCYCRRRFCVCVGR	3, 16
RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVa1)	2, 16 <0, 90

* Peptidy označené hvězdičkou jsou kyselinové formy; všechny ostatní formy jsou amidy.

Počáteční inokulum je přibližně 4xl0⁵ CFU/ml

Tabulka č. 23 • ·

104

Log redukce CFU u Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) po 15 minutách působeni peptidu (4 ůg/ml) v LTM médiu při teplotě 37°C.

sekvence	Log redukce CFU
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	3,19
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	3, 65
RGWGLCYCRPRFCVCVGR	<1,2
RGGGLCYCRPRFTVCVGR	2, 15
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	3, 98
XCYCRRRFCVCV (X=Cha)	2,81
RLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	<0, 5
RLCYCRRRFCVCVGR*	3,29
RXCFCRPRFCVCV (X=Cha)	1,78
RLCYCRRRFCVCV*	3, 52
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha)	2, 87
RGGLCYCRGRFCVCVGR	3, 61
RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	2,70
RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	2,71
RGGRLCYCRGRFCVCVGR*	2, 66
RGWRLCYCRGRFCVCVGR	2,54
RGGRVCYCRGRFCVCVGR	2,37
RGGRVC YCRGR FCVCV	2,18
RGGRVCYCRGRFCVCV*	1,55
WLCYCRGRFCVCVGR	1,27

* Peptidy označené hvězdičkou jsou kyselinové formy; všechny ostatní formy jsou amidy.

Počáteční inokulum je přibližně 4xl0⁷ CFU/ml

Tabulka č. 24

Log redukce CFU u Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) po 15 minutách působení peptidu (0,12 gg/ml) v LTM médiu při teplotě 37°C.

sekvence	15 min	120 min
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	3, 48	3, 68
RGWGLCYCRPRFCVCVGR	3, 48	3,68

• ·

105

RGGGLCYTRPRFTVCVGR	0,75	3, 68
RGGGLCYARKGFAVCVGR	1,20	3, 68
GWRLCYCRPRFCVCVGR	2, 70	2,21
RGGRLCYCRRRFCVC	2,25	>3,73
LCYCRRRFCVCV	1,35	2, 13

Počáteční inokulum je přibližně 4xl0⁵ CFU/ml

Tabulka č. 25

Log redukce CFU endogenní flory ve slinách po 15 minutách působení peptidu (320 μς/πιΐ) při teplotě 37°C.

sekvence	Log redukce CFU
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	1,80
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	2,04
RGGGLCYKRGWIKFCVGR	1,09
RGWGLCYCRPRFCVCVGR	0, 53
RLCYCRPRFCVCVGR	0, 53
RGGGLCYTRPRFTVCVGR	1, 05
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	1,25
LCYCRGRFCVCVGR	1,02
RWRLCYCRPRFCVCV	0,22
RGWRLCYCRPRFCVCVGR	0, 38
RGWRACYCRPRFCACVGR	0,28
GWRLCYCRPRFCVCVGR	0,26
XCYCRRRFCVCV (X=Cha)	0,25
WLCYCRRRFCVCV*	0,16
RLCYCRXRFCVCV (X=MeGly)	3, 43
RLCYCRPRFCVCVGR*	0, 66
RGGGLCYCRPRFCVCVGR*	1,51
RXCFCRPRFCVCV (X=Cha)	0, 71
RWCFCRPRFCVCV	0, 52
LCXCRRRXCVCV (X=Cha)	0,23
RGGRLCYCRRRFCVC	0, 86

106 • ·· ·Φ ·· ·* ·· φφ < φ φ φ φ φ · · · · φ φ φ ···· · φ φφ ·· φ · · ·· · · ···t φ φφφ ···· ΦΦ· ··· φφ φφ φφ ·Φ φφ

LCYTRRRFTVCV	0, 64
RRCYCRRRFCVCVGR	0, 98
RLCYTRRRFCVCV*	0,21
RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha)	<0, 6
(X=MeGly)
RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha)	<0, 6
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha)	1, 65
RGWRGCYKRGRFKGCVGR	<0, 97
RGWRGCYCRXRFCGC (X=MeGly)	<0, 6
RGGLCYCRGRFCVCVGR	2,52
RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	0, 65
RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	2,11
RGGRLCYCRGRFCVCVGR*	2, 16
RGWRLCYCRGRFCVCVGR	1,89
RGGRLCYCRGRFCVCVGR	2,53
RGGRVCYCRGRFCVCVGR	2,37
RGGRVCYCRGRFCVCV	2,07
RGGRVCYCRGRFCVCV*	<0, 97
WLCYCRRRFCVCV	1,87

* Peptidy označené hvězdičkou jsou kyselinové formy; všechny ostatní formy jsou amidy.

Počáteční inokulum je přibližně 4xl0⁷ CFU/ml slin. Peptidy (3200 μς/πιΐ) se rozpustí v 0,01% kyselině octové a ke slinám se přidá 1/10 objemu.

Kinetické experimenty také Haemophilus influenze (ATCC 49247), na TSA, ale přežijí několik hodin v

Na buňky v logaritmické fázi peptid a pak se nanesly účelem aplikoval agarem za testované peptidy

RGGRLCYCRRRFCVCVGR a bakteriocidní proti probíhají za které zpravidla použití nerostou

LTM) se

LTM.

