KR19990071546A - 조정된 프로테그린 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연 발생하는 프로테그린 펩티드와 연관된 항균성 펩티드와, 이와 같은 펩티드를 이용하여 감염의 치료 또는 예방하는데 이용하는 방법에 관계한다.

Description

조정된 프로테그린

발명의 배경

동물이나 식물에서 감염에 대한 방어기작중에 하나는 항균성 및 항바이러스성 활성을 가지는 펩티드를 생산하는 것이다. 다양한 종류의 펩티드가 식물과 동물 조직으로부터 분리되었다. PCT 출원 Wo 95/03325(1995년 2월 2일 공고)에는 본 주제에 대한 문헌을 복습하는 것을 포함한다. 이와 같은 펩티드에는 4개의 인베이언트(invariant) 시스테인을 포함하는 17-18 아미노산 펩티드인 타치플라신(tachyplesins), 데펜신(defensins), β-데펜신, 곤충 데펜신을 포함하는데, 이때, 6개의 인베리언트 시스테인과 식물에서도 발견되는 항박테리아성 펩티드와 단백질을 가지는 것을 특징으로 하는 다소 간 펩티드이다.

모출원에서는 "프로테그린"이라는 새로운 종류의 항균성 펩티드를 제공하는데 이는 돼지 백혈구세포에서 분리한 대표적인 종류이다. 자연상태에서 양쪽성을 나타내는 프로테그린 펩티드는 광역의 항균성 활성을 나타낸다. 따라서, 이와 같은 펩티드는 식물과 동물에서 항균성, 항-곰팡이성, 항-바이러스성 물질에 유용하다.

본 발명의 프로테그린 펩티드의 일부를 분리한 것이 Kokryakov, V.N. et al., 1993, FEBS Lett 377:231-236 (July issue). 에의해 보고되었다. 이들 문헌에서는 새로운 프로테그린 서열에 대해 상술하고 있는데 이 서열과 이의 전구물질은 이의 분리도니 cDNA 클론에서 유추한 것이다. Zhao C. et al., 1994, FEBS Lett 346:285-288. 돼지 호중구로부터 분리한 양이온 펩티드에 대해 상술하는 추가 논문은 Mirgorodskaya, O.A. et al., 1993, FEBS Lett 330:339-342. 에서 상술하였다. Storici, P. et al., 1993, Biochem Biophys Res Comm 196:1363-1367는캐테린-유사 프로서열과 함께 돼지 백혈구세포 항균성 펩티드를 인코드하는 DNA 서열의 회수에 대해 상술하였다. 이하에서 상술하는 펩티드는 프로테그린의 하나이다. 프로테그린과 관련된 추가 공개로는 Harwig S.S.L., et al., 1995, J Peptide Sci 3:207; Zhao, C., et al., 1995, FEBS Lett 376:130-134; Zaho, C. et al., 1995, FEBS Lett 368:197-202; Miyakawa, Y. et al., 1996, Infect Immun 64: 926-932; Yasin, B. et al., 1996, Infect Immun 64:709-713; Qu, X-D et al., 1996, Infect Immun 64:1240-1245; Aumelas, A. et al., 1996, Eur J. Biochem 237:575-583; Mangoni, M.E. et al., 1996, FEBS Lett 383:93-98; Steinberg et al., 1996, "Protegrins: Fast Acting Bacterial Peptides," Presented at 8th Intl. Svmposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, Aix les Bains, France, June 23-26, 1996; Steinberg et al., 1996, "Broad Spectrum Antimicrobial Activity of Protegrin Petides, " Presented at 36th Interscience Conference on Antimicrobial Aqents and Chemotherapy, New Orleans, LA, September 15-18, 1996; Kung et al., 1996, "Protegrin Protects Mice From System Infection By Antibiotic-Resistant Pathogens, "presented at 36th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, New Orleans, LA, September 15-18, 1996; and Steinberg et al., 1996, "In Vitro Efficacy of Protegrins Against Helicobacter Pylori," presented at 36th Interscience Conference on Antimicrobial Aqents and Chemotherapy, New Orleans, LA, September 15-18, 1996.등이 있다.

프로테그린은 엔도톡신 예를 들면, 그램 음성 종으로 간주되는 그램 음성 박테리아에서 유도한 리포폴리사카라이드(LPS) 조성물에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 프로테그린은 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis)와 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae)와 같은 성관계에의해 감염되는 것과 연관된 유기체의 성장을 저해하는데 효과가 있었다.

본 발명은 저항성이 낮은 광역의 활성을 가지는 신속하게 작용하는 살균제의 성질을 제공하는 새로운 프로테그린에 관계한다. 또한, 본 발명의 프로테그린은 가장 효과적으로 저해되는 미생물 또는 바이러스에 대한 활성 범위를 조정하고 이와 같은 저해가 발생하는 조건에 대해 활성 범위를 조정하는 추가 기회를 제공한다. 이와 같은 경우에 프로테그린은 4개 N-단부 아미노산중 적어도 하나에서 결손 또는 다른 지정된 잔지의 적어도 하나의 결손 또는 다른 종류의 아미노산으로 특정 아미노산의 치환등에의해 모출원의 경우와는 상이하다.

발명의 요약

본 발명의 한 특징에 있어서, 본 발명은 약 10-30 아미노산을 포함하는 항균성 펩티드에 관계하는데 이때, 두 가지 주요 원소를 가지는 "코어" 구조를 특징으로 하는데, 안티-페어랠(anti-parallel) β-쉬트를 만드는 두 가닥으로 된 리버스-턴(turn)이 된다. 일반적으로, 분자의 β-쉬트 부분은 양쪽성인데, 한면은 소수성이고 다른 한면은 친수성을 가진다. 펩티드는 리버스-턴 부분에 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함하고, 이는 생리적인 pH에서 적어도 +1의 네트 전하를 가진다. 항균성 펩티드는 선택적으로 N-단부에서 아실화될 수 있고 또는 C-단부에서 아미드화되거나 또는 에스테르화되고, 그리고 이황화결합이 없거나 한 개 또는 두 개의 결합을 가진다.

적절한 구체예에서, 본 발명은 약 10-30개 아미노산 잔기로 구성된 항균성 펩티드를 제공하는데 이는 다음과 같은 서열을 포함한다;

또는 이의 제약학적 염 또는 N-단부가 아실화된 또는 C-단부가 아미데이트화된 또는 이의 에스테르형이 될 수 있는데;

C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 시스테인형-, 염기성, 작은 극성 또는 큰 극성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

C₆또는 C₁₅각각은 시스테인형-, 염기성, 작은 극성 또는 큰 극성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₁-X₅각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 염기성, 소수성, 극성/큰 또는 작은 아미노산일 수 있고;

X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 또는 작은 아미노산일 수 있고;

X₉또는 X₁₂각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고;

X₉-X₁₂는 서열 1의 아미노산에 포함된 경우에 리버스-턴에 영향을 비칠 수 있고, X₉-X₁₂중 적어도 하나는 염기성 아미노산이다;

X₁₆-X₁₈각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 각각은 염기성, 소수성, 극성/큰 또는 작은 아미노산일 수 있다; 이때, 항균성 펩티드로 구성된 아미노산의 약 15% 내지 최고 50%는 염기성 아미노산이고 항균성 펩티드은 네트 전하는 생리 pH에서 적어도 +1이다.

본 발명의 펩티드는 그램 음성(gram-negative) 박테리아, 그램 양성(gram-positive) 박테리아, 이스트, 곰팡이 및 원생동물을 포함한 광범위한 범위의 미생물을 표적으로 하는 살충제가 되는 항-미생물 활성을 나타낸다. 따라서, 펩티드는 다양한 용도에서 항균제로써 사용될 수 있다. 예를 들면, 펩티드를 이용하여 의료 장비, 음식, 화장품, 콘택트 렌즈, 약물 또는 다른 영양소를 포함하는 물질 등의 다양한 물질을 보족하거나 또는 감염을 예방할 수 있다. 펩티드는 식물 및 동물과 연관된 미생물 감염성 질환을 치료하거나 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

또 다른 측명에서는, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 생산하는데 유용한 재조합 물질과 이들 펩티드를 생산하기 위한 발현 시스템을 포함하도록 변형된 동물 및 식물에 관계한다.

또 다른 측명에서는 본 발명은 제약학적 조성물과 활성 물질로써 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물을 식물에 사용할 수 있고 이때 조성물에는 펩티드 생산을 위한 발현 시스템을 포함하거나 또는 이와 같은 펩티드를 인코드하는 핵산 서열의 발현을 위한 것이다.

또 다른 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 합성하는 방법과 이들 펩티드에 특이적인 항체를 합성하는 방법 및 보존제로써 이들 펩티드의 용도에 관계한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 미생물의 생장을 방해하기 위한 전술한 펩티드 도는 이의 조성물을 이용하는 방법에 관계한다. 이 방법은 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 펩티드 또는 조성물의 항균 효과량을 미생물에 접촉시키는 것이다. 적절한 구체예에서, 박테리아는 펩티드 또는 조성물의 살균 효과량과 접촉하게 된다.

마지막으로, 본 발명은 실물 및 동물에 관련된 미생물 감염 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 전술한 펩티드 또는 조성물을 이용하는 방법에 관계한다. 이 방법은 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 펩티드 또는 조성물의 항균 효과량을 식물 또는 동물에 투여하는 것이다. 이와 같은 질환에는 결막염, 각막염, 각막 괴양등과 같은 안과 감염, H. 폴로리(pylori)와 연관된 위 괘양, 성병(STDs), 그램 음성 폐혈증 등을 포함한다. 본 발명의 펩티드에의해 치료될 수 있는 또는 예방할 수 있는 임상적으로 연관된 감얌에는 반코마이신-저항성 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Staphlyococcus aureus) 및 페니실린 저항성 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)와 같은 다양한 약물 저항성 변인균에 의한 전신 감염을 포함한다.

1. 관련 출원

본 발명은 NIH 등록 번호 A122839의 기금으로 이루어 진다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.

본 출원은 1996년 8월 1일자 출원된 08/960,921의 연속출원이고, 이는 1996년 5월 17일자 출원된 08/649,811의 연속출원이고, 이는 1995년 11월 22일자 출원된 08/562,346의 연속출원이고, 이는 1995년 7월 7일자 출원된 08/499,523의 연속출원이고, 이는 1995년 5월 26일자 출원된 08/451,832호의 연속출원이고, 이는 우선권 주장을 PCT/US94/08305(WO 95/03325)을 한 것으로 1994년 5월 17일 출원된 08/243,879호의 연속출원이고, 이는 1994년 1월 13일자 출원된 08/182,483호의 연속출원이고, 이는 1993년 7월 26일자 출원된 08/095,769호의 연속출원이고, 이는 1993년 7월 20일자 출원된 08/093,926호의 연속출원이다. 본 출원의 우선권 주장은 미국 특허 출원 08/960,921; 08/649,811; 08/562,346이 된다. 이들 출원은 참고문헌으로 제시한다.

발명의 분야

본 발명은 항균성 펩티드에 관계한다. 특히, 본 발명은 "프로테그린(protegrins)"이라고 하는 짧은 펩티드에 관계하는데 이는 광범위의 항균성 활성을 가진다.

도 1은 항균성 화합물 PG-1, PG3, PG-5의 전구체 단백질을 인코드하는 게놈 DNA의 핵산 서열과 이의 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 프로테그린 게놈 DNA를 나타낸다.

도 3a-c는 합성된 PG-1과 비교하여 합성된 PG-5의 항균 활성을 나타낸다.

도 4는 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Staphlyococcus aureus)와 슈도모나스 에어로기노사(Pseudomonas aeruginosa)에서 약물 저항성 발생에 항생제를 포함하는 배지로 연속하여 이동한 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 PG-5를 통하여 PG-1 프로테그린의 서열을 나타낸 것이다.

도 6은 β-쉬트 2차 아미노산 구조를 설명한 것이다.

6.1 정의

여기에서 사용된 것과 같이, 다음의 용어는 다음의 의미를 가진다.

"2차 구조"는 α나선과 같은 나선, β-가닥과 같은 연장된 가닥 및 β-쉬트와 같은 연장된 가닥의 쉬트를 포함하난 이에 국한하지 않는 폴리펩티드 단편의 규칙적인 구조를 나타낸다.

"안티-패어랠 β-쉬트"는 안티-패어랠 펩티드 가닥 사이에 분자간 기본 구조와 기본구조 간에 수소 결합에의해 폴리펩티드 사슬의 2차 구조를 말한다. 안티-패얼랠 β-쉬트는 선택적으로 하나 또는 두 개의 이황화 연결을 포함한다.

"양쪽성 안티-패어랠 β-쉬트"는 한 면은 네트 전하가 소수성을 가지고 다른 한 면은 네트 전하가 친수성을 가지는 양쪽성 안티-패어랠 β-쉬트를 말한다.

"리버스-턴"은 양쪽성 안티-패어랠 β-쉬트의 인접 가닥을 연결하는 특징적인 2차 구조를 말한다. 일반적으로, "리버스-턴"은 한 개 폴리펩티드 사슬이 안티-패어랠 β-쉬트를 만들도록 하기 위해 폴리펩티드 사슬의 방향을 바꾸는 2 내지 4 개 아미노산 잔기 펩티드 단편을 말한다. 이와 같은 펩티드 단편은 본 기술에 공지된 것으로 3개 아미노산 잔기 γ-턴(Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot et al., 1988, J, Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394)와 하기에서 상술하게 되는 4개 아미노산 β-턴을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.

"β-턴"은 리버스-턴의 아류로 인식한다. 일반적으로 "β-턴"은 한 개 폴리펩티드 사슬이 안티-패어랠 β-쉬트를 만들도록 하기 위해 폴리펩티드 사슬의 방향을 바꾸는 2 내지 4 개 아미노산 잔기 펩티드 단편을 말한다. 일반적으로, β-턴의 두 개 내부 아미노산 잔기는 β-쉬트의 수소 결합에 관여하지 않고; 내부 잔기의 각 면에 있는 두 개 아미노산 잔기는 β-쉬트의 수소 결합을 형성하는데 포함된다. "β-턴"은 본 기술에 공지된 모든 형태의 β-턴을 포함하는데 예를 들면, type-I, II, III, I', II' III' β-턴을 포함한다(see, Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot et al., 1988, J, Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Finct. Genet. 6:382-394).

"항균성 효과량"은 표적 미생물을 죽일 수 있는 펩티드 또는 이의 조성물의 양을 말한다. 좀더 구체적으로는, 펩티드의 항균성 효과량은 표적 미생물을 죽일 수 있는 또는 생장을 방해하는 펩티드의 양을 말한다.

"치료요법적 효과량"은 식물 또는 동물에서 연관된 감염 또는 질병을 예방하거나 또는 치료하거나, 이의 증상을 감소시키거나 또는 제거하는데 효과적인 펩티드 또는 이의 조성물의 양을 말한다.

"제약학적 수용가능한 염"은 자유 염기의 항균 활성을 보유하고 무기 산과 반응에의해 수득되는 이들 염을 말한다.

6.2. 적절한 구체예의 설명

본 발명은 항균 활성을 가지는 프로테그린 펩티드, 이 펩티드를 포함하는 조성물, 다양한 표적 미생물을 죽이거나 생장을 저해하기위한 이와 같은 펩티드를 이용하는 방법 및 이와 같은 펩티드를 이용하여 식물 또는 동물에 연관된 미생물 감염 및 질환을 치료 및 예방하는 방법에 관계한다.

본 발명의 펩티드는 다양한 표적 미생물을 죽이는 항균 활성을 나타내는데 표적 미생물로는 L. 모노사이토제네스(L. monocytogenes), B. 서브틸리스(B. subtilis), E. 페칼리스(E. faecalis)(반코마이신-감응성(VSEF), 반코마이신-저항성(VREF) 균주포함), E. 페시움(E. faecium)(반코마이신-감응성(VSEF), 반코마이신-저항성(VREF) 균주포함), S. 아우레우스(S. aureus)(메티실린-감응성(MSSA), 메티실린-자항성(MRSA) 균주 포함), S. 살리바리우스(S. salivarius),S. 에피더미스(S. epidermis)(메티실린-감응성(MSSE), 메티실린-저항성(MRSE) 균주포함) C. 미누티시움(C. minutissium), C. 슈도디프테리아(C. pseudodiptheriae), C. 스트라툼(C. stratium), 코리네박테리움 그룹 G1, 코리네박테리움 그룹 G2, S. 뉴모니아(S. pneumoniae)(페니실린 저항성(PRSP) 균주포함), S. 미티스(S. mitis), S. 산기우스(S. sanguis)와 같은 그램 양성 박테리아; A. 칼로아세티쿠스(A. calcoaceticus), E. 콜라이(E. coli), K. 뉴모니아(K. pneumoniae), P. 에어로기노사(P. aeruginosa), S. 마르세센(S. marcescens), H. 인플루엔자(H. influenza), 모라셀라 sp.(Moraxella sp.,), N. 메니지티디스(N. meningitidis), S. 티피무리움(S. typhimurium), H. 플로리(H. pylori), H. 펠리스(H. felis), C. 제주니(C. jejuni)와 같은 음람-음성 박테라아; 원생동물, 이스트 및 특정 바이러스와 레트로바이러스를 포함하나 이에 국한하지 않는다. 중요한 것은 여기에서 상술하는 펩티드는 반코마이신-저항성 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 또는 페칼리스("VRE")(faecalis), 페니실린-자항성 스트렙타코커스 뉴모니아("PRSP")(Staphylococcus pneumoniae) 및 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스("MRSA")(Staphylococcus aureus)와 같은 다양한 약물에 저항성을 나타내는 임상적으로 병인성 미생물에 대해 살균성이 있다.

본 발명의 펩티드 또는 이의 조성물은 다양한 용도에서 살균제로 이용될 수 있다. 예를 들면, 펩티드를 이용하여 다양한 용도에서 항균제로써 사용될 수 있다. 예를 들면, 펩티드를 이용하여 의료 장비, 음식, 화장품, 콘택트렌즈, 약물 또는 다른 영양소를 포함하는 물질 등의 다양한 물질을 보존하거나 또는 감염을 예방할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 특히, VRE, MRSA, MSSE와 같은 다양한 임상적인 약물-저항성 병인균에 대한 살균제로 유용하다.

본 발명의 펩티드 또는 이의 조성물은 식물 및 동물에서 미생물 감염과 연관된 감염 또는 질환의 예방 및 치료에 유용하다. 이와 같은 질병에는 그램-음성, 그램 양성 박테리아 감염, 심내막염, 폐렴, 다른 호흡기 감염, 요도 감염, 전신 칸디다증, 경구 내점막염 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

여기에서 상술하는 펩티드는 전통적인 항생제 또는 다른 항균성 펩티드보다 많은 장점을 제공한다. 예를 들면, 동물에서 자연적으로 발생되는 펩티드에 관계하는데, 이는 전통적인 항생제에서 관찰되는 상대적으로 높은 빈도의 저항성이 여기에서 상술하는 펩티드에서는 나타나지 않는다.

본 발명의 프로테그린의 특징적인 장점은 18개 이하의 아미노산을 가지는 "미니-프로테그린"이 상술되어 있다. 결론적으로 조직에 분포가 더 잘되고 면역원성이 적고 생산 비용이 낮은 것이다.

6.2.1. 펩티드

일반적으로, 본 발명의 프로테그린 펩티드는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나 이의 변형된 형을 포함한다. 자연계에서 발생하는 것과 일치하는 이들 펩티드는 합성하거나 또는 정제된 형으로 또는 분리된 형으로 존재한다.

각 경우에 X_n은 펩티드의 특정 위치에서 아미노산을 나타낸다. 유사하게, C_n은 특정 위치에서 아미노산을 나타내고 서열 1의 아미노산에서 이들 위치를 나타내는데 이때, 이황화연결을 할 수 있는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

X_n또는 C_n으로 나타내는 아미노산 잔기는 유전적으로 인코드된 L-아미노산, 자연발생적인 유전적으로 인코드되지 않는 L-아미노산, 상기의 합성된 L-아미노산 또는 D-이성질체가 될 수 있다. 여기에서 사용되는 아미노산은 20개 유전적으로 인코드된 L-아미노산과 공통적인 인코드되지 않는 아미노산인데 다음과 같다.

