PT96859A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas e metodos para o tratamento de infeccoes provocadas por organismos sensiveis aos antibioticos beta-lactamicos - Google Patents

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BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES PROVOCADAS POR ORGA NISMOS SENSÍVEIS AOS ANTIBIÓTICOS P-IACTAMICOS"

ÍNDICE DAS MATÉRIAS 1. Âmbito da Presente Invenção ..................... 1 2. Antecedentes da Presente Invenção ............... 1 2.1 Antibióticos j0-lactâmieos ............... 1 2.2 Oligopéptidos Catiónicos ................. 3 2.3 Efeitos do Soro sobre o Crescimento das

Bactérias ........ 5 2.4 Métodos de Selecção In Vitro para Composições que Actividade Bactericida ......... 6 3. Sumário da Presente Invenção ............... 7 4. Breve Descrição das Figuras ..................... 9 5. Descrição Pormenorizada da Presente Invenção .... 11 5.1 Composições para Tratar Infecções Causadas por um Organismo Susceptível a um Antibiótico -Lactâmico ..................... 11 * 5.2 Aplicações e Métodos de Utilização ....... 16 5.3 Métodos In Vitro para Rastreio de

Composições Sinergéticas com Antibióticos jâ-Lactama ............... 17 6. Exemplo: Acção Sinérgica de Cefalosporinas e do Péptido Catiónico Magainina 2 ..................... 18 - 2 />·' * . -¾ -ϊ,βΒβ» .¾ 6.1 Materiais e Métodos .............................. . 18 6.1.1. Reagentes e Tampões ...................... 18 6.1.2. Estirpes Bacterianas e Condições de Cultura.19 6.1.3. Soro ............. 19 6.1.4. Determinação da Concentração Inibidora ..... Mínima (MIC) ...............................19 6.1.5. Ensaio Bactericida com Soro ................20 6.2 Resultados ..........................................20 7. Exemplo: Acção Sinergética das Cefalosporinas e do Péptido

Catiónico C—13 do Factor-4 das Plaquetas Humanas ..........22 7.1 Materiais e Métodos .............. 22 7.1.1. Reagentes e Tampões ........... 22 7.1.2. Estirpes Bacterianas e Condições de

Cultura ................................... 23 7.1.3. Soro.................................... 23 7.1.4. Determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) .............................. 23 7..5. Ensaio Bactericida com Soro ............... 23 7.2 Resultados ............ 24 8. Exemplo: Efeito Protector In Vivo de Associações de

Magainina e de Cefepima .................................. 24 8.1 Materiais e Métodos .............................. 25 8.1.1. Reagentes e Tampões ....................... 25 8.1.2. Estirpes Bacterianas e Condições de Cultura.25 8.1.3· Ensaio In Vivo ............................ 25 8.2. Resultados ......................................... 26 9. Exemplo: Síntese de Análogos do Péptido C—13 ............ 26 9.1. Materiais e Métodos ................................ 27 9.1.1. Reagentes e Métodos ....................... 27

10. Exemplo: Rastreio In Vitro de Análogos do Péptido C—13 quanto à sua Actividade Bacteriana e à sua Actividade Hemolítica ......................... 28 10.1 Materiais e Métodos ........................ 29 10.1.1. Reagentes e TampCes .............. 29 10.1.. Estirpes Bacterianas e CondiçCes de Cultura ....................... 29 10.1.3· Ensaio Bactericida com Soro ...... 30 10.1.4. Ensaio Hemolítico ......... 30 '10.2. Resultados ................. 31 11. Exemplo: Efeito de Protecçâo In Vivo da Associação dos Análogos do Péptido C-13 de Cefepima ...... 33 11.1. Materiais e Métodos ........................ 34 11.1.1. Reagentes e TampCes .............. 34 11.1.2. Estirpes Bacterianas e CondiçCes de Cultura .................... 34 11.1.3· Ensaio In Vivo ................... 34 11.2. Resultados .................... 35 1

ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições que contêm pelo menos dois componentes que actuam de um modo sinérgico in vivo e que são eficazes no tratamento de uma infecção causada por um organismo sensível a um antibiótico β-lactâmico. A presente invenção inclui ainda métodos para tratar uma infecção deste tipo num paciente mediante administração de uma quantidade eficaz dessas composições e refere-se tambm a métodos in vitro para o rastreio das composições quanto à actividade bactericida na presença de um complemento activo.

2. ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

As infecções bacterianas constituem a prin cipal causa da morte nos pacientes em estado crítico, principalmente devido a infecções provocadas por bactérias gram-ne-gativas (Klatersky et al., Eur. J. Câncer Clinicai Oncology, 2451 1988) : 535-545). As infecções que surgem nesses pacientes progridem rapidamente e são muitas vezes fatais.

Os pacientes submetidos a quimioterapia muitas vezes um baixo número de granulócitos, isto é, granulo-citopenia e encontram-se particularmente predispostos para infecções bacterianas (Klatersky, Am. J. Med., 80 (1986):2-12). Os organismos infecciosos mais comuns nestes pacientes são os bacilos gram-negativos, Escherichia ooli (E. coli), Pseudomo-nas aeruginosas (P. aeruginosa), e Klepsiella pneumoniae (K. pneumoniae) e os cocos gram-positivos Stachyloccoccus aureus) e (S. aureus) e Staphyloccoccus epidermis (S. epi-dermis).

Outros pacientes que são especialmente sen síveis tanto às infecções bacterianas gram-negativas como gram- -positivas são os pacientes submetidos a cirurgia gastrointes tinal (Bergamini e Polk. J. Antimicrobial Chemotherapy, 23 (1989) : 301—303), apesar de outros pacientes também submetidos a intervenções cirúrgicas correrem também o mesmo risco. Actualmente a única terapia eficaz para estes pacientes são os antibióticos.

2.1. ANTIBIÓTICOS &-LACTÃMICOS

Um grupo de' antibióticos que se tem mostrado eficaz no tratamento destes pacientes é 0 dos antibióti cos /^-lactâmicos que inibem a síntese da parede da célula bac teriana. Uma característica comum aos antibióticos ,^-lactânú cos é a sua capacida de aniquilar uma grande variedade de bactérias diferentes. Esta característica é importante, uma vez que muitas vezes não é possível na prática determinar a bacté ria específica que causa a doença. Além disso, o tratamento com o antibiótico inicia-se, na maioria das vezes, antes de se efectuar 0 diagnóstico do organismo infeccioso, pelo que as infecções bacterianas nestes pacientes podem ser rapidamen te fatais. Os exemplos de antibióticos /^-lactâmicos incluem as penicilinas, as cefalosporinas, as monobactamas, as pi-razidonas, os penemos e os carbapenemos. Observou-se que con centrações baixas de penicilinas induzem a filamentação da E. coli com formação de uma protuberância e lise que ocorria apenas a concentrações superiores de antibiótico (revisão em Waxman e Strominger, Annual Rev. Biochem., 52 (1983) 825-869)· Também se demonstrou que as peptidoglicano-transpeptidases são os alvos dos antibióticos /^-lactâmicos e que numerosas proteí_ nas na membrana da célula bacteriana se ligam por covalên-cia às penicilinas e aos antibióticos ^-lactâmicos com elas

ê relacionados.

Verificou-se que a penicilina G era eficaz na inibição de espécies de cocos gram-positivos, tais como os pneumococos e os estreptococos e em espécies de cocos gram-ne gativos, tais como a Neisseria meningitides (Neu, Medica Cli-nics of North America, 71: (1987) 1051-1064). Inicialmente uti lizaram-se extensivamente as aminopenicilinas, tais como a am-picilina e a amoxicilina para terapia de infecções causadas pelo Hemophilus influenzae (H. influenzae). E^ coli. Salmonel-la e Shigella. No entanto, nestes organismos observou-se uma prevalência maior de beta lactamases mediadas por plasmídeos.As cefalosporinas têm demonstrado ter actividade contra Pseudomo-nas aeroginosa, meningites causadas por agentes patogénico comuns e infecções resultantes de microrganismos multi-resisten tes, embora a resistência a estes agentes aumente também.

Um outro grupo de antibióticos /^-lactâmicos inclui os agentes carbapenímicos, tais como o imipenemo que ini be as bactérias aèróbicas e anaeróbicas gram-positivas e gram--negativas. Verificou-se que os carbapenemos possuem uma gran de afinidade para as proteínas que se ligam à penicilina.

Devido ao aumento da resistência aos antibió-icos ^-lactâmicos têm sido também administradas aos pacientes associações de antibióticos.

As aminopenicilinas foram associadas a clavula-nato, um inibidor de beta-lactamase para ultrapassar a β-lacta mase mediada por plasmídeos presente em influenzae, E. coli. Salmonella e Shigella (Neu, Medicai Clinics of North America, 71 (1987) 1051-1064). Também se associaram ^-lactamas a amino glicósidos (Klastersky, Am. J. Med. 80 (1986): 2-13). Verificou-se que essa associação era relativamente eficaz, variando a eficácia com o tipo de bactéria contra a qual se utilizava a associação. Verificou-se que uma associação de /^-lactâmas com outros antibióticos podia originar um antagonismo entre os dois compostos.

Um número crescente de referência indica que os antibióticos podem afectar a bateria de diversos modos dif£ rentes da acção bactericida esperada (Darveau et al., J. Xnfect. Pis. 162i (1990) 914-921. Essig et al., Arch. Miorobiol.132 (1982), 245-250; Kadurugamuwa et al., Antimicrob. Agents and Chamother. 32 (1988) 364-368; Leying et al., Antimicrob.

Agents and Chemother. 30 (1986) 475-480; Raponi et al., Antimicrob. Chemother., 23 (1989) 565-576; Sauerbaum et al., Antimicrob. Agents and Chemother,, 31 (1987) 1106-1110;Taylor et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 19 (1981) 786-788; Taylor et al., Drugs Exptl. Clin. Res., 8^ (1982) 625-631 e Ve-ringa et al., Drugs Exptl. Clin. Res., 14 (1988) 1-8). São exemplos de alguns destes efeitos a inibição da produção de enzimas (Grimwood et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 33 (1989) 41-47), alterações na estrutura do peptidoglicano (Garcia-Bustos e Dougherty, Antimicrob. Agents and Chemother. 31 (1987) 176-182), e a perdade propriedades de aderência inva siva (Schifferli e Beachey, Antimicrob. Agents and Chemother. 32 (1988) 1603-1608 e Vosbeck et al., Rev. Int. Pis. 1_ (1979) 845-851). Estes efeitos observam-se habitualmente quando as bactérias são incubadas com antibióticos a níveis inferiores à concentração inibidora mínima (MIC). Os efeitos de concentrações sub-inibidoras de antibióticos podem auxiliar o hospe deiro na irradiação das bactérias. Este facto é especialmente relevante com os antibióticos w.i3-lactamicos em que se sabe existir um intervalo de tempo relativamente longo necessário para que a acção bactericida do antibiótico se manifeste.

De um modo geral, doseiam-se os antibióticos de modo a proporcionarem níveis supra MIC ao longo da terapia. No entanto, uma vez que factores do hospedeiro e das bactérias tais como as jO-lactamases podem influenciar a quantidade de antibiótico activo no sítio da infecção as dosagens supra MIC não asseguram concentrações antibióticas adequadas para todos os organismos.

2.2. OLIGOPÉPTIDOS CATIÓNICOS

Isolaram-se a partir de seres humanos e de animais diversos oligopéptidos catiónicos que possuiam activi-dade antimicrobiana. Estes oligopéptidos incuem magainines (Zasloff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84 (1987) 5449--5453; Zasloff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85 (1988), 910-913; e Zasloff. Patente de Invenção Norte-Americana No. 4 810 777); cecropinas (Christensen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85, (1988) 5072-5.076 e Stein et-al. Nature (London) 292. (1981), 246-248); sarcotoxinas (Nakajima et al., J. Biol Chem., 262 (1987), 1665-1669 e Okada e Natori, Biochem. J, 229 (1985), 453-458); e defensinas (Selsted et al. J. Clin. Investig., 76: (1985), 1436-1439 e Lehrer et al., patente de invenção norte-americanas Nos. 4.543.252; 4,659.692 e 4.705.777).

As· mágaininas foram dèscòbertâs nas secreções da pele de. XanOpus·· láevis 0 fungo Sul Africano que se aloja nas unhas. Isolaram-se dois tipos de magaininas, a magainina 1 9

e a magainina 2 (Zasloff et al., Proc. Natl. Acad. Aci. U.S.A. 84 (1987), 5449-5453). A magainina 1 e a magainina 2 relacionam-se estreitamente uma com a outra tendo cada uma delas 23 aminoácidos de comprimento e diferindo exactamente em duas substituições aminoácidas. Estes péptidos são solúveis na água não hemolíticos nas suas concentrações antimicrobianas eficazes e potencialmente antifílicos. Descobriu-se que a concentração antimicrobiana eficaz de magainina necessária para actividade num meio ou tampão não contendo soro era uma função da magainina e do micróbio tratado.

Também se estudou a actividade antimicrobiana de diversos análogos de síntese de magainina (Cuervo et al. , Peptide Researh, 81 (1988), 8186; Zasloff et al., Proc. Natl. Acad. Scie. U.S.A., 81 (1988), 910-913; e Chen et al., Anti- microbial Peptides and Proeess for Making the Same, PAT-APPL--7-280.363 National Technical Information Service). Descobriu-se que a remoção dos três aminoácidos N-terminais da magainina 2 não afectava a actividade antimicrobiana (Zasloff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85 (1988), 910-913). No entanto, a remoção de um quarto aminoácido diminuía significativamente a actividade microbiana. Descobriu-se que toda a região N-terminal era necessária na magainina 1 (Cuervo et al. Peptide Research, 1_ (1988), 81-86). No entanto os análogos com emissões na região C-terminal essencialente nso resíduos alanina-15, glicina-18 ou ácido glutâmico-19 embora possuindo uma actividade antimicrobiana igual ou maior relativamente às formas originais de magainina 1 ou de magainina 2 possuíam uma acção hemolítica variável (cuervo et al., Peptide Research, 1 (1988), 81-86. Descobriram-se (Chen et al., Antimicrobial

Peptides and Processes for Making the Some PAT-APPL-7- jr 10 .% -280.363 National Teohnical Information Service) análogos de péptidos de magainina nos quais os resíduos aminoácidos que possuem uma baixa proensão para a formação da hélice eram substituídos por resíduos aminoácidos que possuíam uma alta propensão para a formação de hélice, assim como uma menor su£ ceptibilidade à acção da exopeptidase e que aumentavam as ca racterísticas estruturais anfifilicas e as propriedades anti-microbianas.

Isolaram-se dois grupos de oligopéptidos ca tiónicos a partir de insectos, cecropinas e sarcotoxinas.Isc> laram-se as cecropinas a partir de diversas espécies de insectos (Christensen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.85 (1988), 5072-5076 e Stein et al., Nature (London), 292,0981), 246-248). Isolaram-se três cecropinas principais, a cecro-pina A, a cecropina B e a cecropina D com, respectivamente, 37, 36 e 36 resíduos tendo cada um deles um carácter anfipá-tico. Descobriu-se que a região N-terminal era necessária para a actividade de ruptura da membrana originada por este péptido. Descobriu-se que três sarcotoninas eram induzidas na hemolinfa da Sarcophaga peregrina.

Também se isola a partir de.seres humanos oligopéptidos catiónicos com actividade antimicrobiana e que são conhecidos como defensinas (Selsted et al., J. Clin.