(4,5xl0^5oCFU/ml v na plotny s čokoládovým zjistit počet viditelnývh CFU. Všechny a a midové formy RGGLCYCRGRFCVCVGR) byly V čase 240 min se (kyselinové amidová forma

H.influenzae.

107

9·· ·· ·· • ·· ·· •· · · •· ·· • · · ··· ·· • · · · ·· ·· • · · · •· ·· ··· ·· • ·· nepozoroval opětný růst, jako v předchozím případě u P.aeruginosa.

Shora popsaný test se uskutečnil za použití H. pylori jako cílového organizmu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 26.

Tabulka č. 26

Účinek peptidů (32 μg/ml) na CFU Helicobacter pylori (ATCC 33591) v LTM po 15 minutách působeni

sekvence

Log redukce CFU

RGGRLCYCRRRFCVCVGR	2.90
RGWGLCYCRPRFCVCVGR	3.43
RLCYCRPRFCVCVGR	1.34
RGGGLCYTRPRFTVCVGR	<1.12
RGGGLCYARKGFAVCVGR	<1.2
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	3.00
LCYCRGRFCVCVGR	<1.12
RGWRACYCRPRFCACVGR	<1.6
XCYCRRRFCVCV (X=Cha)	<1.70
WLCYCRRRFCVCV*	<1.6
RLCYCRXRFCVCV (X=MeGly)	1.57
RLCYCRPRFCVCVGR*	<1.6
RXCFCRPRFCVCV (X=Cha)	>4.66
RGGRLCYCRRRFCVC	<1.2
LCYTRRRFTVCV	<1.28
RLCYCRRRFCVCV*	<1.2
RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha) (Z=MeGly)	1.97
RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha)	<1.47
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha)	3.22
RGGLCYCRGRFCVCVGR	1.57
RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	2.10
RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	1.42
RGGRLCYCRGRFCVCVGR*	2.40
RGLRXCYCRGRFCVCVGR* (X=Cha)	<1.47
RGWRLCYCRGRFCVCVGR	>3.57
RGGRVCYCRGRFCVCV*	<1.47

108

WLCYCRRRFCVCV	3.36
WLCFCRRRFCVCV	1.97
FLCFCRRRFCVCV	1.99
WYCYCRRRFCVCV	<1.6
WXCYCRRRFCVCV (X=Cha)	<1.6
WLCYCRRRFCVCVGR	<1.67
WXCYCRRRFCVCVGR (X=Cha)	<1.67
RLLRLCYCRRRFCVCVGR	<1.67
RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVal)	<1.67

Počáteční inokulum je přibližně 4xl0^5oCFU/ml.

Peptidy označené hvězdičkou jsou kyselinové formy; všechny ostatní jsou amidové formy.

Používají se také modifikované NCCLS testy, přičemž minimální inhibiční koncentrace (μς/πιΐ) se uvádí v tabulkách č. 28 a 29. Peptidy se připravovaly v 0,01% kyseliny octové v přítomnosti nebo bez (+HAS) nebo bez (-HAS) albuminu lidského séra v koncentraci 0,1%. Tabulka č. 28 ukazuje výsledky různých peptidů, které se testují proti různým organizmům; V tabulce č. 29 se uvádějí výsledky v přítomnosti albuminu lidského séra. Obecně lze říci, že HSA snižuje hodnotu MIC, protože předchází absorpci na plastových površích.

Tabulka č. 28

Minimální inhibiční koncentrace (gg/ml) peptidů testovaných v modifikovaném NCCLS testech

sekvence	P.aeruginosa	MRSA	VREF
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	8,00	8,00	2,00
RGWGLCYCRRRFCVCVGR	16, 00	16, 00

109

RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	8,00	16, 00	2, 00
WLCYCRRRFCVCVGR*	32, 0	32, 00
RGGLCYCRRRFCVCVGR	4,00	8,00	2, 00
RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly)	16, 00	16, 00
WLCYCRRRFCVCV	128,00	16, 00	3, 00
WYCYCRRRFCVCV	32,0	64, 00
WLCYCRRRFCVCVGR	>64	64,00
RLLRLCYCRRRFCVCVGR	32, 0	32, 00
RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVa1)	64,0	>128

Peptidy označené hvězdičkou jsou kyselinové formy; všechny ostatní jsou amidové formy.

Peptidy se připravily v 0,01% kyselině octové bez HSA.

Tabulka č. 29

MIC ^g/ml) v Mueller-Hintonově médiu

organizmus	médium	RGGRLCYCRRRF CVCVGR	PG-1 (amid)	PG-1 kysel.
	doplněno	-HSA	+HSA	-HSA	+HSA	-HAS
Staphylococcus aureus MSSA	ne	4		4		4
Staphylococcus aureus MRSA	ne	13,3	2	16	5,3	16
Enterococcus faecium VREF	ne -hematin +hematin	2	0,33 1 8	1,3	0,25	2
Bacillus subtilis	ne	0,7		0, 8		0,2
Streptococcus pneumoniae*	-hematin thematin		2 8
Streptococcus salivarius* viridans	-hematin thematin		0,12 0,5
Pseudomonas aeruginosa	ne	4	1, 33	5,3	0, 33	9,3
Klebsielle pneumoniae	ne	5,3		4		4
Serratia marcescens	ne	16		16		21
Escherichia coli	ne -hematin thematin	4	0,33 0,5 8	5,3	0,12	4
Haemophilus influenzae*	-hematin +hematin		neros 8
Acinetobacter calocoaceticus	ne	2		3		4
Neisseria meningitidis*	-hematin +hematin		8 32
Candida albicans	ne	8	4	16	8	16

110 a ·

Tabulka č. 30 uvádí hodnoty MIC různých peptidu proti různým organizmům.

