ES2913946T3 - Péptido y su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios - Google Patents

Abstract

Péptido que es un factor inhibidor de NET neonatal (nNIF) aislado y purificado que tiene la secuencia de aminoácidos KFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQ.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido y su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios

CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente divulgación se refiere a un péptido que es un factor inhibidor de NET neonatal (nNIF), a composiciones farmacéuticas que lo comprenden y a péptidos nNIF para usar en el tratamiento de un paciente que padece un trastorno inflamatorio o que tiene el riesgo de desarrollarlo.

ANTECEDENTES

[0002] Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son redes extracelulares de cromatina descondensada decoradas con proteínas antimicrobianas extruidas por leucocitos polimorfonucleares (PMN, neutrófilos) para atrapar y matar microbios. Aunque las NET ayudan a atrapar bacterias y otros patógenos, su presencia también provoca daño tisular inflamatorio. De hecho, la formación de las n Et contribuye a la patología de varios trastornos inflamatorios, incluida la lesión pulmonar aguda producida por la gripe o por transfusiones de sangre, la sepsis, la vasculitis de vasos pequeños, el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) y enfermedades autoinmunes crónicas como el lupus eritematoso sistémico. Además, la formación de NET y, en particular, la liberación de histonas asociadas a NET en el espacio extracelular induce directamente la muerte de células tanto epiteliales como endoteliales en cultivo.

[0003] Un proceso de muerte celular activa distinto de la necrosis y la apoptosis, frecuentemente denominado "NETosis", conduce a la formación de redes tridimensionales en las que hay enzimas granulares y péptidos de defensa del hospedador que se unen a la cromatina nuclear antes de la extrusión del neutrófilo. Las histonas, que tienen actividades antimicrobianas, también abundan en las NET. La formación de NET se conserva en muchas especies.

[0004] La formación deficiente de NET es un mecanismo de la inmunodeficiencia y la alteración de la defensa del hospedador humano. Una variedad de patógenos induce la formación de NET. Además de Escherichia coli, Staphylococcus, Streptococcus, Yersinia, y otras bacterias grampositivas y negativas, hay hongos, parásitos y virus que desencadenan la generación de NET por parte de los PMN humanos. Los lipopolisacáridos (LPS) también inducen la NETosis, lo que sugiere que las toxinas microbianas pueden tener esta actividad en términos generales. Los mediadores endógenos del hospedador, como la interleucina-8 (IL-8), el factor activador de las plaquetas (FAP) y el factor C5a del complemento, inducen la formación de NET directamente o tras ser “iniciados” por otros mediadores. Las plaquetas de ratón estimuladas con LPS, las plaquetas humanas activadas y las plaquetas de un modelo murino de lesión pulmonar aguda producida por transfusión (TRALI) que conlleva la iniciación con LPS también desencadenan la formación de NET. Las células epiteliales alveolares infectadas con H1N1 inducen la formación de NET por neutrófilos murinos in vitro. Por lo tanto, múltiples interacciones entre neutrófilos y microbios, células hospedadoras y/o mediadores del hospedador señalan la NETosis y la formación de NET.

[0005] Las NET también son importantes instrumentos biológicos de contención y destrucción de microbios extravasculares in vitro e in vivo, limitando así la propagación de patógenos. Sin embargo, algunos patógenos expresan endonucleasas que escinden la estructura de ADN o inhibidores que bloquean los péptidos antimicrobianos; estos mecanismos actúan como factores de virulencia que limitan la destrucción y proporcionan mecanismos para el escape bacteriano.

[0006] La formación insuficiente de NET parece ser un déficit inmunitario innato previamente no reconocido que da como resultado infecciones graves. Los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (EGC), que tienen una generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) insuficiente y contraen infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes, a menudo potencialmente mortales, también muestran un defecto en la formación de NET. La terapia génica para esta inmunodeficiencia puede restaurar la formación de NET y controlar la aspergilosis pulmonar refractaria en pacientes con EGC. Esto sugiere que las NET también pueden poseer funciones protectoras en la fibrosis quística y la neumonía.

[0007] Si bien las vías de señalización intracelular que regulan la formación de NET por parte de los PMN siguen siendo en gran parte desconocidas, la generación de ROS se considera un evento clave. Los estudios en leucocitos mieloides HL-60 humanos y en ratones modificados genéticamente indican que también se requiere la actividad de la peptidil arginina deiminasa 4 (PAD 4), una enzima responsable de la descondensación de la cromatina.

[0008] Además, la formación de NET puede requerir la actividad enzimática de la elastasa de neutrófilos (NE) para iniciar la degradación de las histonas nucleares que conduce a la descondensación de la cromatina antes de la ruptura de la membrana plasmática. La antitripsina alfa 1 (A1AT) es un inhibidor de la serina proteasa que inactiva la NE en el plasma; sin embargo, los PMN humanos no la expresan. Se ha demostrado que un inhibidor de la serina proteasa relacionado, la serpina B1, que es expresada como una proteína citoplásmica por los PMN humanos, restringe la formación de NET por parte de los PMN humanos y de ratón. Además, el tratamiento con serpina B1 recombinante inhibe la formación de NET en PMN humanos estimulados con forbol 12-miristato acetato (PMA), un inductor de la formación de NET in vitro. Sin embargo, la A1AT recombinante no inhibe la formación de NET. La inhibición de serina proteasas específicas, como la NE, puede inhibir eficazmente la formación de NET por parte de los PMN humanos.

[0009] Aunque la formación de NET es una función antimicrobiana innata fundamental de los PMN, ahora existen pruebas claras de que es un mecanismo de lesión tisular inflamatoria y trombosis si se desencadena o se desregula de manera inapropiada. Véase Saffarzadeh y Preissner, Curr Opin Hematol, 2013, 20: 3-9; y Brinkmann y Zychlinsky, J Cell Biol, 2012, 198(5): 773-783. Las NET median en el daño inflamatorio en múltiples modelos de exposición estéril e infecciosa. Por ejemplo, la formación de NET puede ser un mecanismo clave en la vasculopatía sistémica que es fundamental para la patogenia de la fase proinflamatoria aguda de la sepsis. Las bacterias, incluyendo Staphylococcus y E. coli, son las principales causas de sepsis grave, solas o como infecciones polimicrobianas, según las poblaciones estudiadas.

[0010] Los experimentos en los que se utilizan células endoteliales (EC) humanas y neutrófilos in vitro, y un modelo in vivo de endotoxemia en el que los ratones se expusieron a LPS, indican que las NET causan daño endotelial y hepático, potencialmente mediado por proteasas de neutrófilos asociadas con NET. La NE y otras enzimas granulares de los neutrófilos pueden dañar en gran medida el endotelio y muchos tipos de células extravasculares. La activación de EC, como ocurre en la sepsis, puede mejorar la generación de NET. Además de las enzimas granulares, las histonas asociadas con las NET son agonistas no reconocidos previamente para la lesión endotelial en la sepsis, según modelos experimentales y muestras humanas.

[0011] También hay evidencia de que las NET y los componentes de las NET son potentes procoagulantes, y de que los componentes de las NET inducen trombosis, una característica patogénica central de la sepsis. Los componentes de las NET modifican la estabilidad de la fibrina y la fibrinólisis. Por lo tanto, si bien la formación de NET puede ser fundamental para la captura y contención bacteriana en las primeras fases de la bacteriemia y la sepsis según los modelos murinos, las observaciones hasta la fecha indican que la formación de NET también causa daño al hospedador (por ejemplo, en síndromes sépticos agudos).

[0012] El endotelio vascular activado puede inducir la formación de NET por parte de los PMN humanos y provocar daños en las células endoteliales in vitro. Además, puede producirse daño celular cuando las células endoteliales humanas se incuban con plaquetas y PMN activados, lo que lleva a la formación de NET, y puede producirse daño hepático in vivo después de la formación de NET. Por último, las placentas de madres con preeclampsia grave, un síndrome del embarazo que suele provocar un parto prematuro, muestran una formación de NET abundante. Por lo tanto, si bien es esencial para prevenir infecciones graves, la formación inadecuada de NET también parece ser un mecanismo de lesión tisular y vascular inflamatoria.

[0013] Los síndromes pulmonares inflamatorios e infecciosos proporcionan otro ejemplo de lesión tisular mediada por NET. Las NET forman y contribuyen a la disfunción vascular y alveolar en modelos animales de lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA). El SDRA es una complicación importante de la infección e inflamación sistémica y pulmonar en humanos. Las NET se asocian con lesión pulmonar aguda en modelos de neumonitis inducida por gripe, un desencadenante infeccioso común y letal del SDRA. Los estudios in vitro indican que las histonas de las NET pueden ser mediadores críticos de la muerte de las células epiteliales y endoteliales alveolares.

[0014] Además de la sepsis y la lesión pulmonar, los síndromes vasculíticos son otro ejemplo en el que las NET desempeñan funciones patogénicas. Al igual que en la sepsis, las NET pueden mediar tanto en la inflamación vascular como en la trombosis en la vasculitis. Una variedad de estímulos inflamatorios y agentes infecciosos pueden causar vasculitis.

[0015] También se ha descubierto que la inflamación desregulada contribuye a la patogenia de todas las principales complicaciones de la prematuridad: enterocolitis necrosante (ECN), síndrome de dificultad respiratoria (SDR), neumonía, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar crónica (EPC) neonatal, retraso del desarrollo neurológico, retinopatía del prematuro (RDP) y sepsis. La EPC neonatal causa una morbilidad y mortalidad significativas en los EE. UU. La EPC es una complicación del parto prematuro que resulta de la ventilación mecánica prolongada requerida para tratar la insuficiencia respiratoria crónica. Ocurre en hasta el 70 % de los neonatos de peso extremadamente bajo al nacer (ELBW, por sus siglas en inglés) tratados con ventilación mecánica para tratar la dificultad respiratoria. Si bien la terapia con surfactante y los esteroides prenatales o posnatales han disminuido la gravedad de la EPC, esta morbilidad significativa asociada con el parto prematuro sigue siendo común en los bebés de riesgo, con alrededor de 8000 a 10000 casos nuevos anuales en los EE. UU. La tasa de mortalidad por EPC en los bebés ELBW sigue siendo alta, del 15 al 60 %. Además, la EPC sigue siendo la causa más común de hospitalización a largo plazo en los neonatos y también se asocia con un retraso en el desarrollo.

[0016] La evidencia actual adicional corrobora firmemente la conclusión de que las NET están involucradas en el daño tisular y la trombosis en una variedad de síndromes inflamatorios. En consecuencia, se han investigado algunas estrategias terapéuticas para mitigar o interrumpir la formación de NET o las actividades de los componentes de la NET. Sin embargo, todas las estrategias identificadas hasta la fecha tienen importantes limitaciones. La inhibición global de la función de los neutrófilos y/o los inhibidores específicos de la generación de radicales de oxígeno o los puntos de control molecular clave, como HIF-1a, deprimen otras funciones de los PMN, incluida la migración, la fagocitosis y/o la muerte microbiana intracelular, lo que genera un potencial paralelo de evasión microbiana e infecciones iatrógenas.

[0017] La degradación de NET con DNasas, potencialmente junto con la inhibición de histonas y enzimas asociadas a las NET como estrategia de combinación, representa un enfoque terapéutico basado en modelos experimentales. Sin embargo, se han identificado más de veinte proteínas diferentes asociadas a las NET, lo que hace que esto no sea práctico. Además, la alteración enzimática de las NET como intervención puede conducir a la diseminación de microbios, dependiendo del momento en que se realice. La degradación farmacológica de las NET en la vasculatura también tiene el potencial de diseminar histonas y enzimas de neutrófilos tóxicas a otros lechos vasculares, lo que puede iniciar o aumentar la lesión de múltiples órganos. Finalmente, las heparinas inhiben la formación de NET en algunas condiciones, pero tienen la hemorragia como complicación conocida. BREVE DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

[0018] El documento WO2012/178102 trata sobre una composición de alfa-1 antitripsina recombinante (a-1 antitripsina, AAT).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0019] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0020] Las formas de realización descritas en este documento serán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, en conjunto con los dibujos adjuntos. En estos dibujos se representan solo formas de realización típicas, que se describirán con mayor especificidad y detalle mediante el uso de los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1A es una imagen de PMN humanos adultos expulsando NET (flechas finas) para atrapar y matar bacterias, S. aureus (flechas anchas).

La figura 1B compara la decoración de NET (flecha delgada) con elastasa de neutrófilos (NE) (flecha gruesa) formada por PMN humanos adultos con PMN neonatales que expresan NE pero no forman NET. La figura 1C es un gráfico que indica que los PMN neonatales demuestran una destrucción bacteriana total y mediada por NET significativamente menor en comparación con los PMN de adulto. * p<0,05, ** p<0,001. La figura 2A es una imagen de la formación de NET por PMN humanos estimulados con LPS (tiempo de 1 hora).

La figura 2B es una imagen de PMN humanos incubados en plasma de control (tiempo de 1 hora).

La figura 2C es una imagen de la formación de NET por PMN humanos incubados en plasma aislado de pacientes con sepsis por S. aureus (tiempo de 1 hora).

La figura 3A es una serie de imágenes en las que se muestran PMN prematuros estimulados con LPS aislados del mismo bebé prematuro. Los PMN se aislaron de la sangre del cordón umbilical, el día de vida 3 y el día de vida 14, como se indica.

La figura 3B es una serie de imágenes (de izquierda a derecha) en las que se muestran los resultados de los experimentos de preincubación: PMN del día de vida 28 preincubados en plasma autólogo, PMN del día de vida 28 preincubados con plasma de sangre de cordón umbilical, PMN de adultos preincubados con plasma autólogo y PMN de adultos preincubados con plasma de sangre de cordón umbilical. Luego se indujo la formación de NET con estimulación con LPS.