Investig. 76 (1985), 1436-1439 e Leher et al., patente de invenção norte-americana Nos. 4.543.252; 4.659.692 e 4.705.777). Esses péptidos encontram-se nos macrofagos e granulócitos e têm um teor elevado de cisterna e de argi- nina. Identificaram-se seis dessas proteínas.

Também se demonstrou que os fragmentos peptídicos dos precursores das proteínas das mitocondrias tam bém possuem actividade contra as bactérias gram-positivas (Lee et al., BIOCHEM; Biophys. Acta, 862 (1986) 211-219). 0 espectro CD destes péptidos na presença de lipossomas fosfo-lipídicos demonstrou que a actividade amtimicrobiana se encontrava geralmente em paralelo com o teor de anfifilicidade -helicoidal.

Os oligopéptidos catiónicos antimicrobianos examinados até à data demonstravam determinadas característi-cas comuns. Fundamentalmente eram péptidos catiónicos que ani_ quilavam uma ampla diversidade de bactérias, tal como se deter minou por ensaios normalizados in vitro. Existem provas evidentes que o seu mecanismo de acção se faça por inserção na parte interna da membrana bacteriana formando um pequeno orifício que permite a passagem de pequenos ides (Christensen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85 (1988), 5072-5076;

Nakajima et al., J. Biol. Chem., 262 (1987), 1665-1669; Okada e Natori Biochem J., 229 (1985), 453-458; e Westerhoff et al., Biochem. Biophys. Acta., 975 (1989), 361-369). Esta actividade do ionóforo bloqueia a geração de ATP inibindo a formação de um gradiente de protões que é essencial para a fosfo-rilação oxidativa (Okada e Natori, Biochem. J., 229 (1985), 453-458 e Westernoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86 (1989) 6597-6601). De um modo consistente com este mecanismo de acçSo, diversos destes péptidos têm demonstrado possuir uma estrutura alfa-hlicoidal em dissolventes orgânicos (Lehrer et al., patentes de invenção norte-americanas Nos. 4.543.252; 4,659.692 e 4.705.777; Westerhoff et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. U.S.A. 86 (1989), 6597-6601; eMarion et al., FEBS r

Jr / - 12-^ ^

Letters, 227 (1988), 21-26) e formar orifícios num sistema de membrana artificial (Christensen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85 (1988), 5072-5076 e Cruoiani et al., Biophysical J. ££, (1988), 9a).

Para que as magaininas ou compostos similares possam ser terapeuticamente úteis para o tratamento de infectes bacterianas que possam conduzir a bacteriemia têm de ser capazes de exercer a sua acção bactericida na presença de soro humano. Isto constitui um grande problema, uma vez que se demonstrou que a actividade de pelo menos uma defensina humana é completamente inactivada pelo soro humano (Daher et al., J. Virol, 60 (1986) 1068-1074).

2.3- EFEITOS DO SORO NO CRESCIMENTO BACTERIANO

Um grande número de bactérias especialmente bactérias gram-negativas são aniquiladas pelo soro humano fre£ co (Feingold, J. Infectious Pis., 120 (1969), 437-444). Reco-Jfoâcem-se dois esquemas principais da activação complementar (referido em Joiner et al., Ann. Rev. Immunol., 2 (1984), 461--491. 0 esquema clássico é geralmente activado pela interaeção do anticorpo comuma superfície antigénica. 0 primeiro passo de activação envolve a ligação da proteína complementar C1 à região Fc do anticorpo ligado ao antigeno com subsequente activação da molécula C1. Os passos subsequentes no esquema clássico envolve a utilização de todas as proteínas complementares de C1-C9. 0 segundo esquema, o esquema alternativo, é activado pela ligação de outras proteínas de soro à bactéria e a subs-quente activação da proteína complementar C3. Este esquema é portanto, similar ao esquema clássico para a proteína complementar C9.

Observou-se a aniquilação das bactérias pe los componentes terminais do complemento C5b-9 na ausência de componentes anteriores. Utilizando componentes complemen tares purificados C5, C6, C7, C8 e C9 (revisto em Joiner et ai., Ann. Rev. Immunol., 2 (1984), 461-491). Observou-se uma aniquilação de aprocimadamente 3 log de Salmonella min-nesota (S. minnesota) Re 595 extremamente violenta e uma aniquilação de aproximadamente 1 log de E. coli J5 violenta. De-monstrou-se que os danos da membrana mediados pelo complemento e a citólise eram efectuadas pela própria reunião sobre as membranas alvo, de complexos C5b-9 que são anfifílicos e tubulares (Podack e Tschopp, Mol. Immunol., 2J[ (1984), 589--603). Parece que C5b-9 origina poros funcionais através das partes interna e externa da membrana bacteriana (Born e Bhadki, Immunology, 59 (1986), 139-145). Os poros ou canais transmurais originados permitem o rápido afluxo de K+ originan do a morte celular através do colapso do potencial de membrana.

2.4. MÉTODOS DE SELECÇÃO IN VITRO PARA COMPOSIÇÕES QUE

POSSUEM ACTIVIDADE BACTERICIDA

Efectua-se de um modo rotineiro o rastreio das composições potencialmente bactericidas de acordo com meto dos normalizados, in vitro. Estes métodos são similares aos descritos no Manual of Clinicai Microbiology, 4^ Edição, Lennett, E.H. Ed. in Chief, American Society for Microbiology, 1985, pps. 959-987. As únicas modificações residiram em determinadas referências no que diz respeito a meios, preparação de tampões, etc. A selecção de um agente antimicrobiano adequa do para tratar uma infecção envolve diversas considerações. En tre muitas encontram-se incluídas: (1) sensibilidade in vitro de outros organismos alvo e (2) relação de afinidade da sensibilidade da estirpe alvo com a de outros membros da mesma espécie. A concentração de um agente potencialmente antibac-teriano necessária para inibir ou aniquilar organismos in vi-tro e a atingida nos fluídos orgânicos durante o tratamento in vivo foram submetidas a medição directa no laboratório.

Os métodos de ensaio normalizados de sensibilidade incluem a difusão em disco, a diluição em líquido e a diluição em agar. Cada um destes tris métodos anteriormen-te referidos não inclui componentes que englobem uma cascata complementar activa. Dest modo, a actividade bacteriana refere-se apenas à capacidade do agente antibacteriano para aniquilar o próprio organismo alvo, Descobriu-se que deternd nados péptidos com actividade bactericida in vitro se mostra vam incapazes quando ensaiados em ensaios in vitro que incluíam soros humanos e também não se mostravam capazes de actuar in vivo. As magaininas são um exemplo deste fenómeno. Além disso, qualquer composição que não possuísse actividade bact£ ricida ou apenas actividade bactericida limitada mas que intensificasse a capacidade do complemento do soro para aniquilar as bactérias não seria bem sucedida.

3. SOMÃRIO DA PRESENTE INVENÇÍO A presente invenção refere-se a composiçOes e a métodos para tratar uma infecção originada por umorganis-mo sensível a um antibiótico ,/3-laetâmico. 0 organismo pode ser uma bactéria gram-negativa ou gram-positiva. Uma composição da presente invenção contém pelo menos dois componentes que actuam de um modo sinérgico in vivo. Um dos componentes da composição da presente invenção consiste no antibióticoJí- -lactâmico. 0 antibiótico /^-lactâmico pode ser uma penicilina, uma cefalosporina, um carbapenemo, uma monobactama, uma cefamicina, uma pirazidona ou um penemo. De um modo mais específico a cefalosporina é uma cefepima ou cefotaxima ou ceftazidima, o carbapenemo é imipinemo e a monobactama é a aztreonama. 0 segundo componente de uma decomposição da presente invenção é um oligopéptido catiónico. Os oligopép-tidos catiónicos utilizados em associação com o antibiótico .^Ã-lactâmico para proporcionar composições sinergéticas incluem magaininas, cepropinas, sarcotoxinas, proteínas precursoras mitocondriais e fragmentos, análogos e derivados destes péptidos. Péptidos catiónicos adicionais incluem o factor-4 das plaquetas humanas (PF-4) e seus fragmentos, aná logos e derivados, incluindo um fragmento C-13 de PF-4.

Além disso, os oligopéptidos catiónicos formam uma hélice alfa anfipática na presença de uma interface lípida aquosa.

De um modo mais específico os oligopéptidos possuem pelo menos 8 a 11 aminoácidos de comprimento e podem possuir geralmente a seguinte sequência de aminoácidos: aa .j-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa^aag-Lys-Lys-Leu-Leu-aa^-aa^-X j na qual o símbolo aa^ representa Pro, Ala ou Lys, o símbolo aac representa Ile ou Leu, o símbolo aa, representa * 5

Glu ou Lys, o símbolo aa^ representa Ser, Leu ou Lys e o símbolo X representa uma sequência de aminoácidos de cinco aminoácidos de natureza alfa-helicoidal que possui a sequência geral de aag-Lys-Lys-aag-Gly na qual o símbolo r‘ '.“ttaUCJfc

- 16 - X aa^ representa Ala ou Leu ou Phe.

Os oligopéptidos catiónicos podem ser os se- gruintes:

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala- -Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. #5);

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-

Lys-Lys-Leu-Gly (Sequência I.D. #6)5

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala- -Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. #7);

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-

Orn-Orn-Leu-Gly

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-

Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. #8);

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-

Lys-Lys-Phe-Gly (Seq. I.D. #10);

Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. #11); e Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. # 12).

Um oligopéptido catiónico também pode englobar:

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-

Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly e similares em que os resíduos aminoácidos podem ser d-aminoáeidos. A presente invenção proporciona ainda composições para tratar uma infecção originada pelas bactérias Enterobacteriaceaa, especialmente por Escherichia coli. Enterobacter clocae e Klebsiella pneumoniae. As composições da presente invenção são eficazes para tratar infecções causadas por Pseudomonas aeroginosa. As composições combinam antibióticos -Lactâmicos tal como anteriormente se descreveu com uma substância activa da membrana. As substâncias activas da membrana originam a ruptura das funções essenciais da membrana que contam, por exemplo, com a força motriz dos protões incluindo a fosforilação oxidativa, o transporte es-sensial, etc. As substâncias activas de membrana incluem os oligopéptidos catiónicos, tal como anteriormente se descreveu e se descreverá adiante.

Também se proporcionam métodos para tratar infecções originadas por um organismo sensível e um antibiótico /^-lactâmico. Algumas das infecções responsáveis pelo tratamento pelas composições da presente invenção são origi nadas pelas bactérias Enterobacteriaceaa especialmente E. coli. Nos métodos clínicos administraram-se quantidades terapeuticamente eficazes das composições da presente invenção a pacientes, durante um intervalo de tempo suficiente para se inibir o crescimento das bactérias. As combinações específicas para o tratamento de infecções bacterianas originadas pela Escherichia coli incluem a cefepima combinada com ma-gainina 2, com o péptido C—13 do factor 4 das plaquetas e péptidos catiónicos que possuam as seguintes sequências de resíduos aminoácidos: 18 -

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sequência I.D. #6); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. #7) Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dLeu- dLys-dSer-dAla-dLys-dLys-dLeu-Gly A presente invenção também proporciona métodos in vitro para se efectuar o rastreio de composiçOes para actividade antibacteriana com complemento. As composiçOes que se pretendem ensaiar são combinadas com uma bactéria alvo e com componentes de uma cascata complementar activa num meio normalizado e após um intervalo de tempo suficiente determina--se a actividade antibacteriana. Os componentes completamente activos podem ser adicionados sob a forma de soro ou podem adicionar-se os componentes da cascata complementar individual^ mente. Dá-se especial preferência ao soro humano. 0 especialista verificará facilmente que exi£ tem mais vantagens e benefícios proporcionados pela presente invenção, a partir da descrição pormenorizada que se segue dos exemplos e das reivindicações em anexo.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Nas gravuras: A Figura 1 ilustra a aniquilação, em tamão, pormaainina 2 de E. coli não tratada e alterada por defepima. Desenvolveu-se a E. coli ATCC25922 até à fase exponencial média com (alterada por cefepima) e sem (não tratada) 1/4 MIC de 20

rv cefepima (0,016 ug/ml de cefepima). Diluiram-se as células, tal como se descreveu na Secção 6.1.5 e adicionaram-se aos tubos .contendo tampão GVB++ com ou sem cefepima e variando as concentrações do péptido magainina 2 (indicados no eixo dos X). A cefepima encontrava-se presente nos tubos utilizados para se examinar o crescimento prévio das células com este antibiótico. Decorridos 180 minutos a 37°C, determinou-se um número de bactérias sobreviventes medindo o número de unidades que formavam colónicas (cfu) em cada tubo. Efectuaram-se as contagens de bactérias em triplicado. Para cada concentração de magainina Log de aniquilação = log10cfu sem magai-. nina - log1Q uf,c contenú° magainina. A Figura 2 ilustra o aniquilamento, em soro humano, pela macainina 2 de E. ooli não tratada e alterada por cefepima. Adicionaram-se as células, preparadas tal como se descreveu na Figura 1, aos tubos contendo 40% de soro humano. Decorridos 180 minutos a 37°C determinou-se o número de bacté rias sobreviventes medindo o número de unidades que formavam colónias (ufc) em cada um dos tubos. Efectuaram-se os ensaios em triplicado. Para cada concentração de magainina Log10 de aniquilamento = Log^ ufc sem magainina - log.^ ufc contendo magainina. A Figura 3 ilustra o aniquilamento efectuado pela magainina 2 de E. coli em soro activo e em soro acti-vado pelo calor. Adicionaram-se as células preparadas, tal como se descreveu na Figura 1 a tubos que continham 40% de soro humano, ou *\Q% de soro humano inactivado pelo calor.Uti-lizou-se a cefepima que se encontrava presente nesses tubos para se examinar o crescimento prévio das células com este 21 ,τ*-*αΑ antibiótico. Os tubos também continham ou 100 /Ug/ml de magai nina 2 ou não continham magainina 2. Calculou-se Log^ de aniquilamento para as bactérias não tratadas e alteradas com cefepina em soro activo ou em soro inactivado pelo calor de acordo com a seguinte fórmula: Log,j0 de aniquilamento = =Log10 ufc sem magainina - 100ufç contendo magainina. A Figura 4 ilustra a inibição por soros ina£ tivos do aniquilamento de magainina de bactérias alteradas com cefepima. Desenvolveram-se previamente as células em cefepima, tal como se descreveu na Figura 1. Adicionaram-se as células a tubos que continham cefecima com 0,2,5, 5, 10, 20 ou de soro inactivadopelo calor. Um outro conjunto de tubos continha idênticas quantidades de soro inactivado pelo calor con tendo 200 yug/ml de magainina 2. A percentagem de inibição para cada concentração de soro inactivado pelo calor foi = = (ufc contendo magainina/ufc não contendo magainina) 100. A Figura 5 ilustra a função do complemento hu mano no aniquilamento efectuadopela magainina de E. coli não tratada e de L coli alterada com cefepima. Desenvolveu-se a coli ATCC25922 com e sem 1/4 MIC de cefepima. Adicionaram-se as células a conjuntos de tubos que continham 40$ de soros humanos especificamente desprovidos de complemento huma-o C8 (sem C8) ou com 4056 de soros humanos desprovidos de C8 aos quais se adicionou C8 purificado a 50/ug/ml (=C8). A cef£ pima quando se encontrava presente foi adicionada a 0,016 /ig/ /ml (+cefepima). Cada conjunto de tubos continha também 0, 6,25, 12,5. 25 e 50 mg/ml de magainina 2. Determinaram-se os números viáveis na altura em que se adicionaram as bactérias ao soro (entrada) e determinou-se a percentagem de sobrevi- - 22 /

. *'*VV*CCS*I ventes decorridas três horas. Efectiiou-se o ensaio em triplicado, apresentando-se o resultado como uma média + desvio padrão entre ensaios. A figura 6 ilustra o efeito de diferen -tes antibióticos sobre o aniquilamento efectuado pela magainina nos soros humanos normais agregados. Desenvolveu--se previamente a coli. ATCC25922 e efectuou-se o ensaio sem antibiótico e com 1/32, 1/16 e 1/8 MIC de cada antibiótico examinado. Adicionaram-se as bactérias aos dois conjuntos de tubos contendo ambos 40% de soro normal humano agregado a 200 jxg/ml de magainina 2 ou sem magainina. Para cada concentração de antibiótico: Log^ de aniquilamento = =Log10 ufc sem magainina - Log10 ufc contendo magainina.

