CN114025782A

CN114025782A - 治疗感染性心内膜炎的方法

Info

Publication number: CN114025782A
Application number: CN202080037982.5A
Authority: CN
Inventors: R·舒赫
Original assignee: Contrafect Corp
Current assignee: Contrafect Corp
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2022-02-08
Also published as: EP3941504A4; KR20210141667A; AU2020244764A1; EP3941504A1; JP2022525914A; US20220160842A1; BR112021018219A2; MX2021011469A; IL286389A; CA3134154A1; WO2020198073A1

Abstract

本公开涉及一种治疗或预防由革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌)引起的感染性心内膜炎的方法，所述方法包括施用治疗有效量的一种或多种抗生素(任选地以亚最小抑制浓度(MIC)水平)和PlySs2溶素(比如以亚MIC水平的单剂量的PlySs2溶素)的组合，其中所述一种或多种抗生素和所述PlySs2溶素以任何顺序同时或依次施用于对其有需要的受试者。

Description

治疗感染性心内膜炎的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,386、2019年4月11日提交的美国临时专利申请号62/832,708、2019年5月16日提交的美国临时专利申请号62/849,093、2019年9月10日提交的美国临时专利申请号62/898,379和2020年1月24日提交的美国临时专利申请号62/965,720的权益并依赖于它们的申请日，它们中的每一个的全部公开内容通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过引用整体并入本文。2020年3月20日创建的所述ASCII副本被命名为0341_0005-00-304_SL.txt，并且大小为42,690字节。

技术领域

本公开总体上涉及连续使用溶素和一种或多种抗生素治疗和预防由革兰氏阳性菌引起的感染性心内膜炎，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌，比如甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。

背景技术

感染性心内膜炎是心内膜，即衬在心室内部并形成瓣膜表面的薄而光滑的内皮膜的感染。这种疾病通常是由细菌进入血流且随后在心脏中定居而引起的。虽然健康心肌的内皮内衬和心脏瓣膜通常对细菌感染具有抗性，但受损的内皮内衬常常与血小板-纤维蛋白血栓的形成有关，血小板-纤维蛋白血栓充当细菌粘附和定植的位点，导致含有纤维蛋白、血小板、白细胞、红细胞碎片和高浓度细菌的营养生长。

因为引起感染性心内膜炎的最常见病原体是革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌)，细胞壁抑制剂(比如β-内酰胺抗生素和万古霉素)常常与比如协同剂量的庆大霉素组合，以增强细菌的灭杀。然而，大多数病原体产生在细胞外基质中含有细菌的生物膜，许多抗生素不能有效地穿透该细胞外基质。因此，在延长的时间段内通常需要升高的抗生素血浆浓度，以得到有效的抗生素浓度。不幸的是，副作用(特别是肾毒性)，可限制抗生素在感染性心内膜炎治疗中的应用。此外，即使当耐受强化药物疗法时，根除感染常常仍然是困难的，需要手术。

鉴于与感染性心内膜炎相关的高死亡率(6个月内22-27％)，需要新的策略来治疗该疾病。这些策略应包括能够破坏生物膜结构和/或减少长期对高水平抗生素的需求的药物和/或生物制剂。

发明内容

本公开涉及一种治疗或预防受试者中由革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌，包括甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA))引起的感染性心内膜炎的方法，所述方法包括：施用治疗有效量的一种或多种抗生素和包含SEQ ID NO: 2或其与SEQ ID NO: 2具有至少80％同一性的变体的PlySs2溶素的组合，其中所述一种或多种抗生素和PlySs2溶素以任何顺序连续施用于对其有需要的受试者。

附图说明

图1描绘了溶素的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和编码溶素的多核苷酸(SEQ ID NO:1)，如具体实施方式中所述。SEQ ID NO:2代表245个氨基酸的多肽，其是基于DNA序列预测的氨基酸序列。预测的氨基酸序列包括起始甲硫氨酸残基，其在翻译后加工期间被除去，留下244个氨基酸的多肽。

图2描绘了如实施例中所述的对心脏瓣膜、肾脏和脾脏中细菌负荷的达托霉素剂量反应。

图3描绘了如实施例所述，相对于达托霉素，在不同时间用本公开的溶素治疗后靶组织中的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)密度。

图4描绘了如实施例中描述的不同达托霉素和溶素剂量施用策略。

图5A-5D描绘了如实施例中描述的，除达托霉素之外，还采用不同溶素给药策略的心脏(心脏瓣膜)赘生物中的细菌负荷。给药量如下：0.7 mg/kg的CF-301剂量部分加达托霉素(图5A)、0.35 mg/kg的CF-301剂量部分加达托霉素(图5B)、0.09 mg/kg的CF-301剂量部分加达托霉素(图5C)和0.06 mg/kg的CF-301剂量部分加达托霉素(图5D)。

