RU2658781C1 - Пептид, обладающий противоопухолевой активностью - Google Patents
Пептид, обладающий противоопухолевой активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2658781C1 RU2658781C1 RU2017146644A RU2017146644A RU2658781C1 RU 2658781 C1 RU2658781 C1 RU 2658781C1 RU 2017146644 A RU2017146644 A RU 2017146644A RU 2017146644 A RU2017146644 A RU 2017146644A RU 2658781 C1 RU2658781 C1 RU 2658781C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- cells
- tach1
- ile11asp
- seq
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 abstract 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010070741 Tachypleus tridentatus tachyplesin peptide Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- ZJQFYZCNRTZAIM-PMXBASNASA-N tachyplesin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(N[C@H]2CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC=CC=3)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)C(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZJQFYZCNRTZAIM-PMXBASNASA-N 0.000 description 3
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 2
- 102220571098 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 7_M37L_mutation Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 2-(3,5-diphenyl-1h-tetrazol-1-ium-2-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)N=C(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]1 NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061348 AMP family Proteins 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000239224 Tachypleus tridentatus Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000639 membranetropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 β-cyanoethyl diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к биологически активным пептидам, и может быть использовано в медицине. На основе антимикробного пептида тахиплезина из гемоцитов мечехвоста, представителя семейства бета-шпилечных АМП, получен пептид Tach1[Ile11Asp]. Изобретение позволяет расширить ассортимент пептидных соединений, обладающих противоопухолевой активностью и низкой токсичностью в отношении нормальных клеток человека. 4 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Онкологические заболевания являются одной из основных причин человеческой смертности в современном мире. Классические методы лечения рака - хирургия, химиотерапия, лучевая и гормональная терапия - не приводят к ремиссии в более чем половине случаев. Кроме того, серьезную угрозу для тех, кто успешно прошел курс лечения, представляют рецидивы опухолеобразования. Существенными недостатками химиотерапевтического подхода являются развитие резистентности опухолевых клеток, а также токсичность многих антираковых препаратов для здоровых клеток. Действие традиционных препаратов-цитостатиков направлено на подавление роста быстро делящихся клеток. Однако вследствие того, что высокая скорость деления характерна не только для клеток опухолей, но и для некоторых нормальных клеток, например, клеток эпителиальных тканей и красного костного мозга, цитостатическая терапия сопровождается такими побочными эффектами, как иммуносупрессия, анемия, алопеция, воспаление слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, а также создает риск малигнизации здоровых клеток. В свете вышесказанного актуальной является проблема разработки противоопухолевых препаратов селективного действия, не вызывающих формирования резистентности со стороны клеток-мишеней.
Среди кандидатов на роль противоопухолевых средств нового поколения рассматриваются белки и пептиды системы врожденного иммунитета человека и животных [Zasloff М. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol. 415, №6870. P. 389-395]. Антимикробные пептиды (АМП) -природные соединения, обладающие широким спектром биологической активности. Для целого ряда АМП в экспериментах in vitro и in vivo показано наличие выраженного противоопухолевого действия за счет способности селективно воздействовать на цитоплазматическую мембрану и мембрану митохондрий раковых клеток, вызывая некротическую или апоптотическую гибель клетки.
Селективность действия катионных АМП определяется рядом физиологических особенностей раковых клеток. В норме внешняя поверхность мембран клеток млекопитающих образована цвиттерионными фосфолипидами - фосфатидилэланоламином, фосфатидилхолином и сфингомиелином, однако для опухолевых клеток характерен иной состав мембран. Цитоплазматическая мембрана трансформированных клеток приобретает выраженный отрицательный заряд из-за высокого содержания фосфатидилсерина, гликопротеинов и гликолипидов, обогащенных сиаловыми кислотами, а также протеогликанов, обогащенных сульфатом гепарина [Hoskin D.W., Ramamoorthy A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 1778, №2. P. 357-375.]. Потеря асимметрии в распределении липидов была продемонстрирована на примере многих типов опухолевых линий клеток, что позволяет рассматривать данное явление как ключевой маркер онкогенеза. Для многих АМП показана цитотоксическая активность в отношении различных типов опухолевых клеток, однако, при этом лишь некоторые пептиды имеют выраженное избирательное токсическое действие в отношении клеток рака, в то время как другие повреждают как опухолевые, так и нормальные клетки.
