KR20210141667A - 감염성 심내막염의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스태필로코커스 아우레우스와 같은 그람 양성 세균으로 인한 감염성 심내막염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 임의로 최소 억제 농도 (MIC) 이하 수준의 하나 이상의 항생제 및 MIC 이하 수준의 PlySs2 리신의 단일 용량과 같은 PlySs2 리신의 조합물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 항생제 및 PlySs2 리신은 이를 필요로 하는 대상체에게 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

Description

감염성 심내막염의 치료 방법

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2019년 3월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/822,386호, 2019년 4월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/832,708호, 2019년 5월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/849,093호, 2019년 9월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/898,379호, 및 2020년 1월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/965,720호의 이익을 주장하고 이의 출원일에 의존하며, 이들 각각의 전체 개시 내용은 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 그 전문은 본 출원에 참고로 포함된다. 2020년 3월 20일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 이름이 0341_0005-00-304_SL.txt이고 크기가 42,690바이트이다.

개시 내용의 분야

본 개시 내용은 일반적으로 리신(들) 및 하나 이상의 항생제를 연속하여 사용하는, 메티실린 민감성 스태필로코커스 아우레우스 (MSSA) 및 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA)와 같은 스태필로코커스 아우레우스를 포함한 그람 양성 세균으로 인한 감염성 심내막염의 치료 및 예방에 관한 것이다.

감염성 심내막염은 심실 내부를 감싸고 판막의 표면을 형성하는 얇고 매끄러운 내피 막인 심내막의 감염이다. 이러한 질환은 전형적으로 혈류 내로의 세균 진입 및 심장에서의 정착을 초래한다. 건강한 심근과 심장 판막의 내피 내벽은 일반적으로 세균에 의한 감염에 내성이 있는 반면, 손상된 내피 내벽은 종종 혈소판-섬유소 혈전의 형성과 관련되며, 이는 세균이 부착 및 콜로니화하는 장소의 역할을 하여 섬유소, 혈소판, 백혈구, 적혈구 잔해물 및 고농도 세균을 함유하는 영양 생장 (vegetative growth)을 초래한다.

감염성 심내막염을 유발하는 가장 흔한 병원체는 스태필로코커스 아우레우스와 같은 그람 양성 세균이기 때문에, β-락탐 항생제 및 반코마이신과 같은 세포벽 억제제는 종종, 예를 들어, 세균의 사멸을 증진시키기 위해 상승 작용적 용량의 겐타마이신과 조합된다. 그러나, 대부분의 병원체는 많은 항생제가 사실상 침투할 수 없는 세포외 기질에 세균을 포함하는 생물막을 생성한다. 결과적으로, 상승된 항생제 혈장 농도가 효과적인 항생제 농도를 달성하기 위해 전형적으로 연장된 기간에 걸쳐 필요하다. 불행하게도, 부작용, 특히, 신독성은 감염성 심내막염의 치료에 있어서 항생제의 사용을 제한할 수 있다. 더욱이, 집중적인 약물 치료를 견디더라도, 감염의 근절이 종종 어려워서 수술에 대한 필요성이 요구된다.

감염성 심내막염과 관련된 높은 사망률 (6 개월 내 22~27%)을 고려할 때, 새로운 전략이 이러한 질환을 치료하는데 필요하다. 이러한 전략들은 생물막 구조를 파괴하고/하거나 장기간에 걸쳐 높은 수준의 항생제에 대한 필요성을 감소시킬 수 있는 약물 및/또는 생물제제를 포함해야 한다.

개요

본 개시 내용은 대상체에서 그람 양성 세균 (예를 들어, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 아우레우스)로 인한 감염성 심내막염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하나 이상의 항생제 및 서열 번호 2를 포함하는 PlySs2 리신 또는 서열 번호 2에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 이의 변이체의 조합물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 항생제 및 PlySs2 리신은 이를 필요로 하는 대상체에게 임의의 순서로 연속적으로 투여된다.

도 1은 상세한 설명에 기재된 바와 같은 리신 (서열 번호 2) 및 리신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호 1)의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 서열 번호 2는 245개 아미노산 폴리펩타이드를 나타내며, 이는 DNA 서열을 기반으로 예측된 아미노산 서열이다. 상기 예측된 아미노산 서열은 초기 메티오닌 잔기를 포함하며, 이는 번역후 처리 동안 제거되어 244개 아미노산의 폴리펩타이드를 남긴다.
도 2는 실시예에 기재된 바와 같은 심장 판막, 신장 및 비장에서의 세균 부하에 대한 답토마이신 용량 반응을 도시한 것이다.
도 3은 실시예에 기재된 바와 같은 답토마이신과 비교하여 상이한 시간에 본 개시 내용의 리신으로 처리한 후 표적 조직에서의 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA) 밀도를 도시한 것이다.
도 4는 실시예에 기재된 바와 같은 상이한 답토마이신 및 리신 용량 투여 전략을 도시한 것이다.
도 5a~5d는 실시예에 기재된 바와 같은 답토마이신에 추가하여 상이한 리신 투여 전략에 따른 심장 (심장 판막) 우종 (vegetation)에서의 세균 부하를 도시한 것이다. 투여량은 다음과 같다: 0.7 mg/kg의 CF-301 용량 분획 + 답토마이신 (도 5a), 0.35 mg/kg의 CF-301 용량 분획 + 답토마이신 (도 5b), 0.09 mg/kg의 CF-301 용량 분획 + 답토마이신 (도 5c) 및 0.06 mg/kg의 CF-301 용량 분획 + 답토마이신 (도 5d).
도 6은 상세한 설명에서 기재된 바와 같은 PlySs2 (서열 번호 2)와 PlyC (서열 번호 21)의 CHAP 도메인 사이의 정렬이다.

정의

본 출원에서 사용되는 다음 용어 및 이의 동의어는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 다음의 의미를 갖는다:

"담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면 활성제, 추진제, 희석제, 비히클 등을 지칭한다. 이러한 담체는 물, 생리 식염수, 덱스트로오스 수용액, 글리세롤 수용액과 같은 멸균 액체, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등을 비롯한 오일일 수 있다.

"약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용 가능한 임의의 및 모든 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면 활성제, 추진제, 희석제, 비히클 등을 지칭한다. 담체(들)는 의약에서 전형적으로 사용되는 양으로 치료되는 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용되어야" 한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 상기 조성물을 이의 의도된 목적에 부적합하게 하지 않으면서 상기 조성물의 다른 성분과 상용 가능하다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체는 과도한 불리한 부작용 (예를 들어, 독성, 자극 및 알러지 반응) 없이 본 출원에서 제공된 바와 같은 대상체에게 사용하기에 적합하다. 부작용은 이의 위험이 조성물에 의해 제공되는 이익 보다 클 때 "과도하다". 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제의 비제한적인 예로는 포스페이트 완충 생리 식염수, 물 및 에멀젼, 예를 들어, 오일/물 에멀젼 및 마이크로에멀젼과 같은 임의의 표준 약제학적 담체가 포함된다. 적합한 약제학적 담체는, 예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Edition]에 기재되어 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 자연에 존재하지 않는 담체일 수 있다.

"살균성" 또는 "살균 활성"은 18~24시간에 걸쳐 세균의 초기 집단에서 적어도 3-log10 (99.9%) 이상의 감소 정도까지 세균의 사멸을 유발하거나 세균을 사멸시킬 수 있는 특성을 지칭한다.

"정균성 (bacteriostatic)" 또는 "정균 활성"은 성장하는 세균 세포의 억제를 비롯한 세균 성장을 억제하여 18~24시간에 걸쳐 세균의 초기 집단에서 2-log10 (99%) 이상 및 3-log 이하 감소를 초래하는 특성을 지칭한다.

"항균제"는 정균제 및 살균제 둘 다를 지칭한다.

"항생제"는 치사율 또는 성장 감소와 같이 세균에 부정적인 영향을 미치는 특성을 갖는 화합물을 지칭한다. 항생제는 그람 양성 세균, 그람 음성 세균 또는 둘 다에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 항생제는 세균에서 세포벽 펩티도글리칸 생합성, 세포막 완전성 또는 DNA 또는 단백질 합성에 영향을 미칠 수 있다.

"내약성"은 일반적으로 약물의 항균 활성에 대해 내성이 있는 세균을 지칭한다. 특정 방식으로 사용될 때, 내약성은 특히, 항생제 내성을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 일반적으로 특정 항생제에 감수성이 있는 세균이 항생제에 대한 내성을 일으켜 내약성 미생물 또는 균주가 될 수 있다. "다제내성" (multi-drug resistant: "MDR") 병원체는 각각 단일요법으로 사용되는 적어도 2가지 클래스의 항미생물성 약물에 대해 내성을 일으키는 병원체이다. 예를 들어, 스태필로코커스 아우레 우스의 특정 균주는 메티실린 및/또는 반코마이신을 비롯한 몇몇 항생제에 대해 내성이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention]). 당해 분야의 통상의 기술자는 약물 또는 항생제에 대한 세균의 감수성 또는 내성을 결정하는 일상적인 실험실 기법을 사용하여 세균이 내약성이 있는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

"유효량"은 적절한 빈도 또는 투여 방법으로 적용되거나 투여될 때 세균 성장 또는 세균 부하를 예방, 감소, 억제 또는 제거하거나, 치료 중인 장애 (여기서는 그람 양성 세균 병원체 성장 또는 감염)의 발병, 중증도, 지속 기간 또는 진행을 예방, 감소 또는 개선하거나, 치료 중인 장애의 진전을 예방하거나, 치료 중인 장애의 퇴행을 유발하거나, 항생제 또는 정균제 요법과 같은 또 다른 요법의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)를 증진 또는 개선시키기에 충분한 양을 지칭한다.

"공동 투여"는 순차적인 방식으로 리신과 항생제 또는 임의의 다른 항균제와 같은 2가지 제제를 투여하는 것 뿐만 아니라, 실질적으로 동시적인 방식으로, 예를 들어, 대상체에게 단일 혼합물/조성물로, 또는 개별적으로 제공되지만 실질적으로 동시에, 예를 들어, 같은 날 또는 24 시간 내에 상이한 시간에 투여되는 용량으로 이들 제제를 투여하는 것을 지칭한다. 리신과 하나 이상의 추가 항균제와 같은 두 가지 제제의 이러한 공동 투여는 수 일, 수 주 또는 수 개월까지 지속되는 연속 치료로서 제공될 수 있다. 또한, 용도에 따라, 공동 투여가 연속적이거나 동시적일 필요는 없다. 예를 들어, 상기 용도가 세균성 궤양 또는 감염된 당뇨병성 궤양을 치료하기 위한 전신 항균제로서인 경우, 리신은 추가 항생제 사용 후 24시간 이내에 초기에만 투여될 수 있으며, 이엇, 상기 추가 항생제 사용은 리신의 추가 투여 없이 계속될 수 있다.

"대상체"는 포유 동물, 식물, 하등 동물, 단세포 유기체 또는 세포 배양물을 지칭한다. 예를 들어, "대상체"라는 용어는, 세균성 감염, 예를 들어, 그람 양성 세균 감염에 걸리기 쉽거나 이에 걸린 유기체, 예를 들어, 원핵 생물 및 진핵 생물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 포유 동물, 예를 들어, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트 및 트랜스제닉 비-사람 동물이 포함된다. 특정 실시 형태에서, 상기 대상체는 사람, 예를 들어, 그람 양성 세균에 의한 감염을 앓고 있거나 앓을 위험에 처해 있거나 이에 걸리기 쉬운 사람이며, 이러한 감염은 전신적이든지 국소적이든지 그 밖에 특별한 장기 또는 조직에 집중되거나 한정되든지에 관계 없다.

"폴리펩타이드"는 아미노산 잔기로부터 제조되고 일반적으로 적어도 약 30개의 아미노산 잔기를 갖는 중합체를 지칭한다. "폴리펩타이드"라는 용어는 본 출원에서 "단백질" 및 "펩타이드"라는 용어와 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 단리된 형태의 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 활성 단편 및 유도체도 포함한다. "폴리펩타이드"라는 용어는 또한 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 예를 들어, 리신 기능을 유지하는 융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 문맥에 따라, 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드 또는 재조합, 조작된 또는 합성적으로 생성된 폴리펩타이드일 수 있다. 특정 리신 폴리펩타이드는, 예를 들어, 효소적 또는 화학적 절단에 의해 천연 단백질로부터 유래되거나 제거될 수 있거나, 통상적인 펩타이드 합성 기법 (예를 들어, 고체상 합성) 또는 분자 생물학 기술 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시된 것들)을 사용하여 제조될 수 있거나 전략적으로 절두되거나 분할되어 활성 단편을 생성하여 예를 들어, 동일하거나 적어도 하나의 공통 표적 세균에 대한 리신 활성을 유지할 수 있다.

"융합 폴리펩타이드"는 2개 이상의 핵산 분절의 융합으로부터 생성되어 전형적으로 상이한 특성 또는 기능을 갖는 2개 이상의 도메인 또는 분절을 전형적으로 갖는 융합된 발현 산물을 야기하는 발현 산물을 지칭한다. 보다 특별한 의미에서, 용어 "융합 폴리펩타이드"는 또한 직접적으로 또는 아미노산 또는 펩타이드 링커를 통해 공유적으로 연결된 둘 이상의 이종 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭한다. 융합 폴리펩타이드를 형성하는 폴리펩타이드는 전형적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결되지만, 이들은 또한 C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, 또는 N-말단에서 C-말단으로 연결될 수도 있다. 용어 "융합 폴리펩타이드"는 용어 "융합 단백질"과 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구조를 "포함하는 폴리펩타이드"라는 개방형 표현은 융합 폴리펩타이드와 같은 언급된 구조보다 더 큰 분자를 포함한다.

