HU217442B

HU217442B - Polipeptidek és ezeket tartalmazó HIV-ellenes hatású gyógyászati készítmények

Info

Publication number: HU217442B
Application number: HU9501719A
Authority: HU
Inventors: Akiyoshi Matsumoto; Michinori Waki
Original assignee: Seikagaku Corp.
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-12
Publication date: 2000-01-28
Also published as: EP0677061B1; CN1038841C; US5776899A; CN1116427A; WO1995010534A1; NO952321L; HU9501719D0; KR100208873B1; FI952900A0; DE69416824T2; CZ153395A3; CZ287239B6; RU95112539A; HUT72974A; NZ274560A; DE69416824D1; ZA948005B; NO952321D0; CA2151283A1; FI952900A

Abstract

A találmány tárgya 1 23 4 5 6 7 8 910 11 12 13A1–Trp–Cys–Tyr–A3–A3–X– Tyr–A3–A3–Cys–A3–NH2(I) (I) általánős képletű vegyületek – a képletben A1 jelentése lizin,arginin és őrnitin közül választőtt kettő bázikűs aminősavattartalmazó peptidmaradék, amelynek terminális aminősavmaradékában azN- a-hidrőgénatőm 2–16 szénatőmős alkanőilcsőpőrttal vagyflűőreszcein-tiőkarbamőil-csőpőrttal lehet helyettesítve; A3 jelentéselizin- vagy argininmaradék; X jelentése D-őrnitil-prőlin, D-lizil-prőlin, prőlil-D-lizin, és lizil-glicin közül választőttpeptidmaradék, amelyekben a D-lizin, L-lizin és D-őrnitin w-aminőcsőpőrtjának hidrőgénatőmja egy w- aminő-2–6 szénatőmősalkanőilcsőpőrttal lehet helyettesítve, és maga a peptidmaradékpeptidkötéssel kapcsőlódik a 6-ős és a 8-as helyzetben lévőaminősavmaradékőkhőz; Trp jelentése triptőfánmaradék; Tyr jelentésetirőzinmaradék és Cys jelentése ciszteinmaradék, és a 3-as és 11-eshelyzetben lévő ciszteinmaradékők adőtt esetben diszűlfidkötésselvannak összekapcsőlva – és sóik, melyek antimikrőbás vagy antivirális aktivitásűkkövetkeztében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként alkalmazhatókkülönösen anti-HIV szerként, vagy DNS-transzfektáló rendszerekkőmpőnenseként a génterápiában. ŕ

Description

A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 2 lap ábra)

HU 217 442 B

HU 217 442 Β

A találmány új polipeptidekre és gyógyászatilag elfogadható sóikra vonatkozik, amelyek erős affinitást mutatnak lipopoliszacharidokhoz, különösen endotoxinokhoz. A találmány szerinti polipeptidet gyógyászati készítményekben alkalmazhatjuk antivirális szerként (például anti-HIV szerként).

Kardfarkú tarisznyarákból (Tachypleus, illetve Limulus polyphemus) antimikrobás hatású polipeptidek két családját izolálták, amelyek endotoxinokhoz affinitást mutatnak [lásd például Shigenaga és munkatársai, J. Bioi. Chem. 265. 21350-21354. (1990); Kawano és munkatársai, J. Bioi. Chem. 265, 15 365-15 3 67. (1990); Muta és munkatársai, J. Biochem. 108, 261-266. (1990); JP 167230/1990, JP 152987/1990, JP 53 799/1990 számon közrebocsátott szabadalmi leírások 500 194/1990 számon közzétett szabadalmi leírást, Miyata és munkatársai J. Biochem. 106, 663-668. (1989); Akaji és munkatársai Chem. Pharm. Bull. 37. 2661-2664. (1989); Tokunaga és Iwanaga, Taisha (Metabolism) 26, 429-439. (1989); Shieh és munkatársai, FEBS Lett., 252 121-124. (1989); és Nakamura és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263, 16709-16 713. (1988)].

Az egyik családot, a tachiplezineket japán kardfarkú tarisznyarákból (Tachypleus) izolálták. Azonosították a tachiplezin I-et, ΙΙ-t és ΙΙΙ-at. A másik családot, a polifemuzinokat amerikai kardfarkú tarisznyarákból (Limulus polyphemus) izolálták. Azonosítottak két polifemuzint, a polifemuzin I-et és ΙΙ-t; aminosavszekvenciájukat az 1. ábra mutatja.

A fenti két családba tartozó polipeptidek 17 vagy 18 aminosavmaradékból állnak, és mindegyikben négy közös konzervált régió van és két diszulfidhíd (lásd az 1. ábrát).

Azt találták, hogy mind a tachiplezinek, mind a polifemuzinok alacsony koncentrációkban gátolják mind a Gram-negatív, mind a Gram-pozitív baktériumok szaporodását, valamint a gombák, például a Candida albicans szaporodását, és bakteriális lipopoliszacharidokkal komplexeket képeznek [Shigenaga és munkatársai, J. Bioi. Chem., 265, 21350-21354. (1990) és Muta és munkatársai, J. Biochem. 108, 261-266. (1990)]. Ezenkívül a tachiplezin családba tartozó polipeptidekről kimutatták, hogy vírusok, például influenzavírus és vezikuláris stomatitis vírus [Murakami és munkatársai, Chemotherapy, 37, 327-334. (1991)] vagy humán immunhiány vírus [Morimoto és munkatársai, Chemotherapy, 37, 206-211. (1991)] ellen is mutatnak bizonyos aktivitást. Nagyon érdekes, hogy az ilyen tulajdonságokkal rendelkező fenti polipeptidek valószínűleg azok a kulcsanyagok, amelyek lehetővé tették, hogy a kardfarkú tarisznyarák a külső környezeti változásokhoz adaptálódni tudott, hogy ez a faj mint egy élő kövület fennmaradt az ősidők óta.

Másrészről, a magas fejlettségi fokon lévő emberi faj túlélése szempontjából nagyon kívánatos olyan gyógyszerek felismerése, amelyek profilaktikus vagy terápiás hatást mutatnak a szerzett immunhiány szindróma ellen, amelyet humán immunhiány vírus (HÍV) általi fertőzés okoz.

Kutatásaink során összefüggést kerestünk a polipeptidek molekuláris szerkezete és anti-HIV aktivitása között az aminosavkomponensek cseréje és módosítása segítségével, és így ismertük fel azokat a polipeptideket, amelyek a kardfarkú tarisznyarák hosszú fennmaradásával kapcsolatban vannak. Ennek eredményeként már régebben találtunk olyan új polipeptideket, amelyek alapvetően különböznek a kardfarkú tarisznyarákok ismert polipeptidjeinek közös szerkezetétől.

Meglepő módon azt találtuk, hogy ezek az új polipeptidek kiváló biológiai aktivitást mutatnak, anti-HIV értékük legalább ötször vagy még többször akkora, mint a kardfarkú tarisznyarákból izolált ismert polipeptideké.

Ezen polipeptidek ismertetése az alábbi irodalmi helyeken található: Nakashima és munkatársai, Antimicrob. Agents Chemother. 36. 1249-1255. (1992); Masuda és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 189, 845-850. (1992); Tamamura és munkatársai, Chem. Pharm. Bull., 41, 978-980. (1993); Tamamura és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 1163, 206 -209.; Masuda és munkatársai, J. Pharmacobio. Dyn., 15, s-90 (1992); WO 92/04374 számon közzétett szabadalmi leírás; JP 163 298/1993 számon közrebocsátott szabadalmi leírás.

(A fenti polipeptidek közül a T-22 jelű vegyületet találtuk a legelőnyösebb vegyületnek.) Miután megvizsgáltuk a szerkezeti kívánalmakat a T-22 vegyület által képviselt 16-18 aminosavból álló új polipeptidek kívánt aktivitásához, sikerült néhány elvi összefüggést találnunk a minimálisan szükséges szerkezetre vonatkozóan.