图6是如具体实施方式中描述的PlySs2 (SEQ ID NO: 2) 和PlyC (SEQ ID NO:21)的CHAP结构域之间的比对。

具体实施方式

定义

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则以下术语及其同源词应具有以下含义：

“载体”是指与活性化合物一起施用的溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。这样的载体可以是无菌液体(比如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液)和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油(比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。

“药学上可接受的载体”是指生理学上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。载体必须在以药物中通常使用的量对将被治疗的受试者无害的意义上是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其它成分相容，不会使组合物不适于其预期目的。此外，药学上可接受的载体适用于如本文提供的受试者而没有过度的不良副作用(比如毒性、刺激和过敏反应)。当副作用的风险超过由组合物提供的益处时，它们是“过度的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体，比如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液(比如油/水乳液和微乳液)。合适的药物载体描述在例如E.W. Martin第18版的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。药学上可接受的载体可以是天然不存在的载体。

“杀菌的”或“杀菌活性”是指在18-24小时期间在初始细菌群体中，引起细菌死亡或能够杀死细菌至至少3-log10 (99.9%)或更好减少的程度的性质。

“抑菌的”或“抑菌活性”是指抑制细菌生长的性质，包括抑制正在生长的细菌细胞，因此在18-24小时期间在初始细菌群体中引起2-log10 (99%)或更好且直到刚好低于3-log的减少。

“抗菌剂”是指抑菌剂和杀菌剂。

“抗生素”是指具有对细菌具有负面影响的性质的化合物，比如致死或减少生长。抗生素可对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或两者具有负面影响。例如，抗生素可影响细菌中的细胞壁肽聚糖生物合成、细胞膜完整性或DNA或蛋白合成。

“抗药性”一般是指对药物的抗菌活性具有抗性的细菌。当以某些方式使用时，抗药性可具体指抗生素抗药性。在一些情况下，一般对特定抗生素敏感的细菌可发展对抗生素的抗性，从而变成抗药性微生物或菌株。“多重抗药性”(“MDR”)病原体是发展了对各自用作单一疗法的至少两类抗微生物药物的抗性的病原体。例如，已发现金黄色葡萄球菌的某些菌株对若干种抗生素(包括甲氧西林和/或万古霉素)具有抗药性(AntibioticResistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health andServices, Centers for Disease Control and Prevention)。本领域技术人员可以使用测定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术容易地确定细菌是否是抗药的。

“有效量”是指当以适当的频率或给药方案施加或施用时，足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷或预防、减少或改善所治疗的病症(此处为革兰氏阳性菌病原体生长或感染)的发作、严重性、持续时间或进程，预防所治疗的病症的进展，引起所治疗的病症的消退，或增强或改进另一疗法(比如抗生素或抑菌疗法)的预防或治疗效果的量。

“共施用”是指以顺序方式施用两种药剂(比如溶素和抗生素或任何其它抗菌剂)以及以基本上同时的方式施用这些药剂，比如以单一混合物/组合物，或以分开给予的剂量但仍然基本上同时施用于受试者，例如在同一天或24小时期间的不同时间。两种药剂(比如溶素与一种或多种另外的抗菌剂)的这种共施用，可以作为持续多至数天、数周或数月的连续治疗提供。此外，根据用途，共施用不需要是连续的或共同延伸的。例如，如果用途是作为全身性抗菌剂来治疗比如细菌性溃疡或受感染的糖尿病性溃疡，则溶素可以仅在开始时在另外的抗生素使用的24小时内施用，且然后可以继续使用另外的抗生素而不进一步施用溶素。

“受试者”是指哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物体或细胞培养物。例如，术语“受试者”旨在包括对细菌感染(例如革兰氏阳性菌感染)敏感或遭受所述感染的生物体，比如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，比如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，受试者是人，比如患有革兰氏阳性菌感染、处于患有革兰氏阳性菌感染的风险中或对革兰氏阳性菌感染敏感的人，无论这样的感染是全身性的、局部的或以其它方式集中或限制于特定器官或组织。