Tabulka č. 30

MIC různých peptidů

MIC (gg/ml)
sekvence	MRSA	Psa	VREF	Can.
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	2-4	0.3-1.7	0.13	8, 16
WLCFCRRRFCVCV
FLCFCRRRFCVCV	5.3	>32	0.5	123
WYCYCRRRFCVCV*	42.7	32	1	>128
WXCYCRRRFCVCV* (X=Cha)
WLCYCRRRFCVCVGR*	27-32 32-53	0.25-0.5	>128
WXCYCRRRFCVCVGR* (X=Cha)
RLLRCYCRRRFCVCVGR	32t	321
RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVal)	>128t 64t
RGVCVCFRRRCYCLW
RGVCVCFRRRCYCLW	10.7	>32	0.5	32
VCVCFRRRCYCI.W	16	>32	1	>128
FCVCFRRRCFCLF	16	>32	2	>128
RGVCVCFRRRCYCRGGR	8	8	0.25	16
RGVCVCFRRRCYCLRGGR (all D)	21	8	4	32
RGVCVCFRRRCYCLW»	53	>32	2	128
RGVCVCYRXRCYCLW (X=MeGly)	13	32	1	64
WLCYCRXZYCVCVGR (X=MeGly) (Z=D-Arg)
RGFCVCFRRVCYCLW	>32	128	2	>128
WLCYCRRRFCVCVGR	11	48	0.21	128
WLCYCRRXFCVCVR (X=D-Arg)	5.3	32	0.25	64
WLCYCKKKFCVCVGR	6.7	4.3	0.21	32
Octyl-WLCYCRRRFCVCVGR
XLCYCRRRFCVCV (X=l-Nal	) 4	128	0.5	>123
WLCRGRFCVR*	>128 >128	>32	>128
WLCRGRFCFR	>128 >128	16	>128
WLCYRRVCVR	64	32	16	16
WLCYCOOOFCVCV	2	4	0.5	64
WLCYCXXXFCVCV (X=Dab)	2	2	0.5	32
WLCYCRRRFCVCV (all 0)	1	8	0.5	128
HWRLCYCRPKFCVCV	13..	3 32	1	>128
KWRLCYCRPKFCVCV	1	4	0.5	128

• ·

111

OWRLCYCRPKFCVCV	1	4	0.25	128
XWRLCYCRPKFCVCV (X=Dbu)	2.67	5.3	0.25	107
RWHLCYCRPKFCVCV	4.3	13.3	0.25	>128
RWKLCYCRPKFCVCV	2	13.3	0.5	107
RWOLCYCRPKFCVCV	1	2.7	0.25	43
RWXLCYCRPKFCVCV (X=DbU)	2	2	0.5	64

WLCYCKXKFCVCVGR (X=Tic)

FCYCKXKFCYCV (X-Hyp)

WLXXXRHRFXVXV (X=hCys)	16	64
WOLCYCOXOFCVCVO (X=TÍC)	1	2
OFCVCVOXOFCVCVO (X=TÍC)	16	85
OWOLCYCOXOFCVCV (X=Tic)	4	11
OFCVCXOLCYCFO (X=TÍC)	32	>128
WLCYCKKKFCVCV	2	5.3
OWOLCYCOXOFCVCV (X=Hyp)	1	2.3
WLCYCOXOFCVCVO (X=Pba)
WLCYCOOOFCVCV (all D)
XFCYCLRXFCVCVR* (X=D-Arg)	8	48
WLCYCRRXFCVCVZX* (X=D-Arg)	64	48

(Z=MeGly)

Peptidy označené hvězdičkou jsou kyselinové formy; všechny ostatní jsou amidové formy.

MRSA je kmen S.aureus rezistentní na meticilin

Psa je kmen P.aeruginosa

VREF je kmen E.faecium rezistentní na vankomycin can je C. albicans t označuje test bez přítomnosti HSA nebo BSA • 4 · ·· ·· · · ·· • · · · · · · · · ··· • · · 4 4 444··· • * · · 4 · · 44 4 · * ·« • · · · · · · · ··

4·· ·· «· · ··· ·«

112

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Antimikrobiálni peptid, který obsahuje přibližně 10 až 30 aminokyselinových zbytků a obsahuje aminokyselinovou sekvenci:

   ( I ) XX-X2-X3-X4-X5-C6-X7-C8-X9-X1O-X11-X12-C13-X14-CX5-X16-XÍ7-X18 nebo farmaceuticky přijatelnou sůl nebo jejich formu acetylovanou na N-konci nebo amidovanou na C-konci nebo jejich esterifikovanou formu, kde každý z C₈ a On je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý nezávisle je cysteinu podobná, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina;

   každý z C₈ a Ci₅ je nezávisle cysteinu podobná, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina;

   každý z Χχ-Χ₅ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

   každý z X₇ a X_i4 je nezávisle hydrofobní nebo malá aminokyselina;

   každý z X₉ a X_i2 je nezávisle přítomen nebo není přítomen;