La figura 3C es un gráfico en el que se representa la liberación extracelular de histona H3. El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. Los datos de los PMN de un bebé prematuro hasta el día de vida 28 y los PMN de un adulto de los experimentos de cambio de plasma de la FⁱG. 3B están representados en el eje x.

La figura 4A es una lista de proteínas candidatas a nNIF, la masa molecular esperada y la puntuación de las proteínas.

La figura 4B es una transferencia de Western en la que se usa un anticuerpo policlonal contra el extremo carboxilo terminal de la A1AT que compara la expresión de nNIF (~ 6 kD) en sangre de cordón umbilical y plasma de adulto.

La figura 4C es una comparación de las secuencias obtenidas por espectroscopia de masas de nNIF, CRISPP y el fragmento de escisión A1ATm358 de A1AT de longitud completa.

La figura 5A es una imagen de PMN de adulto de control sin tratar.

La figura 5B es una imagen de PMN de adulto con tratamiento con LPS.

La figura 5C es una imagen de PMN de adulto con tratamiento con LPS después de la incubación previa con plasma de sangre de cordón sin tratar.

La figura 5D es una imagen de PMN de adulto con tratamiento con LPS después de la preincubación con plasma de sangre de cordón sin nNIF.

La figura 5E es una imagen de PMN de adulto con tratamiento con LPS después de la preincubación con nNIF purificado por afinidad a partir de plasma de sangre del cordón umbilical.

La figura 5F es una imagen de PMN de adulto con tratamiento con LPS después de la preincubación con rA1AT de longitud completa.

La figura 6A es una serie de imágenes (en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior izquierda) en las que se muestra la formación de NET por PMN de humano adulto en: ^p Mⁿ de control, PMN estimulados con PMA (20 nM), PMN estimulados con PMA (20 nM) con preincubación de péptido con secuencia aleatoria (1 nM), y PMN estimulados con PMA (20 nM) con preincubación con CRISPP (1 nM). La figura 6B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de liberación de histona humana H3 para cuantificar la formación de NET. El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. Los datos de PMN humanos estimulados en las condiciones indicadas se representan en el eje x.

La figura 7A es una serie de imágenes (en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior izquierda) que muestran la formación de NET por PMN humanos: sin tratamiento, incubación con S. aureus, incubación con S. aureus y preincubación con péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM), e incubación con S. aureus y preincubación con CRISPP (1 nM).

La figura 7B es un gráfico en el que se muestran los resultados de un ensayo de liberación de histona humana H3 para cuantificar la formación de NET (n=2). El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. Los datos de PMN humanos estimulados en las condiciones indicadas se representan en el eje x.

La figura 8A es una serie de imágenes (de izquierda a derecha) que muestran la formación de NET en PMN humanos incubados con: LPS (100 ng/ml), medio de virus del dengue sin infección y virus del dengue (0,05 MOI).

La figura 8B es una serie de imágenes que muestran (en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior izquierda) PMN humanos incubados con: medios de virus del dengue sin infección y pretratados con péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM), medios de virus del dengue sin infección y pretratados con CRISPP (1 nM), virus del dengue y pretratados con CRISPP (1 nM) y virus del dengue y pretratados con péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM).

La figura 9 es un gráfico en el que se muestra la destrucción extracelular total, fagocítica y mediada por NET de bacterias de una cepa patógena de E. coli por PMN humanos con o sin estimulación con LPS (100 ng/mL). Los PMN también se pretrataron con CRISPP (1 nM) o un péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM). * denota significación estadística (p < 0,05).

La figura 10A es un gráfico de seguimiento de la supervivencia de ratones C57BL6 en varios grupos de tratamiento después la inyección intraperitoneal de LPS (20 mg/kg). Los ratones tratados con CRISPP (10 mcg/kg/dosis) recibieron 2 dosis por vía intraperitoneal; una administrada 1 hora antes de la infección y una dosis administrada 6 horas después de la infección. Se siguió la misma dosis, vía de administración y programa para los ratones tratados con péptido de control con secuencia aleatoria. Se evaluaron seis ratones en ambos grupos. La supervivencia del grupo LPS más CRISPP fue estadísticamente mayor que la del grupo LPS más péptido con secuencia aleatoria (p=0,02).

La figura 10B es un gráfico de seguimiento de la supervivencia de ratones Swiss no consanguíneos en varios grupos de tratamiento después de la inyección intraperitoneal de E. coli (4 x 107 bacterias). Como en la fig. 10A, los ratones tratados con CRISPP (10 mcg/kg/dosis) recibieron 2 dosis por vía intraperitoneal; una administrada 1 hora antes de la infección y una dosis administrada 6 horas después de la infección. Se siguió la misma dosis, vía de administración y programa para los ratones tratados con péptido de control con secuencia aleatoria. En este caso, se evaluaron 10 ratones en cada grupo: sin tratamiento, E. coli más CRISPP, y E. coli más péptido con secuencia aleatoria. La supervivencia del grupo de E. coli más CRISPP fue estadísticamente mayor que la del grupo E. coli más péptido con secuencia aleatoria (p < 0,0001). La figura 11 es un gráfico de seguimiento de la supervivencia de ratones Swiss no consanguíneos en varios grupos de tratamiento de un modelo murino con CL/P (ligadura y punción del ciego). Los ratones tratados con CRISPP (10 mcg/kg) recibieron 2 dosis por vía intraperitoneal; una administrada 1 hora antes de la cirugía o cirugía simulada y una dosis administrada 6 horas después de la cirugía. Se siguió la misma dosis, vía de administración y programa para los ratones tratados con péptido de control con secuencia aleatoria. Se evaluaron diez ratones en cada uno de los grupos con CL/P. La supervivencia del grupo con CL/P más CRISPP se acercó a la significación estadística en comparación con el grupo CL/P - control (p=0,06).

La figura 12A es una imagen que muestra la formación de NET en tejido pulmonar humano incluido en parafina obtenido en la autopsia de neonatos que murieron con EPC. La acumulación de histona H3 alveolar extracelular indicativa de la formación de NET está indicada por la flecha blanca.

La figura 12B es una serie de imágenes que evalúan la formación de NET en tejido pulmonar de cordero prematuro incluido en parafina en un modelo de EPC en oveja. En referencia a las dos imágenes superiores, las flechas blancas indican la formación de NET alveolares extracelulares. Con referencia a las dos imágenes inferiores, la tinción con H&E demuestra otras características de la EPC neonatal, incluida la hipercelularidad y la simplificación alveolar.

La figura 13A es una serie de imágenes que muestran PMN aislados de sangre de cordón umbilical de cordero prematuro y de oveja hembra madura. Se muestran muestras de control y muestras estimuladas con LPS (100 ng/mL) durante 1 hora, como se indica.

La figura 13B es una serie de imágenes que muestran PMN de oveja hembra madura pretratados con CRISPP (1 nM) o un péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM) durante 1 hora antes de la estimulación con LPS (100 ng/mL), como se indica.

La figura 14A es una serie de imágenes que muestran PMN prematuros estimulados con LPS aislados del mismo bebé prematuro. Los PMN se aislaron el día de vida 0, el día de vida 3, el día de vida 14 y el día de vida 28, como se indica.

La figura 14B es un gráfico que representa la liberación extracelular de histona H3. El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. Los datos de PMN de 7 bebés prematuros hasta el día de vida 28 se representan en el eje x. * indica p<0,05 y ** indica p<0,01 en comparación con el control (línea discontinua), establecido arbitrariamente en 1.

La figura 14C es un gráfico que representa la liberación extracelular de histona H3. El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. Los datos de los PMN de cinco bebés prematuros en el día de vida 28 y los PMN de cinco adultos de los experimentos de cambio de plasma de la FIG. 3B están representados en el eje x. * indica p<0,05 LPS/Adulto frente a LPS/Prematuro, ** indica p<0,01 LPS/Prematuro frente a LPS de sangre de cordón umbilical/Prematuro, y f indica p<0,001 LPS/Adulto frente a LPS de sangre de cordón umbilical/Adulto. La figura 15A es una transferencia de Western que usa un anticuerpo policlonal contra el extremo caboxilo de alfa 1-antitripsina (AAT, también denominada en este documento A1AT) que compara la expresión de nNIF (~ 4-6 kD) en sangre de cordón umbilical (CB) y plasma adulto (A).

La figura 15B es un gráfico que cuantifica los resultados de la FIG. 15A. * indica p<0,05.

La figura 15C es una serie de imágenes (de izquierda a derecha) que muestran la formación de NET por PMN humanos adultos en: PMN de control, PMN estimulados con LPS, PMN estimulados con LPS preincubados con AAT, PMN estimulados con LPS preincubados con nNIF y PMN estimulados con LPS preincubados con péptido de control con secuencia aleatoria (SCR).

La figura 16A es una serie de imágenes (en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior izquierda) que muestran la formación de NET en: PMN de control, PMN estimulados con LPS (100 ng/mL), PMN estimulados con LPS preincubados con nNIF (1 nM), PMN estimulados con LPS preincubados con CRISPP (1 nM) y PMN estimulados con LPS preincubados con SCR (1 nM).

La figura 16B es un gráfico que representa el contenido de histona H3 extracelular (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) en el eje y. Los datos de PMN humanos en las condiciones indicadas se representan en el eje x. La línea discontinua representa los valores de control, establecidos arbitrariamente en 1. ** indica p<0,05 para LPS y SCR/LPS en comparación con el control, y f indica p<0,05 para CRISPP/LPS y nNF/LPS en comparación con los grupos LPS y SCR/LPS.

La figura 16C es un gráfico que representa el contenido de histona H3 extracelular (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) en el eje y. Los datos de PMN humanos en las condiciones indicadas se representan en el eje x. La línea discontinua representa los valores de control, establecidos arbitrariamente en 1. * indica p<0,05 para CRISPP/PMA en comparación con los grupos PMA y SCR/PMA. La figura 16D es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de liberación de histona humana H3 para cuantificar la formación de NET (n=2). El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. Los datos de PMN humanos estimulados en las condiciones indicadas se representan en el eje x.

La figura 17A es un gráfico que representa recuentos de células mononucleares en líquido peritoneal en las condiciones indicadas. * indica p<0,05 para CTL frente a todos los demás grupos.

La figura 17B es un gráfico que representa los recuentos de neutrófilos en el fluido peritoneal en las condiciones indicadas. * indica p<0,05 para CTL frente a todos los demás grupos y f indica p<0,05 para CRISPP/E. coli frente a los grupos de s Cr/E. coli y E. coli.

La figura 17C es un gráfico que representa las unidades formadoras de colonias (ufc) de E. coli en líquido peritoneal en las condiciones indicadas. * denota p < 0,05.

La figura 17D son imágenes que representan la formación de NET en el líquido peritoneal después de la inyección de E. coli ± preinyección de CRISPP (10 mg/kg) o SCR (10 mg/kg), según se indique.

La figura 17E es un gráfico que representa la liberación de histona H3 para evaluar la formación de NET. El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y. La línea discontinua representa los valores de control, establecidos arbitrariamente en 1. * indica p<0,05 para los grupos de CRISP^p/E. coli y nNIF/E. coli en comparación con los grupos de E. coli y RCS/E. coli

La figura 17F son imágenes que muestran la formación de NET en el tejido peritoneal después la inyección de E. coli ± preinyección de CRISPP (10 mg/kg) o SCR (10 mg/kg), según se indique.

La figura 17G es un gráfico que representa la cuantificación de la formación de NET utilizando el software IMAGEJ y una cuadrícula estandarizada en 5 campos visuales seleccionados al azar para cada muestra en microscopía confocal. El gráfico representa el número de NET que cruzan las líneas de cuadrícula estandarizadas que se muestran en el eje y y los grupos experimentales que se muestran en el eje x. * indica p<0,05 para LPS frente a control, ** indica p<0,01 para grupo SCR/LPS frente a control, y f indica p<0,05 para grupos CRISPP/LPS y nNIF/LPS frente a S^c R/^lPS.

La figura 18A es un gráfico que representa la quimiotaxis inducida por IL-8 (2 ng/mL) para PMN aislados de adultos sanos después del tratamiento ± control de nNIF, CRISPP o péptido SCR, como se indica. También se midió la capacidad de nNIF y CRISPP para inducir la quimiotaxis por sí mismos (columnas CRISPP-BLW, NIF-BLW y SCR-BLW). El eje y muestra el cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia de la quimiotaxis de PMN ± error estándar de la media (EEM).

La figura 18B es un gráfico que representa la fagocitosis por PMN aislados de adultos sanos después de una incubación de cuatro horas de BIOPARTÍCULAS de E. coli con marcadores fluorescentes (6 x 106 partículas/mL). El eje y representa el porcentaje de PMN que dieron positivo en E. coli intracelular ± EEM evaluado mediante microscopía confocal con evaluación multiplano. Se usó el pretratamiento con citocalasina B y D (10 ^j M) como control para la inhibición de la fagocitosis. * indica p<0,05.

La figura 18C es un gráfico que representa la actividad de estallido respiratorio en PMN estimulados con LPS (100 ng/mL) ± preincubación durante 1 hora con CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM). La generación de ROS se midió utilizando un ensayo de dihidrorrodamina. Las columnas indican la generación de ROS mostrada como porcentaje de eventos activados ± EEM.

La figura 18D es un gráfico que representa la muerte bacteriana total, fagocítica y extracelular mediada por NET causada por PMN humanos estimulados con LPS (100 ng/mL) ± pretratamiento con CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM). * indica p<0,05 y ** indica p<0,01.