Általában, ha egy viszonylag nagy molekulatömegű exogén peptidet viszünk be humán szervezetbe, azt a szervezet védekező funkciója gyakran idegen anyagként felismeri. Ennek eredményeként nagyon valószínű, hogy antigén anyaggá válik. Gyógyászati célokra történő alkalmazás esetén kívánatos, hogy a peptid alapú biológiailag aktív anyag viszonylag alacsony móltömeggel rendelkezzen, ezáltal csökken annak valószínűsége, hogy azt idegen anyagként ismeri fel a szervezet. Az is szükséges, hogy az anyag nagy aktivitással rendelkezzen.

A T-22 vegyület egy polipeptid, amely 18 aminosavmaradékból áll. Kutatásaink célja az volt, hogy az anti-HIV-aktivitást ugyanolyan szinten tartsuk, mint a T-22 vegyületé, ugyanakkor az aminosavmaradékok számát csökkentsük. Ennek eredményeként sikerült az aminosavmaradékokat 4-gyel csökkenteni. Ha a vegyület az alapszerkezettel rendelkezik, aktivitása nem csökken még akkor sem, ha egy specifikus régiót módosítunk. Ezen túlmenően a fenti módosítás segítségével találtunk olyan új polipeptidet, amely olyan alapvető szerkezettel rendelkezik, ami szélesebb spektrumú fizikai-kémiai tulajdonságokat biztosít, és a gyógyászati eljárásoknak is szélesebb választékát biztosítja, azaz fokozza a hidrofil jelleget vagy csökkenti és lipofil jelleget (affinitást a lipidekhez); szelektív felhalmozódást biztosít egy specifikus szervben és/vagy sejtben; és fo2

HU 217 442 Β kozza/csökkenti a tartózkodási időt az emberi testben; és lehetőséget nyújt a gyógyászati készítmények fejlesztésére is.

A találmány tehát új polipeptidekre vonatkozik, amelyek a kardfarkú tarisznyarákból izolált, nagy endotoxin affinitással rendelkező polipeptidek alapján általunk felismert erős anti-HIV-aktivitással rendelkező fenti polipeptidekből származnak, de azoktól mégis jelentősen eltérnek.

Az általunk korábban felismert polipeptidek 16-18 aminosavmaradékból állnak, 4 cisztein- vagy 2 cisztinmaradékot tartalmaznak, és antiparallel β-lemezszerkezettel rendelkeznek, amely β-csavarodású. A fenti polipeptidekhez hasonlóan a találmány szerinti polipeptidek is valószínűleg β-csavarodású antiparallel β-lemezszerkezettel rendelkeznek, amely a 7-es helyzetben lévő X maradékon lokalizálódik. Azonban a találmány szerinti polipeptidekben az aminosavmaradékok száma 4-gyel, illetve a ciszteinmaradékok száma 2-vel kevesebb. Ezen túlmenően a biológiai aktivitás nem csökken még akkor sem, ha egy specifikus régiót módosítunk.

A találmány szerinti polipeptideket anti-HIV reagensként, és génterápiás célokra DNS-transzfektáló rendszerek komponenseként alkalmazhatjuk. Amint azt alább részletesen ismertetjük, a találmány szerinti polipeptidek anti-HIV aktivitása lényegesen magasabbak, mint az általunk korábban felismert polipeptideké, amelyek a kardfarkú tarisznyarák nagy endotoxin affinitású polipeptidjeiből származnak.

Definíciók

A leírásban a peptidszekvenciákat az aminosavmaradékok és a szubsztituált aminosavmaradékok hárombetűs rövidítésével újuk le az alábbiak szerint:

Alá alanin;

Arg arginin;

Cys cisztein;

Ile izoleucin;

Gly glicin;

Leu leucin;

Lys lizin;

2 3 4 5 6 7

A[-Trp-Cys-Tyr-A₃-A₃-Xáltalános képletű pepiidre, vagy annak sóira vonatkozik, a képletben

A, jelentése lizin, arginin és omitin közül választott kettő bázikus aminosavat tartalmazó peptidmaradék, amelynek terminális aminosavmaradékában az N-ahidrogénatom 2-16 szénatomos alkanoilcsoporttal vagy fluoreszcein-tiokarbamoil-csoporttal lehet helyettesítve;

A₃ jelentése lizin- vagy argininmaradék;

X jelentése D-omitil-prolin, D-lizil-prolin, Prolil-Dlizin, és lizil-glicin közül választott peptidmaradék, amelyekben a D-lizin, L-lizin és D-omitin ω-aminocsoportjának hidrogénatomja egy ω-amino2-6 szénatomos alkanoilcsoporttal lehet helyettesítve, és maga a peptidmaradék peptidkötéssel kap-

Om	omitin;
Phe	fenilalanin;
Pro	prolin;
Trp	triptofán;
Tyr	tirozin;
Val	valin;
DArg	D-arginin;
DLys	D-lizin;
DOm	D-omitin;
Ac-Arg	N-a-acetil-arginin;
FTC-Arg	N-a-fluoreszcein-tiokarbamoilarginin;
Laur-Arg	N-a-aluroil-arginin;
Myr-Arg	N-a-mirisztoil-arginin;
Oct-Arg	N-a-oktanoil-arginin;
Parm-Arg	N-a-palmitoil-arginin;
Parm-Om	N-a-palmitoil-omitin;
ε-Ν-Ac-DLys	ε-Ν-ω-amino-acetil-D-lizin, és
ε-Ν-But-DLys	ε-Ν-ω-amino-butiril-D-lizin.
Ezenkívül az	alábbi rövidítéseket alkalmaztuk:
HÍV	humán immunhiány vírus (összes variáns)
MOI	fertőzési faktor
Sí	szelektivitási index

(CC_5O/EC_5O arány).

Az alábbiakban röviden ismertetjük a rajzokat.

Az 1. ábra mutatja a tachiplezin I, tachiplezin II, tachiplezin III. polifemuzin I és polifemuzin II aminosavszekvenciáját. A megőrződött aminosavakat bekereteztük. Az összefüggő vastag vonalak mutatják a diszulfidkötéseket, amelyek a Cys-3 vagy -4 és a Cys-16 vagy -17; és a Cys-7 vagy -8 és Cys-12 vagy -13 között jöhetnek létre a polifemuzin II esetén jelölt módon.

A 2. ábra mutatja sematikusan a találmány szerinti (1) polipeptid előállításának szintézismenetét.

A fenti szempontok alapján létrehozott találmány egy új

10 11 12 13

A₃-A₃-Cys-A₃-NH₂ (I) csolódik a 6-os és a 8-as helyzetben lévő aminosavmaradékokhoz;

Trp jelentése triptofánmaradék;

Tyr jelentése tirozinmaradék és Cys jelentése ciszteinmaradék, és a 3-as és 11-es helyzetben lévő ciszteinmaradékok adott esetben diszulfidkötéssel vannak összekapcsolva.

A találmány szerinti (I) általános képletű polipeptidek specifikus példáit az 1. táblázatban közöljük, ezeket a polipeptideket arab számokkal jelöljük.

Az egyes szimbólumok a nemzetközi nómenklatúrának megfelelő hárombetűs kódokat jelentik (lásd fent). Az aminosavak prefixum nélküli neve, illetve hárombetűs kódja a természetes L-konfigáruciót jelenti.

HU 217 442 Β

1. táblázat

HU 217 442 Β

Az erős anti-HIV-aktivitással rendelkező fent említett, általunk korábban előállított polipeptidek 16-18 aminosavmaradékból állnak. A legelőnyösebb vegyület (amelyet a továbbiakban n—18 polipeptidnek vagy Τ-22-nek nevezünk) alapján azt találtuk, hogy az erős aktivitáshoz szükséges szerkezeti faktorok közül esszenciális 4 ciszteínmaradék, 4 vagy 5 aromás aminosavmaradék, 8 bázikus aminosavmaradék és 1 glicinmaradék jelenléte. Ezenkívül az n-18 polipeptid aminosavszekAj-A₂-Cys-A₂-A₃-Cys-A₂-A₃-Gly-A₂általános képletében

A! jelentése legfeljebb két aminosav, amelyet lizin és arginin közül választunk;

A₂ jelentése tirozin-, fenilalanin- vagy triptofánmaradék;

A₃ jelentése arginin- vagy lizinmaradék;

A₄ jelentése legalább egy és nem több, mint két aminosav, amelyet lizin és arginin közül választunk;

A₅ jelentése -OH (amely karboxilcsoportból származik); vagy -NH₂ (amely amidcsoportból származik);

Cys jelentése ciszteínmaradék, és

Gly jelentése glicinmaradék.