"이종"은 자연적으로 인접하지 않은 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 맥락에서, 용어 "이종"은 예를 들어, 리신 폴리펩타이드 및 양이온성 및/또는 다가양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드, 스시 (sushi) 펩타이드 (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65 (7-8):1202-19 (2008)), 디펜신 펩타이드 (Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), 소수성 펩타이드, 및/또는 향상된 용해 활성 (lytic activity)을 가질 수 있는 항미생물 펩타이드와 같이 융합 폴리펩타이드가 정상적으로는 자연에서 발견되지 않는 2개 이상의 폴리펩타이드의 조합 또는 융합을 기술하기 위해 사용될 수 있다. 이 정의에는 2개 이상의 리신 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편이 포함된다. 이들은 용해 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 만드는데 사용될 수 있다.

"활성 단편"은 단편이 취해진 단리된 폴리펩타이드의 하나 이상의 기능 또는 생물학적 활성, 예를 들어, 스태필로코커스 아우레우스와 같은 하나 이상의 그람 양성 세균에 대한 살균 활성을 보유하는 폴리펩타이드의 일부를 지칭한다.

"상승적" 또는 "상가적"은 독립적으로 작용하는 두 가지 제제의 효과의 합을 초과하는 두 가지 물질의 조합에 의해 초래되는 유익한 효과를 지칭한다. 특정 실시 형태에서 상승적 또는 상가적 효과는 독립적으로 작용하는 두 가지 제제의 효과의 합을 유의하게, 즉 통계적으로 유의하게 초과한다. 활성 성분 중 하나 또는 둘 다는 역치-이하 (sub-threshold) 수준, 즉 활성 물질이 개별적으로 사용되는 경우 효과가 전혀 없거나 매우 제한된 효과를 생성하는 수준으로 사용될 수 있다. 효과는 본 출원에 기술된 체커보드 분석 (checkerboard assay)과 같은 분석에 의해 측정될 수 있다.

"치료"는 사람을 포함한 대상체가 직접 또는 간접적으로 장애 치료, 병원체 박멸 또는 대상체의 상태 개선을 목적으로 의학적 도움을 받는 모든 과정, 작용, 적용, 요법 등을 지칭한다. 치료는 또한 발병률 감소, 증상 완화, 재발 제거, 재발 방지, 발병 예방, 발병 위험 감소, 증상 개선, 예후 개선 또는 이들의 조합을 지칭한다. "치료"는 대상체에서 세균의 집단, 성장률 또는 병독성을 감소시키고 이에 의해 대상체에서의 세균 감염 또는 기관, 조직 또는 환경의 세균 오염을 제어하거나 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 발병률을 감소시키는 "치료"는, 예를 들어, 특정 환경에서 이것이 대상체이든 환경이든 적어도 하나의 그람 양성 세균의 성장을 억제하는데 효과적일 수 있다. 다른 한편으로, 이미 확립된 감염의 "치료"는 감염 또는 오염의 원인이 되는 그람 양성 세균의 집단 감소, 사멸, 성장 억제 및/또는 박멸을 지칭한다.

"예방"은 세균 감염과 같은 장애의 발생, 재발, 확산, 발병 또는 확립을 예방하는 것을 지칭한다. 본 개시 내용이 감염의 완전한 예방 또는 확립의 예방에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 양태에서, 발병이 지연되거나, 이후에 걸리는 질환의 중증도 또는 질환에 걸릴 가능성이 감소되며, 이것은 예방의 예를 구성한다.

"걸리는 질환 (contracted disease)"은 발열, 패혈증 또는 균혈증의 검출과 같은 임상적 또는 준임상적 증상을 보이는 질환 뿐만 아니라 이러한 병리와 관련된 증상이 나타나지 않았을 때 (예를 들어, 배양액 중의) 세균성 병원체의 성장에 의해 검출될 수 있는 질환을 지칭한다.

펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편의 맥락에서 "유도체"는, 예를 들어, 용해 활성과 같은 폴리펩타이드의 활성에 실질적으로 악영향을 미치거나 파괴하지 않는 아미노산 이외의 하나 이상의 화학적 모이어티를 함유하도록 변형된 폴리펩타이드를 포함하도록 의도된다. 화학적 모이어티는, 예를 들어, 아미노 말단 아미노산 잔기, 카복시 말단 아미노산 잔기를 통해, 또는 내부 아미노산 잔기에서 펩타이드에 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 변형은 자연적이거나 비-자연적일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 비-자연적 변형은 반응성 모이어티에 보호 그룹 또는 캡핑 그룹의 추가, 항체 및/또는 형광성 표지와 같은 검출 가능한 표지의 추가, 글리코실화의 추가 또는 변형, 또는 PEG (페길화)와 같은 벌킹 그룹의 추가 및 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 기타 변화를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 비-자연적 변형은 N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화와 같은 캡핑 변형일 수 있다. 리신 폴리펩타이드에 첨가될 수 있는 예시적인 보호 그룹은 t-Boc 및 Fmoc를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청록 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 mCherry와 같지만 이에 제한되지 않는 일반적으로 사용되는 형광 표지 단백질은 세포 단백질의 정상적인 기능을 방해하지 않으면서 폴리펩타이드에 공유적 또는 비공유적으로 결합되거나 폴리펩타이드에 융합될 수 있는 소형 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 형광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류 또는 하류에 삽입된다. 이것은 세포 기능 또는 이것이 부착된 폴리펩타이드의 기능을 방해하지 않는 융합 단백질 (예를 들어, 리신 폴리펩타이드::GFP)을 생성할 것이다. 단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 접합은 많은 약제학적 단백질의 순환 반감기를 연장하는 방법으로 사용되어 왔다. 따라서, 리신 폴리펩타이드 유도체와 같은 폴리펩타이드 유도체의 맥락에서, 용어 "유도체"는 하나 이상의 PEG 분자의 공유 부착에 의해 화학적으로 변형된 리신 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 페길화된 리신과 같은 리신 폴리펩타이드는 생물학적 및 치료학적 활성을 유지하면서 페길화되지 않은 폴리펩타이드와 비교하여 연장된 순환 반감기를 나타낼 것으로 예상된다.

"아미노산 서열 동일성 퍼센트"는 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로 보존적 치환을 고려하지 않는, 리신 폴리펩타이드 서열과 같은 참조 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭한다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST와 같은 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 또는 예를 들어, DNASTAR로부터 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 2개 이상의 폴리펩타이드 서열은 0 내지 100% 동일하거나 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 본 개시 내용의 맥락에서, 2개의 폴리펩타이드는 아미노산 잔기의 적어도 80% (전형적으로 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 및 전형적으로 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 적어도 99%)가 동일할 때 "실질적으로 동일"하다. 본 출원에 기술된 바와 같은 용어 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 펩타이드에도 적용된다. 따라서, 용어 "실질적으로 동일한"은 본 출원에 기술된 것과 같은 단리된 폴리펩타이드 및 펩타이드의 돌연변이, 절두, 융합 또는 달리 서열-변형된 변이체, 및 이의 활성 단편, 뿐만 아니라 참조 (야생형 또는 기타 온전한) 폴리펩타이드와 비교하여 실질적인 서열 동일성 (예를 들어, 상기 언급된 하나 이상의 방법에 의해 측정된 바와 같이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성, 적어도 98% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 것이다. 2개의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 적어도 약 80% (전형적으로 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 동일성, 또는 적어도 약 99% 동일성)이 동일하거나 보존적 치환을 나타낼 때 "실질적으로 상동성"이다. 본 개시 내용의 폴리펩타이드의 서열은 본 출원에 기술된 리신 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드의 아미노산 중 하나 이상, 또는 수 개, 또는 최대 10%, 또는 최대 15%, 또는 최대 20%가 유사한 또는 보존적 아미노산 치환으로 치환될 때 실질적으로 상동성이며, 여기서, 본 출원에 기술된 리신과 같은 생성된 폴리펩타이드는 본 출원에 기술된 리신과 같은 참조 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성, 항균 효과 및/또는 세균 특이성을 갖는다.

본 출원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 전하를 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열이 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.

"생물막"은 세균- 및/또는 숙주-유래 성분으로 구성될 수 있는 수화된 중합체 매트릭스에서 표면에 부착되고 응집하는 세균을 지칭한다. 생물막은 세포가 생물 또는 비생물 표면에서 서로 부착되어 있는 미생물의 집합체이다. 이러한 부착 세포는 종종 세포외 중합체 물질 (EPS)로 구성되지만 이에 제한되지 않는 매트릭스 내에 매봉되어 있다. 점액 (slime) (점액으로 기술된 모든 것이 생물막은 아니지만) 또는 플라크라고도 하는 생물막 EPS는 일반적으로 세포외 DNA, 단백질 및 다당류로 구성된 중합체성 복합체이다.

특정 세균에 대해 사용하기에 적합한 항생제의 맥락에서 "적합한"은 내성이 후속적으로 발생하더라도 해당 세균에 대해 효과적인 것으로 밝혀진 항생제를 지칭한다.

감염성 심내막염

본 개시 내용은 본 출원에 기술된 바와 같은 통상적인 항생제 및 리신, 특히, MIC-이하 양의 리신을 사용하여 스태필로코커스 아우레우스와 같은 그람 양성 세균으로 인한 감염성 심내막염 또는 감염성 심내막염 재발을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

특정 실시 형태에서, 본 발명의 방법의 감염성 심내막염은 생물막의 존재를 특징으로 한다. 생체내에서 형성된 이러한 생물막은 흔히, 적어도 부분적으로, 숙주 방어 메커니즘에 대한 이들의 노출로 인해 복잡한 구조를 나타낸다. 이 구조를 관통하는데 있어서의 어려움으로 인해, 많은 항생제와 생물제제는 생물막의 존재와 관련된 감염성 심내막염과 같은 만성 질환을 치료하는데 효과적이지 않다. 그러나, 본 발명의 방법은 실시예에서 입증된 바와 같이 생물막-형성 그람 양성 세균에 의해 유발된 것을 포함한 감염성 심내막염을 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 바와 같은 감염성 심내막염은 심실 및 심장 판막의 내벽인 심내막의 감염을 지칭한다. 감염성 심내막염은 일반적으로 입과 같은 신체의 다른 부위로부터의 세균이 혈류를 통해 퍼지고 심장의 손상된 부위에 부착되어 여기에 생물막을 형성할 수 있을 때 발생한다.

심내막염은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 진단될 수 있다. 전형적으로, 수정된 듀크 기준 (Duke Criteria)이 사용된다 (표 1, 전문이 본 출원에 참고로 포함된 문헌 참조; Cahill et al., Lancet, 2016, 387:882-893). 2개의 주 기준, 1개의 주 기준과 3개의 부 기준 또는 5개의 부 기준이 관찰될 때 진단이 나타난다. 대안적으로, 병리학 표본이 수술로부터 이용 가능하다면, 병리학적 기준, 즉 조직학 또는 우종 또는 농양 조직의 양성 배양을 사용하여 진단이 이루어질 수 있다.

[표 1]

본 발명의 방법은 스태필로코커스 아우레우스와 같은 표 1에 열거된 원인 인자로 인한 심내막염을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 실시예에 기술된 감염성 심내막염의 원인 인자로 인한 심내막염을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 전형적인 원인 인자는 코아귤라아제 음성 스태필로코커스 종 (coagulase-negative Staphylococcus: CoNS)과 같은 스태필로코커스 속의 구성원을 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, CoNS는 불규칙한 "포도상" 클러스터로 분열하는 그람 양성 구균이며, 코아귤라아제 생성 및 토끼 혈장 응고의 무능력에 의해 스태필로코커스 아우레우스와 구별된다. CoNS 종은 스태필로코커스 에피데르미디스 ( Staphylococcus epidermidis ), 스태필로코커스 루그두넨시스 ( Staphylococcus lugdunensis ), 스태필 로코커스 헤몰리티쿠스 ( Staphylococcus haemolyticus ), 스태필로코커스 카피티스 ( Staphylococcus capitis ), 스태필로코커스 호미누스 ( Staphylococcus hominus ) 및 스태필로코커스 와르네리 (Staphylococcus warneri)를 포함한다.

추가의 전형적인 스태필로코커스 제제는 스태필로코커스 슈딘테르메디우스 ( Staphylococcus pseudintermedius ), 스태필로코커스 시우리 (Staphylococcus sciuri), 스태필로코커스 시물란스 ( Staphylococcus simulans ) 및 스태필로코커스 하이쿠스 (Staphylococcus hyicus )를 포함한다. 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA), 반코마이신 내성 스태필로코커스 아우레우스 (VRSA), 답토마이신 내성 스태필로코커스 아우레우스 (DRSA), 및/또는 리네졸리드 내성 스태필로코커스 아우레우스 (LRSA)을 포함하는 항생제 내성 세균 뿐만 아니라 반코마이신 중간-감수성 스태필로코커스 아우레우스 (VISA)를 포함하는 변경된 항생제 감수성 세균이 또한 고려된다.