“多肽”是指由氨基酸残基制成的聚合物，且一般具有至少约30个氨基酸残基。术语“多肽”在本文中可与术语“蛋白”和“肽”互换使用。该术语不仅包括分离形式的多肽，还包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还涵盖包含溶素多肽并维持例如溶素功能的融合蛋白或融合多肽。根据上下文，多肽或蛋白或肽可以是天然存在的多肽或重组、工程改造或合成产生的多肽。例如，特定的溶素多肽可以，比如通过酶促或化学切割从天然蛋白衍生或除去，或者可以使用常规的肽合成技术(比如固相合成)或分子生物学技术(比如Sambrook,J.等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, N.Y. (1989)中公开的技术)制备或可以策略性地截短或分段，产生活性片段，维持比如抗相同或至少一种共同靶细菌的溶素活性。

“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段融合产生的表达产物，导致融合的表达产物通常具有两个或更多个结构域或区段，其通常具有不同的性质或功能。在更具体的意义上，术语“融合多肽”还指包含直接或经由氨基酸或肽接头共价连接的两种或更多种异源多肽或肽的多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常是C-末端到N-末端连接，尽管它们也可以C-末端到C-末端、N-末端到N-末端或N-末端到C-末端连接。术语“融合多肽”可与术语“融合蛋白”互换使用。因此，开放式表达“包含某结构的多肽”包括比所叙述结构更大的分子，比如融合多肽。

“异源的”是指不是天然邻接的核苷酸或多肽序列。例如，在本公开的上下文中，术语“异源的”可用于描述两种或更多种多肽的组合或融合，其中所述融合多肽通常在自然界中不存在，例如溶素多肽和阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide)(Ding等人. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008))、防御素肽(Ganz, T.Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽(其可以具有增强的裂解活性)。该定义中包括两种或更多种溶素多肽或其活性片段。这些可用于制备具有裂解活性的融合多肽。

“活性片段”是指保留分离的多肽的一种或多种功能或生物活性的一部分多肽，所述片段取自所述分离的多肽，例如抗一种或多种革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌)的杀菌活性。

“协同”或“超加性”是指由两种物质组合产生的有益效果，其超过这两种试剂独立起作用的效果的总和。在某些实施方案中，协同或超加性效应显著，即统计学上显著超过这两种试剂独立起作用的效果之和。一种或两种活性成分可以在亚阈值水平使用，即如果单独使用活性物质则不产生或产生非常有限的效果的水平。可以通过本文所述的测定比如棋盘试验来测量效果。

“治疗”是指任何过程、动作、施加、疗法等，其中受试者(包括人类)直接或间接地经受医疗救助，目的是治愈病症、根除病原体或改善受试者的状况。治疗还指减少发生、缓解症状、消除复发、预防复发、预防发生、降低发生风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”可进一步涵盖减少受试者中细菌的群体、生长速率或毒力，从而控制或减少受试者中的细菌感染或器官、组织或环境的细菌污染。因此，减少发生的“治疗”可以，例如有效抑制至少一种革兰氏阳性菌在特定环境(无论其是受试者还是环境)中的生长。另一方面，已经建立的感染的“治疗”是指减少造成感染或污染的革兰氏阳性菌的群体、杀死所述革兰氏阳性菌、抑制所述革兰氏阳性菌的生长和/或根除所述革兰氏阳性菌。

“预防”是指预防病症比如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或建立。本公开不旨在限于完全预防或预防感染的建立。在一些实施方案中，延迟了发作或降低了随后感染性疾病的严重性或感染疾病的机会，且这构成预防的实例。

“感染性疾病”是指表现出临床或亚临床症状的疾病，比如发热、脓毒症或菌血症的检测，以及当与这种病理学相关的症状尚未表现时可通过细菌病原体的生长(比如在培养物中)检测到的疾病。

在肽或多肽或其活性片段的上下文中，“衍生物”旨在涵盖，例如经修饰以含有一个或多个除氨基酸以外的化学部分的多肽，所述化学部分基本上不会不利地影响或破坏多肽的活性，比如溶素活性。化学部分可以，比如经由氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基或在内部氨基酸残基处共价连接至肽。这些修饰可以是天然的或非天然的。在某些实施方案中，非天然修饰可包括在反应性部分上添加保护或封端基团、添加可检测标记比如抗体和/或荧光标记、添加或修饰糖基化或添加填充基团(bulking group)比如PEG(聚乙二醇化)和本领域技术人员已知的其它改变。在某些实施方案中，非天然修饰可为封端修饰，比如N-末端乙酰化和C-末端酰胺化。可加入溶素多肽的示例性保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记蛋白，比如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry，是可以共价或非共价结合到多肽上或融合到多肽上而不干扰细胞蛋白的正常功能的紧密蛋白。在某些实施方案中，将编码荧光蛋白的多核苷酸插入多核苷酸序列的上游或下游。这将产生融合蛋白(比如溶素多肽::GFP)，其不干扰细胞功能或其附着的多肽的功能。聚乙二醇(PEG)与蛋白的缀合已被用作延长许多药物蛋白的循环半衰期的方法。因此，在多肽衍生物比如溶素多肽衍生物的上下文中，术语“衍生物”涵盖通过共价附着一个或多个PEG分子而化学修饰的多肽比如溶素多肽。预期溶素多肽比如聚乙二醇化的溶素，与未聚乙二醇化的多肽相比，将表现出延长的循环半衰期，同时保持生物和治疗活性。