Egy speciális kiviteli alakban a 3-as és 16-os helyzetben lévő ciszteinmaradékok és/vagy a 7-es és 12-es helyzetben lévő ciszteinmaradékok diszulfidkötéssel (-S-S-) kapcsolódhatnak össze.

Az η-18-as polipeptidben a csavarodás - valószínűleg β-csavarodással - a 9-es és a 10-es helyzetben lokalizálódik. Ezenkívül a 3-as helyzetben lévő peptidrész a 8-as helyzetűvel, és a 11-es helyzetű peptidrész a 16-os helyzetűvel néz szembe.

Az η-18 polipeptidhez hasonlóan a találmány szerinti polipeptidek is antiparallel β-lemezszerkezettel rendelkeznek, az intramolekuláris hidrogénkötések és a ciszteinmaradékokkal alkotott diszulfidkötések (-S-S-) jelenlétének következtében. A találmány szerinti polipeptidekben a csavarodás valószínűleg β-csavarodással a 7-es helyzetű X maradékon lokalizálódik úgy, hogy a 3-as helyzetű peptidrész a 6-os helyzetűvel, és a 8-as helyzetű peptridrész a 11-es helyzetűvel szemben helyezkedik el.

A találmány értelmében a találmány szerinti peptidek 1-es helyzetében lévő aminosavmaradékok száma közötti összefüggés ugyanaz, mint az n-18 polipeptidben.

Kimutattuk, hogy az N-terminális aminosavmaradék α-aminocsoportja hidrogénatomjának helyettesítése acilcsoporttal vagy szubsztituált tiokarbamoilcsoporttal fontos az (I) általános képletű új polipeptidek nagy antiHlV-aktivitásának kifejtéséhez. Az acilcsoport vagy szubsztituált tiokarbamoilcsoport különböző tulajdonságainak szelektálásával lehetővé vált, hogy a találmány szerinti új polipeptidnek hidrofílicitást, lipidekkel szembeni affinitást, eltérő fluoreszcenciás tulajdonságokat stb. kölcsönözzünk. így például a fluoreszceinnel szubsztituált tiokarbamoilcsoport fluoreszcenciás tulajdonsága nagy szenzitivitású marker festékként alkalvenciáját tekintve - amelyet az (A) általános képlet mutat - a 2-17-es helyzetben lévő aminosavmaradékok tulajdonságai erősen megkötöttek. Az n-18 polipeptid

1-es helyzetében szerkezet-aktivitás összefüggést talál5 tünk, amely szerint a mutatott anti-HIV-aktivitás viszonylagos értékei az aminosavmaradékok számának növelésével fokozódnak.

Az n-18 polipeptid —Cys—A₂—A₃—A₃—Cys—A₄—Aj (A) mazható a találmány szerinti polipeptidekben különféle célokra [lásd például Brand és Witholt „Methods in Enzymology”, 11, 776-856., kiadó Hirs, Academic Press, New York, New York (1967); Brand és Gohlke, Annu. Rév. Biochem., 41, 843-868. (1972); Stryer, Annu. Rév. Biochem. 47, 819-846. (1978)].

Ezenkívül nagyon fontos és hasznos az, hogy a fluoreszceinnel szubsztituált tiokarbamoilcsoporttal helyettesített találmány szerinti polipeptidek még nagyobb antiHlV-aktivitást képesek kifejteni. így a találmány szerinti fenti polipeptidek, amelyek fluoreszcenciás tulajdonságokkal rendelkeznek, fontos eszközként alkalmazhatók a találmány szerinti polipeptidek anti-HIV-aktivitása hatásmechanizmusának felderítésére. így például a beadagolást követően fluoreszcencia mikroszkópiával detektálni lehet a HÍV-vei fertőzött vagy nem fertőzött szervezetben, szervben, szövetben vagy sejtben a vegyület sorsát, metabolizmusát vagy eloszlását. A fenti polipeptidek intrinsic fluoreszcenciás mintáinak alkalmazásával molekuláris szinten információ nyerhető a receptor molekulával kölcsönhatásba lépő fenti polipeptidek finom konformációs változásairól a sejtben. Magának a receptor molekulának az izolálása és azonosítása is lehetővé válik a fluoreszcenciás próba alkalmazásával.

Ezenkívül az acilcsoportok vagy szubsztituált tiokarbamoilcsoportok segítségével lehetővé vált az, hogy az új polipeptideknek egyéb vegyületek, például cukorláncot tartalmazó vegyületek, lipidvegyületek, nukleinsawegyületek, egyéb típusú peptidek vagy proteinek stb. biológiai aktivitását is kölcsönözzük. A találmány szerinti új polipeptidek aktivitásának megnyilvánulásában jelentős szerepet játszik az a tény, hogy a 4-6-os helyzetben, és a 8-10-es helyzetben lévő aminosavmaradékok tulajdonságai ugyanazok az ismétlődő tulajdonságok. A találmány szerinti új polipeptidek háromdimenziós szerkezetének kialakulását tekintve a peptid aminosavszekvenciája jelentős, mivel ez teszi lehetővé, hogy a 3-7-es helyzetben és 7-11-es helyzetben lévő peptid szerkezeti részek ugyanazon sík szerkezetben legyenek, de ellentétes módon, és az X szimbólummal jelölt két aminosavmaradékból álló peptidmaradék a 7-es helyzetben legyen a fordulópont. Abban az esetben, ha a 3-as és 7-es helyzetben lévő risztéinek kapcsolódnak össze egy diszulfidkötéssel, a találmány szerinti új polipeptidek peptidvázából ezáltal kialakult háromdimenziós szerkezet a találmány egy fontos jellemzője. Úgy is mondhatjuk, hogy az X peptidmaradék csavarodó szerkezete 7-es helyzetben - amely egy gli15

HU 217 442 Β cinből és egy bázikus aminosavból, vagy prolinból és egy D-izomer bázikus aminosavból álló párból épül fel (elvileg a hidroxi-prolin ugyanolyan hatású prolinnal helyettesíthető) - szükséges faktor a β-lemezszerkezetű azonos sík szerkezet kialakulásához. A diszulfid oldallánccal összekötött 3-as és 11-es helyzetű ciszteinmaradékok, és az 5-ös és 9-es helyzetben lévő bázikus aminosavmaradékok bázikus oldalláncai a váz síkjának azonos oldalán vannak, míg a 4-es és 8-as helyzetben lévő aromás aminosavmaradékok aromás oldalláncai és a 6-os és 10-es helyzetben lévő bázikus aminosavmaradékok bázikus oldalláncai a váz síkjának ellentétes oldalán vannak. A fenti háromdimenziós szerkezet kialakulása fontos. így az ezzel a háromdimenziós szerkezettel rendelkező (I) általános képletű új polipeptidben az n-18 polipeptidhez képest az aminosavmaradékok számát 4-gyel tudtuk csökkenteni.

Ezenkívül az n-18 polipeptidhez hasonlóan a találmány szerinti polipeptidek is nagyon bázikus tulajdonságokat mutatnak. Bázikus természetük következtében a találmány szerinti polipeptidek savaddíciós sókat képezhetnek. így például a polipeptidek szervetlen savakkal (sósavval, hidrogén-bromiddal, foszforsavval, salétromsavval, kénsavval vagy hasonlóval) vagy szerves karbonsavakkal (például ecetsavval, halogén-ecetsawal, így például trifluor-ecetsawal, propionsawal, maleinsawal, borostyánkősawal, almasawal, citromsawal, borkősavval, szalicilsawal) és savas cukrokkal (például glukuronsawal, galakturonsawal, glükonsawal, asz1 2 3 4 5 6 7

Aj-Trp-Cys-Tyr-A₃-A₃-X(ahol Aj, A₃, Cys, Trp, Tyr és X jelentése az (I) általános képletre fent megadott).