또한, 본 발명의 방법은 스트렙토코코커스 고르도니이 (Streptocococcus gordonii), 스트렙토코코커스 미티스 (Streptocococcus mitis ), 스트렙토코코커스 오랄리스 (Streptocococcus oralis ), 스트렙토코코커스 인터메디우스 ( Streptocococcus intermedius ), 스트렙토코코커스 살리바리우스 ( Streptocococcus salivarius ), 스트렙토코코커스 피오게네스 (Streptocococcus pyogenes), 스트렙토코코커스 아갈락티에 (Streptocococcus agalactiae ), 스트렙토코코커스 디스갈락티에 (Streptocococcus dysgalactiae ), 스트렙토코코커스 뉴모니에 ( Streptocococcus pneumoniae ), 스트렙토코코커스 무탄스 (Streptocococcus mutans), 스트렙토코코커스 안지오수스 (Streptocococcus anginosus ) 및 스트렙토코코커스 상귀니스 (Streptocococcus sanguinis )와 같은 표 1 및 실시예에 기술된 바와 같은 스태필로코커스 종으로 인한 심내막염을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 전형적인 스태필로코커스 종은 스트렙토코코커스 인터메디우스 ( Streptocococcus intermedius ), 스트렙토코코커스 피오게네스 (Streptocococcus pyogenes) (란스필드 그룹 A), 스트렙토코코커스 아갈락티에 (Streptocococcus agalactiae) (란스필드 그룹 B) 및 스트렙토코코커스 디스 갈락티에 (Streptocococcus dysgalactiae) (란스필드 그룹 G)를 포함한다.

본 발명의 방법은 인공 판막 심내막염, 심장 장치 감염 및 우측 심내막염을 포함한 임의 유형의 감염성 심내막염을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 감염성 심내막염은 인공 판막 심내막염이다. 인공 판막 심내막염은 인공 판막 수술 5년 이내에 환자의 3-4%에서 전형적으로 발생하며 기계적 및/또는 생체 인공 판막에 영향을 미치는 감염을 지칭한다. 일부 양태에서, 인공 판막 심내막염은 의료 후천성 (health-care acquired)이다. 초기 인공 판막 심내막염 (초기 수술 후 1년 미만)은 주로 수술 후 처음 2개월 내에 발생하며 대부분 코아귤라아제 음성 스태필로코커스 또는 스태필로코커스 아우레우스로 인한 것이다. 1년이 넘으면, 인공 판막 심내막염을 일으키는 유기체의 범위는 자연 판막 심내막염과 동일하다.

일부 양태에서, 감염성 심내막염은 심장 장치 감염이다. 심장 장치는 영구 심박 조율기, 심장 재동기화 요법 및 이식형 제세동기를 포함한다. 감염은 발생기 포켓, 장치 리드 또는 주변 심내막 표면을 포함할 수 있다. 심장 장치 감염의 위험 요소는 절개 부위의 혈종 형성, 신부전, 복합 장치 이식 (영구 심박 조율기와 비교하여) 및 항생제 프로필락시스의 부재하에서의 교정 절차를 포함한다. 발생기 포켓 감염의 징후는 국소 봉와직염, 분비물, 열개 또는 통증을 포함한다. 리드 또는 심내막을 포함하는 감염은 발열, 권태감 및 패혈증을 유발할 수 있다.

일부 양태에서, 감염성 심내막염은 우측 심내막염이다. 우측 감염성 심내막염은 전형적으로 정맥내 약물 사용자, 심장 장치 감염이 있는 대상체, 중심 정맥 카테터를 사용하는 대상체, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)가 있는 대상체, 및 선천성 심장 질환이 있는 대상체와 관련이 있다. 일부 양태에서, 삼첨판이 우측 심내막염에 영향을 받는다. 패혈증을 포함한 균혈증의 특징 외에도, 환자는 종종 폐색전, 폐렴 및 폐농양 형성으로부터 야기되는 호흡기 증상을 갖는다. 일부 양태에서, 정맥내 약물 사용자와 같은 우측 심내막염을 가진 환자는 표준 치료에 대한 낮은 순응도를 나타낸다.

일부 양태에서, 본 발명의 방법은 감염성 심내막염을 획득할 위험이 있는 대상체를 치료하는데 사용된다. 감염성 심내막염을 획득할 위험이 있는 대상체는 이전에 감염성 심내막염 진단을 받은 대상체, 인공 심장 판막이 있는 대상체, 본 출원에 정의된 바와 같은 심장 장치가 있는 대상체, 60세 이상의 대상체, 정맥내 약물 사용자 및/또는 류마티스 심장 질환이 있는 대상체를 포함한다.

리신

재발 방지를 포함하여 감염성 심내막염을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명의 방법은 본 출원에 기술된 바와 같은 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 본 출원에 또한 기술된 바와 같은 하나 이상의 항생제와 조합하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 리신은 세포 내부에서 펩티도글리칸을 분해하여 숙주 세균을 용해시킴으로써 감염된 세균으로부터 자손 파지를 유리시키는 박테리오파지-인코딩 가수분해 효소이다. 본 발명의 리신은 세균 세포 외부로부터 펩티도글리칸을 공격함으로써 병원성 세균을 용해시키는 항미생물제로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 리신은 세균 종에 대해 매우 특이적이며 위장 항상성을 유지하는데 유익할 수 있는 공생 장 세균을 포함한 비표적 유기체를 거의 용해시키지 않는다.

일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 그람 양성 세균에 대한 살균 및/또는 정균 활성을 나타낸다. 일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 또한 낮은 내성 경향을 나타내고, 항생제 내성을 억제하고/하거나 통상적인 항생제와 상승효과를 나타낸다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 감염성 심내막염이 있는 대상체의 생물막을 포함하여 세균 응집, 생물막 형성을 억제하고/하거나 생물막을 감소 또는 근절한다.

본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 살균 활성은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 전문이 본 출원에 참고로 포함된 문헌 [Mueller, et al., 2004, Antimicrob Agents Chemotherapy, 48:369-377]에 기술된 바와 같은 시간 사멸 분석 (time kill assay)을 사용하여 시험관내에서 평가될 수 있다.

본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 정균 활성은 또한 임의의 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 성장 곡선은 예를 들어, 사람 혈청 (caMHB/50% HuS)에 보충된 양이온 조정된 Mueller Hinton II 브로스에서 50% 또는 100% 혈청의 최종 농도로 수행될 수 있다. 그람 양성 세균은 리신으로 현탁될 수 있고 배양물 탁도는 예를 들어, SPECTRAMAX® M3 다중-모드 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용하여 예를 들어, 교반하면서 24℃에서 11시간 동안 1분마다 판독하여 600nm의 광학 밀도에서 측정될 수 있다. 전문이 본 출원에 참고로 포함된 문헌 [Saito et al, 2014, Antimicrob Agents Chemother 58:5024-5025]에 기술된 방법에 따라 통기가 있는 플라스크에서 성장한 배양물의 대수 단계에서 배가 시간 (doubling time)을 계산하고 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 부재하에서의 배양물의 배가 시간과 비교할 수 있다.

세균 응집의 억제는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, Walker 등에 기술된 방법, 즉 전문이 본 출원에 참고로 포함된 문헌 [Walker et al., 2013, PLoS Pathog, 9:e1003819]에 기술된 방법이 사용될 수 있다.

시험관내에서 생물막 형성을 억제하거나 감소시키는 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 능력을 평가하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 수정된 브로스 미량희석 최소 억제 농도 (MIC) 방법의 변형을 포함한다 (전문이 본 출원에 참고로 포함된 문헌 [Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776] 및 전문이 본 출원에 참고로 포함된 문헌 [Schuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18] 참조). 최소 생물막 근절 농도 (MBEC)를 평가하기 위한 이러한 방법에서, 예를 들어, 스태필로코커스 아우레우스 균주의 신선한 콜로니를 배지, 예를 들어, TSBg (0.2% 글루코스가 보충된 트립신 대두 브로스)에 예를 들어, 1:100 희석된 인산 완충 용액 (PBS))에 현탁시키고, Calgary 생물막 장치 (96 폴리카보네이트 페그를 포함하는 뚜껑이 있는 96웰 플레이트; lnnovotech Inc.)에 예를 들어, 0.15ml 분취량으로 첨가하고, 예를 들어, 37℃에서 24시간 배양한다. 그후 생물막을 세척하고 예를 들어, TSBg에서 예를 들어, 37℃에서 24시간 동안 리신의 2배 연속 희석물로 처리한다. 처리 후, 웰을 세척하고, 예를 들어, 37℃에서 공기-건조하고 예를 들어, 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 염색한다. 염색 후, 생물막을 예를 들어, 33% 아세트산에서 오염을 제거하고 예를 들어, 추출된 크리스탈 바이올렛의 OD600을 결정한다. 각 샘플의 MBEC는 크리스탈 바이올렛 정량에 의해 평가된 생물막 바이오매스의 >95%를 제거하는데 필요한 최소 리신 농도이다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리신은 전문이 본 출원에 참고로 포함된 제WO 2013/170015호에 기술된 바와 같은 PlySs2 리신을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "PlySs2 리신", "PlySs2 리신", "PlySs2" 및 "CF-301"은 상호교환적으로 사용되며 제WO 2013/170015호에 기술된 바와 같은 서열 번호 2 (초기 메티오닌 잔기가 있거나 없음)로 본 출원에 제시된 PlySs2 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 스트렙토코커스 수이스 ( Streptococcus suis ) 게놈의 프로파지 내에서 인코딩된 항-스태필로코커스 리신으로 확인된 PlySs2는 다음의 예시된 세균에 대해 살균 및 정균 활성을 나타낸다.

[표 2]

본 발명의 방법에 사용하기 위한 특히, 전형적인 리신은 서열 번호 2의 PlySs2 리신, 또는 보다 전형적으로, 서열 번호 18에 제시된 바와 같이 초기 메티오닌 잔기를 포함하지 않는PlySs2의 성숙한 형태이다. 서열 번호 2 및 18의 PlySs2 리신은 세포벽-결합 C-말단 도메인 (서열 번호 20)에 연결된 촉매 N-말단 도메인 (서열 번호 19)에 의해 정의된, 대부분의 박테리오파지 리신에 특징적인 도메인 배열을 갖는다. N-말단 도메인은 리신 및 기타 세균 세포벽-변형 효소 사이에 공통인 시스테인-히스티딘-의존성 아미도하이드롤라제/펩티다제 (CHAP) 패밀리에 속한다. C-말단 도메인은 전형적으로 리신의 세포벽-결합 요소를 형성하는 SH3b 패밀리에 속한다. 도 1은 굵게 표시된 영역으로 나타낸 N- 및 C-말단 도메인을 갖는 서열 번호 2의 PlySs2 리신을 도시한다. N-말단 CHAP 도메인은 LNN으로 시작하는 첫 번째 굵게 표시된 아미노산 서열 영역에 해당하고 C-말단 SH3b 도메인은 RSY로 시작하는 두 번째 굵게 표시된 영역에 해당한다.

일부 양태에서, 본 발명의 방법은 변이체 리신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리신 변이체는 참조 리신의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유하는 서열 번호 2 또는 서열 번호 18을 기준으로 적어도 하나의 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 리신은 스태필로코커스 아우레우스를 포함한 광범위한 그람 양성 세균에 대한 살균 및/또는 정균 효과 및 응집을 억제하고 생물막 형성을 억제하고/하거나 생물막을 감소시키는 능력을 포함하는 항균 활성을 나타낸다. 일부 양태에서, 본 발명의 리신 변이체는 그람 양성 세균을 항생제에 보다 민감하게 만든다.

일부 양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 리신 변이체는 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 98% 또는 예를 들어, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 여기서, 변이체 리신은 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들어, 촉매 활성, 세균 세포벽에 결합하는 능력, 예를 들어, 본 출원에 기술된 바와 같은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 PlySs2 리신의 스태필로코커스 및/또는 스트렙토코커스와 같은 생물막의 그람 양성 세균을 사멸하는 능력을 포함한 스태필로코커스 또는 스트렙토코커스, 살균 또는 정균 활성을 보유한다.

리신 변이체는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있고 전문이 본 출원에 참고로 포함된 제WO 2013/170015호에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발을 통해 또는 서열 번호 2 또는 서열 번호 18의 PlySs2 리신을 생산하고 본 출원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 생물학적 기능을 보유하는 숙주에서 돌연변이를 통해 서열 번호 2 또는 서열 번호 18의 PlySs2 리신을 변형함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, 당해 분야의 통상의 기술자는, 예를 들어, 서열 번호 2 또는 서열 번호 18의 PlySs2 리신의 CHAP 도메인 및/또는 SH3b 도메인에 대한 치환 또는 대체를 합리적으로 만들고 시험할 수 있다. Genbank 데이터베이스에 대한 서열 비교는, 예를 들어, 치환을 위한 아미노산을 확인하기 위해 CHAP 및/또는 SH3b 도메인 서열 중 하나 또는 둘 다를 사용하거나 서열 번호 2 또는 서열 번호 18의 PlySs2 리신 전체 아미노산 서열을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 2 또는 서열 번호 18의 PlySs2 아미노산 서열에서 발린 아미노산 잔기 19에서 발린이 알라닌으로 대체된 돌연변이체 또는 변이체는 활성이며 서열 번호 2 PlySs2 리신과 유사하고 그 만큼 효과적인 방식으로 그람 양성 세균을 사멸할 수 있다.