   X9-X12 dohromady jsou schopny vytvořit reverzní ohyb, v případě, že jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I) a nejméně jeden z Χ₉-Χχ₂ musí být bazická aminokyselina;

   každý z X₁₆-X₁₈ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

   a kde nejméně okolo 15% až 50% aminokyselin, které jsou obsaženy v antimikrobiálním peptidu, je bazických, přičemž uvedený antimikrobiálni peptid má při hodnotě fyziologického pH skutečný náboj nejméně +1;

   • · · · · · · · · · · • · · · « · · · · · · · • · » · · · · · · · · • · ♦ · · · · · · ··» · · ··· ···· ··· • · · · · · ·· ·· ··

   113 pod podmínkou, že všechny X₃-X₄ jsou přítomny a žádný z Xi~X₄ není hydrofóbní aminokyselina, pak nejméně jeden z X₅, Cg, Xg, Xi2, C13 nebo X₃₆ nesmí být přítomen nebo X₅ musí být bazický.

   2. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který obsahuje dva disulfidové můstky a je v nativní formě.

   3. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který obsahuje jeden disulfidový můstek a je ve formě bullet nebo křte.

   4. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který neobsahuje žádný disulfidový můstek a je ve formě snake.

   5. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který má při fyziologickém pH skutečný náboj nejméně okolo +3.

   6. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který obsahuje okolo 10 až 24 aminokyselinových zbytků a kde:

   každý z C₈ a C_X3 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle malá, hydrofóbní nebo polární/velká aminokyselina nebo cystein;

   každý z C₆ a C_i5 je nezávisle malá, polární/velká nebo hydrofóbní aminokyselina nebo cystein;

   každý z Xi-X₅ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo malá aminokyselina a libovelné dva z Xi-X₅ mohou být hydrofóbní každý každý a jestliže hydrofóbní aminokyselinou; z X₇ a Xn je z Xg a Xi2 je je přítomen, aminokyselina;

   nezávisle nezávisle pak každý hydrofóbní aminokyselina; přítomen nebo není přítomen je nezávisle bazická nebo • · φ φ φφφ · φ « φ φφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφ «φ φφ φφ φφ φφ

   114

   Χίο je bazická, hydrofóbni nebo malá aminokyselina nebo prolin;

   X_x6 je přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak je bazická, hydrofóbni, nebo malá aminokyselina;

   každý z X₁₇ a X_i8 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo malá aminokyselina;

   7. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který obsahuje přibližně 10 až 18 aminokyselinových zbytků a kde:

   každý z C₈ a C13 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle malá, polární/velká nebo hydrofóbni aminokyselina nebo cystein;

   každý z Cg a Cis je nezávisle malá, polární/velká nebo hydrofóbni aminokyselina nebo cystein;

   každý z X₇-X₄ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo malá aminokyselina a jeden libovolný z Xi-X₄ může být hydrofóbni aminokyselinou;

   každý z X₅ a X_1S je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická nebo hydrofóbni aminokyselina;

   každý z X₇ a X_i4 je nezávisle hydrofóbni aminokyselina;

   X₉ je přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak je bazická nebo hydrofóbni aminokyselina;

   Xio je bazická nebo malá aminokyselina nebo prolin;

   Xn je bazická nebo hydrofóbni aminokyselina;

   Xi2 je přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak je hydrofóbni aminokyselina;

   X₁₇ je přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak je nezávisle malá aminokyselina; a

   115

   X₁₈ je přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak je nezávisle bazická aminokyselina.

   8. Antimikrobiálni peptid podle C₆, C₈, C13 a C15 je cystein a každý z hydrofóbni aminokyseliny.

   nároku 1, kde každý z X₇ a X₁₄ nezávisle jsou

   9. Antimikrobiálni peptid podle jsou každý nezávisle I,V,L,W,Y nebo F.

   nároku 8, kde X₇ a Xi₄

   10. Antimikrobiálni peptid podle nároku

   I,F,Y nebo W a Χχ₄ je I,V,L,W,Y nebo F.

   9, kde

   X? je

   11. Antimikrobiálni peptid podle nároku nejsou přítomny.

   1, kde

   X1-X4

   12. Antimikrobiálni peptid podle nároku jeden z Χχ-Χ₄ je hydrofóbni aminokyselina.

   1, kde nejméně

   13. Antimikrobiálni hydrofóbni aminokyselina peptid podle je I,V,L,W,F nároku

   12, nebo Y.

   kde uvedená

   14. Antimikrobiálni peptid podle nároku 1, kde nejméně jeden z X9-X12 je hydrofóbni aminokyselina.

   15. Antimikrobiálni peptid podle nároku 1, kde Xi a X₉ jsou každý nezávisle R,K,Orn, Dab, Har nebo hydrofóbni aminokyselina.

   16. Antimikrobiálni peptid podle nároku 1, kde X₂ a X₃ jsou každý nezávisle G, A, S, T, I, V, L, F, Y nebo W.

   • · «·· · · · · · · · · · • · · · · · · * · · · • 9 · · · »· · 9 ··· · ·

   9 9 9 9 9 9 9 9 9

   9 99 9 9 9 9 9 9 9 9

   116

   17. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, kde X₄ je R,

   K, H, Orn, Dab, G, A, S, T, F, Y nebo W.