Abban az esetben, ha Aj jelentése N-a-(2-16 szénatomos alkanoil)-peptid-maradék, amikor az aminoterminális aminosavmaradék Ν-α-helyzetében lévő hidrogénatom van helyettesítve az acilcsoporttal, a fenti peptidgyanta N-terminális aminocsoportját a megfelelő savanhidriddel vagy megfelelő sawal kondenzálószer alkalmazásával acilezzük, így N-acil-peptid-gyantát kapunk. Az oldhatatlan gyanta és az aminosavak védőcsoportjai lehasítása után kapjuk a találmány szerinti (I) általános képletű, egyenes láncú polipeptideket. Abban az esetben, hogyha a fenti (I) általános képletben Al jelentése N-a-fluoreszcein-tiokarbamoil-peptid-maradék, amikor is az aminoterminális aminosavmaradék N-ahelyzetű hidrogénatomja van helyettesítve fluoreszceintiokarbamoil-csoporttal, a találmány szerinti N-terminális Ν-α-fluoreszcein-tiokarbamoil-polipeptideket úgy állíthatjuk elő, hogy szubsztituált izotiocianát vegyülettel reagáltatjuk enyhén lúgos körülmények között.

Ebben az esetben a 12-es helyzetű amínosavmaradék karboxilterminálisa savamiddá van alakítva. Ezenkívül, a kapott polipeptidben a 3-as és 11-es helyzetű két ciszteinmaradék diszulfidkötést (-S-S-) képezhet a merkaptocsoportokon keresztül.

Ezeket a diszulfidkötéseket például levegővel végzett oxidálással vagy Atherton E. és munkatársai módkorbinsavval vagy hasonlóval), és savas poliszacharidokkal (például hialuronsawal, kondroitin-szulfáttal, alginsavval és hasonlókkal) vagy szerves szulfonsavakkal (például metánszulfonsawal, p-toluolszulfonsavval vagy hasonlóval), valamint szulfonsavas cukor-észterekkel (például kondroitin-szulfátokkal képezhetnek sókat.

A találmány szerinti új polipeptideket részletesebben alább ismertetjük.

Polipeptidek előállítása

A találmány szerinti új polipeptideket ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, például szilárd fázisú szintetikus eljárásokkal [lásd például „Solid-phase Peptide Synthesis”, Stewart & Young, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)]. Közelebbről, a találmány szerinti (I) általános képletű, lineáris polipeptideket úgy állíthatjuk elő, hogy a 12-es helyzetű N-védett arginin karboxilcsoportját egy aminocsoportokat tartalmazó oldhatatlan gyantához kötjük közvetlenül, vagy a karboxilcsoportok megkötésére képes funkciós csoportokat tartalmazó spaceren keresztül [például egy olyan csoporton keresztül, amely képes az arginin karboxilcsoportját p-(karboxi-metil)-benzil-észterré alakítani]. A 12-es helyzetű arginin- (Arg) maradékot tartalmazó oldhatatlan gyanta aminocsoportja az N-védőcsoport eltávolítása után szilárd fázisú módszerek szerint egymás után kapcsolható a megfelelően védett 11-es helyzetű aminosavtól az 1-es helyzetű aminosavig az (I) általános képletű szekvenciának megfelelően

10 11 12 13

A₃-A₃-Cys-A₃-NH₂ (I) szerével [J. Chem. Soc., Perkin Trans. I., 2065. (1985)] alakíthatjuk ki.

A fenti szilárd fázisú szintézisben fent említett egyes aminosavak L-izomer formában vannak, hacsak azt másképp nem említjük, míg az X jelentésére megadott 7-es helyzetben lévő prolinhoz kapcsolódó bázikus aminosavak D-izomer formában vannak.

A találmány szerinti új polipeptidek előállítására bármely aminocsoportot tartalmazó, oldhatatlan gyanta alkalmazható, amennyiben az aminocsoportjain keresztül képes a C-terminálison N-védett arginin vagy lizin karboxilcsoportjához, vagy bizonyos esetekben az ahhoz kapcsolódó spacer karboxilcsoportjához kapcsolódni, majd ezután eltávolítható. A fenti oldhatatlan gyantákra - a korlátozás szándéka nélkül - említjük az alábbiakat: amino-metil-gyanták (amino-metilezett sztirol/divinilbenzol kopolimerek), benzhidril-amin-gyanták, metilbenz-hidril-amin-gyanták és amino-metil-fenoxi-metilgyanták és származékaik. Abban az esetben, ha benzhidril-amin-gyantát, metil-benzhidril-amin-gyantát, dimetoxi-benzhidril-amin-gyantát (DMBHA) vagy aminometil-fenoxi-metil-gyantát alkalmazunk, a hasítással közvetlenül amidot kapunk, de egy amino-metil-gyanta előnyösebb a hozam szempontjából.

Karboxilcsoporthoz kötődni képes funkciós csoportot vagy karboxilcsoportot tartalmazó spacerként egy olyan vegyületet alkalmazhatunk, amely képes az argi6

HU 217 442 Β nin karboxilcsoportját p-(karboxi-metil)-benzil-észterré alakítani, de a spacer tekintetében nincsenek különösebb megkötések.

Védett aminosav alatt olyan aminosavat értünk, amelynek funkciós csoportjai ismert módon védőcsoportokkal vannak védve, a különféle védett aminosavak kereskedelmi forgalomban is kaphatók. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a polipeptidek szintetikus előállítási eljárásaiban védőcsoportokat kell alkalmazni az aminosavak labilis oldalláncainak stabilizálására, hogy az oldalláncokat a szintézis során a lehetséges kémiai változásoktól megvédjük.

Egy aminosav α-aminocsoportjának védőcsoportja például (terc-butoxi)-karbonil-csoport (Boc) vagy 9fluorenil-metil-oxi-karboníl-csoport (Fmoc) lehet. Az arginin (Arg) guanidinocsoportjának védőcsoportja például tozilcsoport (Tos), nitrocsoport (NO2), 4-metoxi2.3.6- trimetil-benzolszulfonil-csoport (Mtr) vagy 2,2,5,7,8-pentametil-kromán-6-szulfonil-csoport (Pmc) lehet. A cisztein (Cys) merkaptocsoportjának védőcsoportja például benzilcsoport (Bzl), 4-metoxi-benzil-csoport (MBzl), 4-metil-benzil-csoport (4-MeBzl), acetamido-metil csoport (Acm), tritilcsoport (Trt), 3-nitro-2piridinszulfenil-csoport (Npys), terc-butil-csoport (t-Bu) vagy (terc-butil)-tio-csoport (t-BuS) lehet, előnyösek az MBzl, 4 MeBzl, Trt, Acm és Npys csoportok. A tirozin (Tyr) hidroxilcsoportjának védőcsoportja például Bzl,

2.6- diklór-benzil (Bl₂Bzl) vagy t-Bu lehet, a hidroxilcsoport védetlen is lehet. A lizin (Lys) ε-aminocsoportjának védőcsoportja például benzil-oxil-karbonil-csoport (Z), 2-klór-benzil-oxi-karbonil-csoport (C1Z), Boc vagy Npys lehet. Abban az esetben, ha a 7-es helyzetben lévő X-et képező D- vagy L-lizin oldalláncban lévő εaminocsoportjának hidrogénatomja szabad, a fenti aminocsoportot a fent említett Z, C1Z, Boc vagy Npys védőcsoportokkal védhetjük. Előnyösen a fenti védőcsoportok közül ey olyat választunk, amely a szintézis körülményei között ismert módon megfelel.