Наиболее близкими аналогами заявляемого изобретения являются ранее открытые антимикробные пептиды из гемоцитов мечехвоста, представители семейства бета-шпилечных АМП [Nakamura Т. et al. Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). Isolation and chemical structure // J. Biol. Chem. 1988. Vol.263, №32. P. 16709-16713], в частности тахиплезин-1 (SEQ ID No. 4). Пептиды этой группы обладают стабилизированной дисульфидными связями β-шпилечной структурой, что обуславливает их высокую устойчивость к гидролизу под действием протеолитических ферментов. Несмотря на выраженную мембранотропную активность, в том числе в отношении нормальных клеток млекопитающих, противоопухолевые свойства тахиплезинов связаны не только с вызываемыми ими процессами апоптоза раковых клеток. Тахиплезин способен выступать в качестве связующего звена между гиалуроновыми кислотами на поверхности клеток карциномы простаты и Clq компонентом системы комплемента. Такое взаимодействие приводит к активации классического каскада системы комплемента [Chen J. Tachyplesin activates the classic complement pathway to kill tumor cells // Cancer Res. 2005. Vol. 65, №11. P. 4614-4622]. Благодаря способности одновременно подавлять неоваскуляризацию при развитии опухоли и вызывать апоптоз раковых клеток, тахиплезин показал высокую эффективность при лечении меланомы у мышей [Hoskin D.W., Ramamoorthy A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 1778, №2. P. 357-375.]. Способность пептида подавлять пролиферацию опухолевых клеток была показана на примере гепатомы и аденокарциномы человека [Shi S.-L. et al. Effects of tachyplesin and n-sodium butyrate on proliferation and gene expression of human gastric adenocarcinoma cell line BGC-823 // World J. Gastroenterol. WJG. 2006. Vol. 12, №11. P. 1694-1698]. Недостатком природных тахиплезинов как химиотерапевтических агентов является низкая селективность противоопухолевого действия вследствие высокой токсичности в отношении нормальных клеточных линий [Kuzmin D.V. et al. Comparative in vitro study on cytotoxicity of recombinant β-hairpin peptides // Chem Biol Drug Des. 2017. DOI: 10.1111/cbdd.13081]. Так, тахиплезин-1 вызывает лизис 50% эритроцитов (НС50) и гибель 50% астроцитов (IC50) в концентрации менее 100 мкМ (см. Таблицу).
Изобретение решает задачу расширения ассортимента химических веществ, обладающих селективным противоопухолевым действием. Заявляемый пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1. Заявляемый пептид состоит из 17 аминокислотных остатков, содержит две дисульфидные связи и не имеет иных посттрансляционных модификаций. Заявляемый пептид проявляет выраженную активность в отношении опухолевых клеточных линий (IC50<30 мкМ). Заявляемый пептид характеризуется низкими показателями гемолитического эффекта (НС50>400 мкМ) и цитотоксичности в отношении нормальных клеток человека, например, астроцитов (IC50>100 мкМ). Техническим результатом изобретения является выраженная противоопухолевая активность заявляемого пептида. Биосинтез заявляемого пептида не требует осуществления ферментативных посттрансляционных модификаций, что делает предпочтительным его биотехнологическое получение в бактериальной системе. Заявляемый пептид может быть получен путем гетерологической экспрессии в клетках Escherichia coli, а также с помощью химического синтеза.
Изобретение иллюстрируют графические материалы:
Фиг. 1. Физическая карта плазмидного вектора для экспрессии пептида Tach1[Ile11Asp]: Bg1ll, XhoI - сайты рестрикции с указанием координат; pBR322 origin - участок инициации репликации плазмиды; AmpR - ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам; Т7 promoter - промотор транскрипции; Т7 terminator - терминатор транскрипции; operator - сайт связывания -репрессора; RBS -сайт связывания рибосомы; His8-TrxL-Tach1[Ile11Asp] - последовательность, кодирующая гибридный белок, содержащий целевой пептид.