공통적인 아미노산 약어

아미노산	한 문자약어	통상적인 약어
알라닌	A	Ala
아르기닌	R	Arg
아스파라진	N	Asn
아스파르트산	D	Asp
시스테인	C	Cys
글루타인	Q	Gln
글루타민산	E	Glu
글리신	G	Gly
히스타딘	H	His
이소루이신	I	Ile
루이신	L	Leu
리신	K	Lys
메티오닌	M	Met
페닐알라닌	F	Phe
프롤린	P	Pro
세린	S	Ser
트레오닌	T	Thr
트립토판	W	Trp
티로신	Y	Tyr
발린	V	Val
오르니딘	O	Orn
β-알라닌		bAla
2,3-디아미노프로피오닌산		Dpr
α-아미노이소부틸산		Aib

N-메틸글리신(사르코신)		MeGly
시트룰린		Cit
t-부틸알라닌		t-BuA
t-부틸글리신		t-BuG
N-메틸이소루이신		MeIle
페닐글리신		Phg
시클로헥실알라닌		Cha
노르루이신		Nle
1-나프틸알라닌		1-Nal
2-나프틸알라닌		2-Nal
4-클로로페닐알라닌		Phe(4-Cl)
2-플로로페닐알라닌		Phe(2-F)
3-플로로페닐알라닌		Phe(3-F)
4-플로로페닐알라닌		Phe(4-F)
페니실아민		Pen
1,2,3,4-테트라하이드로-		Tic
이소퀴놀린-3-카르복실산
β-2-티에닐알라닌		Thi
메티오닌 설폭시드		MSO
호모아르기닌		Har
N-아세틸 리신		AcLys
2,4-디아미노 부틸산		Dbu
p-아미노페닐알라닌		Phe(pNH2)
N-메틸발린		MeVal
호모시스테인		hCys
호모세린		hSer
ε-헥사놀산		Aha
δ-아미노발린산		Ava
2,3-디아미노부틸산		Dba

본 발명의 화합물은 지정된 종류의 아미노산를 가지는 펩티드이다. 아미노산 잔기는 일반적으로 다음과 같이 분류할 수 있다;

산성; 생리 pH에서 H⁺이온을 잃기 때문에 잔기는 음전하를 가지고, 펩티드의 모양에서 표면 위치를 찾기위해 잔기는 수용액에의해 끌리고 이때 생리작인 pH에서 펩티드가 수용성 배지에 있을 때 포함된다.

염기성; 잔기는 생리 pH에서 H⁺이온과의 연합에의해 양전하를 가지는데 펩티드가 생리적인 pH에서 수용성 매체에 포함되어 있을 때, 펩티드의 모양에서 표면 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 잔기가 끌린다.

소수성; 잔기는 생리적인 pH에서 전하를 가지지 않으며, 잔기는 펩티드가 수용성 매체에 있을 때 펩티드의 모양에서 내부 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 배척된다.

극성/큰 아미노산; 잔기는 생리적인 pH에서 전하를 가지지 않으나, 잔기는 펩티드가 수용성 매체에 있을 때, 펩티드의 모양에서 내부 위치를 찾기위해 수용액에의해 충분히 배척되지 않는다. 조건에 따라서, 그리고 서열에서 나머지 아미노산에 따라서, 잔지는 내부 공간 또는 단백질 표면에 있을 수 있다.

시스테인-유사형; 이황화결합에 참여할 수 있는 측쇄를 가지는 잔기. 따라서, 일반적으로 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민등과 같은 적어도 하나의 티올(SH)기를 포함하는 측쇄를 가지는 시스테엔-유사 아미노산이 되는데 적절하게는 시스테인이 된다.

작은 아미노산; 극성 기가 부족하더라도 소수성을 제공하기에는 충분히 크지 않는 측쇄를 가지는 특정 중성 아미노산. "작은" 아미노산은 적어도 하나의 극성 기가 측쇄에 있을 경우에는 4개 정도의 탄소를 가지고, 이를 포함하지 않는 경우에는 3개의 탄소를 가진다.

유전자 인코드된 2차 아미노산 프롤린(그리고 3-하이드록시 프롤린 및 4-하이드록시 프폴린과 같은 프롤린-유사 아미노산)은 펩티드 사슬의 2차 모양에서 공지의 효과로 인하여 공간적인 경우로써 이 집단에 포함되지 않는다.

물론, 개별 잔기를 모으면, 일부 분자는 전하를 띄고, 다른 일부는 전하를 띄지 않고 따라서, 어느 정도 수용성 매체에서 끌리거나 배척 당한다. "전하를 가진"을 정의에 맞도록 하기 위해서는 개별 분자의 상당한 비율이(적어도 25%) 생리 pH에서 전하를 가진다. 극성 또는 비극성으로 분류하기 위해 요구되는 인력 또는 척력의 정도는 정해진 것이 아니고 따라서, 본 발명에 의해 고려되는 아미노산은 한 집단 또는 다른 집단으로 분류될 수 있다. 특정하게 명명되지 않는 대부분의 아미노산은 공지의 성질에 기초하여 분류한다.

아미노산 잔기는 고리 또는 고리가 아닌 것으로; 방향족 또는 방향족이 아닌 것으로, 잔기의 측쇄 치환기에 대한 자체 설명 분류등으로 구분될 수 있다.

본 발명의 펩티드중 유전적으로 인코드되지 않는 특정 아미노산은 다음과 같으나 이에 국한되지는 않는다; β-알라닌(b-Ala), 3-아미노프로피온산, 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), 4-아미노부틸산과 같은 다른 오메가 아미노산;α-아미노발린 산(Aib);ε-아미노헥사논산(Aha); δ-아미노발린산(Ava); N-메틸글리신 또는 사르코신(MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(t-BuA); t-부틸글리신(t-BuG); N-메틸이소루이신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 사이클로헥실알라닌(Cha); 노르루이신(Nle); 1-나프틸페닐알라닌(1-Nal); 2-나프틸페닐알라닌(2-Nal); 4-클로로페닐알라닌(Phe(4-Cl)); 2-플로로펜닐알라닌(Phe(2-F)); 3-플로로페닐알라닌(Phe(3-F)); 4-플로로페닐알라닌(Phe(4-F)); 페니실아민(Pen); 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic); β-2-티에닐알라닌(Thi); 메티닌 설폭시드(MSO); 호모아르기닌(Har); N-아세틸 리신(AcLys); 2,3-디아미오부틸산(Dab); 2,4-디아미노부틸산(Dbu); p-아미노페닐알라닌(Phe(pNH₂)); N-메틸 발린(MeVal); 호모시스테인(hCys); 하이드록시프롤린(Hyp); 파라벤질페닐알라닌(Pba); 및 호호세린(hSer). 이와 같은 아미노산은 전술한 집단에 속한다.

전술한 유전적으로 인코드된 그리고 인코드안된 아미노산의 분류는 다음의 표 2에 요약하였다. 표 2는 설명을 위한 것이고 여기에서 상술하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 리스트는 아니다.

아미노산 분류

아미노산 종류	유전적 코드	비유전적 코드
소수성	Y, V, I, L, M, F, W	Phy, 1-Nal, 2-Nal, Thi,
		Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F),
		Phe(3-F), Phe(4-F), t-
		BuA, t-BuG, MeIle, Nle,
		MeVal, Cha
산성	D, E
염기성	H, K, R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-
		NH2), Dbu, Dab
극성/대	Q, N	Cit, Aclys, Mso
소	G, S, A, T	bAla, MeGly, Aib, hSer
시스테인형	C	Pen, hCys

서열 1의 펩티드에서, X_n또는 C_n아미노산 잔기사이에 "-" 의미는 서로 연결된 기본 구조를 나타낸다. 따라서, "-"는 아미드 연결(-C(O)-NH)를 나타낸다. 그러나, 본 발명의 모든 펩티드에서, 하나 이상의 아미드 연결은 아미드 연결 이외의 다른 연결로 대체될 수 있다. 이와 같은 연결에는 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-(시스와 트란스), -C(O)CH₂-, -CH(OH)CH₂-, CH₂-SO-를 포함하나 이에 국한하지 않는다.

이와 같은 연결을 가지는 펩티드와 이와 같은 펩티드를 만드는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(see, e.g., Spatola, 1983, Vega Date 1(3) (general review); Spatola, 1983, "Peptide Backbone Modifications" In: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins (Weinstein, ed.), Marcel Dekker, New York, p. 267 (general review); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1:463-468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH₂NH-, -CH₂CH₂-); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38: 1243-1249 (-CH₂-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH- cis and trans); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH₂-); Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23:2533 (-COCH_2);European Patent Application EP 4566 (1982) CA:97:39405 (-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH₂-); and Hruby, 1982, Life Sci. 31:189-199 (-CH₂-S-).

일반적으로, 본 발명의 펩티드는 약 10 내지 30개 아미노산 서열로 구성된다. 따라서, 서열 1은 "코어" 펩티드 구조로 구성된 18개 특덩 아미노산을 나타내고, 본 발명의 펩티드는 다른 영향이 없는 한, 18개 보다 많이 또는 더 적게 포함할 수 있고, 일부의 경우에는 항균 활성을 강화시키거나 또는 펩티드의 다른 유용한 성질을 가질 수 있다. 18개 이하의 펩티드 잔기를 포함하는 펩티드의 경우에, 펩티드 서열내에 특정 명시된 아미노산을 가지지 않는데 이는 하기에서 상술한다. 18개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 경우에는 서열 1의 아미노산 서열에는 N- 또는 C- 단부에 추가의 아미노산 잔기 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 추가 아미노산 잔기 또는 펩티드 서열은 자연발생적인 프로테그린과 비교하였을 때, 펩티드의 항균 활성에 나쁜 영향을 주지 않는다.

본 발명의 펩티드는 두 가지 주요 원소 또는 모티브를 포함하는 "코어" 구조를 가지는 것을 특징으로 하는데; 안티-패어랠 β-쉬트를 만드는 두 가닥에의한 리버스-턴 부분이 있다. 이론에 구애되지 않고, 서열 1의 화합물의 항균 활성은 이와 같은 코어 구조와 일부 연관이 있는 것으로 보인다.

펩티드의 β-쉬트 부분은 N-가닥(잔기 X₁-C₈)과 C-가닥(잔기 C₁₃-X₁₈)로 구성된다. N-가닥과 C-가닥은 서로 나란하나 방향이 반대인 안티-패어랠이고 지주 구조와 지주 구조간에 수소 결합을 통하여 서로 비-공유적으로 연결되어 있다(β-쉬트 구조의 상세한 설명은 Creighton, 1993, prorein Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., NY, and references cited therein 을 참조한다). 이론에 구애되지 않고, β-쉬트를 구성하는 대부분 중요한 잔기는 X₅-C₈과 C₁₃-X₁₆이다.

적절하게는, 펩티드의 β-쉬트는 양쪽성으로 β-쉬트의 한 면은 소수성이고, 다른 한 면은 친수성인 특징을 가진다. 도 6에서 설명하는 β-쉬트 구조를 참고로 하면, 가닥안쪽 방향으로 서로 인접한 L-아미노산 잔기의 측쇄(잔기 n, n+1, n+2 등)는 서로 반대 방향으로 향하여 β-쉬트의 반대면에 위치한다. 가닥간 방향에서 서로 인접하는 L-아미노산 잔기의 측쇄(n, c, n+1, c+1 등)는 동일한 방향으로 향하여 β-쉬트의 동일 표면에 있게 된다. 이와 같은 일반적은 구조적 모티프를 이용하여, 각 잔기 위치에서 아미노산을 선택함으로써 양쪽성 안티-패어렐 β-쉬트를 얻을 수 있고 이는 쉬트의 한 면에서는 친수성 잔기가 위치하고, 다른 한 면에서는 소수성 측쇄가 위치하게 된다.

물론, 양쪽성 안티-패어랠 β-쉬트 부분의 표면은 소수성 또는 친수성 전하만을 요구하기 때문에, 특정 표면으로 구성된 각 측쇄는 친수성 또는 소수성일 필요가 없다. 표면에는 표면의 네트 전하를 많이 변경시키지 않는 측쇄를 포함할 수 있다. 예를 들면, 소수성 또는 침수성 표면은 작은 아미노산 잔기를 포함하고, 이와 같은 측쇄는 표면의 네트 전하를 많이 변경시키지는 않는다.

서열 1의 펩티드의 β-쉬트 부분에는 C₆, C₈, C₁₃, C₁₅와 같은 1 내지 4개의 시스테인-유사 아미노산을 포함하는데 이들은 가닥간의 이황화 결합에 참여한다. 적어도 2개의 시스테인-유사 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명의 펩티드는 이황화 결합 형성 정도에따라 직쇄 또는 고리 형이 될 수 있다. 고리형은 4개의 인베리언트 시스테인-유사 아미노산의 모두 또는 일부에서 이황화결합이 형성되기 때문이다. 본 발명의 고리형에는 이황화결합을 형성할 수 있는 모든 가능한 치환을 포함한다. 직쇄형은 고리형으로 전환될 수 있고, 이 역도 가능하다. 고리형을 만들기 위해 이황화 결합을 만드는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있는데 이황화결합을 환원시켜 선형 화합물을 만든다.

자연 발생하는 프로테그린(PG-1 내지 PG-5)에는 두 개의 이황화결합을 포함하는데; 하나는 C₆-C₁₅사이에 그리고 다른 하나는 C₈과 C₁₃사이에 있다(Harwig et al., 1995, J. Peptide Sci. 3:207). 따라서, 두 개의 이황화결합을 가지는 구체예에서는 C₆-C₁₅, C₈-C₁₃형이 적절하다. 이와 같은 펩티드는 "고유형(native)"이라 칭한다. 그러나, 한 개의 이황화결합을 포함하는 프로테그린이 활성을 가지며 만들기가 용이하다는 것도 밝혀졌다. 한 개의 이황화결합을 가지는 적절한 구체예는 C₆-C₁₅사이나 C₈-C₁₃사이가 된다.

한 개의 이황화결합으로 C₆-C₁₅이황화결합을 포함하는 형태가 "bullet" 형 프로테그린이고; 유일한 이황화결합이 C₈-C₁₃사이에 있는 것은 "kite" 형 프로테그린이다. bullet 형과 kite 형은 이황화결합에 참여하지 않는 아미노산 예를 들면, 글리신, 세린, 알라닌 또는 트레오닌과 같은 작은 아미노산과 이황화결합에 관여하지 않는 위치에서 시스테인-유사 아미노산 잔기에 대체시켜 용이하게 만들 수 있다. 또는 C₈또는 C₁₃이 없을 수도 있다.

선형 또는 "뱀 모양" 고유 펩티드가 상당한 활성을 가지기 때문에, 본 발명의 펩티드에는 선형을 포함하는데 이때 SH기는 적절한 시약을 사용하여 화학적으로 안정화시킨다. 여기에서 사용한 바와 같이, 본 발명의 "SH-안정화된" 형은 표준 시약으로 반응시켜 이황화결합의 형성을 막거나 또는 시스테인-유사 아미노산이 전술한 다른 아미노산으로 대체된 형을 만들도록 한다. 모든 4개 시스테인 유사 아미노산가 치환되거나 또는 SH-안정화되어 분자간 이황화결합의 형성을 최소화한다.

β-쉬트에서 가닥간에 이황화결합에 관여하는 황원자는 가닥간 지주구조와 지주구조간에 수소결합에의한 평면에 위치하지 않는다; 황원자가 β-쉬트의 표면에 위치하도록 하기위해 연결된 아미노산 잔기의 β-탄소에 대해 각을 이루고 있다. 따라서, 이황화결합의 황원자는 β-쉬트 표면의 네트 소수성에 기여한다. 서열 1의 펩티드에서 다음의 화학식으로 정의되는 β-쉬트 부분은 여기에서 정의하는 양쪽성 안티-패어랠 쉬트의 정의에 속한다는 것으로 이해한다.

이때, C₆, C₈, C₁₃, C₁₅각각은 독립적으로 시스테엔-유사 아미노산이고;

X₇, X₁₄는 각각 독립적으로 소수성 또는 작은 아미노산이고;

∥은 이황화결합을 나타낸다. 특정 구체예에서, C₆, C₈, C₁₃, C₁₅각각은 시스테인이고, X₇, X₁₄는 각각 소수성 아미노산이다.

도 6에서 설명하는 β-쉬트 이차 구조는 전체적으로 L-아미노산으로 구성된다. 당업자는 특정 잔기위치에서 L-아미노산을 이에 상응하는 D-이성체로 대체하면 β-쉬트의 구조적 안정성 또는 양쪽성 안티-패어랠 β-쉬트 부분의 양쪽성이 파괴된다는 것을 인지할 것이다. 특정 이성체 치환으로 구조적 안정성 또는 양쪽성을 파괴하는 정도는 β-쉬트내에 잔기의 위치와 아미노산 측쇄의 크기에 따라 부분적으로 달라진다. 적절하게는 서열 1의 펩티드의 β-쉬트 부분에는 쉬트의 D- 또는 L-이성체를 포함하는 펩티드와 비교하였을 때, 안정성이나 양쪽성에 심각한 영향을 주지않는 L- 및 D- 아미노산 혼합물을 포함한다. β-쉬트 부분의 안정성 또는 양쪽성에 실제 영향을 주지 않는 이성체 치환은 당업자에게는 분명한 것이다.

본 발명의 적절한 구체예에서, β-쉬트 부분을 구성하는 소수성 염기성, 극성/큰 아미노산 및 시스테인-유사 아미노산은 모두 L-이성체 또는 모두 D-이성체이다. β-쉬트 부분을 구성하는 작은 아미노산은 L-이성체 또는 D-이성체일 수 있다.

서열 1의 펩티드의 리버스-턴 부분(잔기 X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂)은 안티-패어랠 β-쉬트 가닥을 연결한다. 따라서, 리버스-턴 부분은 폴리펩티드 사슬 방향이 바뀐 구조로 구성되어 펩티드 부분이 안티-패어랠 β-쉬트 2차구조를 채택하게 된다.

일반적으로 문자의 리버스-턴 부분은 2,3 개 또는 4개 아미노산 잔기(잔기 X₉또는 X₁₂는 없을 수도 있다)로 구성된다. 본 발명 펩티드의 가장 중요한 특징은 분자가 회전하는 부분에 양전하를 가진다는 것이다. 따라서, X₉-X₁₂중 하나와 적절하게는 X₉-X₁₂중 2개가 염기성 아미노산이다. 이와 같은 펩티드에서 회전하는데 영향을 주는 2, 3, 4개 아미노산 단편이 공지되어 있다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 리버스 턴은 3개 아미노산 γ-턴이다. 본 기술 분야에 공지된 γ-턴은 본 발명의 펩티드에 이용되었는데 여기에는 다음에서 상술된 것을 포함한다(Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmet-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol 206:759-777; and Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394).

본 발명의 또다른 구체예에서, 리버스-턴은 4개 아미노산 잔기 β-턴이다. 이와같은 구조에서, 턴의 2개 내부 아미노산 잔기는 안티-패어랠 β-쉬트의 수소-결합에 항상 관련되지는 않으며; 내부 잔기의 각 면에 있는 두 개 아미노산 잔기는 β-쉬트의 수소-결합에 항상 포함된다. 이론에 구애되지는 않으나, 이와 같은 수소 결합은 분자의 β-쉬트부분을 안정시키는데 도움이 되는 것으로 보인다.

많은 펩티드 β-턴의 모양과 서열이 본 기술분야에 공지되어 있는데 여기에는 type-I, type-I', type-Ⅱ, type-Ⅱ', type-Ⅲ, type-Ⅲ', type-Ⅳ, type-Ⅴ, type-Ⅴ', type-Ⅵa, type-Ⅵb, type-Ⅶ, type-Ⅷ 을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다(Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34:167-339; Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394). 이와 같은 모든 형태의 β-턴 구조와 이에 상응하는 서열 및 나중에 발견된 펩티드 β-턴 구조와 서열이 본 발명에서 특이적으로 고려한 것이다.

β-턴과 같은 짧은 펩티드의 특정 모양은 턴에 위치하는 특정 아미노산 잔기(통상적으로 Gly, Asn 또는 Pro)위치에 따라 달라진다. 일반적으로, 타입-I β-턴이 X₉-X₁₂위치에서 임의 아미노산이 가능하나, Pro은 X₁₁위치에서 나타나지 않는다. X₁₂에서는 Gly이 우세하고, 타입 Ⅰ-Ⅱ 턴에서의 X₁₀위치에는 Pro이 우세하다. X₉위치에서는 Asp, Asn, Ser, Cys 잔기가 우세하고, 이들 측쇄는 잔기 X₁₁의 NH에 수소결합된다.

타입-Ⅱ 턴에서, X₁₁위치에는 Gly와 Asn이 가장 흔한데, 그 이유는 이들이 지구 구조에서 요구하는 각을 가장 잘 수용하기 때문이다. 이상적으로는, 타입-Ⅰ'턴이 X₁₀과 X₁₁에서 Gly을 가지고, 타입-Ⅱ"턴에서는 X₁₀에서 Gly을 가진다. 일반적으로 타입-Ⅲ턴은 대부분 아미노산 잔기를 가지나 타입-Ⅲ'턴에서는 X₁₀과 X₁₁위치에서 항상 Gly을 요구한다.

타입-Ⅵa 와 Ⅵb 턴은 내부잔기로써 Cis 펩티드 결합과 Pro을 가진다. 단백질과 펩티드에서 β-턴의 여러형태와 서열에 대해서는 Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232 를 참고하라.