A védett aminosavak kapcsolását ismert kondenzációs eljárásokkal végezhetjük, például diciklohexil-karbodiimides (DCC) eljárással, diizopropil-karbodiimides (DIPCDI) eljárással [Tartar A. és munkatársai, J. Org. Chem. 44., 5000. (1979)], aktívészter-eljárassal, vegyes vagy szimmetrikus savanhidrid-eljárással, karbonil-diimidazol eljárással, DCC-HOBt (1-hidroxi-benzotriazol) eljárással [König W. és munkatársai, Chem. Bér., 103; 788., 2024., 2034. (1970)] vagy difenil-foszforil-azidos eljárással, előnyösen a DCC eljárást, DCC-HOBt eljárást, DIPCDI-HOBt eljárást vagy a szimmetrikus savanhidrides eljárást alkalmazzuk. A kondenzációs reakciót szerves oldószerben, például diklór-metánban, dimetilformamidban, N-metil-pirrolidonban (NMP) vagy ezen oldószerek elegyeiben végezhetjük. Az a-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítására megfelelő reagenst, például triflour-ecetsav/diklór-metánt, HCl/dioxánt, piperidin/dimetil-formamidot (DMF) vagy NMP-t alkalmazunk. A kondenzációs reakció lejátszódásának mértékét a szintézis minden egyes lépésében Kaiser és munkatársai eljárása szerint ninhidrides reakcióval ellenőrizzük [Anal. Biochem. 34., 595. (1970)].

A fent ismertetett eljárásokkal kívánt aminosavszekvenciát tartalmazó védett peptidgyantát kapunk. Ha oldhatatlan gyantaként egy amino-metil-gyantát alkalmazunk, a védett polipeptidet a gyantáról például úgy távolíthatjuk el, hogy a védett peptidgyantát ammóniával kezeljük megfelelő oldószerben. A kapott védett peptidet ezután hidrogén-fluoriddal kezelve kapjuk az (I) általános képletnek megfelelő polipeptid-amidot, amelyből az összes védőcsoportot eltávolítottuk. Ha benzhidril-amingyantát, metil-benzhidril-amin-gyantát, amino-metil-fenoxi-metil-gyantát vagy DMBHA gyantát [Funakoshi S. és munkatársai, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 382. (1988)] alkalmazunk oldhatatlan gyantaként, a gyantáról a polipeptidet, és a polipeptidről a védőcsoportokat egyidejűleg távolíthatjuk el oly módon, hogy a védett peptidgyantát hidrogén-fluoriddal, trifluor-metán-szulfonsavval (TFMSA) [Yajima H. és munkatársai, „The Peptides”, 5. kötet, 65. oldal: Academic Press, szerk. E. Gross, (1983)], trimetil-szilil-trifláttal (TMSOTf) [Fujii N. és munkatársai, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 274 (1987)] vagy trimetil-szilil-bromiddal (TMSBr) [Fujii N. és munkatársai, Chem. Pharm. Bull. 35., 3880. (1987)] vagy hasonlóval kezeljük.

Egy előnyös kiviteli alakban a kapott polipeptidet 2-merkapto-etanollal, ditio-treittel (DTT) vagy hasonlóval redukáljuk, ezzel biztosítjuk a ciszteinekben a merkaptocsoportok redukált formáját. Ezután a merkaptocsoportokat oxidálva kapjuk a ciklusos polipeptidet.

Az oxidációs kezelést ismert eljárással végezhetjük. Oxidálószerként rendszerint levegőt vagy egy [ferri-cíanid]-ot (például kálium-[ferri-cianid]-ot) alkalmazunk.

A találmány szerinti polipeptideket rekombináns DNS-eljárásokkal is előállíthatjuk. Ennek megfelelően a találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát klónozzuk, és ismert eljárásokkal expresszáljuk [lásd például Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1991)].

A találmány szerinti polipeptideket a polipeptidek kémiájában szokásosan alkalmazott eljárásokkal izolálhatjuk és tisztíthatjuk, például extrakcióval, átkristályosítással, különféle kromatográfiás eljárásokkal (gélszűréses, ioncserélős, megoszlásos, adszorpciós, fordítottbázisú), elektroforézissel, ellenáramú megoszlással stb., leghatékonyabb a fordított fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia.

Polipeptidek alkalmazása

A találmány szerinti (I) általános képletű polipeptidek endotoxinokhoz képesek kötődni, antibakteriális aktivitással rendelkeznek, és endotoxinérzékeny hemocitákat hemolizáló aktivitást mutatnak. Ezenkívül a találmány szerinti polipeptidek antivirális aktivitást is mutatnak. Egy specifikus kiviteli alakban a találmány szerinti polipeptidek anti-HIV-aktivitással rendelkeznek.

Amint azt e leírás alábbi részében ismertetjük, a találmány szerinti polipeptidek jelentősen nagyobb anti-HIV-aktivitást mutatnak, mint az ismert, nagy endotoxin affinitást mutató polipeptidek (például tachiplezin I, II vagy III, vagy polifemuzin I vagy II).

HU 217 442 Β

A transzportáló rendszerek fejlesztésének legújabb eredményei lehetővé teszik azt, hogy a DNS-t a célsejtekbe hatékonyan bejuttassuk, ezáltal a genetikus betegségek, a rák, az AIDS stb. humán génterápiája gyakorlatilag lehetővé vált [Morgan és Anderson, Annu. 5 Rév. Biochem. 62., 191-217. (1993)].

A DNS-transzfektáló rendszerekben polikationokat, kalciumfoszfátot, liposzómafiiziót, retrovírusokat, mikroinjekciót, elektroporálást és protplaszt fúziót alkalmaznak. Azonban a fenti módszerek mindegyikénél adódik 10 egy vagy több probléma, vagy a sejttoxicitással, vagy a gyenge reprodukálhatósággal, vagy a módszer kényelmetlenségével, vagy a DNS-transzportjának nem hatékony voltával kapcsolatban [Flegner és munkatársai,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84.. 7413-7417. (1987)]. 15

Újabban ismertettek egy nagyon hatékony DNStranszfektáló eljárást, amelyben kationos lipid-DNSkomplexet vagy ciklikus amfipatikus peptid-DNSkomplexet alkalmaznak [Legendre és Szoka, Jr. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 90.. 893-897. (1993)]. A DNS- 20 sel transzfektáló komplexet képező peptidek közé tartozik például a gramicidin S, a tirocidin, a polimixin B, a polilizin és a melittin, amelyek mindegyike kationos természetű. Ezek közül a leghatékonyabb kationos peptid a gramicidin S, amely β-lap konformációval rendelkező 25 amfipatikus, gyűrűs dekapeptid antibiotikum, amely a sejtmembránokat permeábilissá tudja tenni, és roncsolja.

A gramicidin S-nek mind pozitív töltése, mind amfipatikus jellege fontos a nagymértékű transzfekció szempontjából. A találmány szerinti polipeptidek szerkezeti 30 jellemzőikből adódóan gramicin S helyett alkalmazhatók DNS-komplexek képzésére, amelyek nagy transzfektáló képességgel fognak rendelkezni, mivel ezek a peptidek is erősen kationosak és amfipatikus jellegűek, β-lap konformációval. 35

A találmány szerinti peptidek egyik szülő molekulája, a tachiplezin I ténylegesen képes permeábilissá tenni a membránokat, és DNS-hez kötődni a gramicidin S-hez hasonlóan [Matsuzaki és munkatársai, Biochim. Biophys.

Acta 1070., 259-264. (1991) és Yonezawa és munkatársai, 40 Biochemistry 37., 2998-3004. (1992)]. Ezenkívül a peptidek egyikének, a Τ-22-nek oldatszerkezete nagyon hasonló a tachiplezin I-éhez, amely amfipatikus antiparallel β-lapszerkezetű [Tamamura és munkatársai, Biochim, Biophys. Acta, 7763., 209-216. (1993)]. 45

Ezért a találmány szerinti polipeptidek DNS-transzfektáló rendszerek komponenseként alkalmazhatók a génterápiában.

2 3 4 5 6 7

Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys képletű polipeptid szintézisét. (A (2)-(13), (22) és (23) képletű polipeptideket, és a (14)-(21), (24) és (25) képletű prekurzor peptideket (lásd 1. táblázat) hasonló eljá- 55 rás alkalmazásával állítottuk elő.