Фиг. 2. Электрофоретический анализ продукта экспрессии рекомбинантного гена, кодирующего Tach1[Ile11Asp] Tach1[Ile11Asp]. 1 - стандарт М.м.; 2 - суммарный клеточный лизат, содержащий гибридный белок His8-TrxL-Tach1[Ile11Asp] (молекулярная масса гибридного белка - 15,7 кДа - отмечена стрелкой).
Фиг. 3. Хроматограмма очистки рекомбинантного пептида Tach1[Ile11Asp] (SEQ ID No. 1) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Пик, соответствующий целевому пептиду, отмечен звездочкой.
Фиг. 4. МАЛДИ масс-спектр пептида Tach1[Ile11Asp] (SEQ ID No. 1), полученного генно-инженерным способом.
Таблица. Цитотоксическое действие рекомбинантных пептидов Tach1 и Tach1 [Hell Asp].
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1.
Конструирование плазмидного вектора pET-Trx-Tach1[Ile11Asp]
Нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2, содержащую промотор транскрипции T7 РНК-полимеразы, оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид (последовательно связанные гистидиновый октамер, тиоредоксин с заменой M37L, сайт расщепления бромцианом и Tach1[Ile11Asp]), получают химико-ферментативным синтезом с помощью ПЦР. Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР, синтезируют твердофазным фосфорамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфорамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-О-(β-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом.
Фрагмент ДНК, кодирующий белок-носитель тиоредоксин (M37L), получают методом ПЦР-амплификации и направленного мутагенеза с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы плазмиду рЕТ32а(+), содержащую ген тиоредоксина. Фрагмент ДНК, кодирующий пептид Tach1[Ile11Asp], получают путем медленного отжига 3'-концов двух праймеров (прямой праймер: GCA GAT СТС ATA TGA ААТ GGT GCT ТТС GTG TGT GTT АСС GCG GTG AT; обратный праймер: GCG ААТ ТСТ ТАА CGA CAG CGA CGA TAG САА ТСА CCG CGG ТАА САС АС), кодирующих, соответственно, N- и С-концевые области пептида, с последующей достройкой до двухцепочечной структуры с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli. В ходе дизайна праймеров используют кодоны, предпочтительные для экспрессии в Е. coli. Остальные, участки последовательности pET-Trx-Tach1[Ile11Asp] получают путем последовательного отжига и элонгации взаимно перекрывающихся олигонуклеотидов, а также отжига, элонгации и амплификации промежуточных продуктов синтеза. На завершающей стадии синтеза последовательность амплифицируют с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз Bg1II и XhoI. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1% агарозном геле, полосу ДНК величиной -550 п.н. выделяют из геля с помощью колонки с силикагелем и лигируют с фрагментом ДНК размером 3,5 тыс.п.н., полученным в результате обработки плазмиды рЕТ-20b(+) рестриктазами Bg1II и XhoI. В результате лигазной реакции получают кольцевую ковалентно замкнутую ДНК размером 4054 п.н. (Фиг. 1). Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки Е. coli DH10B, приготовленные с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина.
Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом «ПЦР с клонов» с использованием праймеров на плазмидный остов и вставку. Отобранные клоны подращивают в жидкой питательной среде и выделяют плазмидную ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью рестрикционного анализа. Окончательное строение плазмид, содержащих требуемый фрагмент, подтверждают определением нуклеотидной последовательности с помощью секвенирования по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают плазмиду со вставкой, нуклеотидная последовательность которой полностью соответствует запланированной (SEQ ID No. 2).
Пример 2.
Получение рекомбинантного пептида
Проводят трансформацию компетентных клеток Е. coli BL21(DE3), приготовленных с помощью 0,1 М хлорида кальция, плазмидным вектором, сборка которого описана в примере 1. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина и 0,02 М глюкозы. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 ч.