적절한 β-턴 서열은 다음과 같다(X₉에서 X₁₂순서로 나열함): ZZZG; ZZZF, ZZSG; ZZAL; ZGZL; ZFZL; ZPZV; ZPZF; ZGZY; IZGZ; LZZF; YZGZ. 이때 Z 는 각각 R, K, Dbu 또는 Orn의 L-또는 D-이성체이다.

또다른 적절한 β-턴에는 X₁₀또는 X₁₁이 Tic 또는 Hyp인 것을 포함하는데, 이들 잔기는 펩티드와 단백질에서 β-턴 구조에 영향을 주거나 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 펩티드는 일반적으로 염기성으로, 가령, 생리 pH에서 네트 음전하를 가진다. 이론에 구속되지는 않지만, 분자의 턴 부분에 특히 양전하를 가지는 아미노산 잔기가 존재하는 것이 항균 활성에 중요한 것으로 보인다.

펩티드와 같은 구조에서 개별 아미노산 잔기를 통계학적으로 모아보면, 아미노산 잔기의 일부는 양전하를 띄고, 일부는 음전하를 띄고, 일부는 전하를 가지지 않는다. 따라서, 펩티드중 일부는 전하를 가지고, 일부는 전하를 가지지 않는다. "염기성"의 정의는, 펩티드 분자의 아미노산 잔기가 생리 pH에서 양전하를 가진다는 것이다. 따라서, 아미노산 15% 내지 최고 50%는 염기성 아미노산이어야 하고, 화합물은 생리 pH에서 적어도 +1의 네트 전하를 가진다. 적절하게는 본 발명의 펩티드는 생리 pH에서 적어도 +3의 네트 전하를 가진다.

최소 10개 아미노산을 가지는 구체에에서, 적어도 1개의 염기성 아미노산 잔기가 있으나, 이와 같은 짧은 사슬 잔기에서도 적어도 2개의 염기성 잔기가 적절하다. 프로테그린 펩티드에 15개 정도의 아미노산 잔기가 포함되는 경우에 두 개의 염기성 잔기가 요구된다. 서열에서 아미노산의 적어도 20%는 염기성이고, 적절하게는 30% 정도가 염기성이 된다.

본 발명의 펩티드 아미노 단부는 자유 아미노산형이거나 RCO-에의해 아실화될 수 있는데, 이때 R은 1-25C, 적절하게는 1-10C, 가장 적절하게는 1-8C의 하이드로카르바일기(hydrocabyl group)를 나타낸다. 하이드로카르바일기는 포화되거나, 불포화된 직쇄, 분지쇄 또는 고리형이 되고, 일반적으로, 메틸, 에틸, 이소프로필, t-부틸, n-펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥센-2-yl, 헥센-3-yl, 헥신-4-yl, 옥틸, 데실, 에이카노실등이 될 수 있으나 옥틸이 적절하다.

또는, N-단부에는 나프탈렌등과 같은 방향족 기를 포함할 수 있다. 이와 같은 기는 1-나프틸알라닌 또는 2-나프틸알라닌이 N-단부 아미노산 잔기로 이용하여 본 발명의 펩티드에 결합될 수 있다.

펩티드의 N-단부는 세균의 주변 세포질로 들어가기 위해서 용질-특이적인 막통과 채널을 이용하도록 대체될 수 있다. 예를 들면, 카테콜-NHS 활성화된 에스테르를 이용하여 카테콜로 N-단부가 변형될 수 있다.

본 발명의 펩티드 C-단부는 자유 산(acid) 형태의 카르복실기 또는 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘염 또는 다른 무기 이온염 또는 카페인과 같은 유기 이온형태가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 분자의 나머지 부분이 양전하를 가지고 이는 관련 양이온을 배척하기 때문에 염을 만드는 것이 어려울 수도 있다. 카르복실 단부는 ROH형의 알코올로 에스테르를 만들거나 또는 NH₂또는 RNH₃또는 R₂NH의 아민에 의해 아민을 연결시킬 수 있는데 이때, R은 전술한 것과 같이 1-25C의 하이드로바르빌이 된다. C-단부가 CONH₂인 아민화된 펩티드가 적절하다.

C-단부 또는 N-단부에서 친지성기를 추가하면 펩티드가 표적 미생물 막으로 전이하여 감염부위에 침투할 수 있다. 표적 미생물의 지질 함량에 따라 최적의 치환 비율을 선택한다.

따라서, 구체예에서, 본 발명은 약 10-30개 아미노산 잔기로 구성된 항균성 펩티드를 제공하는데 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다:

여기에서 상술하는 것과 같이, 자연계에서 발생하는 프로테그린에서 발견되는 소수성 아미노산은 X₅에서 염기성 아미노산으로 치환되거나 X₁-X₄중 적어도 하나는 소수성이거나 적어도 하나 적절하게는 자연형의 X₁-X₄의 4개 아미노산이 모두 결손되거나 또는 X₅, C₈, X₉, X₁₂, C₁₃, X₁₆중 하나 이상이 없다. 이들 특징과 다른 특징은 적절히 조정하여, 본 발명의 프로테그린의 종류가 효과를 가지는 조건의 범위를 다양하게 할 수 있다. 또한, 이들이 영향을 끼칠 수 있는 미생물 범위로 변형될 수 있다.

또 다른 경우에, 본 발명의 펩티드는 약 10-14개 아미노산 잔기로 구성되는데 이때, C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 작은 아미노산, 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

C₆또는 C₁₅각각은 작은 아미노산, 소수성 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

X₁-X₅각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각은 염기성, 작은 아미노산이 되고, X₁-X₅중에서 두 개는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 아미노산일 수 있고;

X₉또는 X₁₂각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 존재하는 경우에는 염기성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₁₀은 염기성, 소수성, 또는 작은 아미노산 또는 프롤린일 수 있고;

X₁₆은 존재하거나 존재하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에 염기성, 작은 아미노산 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₁₇와 X₁₈은 각각 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각 염기성 또는 작은 아미노산일 수 있고,

X₁₆-X₁₈은 각각 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각 염기성, 소수성, 극성/큰 아미노산 또는 작은 아미노산일 수 있고,

또 다른 경우에, 본 발명의 펩티드는 약 10-18개 아미노산 잔기로 구성되는데 이때, C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 작은 아미노산, 소수성 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

C₆또는 C₁₅각각은 작은 아미노산, 소수성 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

X₁-X₄각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각은 염기성, 작은 아미노산이 되고, X₁-X₄중에서 한 개는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₅-X₁₆각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각은 소수성 또는 염기성 아미노산일 수 있고;

X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 아미노산일 수 있고;

X₉은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 염기성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₁₀은 염기성 또는 작은 아미노산 또는 프롤린일 수 있고;

X₁₁은 염기성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

X₁₂은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 소수성 아미노산일 수 있고;

X₁₇은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 독립적으로 작은 아미노산일 수 있고;

X₁₈은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 염기성 아미노산일 수 있다.

본 발명의 펩티드는 구체예로 설명한다. 본 발명의 구체예에서, C₆, C₈, C₁₃, C₁₅에서 시스테인-유사 아미노산 잔기 모두는 X₉와 X₁₂와 같다.

또다른 구체예에서, X₁-X₄모두 없을 수도 있다. 또다른 구체예에서, X₁-X₄중 적어도 하나, 적절하게는 두 개는 소수성 아미노산 적절하게는 I, V, L, Y, F 또는 W 가 된다.

또다른 구체예에서, X₉-X₁₂에는 적어도 하나의 소수성 아미노산 잔기, 적절하게는 Phe, Tyr 또는 Trp을 포함한다.

다른 적절한 구체예에는 X₁과 X₉가 각각 R, K, Orn, Dab, Har 또는 소수성에서 선택된 펩티드를 포함하는데; 적절하게는 X₁은 R, K, Har 이고, He 는 R, K, Har 또는 소수성 적절하게는 I, V, L, W, F 또는 Y 가 된다. 그러나, X₁와 X₉는 없다.

또다른 구체예에서, X₂와 X₃는 G, A, S, T, I, V, L, F, Y, W 에서 각각 선택되고, 적절하게는 X₂와 X₃는 G, W, F, Y, L, V 이나, X₂또는 X₃은 없다.

또다른 구체예에서, X₄는 R, K, H, Orn, Har, Dab, G, A, S, T, F, Y, W 에서 선택되고, X₄는 R, K, Orn, Dab, G, W 이나, X₄는 없다.

또다른 구체예에서, X₅와 X₁₆은 각각, I, V, L, Nle, W, Y, F에서 각각 선택되나, 적절하게는 I, V, L, W, F, Y이다. 그러나, X₅또는 X₁₆도 없다.

또다른 구체예에서, X₇와 X₁₄는 I, V, L, W, Y, F에서 각각 선택되나; 적절하게는 X₇은 I, F, Y, W 이고, X₁₄는 I, V, L, W, Y, F이다.

또다른 구체예에서, X₉는 R, K, H, Orn, Dab, Har, I, V, L, Nle, W, Y, F 이고, X₁₂는 I, L, V, W, F 또는 Y이고, 가장 적절하게는 Y, W, F 와 같은 방향족 아미노산이다.

적절한 구체예에서, X₁₀은 R, Orn, Dab, G, W, P이다.

적절한 구체예에서, X₁₁은 R, K, Orn, Dab, G, W, P이다.

적절한 구체예에서, X₁₇이 없고, 존재하는 경우에 G, A, S, T가 된다.

또다른 구체예에서 X₁₈은 없거나, 있는 경우에 R, K, H, Orn, Dab, Har이 된다.

X₁-X₄4개 아미노산이 존재하는 경우가 적절한데, X₁와 X₄은 적절하게는 염기성이고, X₂와 X₃은 작은 또는 소수성아미노산이 된다. X₁와 X₄의 적절한 구체예로는 R-G-G-R, R-G-W-R, R-L-L-R이 된다.

시스테인-유사잔기를 대체하는데 적절한 염기성 아미노산은 R, K, H, Orn, Dab, Har, 가장 적절하게는 R, K, Orn이 된다. 시스테인-유사잔기를 대체하기 위한 적절한 작은 아미노산에는 G, A, S, T를 포함하고, 적절하게는 A와 T가 된다.

본 발명의 특별히 적절한 펩티드에는 다음의 펩티드의 고유, kite, bullet, snake 형을 포함한다.

그리고, N-아실화된 또는 C-아민화된 또는 이의 에스테르형이 되는데, 이때 Z는 각각 소수성, 작은 또는 염기성 아미노산 또는 시스테인이고, 전술한 형에서 X₇은 W이거나, X₁₂는 W 이고, X₁₄는 W이거나 X₁₆은 W이고, X₁₇은 G이고, X₁₈은 R이고 X₅, X₉, X₁₂, X₁₆중 적어도 하나는 없다. 모든 구체예에서 Z는 S, A, T, G 이고, 가장 적절하게는 A 또는 T 이다.

전술한 펩티드에서, 프로테그린 21형은 해당 특징을 가지나 프로테그린-1(PG-1)과 유사하고; 22형은 해당 특징을 가지나, 프로테그린-2(PG-2)와 유사하고; 23형∼25형은 프로테그린-3, -4, -5(PG-3, PG-4, PG-5)와 유사하다(도 5 참조).

또 다른 적절한 화합물에는 다음의 펩티드와 같은 고유, bullet, kite, snake형을 포함한다(서열은 프로테그린 PG-1으로 나타낸다).

6.2.2. 화합물의 준비

"프로테그린"이라고 칭하는 본 발명의 화합물은 N- 또는 C-단부가 변형된 그리고 하나 또는 두 개의 이황화결합을 포함하는 펩티드 기본 구조를 가진다. 펩티드는 먼저 고리가 아닌 형으로 합성한다. 이와 같은 펩티드는 이황화결합을 형성하는 표준 방법에 의해 필요하다면 고리형 펩티드로 전환될 수 있다. 여기에서 프로테그린에서, "고리형"은 펩티드에 있는 시스테인-유사 아미노산 잔기 사이에 이황화결합 형성에 의해 고리 부분을 포함하는 것을 말한다. 고리가 아닌 형태가 적합한 경우에, 두 개 이상의 시스테인-유사 잔기를 포함하는 본 발명의 펩티드의 SH기를 안정화시키는 것이 적절하다.

여기에서 상술하는 크기의 펩티드를 합성하는 방법은 공지되어 있다. 현재 가장 흔히 사용되는 것은 고형상 합성 기술이고; 구조적으로 펩티드를 합성하는 자동화 장비를 구입할 수도 있다. 용액상 합성을 이용할 수도 있고 대규모 생산에서는 상당한 잇점이 있다. 표준 기술을 이용하여 합성할 때, 합성에서는 유전자에 의해 인코드되지 않는 유전자와 D-이성체를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물을 수득하는 실질적인 방법 중의 하나는 이와 같은 표준 화학 합성 기술을 이용하는 것이다.

펩티드 기본 구조를 제공하는데 추가하여, 통상의 화학 기술을 이용하여 N- 또는 C-단부를 유도할 수 있다. 본 발명의 화합물에는 선택적으로 아미노단부에 아실기를 포함할 수 있다. N-단부에 자유 아미노기를 아세틸화, 더 일반적으로는 아실화하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있고; 또한, 합성 때에 N-단부 아미노산은 아실화된 형으로 공급될 수 있다.

C-단부에서, 물론 카르복실기는 염의 형태로 존재할 수 있고; 제약학적 조성물의 경우에는 제약학적 수용 가능한 염이 된다. 적절한 염에는 NH₄ ⁺, Na⁺, K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺와 같은 무기 이온과 카페인과 같은 유기 양이온으로 형성된 염과 다른 치환된 아민을 포함한다. 그러나, 화학식 1의 화합물에 다중 염기성 잔기를 포함하는 경우에는, 염 형성이 어렵거나 불가능하다. 카르복시단부는 ROH형의 알코올을 이용하여 에스테르화되는데, 이때 R은 전술한 것과 같이 하이드로카르빌이다. 유사하게, 카르복시단부는 -CONH₂, -CONHR, -CONR₂와 같은 형을 가지도록 아민으로 처리한다. 에스테르반응과 아민 처리 반응 및 염기 존재 하에 염을 만들기 위해 중화시키는 기술은 모두 표준 유기 화학 기술이다.

본 발명의 펩티드를 생리학적 조건에서 만드는 경우에, 염기성 아미노산의 측쇄 아미노기는 관련된 산 추가 염의 형태가 될 수 있다.

C-단부 아미드가 있는 선형 펩티드를 합성하기 위해, 펩티드 서열은 제조업자의 지시에 따라 자동화된 ABI 433 펩티드 합성기(ABD, Perkin Elmer, Foster City, CA)에서 Fmoc 화학을 이용하여 Fmoc Rink 아미드 고형 서포트 수지(Bachem)에서 통상적으로 합성한다. 실온에서 2시간동안 티오아니졸/EDT/TFA(1/1/9) 10㎖에서 절단을 실행한다. 원래 절단 생성물은 t-부틸 메틸 에테르로 침전시키고, 여과시키고, 건조시킨다.

필요하다면, 약한 산화 물질 존재 하에 이황화결합을 형성시킨다. 화학적 산화제를 이용하거나 또는 화합물을 이와 같은 연결에 영향을 줄 수 있는 공기중 산소에 노출시킨다. 다양한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 이황화 결합 형성에 유용한 공정은 Tam, J.P. et al., Synthesis (1979) 955-957; Stewart, J.M. et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2d Ed. Pierce Chemical Company Rockford, IL (1984); Ahmed A.K. et al., J. Biol Chem (1975) 250:8477-8482 and Pennington M.W. et al., Peptides 1990, E. Giralt et al., ESCOM Leiden, The Netherlands (1991) 164-166 에 상술되어 있다. 또 다른 방법은 Kamber, B. et al., Helv Chim Acta (1980) 63:899-915 에 상술되어 있다. 고형 서포트에서 실행하는 방법은 Albericio, Int J Pept Protein Res (1985) 26:92-97 에 상술하고 있다.

특정 적절한 방법은 산소분자를 이용한 용액 산화반응이다. 여기에서 이용되는 방법으로 합성 PG-1, PG-3를 이의 아미드 또는 산성 형으로 다시 폴드시키고, 이성체 PG-1과 두 개 이황화결합 PG-1 화합물(C₆-C₁₅와 C₈-C₁₃)을 다시 폴드시킨다. 회수률은 65-90%로 높았다.

이황화결합을 만드는 본 적절한 방법에서, 원래 펩티드는 DMSO에 용해시키고, 20mM 암모니움 아세테이트(pH 7)에 첨가한다. 용액에서 펩티드의 최종 농도는 1-8㎎/㎖이고, pH 범위는 7.0-7.2이고, DMSO 농도는 5-20%이다. 펩티드 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반시킨다.

용액의 pH는 농축된 아세트산을 이용하여 pH 5로 조정하고, 샘플은 Prep LC에서 정제한다. 로딩후에, 컬럼은 UV 흡수도가 기본 수준으로 감소될때까지 10% 아세토니트릴/H₂O(0.1% TFA)로 세척한다.

컬럼 : Vydac Cat#218TP101522, 2.2 × 25㎝, C₁₈펩티드 & 단백질; UVλ: 235㎚; 유속: 10㎖/min.

용액 A 는 100% 0.1% TFA/H₂O 이고; 용액 B 는 100% 0.08% TFA/ACN 이다. 농도는 다음과 같다.

농도

시 간(분) 선형농도(%B)

0 1010 1880 3295 95

분취물은 HPLC로 분석하고, 소요의 펩티드를 포함하는 분취물을 복합시킨다. 아세토니트릴을 벗겨내고, 생성된 수용액은 냉동건조시킨다. 황화 결합을 포함하는 생성된 아미드는 질량 스펙트럼으로 확인한다.

펩티드 구조는 전반적으로 유전자-인코드된 아미노산으로 구성된 경우 또는 이의 일부가 구성된 경우, 펩티드 또는 이의 관련 부분은 재조합 DNA 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 인코드하는 DNA는 상업적으로 이용할 수 있는 장비를 이용하여 합성할 수 있고; 숙주의 특징에 따라 합성에 선택 코드를 삽입할 수 있다.

재조합적으로 생성된 프로테그린형은 연속적으로 유도시켜 N- 또는 C-단부를 변형시키고, 분리과정에 따라 여기에서 상술하는 것과 같이 이황화결합 형성에 영향을 준다. 재조합 생산에 이용된 숙주와 단백질이 분리되는 동물 기원에 따라, 이들 전환체의 일부 또는 전부가 영향을 받을 수 있다.

재조합 생산을 위해, 본 발명의 프로테그린을 인코드하는 DNA를 발현 시스템에 포함시켜 적절한 프로모터의 제어 하에 그리고 소요의 숙주 세포에 필적하는 다른 조절 서열하에 이들 코딩 서열을 둔다. 이용할 수 있는 숙주형은 모든 식물과 동물계가 포함된다. 따라서, 본 발명의 프로테그린은 박테리아 또는 이스트에서도 생산될 수 있고(이들은 비독성 또는 굴절(refractile) 형으로 생산될 수 있거나 저항성 균주를 이용한다) 동물세포, 곤충세포 및 식물세포에서 생산될 수 있다. 또한 변형된 식물 세포를 이용하여 관련 발현계를 포함하는 식물을 재생시켜 생성된 유전자전이 식물이 이와 같은 감염성 물질을 자체 생산할 수 있다.

본 발명의 프로테그린은 프로테그린을 인코드하는 DNA, 적절한 시그날 펩티드를 인코드하는 DNA에 융합시켜 숙주 세포에서 이들을 분비하거나 세포내에서 생산될 수 있다. 항균 또는 항바이러스성 화합물로 이용하기 전에 제거할 필요가 있는 또는 없는 추가 아미노산 서열이 있는 융합 단백질로 생산될 수 있다.

따라서, 본 발명의 프로테그린은 화학적 합성, 재조합 생산 또는 이들 기술을 복합하여 생산할 수 있다.

자연 발생하는 프로테그린 종류는 정제형 또는 분리형으로 공급될 수 있다. "정제형 또는 분리형"은 펩티드가 정상적으로 생성되는 환경에는(이와 같은 자연 발생 펩티드의 경우) 없는, 실제 이용되는 형을 말한다. 따라서, "정제된 또는 분리된 형"은 펩티드가 순수한, 가령, 90% 이상 순수한, 적절하게는 95% 이상 순수한, 가장 적절하게는 99% 이상 순수한 것이거나 제약학적 준비물과 같은 완전히 다른 용도의 것을 말한다.