   18. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, kde X? je

   R,K,H, Orn, Dab, Har, I, V, 1, Nle, W, Y nebo F a X₁₂ je I,

   L, V, W, F nebo Y.

   19. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, kde X₉-X₁₂ dohromady jsou tři aminokyselinové zbytky γ-ohybu.

   20. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, kde X₉-X_i2 dohromady jsou čtyři aminokyselinové zbytky β-ohybu.

   21. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, kde uvedený β-ohyb je ZZZG, ZZZF, ZZSG, ZZAL, ZGZL, ZFZL, ZPZV, ZPZF,

   ZGZY, IZGZ, LZZF nebo YZGZ, kde každé Z je nezávisle L- nebo

   D-enantiomér R, K, Dbu nebo Orn.

   22. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, kde všechny aminokyseliny jsou D-enantioméry.

   23. Antimikrobiální peptid podle nároku 1, který je.

   vybrán ze skupiny, jenž zahrnuje

   117

   WLCFCRRRFCVCV (SEQ ID NO:2); FLCFCRRRFCVCV (SEQ ID NO:3); WYCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:4); WXCYCRRRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:5) ; WLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:6); WXCYCRRRFCVCVGR (X=Cha) (SEQ ID NO:7); RLLRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:8); RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVal) (SEQ ID NO:9); RGVCVCFRRRCYCLW (SEQ ID NO:10); RGVCVCFRRRCYCLW (SEQ ID NO:11) ; VCVCFRRRCYCLW (SEQ ID NO:12); FCVCFRRRCFCLF (SEQ ID NO:13); RGVCVCFRRRCYCRGGR (SEQ ID NO:14); RGVCVCFRRRCYCLRGGR (a11 D) (SEQ ID NO:15); RGVCVCFRRRCYCLW (SEQ ID NO:15); RGVCVCYRXRCYCLW (X=MeGly) (SEQ ID NO:17); WLCYCRXZYCVCVGR (X=MeGly) (Z=D-Arg) (SEQ ID NO:18); RGFCVCFRRVCYCLW (SEQ ID NO:19); WLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:20); WLCYCRRXFCVCVR (X=D-Arg) (SEQ ID NO:21); WLCYCKKKFCVCVGK (SEQ ID NO:22); Octyl-WLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:23); XLCYCRRRFCVCV (X=l-Nal) (SEQ ID NO:24); WLCRGRFCVR (SEQ ID NO:25); WLCRGRFCFR (SEQ ID NO:26); WLCYRRVCVR (SEQ ID NO:27); WLCYCOOOFCVCV (SEQ ID NO:28);

   118 • ·· ·· ♦· ·· ·· ♦ · » ···· · ♦ · ♦ • · ··♦ · · · · ··· · 9 ··* · · · · · · · ··· ·· · · ·· · · · ·

   WLCYCXXXFCVCV (X=Dab) (SEQ ID NO:29) WLCYCRRRFCVCV (all D) (SEQ ID NO:30) HWRLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:31) KWRLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:32) OWRLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:33) XWRLCYCRPKFCVCV (X=Dbu) (SEQ ID NO:34) RWHLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:35) RWKLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:36) RWOLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:37) RWXLCYCRPKFCVCV (X=Dbu) (SEQ ID NO:38) WLCYCKXKFCVCVGR (X=Tic) (SEQ ID NO:39) FCYCKXKFCYCV (X=Hyp) (SEQ ID NO:40) WLXYXRRRFXVXV (X=hCys) (SEQ ID NO:41) WOLCYCOXOFCVCVO (X=TÍc) (SEQ ID NO:42) OFCVCVOXOFCVCVO·(X=Tíc) (SEQ ID NO:43) OWOLCYCOXOFCVCV (X=Tic) (SEQ ID NO:44) OFCVCXOLCYCFO (X=Tic) (SEQ ID NO:45) WLCYCKKKFCVCV (SEQ ID NO:46) OWOLCYCOXOFCVCV (X=Hyp) (SEQ ID NO:47) WLCYCOXOFCVCVO (X=Pba) (SEQ ID NO:48) WLCYCOOOFCVCV (all D) (SEQ ID NO:49) XFCYCLRXFCVCVR (X=D-Arg) (SEQ ID NO:50) WLCYCRRXFCVCVZX (X=D-Arg) (Z=MeGly) (SEQ ID NO:51) PC11 LCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:52) PC12 RCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:53) PC15 RGGRLCYCRRRFCVCR (SEQ ID NO:54) PC16 RCYCRRRFCVCR (SEQ ID NO:55) PC17 LCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:56) PC18 LCYARRRFAVCV (SEQ ID NO:57) PC19 RCYARRRFAVCR (SEQ ID NO:58) PC20 LAYCRRRFCVAV (SEQ ID NO:59) PC21 RAYCRRRFCVAR (SEQ ID NO:60) PC22 RGGRLCY RR VCV (SEQ ID NO:61) PC31 GGRLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:62)