A fenti (1) képletben Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, DLys és Pro jelentése a fent megadott aminosavmaradék, és az összefüggő vonal a 3-as és 11-es helyzetű ciszteinmaradékok között diszulfidkötést jelent.

A találmány szerinti polipeptidek ezért gyógyászati készítményekben alkalmazhatók, amelyek a találmány szerinti polipeptidet vagy annak sóját, és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaznak, amely hordozóanyagot az adagolási módszertől és az adagolási formától függően választjuk meg. Gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagként például fiziológiásán kompatibilis puffereket, így például Hank-féle vagy Ringer-oldatot, fiziológiás sóoldatot, só és glükóz elegyét, heparinezett nátrium-citrát/citromsav/dextróz-oldatot alkalmazhatunk. A gyógyászati készítményt orálisan vagy parenterálisan adagolhatjuk a kezelés céljától függően, és a készítmény formája például por, granula, injekciós vagy orális adagolásra alkalmas oldat, tabletta, kúp, pesszárium, kenőcs, krém vagy aeroszol lehet.

Ha a gyógyászati készítményt közvetlenül injekció formájában adjuk a betegnek a találmány szerinti polipeptidet vagy annak sóját intravénás csepegtetéssel, fiziológiás sóoldattal készült oldat formájában folyamatosan vagy megszakításokkal adagolhatjuk 10-5000 mg/testtömeg kg/nap dózisban.

Példák

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.

A leírás példáiban az (1) polipeptid szintézisét ismertetjük. Ezenkívül ismertetjük a találmány szerinti polipeptidek anti-HIV-aktivitásának vizsgálatával kapott eredményeket, valamint a nagy endotoxin affinitással rendelkező ismert polipeptidekre vonatkozó eredményeket. A találmány szerinti polipeptidek jelentősen nagyobb anti-HIV-akti vitással rendelkeznek, mint a nagy endotoxin affinitású ismert polipeptidek.

A példákban az alábbi berendezéseket és reagenseket alkalmaztuk:

HPLC-készülék: Shimadzu Corporation, Model LC6AD

A készülékhez használt oszlop: Asahipak ODP-90 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) Fmoc-aminosav és amino-gyanta: gyártja a Watanable

Chemical Industries, Ltd.

Kondenzálószer: gyártja a Peptide Institute, Inc. és az

Applied Biosystems Japan

FAB-MS (FAB-tömegspektrográf): VC Co. (USA),

Model ZAB-SE.

7. példa

Az alábbiakban ismertetjük az

9 10 11 12 13

-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂ (1)

I (1) Fmoc-DMBHA - CH₂CH₂COOH [{3-[a-(Fmocamino)-4-metoxi-benzil]-4-metoxi-fenil}-propionsavj bevitele egy amino-metil-gyantába 270 mg (0,2 mmol, 0,74 mekv/g) amíno-metilgyantát és 268,5 mg (0,5 mmol, 2,5 ekv) FmocDMBHA-CH₂CH₂COOH-t (moltömeg 537) szilárd fázisú szintetizáló oszlopra viszünk fel, és 2 óra alatt lejátszatjuk a kondenzációs reakciót DIPCDI-HOBt

HU 217 442 Β módszerrel dimetil-formamidban Guo L. és munkatársai [Chem. Pharm. Bull. 36., 4989. (1988)] módszere szerint. A kondenzációs reakció befejeződése után ecetsavanhidridet (DMBHA gyanta) alkalmazásával lejátszhatjuk a kapcsolási reakciót a szabad aminocsoportok védésére.

(2) Arginin bevezetése a DMBHA gyanta 12-es helyzetébe

A fenti lépés szerint előállított DMBHA gyantáról 20% piperidin/DMF alkalmazásával eltávolítjuk az Fmoc-csoportokat, majd hozzáadunk a DMBHA gyantára vonatkoztatva 2,5 ekvivalens Fmoc-Arg(Pmc)-OH-t, és a kondenzációs reakciót DIPCDI-HOBt módszer alkalmazásával DMF-ben lejátszatjuk.

A kondenzációs reakció lejátszódását ninhidrin vizsgálattal ellenőrizzük [Kaiser E. és munkatársai, Anal. Biochem. 34., 595.(1970)].

(3) Cisztein bevitele ll-es helyzetbe

A fenti lépés szerint előállított DMBHA gyantáról 20% piperidin/DMF-dal eltávolítjuk a Fmoc-csoportokat, majd hozzáadunk 2,5 ekvivalens Fmoc-Cys (Trt)-OH-t, és a kondenzációs reakciót DIPCDI-HOBt módszerrel DMF-ban lejátszatjuk. A kondenzációs reakció lefolyását a fentiekhez hasonlóan ninhidrin teszttel ellenőrizzük.

(4) 10-es - 1-es helyzetű aminosavak bevezetése

A fentiekhez hasonló módon, egymást követő lépé10 sekben Lys(Boc), Arg(Pmc), Tyr(tBu), Pro, DLys(Boc), Lys(Boc), Arg(Pmc), Tyr(tBu), Cys(Trt), Trp, Arg(Pmc) és Arg(Pmc) amimonsavakat viszünk be egymás után a DMBHA gyantára, így kapjuk a védőcsoportokkal védett (1) peptidgyantát.

Az egyes aminosavak kondenzálását szilárd fázisú szintézissel a 2. táblázatban közölt műveleti körülmények között hajtjuk végre.

2. táblázat

Művelet	Reagens	Oldószer	Idő χ ismétlések száma
Fmoc-csoport eltávolítása	20% piperidin/DMF	DMF	5 perc χ 3
Mosás	-	DMF	1 perc χ 6
Kondenzációs reakció	Fmoc-aminosav (2,5 ekv.)+DIPCDI+HOBt	DMF	2 óra χ 1
Mosás	-	DMF	1 perc χ 4

(5) (1) polipeptid előállítása a védőcsoportok eltávolításával, a polipeptid lehasitásával a gyantáról és részleges tisztítással

A védőcsoporttal védett (1) polipeptidgyantát 20% piperidin/DMF-dal kezelve eltávolítjuk az Fmoc-csoportot, majd 25 °C-on 2 órán keresztül 1 mol/1 koncentrációjú TMSOTf/tioanizo/TFA (trifluor-ecetsav) rendszerrel (10 ml trifluor-ecetsav, 100 ekvivalens m-krezol és 300 ekvivalens etán-ditiol jelenlétében) reagáltatjuk 100 mg gyantára számítva. A gyantát a reakcióelegyből szűréssel elválasztjuk, és kétszer mossuk 1 ml trifluor-ecetsawal. Ezután a szűrlet és a mosófolyadékok elegyéhez 100 ml jéghideg, vízmentes dietil-étert adunk. A kapott csapadékot centrifáljuk, a maradékot a felülúszótól dekantálással elválasztjuk. A kapott maradékot hideg dietil-éterrel mossuk, 10 ml 4 n ecetsavban oldjuk, és hozzáadunk 830 mg (80 ekvivalens) ditio/treitet. Az elegyet szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül keveijük.