Cipro = ciprofloxacina. ND = Não determinado. A figura 7 ilustra o grau de aniquilamento de magainina/cefepima contra uma diversidade de bactérias. Desenvolveram-se as células bacterianas até à fase exponencial média com ou sem 1/4 MIC de cefepima. Adicionaram-se as bactérias aos dois conjuntos de tubos que continham ambos soro humano normal agregado a 40% e 200 jxg/ml de magainina 2 ou não continham magainina. Além disso, encontrava-se presente cefepma nos tubos utilizados para examinar o crescimento prévio das células com este antibiótico. Para cada estirpe bacteriana calculou-se o Log^ de aniquilamento do modo que se segue: MGN 2 = Log10 aniquilamento sem MGN- - Log^ aniquilamento + MGN; cefepima + Log^ aniquilamento sem MGN - Log^ aniquilamento sem MGN + cefepima; MGN + cefepima = Log^Q aniquilamento sem MGN - Log-jg aniquilamento+ + MGN + cefepima. E. Cloa = E. cloacae. K.p. = K. pneomoniae. - 23 A figura 8 ilustra o péptido C-13 de PF-4 de aniquilamento da E^ ooli em soro activo e em soro inactivado pelo calor. Envolveu-se a coli ATCC25922 com ou sem 1/E MIC de cefepima. Adicionaram-se as células a um conjunto de tubos que continham 40¾ de soro humano normal agregado ou 40¾ de soro inactivado pelo calor. A cefepima encontrava-se presente nesses tubos que se utilizaram para se examinarem o crescimento médio das células com este antibiótico. Os tubos também continham 200 ug/ml do péptido C-13. Para as bactérias não tratadas e para as bactérias alteradas com cefepima em soro activo ou em soro inactivado pelo calor: Log10 de aniquilamento = Log10 ufc sem C13 -- Log10 ufc + C13. Nota: não se verificou qualquer aniquilamento nas bactérias alteradas por cefepima em soros inac-tivados.

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições e a métodos para tratar infecções causadas por um orga nismo sensível a um antibiótico -lactâmico. Tais composições englobam pelo menos dois componentes que actuam de um modo sinérgico. Como resultado, estas composições possuem uma maior eficácia in vivo do que a que se pode obter com cada um dos coonentes individualmente. 0 sinergismo também pode ser manifestado por uma eficácia igual ou superior com doses inferiores e/ou menos frequentes do que as que seriam necessárias se se utilizasse cada um dos componentes individualmente. As composições da presente invenção também podem ser úteis para tratar estirpes resistentes aos antibió- ticos. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos in vitro para efectuar o rastreio das composições sinergéticas com antibióticos jS-Lactâmicos no aniquilamento de células bacterianas e a composições capazes de aniquilar as bactérias com complementos activos para a actividade bac-tericida.

5.1 COMPOSIÇÕES PARA TRATAR INFECÇÕES CAPSADAS POR UM ORGANISMO SPSCEPTÍYEL A UM ANTIBIÓTICO B-LACTÂMICO A presente invenção refere-se a uma composição constituída pelo menos por dois ou mais componentes para tratar de uma infecção causada por um organismo suscep-tível a um antibiótico j3-lactâmico. Os organismos suscep-tíveis a um antibiótico j3-lactâmico podem ser bactérias gram-positivas (e. g. Streptococus) ou bactérias gram-nega-tivas, por exemplo, da familia das Enterobacteriaceae (e. g. Escherichia coli, Klebseilla penumoniae e Enterobactercloa-cae) , das familia das Pseudomonadaceae (i.e. Pseudomonas aeruginosa) e a familia dos Bacterióides. De acordo com um dos aspectos da presente invenção a composição contém: (1) um antibiótico β -lactâmico que inibe o crescimento do organismo e (2) o olipéptido catiónico. 0 antibiótico β-lactâmico pode inibir o crescimento da bactéria alterando a es trutura da membrana bacteriana e o oligopéptido catiónico pode formar canais na membrana bacteriana. Deste modo, o antibiótico β-lactâmico e o oligopéptido catiónico podem ac-tuar de um mod sinérgico. - 25

Os antibióticos -laetâmico tal como se definiu na Secção 2.1 supra, são os antibióticos que inibem a síntese da parede da célula bacteriana. Tais antibióticos podem englobar mas não se limitam a penicilinas, cafalospo-rinas (por exemplo, cefepima, cefotaxima e ceftazidima), carbapenemos (por exemplo, imibenimo), monobactamas (por exemplo, aztreonama), cefamicinas, pirazidonas e penemos. Podem obter-se os antibióticos j&-lactâmicos comerciãlmente e utilizando procedimentos para a obtenção desses antibióticos conhecidos pelo especialista. A designação "oligopéptido catiónico" , tal como se utiliza na presente especificação e nas reivindicações referem-se a oligopéptidos anfipáticos com actividade antimicrobiana que se podem inserir na parte interna da membrana bacteriana e que quando combinados com antibióticos -lactâmicos in vivo proporcionam um aniquilamento sinér-gico da célula bacteriana.

De acordo com o aspecto da presente invenção, os oligopéptidos eatiónicos contêm regiões que são de natureza o( -helicoidal quando se encontram na presença de uma interfase líquido/aquosa. A hélice formada pode encontrar-se à esquerda ou à direita e pode conter aminoáci-dos não proteicos (por exemplo £X -aminoácidos, o(-dial-quilaminoácidos, d-aminoácidos ou derivados de aminoácidos). Além disso, os oligopéptidos eatiónicos formam hálices anfi-páticas. Algumas áreas do péptido linear são de carácter hi-drófobo embora outras sejam de carácter hidrófilo pelo que quando se forma a hélice é predominantemente hidrófobo en- - 26 - κ x- i % quanto o outro lado é predominantemente hidrófilo. Embora es_ ta característica possa não ser evidente quando se inspeccio na a sequência linear pode reconhecer-se facilmente esta pro priedade utilizando diagramas de sistema helicoidal (Crick, Acta Crystallogr, 6^:(1953) 684-697) ou projecções helicoidais axiais (Schiffer et al-, Biophis. J., (1967) 121-135).

As regiões de carácter hidrófobo ou hidrófilico não são necessariamente constituídas exclusivamente por resíduos ami-noácidos de carácter semelhante necessitando apenas de serem predominantemente hidrófobas ou hidrófilas desde que a natureza anfipática do péptido seja conservada. Deverá ter-se igualmente em atenção que as regiões de características físicas idênticas não necessitam de ser rigorosamente paralelas ao eixo da hélice mas podem fazer um ângulo oblíquo com o eixo. Além disso, as regiões helicoidais podem ser quebradas por regiões não helicoidais e conservarem ainda uma ac-tividade bactericida intensa na prèsença de antibióticos ^ -lactâmicos.

De acordo com um aspecto específico da pr£ sente invenção o oligopéptido catiónico pode consistir em factor-4 das plaquetas humanas nos seus fragmentos, análogos e derivados, os análogos e derivados são os péptidos que conservam a natureza catiónica o(-helicoidal anfipática do péptido e conservam para além disso a actividade bactericida. 0 factor-4 das plaquetas humanas (PF-4) constituído por 70 aminoácidos á uma proteína plaquetária O^-granulocítica que possui uma elevada afinidade para a heparina e que inibe a proliferação celular endotelial estimulada pelo factor do crescimento (Maione et al., Science, 247 (1990) 77-80) e que possui também uma actividade imunoreguladora (Zucker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86:(1989) 7571-7574).

Descobriu-se que um fragmento carboxi terminal de 13 amino-ácidos de comprimento (amino-ácidos 58-70) a que daqui a diante se fará referência como ofragmento C-13 de PF-4 ou o péptido C-13 e que se possuia a sequência:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq.I.D.#!) conservava tanto a actividade de inibição do crescimento como a actividade imuno-reguladora (Maione e al., Science 247: (1990) 77-80 e Zucker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86: (1989) 7571-7574). Descobriu-se no entanto que péptidos menores C-12 (aminoácidos 58-69) e C-ll (aminoácidos 58-68) eram menos inibidores (Maione et al., Science,247:(1990) 77--80). Observou-se uma acção inibidora menor com o péptido C—10 (aminoácidos 58-67).

Podem preparar-se os oligopéptidos catió-nicos de acordo com procedimentos que são do conhecimento do especialista. De acordo com um dos aspectos podem isolar-se os oligopéptidos catiónicos a partir das suas fontes naturais, Por exemplo, tal como se referiu na Secção 2.2 Supra, podem isolar-se as magaininas a partir de Xenopus laevis (Zasloff. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84:(1987) 5449 --5453), podem isolar-se as secropinas e as sarcotoxinas a partir de insectos (Christensen et al., Proc. Natl. Acad.

Soi. O.S.A., 85,:(1988)5072-5076 e Nakajima et al. J.Biol. Chem. 262:(1987) 1655-1669), podem isolar-se as proteínas precursoras mitocondriais a partir de mitocondrias e pode iso lar-se o factor-4 das plaquets humanas a partir de plaquetas utilindo procedimentos conhecidos na especialidade. De um mo do alternativo, podem obter-se oligopéotidos catiónicos de acordo com procedimentos de ADN recombinante. Descobriram--se métodos para se obterem, por exemplo, as magaininas (Zasloff, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84:(1987) 5449 --5453) as cecropinas (Christensen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85:(1988) 5072-5076), as sarcotoxinas (Nakajima et al., J. Biol. Chem., 262:(1987) 1655-1669) e o factor-4 das plaquetas humanas (St. Charles et al., J. Biol Chem., 264:(1989) 2092-2099). Também se podem obter os oligopépti-dos catiónicos da presente invenção sintetizando quimicamente as sequncias oligopeptídicas utilizando procedimentos conhecidos na especialidade, tais como os sintetizadores de péptidos comercialmente disponíveis e similares. Pode encon-trar-se a descrição destas técnicas normalizadas para a síntese de polipéptidos em publicações como J. Chem. Soo., 85: (1963) 2149-2154 e Hunkapillar e outros, Nature (London) 310: (1984) 105-111 Merrifield.

Sintetizaram-se diversos análogos do pépti-do C—13 do factor-4 das plaquetas humanas. Os análogos que conservavam actividade bactericida eram Q^-helicoidal tendo aproximadamente 3,6 aminoácidos por volta e tendo pelo menos aproximadamente 11 a 18 aminoácidos de comprimento tendo alternadamente regiões hidrófobas e hidrófilas por cada dois ou três resíduos aminoácidos e são considerados como fazendo parte da presente invenção. Os análogos sintetizados que rompem a natureza helicoidal da molácula ou a natureza an-fipática da molécula reduzem ou obviam em grande parte qualquer actividade bactericida.

Geralmente a sequência de aminoácidos das composições anfipáticas catiónicas -helicoidais da presen te invenção que possuem actividade antibacteriana englobam a sequência de resíduos aminoácidos que se segue:

aa-| -Leu-Tyr-Lys-aag-aa^Lys-Lys-Leu-Leu-aa^-aa^-X em que aa^ representa Pro. Ala ou Lys; aa2 representa Ile ou Leu; aag representa Glu ou Lys; aa^ representa Ser; Leu ou Lys e X representa uma sequência de cinco aminoácidos constituída pela sequência de aminoácidos Ala-Lys-Lys-Leu-Gly.

Os aspectos específicos da presente invenção incluem oligopéptidosque possuem as seguintes sequências de resíduos aminoácidos:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser; Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-

Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-

Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-

Ala-Lys-Lys-Leu-Gly; dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dSer-dAla-dLys-dLeu-Gly; - 30 ,/

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-

Ala-Orn-Orn-Leu-Gly 5

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-

Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Ser-

Ala-Arg-Arg-Leu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-

Ala-Lys-Lys-Phe-Gly;

Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-

Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly; e

Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-

Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;

Após a descrição da estrutura geral das composições bactericidas anfifílicas cationicas o(-helicoi-dais do péptido C-13 do factor-4 plaquetário e de diversos análogos e derivados que possuem actividade antibacteriana podem sintetizar-se de um modo rotineiro estes péptidos de acordo com técnicas normalizadas na especialidade, assim como com sintetizadores de péptidos que se encontram comercial^ mente disponíveis e similares.

Chama-se, no entanto, a atenção para o fa£ to de dada a estrutura geral das composições antibacterianas da presente invenção e os métodos de rastreio para composições que possuem actividade sinergética com antibióticos J3 -lactâmicos ou com componentes de complementos humanos podem prever-se facilmente gerar-se e/ou preparar-se diversos outros análogos e derivados de acordo com métodos comuns nor- - 31 malizados,tais como por modelização em computador de dados e métodos similares.

Todos estes análogos e derivados que sejam equivalentes em estrutura e função às composições descritas na presente invenção consideram-se englobados no âmbito da presente invenção.

De acordo com um aspecto específico da pre sente invenção a composição engloba: (1) um antibiótico β--lactâmico que inibe o crescimento das bactérias e (2) pode utilizar-se uma substncia activa de membrana para tratar uma infecção causada pelas bactérias. Discutiram-se anteriormen-te os exemplos de antibióticos β -lactâmicos. A designação '•substância activa de membrana", tal como se utiliza na presente especificação e nas reivindicações refere-se a uma substância que seja capaz de interferir com as funções integrais da membrana. Tais funções incluem, mas não se limitam, a fosforilação oxidativa, o transporte essencial e a outras actividades de membrana associadas à força motriz dos protões. Um exemplo de uma tal substância é um oligopéptido ca-tiónico. Exemplos de péptidos catiónicos, tal como se expôs supra incluem mas não se limitam às magaininas (por exemplo, magainina 1 e magainina 2), cecropinas,sarcotoxinas, proteínas precursoras mitocondriais, factor-4 das plaquetas humanas e seus fragmentos, análogos e derivados.

Num aspecto muito específico da presente invenção uma composição que engloba (a) cefepima e (b) magai^ nina (2) pode ser utilizada para tratar infecções causadas por Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter - 32 - clocae e Klebseilla penumonias. Num outro aspecto específico pode utilizar-se uma composição constituída por (a) cefepima e (b) pelo péptido C—13 do factor-4 das plaquetas humanas pa ra tratar infecções causadas por Escherichia coli. Ainda de acorco com um outro aspecto específico pode utilizar-se uma composição constituída por (a) cefepima e (b) análogos do péptido C—13 para tratar infecções causadas por Escherichia coli. De acordo com um outro aspecto muito específico pode utilizar-se uma composição constituída por: (a) ceftazidima aztreonamo ou imipenemo e (b) magainina 2 para tratar infecções causadas por Escherichia coli. Ainda de acordo com um outro aspecto bastante específico podem utilizar-se composições constituídas por: (a) aztreonamo e (b) o análogo G do péptido C—13 para tratar de infecções causadas por Escherichia coli.