La figura 18E es un gráfico que representa la expresión de p-selectina en plaquetas tras la preincubación con CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM) antes de la estimulación con trombina (0,1 UI/ml), como se indica. La línea discontinua indica el nivel de expresión de p-selectina en plaquetas al inicio del estudio. f indica p<0,001 para los grupos CRISPP y SCR en comparación con los tres grupos estimulados con trombina y el valor inicial.

La figura 18F es un gráfico que representa la agregación de PMN estimulada por LPS con plaquetas activadas con trombina (0,1 UI/ml) ± preincubación con CRISPP (10 nM) o SCR (10 nM). La línea discontinua representa el grupo de control LPS. * indica p<0,05 para los grupos CRISPP/Factor IIa y SCR/Factor IIa en comparación con el valor inicial.

La figura 18G es una serie de imágenes que representan la absorción de PMN, plaquetas y PMN coincubados y plaquetas, como se indica, con la etiqueta CRISPP-FLAG (1 nM) y la etiqueta SCR-FLAG (1 nM).

La figura 19A es una serie de imágenes que representan el área nuclear de los PMN preincubados con CRISPP (1 nM), SCR (1 nM) o Sivelestat (200 nM) antes de la estimulación con PMA (20 nM), como se indica. Las puntas de flecha blancas resaltan los núcleos descondensados.

La figura 19^b es un gráfico que cuantifica los resultados de los ensayos representados en la FIG. 19A. ** indica p<0,01 y *** indica p<0,001.

La figura 19C es una serie de imágenes que muestran la localización celular del péptido SCR y CRISPP marcado con FLAG, como se indica.

La figura 19D es una serie de imágenes que muestran la colocalización de la elastasa de neutrófilos y el péptido CRISPP-F. La imagen de control (Co) representa PMN tratados con ambos anticuerpos pero sin tratamiento con péptido marcado con FLAG.

La figura 20 es un gráfico que representa una evaluación de diez ratones en cada uno de los cuatro grupos: sin tratamiento, E. coli, CRISPP-Post/E. coli, y SCR-Post/E. coli.

La figura 21A es una serie de imágenes que muestran la formación de NET después de la estimulación con LPS ± pretratamiento con CRISPP, CRIs Pp-F o SCR-F, como se indica.

La figura 21B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de liberación de histona H3 para cuantificar la formación de NET en respuesta a la estimulación con LPS después de la incubación previa con SCR, CRISPP o CRISPP-FLAG. El contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia ± EEM) se representa en el eje y. * indica p<0,05.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

[0021] Un "péptido inhibidor de NET (NIP)" es un agente antiinflamatorio que inhibe la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los ejemplos de NIP incluyen, pero no se limitan a: un factor inhibidor de NET neonatal (nNIF); una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF; un análogo de una forma natural de nNIF, el cual inhibe la NETosis y/o la formación de NET y está estructuralmente alterado, en relación con un nNIF humano dado, por al menos la adición, deleción, sustitución de un aminoácido o por la incorporación de uno o más aminoácidos con un grupo bloqueante; una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF; un péptido relacionado con nNIF (nNRP); una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNRP; un análogo de nNRP; o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNRP.

[0022] Un "péptido que es un factor inhibidor de neutrófilos neonatal" o "péptido nNIF" se define en este documento como un nNIF que se produce de forma natural en los mamíferos.

[0023] Un "péptido neonatal relacionado con NIF" o "nNRP" se define en el presente documento como un péptido de reconocimiento de la SCM asociada con el cáncer, de supresión de la defensa inmune y de protección de la serina proteasa (CRISPP) que se produce de forma natural en los seres humanos; A1ATm358, que se ha demostrado que inhibe la formación de NET; y otros péptidos relacionados con nNIF; y como análogos de formas naturales de nNRP que inhiben la NETosis y/o la formación de NET y están estructuralmente alterados, en relación con un nNRP humano determinado, por al menos la adición, deleción o sustitución de un aminoácido o por la incorporación de uno o más aminoácidos con un grupo bloqueante.

[0024] Los "trastornos inflamatorios" se definen en este documento como trastornos caracterizados por una inflamación patológica. Los trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, afecciones asociadas con la infección, la autoinmunidad y la alergia. Los trastornos inflamatorios, tal como se definen en el presente documento, pueden incluir, entre otros, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística, inflamación en el cáncer y sus complicaciones, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad pulmonar inflamatoria (EPI), neumonitis inducida por gripe, enterocolitis necrosante (ECN), enfermedad pulmonar crónica (EPC) neonatal, periodontitis, preeclampsia, retinopatía del prematuro (RDP), sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS ), trombosis, lesión pulmonar aguda producida por transfusión (TRALI, por sus siglas en inglés), vasculitis, síndromes autoinmunitarios que incluyen, entre otros, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES) y granulomatosis de Wegener (GW), y trastornos inflamatorios no resueltos. Hay otros trastornos inflamatorios que no se enumeran en este documento pero que son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, véase Kumar et al., Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, pp. 43-77, 8th Edition, 2010, Saunders Elsevier, Philadelphia, PA; Nathan, Nature, 2002, 420: 846-852; y Amulic et al., Annu Rev Immunol, 2012, 30: 459-489.

[0025] La frase "no reduce globalmente la función de los leucocitos polimorfonucleares (PMN)", cuando se usa en relación con un NIP, significa que, aunque el NIP puede inhibir o inhibir sustancialmente la NETosis, el NIP no inhibe ni inhibe sustancialmente otras funciones de los PMN. Otras funciones de los PMN incluyen, entre otras, la quimiotaxis, la síntesis y secreción de quimiocinas, la síntesis y secreción de citocinas, la destrucción de bacterias extracelulares, la destrucción de bacterias intracelulares, la fagocitosis y/o la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los métodos para analizar estas funciones se conocen en la técnica. Por ejemplo, en el Ejemplo 11 se describen métodos para evaluar la destrucción de bacterias fagocíticas.

Métodos

[0026] Esta invención está relacionada con usos terapéuticos y relacionados de péptidos inhibidores de NET (NIP), factores inhibidores de NET neonatales (nNIF), análogos de nNIF, péptidos relacionados con nNIF (nNRP) y análogos de nNRP, particularmente para inhibir la NETosis y/o la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET).

[0027] En el presente documento se describen métodos para tratar trastornos inflamatorios.

[0028] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un NIP, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un NIP, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico, para reducir un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio. Los efectos o síntomas patológicos pueden incluir uno o más de los siguientes: dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón y/o edema, hipotensión, fibrosis y/o fibrosis postinflamatoria, insuficiencia orgánica terminal (es decir, renal, cardíaca, hepática), daño tisular y/o pérdida de la función.

[0029] En algunas formas de realización, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para usar en métodos para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0030] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un análogo de nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0031] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un nNRP, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNRP, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0032] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un análogo de nNRP, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNRP, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0033] En algunos aspectos, el paciente puede ser un mamífero. En ciertos aspectos, el paciente puede ser un ser humano. Cualquier paciente o sujeto que requiera la inhibición de la NETosis y/o la formación de NET puede ser potencialmente un candidato para el tratamiento con un NIP, una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un NIP, un nNIF, una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF, un análogo de nNIF, un sal de un análogo de nNIF, un nNRP, una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNRP, un análogo de nNRP y/o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNRP.

[0034] El trastorno inflamatorio puede implicar al menos parcialmente o estar parcialmente causado por la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y/o NETosis. En algunas formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno inflamatorio agudo, un trastorno inflamatorio crónico y/o un trastorno inmunitario. En otras formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno autoinmunitario. En otros aspectos, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno de la coagulación.

[0035] En algunas formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser uno o más de, entre otros, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística, inflamación en el cáncer y sus complicaciones, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad pulmonar inflamatoria (EPI), neumonitis inducida por gripe, enterocolitis necrosante (ECN), enfermedad pulmonar crónica (EPC) neonatal, periodontitis, preeclampsia, retinopatía del prematuro (RDP), sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), trombosis, lesión pulmonar aguda producida por transfusión (TRALI), vasculitis, síndromes autoinmunitarios que incluyen, entre otros, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES) y granulomatosis de Wegener (GW), y trastornos inflamatorios no resueltos. Hay otros trastornos inflamatorios que no se enumeran en este documento pero que son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, véase Kumar et al., Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, pp.

43-77, 8th Edition, 2010, Saunders Elsevier, Philadelphia, PA; Nathan, Nature, 2002, 420: 846-852; y Amulic et al., Annu Rev Immunol, 2012, 30: 459-489.

[0036] En algunos aspectos, la composición farmacéutica puede inhibir sustancialmente la formación de NET y/o la NETosis. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede inhibir o inhibir sustancialmente el daño tisular inflamatorio mediado por NET.

[0037] La forma particular de nNIF y/o su sal seleccionada para inhibir la NETosis y/o la formación de NET se puede preparar mediante una variedad de técnicas conocidas para generar productos peptídicos. Por ejemplo, las formas vertebradas de nNIF y nNRP pueden obtenerse mediante extracción de la fuente natural, utilizando una combinación adecuada de técnicas de aislamiento de proteínas. Otras técnicas también están dentro del alcance de esta divulgación.

[0038] Los análogos de nNIF y/o sus sales pueden sintetizarse usando técnicas estándar de química de péptidos y pueden evaluarse su inhibición de NETosis y/o actividad de formación de NET. Con respecto a la síntesis, el nNIF o el análogo de nNIF seleccionado y/o su sal se pueden preparar mediante una variedad de técnicas para generar productos peptídicos. Los nNIF y los análogos de nNIF y/o sus sales que incorporan solo L-aminoácidos pueden producirse en cantidades comerciales mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante. Para este propósito, el ADN que codifica el nNIF o el análogo de nNIF deseado se incorpora a un vector de expresión y se transforma en una célula hospedadora (por ejemplo, célula de mamífero, levadura o bacteria) que luego se cultiva en condiciones apropiadas para la expresión de nNIF o análogos de nNIF. Se ha adaptado una variedad de sistemas de expresión génica para este propósito, y normalmente causan la expresión del gen deseado a partir de elementos reguladores de la expresión utilizados de forma natural por el hospedador elegido.

[0039] En un enfoque aplicable a la producción de un nNIF o análogo de nNIF seleccionado, y uno que puede usarse para producir un nNIF o análogo de nNIF que incorpora aminoácidos no codificados genéticamente y formas derivatizadas N- y C-terminal, puede emplearse las técnicas de síntesis de péptidos automatizada, cuyas descripciones generales aparecen, por ejemplo, en Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York, NY; y Applied Biosystems 430A Users Manual, 1987, ABI Inc., Foster City, CA. En estas técnicas, un NIP, nNIF, análogo de nNIF, nNRP y/o análogo de nNRP se cultiva a partir de su residuo del C-terminal conjugado con resina mediante la adición secuencial de aminoácidos protegidos adecuadamente, utilizando los protocolos 9-fluoroenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o tert-butiloxicarbonilo (í-Boc), como se describe, por ejemplo, en Orskov et al., FEBS Lett, 1989, 247(2): 193-196.

[0040] Una vez que el nNIF o el análogo de nNIF deseado se ha sintetizado, escindido de la resina y desprotegido completamente, el péptido se puede purificar para asegurar la recuperación de un solo oligopéptido que tenga la secuencia de aminoácidos seleccionada. La purificación se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos estándar, que incluyen, entre otros, cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) en columnas de sílice alquilada (por ejemplo, sílice de C4, C8 o C18). Tal fraccionamiento de columna generalmente se logra ejecutando gradientes lineales (por ejemplo, 10-90 %) de porcentaje creciente de disolvente orgánico (por ejemplo, acetonitrilo, en tampón acuoso) que normalmente contiene una pequeña cantidad (por ejemplo, un 0,1 %) de un agente de emparejamiento como el ácido trifluoroacético (TFA) o la trietanolamina (TEA). Alternativamente, puede emplearse HPLC de intercambio iónico para separar especies peptídicas en función de sus características de carga. Las fracciones de la columna se recogen, y las que contienen el péptido de la pureza deseada y/o requerida se agrupan opcionalmente. En un aspecto de la invención, el nNIF o el análogo de nNIF se pueden tratar de la manera establecida para intercambiar el ácido de escisión (por ejemplo, TFA) con un ácido aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como ácido acético, clorhídrico, fosfórico, maleico, tartárico, succínico y similares, para generar una sal de adición de ácido del péptido aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

[0041] Los análogos de los nNIF humanos se pueden generar usando técnicas estándar de química de péptidos y se pueden evaluar para inhibir la NETosis y/o la actividad de formación de NET, todo de acuerdo con las pautas proporcionadas en este documento. Los análogos de la invención son aquellos basados en las secuencias de nNIF humanos (SEQ ID NO: 1). También se muestra la secuencia de CRISPP (SEQ ID NO: 2) (donde X puede ser cualquier aminoácido natural):

SEQ ID N.°: 1 KAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFM GKVVNPTQK SEQ ID N.°: 2 MXIPPEVKFNKPFVFLMIDQNTKVPLFMGK

[0042] En ciertos aspectos, los análogos de nNIF son al menos tan activos como los NIP, nNIF y/o nNRP humanos nativos. La actividad inhibidora de NET puede determinarse in vitro como se describe en esta divulgación. En otros aspectos, el nNIF tiene una o más propiedades mejoradas en comparación con el nNIF humano nativo. Por ejemplo, dichos análogos pueden poseer una mayor estabilidad en suero, una mayor unión al receptor y una mayor actividad de transducción de señales. Otras modificaciones de nNIF y análogos de nNIF que pueden emplearse de manera útil en esta descripción son aquellas que hacen que la molécula sea resistente a la oxidación.

[0043] Un investigador puede determinar si se puede usar un nNIF, un análogo de nNIF y/o una sal del mismo para tratar un trastorno inflamatorio mediante la administración del péptido o del análogo a individuos que tienen el trastorno inflamatorio. El investigador puede entonces determinar, usando biomarcadores de diagnóstico, si los individuos tratados de este modo muestran una disminución de la inflamación y una mejora de la enfermedad inflamatoria.