6.2.3. 항체

본 발명의 프로테그린에 대한 항체는 다클론성 항혈청을 생산하기 위한 표준 면역학적 기술을 이용하여 생산할 수 있는데, 필요한 경우, 단클론 항체 생산 원료에서 면역화된 숙주의 항체를 생산하는 세포를 불사화시키는 것이다. 관심이 있는 물질에 대해 항체를 만드는 기술은 공지되어 있다. 물질의 면역원성을 강화시킬 필요가 있는데, 특히, 여기에서 물질이 짧은 펩티드인 경우 담체에 헵탄을 결합시킨다. 이 목적을 위한 적절한 담체에는 헵탄-담체 결합물질을 투여할 포유류에서 면역 반응을 생성하지 않는 물질을 포함한다. 사용될 수 있는 통상의 담체에는 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH), 디프테리아 독소, 혈청 알부민, 레트로바이러스 VP6의 바이러스 코트 단백질을 포함한다. 담체에 헵텐을 결합시키면 디사이클로헥실 카르보디이미드와 같은 탈수화제 존재하에 펩티드에 담체를 접촉시키거나 또는 Pierce Chemical Company, Chicago, IL 에서 이용할 수 있는 링커를 이용하여 실행한다.

면역원 형으로 본 발명의 프로테그린을 적절한 포유류 숙주에 주사하고, 혈청에서 항체 역가를 모니터한다. 그러나, 프로테그린이 항원 프로세싱에 저항성이 있기 때문에 항체를 만들기 전에 일부 프로테그린은 변형을 요한다. 가령, 두 개의 이황화연결을 포함하는 고유 PG-1 은 더 큰 담체에 결합하지 않고 투여하였을 때 비-면역원성이고, 글루타알데히드 또는 KLH 에 결합되어 강력한 어쥬번트가 있을 때에도 면역원성이 약하다. 출원인은 백혈구세포 세린 프로테아제(사람 PMN 엘라스타제와 카텝신 G)에 의한 공격과 몇가지 대식세포 카텝신을 닮은 아스파르트 프로테아제에 의한 공격에 대한 저항성때문인 것으로 본다. 따라서, 세포에 있는 항원-주머니에 맞는 선형으로 프로세스하는데 저항성으로 인하여 이와 같은 면역원성이 부족하게 된다. 이황화결합을 절단하면 이와 같은 형의 프로테그린의 면역원성이 강화될 수 있다. 그러나, Huang, W et al., Mol Immunol (1994) 15:1191-1199 에서 보고된 MAPS 기술을 이용하면 면역원성이 강화될 수 있다.

역가가 충분히 높을 때 다클론성 항혈청을 수득한다. 또는 지라 세포 또는 주변 혈액 임파세포와 같은 항체를 생산하는 세포를 수득하고, 불사화할 수 있다. 불사화된 세포는 개별 콜로니로 클론시키고, 원하는 단클론성 항체의 생산에 대해 스크리닝한다.

항체 생산을 위해 재조합 기술을 이용하고, 따라서, 본 발명의 항체는 유전공학 기술에 의해 만들어진 것을 포함한다. 가령, F_v형과 같은 단일-사슬 형, 키메라 항체, 사람과 같은 특정 종의 것과 비슷하도록 변형시킨 항체들은 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 소요의 항체를 인코드하는 유전자를 분리하거나 변형시키고, CHO 세포와 같은 재조합숙주 세포에서 이를 발현시켜 생산하여 만들 수 있다.

물론, 본 발명의 항체는 프로테그린의 양 또는 존재 유무를 확인하기 위한 면역검사에 유용하다. 이와 같은 검사는 본 발명의 프로테그린을 포함하는 조성물의 조절 생산에 필수적이다. 또한, 항체를 이용하여 프로테그린의 재조합 생산의 효과를 평가하고, 프로테그린 인코드하는 유전자의 존재 하에 발현 라이브러리를 스크립할 수 있다.

6.2.4. 프로테그린을 포함하는 조성물과 이를 이용하는 방법

본 발명의 프로테그린은 그램-음성, 그램-양성 박테리아, 이스트, 원생동물, 특정 바이러스를 포함하는 다양한 범주의 미생물과 표적 바이러스를 비활성화시키는데 효과적이다. 이들의 광범위한 활성으로, 본 발명의 프로테그린은 보존제로써 그리고, 치료와 예방 목적에 이용될 수 있다.

MRSA(메티실린 저항성), MSSA(메틸실린-감음성 균주)를 포함한 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)와 E. 페칼리스(VREF 또는 반코마이신 저항성 E. 페칼리스 반코마이신-감응성 E. 페칼리스 포함)(E. faecalis)와 같은 주요 병인균을 포함하는 그램-양성 박테리아에 대해 살균성이 있다. 적절한 표적이 될 수 있는 다른 그램-양성 박테리아에는 리스테리아 모노사이토진(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)(PRSP, 페니실린 저항성 형태 포함), S. 미티스(S. mitis), S. 상구이스(S. sanguis), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis)(메티실린 감응성 균주 MSSE 포함), S. 살리바리우스(S. salivarius), 코리네 박테리움 미누티시움(Corynebacterium minutissium), C. 슈도디프테리아(C. pseudodiphteriae), C. 스트라툼(C. straitum), 코리네박테리움 그룹 G1 과 G2(Corynebacterium), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다. PRSP는 넓은 범위에서 건강에 유해하다.

프로테그린이 효과를 나타내는 그램-음성 유기체에는 에쉬리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 클렙스엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 세라티아 마르세신스(Serratia marcescens), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 아시네토박터 칼로코아세티쿠스(Acinetobacter calocoaceticus), C. 뉴모니아(C. pneumoniae), 나이제리아 메닝지티두스(Neisseria meningitidus)와 전술한 종에 속하는 다른 것들을 포함한다. 가령, 나이제리아 고노리에(Neisseria gonorrhoeae)는 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis)와 같은 성병 질환(STDs)과 연관이 있다. 그램-음성 유기체 가운데, 위장 병인균 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), H. 펠리스(H. felis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)등이 된다.

그램-음성과 그램-양성 박테리아이외에, 본 발명의 프로테그린은 M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 M. 아비움(M. avium)(MAC 포함)과 같은 미코박테리아; 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 관련 병인균, C. 파라피실로스(C. parapsilosis), C. 쿠루세이(C. krusei), C. 트로피칼리스(C. tropicalis), C. 글라브라타(C. glabrata)와 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger)와 같은 곰팡이의 감염과 성장에 대해서도 효과가 있다. 프로테그린이 효과를 가지는 바이러스가운데에는 허피스 심플렉스 I 와 II 그리고 사람 면역결핍 바이러스(HIV)가 있다.

다음은 설명을 위함이고, 이에 국한시키는 의도는 아니다.

언급한 바와 같이, 프로테그린을 감염 예방 조성물에 사용하거나, 음식물, 화장품, 약물 또는 유기체를 위한 영양분을 포함하는 다른 물질 등에 보존제로 사용할 수 있다. 이와 같은 용도를 위해, 단일 프로테그린으로 공급되거나 몇가지 다른 프로테그린과 혼합하거나 추가 항균 물질과 혼합하여 공급될 수도 있다. 일반적으로, 방부제로 이용될 때, 이들은 상당히 낮은 농도, 총 조성물 중량의 5% 이하, 적절하게는 1% 이하, 가장 적절하게는 0.1% 이하가 된다.

본 발명의 펩티드는 리포폴리사카라이드와 같은 엔도톡신에 결합하는 화합물의 능력을 검사하기 위한 검사 및 항균 검사에서 표준으로 이용될 수 있다.

동물을 치료하기 위한 항균 또는 항바이러스 제로써 이용하기 위해, 본 발명의 프로테그린은 제약학적 또는 수의학적 조성물로 조제될 수 있다. 치료할 개체, 투여방법, 치료가 필요한 형-가령, 예방, 방지, 치료-에 따라, 이들 변수에 맞게 조제될 수 있다. 이와 같은 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PA 에서 요약하고 있다.

프로테그린을 이용하여 동물에서 치료요법적 그리고 예방학적인 처리를 할 수 있는데; 감염을 "치료"한다는 것은 증상이 발생되는 것을 막거나 감소시키고, 개체에서 미생물이 자라는 것을 방해하고, 개체에 유익한 미생물에 대해서 다른 음성적인 효과를 주는 것을 방지한다는 의미이다. 따라서 "치료"는 예방학적 그리고 치료학적 의미를 모두 가진다.

프로테그린은 클라미디아 트라쵸마티스(Chlamydia trachomatis), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 허파스 심플렉스 II 와 HIV 에 의한 질병을 포함한 성병 질환을 치료하는데 유용한 제약학적 조성물에 활성 성분으로 유익하다. 적절한 국소적인 부형제는 본 기술 분야에 공지되어 있고 이는 당업자가 특정 용도에 맞게 선택할 수 있다.

일반적으로, STDs 의 치료 또는 예방에서 이용하기 위해, 본 발명의 프로테그린을 단독으로 이용하거나 에리트로마이신, 테트라사이클린, 마크로리드 가령, 아지트로마이신과 세팔로스포린과 같은 다른 항생제와 복합하여 사용될 수 있다. 투여방식에 따라, 프로테그린은 감염부위에 수송될 수 있도록 적절한 조성물로 조제된다. 프로테그린은 하나 또는 두 개의 이황화결합 다리를 포함하는 형태이거나 또는 선형이 될 수 있다. 또한 모두 D-아미노산을 포함하는 이성체 형을 이용하면, L-아미노산을 포함하는 프로테그린이 다소 저항성이 약한 트립신과 키모트립신과 같은 프로테아제에 저항성을 갖는 장점이 있게 된다.

본 발명의 프로테그린은 단족으로 투여되거나 몇 가지 프로테그린과 혼합되거나 다른 제약학적 활성 성분과 복합되어 투여될 수 있다. 조성물은 전신 투여 또는 국소 투여에 적합하도록 적절한 방식으로 조제된다. 전신 조제물에는 주사용(예를 들면, 근육내에, 정맥내, 복막내에 또는 피하내에 주사용)이나 경피, 경점막 또는 경구 투여용으로 조제될 수 있다. 조성물에는 일반적으로 희석제를 포함하나 일부 경우에는 어쥬번트, 완충액, 보존제등이 포함된다. 프로테그린은 리포좀 조성물 또는 다른 마이크로 에멀젼으로 투여될 수 있다.

경구로 투여될 경우에, 본 발명의 프로테그린은 적절한 장 코팅을 위용하여 위장관에서 분해되지 않도록 한다. D-아미노산을 이용하여 어느 정도 이와 같은 분해를 피할 수 있고 프로테아제에 저항성도 제공한다. 프로테그린은 상대적으로 산에 안정적이나, 어느 정도의 장(enteric) 코팅이 요구된다.

본 발명의 프로테그린은 안구 보호/치료 상품에 통상적으로 이용되는 보레이트 용액에 있는 미생물에 대한 활성을 보유한다. 보레이트 완충염에서 리소자임 유무하에 대장균(E. coli)에 대한 항균 활성을 테스트하였을 때 리소자임의 존재로 인하여 PG-3의 효과를 강화시킨 것을 볼 수 있다. PG-3를 증기 살균시켰을 때 이 효과가 더욱 두드러지는데, 유사한 패턴을 자유-산 형태와 아미드에서 얻을 수 있다. 따라서, 프로테그린은 결막염, 각막 궤양등과 같은 눈의 감염 치료용 항균제 또는 이와 같은 조성물에서 보존제로 이용될 수 있다.

상대적으로 높은 염을 포함하는 생리학적인 조건과 혈청 존재하에 프로테그린이 이들의 활성을 보유한다는 것이 특히 중요하다. 또한, 프로테그린은 미생물에 대한 독성과 비교할 때 고등 유기체의 세포에는 독성이 급격히 떨어진다. 실시예에서 상술하고 있는 이와 같은 성질은 생체와 치료요법적 용도에 특히 적합하다.

실시예에서 본 발명의 특정 프로테그린을 선택하는 방법에 의해 설명하겠지만, 특정 표적 미생물에 대해 이의 효과를 최대로 하기 위해 항균 활성을 채택할 수도 있다. 여기에서, "미생물"에는 이스트, 박테리아, 다른 단세포 유기체와 바이러스를 포함한다. 가령 특정 조건하에서는 PG-1과 비교할 때 PC-19가 특히 효과를 가질 수 있다. 특정 프로테그린은 낮은 염 또는 생리학적 염, 사람 혈청의 존재유무 또는 혈액과 체액에서 발견되는 조건을 닮은 조건에 따라 유리하게 선택될 수 있다.

본 발명의 프로테그린은 이들 식물에 바이러스 및 미생물에 의해 유도되는 질병을 예방하기 위해 이들 환경에 또는 식물에 공급될 수 있다. 이와 같은 용도에 적합한 조성물에는 희석제, 분산제 또는 식물 또는 환경에 유익한 보조제를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 프로테그린을 항균 또는 항바이러스 활성을 요구하는데 이용할 수 있다. 이와 같은 용도는 시험관 용도가 될 수 있고 또는 펩티드는 유기체에 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 프로테그린의 생산에 적합한 발현 시스템을 투여하여 그 자리에서 항균 또는 항바이러스 활성을 발생시킬 수 있다. 이와 같은 발현 시스템은 공지의 기술을 이용하여 식물 및 동물 개체에 공급될 수 있다. 가령, 동물에서, in situ 펩티드를 만들기 위해 폭스(pox)-계 발현 벡터를 이용할 수 있다. 유사하게, 식물세포를 발현벡터로 형질 전환시키고, 전체 식물이 펩티드를 자체 생산할 수 있도록 한다.

프로테그린은 또한 표준 검사에서 그램-음성 박테리아에서 유도된 엔도톡신 -가령, 리포폴리사카라이드(LPS)-을 비활성화시킬 수 있다. 따라서, 프로테그린은 LPS를 비활성화시킬 필요가 있는 환경에 이용될 수 있다. 이와 같은 상황중에 하나는 그램-음성 폐혈증의 치료 또는 제거가 된다.

6.2.5. 항균/항바이러스 활성과 연관된 조건

여기에서 상술하는 바와 같이, "항균" 활성은 전통적인 미생물과 바이러스에 대해 저해를 나타낸다는 의미로써, "항균성" 및 "항바이러스성" 모두 특이적으로 지칭하는 것이다.

프로테그린의 특히 유용한 성질은 혈청 존재하에 활성이 있다는 것이다. 데펜신과는 달리, 프로테그린은 혈청 존재하에 이들의 항균활성을 나타낼 수 있다.

항균 활성을 테스트하기 위한 배지는 특정 조건을 모방하도록 고안하였다. 표준 완충액 배지, 배지 A는 다음의 조성물과 바닥에 까는 한천을 이용한다: 트립티카제 콩 브로스 분말 0.3㎎/㎖, 아가로즈 1% w/v, 인산나트륨염 완충액(최종 pH 7.4) 10mM. 이는 "배지 A" 또는 "표준 시험관 조건"으로 칭한다.

나머지 배지에는 이와 동일한 성분을 포함한다. 또한 혈액과 조직액에 염 수준을 모방하기 위해 100mM NaCl을 포함하는 제 2 배지. 이는 "배지 B" 또는 "염 배지"로 지정한다.

제 3 배지에는 2.5% 정상 사람 혈청을 보충한다. 그러나, 이온 강도가 낮고 따라서 체액과는 다르다. 이 배지는 "배지 C" 또는 "혈청을 포함하는 배지"로 칭한다.

제 4 배지에는 80% RPMI-1640, 주요 이온과 혈액 및 조직액에서 볼 수 있는 아미노산을 포함하는 표준 조직 배양 배지를 포함한다. 또한, 2.5% 정상 사람 혈청을 포함한다. 이것은 "배지 D" 또는 "생리학적 배지"로 칭한다.

실시예에서는 항균 성질을 테스트하는데 유용한 다른 배지들도 제공한다.

6.2.6. 특정 징후

본 발명의 특정 프로테그린은 특정 징후를 치료하는데 효과가 있는 것으로 발견되었다. 가령, 감염제가 특히 메티실린 저항성 균주인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 미생물 감염의 치료에 있어서, 출원인은 다음의 아미드가 효과가 있음을 발견하였다.

또한 WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:180) 자유 산성형이 적절하였다.

슈도모나스(Pseudomonas) 감염을 치료하는데 있어서, 출원인은 다음의 아미드가 효과가 있음을 발견하였다.

또한 펩티드 RLCYCRRRFCVCV (SEQ ID NO:66) 자유-산형도 효과가 있다.

마지막으로 H. 플로리(H. pylori)에 의한 감염을 치료하는 경우에, 출원인은 다음의 아미드 화합물이 효과가 있음을 발견하였다.

또한 펩티드 RRRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID NO:240) 의 자유 산과 이성체(모두-D형)도 효과가 있었다.

6.3. 효과적인 약량

본 발명의 펩티드 또는 이의 조성물은 소요의 목적을 얻기 위해 효과량으로 사용된다. 물론, 사용된 약량은 특정 용도에 따라 달라진다.

가령, 감염예방 또는 보존제로 사용되는 경우에, 펩티드 또는 이의 조성물의 항균 효과량은 감염을 예방 또는 보존할 물질에 첨가된다. 항균 효과량이란, 표적이 되는 미생물 집단을 죽이거나 이의 성장을 저해하기 위한 펩티드 또는 조성물의 양을 의미한다. 실제 항균 효과량은 특정 용도에 따라 달라지나, 감염예방 또는 보존제로 사용할 때, 펩티드 또는 이의 조성물은 상대적으로 낮은 양으로 감염을 예방하거나 보존될 물질에 첨가된다. 일반적으로, 펩티드는 보존될 용액 또는 물질의 중량에 5% 이하, 적절하게는 1% 이하, 가장 적절하게는 0.1% 이하로 구성된다. 당업자는 실시예에서 제공하는 시험관 검사를 이용한 실험없이도 특정 용도에 특정 펩티드의 항균효과량을 결정할 수 있다.

미생물 감염 또는 이와 연관된 질병을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위해, 본 발명의 펩티드 또는 이의 조성물은 치료요법적 효과량으로 투여된다. 치료요법적 효과량은 미생물 감염 또는 이와 연관된 질환을 치료 또는 예방, 경감시키는데 필요한 효과량을 말한다. 당업자는 여기에서 제시하는 상세한 설명에 기초하여 치료요법적 효과량을 결정할 수 있다.

감염예방제 및 보존제의 경우에, 박테리아, 이스트, 곰팡이 또는 다른 감염을 치료하거나 예방하기 위한 국소 투여용으로, 치료요법적 효과량은 실시예에서 제공하는 시험관 검사를 이용하여 결정한다. 감염이 보이거나 보이지 않을 때 치료를 할 수 있다. 당업자는 실험 없이도 국소 감염을 치료하기 위한 치료요법적 효과량을 결정할 수 있다.

전신투여를 위해서, 시험관 검사에서 치료요법적 효과량을 결정할 수 있다. 가령, 동물 모델에 순환 펩티드 농도범위를 얻기 위한 약형으로 조제될 수 있는데 이때 농도 범위에는 세포 배양물에서 결정된 IC₅₀(가령, 세포 배양물의 50%를 치사하는 테스트 화합물의 농도), 세포 배양물에서 결정된 MIC(성장을 최소로 저해하는 농도) 또는 세포 배양물에서 결정된 IC₁₀₀(세포 배양물을 100% 죽이는 펩티드 농도)등을 포함한다. 이와 같은 정보를 이용하여 사람에게 유용한 약량을 좀더 정확하게 결정할 수 있다.

초기 약형은 본 기술에 공지된 기술을 이용하여 동물 모델과 같은 생체 데이타에서 평가할 수 있다. 당업자는 동물 데이타에 기초하여 사람에게 투여를 최적화시킬 수 있다.

약량과 투여 간격은 치료요법적 효과를 유지하는데 충분한 활성 펩티드의 혈장 수준을 제공할 수 있도록 개별적으로 조절할 수 있다. 일반적으로 환자에 투여하는 주사약량 범위는 약 0.1∼5㎎/㎏/day, 적절하게는 약 0.5∼1㎎/㎏/day 이다. 매일 여러회 약량을 투여하여 치료요법적 효과가 있는 혈청 수준을 유지할 수 있다.

국소 투여 또는 선택적인 수용의 경우에, 펩티드의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와는 무관하다. 당업자는 실험없이 치료요법적 효과적인 국소 약량을 최적화시킬 수 있다.

물론, 투여될 펩티드 약량은, 치료될 개체, 개체의 중량, 질병의 심각도, 투여방식 및 처방의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.

항균 용법은 감염이 감지되는 동안 또는 감지되지 않을 때에도 간헐적으로 반복한다. 요법은 단독으로 또는 항생제와 같은 다른 약물 또는 다른 항균성 펩티드와 복합하여 사용될 수 있다.

6.4. 독성

적절하게는 여기에서 상술하는 펩티드의 치료요법적 효과량은 실제 독성을 유발하지 않고 치료요법적 잇점을 제공한다.

여기에서 상술하고 있는 펩티드의 독성은 LD₅₀(집단의 50%를 치사시키는 약량) 또는 LD₁₀₀(집단의 100%를 치사시키는 약량)을 측정하여 세포배양물 또는 실험동물에서 표준 제약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료요법적 효과사이에 약량 비율이 치료요법 지수가 된다. 이와 같은 세포 배양물 검사와 동물 연구에서 수득한 데이타를 이용하여 사람에 사용시에 독성이 없는 약량 범위로 조제할 수 있다. 여기에서 상술하고 있는 펩티드의 약량은 독성이 거의 없는 효과량을 포함하는 순환 농도 범위에 있다. 약량은 이 범위내에서 이용되는 약형과 이용된 투여 경로에 따라 다양하게 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 약형은 환자의 상태에 따라 개별 의사가 선택한다(Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).