5.2. APLICAÇÕES E MÉTODOS DE OTXLIZAÇÂO A presente invenção também se refere a métodos para tratar uma infecção num paciente causada por um organismo susceptível a um antibiótico -laetâmico. De acor do com um aspecto da presente invenção, o método consiste na administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamen te eficaz de uma composição constituída por (1) um antibiótico jS -lactâmico que iniba o crescimento do organismo e (2) um oligopéptido catiónico durante um intervalo de tempo suficiente para inibir a infecção bacteriana. Definiram-se e discutiram-se na Secção 5.1. supra os antibióticos β-lacta- - 33 -

% micos e os oligopéptidos catiónicos. De acordo com um aspecto específico, a quantidade de j3 -lactâmico pode ser numa dosagem sub-inibidora. A presente invenção também se refere a um método para tratar específicamente uma infecção causada por bactérias Enterobacteriaceae administrando a um paciente uma composição que contenha uma quantidade de antibiótico β -laç tâmico que iniba o crescimento da Entercoacteriacae e pelo menos uma substância activa de membrana. De acordo com um as pecto da presente invenção, a quantidade de antibiótico β --lactâmico administrada produz uma concentração sub-inibidora do antibiótico no local ínfeccioso no paciente. A substância activa de membrana, tal como se expôs na Secção 5.1 supra , pode incluir soro e seus componentes e oligopéptidos ca tiónicos.

Num aspecto muito específico pode tratar--se uma infecção causada por Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter clocae e Klebseilla penumoniae administrando a um paciente uma quantidade eficaz de uma composição que contenhas (a) cefepima e (b) magainina 2. De acordo com um outro aspecto muito específico,pode tratar-se uma infecção causada por Escherichia coli administrando a um paciente uma quantidade eficaz de uma composição que contenha: (a) cefepima e (b) o péptido C-13 do factor-4 das plaquetas humanas. De acordo com outros aspectos muito específicos, pode tratar-se uma infecção causada por Escherichia coli com uma quantidade eficaz de uma composição que contenhas (a) ceftazidima, aztreonama ou imipenemo e (b) - 34 - magainina 2 ou com uma quantidade eficaz de uma composição na qual se encontra combinada: aztreonama e o análogo G do péptido C—13, tal como se descreverá adiante.

Podem utilizar-se as composições da presen te invenção para tratar diversas infecções bacterianas. Tal como se expôs na Secção 2 supra diversos grupos de indivíduos são especialmente sensíveis a infecções bacterianas. Nestes grupos encontram-rse incluídos os pacientes em estado crítico, os pacientes com cancros submetidos a quimioterapia e os pacientes submetidos a intervenções cirúrgicas. Estas composições podem ser utilizadas para tratar de um modo eficaz estes indivíduos.

Podem formular-se as composições da presente invenção de acordo com diversos modos de administração incluindo a administração sistémica, tópica ou localizada.

De acordo com um dos aspectos da presente invenção misturam--se os agentes activos uns com os outros, antes da administração. De acordo com um procedimento alternativo do método da presente invenção, podem administrar-se os ingredientes activos separadamente na mesma altura ou em intervalos de tempo separados.

As técnicas e formulações para administração das composições da presente invenção podem encontrar-se de um modo geral em Reminoton^ Pharmaceutical Sciences, Easton, P.A., Meade Publishing Co., última edição. Para administração sistémica dá-se preferência às injecções que podem ser por via intramuscular, intravenosa, intraperitoneal e subcutânea. Para injecção formulam-se as composições da - 35 - ;Β'!ΛΪ* presente invenção em soluções líquidas de preferência em tam pões fisiológicos compatíveis tais como o tampão de Hank ou de Ringer. Além disso, podem formular-se as composições numa forma sólida e redissolver-se ou suspender-se imediatamente antes de se utilizarem. Também se incluem as formas liofili-zadas. A Administração sistémica pode ser efectua da por via transmucosa ou transdérmica ou podem administrar--se as composições por via oral. Para administração transmucosa ou transdérmica utilizam-se na formulação agentes de pe netração adequados à barreira que se pretende atravessar.

Tais agentes de penetração são geralmente conhecidos na espe cialidade e incluem por exemplo sais biliares e derivados do ácido fusídico para administração transmucosa. Além disso, podem utilizar-se detergentes para facilitar a permeabiliza-ção. A administração transmucosa pode efectuar-se através de aspersões nasais, por exemplo, ou utilizando supositórios.

Para administração oràl formulam-se as composições sob formas convencionais para administração oral tais como cápsulas comprimidos e tónicos.

Para administração tópica formulam-se as composições da presente invenção sob a forma de unguentos, bálsamos, geles ou pomadas como é do conhecimento geral na especialidade. - 36 -

5.3. MÉTODOS IN VITRO PARA O RASTREIO DE COMPOSIÇÕES SINERGÉTICAS COM ANTIBIÓTICOS β-LACTÂMICOS A presente invenção também se refere a métodos aperfeiçoados para o rastreio in vitro de composições com actividade bactericida especialmente péptidos anfifíli-cos 0(-helicoidais. Os métodos são geralmente conhecidos na especialidade mas podem incluir também os componentes de uma cascata complementar funcional. Os métodos da técnica anterior incluiam difusão em disco, diluição em agar e procedimentos de micro e de macro-diluição de caldos. Pode modifi-car-se cada um destes métodos de modo a incluir uma cascata complementar activa. A inclusão de uma cascata complementar funcional possibilita o reconhecimento de determinadas composições que necessitam de um complemento activo para activi dade bactericida. Estas composições quando utilizadas in vivo são combinadas com o complemento após a administração, uma vez que o complemento faz parte do sistema imunitário dos mamíferos. Os métodos de rastreio in vitro da técnica an terior que não incluiam complementos activos não reconheciam estas composições, pelo que impediam a descoberta de diversas novas composiçõesactivas incluindo as composições da pre sente invenção.

Os componentes do complemento activo para utilização nos ensaios de rastreio in vitro da presente invenção podem ser adicionados sob a forma de soro. Sabe-se que o soro isolado de seres humanos, ratazanas, porcos da In

% dia, coelhos, etc. que se sabem conter elevados níveis de compleento activo e que podem ser utilizados nos ensaios da presente invenção. Dá-se preferência ao complemento humano. Também se pode proporcionar uma cascata complementar funcio nal com os seus diversos componentes e adicionaram-se ao meio de ensaio normalizado.

Após ter-se efectuado a descrição da presente invenção e de alguns dos seus aspectos fornecem-se os exemplos que se seguem com finalidades ilustrativas e sem que limitem de algum modo a presente invenção. 6. EXEMPLO: ACÇÃO SINÉRGICA DE CEFALOS- FORINAS E DO PÉPTIDO CATIÓNICO MAGAININA 2

No exemplo descrito na presente invenção demonstrou-se a acção sinlrgica de diferentes tipos de antibiótico j3 -lactâmicos e de magainina. Nesses ensaios quando se combinavam concentrações sub-inibidoras de antibiótico e de magainina as bactérias eram aniquiladas. Quando se administra apenas um dos agentes, os resultados de aniquilamento são poucos ou nenhuns. 0 segundo tipo de efeito sinérgico aplica-se à utilização destes dois agentes no soro humano.

Na presença de soro humano a combinação de magainina/antibió tico aniquila as bactérias a concentrações inferiores do que as observadas em tampão. Estes resultados indicam que estas composições podem ser úteis para tratamento in vivo de in-fecções causadas por bactérias. Isto representa um efeito s:i nérgico adicional. Este efeito sinérgico necessita de um faç tor labile ao calor. Identificou-se este factor como complemento do soro efectuando ensaios com soro especificamente desprovido de proteína C8 do complemento.

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1. REAGENTES E TAMPÕES

Utilizaram-se os seguintes tampões: tampão gelatina-veronal (GVB++) (Gewortz H. e outros, 19Ô5, em Manual of Clinicai Immunology, N.R. Rose e H. Freedman (eds) ASM, Washington, D.C.).· Além disso, adxcxonou-se dextrose a 0,1% ao tampão com uma fonte de carbono', A solução salina de fosfato tampão foi preparada no local. Os antibióticos na sua forma liofilizada foram fornecidos por Dr. Robert Kes-sler, Bristol-Myers Squibb Company, Wallingford, Conn. Sintetizou-se a magainina 2 no local a partir da sequinciaide aminoácidos publicada (Zasloff e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:(1987), 5479—5^83; Zasloff e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 85:0988), 910-913; e Zasloff, 1989 Patente de invenção norte-americana n2 4810777).

6.1.2. ESTIRPES BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTURA

Obteve-se a Escherichia coli ATCC25922 que se utilizou na maioria dos ensaios a partir do American Type Collection (ATCC). Outras estirpes de E. coli foram a A011 obtida no Harborbiew Medicai Center, Seattle, WA e Η16 obtida no Walter Reed Army Inst. of Research, Dept. of Bacterial 1' - 39

S tt

Diseases., Washington, D.C.. Além disso, examinou-se a Klebsiella penumoniae estirpe ATCC 13883 e um Enterobaoter cloaoae obtido no Veterans Administration Hospital, Seattle, WA. Examinaram-e as estirpes quanto à sua pureza, correcta identificação e depois armazenaram-se a -70QC. Desenvolveram -se todas as estirpes em AMH (Mueller Hinton Ajustado)(Jones^ e outros, 1985, em Manual of Clinicai Miorobiology, E.H. Lennette (ed.), ASM, Washington, D.C.).

6.1.3. SORO

Obteve-se o sangue de 5 voluntários saudáveis e deixou-se coagular à temperatura ambiente durante 1 hora. Após 20 minutos adicionais de incubação a C centri-fugou-se o sangue durante 15 minutos a 1500 x g. Removeu-se o soro e agregou-se, adicionou-se ácido etilenodiaminotetra-cético (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a uma con centração de 10 mM e armazenou-se o soro a -702C em pequenas quantidades, tal como o soro humano normal sedimentado (PNHS). Pouco tempo antes de ser utilizado descongelaram-se os soros e adicionou-se uma parte de CaCl2 0,1 M para 9 par tes de soro ou alternativamente descongelou-se o soro sem a adição de EDTA e utilizou-se sem a adição de CaCl^· Conser-vou-se o soro em gelo até ser misturado com a bactéria para o ensaio bactericida com soro. Quando se considerou indicado inactivou-se o complemento do soro por aquecimento a 56-C du rante 30 minutos. - 40

6.1.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBIDORA MÍNIMA (MIC) MIC representa a menor concentração de a-gente antimicroplano para a qual ocorre uma inibição completa. Determinaram-se as MIC de acordo com o método de diluição em placa utilizando AMH (Manual of Clinicai Microbiology Fourth Edition, Lennette, E.H. Ed. in Chief, ASM. 1985.pps 972-977). Efectuaram-se pelo menos três determinações diferentes para cada antibiótico e para cada estirpe.

6.1.5. ENSAIO BACTERICIDA COM SORO

Desenvolveram-se bactérias inoculadas a partir de culturas efectuadas durante a noite e que se desenvolveram até à fase exponencial média com ou sem antibi£ tico (Absorvância a 660 nm 0,35 a 0,5; aproximadamente 2-3 x 8 . x 10 células/ml para células desenvolvidas com cefepima e q 9 x 10 células/ml para células desenvolvidas sem cefepima). Diluiram-se as células sem lavagem a 1 x 10^ células/ml em tampão gelatina-veronal (GVB++) e adicionou-se 0,05 ml ao soro numa ampola Eppendorf de 1,5 ml. As células bacterianas que se tinham desenvolvido previamente em antibiótico também foram diluídas em GVB++ contendo a mesma concentração de antibiótico. Quer o soro normal humano agregado (PNHS) ou PNHS inactivado foram preparados anteriormente por diluição de uma concentração apropriada em 0,2 ml de GVB++. Os antibióticos ou magaininas quando presentes foram adicionados à ✓

mistura de soro antes de se adicionarem as bactérias. A mistura total reaccional era de 0,25 ml. Determinou-se o número de bactérias adicionadas ao soro adicionando 0,05 ml da suspensão bacteriana a um tubo contendo apenas GVB++ que se colocou em placas no início do ensaio. Depois efectuou-se a ro tação das misturas reaccionais a 37eC até 3 horas. Removeram -se amostras (25 ,μΐ) a determinados intervalos de tempo para se efectuar a análise de contagem das placas. Determinou-se o número de unidades que formavam as colónias após a incubação durante a noite em agar de tripticase de soja. Determi-naram-se as unidades que formavam as colónias em triplicado e determinou-se a sua média.

6.2. RESULTADOS 0 efeito da magainina 2 (MGN 2) e de cefe-pima (um antibiótico da familia das cefalosporinas) estudou--se em tampão. Tal como se indica na Figura 1 a associação de cefepima e de 100 yg/ml de MGN 2 proporcionou um aniquilamento superior a 1,5 log. Observou-se um aniquilamento inferior a 0,3 1 ogq quando se adicionou apenas cefepima. Além disso, não se observou um aniquilamento significativo com a-penas 100 jug/ml de MGN 2. No entanto, observou-se 3 logs (99,9/6) de aniquilamento bacteriano quando se incubaram as bactérias com 200 jug/ml de MGN 2. Esta observação aumenta os dados de Zasloff, uma vez que identifica uma associação si-nérgica. 0 efeito de MGN 2 sobre as bactérias não - 42 tratadas (bactérias não tratadas com cefepima) e das bactérias alteradas com cefepima também foi examinado na presença de 40¾ do soro humano nprmal sedimentado (PNHS) (ver Figura 2). Quando se adicionavam as bactérias não tratadas ao soro não se observava o aniquilamento significativo por MGN. Isto contrastava com as observações prévias em tampão em que 200 Jig/ml de MGN 2 aniquilavam completamente a estirpe bacteria-na (comparar Figuras 1 e 2). Quando se examinou o aniquilamento das bactérias não tratadas verificou-se claramente que PNHS bloqueava a acção de MGN 2. (e de MGN 1, dados não apresentados). No entanto, quando se examinaram as bactérias alteradas com cefepima verificou-se que o aniquilamento por MGN se encontrava intensificado pela presença de PNHS. Obsei? vou-se o aniquilamento por MGN a 25 jjig/ml em PNHS, aniquilamento esse que não tinha sido observado a esta concentração em tampão. Deste mod, verifica-se que PNHS bloqueia a acti-vidade bactericida de MGN 2 sobre as bactérias não tratadas e intensifica a actividade bactericida de MGN nas bactérias alteradas com cefepima.

Para se determinar se era um factor lábile ao aquecimento ou um factor estável ao aquecimento em PNHS que era responsável pelo efeito sinérgico entre a cefepima e MGN 2, examinou-se o aniquilamento em PNHS que havia sido aquecido até 55SC durante 30 minutos para inactivar o comple mento do soro, soro inactivado e soros activos. Quando se examinaram as bactérias não tratadas mais uma vez se observou pouco ou nenhum aniquilamento com ou sem 100jig/ml de MGN (ver Figura 3). Quando se examinaram as bactérias alte- radas com cefepima e inactivação dos soros pelo calor anulou totalmente o aniquilamento por MGN/cefepima observado nos s£ ros activos (ver Figuras 3 e 4). Este ensaio demonstra de um modo claro que quando se examina o aniquilamento em PNHS é necessário um facto lábile ao aquecimento em PNHS (provavelmente complemento) para o aniquilamento por MGN das bacté -rias alteradas com cefepima.