[0044] La descripción también abarca sustituciones no conservativas de aminoácidos en cualquier secuencia de nNIF de vertebrados, siempre que las sustituciones no conservativas se produzcan en posiciones de aminoácidos que se sabe que varían en nNIF aislados de diferentes especies. Las posiciones de residuos no conservados se determinan fácilmente alineando secuencias conocidas de nNIF de vertebrados.

[0045] Para la administración a pacientes, el nNIF, o el análogo de nNIF, el péptido y/o la sal del mismo, puede proporcionarse en una forma aceptable desde el punto de vista farmacéutico (por ejemplo, como una preparación esterilizada por filtración, por ejemplo, a través de un filtro de 0,22 p y sustancialmente libre de pirógenos). Se puede desear que el péptido nNIF que se va a formular migre como un pico único o individualizado en HPLC, muestre una composición y secuencia de aminoácidos auténtica y uniforme tras su análisis y, por lo demás, cumpla con los estándares establecidos por los diversos organismos nacionales que regulan la calidad de los productos farmacéuticos.

[0046] El portador o vehículo acuoso puede complementarse para su uso como inyectable con una cantidad de gelatina que sirve para depositar el nNIF o el análogo de nNIF y/o su sal en el sitio de inyección o cerca de él, para su liberación lenta en el sitio de acción deseado. Se espera que las concentraciones de gelatina eficaces para lograr el efecto de depósito estén en el rango de 10-20 %. Los gelificantes alternativos, como el ácido hialurónico (HA), también pueden ser útiles como agentes de depósito.

[0047] Los nNIF, o los análogos de nNIF y/o sus sales de la presente divulgación también se pueden formular como formulaciones de implantación de liberación lenta para la administración prolongada y sostenida del nNIF, o el análogo de nNIF y/o su sal. Los ejemplos de dichas formulaciones de liberación sostenida incluyen compuestos de polímeros biocompatibles, tales como ácido poli(láctico), ácido poli(láctico-co-glicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno y similares. La estructura, selección y uso de polímeros degradables en vehículos de administración de fármacos se han revisado en varias publicaciones, que incluyen, Domb et al., Polym Advan Technol, 1992, 3: 279-292. Se puede encontrar orientación adicional sobre la selección y el uso de polímeros en formulaciones farmacéuticas en el texto de Chasin y Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Vol. 45 of Dekker, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, 1990, New York, NY. Los liposomas también se pueden usar para proporcionar la liberación sostenida de un nNIF, o un análogo de nNIF y/o una sal del mismo. Los detalles sobre cómo usar y preparar formulaciones liposomales de fármacos de interés se pueden encontrar, entre otras fuentes, en las patentes de EE. UU. n.° 4,944,948; 5,008,050; 4,921,706; 4,927,637; 4,452,747; 4,016,100; 4,311,712; 4,370,349; 4,372,949; 4,529,561; 5,009,956; 4,725,442; 4,737,323; y 4,920,016. Las formulaciones de liberación sostenida pueden ser de particular interés cuando se desea proporcionar una concentración local alta de un nNIF, o un análogo de nNIF y/o una sal del mismo (por ejemplo, cerca del sitio de inflamación para inhibir la NETosis y/o la formación de NET, etc.).

[0048] Los nNIF, o los análogos de nNIF y/o sus sales de la presente invención también pueden incorporarse en un dispositivo o dispositivos, tanto implantados como tópicos, para la administración prolongada y sostenida del nNIF, o el análogo de nNIF y/o su sal.

[0049] Para uso terapéutico, el nNIF elegido o el análogo de nNIF y/o la sal del mismo pueden formularse con un vehículo que sea aceptable desde el punto de vista farmacéutico y apropiado para administrar el péptido por la vía de administración elegida. Los vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico adecuados son los utilizados convencionalmente con fármacos basados en péptidos, tales como diluyentes, excipientes y similares. Se puede hacer referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London, UK. En un aspecto, los compuestos pueden formularse para la administración por infusión o por inyección (por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa), y en consecuencia se pueden utilizar como soluciones acuosas en forma estéril y libre de pirógenos y, opcionalmente, reguladas a un pH fisiológicamente tolerable (por ejemplo, un pH ligeramente ácido o fisiológico). Por lo tanto, los compuestos pueden administrarse en un vehículo tal como agua destilada, solución salina, solución salina regulada con fosfato o solución de dextrosa al 5 %. La solubilidad en agua del nNIF, o del análogo de nNIF y/o de una de sus sales, puede mejorarse, si se desea, incorporando un potenciador de la solubilidad, tal como ácido acético.

[0050] En el presente documento se describen métodos para tratar las complicaciones de la prematuridad.

[0051] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene una complicación derivada de la prematuridad que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un NIP, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un NIP, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto o síntoma patológico de la complicación derivada de la prematuridad, como la necesidad prolongada de soporte de oxígeno asociada con la enfermedad pulmonar crónica neonatal o la necesidad de intervención quirúrgica o nutrición parenteral total prolongada en lactantes que desarrollan enterocolitis necrosante.

[0052] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene una complicación derivada de la prematuridad que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto o síntoma patológico de la complicación derivada de la prematuridad.

[0053] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene una complicación derivada de la prematuridad que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un análogo de nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir un efecto patológico o síntoma de la complicación derivada de la prematuridad.

[0054] En algunos aspectos, el paciente puede ser un mamífero. En algunos aspectos, el paciente puede ser un ser humano.

[0055] La complicación derivada de la prematuridad puede implicar al menos parcialmente o ser causada al menos parcialmente por la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y/o la NETosis. En ciertos aspectos, la composición farmacéutica puede inhibir sustancialmente la formación de NET y/o la NETosis. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede inhibir o inhibir sustancialmente el daño tisular inflamatorio mediado por NET.

[0056] La complicación derivada de la prematuridad puede ser una o más de, entre otras, enterocolitis necrosante (^eCⁿ ), síndrome de dificultad respiratoria (SDR), neumonía, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar crónica (EPC) neonatal, retraso en el desarrollo neurológico, retinopatía de la prematuridad (RDP) y/o sepsis.

[0057] Otro aspecto de la descripción se refiere a un péptido nNIF para su uso en métodos de profilaxis contra trastornos inflamatorios.

[0058] En el presente documento se describen métodos de profilaxis contra un trastorno inflamatorio en un paciente con riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un NIP, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un NIP, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir el riesgo de desarrollar un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0059] En el presente documento se describen métodos de profilaxis contra un trastorno inflamatorio en un paciente con riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir el riesgo de desarrollar un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0060] La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un análogo de nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para usar en métodos de profilaxis contra un trastorno inflamatorio en un paciente con riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un análogo de nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir el riesgo de desarrollar un efecto patológico o síntoma del trastorno inflamatorio.

[0061] En algunos aspectos, el paciente puede ser un mamífero. En otros aspectos, el paciente puede ser un ser humano.

[0062] El trastorno inflamatorio puede implicar al menos parcialmente o estar parcialmente causado por la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y/o la NETosis. En algunas formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno inflamatorio agudo. En otras formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno inflamatorio crónico. En otras formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno autoinmunitario. En algunos aspectos, el trastorno inflamatorio puede ser un trastorno de la coagulación.

[0063] En algunas formas de realización, el trastorno inflamatorio puede ser uno o más de, entre otros, los trastornos inflamatorios definidos y/o enumerados anteriormente.

[0064] La composición farmacéutica puede inhibir sustancialmente la formación de NET y/o la NETosis. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede inhibir o inhibir sustancialmente el daño tisular inflamatorio mediado por NET.

[0065] En el presente documento se describen métodos de profilaxis contra las complicaciones derivadas de la prematuridad.

[0066] En el presente documento se describen métodos de profilaxis contra las complicaciones derivadas de la prematuridad en un paciente con riesgo de desarrollar una complicación derivada de la prematuridad que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un nNIF neonatal, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF, y un vehículo aceptable para reducir el riesgo de desarrollar un efecto patológico o síntoma de la complicación derivada de la prematuridad.

[0067] En el presente documento se describen métodos de profilaxis contra las complicaciones de la prematuridad en un paciente con riesgo de desarrollar una complicación derivada de la prematuridad, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un análogo de nNIF, o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico para reducir el riesgo de desarrollar un efecto patológico o síntoma de la complicación derivada de la prematuridad.

[0068] En algunos aspectos, el paciente puede ser un mamífero. En otros aspectos, el paciente puede ser un ser humano.

[0069] En algunos aspectos, la complicación derivada de la prematuridad puede implicar al menos parcialmente o estar causada al menos parcialmente por la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y/o NETosis. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede inhibir sustancialmente la formación de NET y/o la NETosis. En otros aspectos más, la composición farmacéutica puede inhibir o inhibir sustancialmente el daño tisular inflamatorio mediado por NET.

[0070] La complicación derivada de la prematuridad puede ser una o más de, entre otras, enterocolitis necrosante (eCn ), síndrome de dificultad respiratoria (SDR), neumonía, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar crónica (EPC) neonatal, retraso en el desarrollo neurológico, retinopatía de la prematuridad (RDP) y/o sepsis.

Composiciones farmacéuticas

[0071] En otro aspecto, esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden NIP.

[0072] En algunas formas de realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un factor inhibidor de NET neonatal (nNIF) o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un nNIF y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La composición farmacéutica puede comprender un análogo de nNIF o una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico de un análogo de nNIF y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

[0073] El nNIF, o su sal, comprende la secuencia de aminoácidos:

KFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQ.

[0074] En otros aspectos, al menos un aminoácido del análogo de nNIF, o la sal del análogo de nNIF, puede unirse a un modificador químico. En algunos aspectos, el modificador químico se puede seleccionar de entre al menos uno de un lípido, un polietilenglicol (PEG), un sacárido o cualquier otra molécula adecuada. Otras modificaciones químicas de la composición farmacéutica, por ejemplo, cationización, metilación y ciclación, también están dentro del alcance de esta invención.

[0075] La unión de un lípido al péptido (lipidización) puede aumentar la lipofilia de la composición farmacéutica.

[0076] La unión de un PEG al péptido (PEGilación) aumenta el peso molecular del péptido. En algunos aspectos, la PEGilación puede mejorar la solubilidad de la composición farmacéutica. En otros aspectos, la PEGilación puede reducir la frecuencia de dosificación y/o la toxicidad de la composición farmacéutica. En otros aspectos, la PEGilación puede extender la vida en circulación de la composición farmacéutica y/o extender la estabilidad de la composición farmacéutica y/o puede mejorar la protección de la composición farmacéutica contra la degradación proteolítica. La PEGilación también puede reducir la inmunogenicidad y/o la antigenicidad de la composición farmacéutica.

[0077] La unión de uno o más sacáridos al péptido (glicosilación) puede cumplir una variedad de funciones funcionales y/o estructurales en la composición farmacéutica. La glicosilación puede mejorar la administración de la composición farmacéutica a un sitio o sitios de elección. La glicosilación también puede reducir la toxicidad de la composición farmacéutica.

[0078] La composición farmacéutica que comprende el análogo de nNIF, o la sal del análogo de nNIF, puede estar presente en una cantidad eficaz para inhibir, o para inhibir sustancialmente, el daño seleccionado de al menos uno de entre daño tisular inflamatorio y/o daño vascular inflamatorio.

[0079] La composición farmacéutica que comprende el análogo de nNIF, o la sal del análogo de nNIF, puede no reducir globalmente las funciones de los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Las funciones de los PMN incluyen, pero no se limitan a, quimiotaxis, fagocitosis, generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), síntesis y secreción de citocinas/quimiocinas, formación de NET/NETosis y/o destrucción bacteriana intracelular/extracelular. En ciertos aspectos, la composición farmacéutica puede no inhibir o inhibir sustancialmente la fagocitosis de PMN. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede no inhibir o inhibir sustancialmente la quimiotaxis de PMN. En otros aspectos más, la composición farmacéutica puede no inhibir o inhibir sustancialmente la generación de ROS. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede no inhibir o inhibir sustancialmente la destrucción de bacterias intracelulares de PMN.

[0080] En algunos aspectos, la composición farmacéutica puede comprender un análogo de nNIF, una sal de un análogo de nNIF, y el análogo o la sal del análogo puede no ser un análogo o una sal del análogo de origen natural.

[0081] La composición farmacéutica puede estar presente en una cantidad eficaz para inhibir, o para inhibir sustancialmente, la formación de NET y/o la NETosis. En algunas formas de realización, la formación de NET y/o la NETosis puede ser estimulada por una bacteria, un hongo, un parásito, un virus y/o cualquier otro estimulador apropiado de la formación de NET y/o la NETosis. En ciertas formas de realización, el virus puede ser un virus de fiebre hemorrágica. Los virus de fiebre hemorrágica se describen, por ejemplo, en Borio et al., JAMA, 2002, 287(18): 2391-2405 e incluyen, pero no se limitan a, filovirus tales como el virus del Ébola y el virus de Marburgo, arenavirus tales como el virus de Lassa, hantavirus y flavivirus tales como el virus del dengue y el virus de la fiebre amarilla. En otras formas de realización, la formación de NET y/o la NETosis puede ser estimulada por una o más especies bacterianas, incluidas, entre otras, especies de Bacillus, especies de Escherichia, especies de Francisella, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, especies de Yersinia y/o cualquier otra bacteria o bacteria gramnegativa o grampositiva apropiada. En las formas de realización, la especie de Bacillus puede ser Bacillus Anthracis (ántrax). En las formas de realización, la especie de Escherichia puede ser Escherichia coli. En las formas de realización, la especie de Francisella puede ser Francisella tularensis (tularemia). En las formas de realización, la especie de Staphylococcus puede ser Staphylococcus aureus.