   119 • ·· ·· ·· ·· 9 · · · ·· • 9 9 9 999

   9 9 9 9 9 9 99

   9 9 9 9 99

   9 9 9 999 9

   PC3 2 PC33 RGRLCYCRRRFCVCV GRLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:63) (SEQ ID NO:64) PC34 RRLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:65) PC35 RLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:66) PC3 6 RRCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:67) PC3 7 CYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:68) PC44 RGGRLCYCRRRFCVC (SEQ ID NO:69) PC47 RGGRLCY RRRF VCV (SEQ ID NO:70) PC48 RGWRLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:71) PC37a CYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:72) PC45 RGGRLCYCRRRFCV (SEQ ID NO:73) PC72 LCYCRRRFCVC (SEQ ID NO:74) PC64 LCYTRRRFTVCV (SEQ ID NO:75) PC64a LTYCRRRFCVTV (SEQ ID NO:76) PC31a GGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:77) PC32a RGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:78) PC33a GRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:79) PC34a RRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:80) PC35a RLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:81) PC3 6a RRCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:82) PC44a RGGRLCYCRRRFCVCR (SEQ ID NO:83) PC47a RGGRLCY RRRF VCVGR (SEQ ID NO:84) PC48a RGWRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:85) PC54 RGWRLAYCRRRFCVAVGR (SEQ ID NO:86) PC61 RCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:87) PC62 LCYCRRRFCVCR (SEQ ID NO:88) PC63 VCYCFRRFCYCV (SEQ ID NO:89) PC65 LCYTRPRFTVCV (SEQ ID NO:90) PC66 LCYTRGRFTVCV (SEQ ID NO:91) PC67 LCYFRRRFIVCV (SEQ ID NO:92) PC68 LCYFRPRFIVCV (SEQ ID NO:93) PC69 LCYTFRPRFVCV (SEQ ID NO:94) PC70 LCYTFRGRFVCV (SEQ ID NO:95) PC74 CYCFRRFCVC (SEQ ID NO:96) PC77 LCYCRRRRCVCV (SEQ ID NO:97)

   120

   Φ φ · φ φ Φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ • Φ φ φ • φ · 1 ♦ φφ > i • Φ • • φ φ 9 · φ φ • φφΦ Φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ

   PC78 LCYCFRRRCVCV (SEQ ID NO 98) ; PC79 LCYCRFRRCVCV (SEQ ID NO 99) ; PC80 LCYCRRFRCVCV (SEQ ID NO 100) PC81 LCYCRRFFCVCV (SEQ ID NO 101) PC82 LCYCRFFRCVCV (SEQ ID NO 102) PC83 LCYCFFRRCVCV (SEQ ID NO 103) PC84 LCYCFRRFCVCV (SEQ ID NO 104) PC85 LCYCFRFRCVCV (SEQ ID NO 105) PC85 LCYCRFRFCVCV (SEQ ID NO 106) PC87 LCYCFRFFCVCV (SEQ ID NO 107) PC88 LCYCFFRFCVCV (SEQ ID NO 108) PC89 LCYCFFFRCVCV (SEQ ID NO 109) PC90 LCYCRFFFCVCV (SEQ ID NO 100) RGGRLCY RR VCVGR (SEQ ID NO 111) PC91 YCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 112) PC95 ICYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 113) PC96 FCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 114) PC97 WCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 115) PC99 RCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 115) PC109 RLCYTRGRFTVCV (SEQ ID NO 117) PC11O LCYTRGRFTVCVR (SEQ ID NO 118) PC111 RLCYTRGRFTVCVR (SEQ ID NO 119) PC112 LCYCHHHFCVCV (SEQ ID NO 120) PC113 LCYTHHHFTVCV (SEQ ID NO 121) RGGLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 122) RGGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 123) RGGGLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO 124) RGGGLCYCRRGFCVCFGR (SEQ ID NO 125) RGGGLCYCRRPFCVCVGR (SEQ ID NO 125) RGGGLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO 127) RGGRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID NO 128) RGGLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO 129) RGGRLCYCXGRFCVCVGR (X=Cit) (SEQ ID NO 130) XGGRLCYCRGRFCVCVGR (X=Cit) (SEQ ID NO 131) RGGRVCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO 132)

   • · • · • ·

   121

   RGGGLCYCFPKFCVCVGR (SEQ ID NO:133) RGWGLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:134) RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID NO:135) RGWRLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:136) RGWRLCYCXPRFCVCVGR (X=Cit) (SEQ ID NO:137) RWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:138) RGWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:139) RGWRACYCRPRFCACVGR (SEQ ID NO:140) GWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:141) RWRLCYCKGKFCVCVGR (SEQ ID NO:142) RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID NO:143) GGWRLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:144) RGGWLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:145) RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID NO:146) RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID NO:147) RLLRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:148) RGLRXCYCRC-RFCVCVGR (X=Cha) (SEQ ID NO: 14 9) RGGRLCYCRXRZCVCWGR (X=MeGly) (Z=Cha) (SEQ ID NO:150) RGGRWCVCRXRZCYCVGR (X=MeGly) (Z=Cha) (SEQ. ID NO:151) RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha) (SEQ ID NO:152) RGGRWCVCRGRXCYCVGR (X=Cha) (SEQ ID NO:153) RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X=MeVal) (SEQ ID NO:154) LCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:155) LCYCRRCFCVCV (SEQ ID NO:156) LCYCRRRFCVCF (SEQ ID NO:157) LCACRRRACVCV (SEQ ID NO:158) LCYCRXRFCVCV (X =D-Arg) (SEQ ID NO:159) LCWCRRRFCVCV (SEQ ID NO:160) WCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:161) LCYCRRRXCVCV (X =hPhe) (SEQ ID NO:162) LCYCRRRXCVCV (X= =Phe(4-Cl)) (SEQ ID NO:163) XCYCRRRFCVCV(X= Cha) (SEQ ID NO:164) LCYCRRRFCXCV (X :=D-His) (SEQ ID NO:165) LCYCRRRXCVCV (X=MeGly) (SEQ ID NO:166)