Determinou-se que a natureza do factor lábile ao aquecimento era complemento de soro. Examinou-se a capacidade das magaininas para aniquilarem a E. coli de ATCC 25922 alterada com cefepima e não tratada nos soros dos seres humanos que se encontravam espeeificamente desprovidos de proteína C8 de complemento. Quando este componente da ca£ cata complementar se encontrava ausente do soro não se obser vou aniquilamento por magainina das bactérias (Figura 5). No entanto, quando se adicionou C8 purificado em concentrações fisiológicas (50 jig/ml) observou-se um aniquilamento significativo. Além disso, o aniquilamento de E. coli alterada com cefepima ocorreu a concentrações significativamente inferiores à das magaininas necessárias para aniquilar as bactérias não tratadas.

Também se estudou os efeitos de diferentes antibióticos em soro humano normal agregado. Desenvolveram--se previamente as bactérias e ensaiaram-se a 1/32, 1/16 e 1/8 de MIC para cada antibiótico examinado. Adicionaram-se as bactérias aos dois conjuntos de tubos contendo ambos 40 % de soro humano normal agregado e 200 jag/ml de magainina 2 ou não contendo magainina. Tal como se indica na Figura 6 o antibiótico β -lactâmico imipenemo mostrou-se sinérgico com a 44 - magainina 2 mas o mesmo não aconteceu com a amicacina, um a-minoglicósido, e com ciproflaxacina, uma quinolina que se mostraram sinérgicas. Além disso, a cefepima, a aztreonama e

a ceftazidima que são todos antibióticos de tipo lactâmi co mostraram-se sinérgicas com as magaininas.

Estudou-se as quantidades de aniquilamento efectuadas pela magainina/cefepima contra diversas bactérias. As bactérias estudadas incluíam a E. coli, estirpe A645; a E. coli, estirpe A011, a E. coli, estirpe H16, E. clocae, e K. penumoniae. Desenvolveram-se as células bacterianas até à fase exponencial média com ou sem 1/4 de MIC de cefepima. Adicionaram-se as bactérias a dois conjuntos de tubos que continham ambos 40$ de soro normal agregado e/ou .200 jig/ml de magainina 2 ou não continham magainina.

Tal como se indica na Figura 7 as cinco e£ tirpes bacterianas demonstraram algum efeito sinérgico com as magaininas. Quando MGN se encontrava presente verificou--se um aumento significativo na quantidade de aniquilamentos em comparação com os aniquilamentos efectuados apenas por MGN ou cefepima. 0 acréscimo sobre o aniquilamento efectuado pela cefepima era de aproximadamente 1 log.

Também se estudou o efeito da associação magainina/cefepima sobre o aniquilamento de Pseudomonas aeruginosa. Tal como anteriormente se referiu quando a magai nina se encontrava presente verificava-se um aumento significativo na quantidade de aniquilamentos em comparação com o efectuado apenas com MGN ou apenas com cefepima. - 45 -

7. EXEMPLO: ACÇÃO SINÉRGICA DAS CEFALOSPORINAS E DO PÉPTIDO CATIÓNICO C-13 DO FACTOR 4 DAS PLAQUETAS HUMANAS

No exemplo aqui descrito demonstra-se a acção sinérgica do antibiótico β-lactâmico, uma cefalos-porina, e do péptido C-13 do factor 4 das plaquetas humanas (HPF-4). Nestes ensaios concentraçQes sub-inibidoras de ce-falosporina e do péptido C-13 do factor 4 das plaquetas humanas em associação aniquilam as bactérias. Quando se administra apenas um dos agentes os resultados de aniquilamento são pequenos ou nulos. Efectuaram-se estes ensaios em soro humano normal a 40?6. 0 efeito sinérgico no soro necessita de um factor lábile ao calor, uma vez que a inactivação por a-quecimento moderado do soro anula totalmente qualquer acção sinérgica.

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS 7-1.1. REAGENTES E TAMPÕES

Utilizaram-se os seguintes tampSes: tampão gelatina-veronal (GVB++) (Gewortz H. e outros, 1985 em Manual of Clinicai Immunology, N.R. Rose e H. Freedman (eds.) ASM, Washington, D.C.). Além disso, adicionou-se 0-,1/6 de dex trose ao tampão como fonte de carbono. Preparou-se no local a solução salina de fosfato tampão. Obtiveram-se os antibióticos sob a forma liofilizada, tal como anteriormente se referiu. Sintetizou-se o péptido C-13 de PF-4 no local a par- - 46 tir da sequência de aminoácidos publicada (Maione et al., Science,247:(1990), 77-80). Também se sintetizou o péptido C—13 de PF-4 no local de acordo com técnicas normalizadas de fase sólida.

7.1.2. ESTIRPES BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTURA

Utilizou-se neste ensaio a Escherichia coli ATCC 25922 obtida na American Type Culture Collection (ATCC). Examinou-se esta estirpe quanto à sua pureza, cor-recta identificação e depois armazenou-se a -702C. Desenvol-veu-se em AMH.

7.1.3. SORO

Obteve-se o sangue a partir de cinco volun tários saudáveis e deixou-se coagular à temperatura ambiente durante 1 hora. Depois durante mais 20 minutos de incubação a 42C centrifugou-se o sangue durante 15 minutos a 1500 x g. Removeu-se o soro e agregou-se e armazenou-se a -702C em pequenas quantidades (PNHS). Pouco tempo antes de se utilizar descongelara-se os soros e conservaram-se em gelo até se mi£ turarem com as bactérias para um ensaio bactericida com soro. Quando se considerou adequado inactivou-se o complemento do soro por aquecimento a 56sc durante 30 minutos.

7.1.4. - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBIDORA MÍNIMA (MIC)

Determinaram-se as MIC utilizando um método de diluição de microdiluição em placa utilizando AMH (Manual of Clinicai Microbiology, Lennette, E.H.Ed. em Chief, ASM., 4^ edição, 1985 pp 972-977). Efectuaram-se pelo menos três determinações diferentes com cada um dos antibióticos para cada estirpe.

7.1.5. EMSAIO BACTERICXDA COM SORO

Desenvolveram-se as bactérias inoculadas a partir de culturas durante a noite até à fase exponencial mé dia com ou sem absorvância de antibióticos a 660 nm entre 0,35 e 0,5; apenas se desenvolveram aproximadamente 2-3 x 8 . , x 10 celulas/ml com cefepima). Diluiram-se as células sem 4 se ter efectuado qualquer lavagem para 1 x 10 células/ml em tampão gelatina-veronal (GVB++) e adicionou-se 0,05 ml ao soro numa ampola Eppendorf de 1,5 ml. Também se diluíram as células bacterianas que se tinham previamente desenvolvido em antibiótico em GVB ++ contendo a mesma concentração de an tibiótico. Tinha-se preparado anteriormente tanto PNHS como PNHS inactivado pelo calor diluindo até à concentração ade-quada.em 0,2 ml de GVB ++. Os antibióticos ou as magaininas quando se encontravam presentes foram adicionados à mistura de soro antes da adição das bactérias. A mistura reaccional total era de 0,25 ml. Determinou-se o número de bactérias /

- 48 -V adicionado ao soro adicionando 0,05 ml de uma suspensão de bactérias a um tubo contendo apenas GVB ++ e colocando-os em placas no início do ensaio. Depois agitou-se rotacionalmente as misturas reaccionais a 372C durante até três horas. Removeram-se amostras (25 /il) a determinados intervalos para se efectuar a contagem em placa. Determinou-se o número de uni^ dades que formavam colónias após ter-se incubado durante a noite em agar de tripticase de soja. Determinaram-se as unidades que formavam as colónias em triplicado e determinou-se a sua média.

7.2. RESULTADOS

Estudou-se o efeito bactericida do péptido C-13 obtido a partir do factor-4 das plaquetas humanas. Com base na sequência de aminoácidos deste péptido catiónico ele formaria uma hélice oC-amfipática nos meios hidrófobos. Investigou-se a capacidade deste péptido para aniquilar a E. coli em soro humano normal agregado (Fig. 8). Adicionaram-se células bacterianas que foram desenvolvidas com 1/5 de MIC de cefepima ou sem cefepima a soro humano normal agregado a 40J activo ou inactivado pelo calor. Tal como se indica na Figura 8 este péptido era capaz de aniquilar de um modo significativo as bactérias alteradas por cefepima quando os so ros não haviam sido inactivados pelo calor. 0 péptido não é capaz de aniquilar as bactérias que não foram desenvolvidas em cefepima. Além disso, não aniquila as bactérias alteradas com cefepima quando o soro tinha sido inactivado pelo calor. Estes dados demonstram claramente que este péptido aniquila- - 49 / / y.

V ria as bactérias de um modo sinérgico com um antibiótico β--lactâmico e soro activo.

Também se estudou o efeito bactericida do péptido C—13 modificado obtido a partir do factor-4 das plaquetas e que possuía a seguinte sequência:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Pro-Lys-Ile-Ile-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu--Glu-Ser(seq.I.D.#2)

Quando se adiciona esta sequência a bactérias simultaneamente com cefepima, na presença de soros humanos normais, observa-se um efeito sinérgico pequeno ou nenhum. Isto deve-se ao carácter 0(-helicoidal reduzido da s£ quência de C-13 modificado, uma vez que se sabe que a proli-na provoca a ruptura das hélices o^.

8. EXEMPLO: EFEITO PROTECTOR IN VIVO DE ASSOCIAÇÕES DE MâGAIHINA E DE CEFEPIMA

Verificou-se a capacidade das combinações de magainina e de cefepima para protegerem ratos de uma in-fecção letal de E. coli. Tornaram-se os ratos neutropénicos por injecção de Cytoxan e depois estimularam-se com E. coli. Dividiram-se então os ratos em quatro grupos diferentes: (1) ratos a quem não se proporcionou qualquer tratamento; (2) ratos aos quais se administrou magainina 2 ou apenas o péptido C-13; (3) ratos aos quais se administrou apenas cefe_ pima; (4) ratos aos quais se administrou uma associação de magainina 2 ou com o péptido C-13 ou com cefepima. Observaram-se os ratos durante 10 dias a seguir à infecção e regis-tou-se o número de mortes. Os resultados destes estudos demonstraram claramente que quer um não tratamento, o tratamen to com magainina, o tratamento com o péptido C-13 ou o tratamento apenas com cefepima eram insuficientes para proteger os ratos da morte. Uma associação de magainina e de cef£ pima ou do péptido C-13 e de cefepima originou uma protecção significativa dos ratos. Quando se observou a amicacina, um aminoglicósido, de acordo com ensaios similares não se verificou qualquer actividade bactericida in vitro ou qualquer protecção in vivo.

8.1. MATERIAIS E MÉTODOS

8.1.1. REAGENTES E TAMPÕES

Preparou-se a solução salina de fosfato tampão no local. Obteve-se a cefepima na sua forma liofili-zada, tal como anteriormente se referiu. Sintetizou-se o pé£ tido C-13 e a magainina 2 no local a partir da sequência de aminoácidos publicada.

8.1.2. ESTIRPES BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTURA

Obteve-se a E. coliHlé a partir de Walter Reed Army Institute os Research Department of Bacterial Diseases, Washington, D.C.. Examinou-se esta estirpe quanto - 51 à sua pureza, correcta identificação e depois armazenou-se a -702C. Desenvolveram-se as bactérias em caldo AMH.

8.1.3. ENSAIOS IN VIVO

Tornaram-se ratos neutropénicos cinco dias antes de se estimularem com bactérias. Induziu-se a neutro- penia por via subcutânea injectando 250 mg/kg de Cytoxan 4 (Ciclofosfamida).Estimularam-se os ratos com 2 x 10 E. coli H16. 0 estímulo foi efectuado por injecção intraperitoneal. Depois dividiram-se os ratos em quatro grupos: (1) ratos aos quais se adminsitraram injecções de PBS 1 hora e 3,5 horas após o estímulo bacteriano; (2) ratos aos quais se administraram um total de 2 mg de magainina 2 por rato em 2 injecções 1 hora e 3,5 após os estímulos de I mg por rato em PBS; (3) ratos aos quais se proporcionaram um total de 0,2 mg/kg de cefepima em duas injecções 1 hora e 3,5 horas antes do e£ tímulo bacteriano de 0,1 mg/kg de cefepima em PBS; (4) ratos aos quais se proporcionaram um total de 2 mg de magainina 2 por rato e 0,2 mg/kg de cefepima em duas injecções administradas 1 hora e 3,5 horas após o estímulo bacteriano de 1 mg de magainina 2 por rato e de 0,1 mg/kg de cefepima. Administraram-se todas as injecções de magainina e de cefepima por via intramuscular. Observou-se a sobrevivência dos ratos durante um período de pelo menos 10 dias. - 52

8.2. RESULTADOS

Quando se examinaram os ratos para se determinarem os sobreviventes após o estímulo bacteriano obtiveram-se os seguintes resultados: no grupo 1 em que apenas se tinha administrado PBS, 1 em cada 15 ratos sobreviveu; no grupo 2 em que se tinha administrado apenas magainina 2, 1 em cada 15 ratos sobreviveu; no grupo 3 em que apenas se tinha administrado cefepima, 1 em 20 ratos sobreviveu; e no grupo 4 em que se tinha administrado uma combinação de magai nina 2 e de cefepima, 11 em 20 ratos sobreviveram. 0 aumento de ratos sobreviventes aos quais se tinha fornecido a combinação representa um aumento significativo (p 4L 0,05 ensaio exacto de Fisher) na protecção de cada um deles no tratamento ou tratamento com cefepima ou apenas com magainina 2.

Além disso, efectuaram-se ensaios de protecção similares com o péptido C—13 de PF-4. Nestes ensaios, além dos grupos 1 e 3 anteriormente referidos, modificou-se o grupo 2 de modo a conter o péptido C-13 em vez de magainina 2 e o grupo 4 de modo a conter a associação de C-13 e de cefepima. Os resultados deste ensaio foram os seguintes: nos grupos 1 e 3 os resultados foram idênticos aos anteriormente descritos; no grupo 2 em que se tinha administrado apenas C-13, 1 em cada 10 ratos sobreviveu; no grupo 4 em que se tinha administrado uma associação do péptido C-13 e de cefepima, 4 em cada 10 ratos sobreviveram. Isto representa uma malhoria em relação à sobrevivência dos ratos aos quais se tinham administrado associações do péptido C-13 e de cefepi ma. - 53

Também se examinaram in vivo associações de amicacina, um aminoglicósido, e de magainina 2. Após ter -se determinado a MIC de amicacina e se ter dividido os ratos em quatro grupos similares aos anteriormente referidos obtiveram-se os seguintes resultados: Quando se administrou apenas PBS em oito ratos não sobreviveu nenhum; quando se ad ministrou magainina 2 (duas injecções de 1 mg/rato) não sobreviveu nenhum em nove ratos; quando se administrou amicacina (duas injecções de 3 mg/kg) três em 10 ratos sobreviveram e quando se administrou magainina 2 e amicacina (nas dosagens anteriormente referidas) 1 em 10 ratos sobreviveu. 9. EXEMPLO: SÍNTESE DE ANÁLOGOS DO PÉPTIDO C-13

Sintetizaram-se diversos análogos do pép-tido C-13 (Quadro 1) de acordo com técnicas de fase sólida. Conceberam-se os análogos de modo a alterar os parâmetros f^ sicos do péptido C-13 em campos específicos. Determinadas al terações dos parâmetros físicos afectavam a interacção do a-nálogo do péptido com a membrana bacteriana. Descobriu-se que prolongando a molécula de modo a adicionar mais um anel OC -helicoidal e alterando a densidade da carga positiva ao longo das hélices se alterava a actividade sinérgica com a cefepima.