[0082] En otros aspectos, la formación de NET y/o la NETosis puede ser estimulada por beta-defensina 1, VIH-1, lipopolisacárido (LPS), forbol miristato acetato (PMA) y/o toxina alfa de Staphylococcus aureus.

[0083] En un aspecto adicional, esta invención se refiere a composiciones para inhibir la formación de NET y/o la NETosis en un mamífero.

[0084] En algunos aspectos, una composición para inhibir la formación de NET y/o la NETosis en un mamífero puede comprender un nNIF, una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico del nNIF, un análogo del nNIF, una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico del análogo del nNIF y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. En ciertos aspectos, el mamífero puede ser un ser humano.

Péptidos aislados y purificados

[0085] En otro aspecto, esta invención se refiere a un péptido inhibidor de NET (NIP).

[0086] En otro aspecto, esta invención se refiere a un análogo de nNIF proteico. En algunos aspectos, el análogo de nNIF proteico puede ser un análogo de nNIF aislado y purificado.

[0087] Se puede determinar una pauta posológica y un protocolo de tratamiento eficaces mediante medios convencionales, por ejemplo, comenzando con una dosis baja en animales de laboratorio y luego aumentando la dosis mientras se controlan los efectos, y también variando sistemáticamente la pauta posológica. Un médico puede tener en cuenta numerosos factores al determinar una pauta posológica óptima para un sujeto dado. El principal de ellos es si algún NIP circula normalmente en el plasma y, de ser así, la cantidad de dicho NIP. Los factores adicionales incluyen el tamaño del paciente, la edad del paciente, el estado general del paciente, el trastorno particular que se está tratando, la gravedad del trastorno, la presencia de otros medicamentos en el paciente, la actividad in vivo del nNIF, análogo de nNIF, sal del mismo y similares. Las pautas posológicas de prueba se pueden elegir después de tenr en cuenta los resultados de los estudios en animales y la literatura clínica.

[0088] Hay muchos regímenes terapéuticos específicos que se utilizan para evaluar si una molécula tiene el efecto deseado. Un investigador que se enfrente a la tarea de determinar si un nNIF o un análogo de nNIF en particular puede usarse para inhibir la NETosis y/o la formación de NET elegiría el régimen apropiado para hacer esta determinación.

[0089] Los métodos de administración y las formulaciones útiles para administrar péptidos a individuos se conocen en la técnica, y un experto en la materia podría determinar la idoneidad de cualquier método particular de administración de un péptido a un individuo para circunstancias particulares. Solo con fines ilustrativos, se proporcionan los siguientes ejemplos de métodos y formulaciones para administrar péptidos a individuos.

[0090] Los péptidos pueden administrarse a individuos por vía oral; sin embargo, las acciones del sistema digestivo pueden reducir la biodisponibilidad de los péptidos. Para aumentar la biodisponibilidad oral de los péptidos, estos pueden administrarse en formulaciones que contienen inhibidores de enzimas, o pueden administrarse como parte de una micela, nanopartícula o emulsión para proteger al péptido de la actividad digestiva.

[0091] Los péptidos también pueden administrarse mediante una inyección. Los péptidos pueden inyectarse por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. Se encuentra una divulgación adicional con respecto a los métodos de administración de péptidos mediante inyección, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5,952,301.

[0092] Los péptidos pueden administrarse además por administración pulmonar. Se puede usar un sistema de inhalación de polvo seco, en el que los péptidos se absorben a través del tejido de los pulmones, lo que permite la administración sin inyección, evitando la reducción potencial de la biodisponibilidad que se observa con la administración oral. Véase Onoue et al., Expert Opin Ther Pat, 2008, 18: 429.

[0093] Para su uso en la inhibición de la NETosis de y/o la formación de NET en un mamífero, incluido un ser humano, la presente descripción proporciona en uno de sus aspectos un paquete o kit, en forma de un frasco o ampolla estéril, que contiene una cantidad de un nNIF, un análogo de nNIF y/o una sal del mismo capaz de inhibir la formación de NET y/o la NETosis en cantidades de dosis unitaria o multidosis, en el que el paquete o kit incorpora una etiqueta que indica el uso de su contenido para la inhibición de dicha NETosis y/o formación de NET. En un aspecto, el paquete o kit contiene el nNIF, el análogo de nNIF y/o la sal del mismo y el vehículo deseado, como una formulación lista para la administración. Alternativamente, el paquete o kit proporciona el nNIF, el análogo de nNIF y/o la sal del mismo, en una forma, tal como una forma liofilizada, adecuada para la reconstitución en un vehículo adecuado, como una solución salina regulada con fosfato.

[0094] En un aspecto, el paquete o kit es un frasco o ampolla estéril que contiene una solución inyectable que comprende una cantidad de nNIF, análogo de nNIF y/o sal del mismo eficaz para inhibir la formación de NET y/o la NETosis disuelta en un vehículo acuoso.

EJEMPLOS

[0095] Para ilustrar mejor estos aspectos, se proporcionan los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada, que debe determinarse únicamente en función de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Comparación de PMN de humano adulto y de neonato

[0096] La formación de NET se evaluó en PMN de humano adulto y de neonato. En contraste con los PMN de humano adulto, como se muestra en la FIG. 1B, los PMN de neonato aislados de la sangre del cordón umbilical no forman NET. Además, se evaluó la muerte bacteriana mediada por NET en PMN de humano adulto y de neonato. Como se indica en la fig. 1C, los PMN de neonato muestran una destrucción bacteriana total y mediada por NET significativamente menor en comparación con los PMN de adulto. *p < 0,05, **p < 0,001.

Ejemplo 2 - Inducción de la formación de NET por sepsis por S. aureus

[0097] La formación de NET se evaluó en PMN humanos de control y estimulados en un punto temporal de 1 hora. Los PMN humanos se estimularon con LPS, plasma de control o con plasma aislado de pacientes con sepsis por S. aureus. El plasma de pacientes con sepsis por S. aureus induce la formación de NET por PMN humanos, como se muestra en las FIGS. 2A-2C.

Ejemplo 3: observación de la formación de NET alterada al nacer

[0098] Los PMN se aislaron de la sangre del cordón umbilical de bebés nacidos con menos de 30 semanas de gestación y, posteriormente, de sangre periférica extraída de los mismos bebés de manera repetida durante los primeros 60 días de vida. Como se muestra en las FIGS. 3A-3C, la formación de NET se evaluó cualitativa y cuantitativamente, y se observó una formación de NET alterada por los PMN en el momento del nacimiento. Por el contrario, se observó una sólida formación de NET por parte de los PMN a partir de muestras de sangre aisladas el día 3 de vida o más tarde.

Ejemplo 4 - Demostración del inhibidor de la formación de NET en la sangre del cordón umbilical

[0099] Se preincubaron PMN de donantes adultos sanos y de bebés prematuros de 28 días de edad durante una hora con plasma de sangre de cordón umbilical descongelado de ese bebé prematuro en particular o con plasma autólogo recolectado ese día de la muestra de sangre periférica del bebé prematuro o de la muestra de sangre del adulto sano. Luego se evaluó la formación de NET in vitro después de la estimulación con LPS (100 ng/ml) durante 2 horas. La preincubación con plasma de sangre de cordón umbilical redujo significativamente la formación de NET por PMN estimulados con LPS tanto neonatales como adultos en comparación con los PMN preincubados con plasma de control (véanse las figuras 3B y 14C).

[0100] Como se ilustra en las Figs. 3B y 14C, los experimentos de preincubación con sangre del cordón umbilical humano demuestran que el plasma de la sangre del cordón umbilical puede inhibir la formación de NET por PMN de bebés prematuros autólogos en el día de vida 28 y PMN de donantes adultos sanos, mientras que la preincubación con plasma autólogo aislado de los sujetos de estudio respectivos en ese día puede que no. En la figura 3B se muestra ADN extracelular asociado a NET y ADN nuclear (aumento de 60x).

[0101] La liberación de histona extracelular H3 se usó como un sustituto cuantificable para la formación de NET como se muestra en la FIG. 14C. Como se ilustra, el contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y, y los datos de cinco PMN de bebés prematuros en el día 28 de vida y cinco PMN de adultos, de los experimentos de cambio de plasma descritos anteriormente, se representan en el eje x. * indica p<0,05 LPS/Adulto frente a LPS/Prematuro, ** indica p<0,01 LPS/Prematuro frente a LPS de sangre de cordón umbilical/Prematuro, y f indica p<0,001 LPS/Adulto frente a LPS de sangre de cordón umbilical/Adulto. Se empleó la herramienta estadística ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey.

[0102] Los experimentos de cambio de plasma de sangre de cordón umbilical y de sangre periférica demostraron que el plasma de sangre de cordón umbilical autólogo inhibe la formación de NET por PMN competentes para la formación de NET aislados del mismo bebé el día 28 de vida, y también por PMN aislados de adultos sanos, lo que indica que un factor inhibidor que bloquea la formación de NET por los PMN está presente en la sangre del cordón umbilical, pero esa actividad del factor desaparece o se reduce drásticamente después del nacimiento (véanse las Figuras 3B y 3C).

Ejemplo 5 - Identificación del factor inhibidor de NET neonatal (nNIF)

[0103] Se utilizaron técnicas proteómicas para comparar el proteoma del plasma de la sangre del cordón umbilical con el del plasma aislado del mismo lactante prematuro a los 28 días de edad (véanse las Figuras 3B y 14C). Después de una eliminación abundante de proteínas, se realizó una electroforesis en gel bidimensional en paralelo en cada muestra de plasma, separando las proteínas primero por isoelectroenfoque y luego por peso molecular. Se observó que seis grupos de proteínas estaban presentes de forma diferente tras la comparación de los dos geles. Cuatro grupos de proteínas estaban presentes en el gel de plasma de sangre de cordón umbilical pero no en el gel de plasma del día 28; dos grupos de proteínas estaban presentes en el gel de plasma del día 28 pero no en el gel de plasma de sangre de cordón umbilical. Cada uno de estos grupos de proteínas se extrajo de los respectivos geles para la identificación de proteínas. Las secuencias de oligopéptidos después de la digestión con tripsina y la espectroscopia de masas en tándem se compararon con la base de datos específica de tripsina humana del NCBI (actualizada hasta el 13 de mayo de 2011). En la figura 4A se incluye una lista parcial de proteínas identificadas por espectroscopia de masas en uno de los grupos de proteínas presentes en el gel de sangre de cordón umbilical pero no en el gel de plasma del día 28. De las proteínas identificadas en este grupo de proteínas, dos péptidos relacionados con pesos moleculares predichos de ~ 4 kD y puntuaciones de proteínas de > 100 se convirtieron en péptidos candidatos para la actividad inhibidora de ⁿ E^t . El nuevo péptido se denominó factor inhibidor de NET neonatal (nNIF). Se conocía en la literatura un péptido relacionado con nNIF (NRP): péptido de reconocimiento de la SCM asociada con el cáncer, de supresión de la defensa inmune y de protección de la serina proteasa (CRISPP). A continuación, se determinó que nNIF y CRISPP tienen una homología significativa con el extremo carboxilo de la alfa 1-antitripsina de longitud completa (AAT, también denominada en el presente documento A1AT) (véase la figura 4C). Usando un anticuerpo policlonal generado con los últimos 18 aminoácidos de la AAT, se demostró mediante transferencia Western que nNIF está presente en mayores cantidades en el plasma de la sangre del cordón umbilical en comparación con el plasma de adultos sanos (véanse las FIGURAS 15A y 15B).

[0104] Como se ha descrito, la expresión de proteínas en el plasma de la sangre del cordón umbilical y el plasma del día de vida 28 del mismo bebé prematuro se comparó mediante electroforesis en gel 2D, y se detectó una mancha proteica presente en la sangre del cordón umbilical pero no en el plasma del día de vida 28. En la FIG.

4A se describe una lista de proteínas candidatas para nNIF de esa mancha proteica después de la espectroscopia de masas con las puntuaciones de proteínas y las masas moleculares esperadas. La lista incluye AAT de longitud completa y dos péptidos de 29 aminoácidos con homología significativa con el extremo carboxilo de la AAT: nNIF y CRISPP. Como se ilustra en la FIG. 4C, nNIF y AAT comparten una homología del terminal carboxilo significativa. También se muestran y comparan las secuencias obtenidas por espectroscopia de masas, y también se compara la secuencia publicada de CRISPP. En la figura 15A se muestra una transferencia de Western utilizando un anticuerpo policlonal en el extremo carbonilo de la AAT, que muestra una mayor expresión de nNIF (~ 4-6 kD) en la sangre del cordón umbilical en comparación con el plasma adulto. Como se muestra en la fig. 15B, estos resultados se cuantificaron usando fluorescencia relativa y se halló una diferencia estadísticamente significativa entre cuatro concentraciones de nNIF en plasma de sangre de cordón umbilical (CB) y las de cuatro controles adultos sanos (A). * indica p<0,05. Se utilizó la prueba de la t de Student como herramienta estadística.

[0105] En resumen, se comparó la expresión de proteínas en la sangre del cordón umbilical y el plasma del día 28 de vida del mismo lactante prematuro mediante electroforesis en gel 2D. Se detectó una mancha proteica presente en la sangre del cordón umbilical pero no en el plasma del día de vida 28. Se identificó un péptido endógeno (~ 4-6 kD) con actividad inhibitoria significativa de NET. Este péptido se denominó provisionalmente factor inhibidor de NET neonatal (nNIF).