   122

   LCYCRRRXCVCV (X=MePhe) (SEQ ID NO:167) j LCYCRRRFCXCV (X=MeVal) (SEQ ID NO:168) ; LCXCRRRXCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:169) ; LCGCRRRGCVCV (SEQ ID NO:170) ; LCACRGRACVCV (SEQ ID NO:171); RACYCRPRFCACV (SEQ ID NO:172); RLCYCRPRFCVCF (SEQ ID NO:173) ; RLCYCRPRFCVCV (SEQ ID NO:174); KLCYCKPKFCVCV (SEQ ID NO:175); RLCACRGRACVCV (SEQ ID NO:176); RLCYCRXRFCVCV (X=MeGly) (SEQ ID NO:177); RXCFCRPRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:178); RWCFCRPRFCVCV (SEQ ID NO:179); WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:180) ; WLCFCRRRFCVCV (SEQ ID NO:181) ; FLCFCRRRFCVCV (SEQ ID NO:182) ; WLCFCRRRXCVCV (X=MePhe) (SEQ ID NO:183) ; WYCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:184); WXCYCRRRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:185); RXCFCRGRZCVCV (X=Cha) (Z=MePhe) (SEQ ID NO:186); XLCFCRRRZCVCV (X=Cha) (Z=MePhe) (SEQ ID NO:187) ; RLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:188); WLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:189); WXCYCRRRFCVCVGR (X=Cha) (SEQ ID NO:190); RLCYCRGPFCVCR (SEQ ID NO:191); RRWC FVCYAGFCYRCR (SEQ ID NO:192) ; RRCYCRGRFCGCVGR (SEQ ID NO:193) ; RWRCYCGRRFCGCVGR (SEQ ID NO:194) ; RARCYCGRRFCGCVGR (SEQ ID NO:195) ; GWRCYCRGRFCGC (SEQ ID NO:196) ; RGWACYCRGRFCVC (SEQ ID NO:197) ; RRCYGRRRFGVCVGR (SEQ ID NO:198) ; RGWRLCYGRGRFKVC (SEQ ID NO:199) ; RGWRLCYCRGRFCVC (SEQ ID NO:200) ;

   123

   CYCRRRFCVCF (SEQ ID NO:201) RGWRLCYCRXRFCVC (X=MeGly) (SEQ ID NO:202) RGWRGCYCRXRFCGC (X=MeGly) (SEQ ID NO:203) LCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:204) LCYCKPKFCVCVGK (SEQ ID NO:205) LCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:206) LCYCRPRFCVCVGRGR (SEQ ID NO:207) RRWCYCRPRFCVCVR (SEQ ID NO:208) WRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:209) GWLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:210) RWLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:211) RLLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:212) RWRLCYCRPRFCVCV (SEQ ID NO:213) RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha) (Z=MeGly) (SEQ ID NO:214) RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:215) RGGRVCYCRGRFCVCV (SEQ ID NO:216) LCYCRXRFCVCV (X=D-Ala) (SEQ ID NO:217) LCYCKPKFCVCV (SEQ ID NO:218) VCYCRPRFCVCV (SEQ ID NO:219) LCYCRPRFCVCW (SEQ ID NO:220) LCYRRPRFRVCV (SEQ ID NO:221) RGWRLCYCRGRXCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:222) RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha) (Z=MeGly) (SEQ ID NO:223) RXRLCYCRGRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:224) RGGGLCYARGWIAFCVGR (SEQ ID NO:225) RGGGLCYARGFIAVCFGR (SEQ ID NO:226) RGGGLCYARPRFAVCVGR (SEQ ID NO:227) RGGGLCYTRPRFTVCVGR (SEQ ID NO:228) RGGGLCYARKGFAVCVGR (SEQ ID NO:229) RGGRLCYARRRFAVCVGR (SEQ ID NO:230) RGGGLCYKRGFIKVCFGR (SEQ ID NO:231) RGGGLCYKRGWIKFCVGR (SEQ ID NO:232) RGGGLCYRLPKFRVCVGR (SEQ ID NO:233) RGGGLCYRLPGFRVCVGR (SEQ ID NO:234)

   124

   rgwrgcykrgrfkgcvgr (SEQ ID NO:235); lcykrgrfkvcv (SEQ ID NO:236); ICYRPRFVCVGR (SEQ ID NO:237); WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:238); rlcycrrrfcvcv (SEQ ID NO:240); RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR (SEQ ID NO:241); RRRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:242);

   a jejich formy s acetylovaným N-koncem a amidovaným C-koncem nebo jejich esterifikované formy.