9.1. MATERIAIS E MÉTODOS 9.1.1. REAGENTES E MÉTODOS

Sintetizou-se a magainina 2, a cecropina e - 54 - os análogos do péptido C—13 de acordo com técnicas de síntese de fase sólida (Merrifield, R.B. J.Am.Chem.Soc.,85:(1963) 2149-2154 num sintetizador de péptidos, Modelo 430 A, doc2 Applied Biosystems utilizando uma protecção baseada em Boc/ /benzilo. Tratou-se a resina associada ao péptido de acordo com procedimentos de baixa/elevada HF (Tam, J.P. e outros, J.Am.Chem.Soc., 105i(1983) 6402-6455) ou de acordo com procedimentos de alta HF com 90# de HF/10# de anisole e depois clivou-se. Purificou-se o péptido desprotegido por cromato-grafia líquida de alta resolução (HPLC) numa coluna Dynamax C-8 (Rainin). Caracterizaram-se os péptidos purificados de acordo com HPLC analítica normalizada e métodos de análise de aminoácidos. QUADRO 1 ANÁLOGOS DO PÉPTIDO C-13 SEQUÊNCIA (ÍÚMERO I.D. NÚMERO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS C-13 1 Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu -Leu-Glu-Ser B 3 Pro-Leu-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ile-Lys-Lys-Glu -Leu-Leu-Ser W 4 Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Pro-Ile-Lys-Lys-Pro Leu-Glu-Ser H 5 Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Lue-Gly F 6 Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu QUADRO 1 (Continuação) ANÁLOGOS DO PÉPTIDO C-13 NÚMERO SEQUÊNCIA I.D. NÚMERO SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS G 7 -Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys- X Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly dAla-d-Leu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu- II dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dSer-dAla- -dLys-dLys-dLeu-Gly Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn- KK 8 Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys- HH 9 Leu-Leu-Lys-Lys_Ala-Lys-Lys-Leu-Gly Ala-Leu-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Ar*g- - Leu-Leu-Arg-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Gly P 10 Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys- N 11 Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu- J 12 Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys- Leu-Gly Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys- Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser- Ala-Lys-Lys-Leu-Gly

10. EXEMPLOΪ RASTREIO IN VITRO DE ANÁLOGOS

DO PÉPTIDO C-13 QUANTO Ã SUA ACTIYIDADE BACTERIANA E A SUA ACTIYIDADE HEMOLÍTICA

Ensaiaram-se os análogos produzidos por síntese do péptido C-13 do factor-4 das plaquetas quanto à sua actividade sinérgica com cefepima em ensaios bacterici-das e hemolítieos in vitro.

Os péptidos que possuíam pelo menos cerca de 11 a 18 aminoácidos de comprimento, formando cerca de 4 ou 5 anéis 0(-helicoidais, reduziam a quantidade do péptido necessária para aniquilar metade das células bacterianas segundo um factor compreendido entre 8 e 80.

Os análogos peptídicos que rompiam a natureza 0C-helicoidal do péptido ou a sua amfifilicidade reduziam ou obviavam qualquer actividade bactericida. A adição de aminoácidos para formar um quinto anel O^-helicoidal melhorou a actividade bactericida. Esta actividade foi poste-riormente melhorada alterando a densidade de carga positiva ao longo da hélice.

Descobriu-se que os análogos do péptido C-13 H, F e, em menor extensão, G, X e L proporcionavam aniquilamentos das células bacterianas mais aperfeiçoados quando utilizados em associação com antibiótico. Descobriu-se que os análogos H, F, G, X, II,KK, N e J necessitavam de com plemento ou proporcionavam um maior aperfeiçoamento nos resultados bactericidas quando se encontrava presente complemento no meio de rastreio. Verificaram-se aumentos na activi dade hemolítiea dos análogos do péptido C-13 quando se aumen tou o comprimento do péptido no sentido amino ou quando a ar ginina substituía a lisina nas posições 4, 5, 8, 9, 12, 15 e 16.

10.1. MATERIAIS E MÉTODOS

10.1.1. REAGENTES E TAMPÕES

Utilizaram-se os seguintes tampões: tampão gelatina-veronal (GVB ++ tal como anteriormente se descre -veu). Além disso, adicionou-se 0,1¾ de dextrose ao tampão como uma fonte de carbono. Preparou-se a solução salina de fosfato de tampão no local. Obtiveram-se os antibióticos, isto é, cefepima, na sua forma liofilizada, tal como anteriormente se descreveu.

10.1.2. ESTIRPES BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTURA

Na maioria dos ensaios utilizou-se a Esche richia ooli estirpe ATCC 25922 que se obteve na American Type Collection. Outras estirpes de E. coli utilizadas foram a AO11 obtida no Harboview Medicai Center, Seattle, WA, a H16 isolada em cápsula K1 do Walter Reed Army Inst. of Research, Washington, D.C., a E. coli A645AP originada em laboratório que é uma vesão desenvolvida num animal de ATCC 25922, a E. coliA645AP (pBR322) é a E. coli A645AP contendo o plasmídeo pBR322 que confere resistência aos antibióticos - 58 - 58 / y · *<-tu β -lactâmicos e que se gerou em laboratório. Obteve-se a Klebsiella penumonia C329 (ATCC 13883) na American Type Col-lection, assim como as Pseudomonas aeruginosa estirpe A366 (ATCC 27317). Obteve-se o Staphyloooccus aureus estirpe A546 no Harborview Medicai Center, Seattle, WA. 0 Enterobacter aerogenia estirpe G 438 foi obtido no Veterans Administra-tion Hospital, Seattle, WA e o Streptococcus agarlactie estir pe 1334 foi obtido a partir de Childrens Orthopedic Hospital Seattle, WA. A Pseudomonas aeruginosa estirpe M990 resisten te ao antibiótico obteve-se a partir de uma cultura em laboratório. Examinaram-se as estirpes quanto à sua pureza, cor-recta identificação e depois armazenaram-se a -709C. Efectua ram-se culturas semanalmente a partir das reservas de bactérias congeladas de modo a evitar subculturas repetitivas. Oe_ senvolveram-se todas as estirpes em caldo de Mueller Hinton Ajustado (AMH) contendo 50 /ig/1 de CaC^ e 25 ml/1 de MgCl^.

10.1.3. ENSAIO BACTERICIDA COM SORO

Desenvolveram-se todas as estirpes de bactérias inoculadas a partir de culturs efectuadas durante a noite até à fase exponencial média com ou sem 1/4 ou 1/5 de MIC de cefepima (Absorvência a 660 nm entre 0,35 e 0,5; apro 8 ximadamente 2-3 x 10 células/ml de células desenvolveu-se 8 com cefepima e 9 x 10 células/ml de células desenvolveu-se _ 21 sem cefepima). Diluiram-se as células sem lavagem a 5 x 10 células/ml de tampão gelatina-veronel (GVB ++) e adicionou--se 0,05 ml ao soro (ver Secção 7.1.3) numa ampola e Eppen- dorf de 1,5 ml. Para as células bacterianas previamente desenvolvidas em cefepima adicionou-se a mesma quantidade de cefepima que se encontrava presente durante o crescimento em ambas as preparações e examinaram-se quanto à sua actividade bactericida. Preparou-se quer o soro humano normal agregado quer o soro inactivado pelo calor antes de se efectuar a diluição para uma concentração apropriada em 0,2 ml de GVB++ . A cefepima, quando se encontrava presente, foi adicionada à mistura de soro antes da adição das células bacterianas. Di-luiram-se os péptidos em água desionizada para se efectuar uma solução de reserva os 2mg/ml e depois adicionou-se à ampola de reacção para proporcionar a concentração adequada. 0 volume total de reacção foi 0,05 ml. Determinou-se o número de bactérias adicionadas ao soro adicionando 0,05 ml de suspensão bacteriana a um tubo contendo apenas GVB++ e colocando-as em placa no início do ensaio. Depois agitaram-se rotativamente as misturas reaccionais a 372C durante tris horas. Removeram-se amostras (25 μΐ) a determinados intervalos para se efectuar a contagem em placa. Determinou-se o número de unidades que formavam colónias após incubação durante a noite com agar de tripticase de soja. Determinaram-se as unidades que formavam colónias em triplicado e determinou-se a sua média.

10.1.4. ENSAIO HEMOLÍTICO

Diluiu-se em PBS a totalidade de sangue ob_ tida a partir de voluntários saudáveis, para se obter uma concentração de glóbulos vermelhos de aproximadamente de

Q 6 x 10 células/ml.Efectuou-se uma suspensão dos péptidos em PBS para se obter uma solução de reserva de 2 mg/ml e adicio nou-se 100 ul da solução de reserva a 900 jil dos glóbulos vermelhos diluídos. Incubaram-se as células a 372C durante 45 minutos, centrifugaram-se a 1000.x g durante 5 minutos e depois removeu-se o sobrenadante.

Examinaram-se os sobrenadantes espectrofo-tometricamente a 541 nm. Leu-se a percentagem de hemólise numa curva normalizada preparada a partir de diluição em série de sangue diluído de 1:10 em água destilada. A diluição de 1:10 em água destilada representou 100% de hemólise. QUADRO 2 ACTIVIDADE BACTERICIDA (Π>5())1 E HEMOLÍTICA, IN YITRO, DOS OLIGOPÉPTIDOS CATIÓNICOS COM E. COLI A 645 (ATCC 25922) PÉPTID0 SEM NHS DEFEPIMA HI-NHS 1/4 CIM CEFEPIMA1 NHS Hl - NHS LISE DE RBC {%) (100 jig/ml) MGN2 •7200 >200 85 >200 1 C— 13 >200 >200 80 >200 <1 B >200 >200 >200 >200 ND3 w1 >200 >200 >200 >200 ND H > 100 >100 10 >100 1,5 F 70 >200 10 90 <1 QUADRO 2 (Continuação) ACTIVIDADE BACTERICIDA (ID^)1 E HEMOLlTICA, IN VITRO, DOS OLIGOPÉPTIDOS CATIÕNICOS COM E. COLI A 645 (ATCC 25922) PÉPTIDO SEM CEFEPIMA NHS HI-NHS 1/4 CIM CEFEPIMA1 NHS HI-NHS LISE DE RBC ($) (100 ^ig/ml) G 4 > 200 1 > 200 <1 X 4 > 50 1 > 50 <1 HH2 > 50 >50 >50 >50 3 n2 1 47 <1 43 <1 KK 1 >50 <1 >50 P 10 10 10 10 21 L 46 40 11 40 3 N 1 10 1 >2 7,5 J 1 >8 1 4 2,5 Cecropina 1 1 .25 .5 <1 IDçq - Representa a quantidade de péptido (jug/ml) necessária para reduzir em 50$ o número de bactérias. 2 1/5 MIC cefepima 7 J ND - Não Determinado. - 62

10.2. RESULTADOS

Ensaiou-se o efeito bactericida de diversos oligopéptidos eatiónicos com e sem antibiótico e com e sem complemento activo, incluindo as magaininas, as cecropi-nas, o péptido C—13 de HPF-4 e diversos análogos e derivados do péptido C-13 (Quadro 2). Além disso, monitorizou-se o potencial de toxicidade examinando a capacidade dos péptidos para efectuarem a lise dos glóbulos vermelhos humanos. Inicialmente examinaram-se dois aspectos diferentes da estrutura secundária. Os péptidos que continham substituições ami-nácidas que rompiam ou a natureza amfipática (análogo B) ou a natureza alfa-helicoidal (análogo W) da molécula mostraram -se inactivos em todas as condições de ensaio. Uma vez que a natureza alfa-helicoidal e amfipática do péptido era necessária para a actividade era todas as modificações subsequentes mantiveram-se estes parâmetros. Uma modificação que in-crporava um outro anel na hélice alfa por adição de cinco aminoácidos e conservava a natureza amfipática foi examinada (análogo H). Esta modificação potenciava especificamente o aniquilamento com cefepima em NHS. Verificou-se um aumento de oito vezes na actividade antimicrobiana (análogo H do pé£ tido) contra as bactérias alteradas com cefepima em NHS, embora não se observasse o aumento correspondente em HI-NHS ou contra as bactérias não tratadas. Uma alteração menor no aná logo H dos dois aminoácidos hidrófobos (análogo F) originou um leve aumento na actividade microbiana. Observou-se um aumento de dez vezes na actividade específica para as bactéri- - 63 jf r as alteradas com cefepima em NHS quando se substituiu um resíduo de ácido glutâmico no análogo F por lisina (análogo G)i Não se verificou um aumento correspondente da actividade an-timicrobiana com este péptido em HI-NHS ou quando se examinou este péptido contra as bactérias não tratadas. Além disso, não se observou qualquer acréscimo na lise do número de glóbulos vermelhos (RBC). 0 análogo peptídico G demonstrou que uma alteração numa carga única podia influenciar significativamente a actividade.

Prolongando a hélice com um outro anel por adição de cinco aminoácidos na extremidade amino (análogo J) não originava qualquer acréscimo adicional na actividade bac teriana. Esta modificação aumentava o número de lise de RBC. Isto pode indicar que os péptidos com número superior de anéis helicoidais são tóxicos. A análise in vitro da actividade antimicrobiana em NHS com cefepima originou um péptido (análogo G) com um aumento de 80 vezes a actividade antibac-teriana. Contrastando completamente com estas observações V£ rificou-se que não existia actividade antimicrobiana em HI--NHS ou contra as bactérias não tratadas. 0 exame posterior do análogo G revelou que a actividade bactericida se encontra dependente de NHS com outras estirpes bacterianas (Quadro 3). Estes dados também indicam que a actividade bactericida do análogo G com soros humanos normais pode ser intensi^ ficada pelo antibiótico num grau variável descendo da estirpe bacteriana. - 64 s *·»*» ACTIVIDADE TIDO C-13 QUADRO 3 BACTERIANA (Π>5())1 DO ANÁLOGO G DO PÉP-CONTRA DIFERENTES ESTIRPES BACTERIANAS ESTIRPE SEM CEFEPIMA NHS HI-NHS 1/4 CIM CEFEPIMA2 NHS HI-NHS % SOROS CIM H16 > 200 >200 15 100 40 1/4 C329 1 80 1 50 10 1/8 G438 1 45 1 45 10 1/4 A366 4 25 40 425 40 10 1/8 A011 2 80 2 80 10 1/4 A586 >200 >200 >200: >200 40 SL3 1334 >200 45 80 25 40 1/4 A645AP 1 70 1 80 10 1/4 A645AP2 1 70 ND 80 10 1/8 (pBR322) M0092 2 120 ND ND 20 1/8 1 IDgQ - Representa a quantidade de péptido (yg/ml) necessária para reduzir para 50% 0 número de bactérias. p CIM de estirpes resistentes ao antibiótico A645AP (pBR322) 1 ;ug/ml; CIM de M009 , 64 μβ/ml.