A reakcióelegyet centrifugáljuk, a felülúszót Sephadex G-10-zel kezeljük (3,7 χ 5 cm), 4 n ecetsavval (AcOH) gélszűrjük, és a Sephadexen átfolyt frakciót fő eluátumként összegyűjtjük és liofilizáljuk. A kapott por a részlegesen tisztított, nem ciklizált (1) képletű polipeptid. 50 (6) (1) polipeptid előállítása levegővel végzett oxidálással

A Sephadexen végzett gélszűréssel kapott átfolyó frakció felét pH 7,5-re állítjuk vizes ammóniaoldattal, és levegőztetéssel levegővel oxidáljuk, ily módon lejátszat- 55 juk a ciklizálási reakciót. A levegővel való oxidálás befejezése után az (1) képletű ciklizált polipeptidet 10 g Diaion HP-20 gyantára adszorbeáljuk, majd 60% 30 CH3CN/I n AcOH eleggyel eluáljuk. Az eluátumot szobahőmérsékleten, vákuumban koncentrálva eltávolítjuk a CH₃CN-t, majd liofilizálva port kapunk. A port kevés vízben oldjuk, az oldatot Asahipak ODP-90 oszlopra öntjük, és nagynyomású folyadékkromatográfiás 35 módszerrel tisztítjuk (HPLC-Model LC-6AD, gyártja a Shimadzu Corp.), gradiens eluciót alkalmazunk CH₃CN-lel. Egyetlen csúcsban (1) polipeptidet kapunk, a hozam 27% [ezt az értéket a védőcsoporttal védett (1) polipeptidgyanta alapján számítottuk ki], (7) Polipeptid analízise

A fenti lépés szerint előállított tisztított polipeptidet savas hidrolízisnek vetjük alá Liu és munkatársai módszere szerint [J. Bioi. Chem., 251., 1936. (1976)], majd leucin-amino-peptidázzal emésztjük, és ezután megha45 tározzuk az aminosav-összetételt. Azt találtuk, hogy az jó egyezést mutat az (1) képletű aminosavszekvencia alapján számított összetétellel.

Az FAB-MS szerint kapott móltömegérték 1996,3, míg a számított érték [M + H]+ alapján 1996,1.

A kapott polipeptid fajlagos forgatóképessége [α]^2θο=-17,2° (c=0,ll, 1 n ecetsav).

2. példa (14) polipeptid szintézise [(1) polipeptid aminoterminális aminosavmaradékának N-a-acetilezése] Ebben a példában az

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Ac-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂ (14) I_I képletű polipeptid szintézisét ismertetjük.

HU 217 442 Β

A fenti képletben Ac-Arg, Arg, Trp, Cys,Tyr, Lys, Dlys és Pro jelentése a fenti megadott aminosavmaradék, és az összefüggő vonal a 3-as helyzetű és a 11 -es helyzetű Cys-maradékok között diszulfid kötést jelent. (1) Részlegesen védőcsoporttal védett (1) polipeptidgyanta acetilezése

1,301 g (0,25 mmol) védőcsoporttal védett (1) polipeptidgyantát - amelyet a fenti 1. példa (4) lépésében állítottunk elő - egy manuális, szilárd fázisú szintetizátor reakcióedényébe viszünk. Az Fmoc-csoport eltávolítása után az N-terminális aminocsoportot Hudson-módszerrel acetilezzük [J. Org. Chem., 53., 617. (1988)].

1,241 g N-terminális α-aminosavon acetilezett, védőcsoporttal védett (1) polipeptidgyantát kapunk (a száraztömeg hozama 100%). Az eljárást az alábbi, 3. táblázatban összegezzük.

3. táblázat

Művelet	Reagens	Oldószer (térfogat)	Idő χ ismétlések száma
1 Mosás		15 ml DMF 15 ml izopropanol 15 ml diklór-metán 15 ml DMF	mindegyik 2 perc χ 3
2 Acetilezési reakció	i) 0,057 ml (1,0 mmol) AcOH + 153 mg (1,0 mmol) HOBt ii) 442,3 mg (1,0 mmol) BOP	6 ml DMF	3 perc χ 1
	reagens*¹ iii) 0,35 ml (2 mmol) diizopropiletil-amin	2 ml DMF	3 perc χ 1 60 perc χ 1
3 Mosás		15 ml DMF 15 ml izopropanol 15 ml diklór-metán 15 ml DMF	mindegyik 2 perc x 3

* BOPreagens: (Benzotriazol-l-il-oxi)-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexaf]uor-foszfát

Az acetilezési reakciót addig végeztük a fenti 1 -3 műveletek megismétélésével, amíg a ninhidrinreakció többé már nem volt pozitív.

(2) (14) polipeptid előállítása a védőcsoportok és a gyanta eltávolításával az N-terminális aminosavján acetilezett, védőcsoporttal védett (1) polipeptidgyantáról, részleges tisztítás és oxidálás A (14) polipeptidet az 1. példa 5. és 6. lépésében leírtak szerint eljárva állítjuk elő. A (14) polipeptid fajlagos forgatóképessége [a]^2OD=-18,3° (c=0,08, 1 n ecetsav).

A (14) polipeptidet 0,2% triptamint tartalmazó 4 mol/1 koncentrációjú metánszulfonsawal savasan hidrolizáljuk 115 °C-on, 4 órán keresztül, Liu és munkatársai módszere szerint [J. Bioi. Chem., 251., 1936. (1976)]. Az aminosavanalízis eredménye jól egyezett a számított ér35 tékekkel.

3. példa (19) polipeptid szintézise [N-a-fluoreszcein-tiokarbamoil-(í) polipeptid]

Az

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

FTC-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂ (19) i_i képletű polipeptidet az (1) polipeptid aminoterminális aminosavmaradékának N-a-fluoreszcein-tiokarbamoilezésével állítottuk elő.

A fenti (19) képletben FTC-Arg, Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, DLys és Pro fent definiált aminosavmaradékot jelent, és az összefüggő vonal 3-as és 11-es helyzetű ciszteinmaradékot között diszulfid kötést jelent.

mg (3,9 μ mól) (1) polipeptid ecetsavas sót - amelyet az 1. példa 6. lépésében leírtak szerint állítottunk elő - Imi PBS pufferben oldunk (foszfáttal pufferolt sóoldat, pH 7,5). Az oldathoz 2,8 mg (7,2 pmol) fluoreszcein-izotiocianátot (FITC) I-izomert (Wako Pure Chemical Ind., Ltd.) adunk 1 ml DMSO-ban oldva, jeges hűtés közben. Az elegyet szobahőmérsékleten keverjük, 6-7 óra alatt a szabad aminocsoport fluoreszcein-tiokarbamoileződése végbemegy.

A reakcióelegyet 50 mmol/1 foszfát pufferrel (PB, pH=4,2) ekvilibrált Sephadex G-25 (finom) oszlopra visszük, előzetesen sómentesítjük, és frakcionáljuk. A peptid frakciót egy Sep-Pak C 18 plusz ENV cartridge oszlopon (Millipore Co.) adszorbeáljuk, és 80% acetonitril/vizes ecetsav oldattal (pH=4,2) eluáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. 3,93 mg (19) polipeptidet kapunk ecetsavas só formában, a hozam 35%. A (19) polipeptid ecetsavas sójának fajlagos forgatóképessége [a]²⁰D=-5,9° (c=0,06, H₂O).

A fenti vegyület Liu módszere szerint kapott savas hidrolizátumának aminosavanalízisével eggyel kisebb értéket kaptunk argininmaradékra, mint az (1) polipeptidre számított érték.

A fenti vegyület trifluor-ecetsavval, szobahőmérsékleten 2 órán keresztül végzett részleges hidrolízisé10

HU 217 442 Β vei kapott hidrolizátumának vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatában (n-butanol/ecetsav/víz=4:1:1) egy fő foltot mutattunk ki, amely az FTH-Arg-nak (fluoreszcein-arginin-tiohidantoin) felel meg.

A fenti analíziseredmények azt jelzik, hogy az Nterminális argininmaradék α-aminocsoportja szelektíven fluoreszcein-tiokarbamoileződött.

4. példa

Antivirális aktivitás humán immunhiány vírus (HÍV) ellen

Az 1. példa szerint előállított (1) polipeptid antivirális aktivitását HÍV ellen az alábbi módszer szerint vizsgáltuk és értékeltük ki.

HIV-vel fertőzött MT-4 sejteket [2,5 x 10⁴sejt/rezervoár, fertőzési faktor (MOI): 0,001] különböző koncentrációkban alkalmazott vizsgálandó anyaggal együtt mértük be egy 96-rezervoáros mikrotitráló lemezre.