   24. Rekombinantni expresivni systém pro produkci antimikrobiálniho peptidů podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující uvedený peptid, která je operabilně spojena s kontrolními sekvencemi, což vede k dosažení exprese.

   25. Rekombinantni hostitelská buňka nebo její potomstvo, vyznačující se tím, žeje modifikována, aby obsahovala expresivni systém podle nároku 25.

   26. Způsob produkce antimikrobiálniho peptidů nebo jeho meziproduktu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci modifikované hostitelské buňky nebo jejího potomstva podle nároku 24 za podmínek, kde dochází k produkci uvedeného peptidů; a získání antimikrobiálniho peptidů z kultury.

   27. Antimikrobiální farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje antimikrobiální peptid podle nároku 1 ve směsi s nejméně • · • 9 ·· ···· • · · · · · · · · • ···· ···· • 99 9 9 9 9 ♦ ·· ·· • 9 9 9 9 9 99

   99 ···9

   125 jedním farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.

   28. Antimikrobiální kompozice týkající se prostředí určená pro aplikaci na rostliny vyznačuj ící se tím, že obsahuje antimikrobiální peptid podle nároku 1 ve směsi s nejméně jedním nosičem, ředidlem nebo excipientem, který je přijatelný pro prostředí.

   29. Způsob prevence růstu viru nebo mikrobu, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt kompozice, která podporuje růst zmíněného viru nebo mikroba s množstvím antimikrobiálního peptidu podle nároku 1, který brání uvedenému růstu.

   30. Způsob deaktivace endotoxinu gram-negativních bakterií, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt uvedeného endotoxinu s množstvím antimikrobiálního peptidu podle nároku 1, který deaktivuje uvedený endotoxin.

   31. Protilátky, vyznačující se tím, že specificky reagují s antimikrobiálním peptidem podle nároku 1.

   32. Způsob léčby nebo prevence mikrobiální nebo virové infekce subjektu, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství antimikrobiálního peptidu subjektu, který potřebuje takovou léčbu, přičemž uvedený peptid obsahuje přibližně 10 až 30 aminokyselinových zbytků a aminokyselinovou sekvenci:

   ( I ) K1 ^— X2 ~X3 ^— X4 X5 ^— Gζ ~X7 ~Cg “X9 ~X 1Q~X11 “X12 ~ C} 3 ~X14 “C15 ^— X} ς ”X17 ~X1 Q

   126 * ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· · · · · • · · ···· · · ·· • · · · · · · ·* ··· · · • · · * · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·* ·· nebo farmaceuticky přijatelnou sůl nebo jejich formu acetylovanou na N-konci nebo amidovanou na C-konci nebo jejich esterifikovanou formu, kde každý z C₀ a C13 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý nezávisle je cysteinu podobná, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina;

   každý z C₆ a C₁₅ je nezávisle cysteinu podobná, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina;

   každý z Xi~X₅ je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

   každý z X₇ a X_i4 je nezávisle hydrofobní nebo malá aminokyselina;

   každý z X₉ a X_i2 je nezávisle přítomen nebo není přítomen;

   X9-X12 dohromady jsou schopny vytvořit reverzní ohyb, v případě, že jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I) a nejméně jeden z X9-X12 musí být bazická aminokyselina;

   každý z X16-X18 je nezávisle přítomen nebo není přítomen a jestliže je přítomen, pak každý je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

   a kde nejméně okolo 15% až 50% aminokyselin, které jsou obsaženy v antimikrobiálním peptidu, je bazických, přičemž uvedený antimikrobiální peptid má při hodnotě fyziologického pH skutečný náboj nejméně +1;

   33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je způsobena Staphylococcus aureus.

   127

   34. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že antimikrobiální peptid je vybrán ze skupiný, kterou tvoří

   9

   RGWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO: 139) GWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO: 141) ; XCYCRRRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO: 164; A WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO: 180) . 35. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u jící tím, že antimikrobiální infekce je způsobena

   Pseudomonas.

   36. Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že antimikrobiální peptid je vybrán ze skupiný, která zahrnuje

   RGGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO. : 1); RGGRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO. : 239); RGGGLCYTRPRFTVCVGR (SEQ ID NO. : 228); a RLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO: 66) . 37. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u jící tím, že antimikrobiální infekce je způsobena

   H.pylori.

   38. Způsob podle nároku 37, vyznačuj ící se tím, že antimikrobiální peptid je vybrán ze skupiny zahrnuj ící

   WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:180);

   RXCFCRPRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:178);

   128

   44 • 4 44 ·· • 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • · 4 4 4 4 4 44 4 « 4 • 4 4 · 4 4 * 44 4 4 44 44

   RGGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:1); RGWGLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO :134}; RLCYCRPRFCVCVGR .(SEQ ID NO:138); RGWRLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID NO:136); RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR (SEQ ID NO:241); RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X=Cha) (SEQ ID NO:149); GWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID NO:139); RLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:66) ; WLCYCXXXFCVCV (X=Dab) (SEQ ID NO:29); OWRLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:33); RWOLCYCRPKFCVCV (SEQ ID NO:37); RRCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:82); XCYCRRRFCVCV (X=Cha) (SEQ ID NO:164); RRRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:242); RRRLCYCRRRFCVCVGR (all D) (SEQ ID NO:243).