요약

다음과 같은 성질로 인하여 본 발명의 프로테그린은 유용한 화합물을 제공한다:

1) 레트로바이러스를 포함하는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 이스트, 원생동물을 포함하는 표적 미생물에 대해 항균효과를 가진다.

2) 이들의 항균 활성은 생리적 조건-가령 생리적 염, 혈청 존재- 하에 효과를 가진다.

3) 이들은 미생물에 대해서 보다는 고등 유기체의 세포에 독성이 상당히 적다.

4) 비-면역원 형으로 준비할 수 있어 투여하는 종의 수를 확장시킬 수 있다.

5) 특정 프로테아제에 저항성이 있는 형태로 만들어 리소좀에서도 항균성이 있다.

6) 표적에 대해 특이성을 최대화하기 위해 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다.

7) 항균 활성을 가지는 조건에 맞도록 구조적으로 변형시킬 수 있다.

다음의 실시예는 설명을 위한 것이고 이에 국한시키고자 함은 아니다.

실시예 1.

PG-1, PG-2, PG-3 의 분리와 이의 활성

전술한 PCT/US94/08305 에서 상술한 것과 같이, 다음의 아미노산 서열을 가지는 세가지 항균성 펩티드를 돼지 백혈구세포에서 분리하였다.

이때 C-단부는 아민화되었다.

이들 특정 프로테그린은 항균 활성에 대해 검사하였다.

PG-1과 PG-3은 사람 호중구 펩티드 HNP-1 보다는 대장균(E. coli) ML-35P에 더 효과가 있었고, 토끼 데펜신 NP-1 보다는 효과가 다소 떨어졌다. PG-1과 PG-3는 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes), 균주 EGD와 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해서도 효과가 있다. 일반적으로, 이들 펩티드는 중량을 기준으로 토끼 데펜신 NP-1과 거의 효과가 비슷하였고, HNP-1 보다는 효과가 크다. 모든 경우에서, PG-2는 테스트한 세 가지 유기체에 대해 효과가 있으나 다른 두 가지 펩티드에 대해서는 활성이 없다.

PG-1은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 K. 뉴모니아(K. pneumoneae) 270의 성장을 직접적으로 방해하는 것으로 나타났다. 기준으로 사용된 HNP-1은 S. 아우레우스(S. aureus)에 대해서는 다소 효과가 적었고, K. 뉴모니아(K. pneumoneae)에 대해서는 전체적으로 효과가 없었다.

다양한 다른 유기체에 대해 프로테그린을 테스트하였는데 이들은 광범위한 활성을 가지고 있었다. STDs와 연관된 미생물의 감염 또는 성장을 방해하는데 효과가 있는 것에 추가하여, 여기에서 테스트한 미생물에 추가로 다음의 미생물에 대해 강력한 활성을 가지는 것을 볼 수 있다: 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 클렙스엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 히스토플라즈마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 미코박테리아 아비움-인트라셀룰라(Mycobacterium avium-intracellulare), 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis). 비브리오 불리피커스(Vibrio vulnificus)에 대해서도 프로테그린이 활성을 나타내었고, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)와 보레리아 부르도르페리(Borrelia burgdorferi)에 대해서는 활성이 없다.

여기에서 상술하는 세 가지 프로테그린은 100mM NaCl, 90% 태아 송아지 혈청의 존재를 포함하는 다양한 반응 조건에서 이들의 활성을 보유하였다.

프로테그린은 안과 보호 용품에 사용하는 보레이트 용액과 등장액을 포함하는 생리적인 조건에서 유용한 항균활성을 보유하였다.

PG-1과 PG-3은 100mM NaCl 존재하에서 C. 알비칸(C. albicans)과 대장균(E. coli)에 대해 각 활성을 보유하였다. NP-1 또는 HNP-1은 이와 같은 성질이 없었다. 90% 태아 송아지 혈청에서 NP-1과 NHP-2 는 C. 알비칸스(C. albicans)를 저해하는 능력을 상실하나 PG-3은 저해 활성을 보유하고 있다.

반응조건을 변경시켜도 프로테그린은 다양한 활성 패턴을 나타내었다. 10mM 인산 나트륨염 완충액(pH 7.4)만을 포함하는 한천에서 2.5% 정상 사람 혈청 유무하에 트립티카제 콩 브로스로 1:100으로 희석하여 대장균(E. coli) ML-35(혈청 감응성)에 대해 합성 PG-1을 테스트하였는데, 대장균(E. coli) 균주에 대한 용혈 농도 이하가 된다. 혈청 존재하에, 최소 박테리아 치사 농도는 약 1.0㎍/㎖에서 0.1㎍/㎖로 감소되었다. 이와 같은 효과는 카텝신 G 또는 데펜신 HNP-1 에서는 관찰되지 않았다.

유사하게, 표적 미생물로 C. 알비칸(C. alibicans)을 이용하고, 한천에는 10mM 인산 나트륨염과 10% 정상 사람 혈청 유무하에 준비하였다. 최소 곰팡이 치사 농도는 혈청이 없는 경우에 1.3㎍/㎖이고, 혈청이 있는 경우에 0.14㎍/㎖ 범위에 속한다. 이 농도에서 혈청 자체는 C. 알비칸(C. albicans)에 영향을 주지 않는다. 표적 미생물은 L. 모노사이토진스(L. monocytogenes)를 이용하면 유사한 결과를 얻는다.

프로테그린 PG-1와 PG-3은 pH 2.0에서 4시간동안 0.5㎍/㎖ 펩신으로 배양시키고, 중화시킨다. C. 알비칸(C. albicans), 대장균(E. coli), L. 모노사이토진스(L. monocytogenes)에 대한 잔류 항균 활성을 평가하고, 충분히 보유하고 있음을 발견하였다. 유사한 실험에서 이들 화합물은 사람 백혈구 엘라스타제 또는 사람 백혈구 카텝신 G 고농도에서, 단백질 분해 활성에 유리한 pH 7.0-8.0 에서 노출시킬 때에도 이들 효소에 의해 분해되지 않음을 알 수 있다. 또한 합성 PG-3 아미드와 PG-3는 증기 살균시키고, 대장균(E. coli), L. 모노사이토진스(L. monocytogenes)와 C. 알비칸(C. albicans)에 대해 항균 활성이 있는 지를 테스트하였는데 모든 경우에 완전한 항균 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 프로테아제 분해와 증기 멸균에 대해 이들 화합물의 안정성은 이황화결합이 존재함으로써 강화될 수 있다.

프로테그린은 그램-음성 박테리아 대장균 균주(E. coli) 0.55B5 의 지질 폴리사카라이드(LPS)에 결합하는 능력에 대해 테스트하였다.

아민화된 그리고 아민화안된 형태의 합성된 그리고 고유의 PG-1, PG-2, PG-3는 2.5㎍/0.2㎖의 낮은 농도에서도 LPS에 결합할 수 있다. 다소 더 낮은 농도에서도 nPG-1와 nPG-2가 효과가 있다. 프로테그린은 NP 또는 HNP 테스트 화합물보다 실제 더 효과가 있고; 이들 기준 물질에서 가장 효과가 있는 것은 NP-3a, 펩티드로 이의 1차 서열은 프로테그린의 것과 상당히 유사하다.

LPS의 농도를 증가시켜 겔 형성 방해를 극복할 수 있어 LPS와의 상호작용은 겔 형성 효소의 방해하기보다는 겔 형성이 부족하기 때문이다.

이황화 결합을 SH기로 전환시키는 환원제를 이용하여 nPG-1와 nPG-3은 선형으로 전환되는데 이때 SH기는 요오드아세타미드로 알킬화시켜 안정화시킨다.

선형 프로테그린은 엔도톡신 검사에서 겔 형성을 방해하고, 엔도톡신에 결합되는 것을 방해하는 고리형과 동등하다.

테스트된 고리형 및 선형 프로테그린은 표적 유기체의 성질 및 테스트 조건에 따라 항균성이 달라지기는 하나 여전히 항균활성을 지속적으로 나타내었다.

대장균(E. coli) ML-35P 에 대해 20㎍/㎖-125㎍/㎖ 농도범위에서 고리 및 선형 PG-1와 PG-3의 항균 활성은 100mM NaCl 유무하에 측정하였다. 선형이 완충액 단독하에 고리형보다는 더 강력하고; 한편, 고리형은 등장액 조건하에 선형보다는 더 강력하였다.

L. 모노사이토진(L. monocytogenes)의 경우에, 프로테그린의 고리과 선형은 염이 없는 경우 강력한 항균활성을 가지고 이들 모두 테스트된 농도 범위(20㎍/㎖-125㎍/㎖)에서 동일한 효과를 나타내었다. 고리형은 약간 더 높은 농도범위에서 100mM NaCl에서 강력한 항균 활성을 보유하였다. 선형화로 활성이 약간 낮아지는 것으로 나타났는데 고농도에서는 여전히 항균 효과를 나타내었다.

모든 형태의 프로테그린은 10mM 인산염 완충액 존재하에 테스트하였을 때 상기 농도범위에서 약량에 따라 C. 알비칸(C. albicans)에 대해 효과가 있었고 선형화된 펩티드는 다소 효과가 적었다. 고리형에는 100mM NaCl에서 동일 수준의 항균효과를 보유하고 있는데, 선형의 활성은 상당히 감소되어, 100㎍/㎖ 농도이하에서는 프로테그린은 실제 항균 효과가 없었다. 130㎍/㎖의 고농도에서 약간의 항균 효과가 관찰되었다.

따라서, 표준 미생물과 사용된 조건에 따라 PG-1, PG-3의 고리형 및 선형은 항균 활성을 가지고 있다.

콘택트 렌즈 액은 보레이트 완충 염으로 만드는데 추가로 EDTA를 포함할 수도 있다. 합성 PG-3 아미드와 합성 PG 산형태의 프로테그린은 겔에 25mM 보레이트 완충염, pH 7.4, 1%(v/v) 트립토즈 콩 브로스(0.3㎍/㎖ TSB 분말), 1% 아가로즈를 포함하는 조건하에 테스트하였다. 추가로 100mM NaCl, 1mM EDTA 또는 이들의 복합물을 포함한다. 기준으로 이용된 다른 테스트 화합물은 데펜신 NP-1와 리소자임이다. 약량 반응곡선을 만들었다.

이와 같은 프로테그린은 25mM 인산염 완충액에서 보다는 25mM 보레이트 완충염에서 다소 활성이 적으나, 항균 활성은 생리염을 추가하면 강화되고, 1mM EDTA에 의해 약간 강화될 수 있다.

C. 알비칸(C. albicans)와 L. 모노사이토진(L. monocytogenes)으로 테스트한 결과 프로테그린은 안과 보호 용품에 적절한 조건하에 이들의 항균활성을 발휘할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 2.

cDNA 클론의 회수

상기 WO 95/03325 에서 상술된 것과 같이, PG-1, PG-2, PG-3, PG-4를 인코드하는 cDNA를 돼지 백혈구 세포에서 만들고 이들 프로테그린을 인코드하는 DNA 서열은 도 7 에 제시하였다.

실시예 3.

PG-1, PG-3, PG-5를 인코드하는 게놈 DNA의 회수.

QIAGEN 혈액 DNA 키트(QIAGEN, Chatsworth, CA)로 돼지 백혈구 세포에서 고분자량 DNA를 정제하였다. 프로테그린(PG) 유전자를 증폭하기 위해 주형으로 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 실행한다.

센스 프라이머(5'-GTCGGAATTCATGGAGACCCAGAG(A or G)GCCAG-3')는 실시예 2 의 PG cDNA의 5' 부분에 상응하고 여기에 EcoRI 제한효소부위를 제공한다. 안티-센스 프라이머(5'-GTCGTCTAGA(C or G)GTTTCACAAGAATTTATTT-3')는 PG cDNA의 폴리(A) 꼬리의 바로 앞 3' 단부에 상보적인 것으로 XbaI 제한효소부위를 제공한다. 반응은 총 50㎕에서 실시하는데 여기에는 정제된 돼지 게놈 DNA 200ng, 각 프라이머 25 pmoles, 10mM dNTP 1㎍, 10X PCR 완충액 5㎍(200mM 트리스-HCl, 100mM(NH₄)₂, 20mM MgSO₄, 1% 트리톤 X-100, 0.1% BSA)와 클론된 Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA) 2.5 unit를 포함한다. 각 30회 실시하고, 각 단계는 94℃에서 1분간, 변성, 55℃에서 1분간 프라이머 어닐링(annealing)시키고, 72℃에서 2분간 프라이머 연장시키고, 최종 72℃에서 10분간 연장시키는 단계로 구성된다.

증폭된 PCR 생성물은 EcoRI과 XbaI으로 절단하고, 아가로즈 겔에서 절단하여 정제하고, EcoRI와 XbaI 으로 처리하여 정제한 pBluescript KS+ 벡터에(Stratagene, La Jolla, CA) 결찰시킨다. DNA 두 가닥은 Sequences version 2.0 kit(United States Biochemical, Cleveland, OH) PG 게놈과 cDNA 서열에 기초하여 pBluescript 공통 프라이머와 특정 올리고머 프라이머를 이용하여 디데옥시 방법에 의해 서열화시킨다. PC-Gene Program(Intelligenetics, Palo Alto, CA)을 이용하여 DNA 서열을 컴퓨터 분석한다.

약 1.85kb PCR 생성물은 프로테그린 cDNA 서열 nt 403-429 에 상보적인 프로테그린-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브로 하이브리드시켜 프로테그린-에 연관됨을 확인하였다. PCR 생성물은 pBluescript 벡터에 서브클론시키고, 재조합 플라스미드를 DNA 정제와 서열화시킨다. 세가지 상이한 프로테그린에 대한 유전자 서열은 PG-1, PG-3, PG-5로 확인되었다. 뉴클레오티드 서열과 유추된 아미노산 서열은 도 1 에 나타내었다.

프로테그린 cDNAs와 유전자를 비교하면, 프로테그린 유전자의 코딩 서열은 세 개의 인터론이 끼어있는 4개 엑손으로 구성된다는 것을 알 수 있다(도 2). 엑손 I 은 5' 비-코드 부분과 프로테그린 프레프로펩티드의 제 1 아미노산에 대한 코돈을 포함하고 여기에는 29개 잔기 시그날 펩티드와 제 1 37개 카테린 잔기를 포함한다. 엑손 II 와 III 은 각 108bp와 72bp로 상대적으로 작고, 그 다음 60개 카테린 잔기를 함께 보유한다. 마지막 두 개 카테린 잔기는 엑손 IV 에 있고 그 다음 프로테그린 서열이 있다. 엑손-인트론 접합부위 서열은 다음의 표에 나타나있다. 이는 표준 규칙에 상응한다: 모든 인트론은 AG로 끝나고, 8-12개 염기의 T/C 부분이 있고, 모든 인트론은 GT로 시작하고 이어서 A/G A/G G 서열이 이어져 있다.

매우 보존성이 큰 카테린 부위는 엑손 I-IV 에 연장되어 있고 엑손 IV 에는 성숙한 프로테그린 펩티드와 전체 서열과 아미드화된 표준 서열, 3'-해독 안되는 부분, 가상 폴리아데닐화 부분을 포함한다. 세 개 인트론은 크기가 152∼596bp 범위가 된다. 프로테그린 유전자가 다른 카테린-유사 유전자를 대표하는 경우 카테린-연합된 펩티드의 제 3 인트론은 엑손 IV을 인코드하는 가변성 항균 펩티드에서 매우 보존된 카테린 부분의 마지막 두 개 잔기에서 분리된다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 배열은 프레프로-부분을 포함하는 카테론을 나타내는 처음 세 개 엑손과 가변 엑손 IVs 와의 연합된 재조합 기작에 유리하다.

따라서, 자연적으로 발생하는 프로테그린의 족에는 적어도 5개 구성부를 포함한다. 도 5에는 돼지 백혈구세포에서 발견되는 5개 프로테그린의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 1-3, 5-9, 13, 15-16 위치에서 완전한 동일성을 나타낸다.

EMBL/GenBank 에 대해 프로테그린 유전자의 유사성 연구에서 상당히 동일한 유전자는 확인되지 않았다. 더 구체적으로, 프로테그린의 유전자 구조와 뉴클레오티드 서열은 골수 데펜신에는 3개 엑손이 포함되고, 장 데펜신 유전자에는 2개 엑손이 포함된 데펜신의 것과는 상당히 다르다. 예상한 것과 같이, 연구결과로 카테린-연합된 소, 돼지, 토끼 백혈구 세포 펩티드에 상응하는 cDNAs를 만든다.

추가로 프로테그린-연관된 유전자를 연구하기 위해,³²P-라벨된 프로테그린 cDNA가 있는 EMBL-3 SP6/T7에 약 2.3×10⁵클론의 돼지 게놈 라이브러리를 스크리닝하였는데 45개 하이브리드된 클론을 확인하였다.

EMBL3 SP6/T7 파아지에서 돼지 간 게놈 라이브러리는 Clontech(Palo Alto, CA)에서 구입하였다. 대장균(E. coli) 균주 K803은 숙주로 이용하였고, 파이지 플락의 DNA는 나일론 막(DuPont, Boston, MA)에 옮긴다. 필터는³²P-라벨된 돼지 691 PG-3 cDNA로 하이브리드시킨다. 필터는 여러 번 세척하고, 마지막으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세척하고, x-선 필름에 노출시켜 -70℃에서 스크린 한다. 양성 클론은 낮은 밀도에서 플락 정제를 위해 추가 두 가지 과정을 거치게 된다.

하이브리드 클론에서 정제된 DNA는 다양한 제한효소 엔도뉴클레아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리하고, 0.8% 아가로즈 겔에서 분류하고, GeneScreen Plus 막(DuPont, Boston, MA)에 옮긴다. 하이브리드화된 프로브는³²P로 라벨시키고, 여기에는 돼지 PG-3 cDNA와 PG-1, 2, 3, cDNA의 nt 403-429 에 상보적인 5'-라벨된 프로테그린-특이적 올리고 뉴클레오티드를 포함한다. cDNA 프로브의 경우, 라이버리리 스크리닝에서와 같이, 하이브리드 반응과 세척을 실행한다. 올리고 뉴클레오티드 프로브의 경우에, 막은 42℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세척한다.

프로테그린 cDNA와 프로테그린 cDNA 서열의 nt 403-429 에 상보적인 프로테그린 특이적 올리고뉴클레오티드로 하이브리드시켜 양성 클론에서 정제된 DNA로 서든 블랏 분석을 실행한다. 비록 모든 클론이 완전한 cDNA 프로브로 하이브리드되나 이들중 절반이 프로테그린-특이적 프로브와 하이브리드된다. 돼지 프로페닌에 대한 특정 올리고뉴클레오티드 프로브, 다른 카테린-연합된 돼지 백혈구 세포-유도된 항균성 펩티드는 프로테그린이 아닌 몇 개의 클론에 하이브리드 된다. 이와 같은 결과에서, a) 카테린에 동일한 보존된 프로부위는 성숙한 항균 펩티드의 동일 유전자에 있고 전사후 단계에 의해 첨가되지 않고, b) 프로테그린은 돼지에 있는 카테린-유관 유전자의 절반을 차지한다는 것을 확인하였다.

PG-5의 아미노산 서열에 상응하는 합성 펩티드를 준비하고, 대장균(E. coli), L. 모노사이토진(L. monocytogenes), C. 알비칸(C. albicans)에 대해 항균 활성을 테스트하였다. 결과를 합성된 PG-1의 결과와 비교하였다. 결과는 도 3a-3c 에 나타내었다. 그래프로 나타낸 결과에서, PG-5는 테스트한 세가지 유기체 모두에 대해 PG-1과 필적할 항균 활성을 가진다는 것을 볼 수 있다.

실시예 4.

이성체 PG-1 의 준비.

표준 고체상 기술을 이용하여, PG-1의 아미노산 서열을 가지나 모든 아미노산이 D-형인 프로테그린을 만든다. 이와 같은 형태의 프로테그린은 프로테아제 유무하에 대장균(E. coli), L. 모노사이토진(L. monocytogenes), C. 알비칸(C. albicans)에 대해 테스트하였고, Lehrer, R.I. et al. J Immunol Meth (1991) 137:167-173 에서 상술하는 것과 같이 아가로즈 겔에서 방사확산 검사에 대해 테스트하였다. 이 결과에서, 프로테아제가 없을 때 고유 PG-1과 이성체 PG-1은 대장균(E. coli)의 성장을 저해하는데 동일한 효과를 가졌다. 트립신이나 키모트립신은 이성체 PG-1의 항균 효과를 저해하지 못했다. 이와 같은 단백질 분해성 효소 존재하에, L. 모노사이토진(L. monocytogenes)의 생장을 저해하는 고유 PG-1의 능력이 불리하게 영향을 받지만, 이들 프로테아제가 없는 경우, PG-1은 이성체 PG-1과 활성이 유사하다.