Бактериологической петлей переносят выросшие колонии в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, растят в течение 18 ч на термостатируемой качалке со скоростью вращения 220 об⋅мин-1 при температуре 37°С. Полученную культуру засевают в жидкую питательную среду LB, содержащую 0,02 М глюкозы, 100 мкг/мл ампициллина, 1 мМ MgSO4, при этом начальная OD600 составляет 0,05. Индукцию биосинтеза гибридного белка осуществляют путем добавления изопропилтио-β-D-галактопиранозида (IPTG) к культуре клеток с оптической плотностью 1,0 до конечной концентрации 0,2 мМ. Культуру растят в течение 6 ч при температуре 32°С на термостатируемой качалке со скоростью вращения 220 об⋅мин-1. Контроль уровня экспрессии гибридного белка осуществляют методом денатурирующего SDS-электрофореза в полиакриламидном геле. Уровень экспрессии гибридного белка His8-TrxL-Tach1[Ile11Asp] при постановке эксперимента по приведенной методике составляет не менее 30%. Расчетная молекулярная масса гибридного белка (SEQ ID No. 3) составляет 15,7 кДа (Фиг. 2).
После экспрессии клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в фосфатном буфере (рН 7.8) с добавлением 6М гуанидин гидрохлорида и 20 мМ имидазола при помощи стеклянного гомогенизатора Поттера и разрушают путем ультразвуковой обработки. Лизат клеток центрифугируют при 25000 g в течение 40 мин. Все работы по получению осветленного лизата проводят при температуре 4°С. Очистку гибридного белка, содержащего в качестве аффинной метки октагистидиновую последовательность, осуществляют с помощью металлохелатной хроматографии на препаративной колонке с Ni-NTA агарозой в денатурирующих условиях. Элюцию проводят повышением концентрации имидазола в буфере до 0,5 М. Собранную после очистки с помощью металлохелатной хроматографии фракцию, содержащую гибридный белок, титруют концентрированной соляной кислотой до значения рН 1,0, после чего добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте в течение 18 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего упаривают образцы на вакуумной центрифуге до исходного объема раствора и титруют до нейтральных значений рН. Финальную стадию очистки пептида проводят методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) на колонке Reprosil-Pur C18-AQ в системе водных буферов, содержащих ацетонитрил и 0,1% ТФУ. Разделение происходит в линейном градиенте ацетонитрила от 5% до 80% за 60 мин. Выход полипептидов детектируют по изменению оптического поглощения при длине волны 214 нм (Фиг. 3). Концентрацию водного раствора очищенного пептида Tach1[Ile11Asp] определяют методом спектрофотометрии по поглощению при 280 нм и расчета на основе коэффициентов экстинкции.
Пример 3.
Определение молекулярной массы пептида
Соответствие относительной молекулярной массы полученного рекомбинантного пептида расчетному значению, а также его химическую чистоту оценивают с помощью масс-спектрометрического анализа на приборе Reflex III (Bruker Daltonics), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 336 нм, с регистрацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 20% ацетонитрил и 0,1% трифторуксусную кислоту. Пик с m/z 2266,3 (Фиг. 4) соответствует молекулярному иону пептида Tach1[Ile11Asp] (SEQ ID No. 1) (расчетная средняя молекулярная масса 2266,7), что свидетельствует об образовании двух дисульфидных связей. По аналогичной схеме анализируют пептид Tach1.
Пример 4.
Тестирование гемолитической активности пептида
Для тестирования гемолитической активности пептида используют свежевыделенные человеческие эритроциты. Для предотвращения свертывания к цельной крови добавляют цитратный буфер. Кровь центрифугируют в растворе фиколла и урографина плотностью 1,077 г/мл в течение 15 мин при 1500 об⋅мин-1. Фракцию эритроцитов отбирают со дна и трижды промывают двадцатью объемами изотонического натрий-фосфатного буфера (рН 7,4), последовательно осаждая эритроциты путем центрифугирования при 2000 об⋅мин-1 в течение 10 мин. После отмывки готовят 8% суспензию эритроцитов в изотоническом натрий-фосфатном буфере.