또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, CHAP 도메인은 다른 폴리펩타이드의 CHAP 도메인에서 특징적이고 보존되어 있는 보존된 시스테인 및 히스티딘 아미노산 서열 (CHAP 도메인의 첫 번째 시스테인 및 히스티딘)을 포함한다. 예를 들어, 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기가 활성 또는 능력을 유지하도록 PlySs2의 돌연변이체 또는 변이체에서 유지되어야 한다고 예측하는 것이 합리적이다. 따라서, 본 개시 내용의 리신 변이체에 보유하기에 특히, 바람직한 잔기는 서열 번호 2의 CHAP 도메인에 활성 부위 잔기 Cys26, His102, Glu118 및 Asn120을 포함한다. 특히, 바람직한 치환은 다음을 포함한다: 양전하가 유지될 수 있도록 Arg를 Lys로 및 그 반대, 음전하가 유지될 수 있도록 Asp를 Glu로 및 그 반대, 유리 -OH가 유지될 수 있도록 Thr을 Ser로 및 유리 NH2가 유지될 수 있도록 Asn을 Gln로 치환함. 다른 적합한 변이체는 본 발명의 서열 번호 2의 CHAP 도메인과 예를 들어, 전문이 본 출원에 참고로 포함되고 도 6에 도시된 문헌 [Schmitz, 2011, "Expanding the Horizons of Enzybiotic Identification" Student Theses and Dissertations, paper 138]에 나타낸 바와 같은 PlyC의 CHAP 도메인 사이와 같이 알려진 다른 리신 간에 공유되지 않는, CHAP 및/또는 SH3 도메인 영역의 서열 번호 2 또는 서열 번호 18에 치환을 포함한다.

적합한 변이체 리신은 또한 전문이 본 출원에 참고로 포함된 PCT 공개 출원 제WO 2019/165454호 (국제 출원 제PCT/US2019/019638호)에도 기술되어 있다. 특히, 적합한 변이체 리신은 서열 번호 3 내지 17로서 본 출원에 제시된 것들 뿐만 아니라 서열 번호 3 내지 17 중의 어느 하나와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 98% 또는 예를 들어, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 리신을 포함하며, 여기서, 변이체 리신은 본 출원에 기술된 바와 같은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 PlySs2 리신의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유한다.

서열 번호 3 내지 17은 항균 활성 및 유효성을 보존하면서 대응물 야생형 PlySs2 리신 (서열 번호 2)에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 변형된 리신 폴리펩타이드이다. 서열 번호 3 내지 17은 아래 표 A에 나타낸 바와 같이 서열 번호 2에 대한 이들의 아미노산 치환을 참조하여 기술될 수 있다. 변형된 리신 폴리펩타이드의 아미노산 서열 (서열 번호 2와의 차이 및 이의 아미노산 잔기의 위치 참고)은 다음과 같이 한글자 아미노산 코드를 사용하여 요약된다:

[표 A]

일부 양태에서 본 발명의 방법은 리신의 활성 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 적합한 활성 단편은 본 출원에 기술된 바와 같은 양태의 단백질 또는 펩타이드 단편의 생물학적 활성 부분을 보유하는 것들을 포함한다. 이러한 변이체는 리신 단백질의 전장 단백질보다 적은 수의 아미노산을 포함하고 상응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 상응하는 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. PlySs2 리신의 N-말단 CHAP 도메인에 대한 예시적인 도메인 서열은 도 1 및 서열 번호 19에 제공되어 있다. PlySs2 리신의 C 말단 SH3b 도메인에 대한 예시적인 도메인 서열은 도 1 및 서열 번호 20에 제공되어 있다. 본 개시 내용의 단백질 또는 단백질 단편의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어, 10, 25, 50, 100개 아미노산 길이인 폴리펩타이드일 수 있다. 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고 양태의 폴리펩타이드의 천연 형태의 기능적 활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.

일부 양태에서, 적합한 활성 단편은 서열 번호 19 또는 20을 포함하는 본 출원에 기술된 활성 단편과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 98% 또는 예를 들어, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 것들을 포함하며, 여기서, 이의 활성 단편은 CHAP 및/또는 SH3b 도메인의 적어도 하나의 활성을 보유한다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 출원에 기술된 바와 같은 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 특정 박테리오파지로 감염된 후 세균 유기체에 의해 생산될 수 있거나 재조합 또는 합성, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 생산 또는 제조될 수 있거나 무세포 합성 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 리신 폴리펩타이드 서열 및 리신 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 본 출원에 기술되고 참조되는 한, 본 발명의 리신은 파지 게놈으로부터의 리신에 대한 단리된 유전자를 통해, 유전자를 전달 벡터에 넣고, 상기 전달 벡터를 예를 들어, 전문이 본 출원에 참고로 포함된 제WO 2013/170015호에 기술된 바와 같은 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 발현 시스템으로 클로닝하여 생산될 수 있다. 본 발명의 리신 변이체는 절단, 키메라, 셔플 또는 "천연"일 수 있고, 예를 들어, 전문이 본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,604,109호에 기술된 바와 같이 조합될 수 있다.

돌연변이는 특정 코돈이 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변경되어 치환된 아미노산을 갖는 서열을 수득하거나, 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 추가되도록, 서열 번호 2, 서열 번호 18에 제시된 리신 서열 또는 이의 활성 단편 또는 절단부를 포함하여 아미노산 서열에서 또는 본 출원에 기술된 폴리펩타이드 및 리신을 인코딩하는 핵산 서열에서 이루어질 수 있다.

이러한 돌연변이는 일반적으로 최소한의 뉴클레오타이드 변화를 가능하게 함으로써 이루어진다. 이러한 종류의 치환 돌연변이는 비보존적 방식으로 (예를 들어, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산에서 다른 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변경함으로써) 또는 보존적 방식으로 (예를 들어, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산에서 동일한 그룹에 속하는 아미노산으로 코돈을 변경함으로써) 생성된 단백질의 아미노산을 변경하도록 이루어질 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로 생성된 단백질의 구조 및 기능의 변화를 덜 유발한다. 비보존적 변화는 생성된 단백질의 구조, 활성 또는 기능을 변경할 가능성이 더 높다. 본 개시 내용은 생성된 단백질의 활성 또는 결합 특성을 유의하게 변경하지 않는 보존적 변화를 함유하는 서열을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 당해 분야의 통상의 기술자는, 본 출원에 제공된 PlySs2 리신 폴리펩타이드의 서열의 검토 및 그들의 지식 및 다른 리신 폴리펩타이드에 대해 이용가능한 공개 정보에 기초하여, 리신 폴리펩타이드 서열에 아미노산 변화 또는 치환을 만들 수 있다. 아미노산 변화는 본 출원에 제공된 리신(들)의 서열에서 하나 이상, 하나 또는 몇 개, 하나 또는 여러 개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 또는 이와 같은 다른 수의 아미노산을 대체하거나 치환하도록 이루어져 돌연변이체 또는 이의 변이체를 생성할 수 있다. 이러한 돌연변이체 또는 이의 변이체는 기능에 대해 예측되거나, 예를 들어, 스태필로코커스, 스트렙토코커스 또는 엔테로코커스 세균에 대한 본 출원에 기술된 바와 같은 항균 활성에 대한 기능 또는 능력에 대해 및/또는 기술되고 특히, 본 출원에 제공된 바와 같은 리신(들)에 필적하는 활성을 갖는지에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 리신의 서열에 대해 이루어진 변경, 및 본 출원에 기술된 돌연변이체 또는 변이체는 당해 분야에 공지되고 본 출원에 기술된 분석 및 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 본 발명의 리신(들)의 도메인 구조에 기초하여, 치환 또는 대체에 적합한 하나 이상, 하나 또는 여러 개의 아미노산 및/또는 합리적인 보존적 또는 비보존적 치환을 포함한 치환 또는 대체에 적합하지 않은 하나 이상의 아미노산을 예측할 수 있다.

항생제

본 출원에 기술된 감염성 심내막염을 치료 또는 예방하는 방법은 치료학적 유효량의 하나 이상의 항생제 및 PlySs2 리신을 공동 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본 출원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 항생제의 공동 투여는 스태필로코커스 아우레우스와 같은 그람 양성 세균에 대한 상승적 살균 및/또는 정균 효과를 초래한다. 전형적으로, 공동 투여는 정균 및/또는 살균 활성에 대한 상승 효과를 초래한다. 또 다른 양태에서, 공동 투여는 생물막 형성 및/또는 응집을 포함하는 독성 표현형을 억제하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 공동 투여는 대상체에서 생물막의 양을 감소시키기 위해 사용된다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항생제는 페니실린 (예를 들어, 메티실린, 옥사실린), 세팔로스포린 (예를 들어, 세팔렉신 및 세팩터), 모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남) 및 카바페넴 (예를 들어, 이미페넴 및 엔타페넴)을 포함한 베타-락탐; 매크롤리드 (예를 들어, 에리트로마이신, 아지트로마이신), 아미노글리코사이드 (예를 들어, 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신), 글리코펩타이드 (예를 들어, 반코마이신, 테이코플라닌), 옥사졸리디논 (예를 들어, 리네졸리드 및 테디졸리드), 리포펩타이드 (예를 들어, 답토마이신) 및 설폰아미드 (예를 들어, 설파메톡사졸)과 같은 상이한 유형 및 부류의 항생제를 포함한다.

전형적으로, 반코마이신, 답토마이신, 리네졸리드 및 옥사실린이 본 발명의 방법에 사용된다. 훨씬 더 전형적으로, 답토마이신이 사용된다.

투여량 및 투여

이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 투여량은 치료될 감염의 활성, 치료될 대상체의 연령, 건강 및 일반적인 신체 상태, 특정 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 활성, 존재하는 경우, 본 개시 내용에 따른 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체와 페어링되는 항생제의 성질 및 활성 및 이러한 페어링의 조합된 효과를 포함하는 다수의 인자에 따라 좌우된다. 일반적으로, 투여되는 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 유효량은 0.1-50mg/kg (또는 1 내지 50mcg/ml)의 범위내에 드는 것으로 예상된다. 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 임의의 원하는 빈도 또는 기간에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 최대 14일의 기간 동안 매일 1 내지 4회 투여될 수 있다. 전형적으로, 단지 단일 투여량이 투여된다. 항생제는 표준 투여 섭생으로 투여되거나 상승작용의 관점에서 더 적은 양으로 투여될 수 있다. 그러나 모든 이러한 투여량 및 섭생 (리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 또는 이와 함께 투여되는 임의의 항생제)은 최적화를 거친다. 최적의 투여량은 당해 분야의 기술 내에서 그러나 본 개시 내용을 고려하여 시험관 내 및 생체내 파일럿 효능 실험을 수행함으로써 결정될 수 있다.

전형적으로, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 투여량은 약 0.000025 내지 약 1.8mg/kg, 예를 들어, 약 0.05mg/kg 내지 약 0.5mg/kg 또는 약 0.1mg/kg 내지 약 0.3mg/kg 범위이다. 보다 전형적으로, 건강한 개인에서, 투여량 범위는 약 0.2mg/kg 내지 약 0.3mg/kg, 예를 들어, 0.25mg/kg이다. 일부 양태에서, 예를 들어, 중등도 및 중증 신장 장애가 있는 개인에서는 투여량이 예를 들어, 0.1mg/kg 내지 0.2mg/kg, 예를 들어, 0.12mg/kg로 더 낮을 수 있다. 일부 양태에서, 단일 투여량과 같은 투여량은, 예를 들어, 2시간의 기간에 걸쳐 정맥내 투여된다.

본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 살균 효과 및, 더 적은 양으로 사용되는 경우, 정균 효과를 제공하고 광범위한 항생제 내성 세균에 대해 활성이며 진화하는 내성과 관련이 없는 것으로 고려된다. 본 개시 내용에 기초하여, 임상 환경에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 특정 항생제 (심지어 내성이 발달한 항생제)와 조합된 경우 약물- 및 다중 내약성 세균으로부터 발생하는 심내막염 감염을 치료하기 위한 조성물의 강력한 대안 (또는 첨가제 또는 성분)이다. 그람 양성 세균에 대한 기존의 내성 메커니즘이 본 발명의 폴리펩타이드의 용해 활성에 대한 감수성에 영향을 미치지 않아야 한다.

본 개시 내용의 임의의 폴리펩타이드에 대해, 치료학적 유효량은 초기에 세포 배양 검정에서 또는 동물 모델, 통상적으로 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 원하는 농도 범위 및 투여 경로를 달성하는데 사용될 수 있다. 그후 입수된 정보는 사람에서 유효 용량 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 전형적으로 전신 투여, 특히, 정맥내 투여가 사용된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 성분을 제공하거나 원하는 효과를 유지하기 위해 추가로 조정될 수 있다. 고려할 수 있는 추가 요소는 질환 상태의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 원하는 치료 기간, 투여 방법, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 요법에 대한 내성/반응 및 담당의의 판단을 포함한다.