“氨基酸序列同一性百分比”是指在比对序列并引入缺口(如果需要)以获得最大序列同一性百分比且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列(比如溶素多肽序列)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的软件(比如BLAST)或例如从DNASTAR商购可获得的软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100%(其间的任何值)相同的，或其间的任何整数值。在本公开的上下文中，当至少80％的氨基酸残基(通常至少约85％、至少约90％并且通常至少约95％、至少约98％或至少99％)相同时，两个多肽是“基本上相同的”。如本文所述的术语“氨基酸序列同一性百分比(%)”也适用于肽。因此术语“基本上相同的”将涵盖分离的多肽和肽(比如本文所述的多肽和肽)的突变的、截短的、融合的或以其它方式序列修饰的变体及其活性片段，以及与参考(野生型或其它完整的)多肽相比具有相当大的序列同一性(比如，例如如通过以上提及的一种或多种方法测量的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)的多肽。当至少约80％的氨基酸残基(通常至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％同一性或至少约99％同一性)相同或表现保守取代时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”。当多肽(比如本文所述的溶素多肽)的一个或多个或若干个，或高达10％、或高达15％、或高达20％的氨基酸被类似的或保守的氨基酸取代所取代，并且其中所得多肽(比如本文所述的溶素)具有参考多肽(比如本文所述的溶素)的至少一种活性、抗菌效果和/或细菌特异性时，本公开的多肽序列基本上是同源的。

如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(比如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(比如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(比如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(比如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(比如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(比如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

“生物膜”是指附着于表面并聚集在水合聚合基体中的细菌，所述水合聚合基体可包含细菌和/或宿主来源的组分。生物膜是微生物的聚集体，其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞频繁地包埋在由但不限于胞外聚合物质(EPS)组成的基体中。生物膜EPS，也称为粘液(slime)(尽管不是所有描述为粘液的都是生物膜)或菌斑，是一般由细胞外DNA、蛋白和多糖组成的聚合聚集物。

在适用于抗某些细菌的抗生素的上下文中，“合适的”是指发现对那些细菌有效的抗生素，即使随后发展出抗性。

感染性心内膜炎

本公开涉及一种使用如本文所述的常规抗生素和溶素(特别是亚MIC量的溶素)治疗或预防由革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌)引起的感染性心内膜炎或感染性心内膜炎复发的方法。

在某些实施方案中，本发明方法的感染性心内膜炎的特征在于生物膜的存在。这种在体内形成的生物膜常常表现出复杂的结构，至少部分是由于它们暴露于宿主防御机制。由于难以穿透该结构，许多抗生素和生物制剂不能有效治疗与生物膜的存在相关的慢性疾病，比如感染性心内膜炎。然而，如实施例中所证明的，本发明方法可有效地用于治疗感染性心内膜炎，包括由形成生物膜的革兰氏阳性菌引起的感染性心内膜炎。

如本文所用的感染性心内膜炎是指心内膜的感染，所述心内膜是心室和心脏瓣膜的内衬。感染性心内膜炎通常发生在当来自身体的另一部分(比如嘴)的细菌通过血流扩散并附着到心脏中的受损区域时，在那里细菌可形成生物膜。

心内膜炎可通过任何本领域已知的方法诊断。通常使用经改良的Duke标准(表1，来自Cahill等人，Lancet, 2016, 387:882-893，其通过引用整体并入本文)。当观察到2个主要标准、1个主要标准连同3个次要标准或5个次要标准时，指示诊断。或者，如果可从手术获得病理学标本，则可使用病理标准(即赘生物或脓肿组织的组织学或阳性培养物)进行诊断。