Ejemplo 6 - Caracterización del péptido nNIF

[0106] Se usó espectroscopia de masas para caracterizar adicionalmente el péptido nNIF del Ejemplo 5 y para resolver porciones principales de su secuencia. Una lista de proteínas candidatas a nNIF de la mancha proteica del Ejemplo 5 después de la espectroscopia de masas se describe en la FIG. 4A con la masa molecular esperada y la puntuación de proteínas. Como se muestra en la fig. 4C, se observó que nNIF tenía una homología significativa con un fragmento de escisión del extremo carboxilo de la A1AT. Se usó un anticuerpo contra el extremo carboxilo de la A1AT para detectar un péptido de 4-6 kD en el plasma de la sangre del cordón umbilical que solo estaba mínimamente presente en el plasma adulto (véase la figura 4B).

Ejemplo 7 - Caracterización adicional del péptido nNIF

[0107] Se extrajo del plasma de sangre del cordón umbilical toda la A1AT fragmentada y de longitud completa usando purificación por afinidad (AP) con el anticuerpo del extremo carboxilo terminal de A1AT. Como se muestra en las FIGS. 5A-5F, el plasma de sangre de cordón umbilical sin nNIF no pudo inhibir la formación de NET, mientras que el pretratamiento con las proteínas eluidas con AP inhibió la formación de NET por PMN estimulados con LPS. La adición de A1AT de longitud completa recombinante al plasma tratado no inhibió la formación de NET. Estos datos sugieren que nNIF es un fragmento de escisión de A1AT o un péptido similar y no la proteína de longitud completa.

Ejemplo 8: identificación del péptido relacionado con nNIF (nNRP), CRISPP

[0108] Se identificó una homología significativa entre nNIF y el péptido de reconocimiento de la SCM asociada con el cáncer y de protección de la serina proteasa (CRISPP) (véase la figura 4C). Se sintetizó el péptido CRISPP y se observó que CRISPP bloqueó la formación de NET por PMN estimulados por LPS en función de la concentración. Un péptido de control con secuencia aleatoria no bloqueó la formación de NET por PMN estimulados por LPS.

Ejemplo 9 - Inhibición de la formación de NET con tratamiento con CRISPP

[0109] Se evaluó la formación de NET por PMN de adulto estimulados con PMA con o sin preincubación con CRISPP. Como se muestra en las FIGS. 6A y 6B, el pretratamiento con CRISPP (1 nM) durante 1 hora antes de la estimulación inhibió la formación de NET, mientras que el pretratamiento con un péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM) no. Se observó que CRISPP bloquea la formación de NET inducida por PMA.

Ejemplo 10: análisis de la formación de NET en múltiples modelos de infección in vitro

[0110] Se utilizó un ensayo de liberación de histona humana H3 para cuantificar la formación de NET (n=2). La actividad inhibidora de NET de CRISPP se analizó usando modelos in vitro de dos enfermedades infecciosas humanas: bacteriemia por Staphylococcus aureus y dengue. Se ha demostrado previamente que S. aureus induce la formación de NET por PMN de adultos humanos. El pretratamiento con CRISPP bloqueó por completo la formación de NET por PMN humanos incubados con S. aureus vivos (véanse las FIGURAS 7A y 7B). Por el contrario, la incubación con un péptido de control con secuencia aleatoria no bloqueó la formación de NET por parte de los PMN humanos.

[0111] Como se muestra en las FIGS. 8A y 8B, se incubaron PMN humanos con virus del dengue (0,05 MOI) y se evaluó cualitativamente la formación de NET. La incubación simulada usando medios de virus del dengue sin infección sirvió como control. El virus del dengue indujo la formación de NET por PMN de adultos humanos. El pretratamiento con CRISPP (1 nM) durante 1 hora antes de la estimulación bloqueó por completo la formación de NET por parte de los PMN humanos incubados con el virus del dengue. Por el contrario, la incubación con un péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM) no bloqueó la formación de NET por parte de los PMN humanos.

Ejemplo 11 - Determinación del efecto del tratamiento con CRISPP en las funciones de los PMN

[0112] Se evaluó la destrucción bacteriana extracelular total, fagocítica y mediada por NET de una cepa patógena de E. coli por PMN humanos ± estimulación con LPS (100 ng/mL), y los resultados se resumen en la FIG. 9. Los PMN también se pretrataron con CRISPP (1 nM), o un control de péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM). La destrucción fagocítica se inhibió con pretratamiento con citocalasina B y D (10 ^j M). La destrucción mediada por NET se inhibió mediante el tratamiento con DNAsa para desintegrar las NET antes de la adición de la bacteria. El pretratamiento con CRISPP redujo significativamente la destrucción bacteriana total y mediada por NET de E. coli, pero no alteró la destrucción fagocítica, medida usando la herramienta estadística ANOVA unidireccional con el análisis post hoc de la prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls. Ejemplo 12 - Evaluación del efecto del tratamiento con CRISPP en modelos murinos

[0113] La capacidad de CRISPP para inhibir la formación de NET in vivo se evaluó utilizando modelos murinos de peritonitis por E. coli. Se inyectó intraperitonealmente a ratones Swiss-Webster consanguíneos con 4,5 x 107 unidades formadoras de colonias (ufc) de E. coli ± nNIF, CRISPP o péptido de control con secuencia aleatoria (SCR) (10 mg/kg, inyección IP) una hora antes de la infección por E. coli. A las 3 horas de la infección, se sacrificaron 3 ratones y el líquido peritoneal y el tejido peritoneal se recolectaron y se analizó la acumulación de leucocitos, la bacteriología y la formación de NET in vivo. Se determinaron los recuentos de leucocitos mononucleares y polimorfonucleares totales en el líquido peritoneal y se observó un aumento estadísticamente significativo en la acumulación de PMN peritoneal en todos los grupos experimentales en comparación con el control (véase la figura 17A). Los ratones pretratados con CRISPP demostraron un aumento significativo en la acumulación de PMN en comparación con ratones con E. coli solo o pretratados con SCR (véanse las Figuras 17A y 17B). Este resultado parece concordar con una disminución mediada por CRISPP en la muerte de neutrófilos a través de la inhibición de la NETosis. Véase Fuchs et al., J Cell Biol, 2007, 176: 231-241.También se determinó el número de ufc de E. coli /ml de líquido peritoneal en ratones pretratados con CRISPP en comparación con ratones SCR (véase la figura 17C). Se detectó un aumento significativo en la concentración de bacterias en el líquido peritoneal en animales pretratados con CRISPP en comparación con SCR, lo que indica que la inhibición de la NETosis y la formación de NET puede provocar una disminución de la destrucción de bacterias y concentraciones más altas de bacterias en el líquido peritoneal.

[0114] Se hizo un seguimiento de la supervivencia de ratones Swiss consanguíneos en varios grupos de tratamiento después de la inyección intraperitoneal de LPS (20 mg/kg) o E. coli (4 x 107 bacterias), como se muestra en las Figs. 10A y 10B. Los ratones tratados con CRISPP (10 mcg/kg/dosis) recibieron 2 dosis por vía intraperitoneal; una administrada 1 hora antes de la infección y una dosis administrada 6 horas después de la infección. Se siguió la misma dosis, vía de administración y programa para los ratones tratados con péptido de control de control con secuencia aleatoria. Se evaluaron seis ratones en ambos grupos: LPS CRISPP y LPS péptido de control con secuencia aleatoria. La supervivencia del grupo LPS CRISPP fue estadísticamente mayor que la del grupo LPS péptido de control con secuencia aleatoria (p = 0,02). Se evaluaron diez ratones en cada grupo: sin tratamiento, E. coli + CRISPP, y E. coli + péptido de control con secuencia aleatoria. No se administraron antibióticos. No se produjeron muertes en el grupo sin tratamiento. La supervivencia del grupo de E. coli + CRISPP fue estadísticamente mayor que la del grupo E. coli + péptido de control con secuencia aleatoria (p<0,0001). En referencia a la fig. 11, CRISPP también se evaluó en un modelo murino de infección polimicrobiana causada por ligadura y punción del ciego (CL/P). La CL/P también se realizó sin tratamiento antibiótico concomitante. Se evaluaron diez ratones en cada uno de los grupos CL/P. La supervivencia del grupo CL/P CRISPP se acercó a la significación estadística en comparación con el grupo de control CL/P (p=0,06). La figura 20 es un gráfico que representa la evaluación de diez ratones de cada uno de los siguientes grupos: sin tratamiento, E. coli, CRISPP-Post/E. coli, y SCR-Post/E. coli. El aumento de la supervivencia observado en ratones con CRISPP-Post/E. coli en comparación con ratones con SCR-Post/E. coli se acercó a la significación estadística. Para todos los experimentos en cada uno de los tres modelos murinos, se usó la herramienta estadística Log-rank (Mantel-Cox) para comparar las curvas de supervivencia entre grupos y se empleó la corrección de Bonferroni post hoc. Para todos los experimentos en los tres modelos, * denota p<0,05, ** denota p<0,01 y *** denota p<0,001.

Ejemplo 13: análisis de la formación de NET en EPC utilizando tejido humano y un modelo de oveja

[0115] Se analizó inmunohistoquímicamente tejido pulmonar humano no identificado de bebés prematuros que murieron con EPC para detectar ADN extracelular e histona H3, dos indicadores clave de la formación de NET (véanse las FIGS. 12A y 12B). Usando técnicas similares, también se examinaron muestras de tejido pulmonar recolectadas de corderos nacidos prematuramente en el modelo de oveja con EPC. Las muestras de tejido pulmonar de corderos prematuros tratados con ventilación mecánica durante 18 a 21 días mostraron todas las características de la EPC, mientras que las muestras de tejido de control tomadas de corderos nacidos a término o prematuros pero solo con soporte CPAP no. Las muestras de tejido pulmonar de los corderos prematuros tratados con ventilación mecánica mostraron una fuerte formación de NET, mientras que las de los corderos de control no.

[0116] La formación de NET se evaluó en tejido pulmonar humano incluido en parafina obtenido en la autopsia de neonatos que murieron con EPC. En un análisis preliminar, se observó una acumulación de histona H3 alveolar extracelular concordante con la formación de NET. La formación de NET también se evaluó en tejido pulmonar de cordero prematuro incluido en parafina en el modelo de EPC en oveja. Se detectó la formación de NET alveolar extracelular en la muestra de EPC de cordero prematuro, pero no en el cordero prematuro de control. Se ha hallado un depósito similar de NET en un modelo murino de TRALI. También se observaron otras características de la EPC neonatal en muestras de EPC tanto en humanos como en corderos, incluida la hipercelularidad y la simplificación alveolar.

Ejemplo 14 - Caracterización de la formación de NET en PMN de oveja

[0117] En referencia a las FIGS. 13A y 13B, se aislaron PMN de sangre de cordón umbilical de cordero prematuro y de ovejas maduras. Los p Mn aislados se estimularon con LPS (100 ng/ml) durante 1 hora y se evaluó cualitativamente la formación de NET. Los PMN de ovejas maduras se trataron con CRISPP (1 nM) o un péptido de control con secuencia aleatoria (1 nM) durante 1 hora antes de la estimulación con LPS (100 ng/ml) y se evaluó cualitativamente la formación de NET. Los PMN aislados a partir de sangre de cordón umbilical de cordero no lograron formar NET in vitro, pero los PMN aislados de ovejas maduras formaron sólidamente NET después de la estimulación con LPS. El pretratamiento con CRISPP de PMN de oveja inhibió la formación de NET de manera dependiente de la dosis, mientras que el péptido de control con secuencia aleatoria no lo hizo. El pretratamiento con CRISPP de PMN de oveja inhibió la formación de NET estimulada con PMA.

Ejemplo 15 - Aislamiento de PMN

[0118] Los PMN se aislaron de sangre venosa anticoagulada con ácido-citrato-dextrosa (ACD) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de adultos sanos, neonatos a término sanos y neonatos prematuros. Para los 11 bebés nacidos prematuramente de quienes se recolectaron muestras de sangre periférica y de cordón umbilical, se obtuvieron preparaciones de PMN y plasma de sangre periférica y de cordón umbilical en 5 puntos temporales separados a lo largo de los primeros 2 meses de vida. Se prepararon suspensiones de PMN (> 96 % de pureza) mediante inmunoselección positiva utilizando microesferas recubiertas de anti-CD15 y un clasificador de células auto-MACS (MILTENYI BIOT^eC, INC.) y se resuspendieron a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio M-199 sin suero a 37 °C.

[0119] La Tabla 1 (a continuación) proporciona los datos demográficos asociados con la cohorte de bebés prematuros (n=11).

T l 1. Inf rm i n m r fi l r m r 1

[0120] Se observó que los PMN aislados de neonatos, ya sea nacidos a término o prematuros, adquirieron rápidamente la capacidad de formar NET, como lo demuestran los ensayos cualitativos y cuantitativos de formación de NET después de la estimulación in vitro con LPS (véanse las figuras 14A y 14B; véase también Yost et al., Blood, 2009, 113: 6419-1154; y Mclnturff et al., Blood, 2012, 120: 3118-3125). Se demostró una buena formación de NET desde el tercer día de vida, incluso para los bebés más prematuros, y la competencia de NET permaneció intacta en los PMN aislados en serie hasta los dos meses de edad.

Ejemplo 16 - Aislamiento de plaquetas

[0121] Se aislaron plaquetas humanas como se describe en Weyrich et al., J Clin Invest, 1996, 97: 1525-1534. Brevemente, se centrifugó sangre entera anticoagulada con ACD a 100 x g durante 20 minutos. Se recogió el plasma rico en plaquetas (PRP), se transfirió a un tubo cónico nuevo de 50 ml y se añadió prostaglandina E1 (PGE; 100 nM; Ca YmAN CHEMICAL). Luego, el PRP se centrifugó a 1500 r.p.m. durante 20 minutos. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y el sedimento de plaquetas se resuspendió con 10 ml de medio PSG a 37 °C y PGE (100 nM). Las plaquetas se resuspendieron en medio M-199 libre de suero a 1 x 108 células/ml con recuentos de plaquetas adquiridos mediante un contador de partículas BECKMAN COULTER (BECKMAN COULTER).