A lemezt 37 °C-on 5 napon keresztül szén-dioxidos inkubátorban inkubáltuk, majd a túlélő sejtek számát MTT módszerrel [Pauwels és munkatársai, J. Virol. Methods 20., 309—321. (1988)] határoztuk meg. Az antivirális aktivitást azzal a koncentrációval fejeztük ki, amely a HIV-fertőzés általi sejtpusztulás 50%-os gátlásához szükséges (EC₅₀: 50%-os hatásos koncentráció). Másrészről a vizsgálandó anyagok MT-4 sejtekre kifejtett citotoxicitásának vizsgálatára a vírussal nem fertőzött sejteket inkubáltuk a fentiekhez hasonló módon a vizsgálandó vegyületek különböző koncentrációinak jelenlétében. A vizsgálandó anyag által okozott citotoxicitást az 50%-os citotoxikus koncentrációval (CC₅₀) fejeztük ki. Ezenkívül a szelektivitási indexet (Sí) is kiszámol15 tűk, amely a CC₅₀ és az EC₅₀ arányát jelenti.

Az (1) polipeptid aktivitását az alábbi aminosavszekvenciájú T-22 jelű pepiid antivirális aktivitásával hasonlítottuk össze:

Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂ (T-22).

A 4. táblázatban ismertetjük az EC₅₀, CC₅₀ és Sí értékeket az (1) képletű polipeptidre és a fenti (8) képletű T-22 peptidre, valamint az anti-HIV hatású összehasonlító anyagként alkalmazott azidotimidinre (AZT).

4. táblázat

Vizsgált vegyület	CC₅₀ (pg/ml)	ec₅₀ (pg/tnl)	Sí
(1) polipeptid	49,8	0,0034	14647
T-22	54,1	0,0099	5 465
AZT pmol/l	6,68	0,0001	66800

A fenti táblázat adataiból kitűnik, hogy a találmány szerinti (1) polipeptid a Τ-22-vel - amelynek anti-HIVaktivitását korábban már kimutattuk - azonos citotoxicitást mutat, de antivirális aktivitása a T-22 koncentrá25 ciójának '/₃-ában megnyilvánul. Ha figyelembe vesszük is, hogy a találmány szerinti peptidben 4 aminosavmaradékkal kevesebb van, és így móltömege kisebb, a találmány szerinti polipeptid még így is nagyobb aktivitást mutat.

Az azidotimidinnel (AZT) összehasonlítva az (1) polipeptid EC₅₀-értéke valamivel nagyobb, de csak rendkívül kis citotoxicitást mutat. Ezért várhatólag biztonságosabban alkalmazható anti-HIV-szerként.

5. példa

Polipeptidek jellemzői és anti-HIV-aktivitásuk Az 5. táblázat mutatja az 1., 2. és 3. példa szerint előállított találmány szerinti polipeptidek szerkezeti képletét és jellemzőit. Az 5. táblázatban ismertetjük a 4.

példa szerint vizsgált és kiértékelt polipeptidek antiHlV-aktivitását is.

5. táblázat

HU 217 442 Β

Hacsak azt másképp nem említettük, a fenti táblázatokban szereplő vegyületekben a 3-as és 11-es helyzetben lévő ciszteinmaradékok diszulfidkötéssel vannak összekapcsolva. Ezenkívül a fenti táblázatban AZT azido-timidint jelent (ismert neve zidovudin), és T-22 jelenti a (8) képletű polipeptidet.

A találmány szerinti új polipeptidek antivirális aktivitást mutatnak humán immunhiány vírus (HÍV) ellen, valamint hidrofil jellegűek, lipidekkel szemben aktivitást mutatnak, és anti-HIV-aktivitásuk nagyobb, mint az ismert vegyületeké.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Ai-Trp-Cys-Tyr-A₃-A₃-X-Tyr-A₃-A₃-Cys-A₃-NH₂ (I) (I) általános képletű polipeptidek és sóik, a képletben A, jelentése lizin, arginin és omitin közül választott kettő bázikus aminosavat tartalmazó peptidmaradék, amelynek terminális aminosavmaradékában az N-ahidrogénatom 2-16 szénatomos alkanoilcsoporttal vagy fluoreszcein-tiokarbamoil-csoporttal lehet helyettesítve;

A₃ jelentése lizin- vagy argininmaradék;

X jelentése D-omitil-prolin, D-lizil-prolin, prolil-Dlizin, és lizil-glicin közül választott peptidmaradék, amelyekben a D-lizin, L-lizin és D-omitin ω-aminocsoportjának hidrogénatomja egy a>-amino-2-6 szénatomos alkanoilcsoporttal lehet helyettesítve, és maga a peptidmaradék peptidkötéssel kapcsolódik a 6-os és a 8-as helyzetben lévő aminosavmaradékokhoz;

Trp jelentése triptofánmaradék;

Tyr jelentése tirozinmaradék és

Cys jelentése ciszteinmaradék, és a 3-as és 11-es helyzetben lévő ciszteinmaradékok adott esetben diszulfidkötéssel vannak összekapcsolva.

2. Gyógyászati készítmények HIV-aktivitás gátlására, amelyek egy 1. igénypont szerint polipeptid vagy annak sója hatásos mennyiségét és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaznak.

HU 217 442 Β Int.Cl.⁷·. C 07 K 7/08 cd £

ΓΜ ΓΜ ΓΜ (Μ X X X X χ z ζ ζ ζ ζ Dl 0» Dl Dl a o U U Μ Μ Ει rH < < < < m 01 0) 01 01 Ό >1 >1 >1 >1 >1 — iH υ U U Ο Cl 1 0) 1 01 01 I 01 1 01 in El ÍN ►» >1 >4 «Η t kJ 1 kJ 1 X 1 X I 0) 0) Οι Dl a rt· M Μ Μ Μ r-1 < < < < < l < ι ι El Η Ε Η Η ω >i >, >, >1 >1 i—1 Η Η Η Η 01 01 01 Μ 01 <N >1 >1 >1* rd u υ Ο υ υ 1 Φ 1 α) 1 0) 1 φ 1 φ r-1 r~f Η rH X X »—1 H 1 Η 1 Η | X X >1 >, >1 >4 >1 o iH Η Η γΗ ι-4 rH Ü ο ο ο Ο 1 0) 1 0) 1 0) 1 Ö 1 01 σ> El Η Ει Μ >1 < 1 1 < 1 < I X 1 Η Μ Ε Μ 00 >1 >1 >1 >1 Η Η Ε-* Ε-< 0) 01 01 όι 01 c> ΪΗ Sri >1 >1 ><» o U Ο U U H Η Η Η •Η ΙΟ (0 (0 <0 (0 (0 > > > > > 0) 0) D> Dl a LD El Η Ε Ει Η < < < < < Φ φ Φ Φ φ Λ X X X χ X X X X χ ω ω ω 01 W . ΚΊ Ο »<Ί ο ΡΊ ο ο υ Οι 0. a a a CJ El Η Μ η El Ε-* Ε-< Η Ε* ε· ω 1 Οι 1 ω σι 1 σ> >1 Η >1 Ε Ρ I—i X X < < a a Μ Ρ < < Η Η Η Η Μ Η Η Μ Η Ε Ε Ε Ε Ε •Η •Η •Η •Η ♦Η Ν Ν Ν Ν ω ω <D 3 3 r-· r—1 r-^> ε ε ρχ & & <D ω •Η •Η Ή «Χ <4-1 X X X •Η •Η Ü ο Ü rH r-í ti ti σ! Ο Ο Α Η ε-· a a

HU 217 442 Β Int. Cl.⁷: C 07 K 7/08

2. ábra

II

DMBHA-gyanta

I u

Védett aminosavak kondenzálása a peptid— -szekvenciának megfelelő sorrendben

II (2) Fmoc-Arg(Pmc)^lz-DMBHA-gyanta ( 3 ) Fmoc-Cys( Trt )^U-Arg( Pmc)¹²-DMBHA-gyanta (4) Gyanta, amelyhez a 10-1-es helyzetű védett aminosavakat kondenzáljuk u

Védőcsoporttal védett (1) polipeptid-DMBHA-gyanta (5) Védőcsoportok és gyanta eltávolítása és redukálás

II

Redukált formájú (1) polipeptid (6) Oxidatív ciklizálás

II

Cl) polipeptid