表1.感染性心内膜炎的诊断的经改良的Duke标准

本发明方法可用于治疗或预防由表1中列出的病原体(比如金黄色葡萄球菌)引起的心内膜炎。本发明方法还可用于治疗或预防由实施例中描述的感染性心内膜炎的病原体引起的心内膜炎。典型的病原体包括葡萄球菌属的成员，比如凝固酶阴性葡萄球菌物种(CoNS)。如本领域已知的，CoNS是革兰氏阳性球菌，其以不规则的“葡萄样”簇分裂，且因不能产生凝固酶并凝固兔血浆而与金黄色葡萄球菌区分。CoNS物种包括表皮葡萄球菌、路邓葡萄球菌、溶血葡萄球菌、头状葡萄球菌、人葡萄球菌和沃氏葡萄球菌。

另外的典型葡萄球菌病原体包括假中间葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、拟葡萄球菌和猪葡萄球菌。抗生素抗性菌包括甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)、达托霉素抗性金黄色葡萄球菌(DRSA)和/或利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌(LRSA)以及包括万古霉素中度敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)的改变的抗生素敏感性菌也被考虑。

此外，本发明方法可用于治疗或预防由如表1和实施例中所述的链球菌物种(比如戈登链球菌(Streptocococcus gordonii)、缓症链球菌(Streptocococcus mitis)、口腔链球菌(Streptocococcus oralis)、中间链球菌(Streptocococcus intermedius)、唾液链球菌(Streptocococcus salivarius)、化脓链球菌(Streptocococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptocococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptocococcus dysgalactiae)、肺炎链球菌(Streptocococcus pneumoniae)、变形链球菌(Streptocococcus mutans)、血管病链球菌(Streptocococcus anginosus)和血链球菌(Streptocococcussanguinis))引起的心内膜炎。典型的链球菌物种包括中间链球菌、化脓链球菌(兰斯菲尔德A群)、无乳链球菌(兰斯菲尔德B群)和停乳链球菌(兰斯菲尔德G群)。

本发明方法可用于治疗或预防任何类型的感染性心内膜炎，包括人工瓣膜心内膜炎、心脏器械感染和右侧心内膜炎。在一些实施方案中，感染性心内膜炎是人工瓣膜心内膜炎。人工瓣膜心内膜炎是指在人工瓣膜手术5年内通常在3-4％的患者中发生的感染，并且其影响机械和/或生物人工瓣膜。在一些实施方案中，人工瓣膜心内膜炎是医疗获得性的。早期人工瓣膜心内膜炎(初次手术后不到1年)主要发生在术后前2个月，且最常见是由凝固酶阴性葡萄球菌或金黄色葡萄球菌引起的。超过一年，导致人工瓣膜心内膜炎的生物体范围与自体瓣膜心内膜炎相同。

在一些实施方案中，感染性心内膜炎是心脏器械感染。心脏器械包括永久性起搏器、心脏再同步疗法和植入式心律转复除颤器。感染可能涉及发生器囊袋、器械导线或周围心内膜表面。心脏器械感染的风险因素包括切口部位血肿形成、肾衰竭、复杂器械植入(与永久性起搏器相比)和缺乏抗生素预防的翻修术。发生器囊袋感染的迹象包括局部蜂窝织炎、排出物(discharge)、裂开或疼痛。涉及导线或心内膜的感染可导致发热、不适和脓毒症。

在一些实施方案中，感染性心内膜炎是右侧心内膜炎。右侧感染性心内膜炎通常与静脉内药物使用者、患有心脏器械感染的受试者、使用中心静脉导管的受试者、携带人免疫缺陷病毒(HIV)的受试者和患有先天性心脏病的受试者相关。在一些实施方案中，三尖瓣膜在右侧心内膜炎中被影响。除了菌血症(包括脓毒症)的特征之外，患者还常常具有由肺栓塞、肺炎和肺脓肿形成引起的呼吸症状。在一些实施方案中，患有右侧心内膜炎的患者(比如静脉内药物使用者)，对标准治疗表现出低顺应性。

在一些实施方案中，本发明方法用于治疗处于患感染性心内膜炎风险的受试者。处于患感染性心内膜炎风险的受试者包括先前已被诊断为感染性心内膜炎的受试者、具有人工心脏瓣膜的受试者、具有如本文所定义的心脏器械的受试者、年龄大于60岁的受试者、静脉内药物使用者和/或患有风湿性心脏病的受试者。