Для теста в 96-луночном планшете готовят серии двойных разведений исследуемого пептида от 400 до 6,25 мкМ (в пересчете на конечную концентрацию) объемом 50 мкл. После этого к раствору пептида добавляют по 50 мкл 8% суспензии эритроцитов. Планшет инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С и перемешивании 1000 об⋅мин-1. После инкубации планшеты центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об⋅мин-1 для осаждения интактных эритроцитов. Далее аликвоты супернатанта переносят в другой планшет для измерения количества свободного гемоглобина. Определение количества гемоглобина в растворе осуществляют по поглощению раствора при 405 нм. В качестве отрицательного контроля (K-) используют супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в растворе натрий-фосфатного буфера без добавления пептидов. В качестве положительного контроля (K+) используют супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в 0,1% водном растворе неионогенного детергента Triton X-100, вызывающего их полный лизис. Эксперименты проводят дважды с кровью одного и того же человека в трехкратной повторности. Процент гемолиза рассчитывают по формуле:
Полученные данные о гемолитической активности представлены в Таблице. В отличие от пептида дикого типа Tach1 (SEQ ID No. 4), пептид Tach1[Ile11Asp] (SEQ ID No. 1) не обладает выраженной гемолитической активностью при концентрациях до 400 мкМ, используемых при тестировании.
Пример 5.
Тестирование цитотоксического действия пептида
Тестирование цитотоксического действия пептида в отношении астроцитов и опухолевых клеточных линий проводят с помощью МТТ-теста. Методика основана на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий бромид (МТТ-реагент) до нерастворимого в воде фиолетового кристаллического формазана. Клеточные линии (нормальные астроциты человека (NHA), эпидермоидная карцинома кожи человека (А431), трансформированные клетки эмбриональной почки человека (НЕК293Т)) высаживают в 96-луночные планшеты (по 10000 клеток в каждую лунку) и растят в среде DMEM/F-12 в течение 24 ч при 37°С в СО2-инкубаторе (5% СО2 в воздухе). Далее культуральную жидкость заменяют свежей средой, в которой предварительно растворяют тестируемый пептид. После инкубации в течение 48 ч в приведенных выше условиях в каждую лунку добавляют по 20 мкл раствора МТТ в забуференном физиологическом растворе (5 г/л), после чего продолжают инкубацию в течение 4 ч. Аккуратно удаляют среду, добавляют в лунки по 100 мкл смеси диметилсульфоксида и этилового спирта (1:1) для растворения кристаллов формазана и измеряют оптическую плотность растворов при 570 нм с помощью планшетного спектрофотометра. Долю живых клеток определяют по формуле:
где «K-» - фоновое поглощение лунки с растворителем. Эксперименты проводят дважды в трехкратной повторности. С помощью математической модели нелинейной регрессии строят графики сглаживающих кривых для экспериментальных значений выживаемости клеток. С использованием уравнений полученных кривых и программного обеспечения GraphPad PRISM 6.0 рассчитывают значения IC50. Полученные данные о цитотоксической активности представлены в Таблице. Пептид Tach1[Ile11Asp] (SEQ ID No. 1) обладает выраженной селективностью в отношении опухолевых клеточных линий по сравнению с пептидом Tach1 (SEQ ID No. 4).