Determinou-se uma concentração sub-letal (SL) de cefepima - 65 - * por diluição do antibiótico em caldo e observando o crescimento ao fim de três horas.

11. EXEMPLO: EFEITO PROTECTOR IN VIVO DA ASSOCIAÇÃO DOS ANÁLOGOS DO PÉPTIDO C-13 E DE CEFEPIMA

Observou-se a capacidade das combinações do análogo do péptido C-13 de cefepima para protegerem os ratos contra uma infecção letal de E. ooli. Tornaram-se os ratos neutropénicos através de uma injecção de ciclofosfami-da e depois estimularam-se com E. coli. Depois dividiram-se os ratos em quatro grupos: (1) ratos aos quais se administrou PBS; (2) ratos aos quais se administrou apenas análogos do-péptido C-13; (3) ratos aos quais se administrou apenas ce fepima; e (4) ratos aos quais se administrou uma combinação de análogos do péptido C-13 e de cefepima. Dez dias após a infecção observaram-se os ratos e registou-se o número de mortes. Os resultados destes estudosdemonstraram claramente que nenhum tratamento, quer o tratamento apenas com cefepima quer o tratamento com os análogos G, X, II e F do péptido C-13 se mostraram insuficientes para proteger os ratos da morte. Uma associação dos análogos do péptido C-13 com cefepima originou uma protecção significativa dos ratos. - 66

11.1. MATERIAIS E MÉTODOS

11.1.1. REAGENTES E TAMPÕES

Preparou-se a solução salina de fosfato tampão em laboratório. Obteve-se cefepima através de Dr. Ro-bert Kessler, Bristol-Myers Squibb Company, Wallingford, Conn. na sua forma liofilizada. Sintetizou-se a cecropina em laboratório a partir da sequência publicada. Adquiriu-se a ciclofosfamida em Mead Johnson sob o nome comercial Cytoxan.

11.1.2. ESTIRPES BACTERIANAS E CONDIÇÕES PE CULTURA

Obteve-se a E. coli H16 no Walter Reed Ar-my Inst. of Research, Washington, D.C. e a E. coli A645AP foi gerada por desenvolvimento no animal da E. coli ATCC 25922 em laboratório. Examinaram-se as estirpes quanto à sua pureza, identificação adequada e depois armazenaram-se a -70sc.Efectuaram-se semanalmente culturas a partir das reser vas bacterianas congeladas para evitar subculturas repetitivas. Desenvolveram-se todas as estirpes em caldo de Mueller Hinton Ajustado contendo 50 mg/1 de CaClg e 25 mg/1 de MgCl2.

11.1.3. ENSAIOS IN VIVO

Tornaram-se ratos machos CrL:CF1 neutropé-nicos 5 dias antes do estímulo bacteriano. Induziu-se a neu- - 67 - tropenia por injecção subcutânea de 250 mg/kg de Cytoxan (ci^ clofosfamida). Estimularam-se os ratos ou com 2 x 10^ E.coli H16 (Quadro 4) ou com 5 x 10 A645AP por injecção intraperi toneal. Dividiram-se os ratos em quatro grupos de tratamento (1) PBS; (2) análogo do péptido C-13 (15 mg/kg)5 (3) cefe- pima (0,1 mg/kg); (4) uma associação de tratamento de cefe-pima e do análogo do péptido C-13 (0,1 mg/kg de cefepima e 15 mg/kg do análogo do péptido C-13) que se tinham combinado antes de se efectuar a injecção. Todas as injecções foram efectuadas em PBS (0,2 ml) e foram administradas por via intramuscular tendo sido ministrada cada uma das injecções num e noutro membro inferior, 1 e 3,5 horas após o estímulo bac-teriano. Observou-se o número de ratos sobreviventes durante 10 dias e analisaram-se os resultados de acordo com o ensaio Exacto de Fisher.

11.2. RESULTADOS

Examinou-se 0 efeito dos análogos do péptido C—13 e de cefepima para protegerem os ratos de uma infec-ção sistémica causada pela E. coli Η16 (Quadro 4). Tanto o PBS, como a cafepima ou os análogos G, X, II e F do péptido C-13 quando administrados sozinhos não foram capazes de proporcionar um nível significativo de protecção. Como contraste verificou-se um aumento significativo (p ^0,05, teste Exacto de Fisher) no número de ratos sobreviventes quando se lhes forneceu a associação de cefepima e do análogo G ou F do péptido C-13 por comparação com 0 tratamento efectuado - 68

apenas com cefepima ou apenas com um análogo do péptido C-13 Além disso, efectuaram-se ensaios similares com cecropina dos quais não resultou um aumento significativo de protec-ção quando se utilizou apenas cecropina ou em associação com cefepima.

Além disso, ensaiaram-se de acordo com experiências similares a aztreonama e outros antibióticos. Estes antibióticos p-laetâmicos quando associados ao análogo G do péptido C-13 proporcionaram uma protecção estatisticamente significativa (p 0,05, teste Exacto de Fisher). Os resultados destes ensaios são os seguintes: quando se administrou apenas PBS em 5 ratos não sobreviveu nenhum; quando se administrou apenas aztreonama de 20 ratos sobreviveu 1; quando se administrou apenas o análogo G do péptido C-13 em 10 ratos não sobreviveu nenhum; quando se administrou aztreonama e o análogo G do péptido C-13 em 20 ratos sobreviveram 11.

Também se observou o efeito do análogo G do péptido C-13 em ratos neutropénicos com a E. coli estirpe A645AP não K1 (5,0 x 10 organismos). Quando se observaram os ratos para se verificar o número de sobreviventes após o estímulo bacteriano obtiveram-se os seguintes resultados: no grupo 1 em que apenas se tinha administrado PBS sobreviveram 3 ratos em 20; no grupo 2 em que apenas se havia administrado G não sobreviveu nenhum rato em 15; no grupo 3 em que havia administrado cefepima sobreviveram 3 ratos em 20; e no grupo 4 em que se tinha administrado G e cefepima sobreviveram 8 ratos em 15. 0 aumento do número de ratos sobreviven- - 69 - tes proporcionado pela associação mostrou-se novamente signjL ficativo (p ^0,05, teste Exacto de Fisher) e representa um melhoramento no número de sobreviventes sobre os péptidos ou os antibióticos administrados isoladamente. - 69 - QUADRO EFEITO DOS ANÁLOGOS DO PÉPTIDO C-13 E DE CEFEPIMA NA INFECÇÃO SISTÉMICA ORIGINADA PELA E. COLI Número de Sobre % de Sobre- Tratamento viventes/Total viventes PBS 2 / 25 8 cefepima 3 / 25 12 G 1 / 15 6.7 cefepima + G 11 / 20 55 X 1 / 18 5.6 cefepima + X 15 / 20 75 II 0 / 5 cefepima + II 3 / 10 30 F 0 / 10 cefepima + F 3 / 10 30 Cecropina 2 / 20 20 Cefepima+Cecropina 2 / 10 20 - 70 A descrição da presente invenção e as reivindicações em anexo não limitam de modo algum o âmbito da presente invenção aos aspectos específicos aqui referidos, uma vez que estes aspectos são apresentados a título ilustra tivo dos diversos aspectos da presente invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são considerados abrangidos pelo âmbito da presente invenção. 0 especialista verificará que será possível efectuarem-se diversas modificações à presente invenção, além das apresentadas e descritas. Estas modificações encontram-se também abrangidas pelo âmbito da presente invenção e das reivindicações em anexo. - 71

LISTA SEQUENCIAL (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE: Darveau, Riohard P.

Blake, James J.

Cosand, Wesley L.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR INFECÇÕES CAUSADAS POR ORGANISMOS SENSÍVEIS AOS ANTIBIÓTICOS -LACTÃMICOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) ENDEREÇO P/ CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Bristol-Myers Squibb Company, Patent

Department (B) RUA: 3005 First Avenue (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington

(E) PAÍS: USA (F) ZIP: 98121 (v) CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA INFORMÁTICO: (A) TIPO DE MEIO: disco flexível (B) COMPUTADOR: PC IBM Compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0 . Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL:

(A) N2 DO PEDIDO: US (B) DATA DE DEPÓSITO: 19-Fev.-1991 - 72 - 72 / % (C) CLASSIFICAÇÃO:

(vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR (A) Ne DO PEDIDO: US 07/484,020 (B) DATA DE DEPÓSITO: 23-FEV-1990 (viii) PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Poor, Brian W.

(C) REFERÊNCIA/N2 DE RECIBO: ON0O63A (ix) INFORMAÇÕES POR: (A) TELEFONE: 206/728-4800 (B) TELEFAX: 206/448-4775 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 13 arainoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: NÃO CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA - 73 /

(ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Pro Leu Tyr Lys Pro Lys Ile Ile Lys Pro Lys Leu Leu Glu Ser 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3ϊ

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Pro Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Lys Lys Glu Leu Leu Ser 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ: ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 13 aminoáeidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Pro Leu Tyr Lys Lys Pro Ile Lys Lys Pro Leu Glu Ser 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Ala Leu Tyr LyS“Lys He Ile Lys Lys Leu Leu Glu Sér Ala Lys 15 10 15

Lys Leu Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ala Ly 15 10 10

Lys Leu Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA - 75 ,/ * ·βπ~· «;>j2 f * (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ala Lys 15 10 15

Lys Ley Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERlSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoáeido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15

Lys Leu Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERlSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoáeido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Ser Ala Arg 15 10 15

Arg Leu Gly - 76 - (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Phe Ala Lys 15 10 15

Lys Phe Gly (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPdTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Lys Trp Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ser 15 10 15

Ala Lys Lys Leu Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos - 77 -

- 77 - / V --rÍCi:ae3® (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPÓTESE: CONFIRMADA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu 15 10 15

Leu Lys Ser Ala Lys Lys Leu Gly 20

Claims (78)

1. — Processo para a preparação de uma composição apro priada para tratar uma infecção causada por um organismo sensí vel a um antibiótico ji-lactâmico, caracterizado por se mistu rar (a) um antibiótico j&-lactâmico capaz de inibir o crescimento desse organismo e (b) um oligopeptido catiõnico.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se seleccionar o antibiótico ^-lactâmico entre o grupo constituído por penicilina, cefalosporina, carbapenem, Â9- f * .-sdBta* monobactama, cefamicina, piradizona e penem.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de o antibiótico jS-lactâmico ser uma cefa-losporina.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracte rizado pelo facto- de se seleccionar a cefalosporina entre o grupo constituído.por cefepiraa, cefotaxima e ceftazidima.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de o antibiótico p-lactâmico ser um car-bapenem.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracte rizado pelo facto de. o carbapenem ser imipenem.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de o antibiótico p-lactâmico ser uma monobactama .

8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracte rizado pelo facto de a monobactama ser aztreonama. 9.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte

% rizado pelo facto de se seleccionar o oligopeptido catiônico en tre o grupo constituído por magainina, cecropina, sareotoxina, uma proteína precursora mitocondrial, os seus fragmentos, análo gos e derivados.

10.- Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiônico ser uma magaini na. 11. » Processo de acordo com a reivindicação 10, carac . terizado pelo facto de se seleccionar a magainina entre o grupo constituído por magainina 1 e magainina 2.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo facto, de o oligopeptido catiônico ser o factor 4 das plaquetas humanas ou um. seu fragmento; um seu análogo ou um seu derivado.

13.- Processo.de acordo com a reivindicação 12, carac terizado pelo facto de o factor 4 das plaquetas humanas ser um péptido C-13, que possui a seguinte sequência: Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq. I.D. ΦΦ1).

14.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac- / V -81r f terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico formar uma héli ce alfa-anfipática na presença de uma interface lípido/aquosa.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico possuir pelo me nos 11 aminoacidos de extensão.

16. - Processo de acordo: com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico corresponder es sencialmente a uma sequência de resíduos de aminoacidos constituída por: aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-Leu-aa3-aa4-X; em que aa^ representa Pro, Ala ou Lys, aa2 representa Zle ou Leu, aa2 representa. Glu ou.Lys, aa4 representa Ser, Leu ou Lys e X representa uma sequência de cinco.aminoacidos de natureza -helicoidal e que possui a sequência geral aa^-Lys-Lys-aag--Gly, em que aa^ representa Ala ou Leu e aag representa Leu ou Phe.

17.- Processo de acordo com. a reivindicação 16, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico incorporar uma sequência de resíduos de aminoacidos seleccionada entre o grupo constituído por Ala-Láu-Tyr-Lys-Lys-He-Ile-Lys-Lys-Leu'Leu*Glu-Ser*AIa-Lys-Lys-Lau-Gly (Seq. I.D. #5); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lsu-Gíu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (SeqaêncáaLD. #6); Ala-Leu-Tvr-Lvs-Lys-Leu-Leu-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Lvs-Ser-AIa-Lvs-Lvs-Leu-Gly (Seq. LD. #7); Ala-Leu-Tvr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lsu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Lsu-Gly (Seq. LD, #8); Ala-Leu-Tvr-Lvs-Lvs-Leu-Lôu-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Lvs-Phe-Ala-Lvs-Lvs- • · 0 »4 0 tf tf Phe-Gly (Seq. I.D. #10); Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. IJD. #11); e Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-GIy (Seq. IJD. # 12).

18. - Processo de acordo, com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiônico ser constituído pela seguinte sequência de resíduos aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys--Lys-Leu-Gly; na qual os resíduos de aminoácidòs podem ser d-aminoácidos.

19. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiónico ser constituído pela sequência de aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Om-Om-Leu-Leu-Om-Ser-Ala-Om--Orn-Leu-Gly. -83- 20.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica apropriada para tratar uma infecção causada por bacti rias Enterobacteriaceae, caracterizado por se misturar: (a) um antibiótico p-lac.tâmico capaz de inibir o crescimento das . bactérias Enterobacteriaceae com (b) uma substância activa da membrana.

21-- Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de se seleccionar o antibiótico p~lactâ-mico entre o grupo constituído por penicilina, cefalospórina, carbapenem, monobactama, cefamicina, pirazidon e penem.

22.- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o antibiótico · j5-lactâmico ser uma ce-falosporina.

23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto se seleccionar a cefalosporina entre o grupo constituído por cefepima, cefotaxima e ceftazidima. 24. — Processo.de acordo com a reivindicação 21, carac- ter izado pelo facto de o antibiótico bapenem. p-lac.tâmico ser um cár

25.- Processo de acordo' com a reivindicação 24, carac- r84- Jíi. Γ0 terizado pelo facto de o carbapenem ser imipenem.

26. - Processo de acordo.com.a reivindicação 21, carac terizado pelo facto de o antibiótico j$-lactâraico ser uma mo-nobactama.

27. - Processo de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto .de a monobactama ser aztreonama. .

28. - Processo.de acordo com a reivindicação 20, cara£ terizado pelo facto de a substância activa da membrana ser um oligopeptido catiõnico.

29. - Processo de acordo.com a reivindicação 28, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser uma magai-nina.

30. - Processo de.acordo com a reivindicação 29, carac terizado pelo facto de se seleccionar a magainina entre o grupo constituído por magainina 2.

31. - Processo de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser factor 4 das plaquetas humanas, ou um seu fragmento, um seu análogo ou um seu derivado.

32. - Processo de acordo com a reivindicação 31/ carac-terizado pelo facto de o fragmento do factor 4 das plaquetas hu manas ser um péptido C-13 possuindo a seguinte sequência: Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq. I.D. jMD.