치료 섭생은 매일 투여 (예를 들어, 매일 1회, 2회, 3회 등), 격일로 (예를 들어, 격일로 1회, 2회, 3회 등), 2주마다, 매주, 2주에 한 번, 한 달에 한 번 등을 수반할 수 있다. 하나의 양태에서, 치료는 연속 주입으로 제공될 수 있다. 단위 용량은 여러 차례 투여될 수 있다. 간격은 임상 증상을 모니터링함으로써 표시되는 바와 같이 불규칙할 수도 있다. 대안적으로, 단위 용량은 서방성 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에 따라 다를 수 있다. 이러한 가이드라인은 국소 투여, 예를 들어, 비강내, 흡입, 직장 등을 위해, 또는 전신 투여, 예를 들어, 경구, 직장 (예를 들어, 관장을 통해), i.m. (근육내), i.p. (복강내), i.v. (정맥내), s.c. (피하), 경요도 등을 위해 조정될 것임을 당해 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.

일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 이를 필요로 하는 대상체에게 MIC 양으로 투여된다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, MIC 값은 대조군과 비교하여 세균 성장의 적어도 80%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도를 지칭한다. 이론에 제한됨이 없이, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 MIC 수준 이상으로 투여될 경우 하나 이상의 통상적인 항생제와 공동 투여될 때 감염성 심내막염에 대해 효과적일 수 있고 본 출원에 기술된 바와 같은 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는 광범위한 그람 양성 세균에 대한 살균 효과를 나타낼 수 있는 것으로 믿어진다. 또한, 일부 양태에서, MIC 수준 이상의 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 투여는 대상체에서 생물막을 근절하는데 사용될 수 있다.

MIC는 임의의 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, MIC 값은 CLSI[Clinical and Laboratory Standards Institute methodology), 2018, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11^th Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA]에 따르는 브로스 미량희석 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 양태에서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체에 대한 MIC 값은 100% 사람 혈청 또는 생체내 환경에 적합한 MIC 값을 결정하기 위해 최종 농도 25%로 말 혈청 및 최종 농도 0.5mM로 디티오트레이톨 (DTT)이 보충된 양이온 조정된 Mueller Hinton II 브로스를 사용하여 시험된다.

일부 양태에서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 또한 MIC 이하 수준, 예를 들어, 0.9X MIC 내지 0.0001X MIC 범위의 MIC 이하 수준으로 이러한 생물제제를 투여함으로써 감염성 심내막염의 재발을 포함한 감염성 심내막염의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. 이러한 MIC-이하 수준에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 전형적으로 그람 양성 세균의 성장을 억제하고, 응집을 감소시키고/시키거나 생물막 형성을 억제하거나 생물막을 감소 또는 근절하기 위해 사용된다.

이론에 제한됨이 없이, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC-이하 투여량은 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 펩티도글리칸 가수분해 활성에 의해 매개되는 세포 외피에 치명적이지 않은 손상을 초래한다. 일부 양태에서, 결과로 초래된 세포 외피의 물리적 및 기능적 변화가 성장 지연의 원인이 된다. 이러한 물리적 및 기능적 변화는 예를 들어, 세포벽의 불안정화, 막 투과성의 증가 및 막 전위의 소산을 포함한다. 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체가 세균 세포막에 직접적으로 작용하지는 않지만, 세포막 투과성 및 정전기 전위에 대한 임의의 효과는 매우 낮은 농도에서의 리신의 펩티도글리칸 가수분해 활성 (및 세포 외피의 불안정화)에 의해 유도된 삼투 스트레스의 결과일 것 같다. 또한 국소 세포벽 가수분해가 내막의 압출 및 기공의 형성 뿐만 아니라 세포 합성과 가수분해의 연합 해제 (uncoupling), 세포벽 두께 변화를 초래하여 후속 성장 정지를 야기할 수 있다고 가정된다.

일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC-이하 농도는 세균 세포 외피를 손상시켜, MIC-이하 용량의 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 부재하에서보다 종래의 항생제에 더 민감한 세균을 야기한다.

일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC-이하 수준의 효능은, 예를 들어, "스태필로코커스 아우레우스 ( S. aureus)에 대한 리신 CF-301의 MIC-이하 효과"라는 제목으로 오 준 (Jun Oh) 및 레이몬드 슈크 (Raymond Schuch)에 의해 LA 뉴올리언스에서 2017년 6월 2일에 미국 미생물 학회 (ASM)의 포스터 발표에서 기술된 바와 같은 시험관내 약력학 (PD) 매개변수를 사용하여 결정될 수 있다. 또한 contrafect.com/technology/publications-posters?page=2의 월드 와이드 웹을 참조한다. 전술한 포스터 발표는 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.

간단히 말해서, 후기항생 효과 (postantibiotic effect; PAE), PA MIC-이하 효과 (PA-SME) 및 MIC-이하 효과 (SME)를 포함한 시험관내 약력학 (PD) 매개변수는 세균 성장에 대한 단기간 및/또는 MIC-이하 노출의 영향을 결정할 수 있게 한다. 정의에 의하면, PAE는 항균제 제거 후 정상적인 세균 성장이 재개될 때까지 항미생물제에 대한 초기 노출 (종종 MIC-이상 수준) 후에 지속되는 세균 성장의 억제된 단계이다. PA-SME는 PAE 단계에서 MIC-이하에의 노출 동안 억제된 성장이고; 따라서 PA-SME는 PAE와 성장이 MIC-이하에 의해 억제되는 추가 시간을 포함하는 시간 간격을 나타낸다. 치료 환경에서 투여 후 억제-이하 농도가 존재할 수 있기 때문에, PA-SME는 PAE보다 생체내 상황을 보다 면밀하게 반영할 수 있다. PA-SME와 달리, SME는 이전에 예를 들어, 리신 또는 항생제에 노출되지 않은 세균의 성장에 대한 억제-이하 수준의 영향을 측정한다.

시험관내 PAE는 예를 들어, 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 MIC의 4X에서 관심 리신에 그람 양성 세균 배양물을 적용함으로써 결정될 수 있다. 노출 후, 리신은 새로 준비된 배지로 예를 들어, 1:1,000 희석에 의해 제거된 다음 24시간 동안 200rpm에서 교반하면서 37℃에서 추가로 배양된다. 각 PAE 시험 배양물에 대해, 세균 농도는 희석 직전과 직후 정량적 플레이팅에 의해 결정되며; 그후 예를 들어, 24시간 동안 예를 들어, 1시간 간격으로 정량적 플레이팅에 의해 성장이 뒤따를 수 있다. PAE는 T - C로 정의되며; 여기서, T는 항생제- 또는 리신-노출된 배양물의 생존력 계수가 리신 제거 직후 계수보다 1-log₁₀ 증가하는데 필요한 시간이고 C는 리신에 노출되지 않은 성장 대조군에 대한 상응하는 시간이다.

시험관내 PA-SME는 다음과 같이 결정될 수 있다. 리신으로 1시간 동안 PAE를 유도한 후, 배양 샘플을 4가지 상이한 MIC-이하 농도의 리신을 함유하는 배지의 분취량으로 예를 들어, 1:1,000으로 희석하고 24시간 동안 225rpm에서 교반하면서 37℃에서 추가로 배양한다. 생존력은 시험관내 PAE 결정에 대해 상기 기술된 바와 같이 결정될 수 있다. PA-SME는 T _pa - C로 정의되며; 여기서, T _pa는 이전에 리신에 노출된 다음 다른 MIC-이하 농도에 노출된 배양물이 리신의 제거 직후 계수보다 1-log₁₀ 증가하는데 필요한 시간이고 C는 리신에 노출되지 않은 성장 대조군에 대한 상응하는 시간이다.

시험관내 SME는 PAE의 사전 유도 없이 PA-SME와 동일한 방식으로 유도될 수 있다. 1시간의 성장 단계 (리신 없음) 후, 배양 샘플을 상이한 MIC-이하 농도의 리신을 함유하는 100% 사람 혈청에 1:1,000으로 희석한 다음 최대 24시간 동안 225rpm에서 교반하면서 37°C에서 추가로 배양한다. 생존력 계수는 시험관내 PAE 결정에 대해 상기와 같이 결정된다. SME는 T _s - C로 정의되며; 여기서, T _s는 MIC-이하 농도에만 노출된 배양물이 희석 직후 계수보다 1-log₁₀ 증가하는데 필요한 시간이고; C는 노출되지 않은 대조군에 대한 상응하는 시간이다.

일부 양태에서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC-이하 값의 효능은 예를 들어, 호중구감소성 마우스 허벅지 모델을 사용하여 생 체내 PA-SME 값을 결정함으로써 평가될 수 있다. 이 모델은 리신 수준이 MIC 아래로 떨어진 후 그람 양성 세균 재성장 억제를 시험하며, 주로 생체내 생물막 형성을 포함한 생체내 감염 조건에 의해 추가로 영향을 받는 MIC-이하 효과에 대한 설명을 제공하는 것으로 간주된다. PA-SME는 다음 방정식 PAE= T-C-M을 사용하여 결정될 수 있으며, 여기서, M은 혈청 수준이 MIC를 초과하는 시간을 나타내고, T는 처리된 마우스의 허벅지에서의 CFU가 시간 M에서의 계수보다 1-log₁₀ 이상 증가하는데 필요한 시간이고, C는 비처리 대조군의 허벅지에서의 CFU가 T=0 시간에서의 생존 계수보다 1-log₁₀ 증가하는데 필요한 시간이다.

일부 양태에서, MIC-이하 및/또는 MIC 수준 용량의 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 생물막, 특히, 생체내 생물막을 감소시킬 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 생체내 생물막은 시험관내 생물막과 구조적으로 구별될 수 있다. 전형적으로, 만성 감염과 관련된 것과 같은 시험관내 생물막 및 생체내 생물막 간의 차이에 대한 이유는 시험관내 생물막 시스템에서의 방어 메커니즘 노출의 부족이다. 대부분의 생체내 생물막 서식지에는, 식세포, 및 심지어 박테리오파지가 고름 및 기타 배설된 체액 및 중합체와 함께 존재할 수 있다. 일반적으로 제어하거나 재현하기 어려운 시험관내 모델 시스템에서는 이러한 변수를 피한다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 유리하게는 보다 구조적으로 복잡한 생체내 생물막을 근절하거나 감소시키는데 사용된다.

일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 살균 및/또는 정균 활성에 필요한 항생제의 MIC를 감소시킨다. MIC를 평가하기 위한 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 체커보드 분석 (checkerboard assay)이 항생제 농도에 대한 리신의 효과를 결정하는데 사용된다. 체커보드 분석은 본 출원에 기술된 바와 같은 브로스 미량희석에 의한 MIC 측정을 위한 CLSI 방법의 수정에 기반한다.

체커보드는, 예를 들어, 96-웰 폴리프로필렌 미세역가 플레이트의 열 (column)을 먼저 생성함으로써 구성되며, 여기서, 각 웰은 수평 축을 따라 2배 희석된 동량의 항생제를 갖는다. 별도의 플레이트에서, 각 웰이 수직 축을 따라, 예를 들어, 2배 희석된 동량의 리신을 갖는 유사한 행을 생성한다. 그후, 각 열은 일정량의 항생제 및 리신의 2배 희석액을 갖는 반면 각 행은 일정량의 리신 및 항생제의 2배 희석액을 갖도록 리신과 항생제 희석액을 합한다. 따라서 각 웰은 리신과 항생제의 독특한 조합을 갖는다. 세균을 예를 들어, 25%의 최종 농도로 말 혈청 및 0.5mM의 최종 농도로 디티오트레이톨 (DTT)이 보충된 양이온 조정된 Mueller Hinton II 브로스에서 1 x 10⁵ CFU/ml의 농도로 약물 조합에 첨가한다. 그후, 단독 및 조합으로서의 각 약물의 MIC를, 예를 들어, 주위 공기 중 37℃에서 16시간 후에 기록한다. 합산 분할 억제 농도 (∑FIC)를 각 약물에 대해 계산하고, 최소 ∑FIC 값 (∑FICmin)을 리신/항생제 조합의 효과를 결정하는데 사용한다.

일부 양태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제는 MIC 수준 또는 1X MIC, 2X MIC, 3X MIC 및 4X MIC와 같은 MIC 수준 이상으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 또 다른 양태에서, 항생제는 MIC-이하 수준, 예를 들어, 0.9X MIC 내지 0.0001X MIC 범위로 투여된다.

일부 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 답토마이신과 같은 본 발명의 방법의 하나 이상의 항생제는 동시에 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 답토마이신과 같은 본 발명의 방법의 하나 이상의 항생제는 연속적으로, 예를 들어, 순차적으로, 임의의 순서로 투여된다. 일부 양태에서, 리신은 표준 치료 항생제 치료제, 예를 들어, 옥사실린 및 겐타마이신 또는 답토마이신의 2주 과정의 투여 동안 또는 투여에 후속적으로 투여된다. 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본 발명의 하나 이상의 항생제는 단일 용량 또는 다중 용량으로 단독으로 또는 조합하여 투여될 수 있다.

본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 하나 이상의 항생제는 동일한 투여 방식에 의해 또는 상이한 투여 방식에 의해 투여될 수 있고, 1회, 2회 또는 다수회, 1회 이상 조합하여 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 특히, 반응, 예를 들어, 살균 및/또는 정균 효과 및/또는 응집 및/또는 생물막 형성 또는 감소에 대한 효과에 따라 초기 용량에 이어 후속 용량 또는 용량들로 투여될 수 있으며, 항생제 용량(들)과 조합되거나 대체될 수 있다. 전형적으로, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체가 단일 볼루스로 투여된 다음 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 통상적인 용량 및 투여 방식이 뒤따른다.