溶素

用于治疗和/或预防感染性心内膜炎(包括预防复发)的本发明方法包括将如本文所述的溶素或其活性片段或变体或其衍生物与一种或多种也如本文所述的抗生素组合施用于对其有需要的受试者。溶素是噬菌体编码的水解酶，其通过从细胞内降解肽聚糖引起宿主细菌的裂解来从被感染的细菌中释放子代噬菌体。本发明的溶素可用作抗微生物剂以通过从细菌细胞外攻击肽聚糖而裂解病原菌。通常，溶素对菌种是高度特异性的，并且很少裂解非靶标生物体包括肠道共生细菌，这可能有益于维持胃肠稳态。

在一些实施方案中，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物表现出对革兰氏阳性菌的杀菌和/或抑菌活性。在一些实施方案中，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物还表现出低抗性倾向，抑制抗生素抗性和/或表现出与常规抗生素的协同。在其它实施方案中，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物抑制细菌凝集、生物膜形成和/或减少或根除生物膜，包括患有感染性心内膜炎的受试者中的生物膜。

本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的杀菌活性可以使用本领域已知的任何方法测定。例如，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以使用例如，如在Mueller等人, 2004, Antimicrob Agents Chemotherapy, 48:369-377中所述的时间杀菌试验在体外评估，所述文献通过引用整体并入本文。

本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的抑菌活性也可使用本领域已知的任何方法评估。例如，生长曲线可以在比如补充了人血清至50%的终浓度的阳离子调节的Mueller Hinton II肉汤中(caMHB/50% HuS)或补充了100％血清的阳离子调节的MuellerHinton II肉汤中进行。革兰氏阳性菌可用溶素悬浮，并且培养物浊度可在600nm的光密度下使用比如SPECTRAMAX ®M3多模式微板读取器(Molecular Devices)测量，伴随着比如在24℃下在搅拌下11小时内每1分钟读取一次。可以根据在Saito等人, 2014, AntimicrobAgents Chemother 58：5024-5025中所述的方法在通气的烧瓶中生长的对数期的培养物中计算倍增时间，所述文献通过引用整体并入本文，并且与在不存在本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的情况下的培养物的倍增时间比较。

可以使用本领域已知的任何方法评估细菌凝集的抑制。例如，可以使用Walke等人描述的方法，即Walker等人, 2013, PLoS Pathog, 9:e1003819，其通过引用整体并入本文。

用于评估溶素或其活性片段或变体或其衍生物在体外抑制或减少生物膜形成的能力的方法是本领域熟知的，并且包括对肉汤微量稀释最小抑制浓度(MIC)方法经改良的变型(参见Ceri等人, 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776(其通过引用整体并入本文)和Schuch等人, 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, 1-18页(其通过引用整体并入本文))。在用于评估最小生物膜根除浓度(MBEC)的该方法中，将比如金黄色葡萄球菌菌株的新鲜菌落悬浮于培养基中，比如在TSBg(用0.2％葡萄糖补充的胰酶大豆肉汤)中以比如1:100稀释的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，以比如0.15ml等分试样添加到卡尔加里生物膜装置(Calgary Biofilm Device)(具有带有96个聚碳酸酯桩钉的盖的96孔板; InnovotechInc.)中并在37℃下孵育比如24小时。然后洗涤生物膜并用在比如TSBg中的比如2倍稀释系列的溶素在比如37℃下处理24小时。处理后，洗涤孔，在比如37℃下风干并用比如0.05％结晶紫染色10分钟。染色后，将生物膜在比如33％乙酸中脱色并测定比如提取的结晶紫的OD600。每个样品的MBEC是通过结晶紫定量评估的除去>95%的生物膜生物量所需的最小溶素浓度。

适用于本发明方法的溶素包括如WO 2013/170015中所述的PlySs2溶素，所述文献通过引用整体并入本文。如本文所用，术语“PlySs2溶素(lysin)”、“PlySs2溶素(lysins)”、“PlySs2”和“CF-301”可互换使用并且涵盖如WO 2013/170015中所述的如本文SEQ ID NO:2所示的PlySs2溶素(具有或不具有初始甲硫氨酸残基)或其活性片段或变体或其衍生物。PlySs2，其被鉴定为在猪链球菌(Streptococcus suis)基因组的原噬菌体内编码的抗葡萄球菌溶素，表现出对以下例举的细菌的杀菌和抑菌活性。