Ejemplo 17 - Obtención de imágenes de células vivas durante la formación de NET

[0122] Se determinó si nNIF y CRISPP inhiben la formación de NET por parte de los PMN humanos utilizando ensayos cualitativos y cuantitativos de la formación de RED in vitro. Los PMN humanos aislados de donantes adultos sanos se estimularon con LPS (100 ng/mL) o forbol-12-mistirato (PMA; 20 nM), ± nNIF (1 nM) o CRISPP (1 nM), preincubación (1 hora). El péptido de control con secuencia aleatoria (SCR) generado usando el mismo contenido de aminoácidos que CRISPP pero enlazado en un orden aleatorio se usó como control. La formación de NET se evaluó 2 horas después de la estimulación. Se observó que tanto nNIF como CRISPP inhibieron significativamente la formación de NET en el sistema in vitro en comparación con el control de péptido SCR (véanse las Figuras 6A y 16A-16D).

[0123] La formación de NET se evaluó mediante PMN de adulto estimulados ± preincubación con nNIF o CRISPP, tanto cualitativa como cuantitativamente (véanse las Figuras 6A y 16A-16D). La preincubación con nNIF o CRISPP (1 nM) durante 1 hora antes de la estimulación (LPS, 100 ng/mL o PMA, 20 nM) inhibió la formación de NET, mientras que el pretratamiento con SCR (1 nM) no pareció inhibir la formación de NET. Las imágenes representativas de la fig. 16A (aumento de 20x) y la fig. 6A (aumento de 60x) muestran ADN extracelular asociado a NET y ADN nuclear. El ensayo de liberación de histona humana H3 se utilizó para cuantificar la formación de NET en PMN estimulados ± preincubación con nNIF o CRISPP. Como se representa en las Figs. 16B y 16C, el contenido de histonas extracelulares (cambio en múltiplos con respecto a los valores de referencia) se representa en el eje y, y la línea discontinua representa los valores de control, establecidos arbitrariamente en 1. Los datos presentados son representativos de 3 experimentos separados realizados usando PMN aislados de 3 participantes diferentes. * indica p<0,05 para CRISPP/PMA en comparación con los grupos PMA y SCR/PMA, ** indica p<0,05 para LPS y SCR/LpS en comparación con el control, mientras que f indica p<0,05 para CRISPP/LPS y nNIF/LpS en comparación con los grupos LPS y SCR/LPS. Se empleó la herramienta estadística ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey.

[0124] La formación de NET se evaluó en el peritoneo utilizando imágenes de células vivas. Un tinte de ADN impermeable a las células tiñó todo el ADN extracelular, y un tinte de ADN permeable a las células sirvió como contratinción nuclear. Se observó una disminución cualitativa en la formación de NET en el líquido peritoneal de ratones pretratados con nNIF o CRISPP en comparación con el control SCR y una disminución cuantitativa significativa en la formación de NET según lo analizado por el ensayo de liberación histona H3 del líquido peritoneal (véanse las figuras 17D y 17E). La formación de NET también se examinó en tejido de membrana peritoneal recién resecado utilizando imágenes de células vivas. Se observó una disminución cualitativa y cuantitativa en la formación de NET asociados a la membrana peritoneal (véanse las figuras 17F y 17G). Estos resultados demuestran que nNIF y el NRP CRISPP pueden inhibir la formación de NET estimulada en sistemas de modelo in vivo así como in vitro.

[0125] También se evaluó la capacidad de CRISPP para inhibir la formación de NET inducida por patógenos bacterianos y virales. CRISPP inhibió la formación de NET inducida por la incubación con bacterias de S. aureus (MOI 100) e infección viral del dengue (MOI 0.05) (véanse las figuras 7A, 8A y 8B; véase también el ejemplo 18) que demuestra que nNIF puede inhibir la formación de NET en modelos experimentales reduccionistas de infección bacteriana y viral.

[0126] La evaluación cualitativa de la formación de NET se realizó como se ha mencionado anteriormente en Yost et al., Blood, 2009, 113: 6419-6427 y McInturff et al., Bloos, 2012, 120: 3118-3125. Brevemente, los PMN primarios aislados de neonatos prematuros, neonatos a término sanos y adultos sanos (2 x 106 células/ml) se incubaron con tampón de control o se estimularon con LPS (100 ng/ml), PMA (20 nM) o bacterias de S. aureus (MOI 100) durante 1 hora a 37 °C en 5 % de CO2/95 % de aire sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina. Para experimentos seleccionados, los PMN primarios se preincubaron con plasma autólogo, plasma de sangre del cordón umbilical, nNIF (1 nM), CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM) durante 1 hora antes de la obtención de imágenes. Después de la preincubación y/o estimulación, los PMN se lavaron suavemente con PBS y se incubaron con una mezcla de colorantes fluorescentes de ADN permeables a las células (SYTO Green, MOLECULAR PROBES) e impermeables (SYTOX Orange, MOLECULAR PROBES). La microscopía confocal se realizó utilizando un microscopio FV3001X81 y el software FLUOVIEW (OLYMPUS). Se utilizaron objetivos 20X y 60X. Se obtuvieron imágenes de serie Z con un tamaño de paso de 1 |_im en un rango de 20 |_im para cada campo. Para el procesamiento de imágenes se utilizó el software OLYMPUS FLUOVIEW y ADOBE PHOTOSHOP CS2.

Ejemplo 18 - Imágenes de la formación de NET inducida por el virus del dengue

[0127] Se incubaron PMN primarios aislados de adultos sanos (2 x 106 células/mL) con tampón de infección simulada o virus del dengue vivo (MOI 0,05), como para las imágenes de células vivas mencionadas anteriormente. Después de una incubación de 1 hora, los PMN infectados se fijaron con p-FA al 2 % durante 10 minutos antes de la incubación con colorantes de ADN marcados con fluorescencia, permeables a las células e impermeables a las células, y se tomaron imágenes como para la obtención de imágenes de células vivas usando microscopía confocal.

Ejemplo 19 - Cuantificación de la formación de NET y del contenido de histona H3 en el sobrenadante [0128] El contenido de histona H3 total en el sobrenadante se determinó como se ha mencionado anteriormente en McInturff et al., Blood, 2012, 120: 3118-3125. Después de la obtención de células vivas de control y PMN primarios estimulados (2 x 106/mL; varios agonistas), las células se incubaron con PBS que contenía DNAsa (40 U/mL) durante 15 minutos a temperatura ambiente para descomponer y liberar las NET formadas en respuesta a la estimulación. Se extrajo con cuidado el sobrenadante y se centrifugó a 420 xg durante 5 minutos. El sobrenadante libre de células luego se mezcló 1:3 con tampón Laemmli 4x antes de la transferencia de Western. Se utilizaron un anticuerpo primario policlonal contra la histona humana H3 (CELL SIGNALING TECHNOLOGY) y anticuerpos secundarios infrarrojos (LI-COR BIOSCIENCES). Las imágenes y la densitometría se realizaron en el sistema de imágenes infrarrojas ODYSSEY™ (LI-COR BIOSCIENCES).

Ejemplo 20 - Aislamiento e identificación de nNIF en plasma de sangre de cordón umbilical

[0129] Dos muestras de plasma de un solo neonato prematuro, una de la sangre del cordón umbilical y otra de una muestra de sangre periférica tomada el día 28 de vida, se sometieron a una extracción abundante de proteínas plasmáticas (PROTEOSPIN, NORGEN) antes de la electroforesis 2D utilizando la separación primero por isoelectroenfoque (rango de pH 3 - 8) y luego por tamaño (TGX PRECAST GEL, BIORAD). Los geles resultantes se compararon en cuanto al contenido de proteína diferencial. Se analizaron seis grupos de proteínas expresadas diferencialmente. Después de la digestión con tripsina y la espectrometría de masas en tándem con un espectrómetro de masas híbrido LTQ-FT con trampa de iones/FTMS (THERMOELECTRON), se identificaron proteínas/péptidos candidatos como posibles sustancias inhibidoras de NET.

Ejemplo 21 - purificación por afinidad de nNIF

[0130] Para determinar si el péptido de 29 aminoácidos identificado en el Ejemplo 5 eran las sustancias que circulaban en la sangre del cordón umbilical responsables de la inhibición de la formación de NET, se extrajeron los nNIF del plasma sanguíneo del cordón umbilical mediante purificación por afinidad utilizando el anticuerpo AAT del extremo carboxilo. A continuación, el nNIF se eluyó de la columna y se utilizó en experimentos para evaluar la actividad inhibidora de NET del plasma de sangre del cordón umbilical inalterado, el plasma de sangre del cordón umbilical sin nNIF y el nNIF purificado por afinidad del plasma de sangre del cordón umbilical. Como control, también se evaluó AAT recombinante en sangre de cordón umbilical sin nNIF (véanse las Figuras 5A-5F). Los PMN aislados de donantes adultos sanos respondieron con una buena formación de NET después de 2 horas de incubación con LPS (100 ng/mL). La preincubación con plasma de sangre de cordón umbilical inalterado inhibió la formación de NET in vitro, lo que concuerda con resultados anteriores (véanse las figuras 3B y 14C). La preincubación con plasma de sangre del cordón umbilical sin nNIF ± rAAT (1 nM) no lo hizo. Sin embargo, la incubación previa con nNIF purificado por afinidad inhibió la formación de NET por PMN estimulados por LPS en un grado similar al de la sangre de cordón umbilical inalterada. Otros experimentos también demostraron que la AAT humana enzimáticamente activa y de longitud completa no inhibió la formación de NET por parte de los PMN aislados de donantes adultos sanos, mientras que nNIF sí (véase la figura 15C). Estos resultados sugirieron que los péptidos de 29 aminoácidos nNIF y CRISPP detectados en la sangre del cordón umbilical tienen actividad inhibidora de NET. Luego se realizó la síntesis de nNIF y CRISPP para estudios in vitro de sus capacidades para inhibir NET.

[0131] Como se ha mencionado anteriormente, después de la eliminación abundante de proteínas plasmáticas (PROTEOSPIN, NORGEN), se usó un anticuerpo policlonal generado contra los últimos 18 aminoácidos del extremo carboxilo de la AAT de longitud completa (LIFESPAN BIOSCIENCES) para purificar por afinidad nNIF del plasma de sangre del cordón umbilical usando un kit de inmunoprecipitación. (TERMO SCIENTIFIC). Se recogió plasma de sangre de cordón umbilical sin nNIF ni AAT de longitud completa, al igual que se capturaron los péptidos mediante purificación por afinidad para su uso en ensayos de formación de NET in vitro. La AAT enzimáticamente activa (SIGMA) de longitud completa también se resuspendió en tampón de elución y se analizó en paralelo.

Ejemplo 22 - Análisis de líquido y membranas peritoneales

[0132] Se trató a los animales con CRISPP (10 mg/kg), nNIF (10 mg/kg) o SCR (10 mg/kg) por inyección intraperitoneal 1 hora antes de la infección (E. coli, 4.5 x 107 ufc/ratón, inyección intraperitoneal) o estimulación (LPS, 25 mg/kg, inyección intraperitoneal (SIGMA)). A los ratones de control se les inyectó solución salina sola. Los ratones se sacrificaron en una cámara de CO23 horas después de la infección/estimulación con el contenido peritoneal recogido y analizado. Al poco tiempo, la piel del abdomen se abrió por la línea media después de una desinfección completa y sin lesionar el músculo. La cavidad peritoneal se lavó con solución salina estéril (100 ml) y se analizó la formación de NET, la bacteriología y la acumulación de leucocitos in vivo. Las NET presentes en el líquido peritoneal se analizaron cualitativa y cuantitativamente por obtención de imágenes de células vivas con microscopía confocal y ensayos de liberación de histonas. Las NET presentes en la superficie interna de la membrana peritoneal se evaluaron cuantitativamente por obtención de imágenes de células vivas seguido de un análisis con cuadrícula estandarizado de 5 campos visuales de alta potencia seleccionados al azar por muestra de tejido (software IMAGE-J, NIH). Los recuentos de unidades formadoras de colonias (ufc) bacterianas peritoneales se cuantificaron permeabilizando todos los leucocitos recuperados con Triton-X 100 al 0,1 % durante 10 minutos y realizando diluciones en serie y cultivos bacterianos en placas de agar con sangre de oveja al 5 % (HARDY DIAGNOSTICS). Después de una incubación de 24 horas, se determinaron los recuentos bacterianos. Los recuentos de leucocitos totales en el lavado peritoneal se determinaron en cámaras de Neubauer utilizando un microscopio óptico después de la dilución en solución de Turk (ácido acético al 2 %). El análisis diferencial de leucocitos se realizó utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60x para evaluar la morfología de las células citocentrifugadas teñidas con colorante de May-Grünwald-Giemsa.

Ejemplo 23 - Ensayo de quimiotaxis

[0133] Se evaluaron los posibles efectos mediados por CRISPP en actividades clave de los neutrófilos además de la formación de NET: quimiotaxis, fagocitosis, generación de especies reactivas de oxígeno y destrucción de bacterias. Se observó que nNIF y CRISPP no inhibían significativamente la quimiotaxis, la fagocitosis o la generación de especies reactivas de oxígeno de PMN (véanse las Figuras 18A-18C). También se evaluó la destrucción bacteriana total, fagocítica y mediada por NET de una cepa patógena de E. coli. Se observó que, mientras la preincubación con CRISPP de PMN estimulados con LPS disminuyó significativamente la destrucción bacteriana extracelular total y mediada por NET en comparación con los PMN de control, el componente fagocítico de la destrucción bacteriana no fue diferente entre los tres grupos (véase la FIG. 18D).