보다 전형적인 양태에서, 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 단일 볼루스가 대상체에게 투여된 다음 답토마이신과 같은 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 통상적인 섭생, 예를 들어, 표준 치료 (SOC) 투여량이 뒤따른다. 또 다른 전형적인 양태에서, 답토마이신과 같은 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제가 대상체에게 투여된 다음 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 단일 볼루스가 투여되고, 이어서 답토마이신과 같은 통상의 투여량의 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 추가 투여량이 투여된다. 훨씬 더 전형적으로, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 단일 MIC-이하 용량이 대상체에게 투여된 다음 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 1회 이상의 용량의 통상적인 섭생이 뒤따른다. 또 다른, 훨씬 더 전형적인 양태에서, 답토마이신과 같은 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제가 통상적인 투여량으로 대상체에게 투여된 다음 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC-이하 투여량으로 단일 볼루스가 투여되고, 이어서 답토마이신과 같은 통상의 투여량의 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 추가 투여량이 투여된다.

또 다른 양태에서, 단일 MIC-이하 용량의 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체가 대상체에게 투여된 다음 답토마이신과 같은 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 1회 이상의 투여량이 투여되며, 여기서, 항생제 용량(들) 또한 MIC-이하 수준으로 투여된다.

또 다른 양태에서, 답토마이신과 같은 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제가 MIC-이하 투여량으로 대상체에게 투여된 다음 MIC-이하 투여량의 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 단일 볼루스가 투여되고, 이어서 답토마이신과 같은 MIC-이하 투여량의 본 개시 내용의 하나 이상의 항생제의 1회 이상의 추가 투여량이 투여된다.

제형

본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 본 출원에 기술된 하나 이상의 항생제와 함께 투여될 수 있다. 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체와 항생제는 각각 단일 약제학적 제형에 포함될 수 있거나 용액, 현탁액, 에멀젼, 흡입성 분말, 에어로졸, 또는 스프레이, 정제, 환제, 펠렛, 캡슐, 액체를 함유하는 캡슐, 분말, 서방출 제형, 좌약, 탐폰 적용 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 로젠지, 트로키, 캔디, 주사제, 츄잉 검, 연고, 도말, 시간-방출 패치, 액체 흡수 와이프, 및 이들의 조합의 형태로 별도로 제형화될 수 있다.

일부 양태에서, 약제학적 제형의 투여는 전신 투여를 포함할 수 있다. 전신 투여는 장내 또는 경구일 수 있고, 즉 물질이 소화관을 통해 제공되고, 비경구일 수 있고, 즉 물질이 주사 또는 흡입과 같은 소화관 이외의 다른 경로로 제공된다. 따라서, 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 하나 이상의 항생제는 경구, 비경구, 흡입, 국소, 직장, 비강, 협측 또는 이식된 저장소를 통해 또는 임의의 다른 공지된 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 하나 이상의 항생제는 또한 서방성 투여 형태에 의해 투여될 수 있다.

경구 투여를 위해, 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 하나 이상의 항생제는 고체 또는 액체 제제, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액 및 분산액으로 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 하나 이상의 항생제는, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 옥수수 전분, 젤라틴, 감자 전분, 알긴산 및/또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 부형제와 함께 제형화될 수 있다.

정제 및 환제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 본 개시 내용의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 하나 이상의 항생제를 약제학적 부형제와 혼합하여 고체 예비-제형 조성물을 형성한다. 원하는 경우, 정제는 표준 기술에 의해 당 코팅되거나 장용 코팅될 수 있다. 정제 또는 환제는 장기간 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공하기 위해 코팅되거나 달리 배합될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 성분과 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자 위에 외피 형태이다. 두 가지 투여 성분은 장내 층에 의해 분리될 수 있으며, 이것은 위에서 붕해되지 않고 내부 성분이 십이지장으로 온전하게 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 역할을 한다. 다수의 중합체 산 및 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질과 중합체 산과의 혼합물을 포함하는 물질과 같은 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시 내용의 약제학적 제형은 흡입성 조성물로서 제형화된다. 일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 제형은 유리하게는 건조, 흡입 가능한 분말로서 제형화된다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 제형은 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 추가로 제형화될 수 있다. 적합한 추진제의 예는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 및 이산화탄소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 형태에서, 제형은 분무될 수 있다.

일부 양태에서, 흡입 가능한 약제학적 제형은 부형제를 포함한다. 적합한 부형제의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 락토스, 전분, 중쇄 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르; 중쇄 지방산, 단쇄 또는 장쇄 또는 이들의 임의의 조합의 트리글리세리드 에스테르; 퍼플루오로디메틸사이클로부탄; 퍼플루오로사이클로부탄; 폴리에틸렌 글리콜; 멘톨; 라우로글리콜; 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르; 중쇄 지방산의 폴리글리콜화 글리세리드; 알콜; 유칼립투스 오일; 단쇄 지방산; 및 이들의 조합.

계면 활성제는 약제와 추진제 사이의 표면 및 계면 장력을 낮추기 위해 본 개시 내용의 흡입 가능한 약제학적 제형에 첨가될 수 있다. 계면 활성제는 본 발명의 폴리펩타이드와 비반응성인 임의의 적합한 무독성 화합물일 수 있다. 적합한 계면 활성제의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 올레산; 소르비탄 트리올레이트; 세틸 피리디늄 클로라이드; 대두 레시틴; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트; 폴리옥시에틸렌 (10) 스테아릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 (2) 올레일 에테르; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에틸렌 디아민 블록 공중합체; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체; 피마자유 에톡실레이트; 및 이들의 조합.

일부 양태에서, 본 개시 내용의 약제학적 제형은 비강 제제를 포함한다. 비강 제형은, 예를 들어, 비강 스프레이, 비강 점적제, 비강 연고, 비강 세척제, 비강 주사제, 비강 패킹, 기관지 스프레이 및 흡입기, 또는 간접적으로 인후 로젠지, 구강 세척제 또는 가글의 사용을 통해, 또는 콧구멍 또는 얼굴에 바르는 연고의 사용을 통해 또는 이들 및 유사한 적용 방법의 조합을 포함한다.

본 개시 내용의 약제학적 제형은 보다 전형적으로 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 약제학적 제형은 그람 양성 세균에 의한 감염, 전형적으로 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA)를 포함하는 스태필로코커스 아우레우스에 의해 유발된 감염성 심내막염을 치료하기 위해 근육내, 척수강내, 피하 (subdermally), 피하 (subcutaneously) 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 증류수, 생리 식염수, 알부민, 혈청, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 추가로, 비경구 주사의 약제학적 제형은 pH 완충 용액, 보조제 (예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제), 리포솜 제형, 나노입자, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 뿐만 아니라 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다.

비경구 주사가 선택된 투여 방식인 경우, 등장성 제형이 전형적으로 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 포스페이트 완충 염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정제는 젤라틴과 알부민을 포함할 수 있다. 혈관수축제가 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 유형의 적용에 따른 약제학적 제제는 무균 및 피로겐 비함유 상태로 제공된다.

본 개시 내용의 약제학적 제형은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고 당해 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 숙주, 감염성 세균에 대한 수용자의 노출 기간, 대상체의 크기 및 체중, 및 특정 투여 방식에 따라 다를 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 각 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 총 양은 활성 성분의 약 1% 내지 약 99%, 전형적으로 약 5% 내지 약 70%, 가장 전형적으로 약 10% 내지 약 30%의 범위일 것이다.

실시예

실시예 1. 감염성 심내막염과 관련된 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 종에 대한 본 개시 내용의 리신의 시험관내 효능.

CF-301 (엑세바카제) 및 비교 항생제, 예를 들어, 답토마이신 및 반코마이신의 시험관내 활성을 본 출원에 기술되고 표 2에 나타낸 바와 같이 감염성 심내막염과 가장 일반적으로 관련된 다양한 세균 종에 대해 평가하였다. 다양한 균주와 분리주는 미국, 유럽 및 아시아의 수집 및 저장소로부터 획득되었다. 균주 및 분리주는 각 공급원에 의해 종 수준에서 확인되었다. 대부분의 분리주는 균혈증 (및 심내막염), 피부 및 연조직 감염, 및 호흡기 감염을 포함한 다양한 감염 유형으로부터 단리되었다. 각 표적 종에 대해 충분한 수의 분리주를 보장하기 위해 다양한 감염 유형이 포함되었다.

스태필로코커스에 대한 엑세바카제의 최소 억제 농도 (MIC)는 말 혈청 (Sigma Aldrich) 및 디티오트레이톨 (DTT, Sigma Aldrich)이 각각 25% 및 0.5mM의 최종 농도로 보충된 양이온-조정된 Mueller Hinton 브로스 (caMHB)로 구성된 비표준 항미생물 감수성 시험 (AST) 배지를 사용하여 브로스 미량희석 (BMD)에 의해 결정되었다. caMHB-HSD라고 하는 이 배지는 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) ((CLSI. 2017, January 16-17. AST Subcommittee Working Group Meetings and Plenary. AST Meeting Files & Resources, clsi.org/education/microbiology/ast/ast-meeting-files-resources/)에 의해 엑세바카제 AST에 사용하도록 승인되었다. CLSI에 의해 권장된 바와 같이, 2.5% 용해된 적혈구를 갖는 추가 보충물 (Remel™, ThermoFisher)이 스트렙토코커스 분리주의 분석을 위해 포함되었다. 문헌 [CLSI, 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA]을 참조한다.

답토마이신 (Sigma Aldrich) 및 반코마이신 염산염 (Sigma Aldrich)을 각각에 대한 참조 BMD 방법에 따라 시험하였다. 문헌 [CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA]을 참조한다.

엑세바카제 활성은 73개의 MSSA 및 74개의 MRSA 분리주 세트를 사용하여 처음 확인되었으며, 이것은 각각 0.5/0.5μg/mL 및 0.5/1μg/mL의 MIC_{50 /90} 값과 0.25-1μg/mL 및 0.5-2μg/mL의 범위를 입증하였다 (표 3). 다음으로 스태필로코커스 에피데르미디스 ( S. epidermidis ) (MIC_{50 /90} = 0.5/0.5μg/mL), 스태필로코커스 루그두넨시스 ( S. lugdunensis ) (MIC_{50 /90} = 1/1μg/mL), 스태필로코커스 헤몰리티쿠스 ( S. haemolyticus ) (MIC_{50 /90} = 0.5/1μg/mL), 스태필로코커스 카피티스 ( S. capitis) (MIC_50/90 = 1/2μg/mL) 및 스태필로코커스 와르네리 (S. warneri) (MIC_{50 /90} = 0.5/1 μg/mL)를 포함하여 각각의 코아귤라아제 음성 스타킬로코커스 종에 대해 유사한 수준의 활성이 관찰되었다. IE와 거의 관련이 없는 스태필로코커스 호미누스 (S. hominus)를 시험하였으며 (n=2개 균주) 0.125μg/mL 및 0.25μg/mL의 엑세바카제 MIC 값을 입증하였다 (데이터는 표시되지 않음). 스태필로코커스 슈딘테르메디우스 ( S. pseudintermedius) (MIC = 0.25μg/mL, 각각 n=6개 분리주), 스태필로코커스 시우리 (S. sciuri ) (MIC = 2μg/mL, n=3개 분리주), 스태필로코커스 시물란스 ( S. simulans) (MIC = 0.125μg/mL, n=1개 분리주) 및 스태필로코커스 하이쿠스 (S. hyicus) (MIC = 0.25μg/mL, n=1개 분리주)를 포함한 다른 스태필로코커스 종을 또한 시험하였다. 답토마이신 및 반코마이신에 대한 MIC는 시험된 모든 스태필로코커스에 대해 각각 0.125-2μg/mL 및 0.5-4μg/mL 범위인 것으로 관찰되었으며 예상 범위와 일치하였다. 문헌 [Sader et al., 2019, J. Antimicrob . Chemother. doi:10.1093/jac/dkz006 and Pfaller et al., 2018, Int . J. Antimicrob . Agents. 51:608-611]을 참조한다.

스트렙토코코커스 뉴모니에 ( S. pneumoniae ) 및 엔테로코커스 패칼리스 ( E. faecalis) (이전에는 그룹 D 스트렙토코커스) 이외에 시험된 비리던스 스트렙토코커스의 대부분은 8 내지 512μg/mL 이상으로 높은 범위의 MIC 값과 엑세바카제에 대해 매우 가변적이고 낮은 수준의 감수성을 나타내었다 (표 4). 주목할 만한 예외는 각각 0.06-0.5μg/mL, 0.5-4μg/mL, 0.25-4μg/mL, 및 1-2μg/mL의 MIC를 갖는 스트렙토코커스 인터메디우스 ( S. intermedius ), 스트렙토코커스 피오게네스 ( S. pyogenes ) (란스필드 그룹 A), 스트렙토코코커스 아갈락티에 ( S. agalactiae) (란스필드 그룹 B) 및 스트렙토코커스 디스갈락티에 (S. dysgalactiae) (란스필드 그룹 G)를 포함하였다. 주로 아급성 IE를 유발하는 다수의 비리던스 스트렙토코커스 및 엔테로코커스 패칼리스와는 달리, 스트렙토코커스 인터메디우스 (비리던스 그룹 종) 및 스트렙토코코커스 아갈락티에와 스트렙토코코커스 디스갈락티에는 모두 스태필로코커스에 의해 유발되고 심내막의 빠른 파괴를 초래하는 것으로 당해 분야에 공지된 보다 공격적인 급성 질환과 관련이 있다.