表2.使用溶素PlySs2的不同细菌生长的减少和相对灭杀(部分列表)*

*另外的物种描述在实施例1中。

用于本发明方法的特别典型的溶素是SEQ ID NO: 2的PlySs2溶素，或者更典型的，PlySs2的成熟形式，其不包含初始甲硫氨酸残基，如SEQ ID NO: 18中所示。SEQ ID NO:2和18的PlySs2溶素具有大多数噬菌体溶素特征性的结构域排列，由与细胞壁结合C-末端结构域(SEQ ID NO: 20)连接的催化N-末端结构域(SEQ ID NO: 19)定义。N-末端结构域属于溶素和其它细菌细胞壁修饰酶中常见的半胱氨酸-组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)家族。C-末端结构域属于常常形成溶素的细胞壁结合元件的SH3b家族。图1绘出了SEQ ID NO: 2的PlySs2溶素，其中N-和C-末端结构域以粗体区域显示。N-末端CHAP结构域对应于以LNN开始的第一个粗体氨基酸序列区域，而C-末端SH3b结构域对应于以RSY开始的第二个粗体区域。

在一些实施方案中，本发明方法包括将变体溶素施用于对其有需要的受试者。用于本发明方法的合适的溶素变体包括相对于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18具有至少一个取代、插入和/或缺失的那些多肽，其保留参考溶素的至少一种生物学功能。在一些实施方案中，变体溶素表现出抗细菌活性，包括对广泛范围的革兰氏阳性菌(包括金黄色葡萄球菌)的溶菌和/或抑菌效果，和抑制凝集、抑制生物膜形成和/或减少生物膜的能力。在一些实施方案中，本发明的溶素变体使革兰氏阳性菌对抗生素更敏感。

在一些实施方案中，适用于本发明方法的溶素变体包括与SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO: 18具有至少80％，比如至少85％、比如至少90％、比如至少95％、比如至少98％或比如至少99％序列同一性的分离的多肽序列，其中变体溶素保留具有如本文所述的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的PlySs2溶素的一种或多种生物活性，比如催化活性、结合细菌(比如葡萄球菌或链球菌)细胞壁的能力、杀菌或抑菌活性，包括杀死生物膜中的革兰氏阳性菌比如葡萄球菌和/或链球菌的能力。

溶素变体可以通过本领域已知的且如WO2013/170015中所述的任何方法形成，比如通过定点诱变修饰SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18的PlySs2溶素或经由在产生SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO: 18的PlySs2溶素的宿主中的突变，且其保留如本文所述的一种或多种生物功能，所述WO2013/170015通过引用整体并入本文。例如，本领域技术人员可以合理地对比如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18的PlySs2溶素的CHAP结构域和/或SH3b结构域进行和测试取代或替代。与Genbank数据库的序列比较可以用CHAP和/或SH3b结构域序列之一或两者或用SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18的PlySs2溶素全氨基酸序列进行，例如，以鉴定用于取代的氨基酸。例如，在SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18的PlySs2氨基酸序列中的缬氨酸氨基酸残基19处，具有替代缬氨酸的丙氨酸的突变体或变体是有活性的，并且能够以与SEQID NO: 2 PlySs2溶素相似和同样有效的方式杀死革兰氏阳性菌。

此外，如图1所示，CHAP结构域含有保守的半胱氨酸和组氨酸氨基酸序列(CHAP结构域中的第一个半胱氨酸和组氨酸)，其在不同多肽的CHAP结构域中是特征性的和保守的。合理地预测，例如，保守的半胱氨酸和组氨酸残基应该保持在PlySs2的突变体或变体中，以维持活性或能力。因此，保留在本公开的溶素变体中的特别期望的残基包括SEQ ID NO: 2的CHAP结构域中的活性位点残基Cys₂₆、His₁₀₂、Glu₁₁₈和Asn₁₂₀。特别期望的取代包括：Lys取代Arg且反之亦然，使得可以维持正电荷；Glu取代Asp且反之亦然，使得可以维持负电荷；Ser取代Thr使得可以维持游离的-OH，以及Gln取代Asn使得可以维持游离的NH₂。其它合适的变体包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 18中的CHAP和/或SH3结构域区域中的取代，所述CHAP和/或SH3结构域区域不在其它已知的溶素之间共享，比如在例如Schmitz, 2011,“Expanding the Horizons of Enzybiotic Identification” Student Theses andDissertations,138页中所示的本发明的SEQ ID NO: 2的CHAP结构域和PlyC的CHAP结构域之间，所述文献通过引用整体并入本文并且在本文描绘在图6中。

合适的变体溶素还描述在PCT公开申请号WO 2019/165454(国际申请号：PCT/US2019/019638)中，其通过引用整体并入本文。特别地，合适的变体溶素包括本文如SEQ IDNO: 3-17所示的变体溶素以及与SEQ ID NO: 3-17中的任一个具有至少80％，比如至少85％、比如至少90％、比如至少95％、比如至少98％或比如至少99％序列同一性的变体溶素，其中变体溶素保留具有如本文所述的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的PlySs2溶素的一种或多种生物活性。