Перечень аминокислотных и нуклеотидных последовательностей
SEQ ID No. 1
SEQ ID No. 2
SEQ ID No. 3
SEQ ID No. 4
* - данные НС50 и IC50 приведены как средние значения с учетом стандартного отклонения
Claims (1)
- Пептид, обладающий противоопухолевой активностью, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017146644A RU2658781C1 (ru) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | Пептид, обладающий противоопухолевой активностью |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017146644A RU2658781C1 (ru) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | Пептид, обладающий противоопухолевой активностью |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2658781C1 true RU2658781C1 (ru) | 2018-06-22 |
Family
ID=62713430
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017146644A RU2658781C1 (ru) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | Пептид, обладающий противоопухолевой активностью |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2658781C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2702661C1 (ru) * | 2019-05-24 | 2019-10-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Пептид, проявляющий антибактериальные и противоопухолевые свойства |
RU2771492C1 (ru) * | 2021-04-15 | 2022-05-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Пептид, обладающий противоопухолевой активностью |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995010534A1 (en) * | 1993-10-14 | 1995-04-20 | Seikagaku Corporation | Polypeptide and anti-hiv agent prepared therefrom |
RU2528860C2 (ru) * | 2008-10-29 | 2014-09-20 | Леуколект Ас | Лейколектины и их применение |
RU2580031C2 (ru) * | 2015-03-16 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА |
-
2017
- 2017-12-28 RU RU2017146644A patent/RU2658781C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995010534A1 (en) * | 1993-10-14 | 1995-04-20 | Seikagaku Corporation | Polypeptide and anti-hiv agent prepared therefrom |
RU2528860C2 (ru) * | 2008-10-29 | 2014-09-20 | Леуколект Ас | Лейколектины и их применение |
RU2580031C2 (ru) * | 2015-03-16 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAKAMURA Т. et al., Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). Isolation and chemical structure, J. Biol. Chem., 1988, v.263, n.32. p. 16709-16713. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2702661C1 (ru) * | 2019-05-24 | 2019-10-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Пептид, проявляющий антибактериальные и противоопухолевые свойства |
RU2771492C1 (ru) * | 2021-04-15 | 2022-05-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Пептид, обладающий противоопухолевой активностью |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Boldrini-França et al. | Minor snake venom proteins: Structure, function and potential applications | |
Chou et al. | Design and synthesis of cationic antimicrobial peptides with improved activity and selectivity against Vibrio spp. | |
Lai et al. | Functional and structural characterization of recombinant dermcidin-1L, a human antimicrobial peptide | |
US11965003B2 (en) | Recombinant lectin variants | |
Xia et al. | Expression and characterization of cecropinXJ, a bioactive antimicrobial peptide from Bombyx mori (Bombycidae, Lepidoptera) in Escherichia coli | |
Shlyapnikov et al. | Bacterial production of latarcin 2a, a potent antimicrobial peptide from spider venom | |
WO2008089645A1 (fr) | Polypeptide de fusion inhibant la croissance cellulaire et son utilisation | |
RU2658781C1 (ru) | Пептид, обладающий противоопухолевой активностью | |
CN105683216B (zh) | 人源egf结构域蛋白及其应用 | |
Grafskaia et al. | Discovery of novel antimicrobial peptides: A transcriptomic study of the sea anemone Cnidopus japonicus | |
Wu et al. | Limnonectins: a new class of antimicrobial peptides from the skin secretion of the Fujian large-headed frog (Limnonectes fujianensis) | |
Campos et al. | A general method of protein purification for recombinant unstructured non-acidic proteins | |
KR102060881B1 (ko) | 재조합 인간 혈청 알부민의 수용성 과발현 및 정제 방법 | |
RU2702661C1 (ru) | Пептид, проявляющий антибактериальные и противоопухолевые свойства | |
Ji et al. | Expression and characterization of recombinant rattusin, an α-defensin-related peptide with a homodimeric scaffold formed by intermolecular disulfide exchanges | |
RU2580031C2 (ru) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА | |
KR20200018123A (ko) | 폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이의 용도 | |
Sebastian et al. | Molecular and Functional Characterization of an Anti-lipopolysaccharide Factor Mm-ALF from Speckled Shrimp Metapenaeus monoceros | |
RU2721273C1 (ru) | Пептид никомицин из морского кольчатого червя nicomache minor, обладающий антимикробным и противоопухолевым действием. | |
RU2778856C1 (ru) | Катионный пептид, проявляющий антибактериальные свойства | |
JPH03297388A (ja) | 新規なtnf変異体、その製造法及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
Zhang et al. | Identification of novel Amurin-2 variants from the skin secretion of Rana amurensis, and the design of cationicity-enhanced analogues | |
RU2624020C2 (ru) | Бета-шпилечный полипептид, обладающий антимикробной активностью | |
GENE | Molecular cloning and heterologous expression of human interferon alpha2b gene | |
RU2760585C1 (ru) | Штамм бактерий Escherichia Coli - продуцент рекомбинантного белка IL-29 |