전반적으로, 본 출원에 제시된 데이터는 급성 IE와 관련된 것들을 포함하여 모든 스태필로코커스 종 및 스트렙토코커스의 하위세트에 대한 엑세바카제의 강력한 시험관내 활성을 입증하였다. 이러한 발견은 스태필로코커스 IE 감염의 발생률이 증가하고 비리던스 그룹 스트렙토코커스와 관련된 감염의 발생률이 감소하는 것을 고려할 때 특히, 유의하다.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

실시예 2. 감염성 심내막염 토끼 모델에서 답토마이신과 연속으로 CF-301 투여의 효과.

재료 및 방법

고전적인 스태필로코커스 아우레우스 "생물막" 감염 모델에 대한 PlySs2 (CF-301)의 생체내 효능은 사람 치료 용량 (HTD)-등가 미만의 답토마이신 용량의 존재하에서 평가하였다. 답토마이신 용량 선택의 근거는 다음과 같다. 답토마이신 파일럿 용량-반응 실험은 MRSA 균주, MW2에 의해 유발된 하기에 기술된 감염성 심내막염 토끼 모델에서 1mg/kg 내지 10mg/kg 범위에 걸쳐 4일 동안 1일 1회 정맥내 투여하여 수행하였다. 도 2는 치료 섭생 대 log₁₀ CFU/조직 g으로 플롯팅된 개별 동물에 대한 데이터를 도시한다 (평균 ± SEM이 표시됨). 이러한 연구로부터, 답토마이신 용량-반응이 정의되었다. HTD 당량 미만의 용량인 4mg/kg의 답토마이신을 선택하여 답토마이신에 추가하여 CF-301 요법의 상승 효과를 탐구하였다. 토끼 감염성 심내막염 모델에서, 정맥내 투여된 4mg/kg의 답토마이신-단독 용량은 비히클-처리된 대조군과 비교하여 세균 부하의 약 0.25 내지 1.45 log₁₀ 감소를 제공하였다. 처리된 동물은 여전히 약 5 내지 7 log₁₀의 부하를 가지고 있어, 이러한 치료 섭생에서 CF-301의 잠재적인 추가 효과를 관찰하기 위한 동적 범위를 제공한다.

대동맥 판막 감염성 심내막염의 잘 설명된 유치 경동맥-좌심실 카테터-유도된 모델이 토끼에서 사용되었다. 문헌 [Xiong et al., 2011, AAC, 55:P5325-5330]을 참조한다. 카테터 배치 후 48시간에, 감염성 심내막염을 약 2 x10⁵ CFU의 정맥내 접종물에 의해 유도하였다 (이 모델에서 MRSA 균주 MW2의 ID95의 유도). 감염 후 24시간에, 동물을 7개 그룹으로 무작위 배정하였다: i) 완충제 대조군; 또는 ii)-iv) 답토마이신 투여 1 또는 4시간 전 대 답토마이신 투여 직후 또는 답토마이신 투여 (4mg/kg 정맥내) 2 또는 4시간 후에 단일 정맥내 용량 (5 내지 10분 주입)으로 투여된 CF-301 (0.09mg/kg의 MIC-이하 용량). 답토마이신 투여는 4일 동안 1일 1회 계속하였다. 답토마이신의 마지막 용량 후 24시간에, 동물을 인도적으로 안락사시키고 심장 우종 (cardiac vegetation), 신장 및 비장을 무균적으로 제거하고 정량적으로 배양하였다. 다른 처리 그룹에 대한 각 기관의 세균 밀도는 평균 log₁₀ CFU/조직 g으로 계산되었다 (±95% 신뢰 구간).

결과

시험된 모든 시점 (답토마이신 처리 시작 전 또는 후)에서 단일 용량의 CF-301을 답토마이신 섭생에 추가하면 대조군 및 답토마이신 단독과 비교하여 3개의 표적 조직 모두에서 MRSA 밀도가 유의하게 감소하였다 (도 3 및 표 3). CF-301과 답토마이신의 조합으로 처리된 임의의 그룹에 대해 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (표 4).

[표 3]

[표 4]

이러한 결과는 다양한 시점에서 (답토마이신 전 대 답토마이신과 동일한 시간 및 답토마이신 투여후 최대 4시간까지) 답토마이신에 단일 용량의 CF-301을 추가하는 것이 이 실험에서 모든 관련 표적 조직 내에서 MRSA 밀도를 유의하게 감소시켰음을 입증한다. 놀랍게도, 이러한 결과는 CF-301과 답토마이신의 공동 투여가 생체내 생물막 환경의 맥락에서 MRSA를 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이러한 데이터는 또한 답토마이신과 같은 종래의 항-스태필로코커스 항생제의 투여에 비해 CF-301의 최적의 효과적인 투여를 위한 비교적 넓은 시간-창이 있음을 시사한다.

실시예 3. 성인에서 심내막염을 포함한 스태필로코커스 아우레우스 균혈증의 치료를 위한 CF-301 및 배경 표준 치료 (SOC) 항균 요법.

재료 및 방법

스태필로코커스 아우레우스 균혈증/심내막염이 확인된 71명의 환자는 배경 SOC 항균 요법, 예를 들어, 정맥내 반코마이신 또는 답토마이신 (6주 동안 1일 1회 정맥내 kg당 6mg)에 더하여 2시간 동안 CF-301의 단일 주입 (CF-301 치료 그룹)을 제공받고 스태필로코커스 아우레우스 균혈증/심내막염이 확인된 45명의 환자는 표준 치료 항생제만을 제공받았다 (위약 그룹). 이들 116명의 환자가 2상 임상 연구의 mITT (microbiological intent to treat; 미생물학적 치료 의도) 집단을 구성하였으며 1차 효능 분석 집단이었다. 1차 효능 종점은 14일째의 임상 반응자 비율 (CRR)이었다. 진단 및 임상 결과는 맹검 판정 위원회에 의해 결정되었다.

결과

평균 환자는 백인 남성이었고 대략 56세 (67.8%)였다. CF-301-치료된 환자의 총 38.8%와 위약 환자의 35.5%가 각각 MRSA 감염을 가졌다. 두 치료 그룹의 대부분의 환자는 균혈증을 가졌다 (치료 그룹의 77.5%, 위약 그룹의 86.7%); 그러나, 치료 그룹 사이에 좌측 심내막염을 갖는 환자의 분포가 불균등하였다. 위약 환자의 6.7%에 비해 CF-301-치료된 환자의 총 15.5%가 좌측 심내막염을 가졌다. CRR은 CF-301 치료 그룹의 경우 70.4%, 위약 그룹의 경우 60%였다 (p=0.314).

MRSA-감염 환자 간의 사전 지정된 분석에서, CF-301 및 표준 치료 항생제로 치료된 그룹의 CRR은 표준 치료 항생제 단독으로 치료된 환자의 CRR보다 약 40% 더 높았다 (74.1% vs 31.3%; p=0.01). 균혈증/우측 심내막염을 가진 하위세트의 CRR은 CF-301 치료 그룹과 위약 그룹에서 각각 80% 및 59.5%였다 (p=0.028). 균혈증만을 가진 환자에서, CRR은 CF-301 치료 그룹과 위약 그룹에서 각각 81.8% 및 61.5%였다 (p=0.035). CF-301을 제공받은 환자들 중에서, 일시적 이상 반응 (TEAE)의 발생률은 중대한 TEAE (치료 그룹의 47.2% 및 위약 그룹의 51.1%)와 마찬가지로 그룹 간에 균형을 이뤘다 (치료 그룹의 88.9% 및 위약 그룹의 85.1%). 치료 그룹의 19.4% 및 위약 그룹의 14.9%가 연구 약물 투여로부터 표준 치료 항생제 치료 종료 후 28일까지의 기간 동안 사망하였다. CF-301에 대한 과민증의 보고는 없었고 치료 그룹에서 연구 약물을 중단한 환자도 없었다.

이 실시예의 결과는 표준 치료 항생제 치료 동안 CF-301의 단일 용량을 추가하는 것이 심내막염을 포함한 MRSA 균혈증의 치료를 위해 항생제 단독에 비해 반응자 비율의 임상적으로 의미있는 개선을 제공한다는 것을 입증한다. 또한, 표준 치료 항생제 섭생에 CF-301을 추가하는 것은 내약성이 우수하였다.

본 개시 내용은 본 출원에 기술된 특정 실시 형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 출원에 기술된 것에 더하여 그 안에서 사용된 방법 및 구성요소의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당해 분야의 통상의 기술자들에게 명백해질 것이다.

본 출원에 인용된 모든 특허, 출원, 공보, 시험 방법, 문헌 및 기타 자료는 본 출원에 참고로 포함된다.

실시예 4. MRSA로 인한 실험적 감염성 심내막염 ( IE ) 모델에서 DAP에 추가한 CF-301의 용량-투여의 영향.

재료 및 방법

토끼에서 MRSA로 인한 좌측 카테터-유도 IE의 모델 (Li et al. The Journal of infectious diseases 2018, 218, 1367-1377)을 사용하여 CF-301 및 DAP 단독, 및 DAP와 조합된 CF-301의 효능을 실험하였다. 이 실시예에서 사용되는 MRSA 균주는 MW2였다 (CA-MRSA; USA400; MIC (μg/ml) - DAP (0.5) CF-301 (1.0), 참조; Indiani et al. Antimicrob . Agents Chemother . 2019, 63 doi:10.1128/AAC.02291-18 and Schuch et al. The Journal of infectious diseases 2014, 209, 1469-1478).

간단히 말해서, 암컷 뉴질랜드 흰 토끼 (Harlan Laboratories; 2.3 내지 2.5kg 체중)는 경동맥-경대동맥 판막 카테터 삽입술을 받았고, 카테터 삽입 후 48시간 (h)에 ~1-2 x10⁵ cfu의 MW2의 IV 감염에 의해 IE가 유도되었다. 감염 후 24시간에, 동물을 15개 그룹 중 하나로 무작위 배정하였다: 1) 대조군; 2) 1일 1회 (QD) 제공되는 비히클 대조군; 3-15) DAP 단독 (4mg/kg iv QD x 4일; 이 용량은 실험적 IE에서 유의하지만 적당한 MRSA 제거를 야기함); DAP + CF-301 (DAP 치료 첫날 다음의 (mg/kg)에서 단지 5 내지 10분 완속 볼루스에 의해 IV 용량으로 제공됨: 0.70 QD, 0.35 Q12, 0.23 Q8h, 0.35 QD, 0.175 Q12h, 0.117 Q8h, 0.09 QD, 0.045 Q12h, 0.03 Q8h, 0.06 QD, 0.03 Q12h 또는 0.03 QD). 도 4를 참조한다.

5일째에, 동물을 희생시키고, 표적 조직 (심장 우종, 신장 및 비장)을 제거하고 정량적으로 배양하였다. 조직 MRSA 수는 평균 log₁₀ CFU/조직 g ± SD)로 제공된다.

양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 상이한 그룹 간의 조직 MRSA 수를 분석하였다. P 값 < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 이 연구에서 보고된 모든 P 값에 대해 조정이 이루어지지 않았다.

결과

DAP 단독으로의 처리는 비히클 대조군에 비해 3개의 표적 조직 모두에서 MRSA 밀도의 약 2-3 log₁₀ cfu/g 감소를 야기하였다. DAP에 추가하여 제공된 모든 CF-301 용량은, 가장 낮은 CF-301 용량 (0.03mg/kg)에서도, DAP 단독 (약 3 log₁₀ cfu/g) 및 비히클 대조군 (약 6 log₁₀ cfu/g)에 비해 모든 표적 조직에서 MRSA 밀도를 유의하게 더욱 감소시켰다. 도 5a-5d 및 표 5. 일반적으로, 단일 용량 ("SD")으로 제공된 DAP + CF-301은, 놀랍게도, Q12h 또는 Q8h에 제공된 CF-301보다 미생물학적 효능이 더 양호한 경향이 있었지만, 이 차이가 통계적으로 유의하지는 않았다.

이러한 결과는 준치사 DAP에 추가하여 다중 용량 전략으로 및 상이한 용량-섭생으로 제공된 CF-301이 (DAP 단독 및 비처리 대조군에 비해) IE 모델에서 관련 표적 조직에서 MRSA 밀도를 추가로 감소시키는데 유의한 효능을 가졌음을 입증한다. DAP + 단일 용량의 CF-301은 분할 용량 전략으로 투여되었을 때보다 효능이 더 양호한 경향이 있었다.

[표 5]

실시예 5 - 심내막염을 포함한 스태필로코커스 아우레우스 ( S. 아우레우스 ) 혈류 감염 ( 균혈증 )을 갖는 성인 환자에 대한 최적 용량 결정을 위한 CF-31의 목표 달성

CF-01의 최적 용량에 대한 목표 달성 (TA) 시뮬레이션을 결정하기 위해 스태필로코커스 아우레우스 균혈증 감염을 나타내는 72명의 사람 환자로부터의 데이터로 집단 약동학 (PPK) 모델을 개발하였다. 환자들은 표준 치료 항생제와 함께 CF-301을 투여받았다. CF-301은 투석 중인 환자를 포함하여 크레아틴 청소율이 60mL/분 미만인 환자에 대해 0.25mg/kg 또는 0.12mg/kg의 단일 2시간 주입으로 투여되었다. PPK 모델은 아래에 기술된 바와 같이 다양한 정맥내 주입 섭생의 TA 시뮬레이션에 사용되었다.