33. - Processo de acordo com a reivindicação 28, carac-terizado pelo facto, de o oligopeptido catiónico formar uma héli ce alfa-anfipática na presença de uma interface lípido/aquosa.

34. - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiónico possuir pelo me nos 11 aminoãcidos de extensão.

35. - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiónico corresponder essencialmente a uma sequência de resíduos de aminoãcidos constituída por: aa^-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-lys-Lys-Leu-Leu-Leu-aa3-aa4-X na qual aa^ representa Pro, Ala ou Lys, aa2 representa Ile ou Leu, aa3 representa Glu ou Lys, aa4 representa Ser, Leu ou Lys e X representa uma sequência de cinco aminoãcidos de natureza -helicoidal e que possui a sequência geral aa^-Lys-Lys--aag-Gly, em que aa^ representa Ala ou Leu e aa^ representa Leu ou Phe.

36. - Processo de acordo com a reivindicação 35, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiónico ser constituído por uma sequência de resíduos de aminoãcidos seleccionada entre o grupo que consiste em: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AIa-Lys-Lys-Leu- Gly (Seq. LD. #5); Ala-I^u-Tvr-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Glu-Ser-Aia-Lvs-Lvs- m 4 é * 4 4 0 Leu-GIy (SequênciaLD. #6); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Lôu-Lys-Lys-Leu*Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys- Leu-Gly (Seq. LD. #7); Ala-Leu-Tyr-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Lys-Lvs-Ala-Lvs-Lvs- Leu-GIy (Seq. LD. #8); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-AIa-Lys-Lys- Phe-Gly (Seq. IJD. #10); Lys-Trp-Lys-Leu-Tvr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala- Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. LD. #11); e Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu- Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. IJD. # 12).

37. - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiónico ser constituído pela seguinte sequência de resíduos de aminoãcidos: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala--Lys-Lys-Leu-Gly, na qual os resíduos de aminoãcidos podem ser d-aminoácidos.

38.- Processo de acordo com a reivindicação 34, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiónico ser constituí- do pela seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Om-Om-Leu-Leu-Om-Om-Leu-Leu-Om-Ser-Ala-Om -Om-Leu-Gly.

39. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica apropriada para tratar infecções causadas por Escherichia coli, caracterizado · por se misturar: (a) cefepima com (b) magainina 2.

40. - Processo para a preparação de tuna composição far macêutica apropriada para tratar infecções causadas por . Escherichia coli, caracterizado pelo facto de se misturar (a) cefepima e (b) um péptido C-13 do factor 4 das plaquetas humanas, constituído pela seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq. I.D. jMD .

41. - Processo para a preparação de uma composição far macêutica apropriada para tratar infecções bacterianas causadas por Escherichia coli, caracterizado pelo facto de se mistu rar: (a) uma cefepima e (b) um oligopeptido catiõnico anfipati co alfa-helicoidal.

42.- Processo de acordo com a reivindicação 41, carac /-88- / terizado pelo facto.de o oligopeptido possuir uma extensão de pelo menos 11 resíduos de aminoácidos.

43. - Processo de acordo com a reivindicação 42, ca-racterizado pelo facto de o oligopeptido corresponder, essencialmente a uma.sequência de aminoácidos constituída por: aa^-Leu-Tyr-Lys-Lys-aaj-aa^Lys-Lys-Leu-Leu-Leu-aa-j-aa^-X na qual aa^ representa Pro, Ala ou Lys, aa2 representa Ile ou Leu, aa^ representa Glu ou Lys, aa^ representa Ser, Leu ou Lys e X representa uma sequência de cinco aminoácidos de natu reza Q^-helicoidal e que possui a sequência geral aa^-Lys-Lys-aag-Gly, em que aa,- representa Ala ou Leu e aag re presenta Leu ou Phe.

44. - Processo de acordo.com a reivindicação 43, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser constituído por uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada entre o grupo que consiste em: • · * Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-He-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-GIu-Ser-AIa-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. #5); Ala-Lôu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Lea-Leu-GIu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly £equênciaI.D. #6); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Lau-Leu-Lys-Lys-Lsu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lvs-Leu-Gly (Seq. IX). #7); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lvs-Leu-Gly (Seq. LD. #8); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lvs-Lys-Phe-Gly (Seq. I.D. #10); Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AIa-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. LD. #11); e Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. IX). #12).

45. - Processo de acordo com a reivindicação 44, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiônico ser constituído pela seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys--Lys-Leu-Gly, na qual os resíduos de aminoácidos podem ser d-aminoãcidos.

46. - Processo de acordo com a reivindicação 42, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiônico ser constituído pela seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Om-Orn-Leu-Leu-Om-Om-Leu-Leu-Om-Ser-Ala-Om--Ora-Leu-Gly. / ( -90-

47. - Processo para a preparação de uma composição far macêutica apropriada para tratar uma infecção causada por Escherichia coli, caracterizado pélo facto de se misturar: (a) aztreonam e (b) magainina 2. 8-lactâmico, caracteriza

48. - Método para tratar uma infecção causada por um organismo sensível a um antibiótico do pelo facto de se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição constituída por: (a) um antibiótico ^-lactâmico que seja capaz de inibir o crescimento do organismo e (b)um oligopeptido catiõnico, du-. rante um intervalo de tempo suficiente para inibir o crescimento do referido organismo.

49. - Método de acordo com a reivindicação 48, caracte rizado pelo facto de a quantidade de antibiótico p-lactâmico ser uma dosagem subinibidora.

50. - Método de acordo com a reivindicação 48, caracte rizado pelo facto de se seleccionar o antibiótico p-lactâmi-co entre o grupo constituído por penicilina, cefalosporina, carbapenem, monobactama, cefamicina, pirazidona e penem.

51. - Método de acordo com a reivindicação 48, caracte rizado pelo facto de se seleccionar o oligopeptido catiõnico -91- / .¾ .s / entre o grupo constituído por magainina, cecropina, sarcotoxi-na, uma proteína precursora mitocondrial, os seus fragmentos, análogos e derivados.

52. - Método de acordo com a reivindicação 48, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser factor 4 das plaquetas humanas, ou um seu fragmento, um seu análogo ou um seu derivado.

53. - Método de acordo com a reivindicação 52, carac terizado pelo facto de o fragmento de factor 4 das plaquetas humanas ser um péptido C13, possuindo a seguinte sequência de resíduos aminoácidos: Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser Seq. I.D. jÉjÉl).

54. - Método de acordo com a reivindicação 48, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico formar uma hélice alfa-anfipática na presença de uma interface lípido/ /aquosa.

55.- Método de acordo com a reivindicação 54, carac terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico possuir uma extensão de pelo menos 11 resíduos de aminoácidos. f / f /f %

56.- Método de acordo com a reivindicação 55, carac terizado pelo.facto de o oligopeptido catiõnico corresponder essencialmente a uma sequência de resíduos de aminoácidos constituída por: aa^-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa2-aa4-X na qual aa^ representa Pro, Ala ou Lys, aa2 representa Ile ou Leu, aa^ representa Glu ou Lys, aa^ representa Ser, Leu. ou Lys e X representa uma sequência de cinco aminoácidos de na tu reza -helicoidal, e que possui a sequência geral aa^-Lys--Lys-aag-Gly, em que aa^ representa Ala ou Leu e aag represen ta Leu ou Phe.

57.- Método de acordo com a reivindicação 56, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico incorporar uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada entre o grupo constituído por: Ala-Leu*Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala*Lys-Lys-Ieu-Gly (Seq. I.D. #5); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Lsu-Leu-GIu-Ser-Ala-Lys-Lys- Leu-Gly (SequênciaI.D. #á); Ala-Leu-Tvr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys- Leu-Gly (Seq. LD. #7); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-GIy (Seq. LD. #8); Aia-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Lôu-Leu-Lys-Phe-AIa-Lys-Lys-Phe-Gly (Seq. LD. #10); Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lvs-Leu-Giy (Seq. I.D. #11); e Ala-Lys-Lys-Leu-AIa-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Glv (Seq. I.D. #12). ./ / -93-

58. - Método de acordo com a reivindicação 57, caracte rizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser constituído pela seguinte sequência: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys- -Lys-Leu-Gly; na qual os resíduos de aminoácidos- podem ser d-aminoãcidos.

59. - Método de acordo com a reivindicação 55, caracte rizado pelo facto de o oligopeptido catiónico ser constituído pela seguinte sequência: Ala-Leu-Tyr-Om-Om-Leu-Leu-Om-Om-Leu-Leu-Om-Ser-Ala-Om- -Oro-Leu-Gly.

60. - Método para o tratamento de uma infecção bacte-riana de Enterobacteriaceae, caracterizado.pelo.facto de se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição constituída por (a) um antibiótico jS -lactâmico capaz de inibir o crescimento de bactérias . Enterobacteriaceae e (b) pelo menos uma substância activa da membrana, durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o crescimento das referidas bactérias.

61. - Método de acordo com a reivindicação 60, caracte rizado pelo facto de a quantidade de antibiótico p-lactâmico consistir em uma dosagem sub-inibidora. -94- /

62. - Método de acordo com a reivindicação 60, caracte rizado pelo facto de se seleccionar o antibiótico j3-lactâmico entre o grupo constituído por penicilina, cefalosporina, car-penem, monobactama, cefamicina, pirazidona e penem.

63. - Método de acordo com a reivindicação 60, caracte rizado pelo facto de a substância activá da membrana ser um oligopeptido catiónico.

64. - Método de acordo com a reivindicação 63, caracte rizado pelo facto de se seleccionar o oligopeptido catiónico entre o grupo constituído por magainina, cecropina, sarcotoxi-na, uma proteína precursora mitocondrial, os seus fragmentos, análogos, e derivados.

65. - Método de acordo com a reivindicação 63, caracte rizado pelo facto de o oligopeptido catiónico ser o factor 4 das plaquetas humanas, ou um seu fragmento, um seu análogo ou um seu derivado.

66. - Método de acordo com a reivindicação 65, caracte rizado pelo facto de o fragmento de factor 4 das plaquetas humanas ser um péptido C13, possuindo a seguinte sequência de re síduos de aminoácidos: / -95- • ·=~Τaeí» Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq. I.D. ΦΦ1).

67. - Método de acordo com a reivindicação 63, caracte rizado pelo facto de o oligopeptido catiônico. formar uma hélice alfa-anfipática na presença de uma interface lípido/aquosa.

68. - Método de acordo com a reivindicação 67, caracte rizado pelo facto de- o oligopeptido catiônico, possuir uma extensão de pelo menos 11 resíduos de aminoãcidos.

69. - Método de acordo com a reivindicação 68, caracte rizado pelo facto de o oligopeptido catiônico corresponder, e£ sencialmente, a uma sequência de resíduos de aminoãcidos constituída por; aa^-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2“Lys-Lys-Leu-Leu-aa2-aa^-X na qual aa^ representa Pro, Ala ou Lys, aa2 representa lie ou Leu, aa^ representa Glu ou Lys, aa^ representa Ser, Leu ou Lys e X representa uma sequência de cinco aminoãcidos de natureza ^-helicoidal e que possui a sequência geral aa5-Lys--Lys-aag-Gly, em que aa5 representa Ala ou Leu e aag representa Leu ou Phe.

70.- Método de acordo com a reivindicação 69, caracte rizado pelo facto de o oligopeptido catiônico incorporar uma -9*6-sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada entre o grupo constituído por: AIa-Leu-Tvr-Lvs-Lvs-Ile-Ile-Lvs-Lvs-Leu-Leu-Glu-Ser*Ala-Lvs-Lvs-Leu- φ Λ 4 * ·* + + Gly (Seq. LD. #5); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lvs-Lys-l^u-Lau-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sequência LD. #6); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Giy (Seq. I.D. #7); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Lôu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Aia-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. LD. #8); Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-PIie-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly (Seq. LD. #10); Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. LD. #11); e Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lsu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Seq. LD. #12).

71. - Método de acordo com a reivindicação 69/ carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser constituído pela seguinte sequência: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys--Lys-Leu-Gly-; na qual os resíduos de amonoácidos podem ser d-aminoácidos.

72. - Método de acordo com a reivindicação 68, carac-terizado pelo facto de o oligopeptido catiõnico ser constituído pela seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Om-Orn-Leu-Leu-Om-Om-Leu-Leu-Om-Ser-Ala-Om--Orn-Leu-Gly.

73. - Método para tratar uma infecção bacteriana causada pela Escherichia coli, caracterizado por se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição constituída por: (a) cefepima e (b) magainina 2, durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o cresci mento da bactéria.

74. - Método para tratar uma infecção bacteriana causada por Escherichia coli/ caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição constituída por: (a) cefepima e (b) um pêptido C-13 do factor 4 das plaquetas humanas que incorpora a seguinte sequência de aminoácidos: Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq. I.D. j^l); durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o crescimento da bactéria.

75. - Método para tratar uma infecção bacteriana causada por Escherichia coli, caracterizado por se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma com posição constituída por: (a) cefepima e (b) um oligopeptido catiónico que incorpora a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: -98- Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys--Lys-Leu-Gly (Seq. I.D. jM7); durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o desenvolvimento da bactéria.

76. - Método para tratar uma infecção bacteriana causada por Escherlchia coli, caracterizado por se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma com posição constituída por: (a) cefepima e (b).um oligopeptido cationico que incorpora a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys--Lys-Leu-Gly; na qual todos os resíduos de aminoácidos são d-aminoácidos, durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o cresci mento da bactéria.

77. - Método para tratar uma infecção bacteriana causada por Escherichia coli/ caracterizado pór se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição constituída por: (a) cefepima e (b) um oligopeptido ca tiõnico que incorpora a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos : Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys--Lys-Leu-Gly (Sequência I.D. ?M6); 99- durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o crescimento da bactéria.

78. - Método para tratar uma infecção bacteriana causa da por Escherichia coli, caracterizado por se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi ção constituída por: (a) cefepima e (b) um oligopeptido catiõ-nico que incorpora a seguinte sequência de resíduos de ami-noácidos: Ala-Leu-Tyr-Om-Om-Leu-Leu-Om-Om-Leu-Leu-Om-Ser-Ala-Om- -Orn-Leu-Gly; durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o crescimento da bactéria.

79. - Método para tratar uma infecção bacteriana causa da por Escherichia.coli, caracterizado por se administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi ção constituída por: (a) aztreonam. e (b) magainina 2, durante um intervalo de tempo suficiente para inibir o crescimento da bactéria.

80.- Método para efectuar o rastreio in vitro de uma composição para actividade antibacteriana com complemento ac tivo, caracterizado por: (a) se combinar a composição cujo rastreio de pretende efectuar com uma bactéria alvo e com os -100- r componentes de uma cascata complementar activa? e (b) se deter minar a actividade antibacteriana da composição na referida bactéria alvo.

81. - Método de acordo com a reivindicação 80, caracte rizado pelo facto de a bactéria alvo ser previamente tratada com uma concentração inibidora subminima do antibiótico p-lac tâmico antes de se efectuar o passo de combinação.

82. - Método de acordo com a reivindicação 80, caracte rizado pelo facto de os componentes da. cascata complementar ac tiva serem proporcionados por .soro. Lisboa, 22 de Fevereiro de 1991 r, ΛαΜΜό αα frccnecioce mdwjrict