비슷한 기술을 이용하여, 이성체 PG-2, PG-3, PG-4, PG-5를 합성하였다. 유사하게, 특정화합물에 대한 이성체형도 제공할 수 있다.

실시예 5.

STD 병인균에 대한 프로테그린의 활성.

WO 95/03325 에서 보고한 바와 같이, PG-1은 성관계에 의해 감염되는 질병(STDs)과 연관된 감염의 원인이 되는 다양한 유기체에 대해 테스트하였다. PG-1은 HIV-1, 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 트레포니마 팔리둠(Treponema pallidum), 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae)에 대해 상당한 활성을 나타내고, 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)와 허피스 심플렉스-2에 대해서는 중간정도의 활성을 가진다. PG-1은 허피스 심플렉스-1에 대해서는 활성이 없으나, 다른 프로테그린, RGGLVYVRGRFCVCVGR 아미드 형은 허피스 심플렉스 바이러스-1에 대해 활성을 가진다.

실시예 6. 항-레트로바이러스성 활성.

합성 및 고유 PG-1과 고유 PG-2는 Miles, S.A. et al., Blood (1991) 78:3200-3208, as set forth in WO 95/03325 에서 상술하는 방법을 이용하면 HIV 다양한 균주에 대해 항바이러스성 활성을 가진다는 것을 알 수 있다.

프로테그린은 다른 레트로바이러스에 대해 유사한 활성을 가진다.

실시예 7.

변형된 프로테그린의 준비: Kite 와 Bullet 형.

PG-1 Kite 형과 Bullet 형(이때, Z는 알라닌)은 통상적인 Fmoc 화학을 이용하여 합성할 수 있다. 합성된 펩티드는 합성 펩티드와 동일한 중량으로 디티오트레톨(DTT)을 첨가하여 환원시키는데 합성 펩티드는 6molar 구아니딘 HCl, 0.5 molar 트리스 완충액, 2mM EDTA pH 8.05를 포함하는 용액에 10㎎ 펩티드/㎖로 용해시키고 질소하에 52℃에서 2시간동안 배양시킨다. 혼합물은 0.45㎛ 필터를 통과시키고, 1/20(v/v) 빙초산으로 산성화시키고, C-18 컬럼에서 통상적인 RP-HPLC 정제시킨다. HPLC-정제된, 환원된 합성 bullet 와 Kite 형 PG-1은 스피드 vac에서 진공 원심분리에 의해 부분적으로 농축시키고, 낮은 농도(0.1㎎ 펩티드/㎖)에서 0.1M 트리스 pH 7.7에서 대기, 실온하에 24시간동안 폴딩시켜, 사슬간 이황화결합 형성을 최소화시킨다. 혼합물은 농축시키고, HOAC로 산성화시켜 최종 농도가 5%가 되도록 하고, RP-HPLC 정제시킨다.

최종 생성물 bullet 와 kite PG-1의 순도는 AU-PAGE, 분석 HPLC, FAB-mass spec로 증명한다. AU-PAGE에서 각 경우에 최종 산물에 대해 단일 밴드가 나타났다. 양쪽 경우 모두에서 관찰된 MH+ 질량 값을 2093이다.

실시예 8.

Kite 와 Bullet 형의 항균 활성.

실시예 7 에서 준비한 kite와 bullet PG-1 화합물은 Lehrer, R.I. et al., J Immunol Meth (1991) 137:167-173 에서 공개한 방사 확산 검사를 이용하여 항균 활성에 대해 테스트하였는데 단, 아래 까는 한천에는 최종 pH 7.4인 10mM 인산나트륨염 완충액을 포함한다. 실시예 1 에서 상술한 것과 같이, 아래에 까는 한천에는 0.3㎎/㎖ 트립티카제 콩 브로스 분말과 1% 아가로즈를 이용한다. 일부 경우에, 100mM NaCl 또는 RPMI+ 2.5% 정상 사람 혈청(NHS)을 한천에 추가한다.

제 1 결정 실험에서, PG-1의 kite와 bullet 형은 L. 모노사이토진(L. monocytogenes), E. 페시움(E. facium)(VR) 또는 S. 아우레우스(S. aureus)를 이와 같은 조건하에서 항균 활성에 대해 테스트하였다.

bullet 와 kite 형은 표준 검사 조건을 이용하면 이들 세 가지 세균에 대해 거의 동일한 효과를 가지는 것을 볼 수 있다. 100mM NaCl을 한천에 첨가하였을 때 kite 형은 bullet 형보다 약간 활성이 적은 것으로 나타났고 이와 같은 조건하에 bullet 형은 S. 아우레우스(S. aureus)를 제외한 세 가지 균주 모두에 대해 상당히 강화된 항균 활성을 나타내었다. 유사하게, RPMI+ 2.5% NHS를 첨가하는 경우에, bullet 형은 kite 형보다는 더 효과가 크다. 이와 같은 조건하에서 E. 페시움(E. faecium)에 대한 kite 형의 활성은 상당히 적었다.

이와 같은 형태의 PG-1은 대장균(E. coli), K. 뉴모니아(K. pneumoniae), P. 에어루기노사(P. aeruginosa)에 대해 테스트하였다. 이들 세 가지 미생물은 표준 조건하에 kite와 bullet 형 모두에 의해 저해를 받았다. 이와 같은 항균 활성은 100mM NaCl 와 RPMI 와 NHS에서도 유지되었다.

실시예 9.

Snake 형 PG-1의 합성.

Synpep Inc., Dublin, CA 의 표준방법에 따라 PG-1의 Snake 형을 합성하였고 FAB-mass spec에서 MH+ 값은 2031.3으로 나타냈다. Snake 형은 RP-HPLC에 의해 균질성을 가지도록 정제하였다.

실시예 10.

Snake PG-1의 항균 활성.

Snake PG-1은 PG-1의 bullet와 kite 형에 대해 실시예 8 에서 제시한 것과 같이 동일한 조건을 이용하여 동일한 6개 유기체에 대해 테스트하였다. 이와 같은 경우에, 고유 이황화 결합을 2개 가지는 PG-1을 기준으로 사용한다. Snake 형이 표준 조건하에서는 L. 모노사이토진(L. monocytogenes), E. 페시움(E. faecium), S. 아우레우스(S. aureus)에 대해 다소 높은 활성을 나타내는 반면에, 100mM NaCl 또는 RPMI+ NHS 존재하에 고유형보다는 효과가 상당히 감소되었다. 테스트 유기체가 대장균(E. coli), K. 뉴모니아(K. pneumoniae), P. 에어루기노사(P. aeruginosa)인 경우 동일 패턴이 나타났다.

실시예 11.

염기성이 강화된 미니 프로테그린과 프로테그린의 준비.

bullet와 kite 형을 포함하는 일련의 프로테그린을 만드는데 이때 X₅와 X₁₆중 하나 또는 둘 다는 소수성 아미노산과는 달리 염기성이고, X₁-X₄는 없다. 준비된 펩티드를 요약하여 PG-1의 아미노산 서열과 비교한 것을 다음의 표에서 나타낸다.

같은 성질의 프로테그린은 중간 로그 상태의 유기체를 이용하여 전술한 방사 확산 검사를 이용하여 테스트하는데 단, C. 알비칸(C. albican)은 하룻밤 배양한 것으로 검사하였다. 전술한 것과 같이, 아래 까는 한천에는 0.3㎎/㎖ 트립티카즈 콩 브로스 분말/㎖, 1% w/v 아가로즈, 10mM 인산 나트륨염 완충액(pH 7.4)를 포함하고, 4×10⁶박테리아 또는 곰팡이 CFU/10㎖로 접종시켰다. 표준 배지, 배지 A는 전술한 것과 같고; 배지 B는 100mM NaCl을 추가 포함한 것을 제외하고는 동일하고; 배지 C에는 표준 배지+ 2.5% 정상 사람 혈청을 포함하고; 배지 D에는 80% RPMI-1460+ 2.5% 정상 사람 혈청을 포함한다.

테스트 펩티드는 0.01% 아세트산에 500㎍/㎖로 용해시키고, 동일 용매로 2배 희석 및 ½log 희석(½log 희석은 500㎍/㎖에서, 250, 78, 25, 7.8, 2.5, 0.78, 0.25, 0.078㎍/㎖이 된다)한다.

매일 실험을 위해 충분한 양으로 희석하고; 테스트를 실행하기 위해, 용액 5㎍을 박테리아 겔이 있는 미리 구멍을 뚫은 웰(3㎜ 직경)에 첨가한다. 위에 얹는 겔(2 × 통상 트립티카즈 콩 한천)을 3시간 후에 붇는다. 지역크기는 하룻밤 배양후 0.1㎜가 될 때 측정한다. 제거되는 단위에서 지역크기(10단위 = 1㎜ 직경)는 시그마 플롯 프로그램을 이용하여 펩티드 농도 log₁₀에 대해 그래프로 나타낸다. X 절편은 최소 살균 농도에 상응하고, 이는 평균 제곱 희귀분석에 의해 결정한다. 제거가 나타나지 않은 최대 펩티드 농도만을 계산에 포함한다.

결과는 최소 살균 농도(㎍/㎖)와 관련 몰에 대해 제공하는데 이는 분자량으로 보정한다.

초기 실험에서 PG-1에 비교하여 PC-11와 PC-12를 테스트하였다. 결과는 다음의 표 6, 7 에 나타내었다.

최소 살균 농도(㎍/㎖)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 10mM Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 Protegrin PC-11 PC-12 Protetrin PC-11 PC-12PG-1 PG-1E. coli ML-35p 5.3 2.3 3.8 2.8 1.3 1.9L. mono., EGD 5.8 4.8 5.1 3.6 3.7 5.5C. albicans 820 6.1 7.1 4.3 7.9 11.6 20.5S. aureus 7.0±0.54 3.7 3.3 4.5±1.26 3.3 3.9930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. n.t. 4.0±0.18 3.2 3.1MRSA 28841 n.t. n.t. n.t. 3.1±0.03 2.1 2.6

상대적인 몰 효과(PG-1 = 1.00)

10 mM 인산염 완충액 Buffer+100mM NaCl

유 기 체 PC-11 PC-12 PC-11 PC-12

E. coli ML-35p 1.85 1.15 1.73 1.65L. mono., EGD 0.97 0.99 0.78 0.80C. albicans 820 0.69 0.71 0.55 0.47S. aureus 1.52 1.75 1.09 0.95930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. 1.00 1.06MRSA 28841 n.t. n.t. 1.19 0.98

표 7 에서 볼 수 있는 것과 같이, 짧아진 형의 프로테그린은 PG-1과 비교할 때 대장균(E. coli)와 S. 아우레우스(S. aureus)에 약간 효과가 더 있었고, C. 알비칸(C. albicans)을 제외하고는 테스트된 나머지 유기체에 대해 비슷한 효과를 가지는데 이 효과는 동일 수준이다.

표 8 와 표 9 에서는 PC-15의 최소 살균 농도와 관련 몰 효과에 대해 나타내는데, 이때 X₁₆은 염기성 아미노산이다. 이들 표에서 나타낸 PC-13은 X₁₇와 X₁₈이 부족한 것을 제외하고는 PG-1과 동일하다. 이들 표에서 볼 수 있는 것과 같이, X₁₆을 염기성 아미노산으로 대체하면, 대부분 유기체에 대해 능력이 강화되나 염을 추가하는 경우에 반응이 달라진다.

최소 살균 농도(㎍/㎖)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 10 mM Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 PG-1 PC-13 PG-2 PC-15 PG-1 PC-13 PG-2 PC-15

E. coli ML-35p 6.1 3.4 4.7 3.7 3.4 2.3 2.9 1.5L. mono., EGD 6.5 4.6 5.2 2.8 4.0 2.7 3.2 2.4C. albicans 820 5.5 4.0 4.8 2.6 7.5 10.2 10.1 8.8E. faecium 10.7 6.6 10.8 4.3 2.6 3.4 4.0 6.2(clin. isol.)VREF CDC21 n.t. n.t. n.t. n.t. 3.1 4.6 3.6 5.6(E. faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. n.t. n.t. 3.0 2.0 2.3 0.8(E. faecium)S. aureus 6.0 6.1 7.5 5.3 4.7 3.4 3.6 5.7930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. n.t. n.t. 4.1 3.4 3.6 4.4MRSA 23341 n.t. n.t. n.t. n.t. 3.2 2.6 2.1 2.3

관련 몰 효과(PG-1 = 1.00)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 10 mM Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 PC-13 PG-2 PC-15 PC-13 PG-2 PC-15

E. coli ML-35p 1.62 1.18 1.53 1.33 1.06 2.1L. mono., EGD 1.27 1.14 2.15 1.33 1.14 1.55C. albicans 820 1.24 1.04 1.96 0.66 0.67 0.79E. faecium 0.89 0.90 2.31 0.69 0.59 0.39(clin. isol.)VREF CDC21 n.t. n.t. n.t. 0.61 0.78 0.51(E. faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. n.t. 1.35 1.18 3.48(E. faecium)S. aureus 930918-3 0.89 0.75 1.05 1.25 1.19 0.77MRSA 30371 n.t. n.t. n.t. 1.09 1.03 0.86MRSA 28841 n.t. n.t. n.t 1.11 1.38 0.85

표 10-13에서는 PC-16 과 PC-17의 결과를 나타내는데 이들 모두 X₁-X₄가 없고; PC-16에는 X₅와 X₁₆위치에 염기성 아미노산을 포함한다. 표 11-13 에서는 최소 살균 농도를 나타내었는데 여기에서는 희석 방법만을 변경시켰다. 표 11과 12에서, 2배 희석을 이용하였고 표 13-14 에서는 half-log 희석을 이용하였다. 이들 표에 나타낸 데이터를 참고하면 PG-1와 비교하여 효과를 표적 유기체와 테스트 조건에 따라 다양하다는 것을 볼 수 있다. 표 12 에서 볼 수 있는 것과 같이 PC-17(PC-16)은 염존재하에 PC-1과 비교할 때 다소 활성이 적고; 표 14에서 볼 수 잇는 것과 같이 혈청 존재하에서는 PC-6의 경우에 특히 문제가 있었다.

최소 살균 농도(㎍/ml)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 10 mM Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 PG-1 PC-16 PC-17 PG-1 PC-16 PC-17

E. coli ML-35p 4.4 1.1 2.0 3.0 0.9 2.7L. mono., EGD 4.0 1.1 2.2 2.6 4.1 5.0C. albicans 820 5.2 1.9 5.5 8.0 29.3 32.6E. faecium 6.6 3.4 4.8 3.3 3.8 5.7VREF CDC21 n.t. n.t. n.t. 4.1 16.7 6.4(E. faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. n.t. 3.3 1.2 3.7(E. faecium)S. aureus 7.6 3.8 5.2 4.7 27.5*6.4930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. n.t. 4.3 12.3*5.7MRSA 28841 n.t. n.t. n.t 3.1 3.5*4.0

관련 몰 효과(PG-1=1.00)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 10 mM Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 PC-16 PC-17 PC-16 PC-17

E. coli ML-35p 3.00 1.55 2.50 0.78L. mono., EGD 2.73 1.28 0.48 0.37C. albicans 820 2.05 0.67 0.20 0.17E. faecium 1.46 0.97 0.65 0.41VREF CDC21 n.t. n.t 0.18 0.45(E. faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. 2.06 0.63(E. faecium)S. aureus 930918-3 0.13*0.13MRSA 30371 n.t. n.t. 0.26*0.26MRSA 28841 n.t. n.t. 0.66*0.55

최소 살균 농도(㎍/ml)

Series 2 Buffer + 10 mM NaCl RPMI + 2.5% NHSDilutions

유 기 체 PG-1 PC-16 PC-17 PG-1 PC-16 PC-17

E. coli ML-35p 1.4 0.59*1.0 0.36 1.49 0.42L. mono., EGD 0.7 1.5 0.7 0.35 0.61 0.42C. albicans 820 8.6 25.5 10.5 7.1 24.1*29.8*E. faecium 1.2 10.0 0.63 0.42 31.1 0.40VREF CDC21 1.5 11.3 1.6 0.5 28.4 0.90(E. faecalis)VREF 94.132 0.67 0.44 0.56 0.37 8.8 0.39(E. faecium)P. aeruginosa MR 2330 1.3 0.41 1.2 0.96 8.8 0.80P. aeruginosa SBI-N 1.4 1.2 1.1 0.81 2.8 0.83P. aeruginosa 1.3 0.80 0.60 1.1 8.9 0.88MR 3007P. aeruginosa 1.4 0.85 0.59 0.91 3.9 0.81MR 2133S. aureus 930918-3 3.3 >250 3.9 0.44 0.82*0.35MRSA 30371 1.5 >250 1.6 0.32 1.0*0.30MRSA 28841 1.3 7.9*1.6 0.6 9.5 0.20

관련 몰 효과(PG-1=1.00)

Series 2 Buffer + 10 mM NaCl RPMI + 2.5% NHSDilutions

유 기 체 PC-16 PC-17 PC-16 PC-17

E. coli ML-35p 1.78 0.99 0.35 0.60L. mono., EGD 0.35 0.70 0.43 0.59C. albicans 820 0.25 0.58 0.22 0.17E. faecium 0.09 1.34 0.01 0.74VREF CDC21(E. faecalis) 0.10 0.66 0.01 0.39VREF 94.132(E. faecium) 1.14 0.84 0.03 0.67P. aeruginosa MR 2330 2.38 0.76 0.08 0.85P. aeruginosa SBI-N 0.88 0.90 0.22 0.69P. aeruginosa MR 3007 1.22 1.53 0.09 0.88P. aeruginosa MR 2133 1.24 1.67 0.18 0.79S. aureus 930918-3 <0.03 0.60 0.40 0.89MRSA 30371 <0.03 0.66 0.24 0.75MRSA 28841 0.12 0.57 0.05 2.11

표 14-17 에서는 본 발명 프로테그린 kite 형에 대한 결과를 나타낸 것이다. 또한, 반응이 있는 표적 유기체 범위와 반응이 얻어진 조건 범위는 다양한 것으로 나타났다. 일반적으로, 양성이 강한 PC-19는 X₁-X₄가 부족한 변형안된 형보다 효과가 적었다. 생리적인 조건에서 PC-19는 실제 활성이 없었다.

최소 살균 농도(㎍/ml)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 PG-1 PC-18 PC-19 PG-1 PC-18 PC-19

E. faecium 7.7 1.7 17.7 4.2 2.9 >250VREF CDC21 n.t. n.t. n.t. 4.6 5.3 >250(E. faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. n.t. 3.6 1.4 5.6(E. faecium)S. aureus 7.3 3.9 7.3 5.0 2.1 10.4930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. n.t. 4.1 6.5 68.6MRSA 28841 n.t. n.t. n.t. 3.6 3.9 17.4

관련 몰 효과(PG-1=1.00)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 Buffer+100mM NaClDilutions

유 기 체 PC-18 PC-19 PC-18 PC-19

E. faecium 3.06 0.31 0.98 0.01VREF CDC21(E. faecalis) n.t. n.t. 0.59 0.01VREF 94.132(E. faecium) n.t. n.t. 1.74 0.46S. aureus 930918-3 1.26 0.72 1.61 0.35MRSA 30371 n.t. n.t. 0.43 0.04MRSA 28841 n.t. n.t. 0.62 0.15

최소 살균 농도(㎍/ml)

Series 2 10 mM Buffer + 100mM NaCl PRIM + 2.5% NHSDilutions

유 기 체 PG-1 PC-18 PC-19 PG-1 PC-18 PC-19

E. faecium 1.5 3.2 >250 2.9 >250VREF CDC21(E. faecalis) 1.4 3.4 >250 10.0 >250VREF 94.132(E. faecium) 0.61 0.50 2.9 0.30 1.2 30.2P. aeruginosa MR 2330 1.3 1.1 3.0 0.7 3.0 29.2P. aeruginosa SBI-N 1.3 1.2 2.1 0.85 4.6 >250P. aeruginosa MR 3007 1.3 1.1 1.1 0.72 3.89 >250P. aeruginosa MR 2133 1.2 2.4 2.5 0.9 3.9 >250

관련 몰 효과(PG-1=1.00)

Series 2 10 mM Buffer + 100mM NaCl PRIM + 2.5% NHSDilutions

유 기 체 PC-18 PC-19 PC-18 PC-19

E. faecium 0.32 <0.01 0.98 0.01VREF CDC21(E. faecalis) 0.28 <0.01 0.03 <0.01VREF 94.132(E. faecium) 0.81 0.15 0.17 <0.01P. aeruginosa MR 2330 0.8 0.31 0.16 0.02P. aeruginosa SBI-N 0.73 0.45 0.12 <0.01P. aeruginosa MR 3007 0.80 0.85 0.13 <0.01P. aeruginosa MR 2133 0.34 0.35 0.16 <0.01

표 18과 19에서는 본 발명의 kite형 프로테그린에서 얻은 결과를 제공한다. 염이 높은 또는 혈청의 농도가 높은 조건하에서는 PG-1보다 더 양성인 형은 일반적으로 효과가 적었다. 그러나, 대장균(E. coli)에 대해서는 효과가 비슷하다.