데이터에 가장 잘 맞는 3-구획 모델이 결정되었고 매개변수가 잘 추정되었다. 청소율은 4.2리터 (L)/시간 (hr)이고 상대 표준 오차 (RSE)는 5.5%였으며, 중심 구획 (V_c)은 4.5L이고 RSE는 8.2%였다. 총 체적 분포는 20.2리터였다. 값은 건강한 대상체에서 이전에 추정된 것, CL=7.1L/hr 및 체적 분포 (V_d) 27.7L보다 낮았다. 크레아틴 청소율은 임상적으로 의미있는 공변량이었다. 중등도 및 중증 신장애를 가진 환자는 정상적인 신장 기능을 가진 환자보다 1.3 내지 2배 더 높은 AUC_{0 -24} 또는 C_max를 갖는 것으로 예상된다. 연령은 말초 청소율에 대해 통계적으로 유의했지만 임상적으로 의미있지는 않았다 (AUC_{0 -24} 또는 C_max에 대해 4% 미만 효과).

TA 시뮬레이션은 다양한 고정 용량 및 체중-기반 용량에 걸쳐 수행된 신장 기능에 의해 계층화되었다. 정상적인 신장 기능 또는 경미한 장애를 가진 환자에서, 18mg의 용량을 2시간 IV 주입하면 각각 1254ng/ml 및 3026ng*hr/mL의 C_max 및 AUC_{0 -24}가 야기된다. 혈액 투석을 포함한 말기 신장 질환 (ESRD) 환자에게 8mg의 용량을 2시간 IV 주입하면 각각 910ng/mL 및 3109ng*hr/mL의 C_max 및 AUC_{0 -24}가 야기된다. 이러한 노출은 >99% 대상체를 동물에서 확립된 AUC/MIC > 0.2의 예상 유효 역치 이상으로 배치한다.

PPK 모델은 환자에서 CF-301의 PK를 적절하게 설명하였다. CL 및 V_d는 건강한 대상체에서보다 각각 40% 및 17% 낮은 것으로 추정되었다. CrCl은 용량 조정을 필요로 하는 유일한 임상적으로 의미있는 공변량인 것으로 결정되었다. TA 평가는 최소 효능을 달성하는 용량을 확인하였다.

<110> CONTRAFECT CORPORATION <120> METHOD OF TREATING AND PREVENTING INFECTIVE ENDOCARDITIS <130> 0341.0124-00-304 <150> 62822386 <151> 2019-03-22 <150> 62832708 <151> 2019-04-11 <150> 62849093 <151> 2019-05-16 <150> 62898379 <151> 2019-09-10 <150> 62965720 <151> 2020-01-24 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 738 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 1 atgacaacag taaatgaagc attaaataat gtaagagctc aggttgggtc cggtgtgtct 60 gttggcaacg gcgaatgcta cgctttggct agttggtacg agcgcatgat tagtccggat 120 gcaactgtcg gacttggcgc tggtgtgggc tgggtcagcg gtgcaatcgg cgatacaatc 180 tctgccaaaa acatcggctc atcatacaac tggcaagcta acggctggac agtttccaca 240 tctggtccat ttaaagcagg tcagattgtg acgcttgggg caacaccagg aaacccttac 300 ggacatgtgg taatcgtcga agcagtggac ggcgatagat tgactatttt ggagcaaaac 360 tacggcggga aacgttatcc cgtccgtaat tattacagcg ctgcaagcta tcgtcaacag 420 gtcgtgcatt acatcacacc gcctggcacg gtcgcacagt cagcacccaa ccttgcaggc 480 tctcgttcct atcgcgagac gggcactatg actgtcacgg tcgatgctct caatgttcgc 540 agggggccaa atacttcagg cgagattgta gcagtataca agcgtggtga atcatttgac 600 tatgatactg tcatcatcga tgtcaatggc tatgtctggg tgtcttacat aggcggcagc 660 ggcaaacgta actacgttgc gacgggcgct accaaagacg gtaagcgttt cggcaatgct 720 tggggtacat ttaaataa 738 <210> 2 <211> 245 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 2 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 4 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu His Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Glu Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 5 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Gln Phe Asp Tyr Asp Thr Ala Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Ala Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 6 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asp Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Gln Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 7 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asp Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 8 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Asn Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Glu Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 9 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asp Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu His Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 10 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asp Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Ala Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Ala Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 11 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Asn Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asp Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Glu Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Glu Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 12 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Glu Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 13 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 14 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 15 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Lys Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Glu Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 16 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asp Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Gln Phe Asp Tyr Asp Thr Lys Ile Ile Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Glu Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 17 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Trp Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Ser Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Thr 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Arg Gln Gln Val Val His Tyr 130 135 140 Ile Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Arg Ser Lys Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val 180 185 190 Tyr Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Glu Asp Val 195 200 205 Asn Gly Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn 210 215 220 Tyr Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala 225 230 235 240 Trp Gly Thr Phe Lys 245 <210> 18 <211> 244 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 18 Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly Ser 1 5 10 15 Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp Tyr 20 25 30 Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly Val 35 40 45 Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn Ile 50 55 60 Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr Ser 65 70 75 80 Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro Gly 85 90 95 Asn Pro Tyr Gly His Val Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp Arg 100 105 110 Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val Arg 115 120 125 Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val His Tyr Ile 130 135 140 Thr Pro Pro Gly Thr Val Ala Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ala Gly Ser 145 150 155 160 Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala Leu 165 170 175 Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val Tyr 180 185 190 Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val Asn 195 200 205 Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn Tyr 210 215 220 Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Asp Gly Lys Arg Phe Gly Asn Ala Trp 225 230 235 240 Gly Thr Phe Lys <210> 19 <211> 139 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 19 Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly Ser Gly Val Ser Val Gly Asn 1 5 10 15 Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro 20 25 30 Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly Val Gly Trp Val Ser Gly Ala 35 40 45 Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp 50 55 60 Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro Gly Asn Pro Tyr Gly His Val 85 90 95 Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln 100 105 110 Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala 115 120 125 Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val His Tyr Ile Thr 130 135 <210> 20 <211> 67 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 20 Arg Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Thr Met Thr Val Thr Val Asp Ala Leu 1 5 10 15 Asn Val Arg Arg Ala Pro Asn Thr Ser Gly Glu Ile Val Ala Val Tyr 20 25 30 Lys Arg Gly Glu Ser Phe Asp Tyr Asp Thr Val Ile Ile Asp Val Asn 35 40 45 Gly Tyr Val Trp Val Ser Tyr Ile Gly Gly Ser Gly Lys Arg Asn Tyr 50 55 60 Val Ala Thr 65 <210> 21 <211> 150 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 21 Asn Leu Ala Asn Ala Gln Ala Gln Val Gly Lys Tyr Ile Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Cys Tyr Ala Trp Val Gly Trp Trp Ser Ala Arg Val Cys Gly Tyr 20 25 30 Ser Ile Ser Tyr Ser Thr Gly Asp Pro Met Leu Pro Leu Ile Gly Asp 35 40 45 Gly Met Asn Ala His Ser Ile His Leu Gly Trp Asp Trp Ser Ile Ala 50 55 60 Asn Thr Gly Ile Val Asn Tyr Pro Val Gly Thr Val Gly Arg Lys Glu 65 70 75 80 Asp Leu Arg Val Gly Ala Ile Trp Cys Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala 85 90 95 Pro Phe Tyr Thr Gly Gln Tyr Gly His Thr Gly Ile Ile Glu Ser Trp 100 105 110 Ser Asp Thr Thr Val Thr Val Leu Glu Gln Asn Ile Leu Gly Ser Pro 115 120 125 Val Ile Arg Ser Thr Tyr Asp Leu Asn Thr Phe Leu Ser Thr Leu Thr 130 135 140 Gly Leu Ile Thr Phe Lys 145 150

Claims (43)

1. 대상체에서 그람 양성 세균으로 인한 감염성 심내막염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이
   하나 이상의 항생제, 및 서열 번호 18 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 PlySs2 리신 또는 서열 번호 2와 적어도 80% 동일성을 갖는 이의 변이체의 조합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 변이체가 상기 그람 양성 세균에 대해 항균 및/또는 정균 활성을 포함하며, 상기 하나 이상의 항생제 및 상기 PlySs2 리신이 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체가 최소 억제 농도 (minimal inhibitory concentration: MIC) 용량 미만의 용량으로 투여되는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 MIC 용량 미만의 용량으로 투여되는, 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 및/또는 이의 변이체 및 상기 하나 이상의 항생제가 최소 억제 농도 (MIC) 용량 미만의 용량으로 투여되는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체가 단일 용량으로 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 베타-락탐, 아미노글리코사이드, 글리코펩타이드, 옥사졸리디논, 리포펩타이드 및 설폰아미드 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 글리코펩타이드, 리포펩타이드, 옥사졸리디논 및 베타-락탐 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제의 활성이 상기 PlySs2 리신의 존재에 의해 상승 작용적으로 증진되는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 PlySs2 리신이 서열 번호 3 내지 17 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 PlySs2 리신이 서열 번호 2의 폴리펩타이드와 적어도 80% 동일성을 갖고 상기 하나 이상의 항생제의 존재하에 그람 양성 세균에 대한 정균 활성을 포함하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 항생제 내성 그람 양성 세균인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 심내막염이 우측 심내막염인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 심내막염이 인공 판막 심내막염인, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 상기 하나 이상의 항생제를 1일 당 복수회 용량으로 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 그람 양성 세균의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 정맥내 약물 사용자인, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 감염성 심내막염이 생물막을 포함하는, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 글리코펩타이드이고, 여기서, 상기 글리코펩타이드가 반코마이신인, 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 베타-락탐이고, 여기서, 상기 베타-락탐이 페니실린인, 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 페니실린이고, 여기서, 상기 페니실린이 옥사실린인, 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 지단백질이고, 여기서, 상기 지단백질이 답토마이신인, 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 옥사졸리디논이고, 여기서, 상기 옥사졸리디논이 리네졸리드인, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스태필로코커스 (Staphylococcus) 세균을 포함하는, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 코아귤라아제 음성 스태필로코커스 (coagulase-negative Staphylococcus: CoNS)를 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 CoNS가 스태필로코커스 에피데르미디스 ( Staphylococcus epidermidis ), 스태필로코커스 루그두넨시스 ( Staphylococcus lugdunensis), 스태필로코커스 헤몰리티쿠스 ( Staphylococcus haemolyticus ), 스태필로코커스 카피티스 ( Staphylococcus capitis ), 스태필로코커스 호미누스 ( Staphylococcus hominus ) 및 스태필로코커스 와르네리 ( Staphylococcus warneri ) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 메티실린 민감성 스태필로코커스 아우레우스 (Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus: MSSA), 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: MRSA), 스태필로코커스 슈딘테르메디우스 ( Staphylococcus pseudintermedius ), 스태필로코커스 시우리 (Staphylococcus sciuri ), 스태필로코커스 시물란스 ( Staphylococcus simulans ) 및 스태필로코커스 하이쿠스 (Staphylococcus hyicus ) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
28. 제1항 내지 제24항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는, 방법.
29. 제1항 내지 제24항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는, 방법.
30. 제1항 내지 제24항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 메티실린 민감성 스태필로코커스 아우레우스를 포함하는, 방법.
31. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스태필로코커스 헤몰리티쿠스를 포함하는, 방법.
32. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스태필로코커스 와르네리를 포함하는, 방법.
33. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스트렙토코코커스 (Streptocococcus) 세균을 포함하는, 방법.
34. 제1항 내지 제23항 및 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스트렙토코코커스 고르도니이 (Streptocococcus gordonii ), 스트렙토코코 커스 미티스 (Streptocococcus mitis ), 스트렙토코코커스 오랄리스 (Streptocococcus oralis), 스트렙토코코커스 인터메디우스 (Streptocococcus intermedius ), 스트렙토코코커스 살리바리우스 (Streptocococcus salivarius ), 스트렙토코코커스 피오게네스 ( Streptocococcus pyogenes ), 스트렙토코코커스 아갈락티에 (Streptocococcus agalactiae), 스트렙토코코커스 디스갈락티에 (Streptocococcus dysgalactiae ), 스트렙토코코커스 뉴모니에 (Streptocococcus pneumoniae ) 및 스트렙토코코커스 상귀니스 ( Streptocococcus sanguinis) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
35. 제1항 내지 제23항, 제33항 및 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 스트렙토코코커스 인터메디우스, 스트렙토코코커스 피오게네스 (란스필드 그룹 A), 스트렙토코코커스 아갈락티에 (란스필드 그룹 B) 및 스트렙토코코커스 디스갈락티에 (란스필드 그룹 G) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
36. 제1항 내지 제28항 또는 제31항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 항생제 내성 그람 양성 세균인, 방법.
37. 제1항 내지 제28항 또는 제31항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 세균이 항생제 민감성 그람 양성 세균인, 방법.
38. 제1항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 단일 용량의 용량 분획으로 대상체에게 투여되는, 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 각 용량 분획이 하루 동안 8 시간마다 투여되는, 방법.
40. 제38항에 있어서, 상기 각 용량 분획이 하루 동안 12 시간마다 투여되는, 방법.
41. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 항생제 치료를 받고 있거나 받은 적이 있고, 여기서, 상기 치료가 서열 번호 18 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 PlySs2 리신 또는 이의 변이체를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 또는 이의 변이체가 단일 용량으로 정맥내 투여되는, 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 투약량이 0.1 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg 범위인, 방법.

Images