[0134] La quimiotaxis por PMN aislados de donantes adultos sanos se evaluó mediante un ensayo de cámara de Boyden modificado ± una preincubación de una hora con nNIF (1 nM), CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM). Se utilizó IL-8 humana recombinante (2 ng/ml) como quimioatrayente. La quimiotaxis a través de un filtro de 5 micras se determinó contando PMN en 10 campos de alta potencia seleccionados al azar como se ha descrito previamente en Hill et al., Lancet, 1974, 2: 617-619. En experimentos separados, se evaluó la actividad quimioatrayente de nNIF, CRISPP o SCR (todos a 1 nM) usando el mismo sistema.

Ejemplo 24 - Ensayo de fagocitosis

[0135] Como se ha mencionado anteriormente, se observó que nNIF y CRISPP no inhibían significativamente la actividad de fagocitosis en los neutrófilos. Se aislaron p Mn de la sangre de donantes adultos sanos y se resuspendieron en M-199 a una concentración de 2 x 106 células/ml. Los leucocitos se preincubaron durante 60 minutos en condiciones estándar con citocalasina B y D (10 j M), nNIF (1 nM), CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM). Después de la preincubación, los PMN se incubaron con 6 x 106 biopartículas de E. coli (E. coli BIOPARTICLES) (E-13231, MOLECULAR PROBES) en un rotador durante 4 horas en condiciones estándar. Luego, los PMN se lavaron y se resuspendieron en el volumen inicial en M-199 antes de centrifugarlos sobre cubreobjetos de vidrio y se fijaron con paraformaldehído al 2 % durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton-X-100 al 0,1 % durante 10 minutos. Los leucocitos se tiñeron con WGA 555 (INVITROGEN) y TOPRO-3 (MOLECULAR PROBES) y se capturaron imágenes de campo visual de alta potencia seleccionadas al azar mediante microscopía confocal. Se usó el software IMAGE-J (NIH) para determinar el porcentaje de PMN que dieron positivo para biopartículas de E. coli con marcadores fluorescentes detectadas a 488 nM.

Ejemplo 25 - Ensayo de generación de especies reactivas de oxígeno

[0136] Además, como se ha mencionado anteriormente, se observó que nNIF y CRISPP no inhibieron significativamente la actividad de generación de ROS en los neutrófilos. Los PMN humanos aislados de sangre completa de adultos sanos se resuspendieron a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio M-199 y péptido preincubado ± CRISPP (1 nM) o SCR (1 nM) durante 1 hora en condiciones estándar. Luego, los PMN se estimularon con LPS (100 ng/ml) durante 1 hora, se lavaron y se resuspendieron con una mezcla de dihidrorrodamina (7,25 mM; D-632, MOLECULAR PROBES) y catalasa (1000 unidades/ml; C-40, SIGMA) y se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. Después de la incubación, las muestras se pusieron a 4 °C y se analizaron en busca de fluorescencia dependiente de ROS utilizando un dispositivo BECTON-DICKINSON FACSCAN equipado con el software CELLQUEST.

Ejemplo 26 - Ensayo de Activación de Plaquetas

[0137] Según se ha observado, las plaquetas desempeñan un papel en la regulación de la formación de NET por parte de los PMN humanos (véase Clark et al., Nat Med, 2007, 13: 463-469). Se determinó si CRISPP altera la activación plaquetaria y las interacciones plaquetas-PMN. La expresión de selectina P se determinó mediante plaquetas preincubadas con péptidos CRISPP y SCR seguido de estimulación con trombina. Se descubrió que los péptidos CRISPP y SCR no alteraban la expresión de p-selectina en plaquetas cuando se administraban solos o tras la estimulación con trombina (véase la figura 18E). Además, en experimentos en los que se mezclaron PMN estimulados con LPS con plaquetas estimuladas con trombina aisladas del mismo donante, CRISPP y SCR no alteraron la asociación de plaquetas/PMN evaluada mediante citometría de flujo (véase la FIG. 18F). Para evaluar más a fondo si las plaquetas absorben CRISPP del medio inflamatorio, se sintetizaron péptidos CRISPP y SCR con un motivo de etiqueta FLAG agregado al extremo carboxilo de cada péptido (CRISPP-F, SCR-F). Luego se demostró que CRISPP-F mantiene una actividad inhibidora de NET similar a la de CRISPP sin etiquetar (véanse las FIGURAS 21A y 21B), y se realizaron experimentos inmunocitoquímicos con plaquetas humanas recién aisladas para determinar si las plaquetas captan CRISPP-F del medio inflamatorio. Se observó que las plaquetas no absorben CRISPP-F o SCR-F en su citoplasma (véase la figura 18G) mientras que los PMN coincubados con plaquetas sí lo hacen. Esto puede sugerir que los efectos inhibidores de NET de nNIF y CRISPP no son el resultado de alteraciones en la activación o señalización plaquetaria para desencadenar la formación de NET por los PMN.

[0138] Utilizando protocolos modificados de van Velzen, et al., Thromb Res, 2012, 130: 92-98, se incubaron plaquetas humanas (1 x 108 células/ml) con CRISPP o SCR (0,1-10 ng/ml) durante 1 hora seguido de estimulación con trombina (0,1 UI/ml) o medio de control M-199 durante 15 minutos. Las células se prepararon para análisis FACS con los siguientes anticuerpos monoclonales primarios durante 20 minutos: CD41a conjugado con PE (marcador específico de plaquetas) y CD62P conjugado con FITC (selectina P). Se usaron anticuerpos de control emparejados con isotipo y fluorocromo. Después de la incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, las células se lisaron con tampón de lisis FACS y se analizaron por citometría de flujo (software BECTON-DICKINSON FACSCAN, CELLQUEST).

Ejemplo 27 - Ensayo de agregación de plaquetas/PMN

[0139] Utilizando protocolos modificados de Saboor et al., Malays J Med Sci, 2013, 20: 62-66, se aislaron PMN humanos (2 x 106 células/ml) y se incubaron con CRISPP o SCR (0,1-10 ng/ml) durante 1 hora antes de añadir plaquetas humanas recién aisladas en una proporción de 100:1 durante otros 15 minutos de incubación. Después de este período, las células (PMN y plaquetas) se estimularon con trombina (0,1 UI/mL) o medio de control M-199 durante 1 hora. Las células se tiñeron durante 20 minutos con los siguientes anticuerpos monoclonales primarios: CD41 conjugado con PE y CD16 conjugado con FITC. Se usaron anticuerpos de control emparejados con isotipo y fluorocromo. La citometría de flujo se realizó utilizando el software BECTON-DICKINSON FACSCAN y CELLQUEST.

Ejemplo 28 - Ensayo de descondensación nuclear

[0140] Se determinó un posible mecanismo por el cual nNIF y CRISPP inhiben la formación de NET. Utilizando técnicas modificadas de Papayannopoulos et al., J Cell Biol, 2010, 191: 677-691, se utilizaron ensayos de área nuclear para PMN estimulados por PMA como sustituto de la formación de NET. Los PMN se estimularon con PMA (20 nM) durante 2 horas y luego se visualizaron a través de imágenes de células vivas con un tinte de ADN permeable a las células. Se capturaron imágenes de 5 campos de alta potencia seleccionados al azar y se cuantificó el área nuclear de todos los PMN en cada campo visual utilizando el software IMAGEJ. Las áreas nucleares se compararon para PMN estimulados con PMA con PMN preincubados con CRISPP (1 nM), SCR (1 nM) o el inhibidor de NE Sivelestat (200 nM). Los resultados cualitativos y cuantitativos de estos ensayos mostraron un aumento significativo en el área nuclear de los PMN estimulados con PMA en comparación con los PMN de control o los PMN preincubados con cada uno de los tres reactivos pero sin PMA (véase la figura 19A). Sin embargo, la incubación previa de PMN estimulados por PMA con CRISPP y Sivelestat dio como resultado una disminución significativa en el área nuclear en comparación con PMA solo, mientras que no se observaron cambios en el grupo SCR (véanse las FIG. 19A y 19B). A continuación, se realizaron experimentos inmunocitoquímicos diseñados para ver si los PMN humanos absorben CRISPP. Los péptidos CRISPP-F y SCR-F y los anticuerpos primarios específicos con etiqueta FLAG se utilizaron para evaluar la ubicación celular. Se observó que los PMN absorben CRISPP-F y SCR-F en el citoplasma durante una hora de incubación (véanse las Figuras 18G y 19C). No se observó evidencia de translocación nuclear de CRISPP-F o SCR-F (véanse las Figuras 18G, 19C y 19D). Estos resultados pueden sugerir que los NRP entran rápidamente en los PMN pero no en las plaquetas (véanse las FIG. 18G, 19C y 19D), y que la captación de NRP por parte de los PMN depende del tamaño y puede no depender de la secuencia de aminoácidos o del transporte mediado por receptores específicos. Además, los ensayos de colocalización de proteínas utilizando el ensayo de proximidad de proteínas DUOLINK (véase Carlo et al., FASEB J, 2013, 27: 2733-2741) y anticuerpos primarios dirigidos a F-CRISPP y NE, demuestran que F-CRISPP y NE pueden ubicarse a 40 nM entre sí después de la incubación con CRISPP durante 1 hora (véase la figura 19D). CRISPP puede inhibir la descondensación de la cromatina nuclear, lo cual concuerda con la inhibición selectiva de la formación de NET por parte de CRISPP y nNIF. Este proceso puede implicar la inhibición de la actividad NE.

[0141] Los PMN se aislaron y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en medio M-199. Se preincubaron con CRISPP (1 nM), SCR (1 nM) o el inhibidor de elastasa de neutrófilos Sivelestat (100 ^j M) en condiciones estándar. En las mismas condiciones, las células se trataron ± PMA (20 nM) en cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-L-lisina durante 2 horas. Se capturaron 5 campos visuales de alta potencia seleccionados al azar por muestra mediante microscopía confocal y se analizó el área nuclear utilizando el tinte de ADN fluorescente permeable a las células S^y T^o Green. Las áreas de píxeles nucleares de > 100 células individuales por campo de alta potencia se determinaron utilizando el software IMAGE-J (NIH).

Ejemplo 29 - Determinación de la localización celular del péptido CRISPP

[0142] Las ubicaciones celulares de los péptidos CRISPP (F-CRISPP) marcados con FLAG y SCR (F-SCR) marcados con FLAG se determinaron mediante inmunocitoquímica. Los neutrófilos adultos se preincubaron con F-CRISPP (1 nM) o F-SCR (1 nM) durante 1 hora en condiciones estándar, seguido de estimulación con LPS (100 ng/mL) durante 2 horas. Luego, los PMN se centrifugaron sobre cubreobjetos de vidrio con fijación de p-FA al 2 % y permeabilización con Triton-X-100 al 0,1 %. El péptido marcado con FLAG se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (F1804, SIGMA) con TOPRO-3 como contratinción nuclear.

Ejemplo 30: uso de un ensayo de proximidad de proteínas DUOLINK

[0143] Se utilizó el ensayo de proximidad de proteínas DUOLINK (SIGMA) para determinar si CRISPP y NE se colocalizan dentro de los PMN aislados de adultos sanos. Los PMN se aislaron y preincubaron durante 1 hora con F-CRISPP (10 nM) o F-SCR (10 nM) en condiciones estándar antes de la estimulación con LPS (100 ng/mL) en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina. El ensayo de proximidad de proteínas DUOLINK se realizó

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Péptido que es un factor inhibidor de NET neonatal (nNIF) aislado y purificado que tiene la secuencia de aminoácidos KFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQ.

2. Composición farmacéutica, que comprende:

un péptido inhibidor de NET (nNIF) según la reivindicación 1; y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

3. Composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que al menos un aminoácido del nNIF está unido a un modificador químico, y en el que el modificador químico se selecciona de entre al menos uno de un lípido, un polietilenglicol (PEG) o un sacárido.

4. Péptido que es un factor inhibidor de NET (nNIF) según la reivindicación 1 o una composición farmacéutica según la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de un paciente que padece, o está en riesgo de desarrollar, un trastorno inflamatorio.

5. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 4, en el que el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio agudo, un trastorno inflamatorio crónico y un trastorno inmunitario.

6. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 4, en el que el trastorno inflamatorio es un trastorno autoinmunitario.

7. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 4, en el que el trastorno inflamatorio se selecciona de al menos uno de entre síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), displasia broncopulmonar (DBP), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística, inflamación en el cáncer, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad pulmonar inflamatoria (EPI), neumonitis inducida por gripe, enterocolitis necrosante (ECN), enfermedad pulmonar crónica (EPC) neonatal, periodontitis, preeclampsia, retinopatía del prematuro (RDP), sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), trombosis, lesión pulmonar aguda producida por transfusión (TRALI), vasculitis, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES), granulomatosis de Wegener (GW) o un trastorno inflamatorio no resuelto.

8. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 7, en el que la trombosis es trombosis venosa.

9. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 7, en el que la trombosis es trombosis arterial.

10. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 4, en el que el péptido o composición inhibe sustancialmente el daño tisular inflamatorio mediado por NET.

11. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 10, en el que la formación de NET es estimulada por al menos una bacteria, un hongo, un parásito o un virus.

12. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 11, en el que el virus es un virus de la fiebre hemorrágica, un filovirus, un arenavirus, un hantavirus o un flavivirus.

13. Péptido o composición para el uso según la reivindicación 11, en el que la formación de NET es estimulada por al menos una de una especie de Bacilus, una especie de Escherichia, una especie de Francisella, una especie de Staphylococcus, una especie de Streptococcus, o una especie de Yersinia.