최소 살균 농도(㎍/ml)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 Buffer+100mM NaCl Buffer+2.5% NHSDilutions

유 기 체 PG-1 PC-20 PC-21 PG-1 PC-20 PC-21 PG-1 PC-20 PC-21

E. coli ML-34 4.6 0.75 0.36 2.0 1.9 1.8 0.34 0.27 0.28L. mono. EGD 4.8 3.3 1.4 3.4 21.7 36.3 1.3 5.5 5.6C. albicans 820 6.1 5.3 8.5 6.8 67.5 >250 8.1 30.1 59.7E. faecium 6.7 6.7 18.0 3.9 69.0 >250VREF, CDC21 n.t. n.t. n.t. 4.9 >250 >250(faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. n.t. 2.5 3.3 28.3(faecium)S. aureus 10.3 5.8 7.2 5.1 30.3 64.6*930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. n.t. 4.2 29.9 64.6*MRSA 28841 n.t. n.t. n.t. 3.3 8.4 8.4

관련 몰 효과(PG-1=1.00)

Series 1 10 mM 인산염 완충액 Buffer+100mM NaCl Buffer+2.5% NHSDilutions

유 기 체 PC-20 PC-21 PC-20 PC-21 PC-20 PC-21

E. coli ML-34 4.14 9.21 0.71 0.8 4.50 0.88L. mono. EGD 0.98 2.47 0.09 0.07 0.16 0.17C. albicans820 0.78 0.52 0.07 <0.02 0.18 0.10E. faecium 0.68 0.27 0.03 0.01VREF, CDC2 n.t. n.t. 0.01 0.01(faecalis)VREF 94.132 n.t. n.t. 0.20 0.06(faecium)S. aureus 1.20 1.03 0.11 <0.06930918-3MRSA 30371 n.t. n.t. 0.09 <0.05MRSA 28841 n.t. n.t. 0.26 0.28

실시예 12: 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae)에 대한 활성에 필요한 PG-1의 최소 생활성 모양.

Lehrer et al., 1991. J Immunol Methods 137:167. 의 방사 확산 검사를 이용하여 다양한 PG-1 변이체에 대한 N. 고노리아(N. gonorrhoeae)의 감수성을 결정하였다. 고유 프로테그린 PG-1은 Koiryakov, V.N. et al. (FEBS Lett(1993) 327:231-236) 방법에 따라 돼지 백혈구세포에서 정제하였다. 모든 다른 프로테그린은 F-moc 화학에 의해 합성하고, 역상 HPLC로 정제하였다.

다음과 같이 N. 고노리아(N. gonorrhoeae)균주를 테스트하였다; FA19(sac-1, sac-3; 혈청-저항성[Sac^R]), JS-1(혈청-저항성; sac-1, sac-3; [Sac^R]), F62(sac-1⁺, sac-3; 혈청-감응성[Sac^S])는 Cannon et al. (Infect Immun (1981) 32:547-552) and Judd, R.C. (Infect Immun(1982) 37:632-641) 에서 상술하고 있다. 균주 FA628 (sac-1⁺, sac-3)와 FA899(sac-1, sac-3⁺)는 FA19 Sac^S형질전환체이다(Shafer, W.M. et al., Infect Immun(1982) 35:764-769). 균주 FA5101 와 WS1은 절두형 LOS를 생산하는 균주 FA19의 피신(pycin)-저항성 돌연변이주이다(Lucas, C.E. et al., Molec Microbiol(1995) 16:1001-1009). 박테리아는 NGTM 배지에 도말하고, 5% CO₂/실온 대기에서 37℃, 하룻밤동안 배양하고, 매일 계대한다. 플레이트의 세균은 25ml GC 브로스에 넣고, 37℃에서 3시간동안 교반하면서 배양하여 mid-log 고노코카이(gonococci)를 얻는다.

아래 까는 겔과 위에 까는 겔은 Qu, X.D.에서 방사 확산 검사에서 상술한 것과 같이 준비한다. 펩티드는 용해시키고, 0.01% 아세트산에 연속적으로 희석시켜 5ml 액을 테스트한다. 플레이트는 3시간동안 37℃ CO₂배양기에서 배양시켜, 위에 까는 겔을 얹고, 펩티드가 아래층으로 확산되도록 한다. 하룻밤 배양후에, 최소 저해 농도(mg/ml)는 Qu et al. 에서 상술한 곡선의 X절편에서 결정한다. 각 균주는 프로테그린-감응성을 나타낸다(표 20-22)

표에 있는 모든 펩티드는 C-단부 아미드가 된다.

프로테그린 PC-13, PC-11, PC-17에서는 아미노산 잔기 X₁-X₁₄와 X₁₇-X₁₈아미노산은 저해 활성 손실없이 PG-1에서 제거한다(표 20).

N. 고노리아(N. gonorrhoeae)저해에서 PG-1의 두가지 분자내 이황화결합의 효과를 결정한다. 두 개 이황화결합(프로테그린 PC-8)을 제거하면 테스트된 모든 균주에서 저해 효과가 감소되었다(표 20). 대조적으로 cys₈:cys₁₃이황화결합이 없는 프로테그린 PC-10은 균주 F62, JS-1, FA19에 대한 활성이 증가된다. 이는 균주 FA19에 대한 활성의 감소에 3.8배가 된다. 한 개 이황화결합을 가지는 PG-1 절두형 12-mer 변이주도 강력한 저해활성을 나타낸다(표 21에서 프로테그린 PC-18, PC-64, PC-20, PC-64a 참조).

혈청 저항성 FA19균주에서 유도된 두가지 혈청-감응성 균주 FA628(sac-1⁺)와 FA899(sac-3)에 대해 프로테그린 변이주의 저해 활성을 측정하였다. PG-1에서는 야생형 혈청 저항성 FA19균주와 혈청-감응성 유도 균주 FA628와 FA899에 대해 유사한 활성을 나타내었다(표 21). 혈청-감응성 균주는 혈청 저항성 균주에 비해 PC-8에 2-4배 민감하였다. 한 개 이황화결합을 가지는 변이주 PC-9 와 PC-10은 강혁한 저해 활성을 보유하고 있다.

혈청-감응성 N. 고노리아(N. gonorrhoeae)균주에 대한 프로테그린 효과

아미노산 최소 저해 농도(㎍/ml)

Protegrin n FA19 FA628 FA899

PG-1 18 2.1±0.1 1.6±0.1 1.6±0.1PC-8 18 420.8±24.2 150.9±14.0 263.5±10.3PC-9 18 11.2±1.8 4.0±0.1 3.9±0.2PC-10 18 1.7±0.1 1.2±0.1 1.3±0.1

LOS절두로 사람 PMN의 항균 단백질에 고노코카이의 민감성이 증가하기 때문에(Shafer, W.M. et al., 1986, J Infect Dis 86:910-917) LOS 돌연변이주 FA5101, WS1, 야생형 균주 FA19에 대해 프로테그린 PG-1, PC-8, PC-9, PC-10을 테스트하였다(표 22). LOS를 절두하면, 선형 프로테그린 PC-8에 대해 N. 고노리아(N. gonorrhoeae)의 민감성이 증가하나 PG-1 또는 PC-10에 대한 민감성에는 거의 효과가 없었다.

N. 고노리아(N. gonorrhoeae) LOS 돌연변이주에 대한 프로테그린의 효과

아미노산 최소 저해 농도(㎍/ml)

Protegrin n FA19 FA5101 WS1

PG-1 18 2.1±0.1 1.5±0.2 1.4±0.2PC-8 18 420.8±24.2 23.1±9.3 29.7±12.8PC-9 18 11.2±1.8 2.7±0.4 2.6±0.7PC-10 18 1.7±0.1 1.2±0.1 1.1±0.1

실시예 13:

프로테그린으로 처리한 N. 고노리아(N. gonorrhoeae)의 전자현미경 검사.

50㎍/ml PG-1 또는 절두형 유도체 PC-17로 N. 고노리아(N. gonorrhoeae)를 처리한 효과를 결정한다. PG-1으로 처리한 후 60분뒤에 박테리아의 전자현미경 사진에서는 중앙에 공포(vacuolation)형성과 막-연합된 전자-조밀한 구조를 나타낸다. PG-1 또는 PC-17로 처리한 박테리아의 전자현미경 스캐닝에 의하면 표면 명소가 직경이 약 100mm로 나타난다.

실시예 14

항균 활성에서 타액의 효과

Lehrer et al., 1991, J. Immunol. Meth. 137:167 의 방사 확산 검사를 이용하는데 단, 아래에 까는 한천은 10mM pH6.5 인산완충염, 100mM NaCl, 1% TSB, 1% 아가로즈를 포함한다. 위에 까는 배지에는 10mM 인산완충염, pH6.5, 100m NaCl, 2XTSB, 1% 아가로즈를 포함한다. 펩티드는 10mM 아세테이트 완충액 pH5 또는 타액과 0.01% 아세트산(AA)로 만든 10X 원액으로 희석한다.

감지가능한 깨끗해지는 지역, 또는 MCZ-예를 들면, 펩티드 농도를 지역의 직경에 대해 플롯하였을 때 X-축에 추정값에 필요한 최저 농도로 결과를 나타낸다. 결과는 표 23 에 나타낸다.

테스트된 펩티드 수를 비교할 수 있거나, 타액존재하에 개량된 활성을 나타낸다.

실시예 15: 추가 프로테그린의 항균 활성.

다음의 실시예는 하기에서 상술하는 본 발명의 추가 펩티드를 테스트하는데 이용되는 항균 활성을 측정하는 검사를 제공한다. 다음의 시약, 원액, 배양물을 테스트에 이용한다.

미생물: Dr. Robert Lehrer (UCLA, see also, Lehrer et al., 1988, J. Immunol. Methods 108:153) and Dr. Gray Schoolnik (Stanford), respectively.로 부터 대장균(Escherichia coli) ML-35p와 반코마이신-저항성 엔테로코커스 페시움(VRE)를 수득하였다. American Type Culture Collection, Rockville, MD.에서 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 9027), 칸디다 알비칸(Candida albicans)(ATCC 1023), 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC 33591)을 구하였다.

임상적으로 분리한 것과 같은 다른 원료에서 수득한 미생물도 여기에서 사용하는 검사에서 전술한 미생물을 대신하여 사용할 수 있다.

배지와 시약:

트립티카제 콩 한천(TSA; Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, BBL #4311768): 1ℓ 탈이온수에 40g을 용해시키고, 121℃, 20분간 증기 살균한다.

트립타카제 콩 브로스(TSB; Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, BBL #4311768): 1ℓ 탈이온수에 30g을 용해시키고, 121℃, 20분간 증기 살균시키고, 실온에 저장한다.

2X 트립타카제 콩 브로스(2X TSB): 1ℓ 탈이온수에 60g을 용해시키고, 121℃, 20분간 증기 살균시키고, 실온에 저장.

글리세롤(20% v/v): 80ml 탈이온수에 20g글리세롤을 혼합시키고, 0.20μ필터를 통하여 여과살균시키고, 실온에 저장한다.

1염기성 인산완충액(100mM): 1ℓ 탈이온수에 13.7g 1 염기성 인산나트륨염(Fisher #S368-500)을 용해시키고, 0.20μ필터를 통과시켜 여과 살균시키고, 실온에 저장한다.

인산 완충염(PBS: 10mM 인산염, 100mM NaCl, pH7.4): 15ml 이염기 인산염 완충액(100mM), 5ml 1염기 인산염 완충액(100mM), 4ml NaCl(5 M), 176ml 탈이온수를 혼합시킨다. 필요에 따라 pH를 조정하고, 0.45μ필터를 통과시켜 여과 살균시키고, 실온에 저장한다.

액체 테스트 배지(LTM): 멸균 상태에서 다음의 성분을 복합시킨다: 10ml 인산염 완충액(100mM pH6.5), 1.0ml TSB, 2ml NaCl(5 M), 87ml 탈이온수. 실온에 저장.

아세트산(0.01% v/v): 100ml 멸균 탈이온수와 10㎕ 아세트산을 혼합시킨다.

아가로즈: 80ml 탈이온수에 1g 아가로즈(Sigma #S6013)을 혼합시키고, 121℃, 20분간 증기살균시킨다.

아가로즈 아래 까는 배지: 10ml 인산완충염(100mM, pH6.5), 1.0ml TSB, 2ml NaCl(5 M), 7ml 탈이온수를 80ml 녹인(50℃)아가로즈에 복합시킨다.

2X TSB 아가로즈 위에 까는 배지: 1ℓ탈이온수에 60g TSB 와 10g 아가로즈를 용해시키고, 병당 100ml씩 넣고, 121℃, 20분간 증기살균하고 실온에서 저장한다.

미생물 슬랜트(slant) 준비: 각 균주는 TSA에서 배양한다. 분리된 콜로니는 멸균 1회용 루프를 이용하여 TSB(멸균된 50ml Erlenmeyer 플라스크에 10ml)로 옮기고, 플라스크는 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트의 경우)에서 16-18시간동안 교반(200RPM)하면서 배양한다.

액체 배양물은 20% 멸균 글리세롤로 1:1 희석시키고, -80℃에서 1.0ml씩 저장한다. 매일 접종을 위해 액체는 멸균 루프를 이용하며 해동된 바이알에서 이동시켜 TSA 슬랜트 표면에 도말한다. 뚜껑이 있는 튜브는 하룻밤동안 배양시키고 최고 한달까지 4℃에 저장한다.

접종물 준비

1. 튜브의 뚜껑을 열고, TSA 슬랜트에 두껍게 자란 부분에 멸균 루프로 가볍게 스친다.

2. TSB 10ml (50ml 플라스크)를 접종하고, 플라스크는 18시간동안 수조에서 교반시키면서 배양한다.

3. 큐벳에서 하룻밤 배양된 배양물과 TSB를 1:20으로 희석한 희석액 50㎕를 넣고 TSB를 기준으로 하여 600mm에서 흡수도를 측정한다. 희석된 배양물의 A₆₀₀은 0.1-0.4이다.

4. 250ml Erlenmeyer 플라스크에서, 하룻밤 배양물 50㎕을 TSB와 1:1000 (박테리아의 경우) 또는 (이스트의 경우) 1:100으로 희석한다.

5. 로그 상태에 도달할때까지, 가령 배양물의 A₆₀₀이 0.200 내지 0.400이 될 때까지 200RPM에서 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트이 경우)에서 수조안에서 교반시키면서 플라스크를 배양시킨다.

6. 멸균 원심분리 튜브에 log-상 배양물 25ml을 넣고, 4℃, 10분간, 2000rpm에서 원심분리시킨다. 상청액은 버리고, 멸균 PBS 25ml 을 첨가하고 펠렛은 볼텍스를 하여 다시 현탁시킨다.

7. 현탁액은 2000rpm, 4℃, 10분간 원심분리시킨다. 상청액은 버리고 5ml 멸균 PBS로 펠렛을 다시 현탁시킨다.

8. 희석안 된 현탁액 A₆₀₀을 측정한다. 흡수도가 0.5이상이면, 흡수도가 0.100 내지 0.500 이 될 때까지 멸균 PBS 로 희석시킨다.

9. 염(0.87%)에서 10배 연속 희석하고, 플레이트 하나당 한 개 희석물로 TSA 플레이트에 10⁴-, 10⁵-, 10⁶배 희석액 100㎕로 깔아 ml 현탁액당 콜로니형성수(CFUs/mL)를 결정한다. 하룻밤 배양시켜, 콜로니수를 헤아리고, CFUs/ml를 결정한다(정확한 측정에는 플레이트당 약 30-300 콜로니가 필요하다).

보고된 균주에 대해서 A₆₀₀=0.2를 가지는 현탁액의 CFUs/ml은 다음의 표에 보고한 바와 같이 결정한다.

현탁액의 CFUs/mL(A₆₀₀=0.2)

Strain CFUs/mL

E. coli 8.0×107P. aeruginosa 7.8×107MRSA 2.0×107VRE 3.8×107C. albicans 9.7×105

펩티드 원액의 준비

1. 멸균된 폴리프로필렌 키로바이알(1.8ml)에 테스트할 각 펩티드 1.0mg을 넣는다.

2. 1280㎍/ml농도를 가지는 원액을 만들기 위해 충분한 아세트산(0.01%)를 첨가한다. 원액은 몇 개의 바이알에 바이알 당 100㎕씩 나누어 넣고, 밀봉하여 -80℃에서 저장한다.

6.5 방사 확산(MCZ)검사

MCZ 검사는 다양한 항균 화합물에 대해 미생물의 강도를 결정하는데 시험물질을 최소량 이용한다. 세포는 mid-log 상태로 생장시키고 최소 영양소 완충된 아가로즈에 재현탁시킨다. 이겔에는 아가로즈(한천이 아님)를 이용하여 항균 펩티드와 표준 한천의 다가음이온성분간에 정전기적 상호작용을 피하도록 한다. 펩티드는 작은 웰로부터 겔로 신속하게 확산되고, 성장 저해 지역의 직경은 용액에 있는 펩티드의 농도에 비례한다(Lehrer et al., 1988, J. Immunol. Method 108:153; Lehrer et al., 1991, J. Immunol. Methods 137:167).

MCZ 검사 플레이트의 준비

1. 각 페트리 플레이트에, 멸균 프로필렌 튜브(15ml)내로 10ml 아가로즈(50℃) 아래 까는 배지를 분배한다. 각 튜브에 4×10⁶CFU 균주를 첨가한다. 튜브를 3회 아래위로 뒤집어 잘 혼합한다음 배양접시에 용융된 아가로즈를 바로 붓는다.

2. 아가로즈가 굳은 후에, 아가로즈에 멸균 캐뉼라(3mm i.d.)를 이용하여 16웰(4×4 공간 격자)을 구멍을 뚫는다. pasteur 피펫으로 아가로즈 플러그를 제거하고, 아가로즈를 진공에서 부착된 측면 암 포트가 있는 플라스크에 넣는다.

3. 펩티드 원액에서, 희석물로 아세트산(0.01%)를 이용하여 연속 2배 희석액(128㎍/ml 에서 0.06㎍/ml)를 만들거나, 펩티드 농도가 50㎍/ml 보다 낮은 경우에, 사람 혈청 알부빈(HSA: 0.1% w/v)를 포함하는 아세테이트 나트륨을 희석물로 이용한다.

4. 아가로즈웰에 각 희석물 5㎕씩을 넣는데, 한 웰에는 한가지 희석액을 첨가한다.

5. 음성 기준으로 웰에 희석물을 첨가하고, 양성기준으로 프로테그린-1(미국특허 5,464,823; 32㎍/ml, 8㎍/ml, 2㎍/ml)을 넣는다.

6. 3시간동안 플레이트는 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트의 경우)에 플레이트를 배양한다.

7. 각 플레이트의 표면에 2X TSB 아가로즈 위에 까는 배지(10ml)을 부어서, 아가가 고형화되도록 하고, 플레이트는 뒤집어서 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트)에서 16-18시간동안 배양시킨다.

8. 플레이트를 검사하여 성장 저해 지역(각 웰당 깨끗해진 부위)의 직경(mm)을 측정한다.

9. 웰에서 펩티드의 농도(X-축)에 대해 성장 저해 지역의 직경(Y-축)을 플롯시켜 선형 회귀 분석을 이용하여 선을 얻는다. X절편을 각 펩티드 농도에서 성장 저해 지역에 대해 최소 농도가 된다.

6.6 마이크로브로스 희석(MCB) 검사

마이크로브로스 희석 방법은 샘플 수가 많을 때 적합하고, MCZ 검사보다는 자동화하기에 더 편리하고, 데이터 분석을 직접할 수 있고 간단하다. 이검사의 중요한 단계는 펩티드의 생물학적 활성의 간섭을 최소화하는 최소 영양 완충 시스템에서 미생물과 펩티드를 복합시키는 것이다. 또한 펩티드 희석물에 0.1%(w/v)사람 혈청 알부민(HSA) 또는 소 혈청 알부민(BSA)가 존재하여 용기에 펩티드가 흡착하는 것을 최소로 한다.

MCB 검사 플레이트의 준비

1. 멸균 96-웰 미량 적정 플레이트의 각 웰에 100㎕ log 상 세포/LTM(MCB-5는 4×10⁵CFU/ml; MCB-3는 4×10³CFUs/ml)를 분배한다.

2. 펩티드 원액에서, 희석액으로 아세트산(0.01%)를 이용한 연속 2배 희석물(1280㎍/ml에서 0.625㎍/ml로)을 준비하거나, 희석제로써 HSA 또는 BSA (0.1%, w/v)를 포함하는 아세테이트 나트륨(10mM pH5)로 희석한다.

3. 미량적정 플레이트 웰에 각 2배 희석한 용액 11㎕를 3개씩 분배한다.

4. 플레이트는 37℃(박테리아의 경우)에서 또는 30℃(이스트의 경우)에서 3시간동안 배양시킨다.

5. 각 웰에 2X TSB 100㎕를 첨가하고, 혼합하여, 추가 16-18시간동안 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트의 경우)에서 배양시킨다.

6. 플레이트를 검사하고, 탁도(세포 생장)에 대해 각 웰을 평가하였다. MRSA는 가라앉고, 웰의 바닥에서 펠렛이 형성된다. MRSA는 미량적정 플레이트를 세워두고, 기울어진 거울을 이용하여 웰의 바닥을 검사하여 평가할 수 있다.

7. 육즙 배지에서 성장을 저해시키는데 최저 농도(MCB)는 모든 시각적인 성장을 저해하는 펩티드 최저 농도로 정의할 수 있다. 각 3중 샘플에서 MCB값이 상이할 경우, MCB는 세 개 샘플의 결과를 평균하여 얻을 수 있다.

8. 적어도 99.9% 치사활성(시작 접종물에서 적어도 3log의 감소)을 나타내는 펩티드의 최저 농도는 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트의 경우)에서 24시간동안 TSA 플레이트 각 웰에 50㎕씩 배양하여 결정한다(플레이트를 위해, 24-웰 플레이트의 각 웰에 1.5㎕ TSA는 교차 감염을 최소화시킨다).

6.7 변형된 NCCLS 최소 저해

농도 (MIC)검사

NCCLS(National Committee for Clinical Standards)는 512㎍/ml에서 Mueller-Hinton Broth("MHB")에 원액으로 테스트 화합물을 준비하도록 요구하였다. 원액은 배지에서 연속 희석 시키고(2배), 각 희석물에는 1×10⁶CFU/ml) 박테리아를 포함하는 배지에 1:1 로 첨가하였다(National committee on Clinical Laboratory Standards, December 1994, "Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing," NCCLS Document M100-S5 vol. 14, No. 16; Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria that Grow Aerobically, 3d Ed., Approved Standard M7-A3, National Committee for Clinical Standards, Villanova, PA).

본 발명의 펩티드는 128㎍/ml 이상의 농도에서 MHB에 침전하는 것으로 발견되었다. 따라서, NCCLS 프로토콜에 따르면, 2배 희석물은 계산된 것보다 더 적은 펩티드를 포함하는데 이는 MIC값이 너무 높게 되었기 때문이다.

이와 같은 문제를 해결하기 위해, 다음과 같이 변형된 NCCLS 검사가 본 발명의 펩티드의 MICs를 결정하는데 적절한 방법이다. 방법에서, 펩티드에 적합하고, 미생물에 유해한 영향을 주지 않는 완충액(0.01%, v/v 아세트산, 0.1%, w/v HSA)에 테스트 펩티드 농축(10%)원액을 만들고, 미생물을 포함하는 MHB에 원액을 1:10으로 희석하여 침전을 피할 수 있다.

MIC 검사 플레이트 준비

1. Meuller-Hinton broth(MHB: Becton-Dickinson, Cockysville, MD, BB2 #11443)에서 테스트 유기체의 새로 배양한 배양물을 준비한다.

2. 배양물은 새로운 MHB로 약 4×10⁵CFUs/ml 로 희석시키고, 멸균 96-웰 미량적정 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 분배한다.

3. 펩티드 원액으로부터, 희석물로 아세트산(0.01%)를 이용하여 연속 2배 희석액(128㎍/ml 에서 0.06㎍/ml)를 만들거나, 펩티드 농도가 50㎍/ml 보다 낮은 경우에, 사람 혈청 알부민(HSA: 0.01% w/v)를 포함하는 아세테이트 나트륨(10mM, pH5)을 희석물로 이용한다.

4. 미량 적정 플레이트웰에 각 희석물 11㎕씩을 넣는다.

5. 16-18시간동안 플레이트는 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트의 경우)에 공기제공 없이 플레이트를 배양한다.

6. 플레이트를 검사하고, 탁도(세포 생장)에 대해 각 웰을 평가하였다. MRSA는 가라앉고, 웰의 바닥에서 펠렛이 형성된다. MRSA는 미량적정 플레이트를 세워두고, 기울어진 거울을 이용하여 웰의 바닥을 검사하여 평가할 수 있다.

7. 최저 저해 농도(MIC)는 모든 시각적인 성장을 저해하는 펩티드 최저 농도로 정의할 수 있다. 각 3중 샘플에서 MIC값이 상이할 경우, MCB는 세 개 팸플의 결과를 평균하여 얻을 수 있다.

8. 100% 치사 활성(시작 접종물에서 적어도 3 log의 감소)을 나타내는 펩티드의 최저 농도는 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트의 경우)에서 24시간동안 TSA플레이트 각 웰에 10㎕씩 배양하여 결정한다(플레이트를 위해, 24-웰 플레이트의 각 웰에 1.5ml TSA는 교차 감염을 최소화시킨다).

6.8 역학적인 살균성 검사

다음의 검사는 펩티드가 표적미생물을 어느정도의 속도로 죽이는지 그리고 펩티드가 살균성이 있는지를 결정하는데 이용된다.

검사

1. 96-웰 미량적정 플레이트 용액의 각 웰에 200㎕ log상 세포/LTM(4×10⁵CFU/ml)을 분배한다.

2. T=0일 경우, 웰 A1에 1280㎍/ml 펩티드 22㎕를 첨가하고, 3회분 분쇄하여 혼합시킨다.

3. 30초를 기다리고, 제 2 농도 펩티드 22㎕를 그 다음 웰(A2)에 첨가하고 3회 분쇄하여 혼합시킨다.

4. 공정을 반복하고 모든 농도의 펩티드가 첨가될 때까지 각 펩티드의 첨가를 30초 정도 간격을 두고 첨가한다. 일반적으로, 원액 펩티드의 4배 희석액(가령, 1280, 320, 80, 20, 5㎍/ml 펩티드는 각 웰에서 1:10으로 희석된다)은 상대적으로 우수한 치사곡선을 만든다. 한 개 웰에는 기준으로 0.01% 아세트산 22㎕를 첨가한다.

5. T=15분경에, 3회분 분쇄시켜 웰 A1을 혼합하고, 비어있는 멸균 배양접시(100mm×15mm)에 20㎕를 옮긴다.

6. 신속하게 20㎕ 용융된(50℃) TSA를 첨가하고, 플레이트를 회전시켜 혼합한다.

7. 모든 펩티드 농도를 플레이트할 때까지 5-6단계를 반복한다.

8. 기준 웰의 경우에는, 샘플을 LTM 으로 1:100으로 희석시키고, 희석액 50㎕를 플레이트하여 CFU를 정확하게 얻는다.

9. 아가는 고형화시킨후에, 뒤집어서, 18-24시간동안 37℃(박테리아의 경우) 또는 30℃(이스트으 경우)에서 배양시킨다.

10. T=30, 60, 120, 240분에 모든 펩티드 농도와 기준 샘플에서 5-9단계를 반복한다.

11. 플레이트당 CFU의 수를 헤아리고, 각 펩티드 농도에서 CFU의 감소를 평가한다. 이와 같은 검사를 이용하여 효과를 평가하기 위해, 펩티드는 적어도 1 log(플레이트당 적어도 800CFU)로 CUFs를 감소시킨다. 이와 같은 수는 추전한것과 더 큰 경우라하더라도(30-300CFUs/플레이트), 회수가능한 CFUs에서 log차수 변화는 중요한 살균 효과를 가지는 것으로 나타낸다.

12. 비교 치사 곡선을 얻기위해, 펩티드 농도에 대해 살아있는 분취물 log를 플롯하였다.

표 27 에서는 전술한 MCB-3 검사를 이용한 다양한 표적 미생물에 대해 본 발명의 다수 화합물의 항균활성을 나타내었다(가령 10³CFU에서). 결과는 "육즙배지에서 성장을 저해하기 위한 최저 농도"(MCB)"로 제공되는데, 눈에 보이는 탁도가 없는 최저농도가 된다. TSA 에서 "최소 살균 농도"(MBC)는 MCB와 등가의 것이다. 농도 단위는 ㎍/ml이다. 표 27 에서, 펩티드 사슬에 다양한 치환이 이루어져 항균활성 범위를 미세하게 조율한다. C-단부에 *는 자유산형태로 공급된 것이고; 그렇지 않은 경우에는 아미드가 검사에 이용되었다.

표 28-31에서는 여기에서 상술하는 살균 검사에서 활성을 MRSA, 뉴도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)와 타액에 있는 내생 미생물총(flora)에 대해 본 발명의 다양한 펩티드가 CFUs 에서 log 감소되는 것으로 나타났다.

TSA에서는 성장적으로 생장하지 않으나 LTM에서는 몇 시간 동안 생존하는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(ATCC 49247)을 이용하여 역학 실험을 하였다.

log-상태 세포(4.5×10⁵CUFs/ml LTM)는 펩티드로 처리하고, 그다음 Chocolate 한권에 플레이트하여 눈에 보이는 CFU의수를 헤아린다. 테스트한 모든 펩티드(RGGRLCYCRRRFCVCVGR의 산과 아미드형, 그리고 RGGLCYCRGRFCVCVGR 아미드형)는 H. 인플루엔자(H. influenzae) 에 대해 신속한 살균성을 나타내었다. P. 에루기노사(P. aeruginosa)에서 볼 수 있는 것과 같이 240분내에 재성장은 관찰되지 않았다.

마지막으로, 전술한 검사는 표적으로 H. 플로리(H. pylori)를 이용하여 실행하고 그 결과는 표 33 에 나타내었다.

전술한 것과 같이 변형된 NCCLS 검사를 이용하는데 표 34 와 35 에서는 최저 저해농도(㎍/ml)를 나타내었다. 펩티드는 0.1% HSA 유무하에 0.01% AA에서 준비한다. 표 34에서는 다양한 유기체에 대한 테스트한 다양한 펩티드의 결과를 나타낸다; 표 35 에서는 사람혈청 존재하에 결과를 나타낸다. 일반적으로 HSA는 플라스틱 표면에 흡착을 방해하여 MICs를 감소시킨다.

Mueller Hinton 배지에서 MIC(㎍/ml)

Mueller Hinton 배지에서 MICs(㎍/㎖)
유기체	배지보충물	RGGLCYCRGRFCVCVGR(amide)-HSA + HSA	PG-1 (amide)-HSA +HSA	PG-1(acid)-HSA
Staphylococcus aureusMSSA	없음	4		4		4
Staphylococcus aureusMRSA	없음	13.3	2	16	5.3	16
Enterococcus faeciumVREF	없음	2	0.33	1.3	0.25	2
	-헤마틴		1
	+헤마틴		8
Bacillus subtilis	없음	0.7		0.8		0.2
StreptococcusPneumoniae*	-헤마틴		2
	+헤마틴		8
Streptococcussalivarius*viridans group	-헤마틴		0.12
	+헤마틴		0.5
Pseudomonas aeruginosa	없음	4	1.33	5.3	0.33	9.3
Klebsiella pneumoniae	없음	5.3		4		4
Serratia marcescens	없음	16		16		21
Escherichia coli	없음	4	0.33	5.3	0.12	4
	-헤마틴		0.5
	+헤마틴		8

Haemophilus influenzae*	-hematin		No growth
	+hematin		8
Acinetobactercalocoaceticus	None	2		3		4
Neisseria meningitidis*	-hematin		8
	+hematin		32
Candida albicans	None	8	4	16	8	16

표 36 에서는 다양한 미생물에 대한 다양한 펩티드의 MIC를 나타낸다.

Claims (38)

1. 약 10 내지 30개 아미노산으로 구성되고 다음의 아미노산 서열을 가지거나 또는 이의 제약학적 염 또는 N-단부가 아실화된 또는 C-단부가 아미데이트화된 또는 이의 에스테르형을 가지는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.

   이때,

   C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 시스테인형-, 염기성, 작은 아미노산, 극성/큰 아미노산 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

   C₆또는 C₁₅각각은 시스테인형-, 염기성, 작은 아미노산 또는 극성/큰 아미노산 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₁-X₅각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 염기성, 소수성, 극성/큰 아미노산 또는 작은 아미노산일 수 있고;

   X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 또는 작은 아미노산일 수 있고;

   X₉또는 X₁₂각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고;

   X₉-X₁₂는 서열 1의 아미노산에 포함된 경우에 리버스-턴에 영향을 비칠 수 있고, X₉-X₁₂중 적어도 하나는 염기성 아미노산이다;

   X₁₆-X₁₈각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 각각은 염기성, 소수성, 극성/큰 아미노산 또는 작은 아미노산일 수 있고;

   이때, 항균성 펩티드로 구성된 아미노산의 약 15% 내지 최고 50%는 염기성 아미노산이고 항균성 펩티드은 네트 전하는 생리 pH에서 적어도 +1이고;

   X₁-X₄모두 존재하는 경우에, X₁-X₄어느 것도 소수성 아미노산이 아니고, X₅, C₈, X₉, X₁₂, C₁₃, X₁₆중 적어도 하나는 없거나 또는 X5는 염기성인 것을 조건으로 한다.
2. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 두 개의 이황화결합을 포함하고 고유형인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 한 개의 이황화결합을 포함하고 bullet 또는 kite형인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 이황화결합을 포함하자 않고, snake형인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
5. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 생리 pH에서 네트 전하가 적어도 +3인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
6. 약 10 내지 24개 아미노산으로 구성되고 다음의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.

   이때,

   C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 작은 아미노산 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

   C₆또는 C₁₅각각은 작은 아미노산, 소수성 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

   X₁-X₅각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 염기성, 작은 아미노산이고, X₁-X₅적어도 두 개는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₉또는 X₁₂각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 존재하는 경우에 염기성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₁₀은 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 존재하는 경우, 작은 아미노산 또는 프롤린일 수 있고;

   X₁₆은 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 존재하는 경우, 염기성, 작은 아미노산 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₁₇또는 X₁₈각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 존재하는 경우에 염기성 또는 작은 아미노산일 수 있고;

   X₁₆또는 X₁₈각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 존재하는 경우에 염기성, 소수성, 극성/큰 아미노산 또는 작은 아미노산일 수 있다.
7. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 약 10-18개 아미노산 잔기로 구성되는데 이때, C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 작은 아미노산, 소수성 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

   C₆또는 C₁₅각각은 작은 아미노산, 소수성 또는 극성/큰 아미노산 또는 시스테인일 수 있고;

   X₁-X₄각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각은 염기성, 작은 아미노산이 되고, X₁-X₄중에서 한 개는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₅-X₁₆각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 각각은 소수성 또는 염기성 아미노산일 수 있고;

   X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₉은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 염기성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₁₀은 염기성 또는 작은 아미노산 또는 프롤린일 수 있고;

   X₁₁은 염기성 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₁₂은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 소수성 아미노산일 수 있고;

   X₁₇은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 독립적으로 작은 아미노산일 수 있고;

   X₁₈은 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 존재하는 경우에, 염기성 아미노산일 수 있다.
8. 제 1 항에 있어서, C₆, C₈, C₁₃, C₁₅는 각 시스테인이고, X₇과 X₁₄는 각각 독립적으로 소수성 아미노산인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
9. 제 8 항에 있어서, X₇, X₁₄는 각각 독립적으로 I, V, L, W, Y, F가 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
10. 제 9 항에 있어서, X₇은 I, F, Y, W이고, X₁₄는 I, V, L, W, Y, F가 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
11. 제 1 항에 있어서, X₁- X₄는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
12. 제 1 항에 있어서, X₁- X₄중 적어도 하나는 소수성 아미노산인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
13. 제 12 항에 있어서, 소수성 아미노산는 I, V, L, W, Y, F가 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
14. 제 1 항에 있어서, X₉- X₁₂중 적어도 하나는 소수성 아미노산인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
15. 제 1 항에 있어서, X₁, X₉는 각각 독립적으로 R, K, Orn, Dab, Har 또는 소수성 아미노산이 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
16. 제 1 항에 있어서, X₂, X₃는 각각 독립적으로 G, A, S, T, I, V, L, F, Y, W가 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
17. 제 1 항에 있어서, X₄는 각각 독립적으로 R, K, H, Orn, Dab, G, A, S, T, F, Y, W가 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
18. 제 1 항에 있어서, X₉는 각각 독립적으로 R, K, H, Orn, Dab, Har, I, V, L, Nle, W, Y, F이고, X₁₂는 I, L, V, W, F, Y가 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
19. 제 1 항에 있어서, X₉- X₁₂는 함께 세 개의 아미노산 잔기 γ-턴(TURN)이 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
20. 제 1 항에 있어서, X₉- X₁₂는 함께 네 개의 아미노산 잔기 β-턴(TURN)이 되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
21. 제 1 항에 있어서, β-턴 서열은 ZZZG; ZZZF, ZZSG; ZZAL; ZGZL; ZFZL; ZPZV; ZPZF; ZGZY; IZGZ; LZZF; YZGZ 이고, 이때 Z 는 각각 R, K, Dbu 또는 Orn의 L-또는 D-이성체인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
22. 제 1 항에 있어서 모든 아미노산은 D-이성체인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
23. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
24. 제 1 항에 따른 항균성 펩티드를 생산하기 위한 재조합 발현 시스템에 있어서, 발현 시스템은 발현에 영향을 주는 조절 서열에 연결된 펩티드를 인코드하는 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 발현 시스템.
25. 제 25항에 따른 발현 시스템을 포함하도록 변형된 재조합 숙주 세포 또는 이의 자손 세포.
26. 항균성 펩티드 또는 이의 중간생성물 펩티드를 생산하는 방법에 있어서, 펩티드가 생산되고, 배양물에서 항균성 펩티드를 회수할 수 있는 조건하에 제 24항 에 따른 변형된 숙주 세포 또는 이의 자손 세포를 배양하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 1 항에 따른 항균성 펩티드와 제약학적 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제중 적어도 하나와 혼합된 것을 특징으로 하는 항균성 제약학적 조성물.
28. 식물에 효과가 있는 제 1 항에 따른 항균성 펩티드와 제약학적 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제중 적어도 하나와 혼합된 것을 특징으로 하는 항균성 제약학적 조성물.
29. 바이러스 또는 미생물의 생장을 방해하는 방법에 있어서, 생장을 방해하는데 효과적인 제 1 항에 따른 항균성 펩티드 효과량을 바이러스 또는 미생물의 성장을 지원하는 조성물에 접촉시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
30. 그램-음성 박테리아의 엔도톡신을 비활성화시키는 방법에 있어서, 엔도톡신을 비활성화시키는데 효과가 있는 제 1 항에 따른 항균성 펩티드를 엔도톡신과 접촉시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 1 항에 따른 항균성 펩티드와 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 항체.
32. 개체에서 미생물 또는 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기위한 방법에 있어서, 치료를 요하는 개체에 다음과 같은 펩티드 효과량을 투여하는 단계로 구성되는데 이때, 펩티드는 약 10 내지 30개 아미노산으로 구성되고 다음의 아미노산 서열을 가지거나 또는 이의 제약학적 염 또는 N-단부가 아실화된 또는 C-단부가 아미데이트화된 또는 이의 에스테르형을 가지는 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.

    이때,

    C₈또는 C₁₃각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 시스테인형-, 염기성, 작은 아미노산, 극성/큰 아미노산 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

    C₆또는 C₁₅각각은 시스테인형-, 염기성, 작은 아미노산 또는 극성/큰 아미노산 또는 소수성 아미노산일 수 있고;

    X₁-X₅각각은 독립적으로 존재하거나 하지 않을 수 있는데, 각각은 염기성, 소수성, 극성/큰 아미노산 또는 작은 아미노산일 수 있고;

    X₇또는 X₁₄각각은 독립적으로 소수성 또는 작은 아미노산일 수 있고;

    X₉또는 X₁₂각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고;

    X₉-X₁₂는 서열 1의 아미노산에 포함된 경우에 리버스-턴에 영향을 비칠 수 있고, X₉-X₁₂중 적어도 하나는 염기성 아미노산이다;

    X₁₆-X₁₈각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 각각은 염기성, 소수성, 극성/큰 아미노산 또는 작은 아미노산일 수 있고;

    이때, 항균성 펩티드로 구성된 아미노산의 약 15% 내지 최고 50%는 염기성 아미노산이고 항균성 펩티드은 네트 전하는 생리 pH에서 적어도 +1이다.
33. 제 32 항에 있어서, 미생물 감염은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylcoccus aureus)에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 31 항에 있어서, 항균 펩티드는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 32 항에 있어서, 미생물 감염은 슈도모나스(Pseudomonas)에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 항균 펩티드는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 32 항에 있어서, 미생물 감염은 H. 플로리(pylori)에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 항균 펩티드는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.