SEQ ID NO: 3-17是经修饰的溶素多肽，其相对于对应的野生型PlySs2溶素(SEQID NO: 2)具有至少一个氨基酸取代，同时保持抗菌活性和有效性。SEQ ID NO: 3-17可参考其相对于SEQ ID NO: 2的氨基酸取代进行描述，如下表A所示。经修饰的溶素多肽的氨基酸序列(参考与SEQ ID NO: 2的差异及其氨基酸残基的位置)使用单字母氨基酸代码总结如下：

表A

在一些实施方案中，本发明方法包括将溶素的活性片段施用于对其有需要的受试者。合适的活性片段包括保留实施方案的蛋白或肽片段的生物活性部分的活性片段，如本文所述。这样的变体包括包含含有比溶素蛋白的全长蛋白更少的氨基酸且表现出对应全长蛋白的至少一种活性的氨基酸序列的多肽。通常，生物活性部分包含具有对应蛋白的至少一种活性的结构域或基序。在图1和SEQ ID NO: 19中提供了PlySs2溶素的N-末端CHAP结构域的示例性结构域序列。在图1和SEQ ID NO: 20中提供了PlySs2溶素的C末端SH3b结构域的示例性结构域序列。本公开的蛋白或蛋白片段的生物活性部分可以是在长度上为例如10、25、50、100个氨基酸的多肽。可以通过重组技术制备其中蛋白的其它区域缺失的其它生物活性部分，并评价天然形式的实施方案的多肽的一种或多种功能活性。

在一些实施方案中，合适的活性片段包括与本文所述的活性片段(包括SEQ IDNO: 19或20)具有至少80％，比如至少85％、比如至少90％、比如至少95％、比如至少98％或比如至少99％序列同一性的活性片段，其中其活性片段保留CHAP和/或SH3b结构域的至少一种活性。

本文所述的用于本发明方法的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以在用特定噬菌体感染后由细菌生物体产生，或者可以重组或合成产生或制备，比如使用不含细胞的合成系统化学合成或制备。由于本文描述和提及了溶素多肽序列和编码溶素多肽的核酸，本发明的溶素可以经由从噬菌体基因组中分离溶素基因，将该基因放入转移载体中，并将所述转移载体克隆到表达系统中来产生，使用如例如WO2013/170015中所述的本领域的标准方法，所述文献通过引用整体并入本文。本发明的溶素变体可以是截短的、嵌合的、改组的或“天然的”，并且可以是如例如在美国专利号5,604,109中所述的组合，所述文献通过引用整体并入本文。

可以在氨基酸序列中，或在编码本文所述的多肽和溶素的核酸序列中，包括在SEQID NO: 2、SEQ ID NO: 18所示的溶素序列中，或在其活性片段或截短物中进行突变，使得特定密码子变为编码不同氨基酸的密码子，以获得具有经取代的氨基酸或缺失或加入一个或多个氨基酸的序列。

这种突变一般通过尽可能进行最少的核苷酸改变来进行。这种取代突变可以以非保守方式(例如，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸改变为属于另一组的氨基酸)或以保守方式(例如，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸改变为属于相同组的氨基酸)进行以改变所得蛋白中的氨基酸。这种保守性改变一般导致所得蛋白的结构和功能变化较小。非保守性改变更可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。本公开应被认为包括含有不显著改变所得蛋白的活性或结合特征的保守性改变的序列。因此，本领域技术人员基于对本文提供的PlySs2溶素多肽的序列的考查以及他们的知识和可获得的其它溶素多肽的公开信息，可以在溶素多肽序列中进行氨基酸改变或取代。可以进行氨基酸改变以替代或取代本文提供的溶素序列中的一个或多个、一个或几个、一个或若干个、一个至五个、一个至十个或此类其它数目的氨基酸，以产生其突变体或变体。可以预测所述其突变体或变体的功能，或测试所述其突变体或变体的如本文所述的对比如葡萄球菌、链球菌或肠球菌的抗菌活性的功能或能力，和/或具有与本文所述和特别提供的溶素相当的活性的功能或能力。因此，可以使用本领域已知的和本文描述的测定和方法，测试对溶素序列和本文描述的突变体或变体进行的改变。本领域技术人员基于本文的溶素的结构域结构可以预测一个或多个、一个或若干个适于取代或替代的氨基酸和/或一个或多个不适于取代或替代的氨基酸，包括合理的保守或非保守取代。

抗生素

如本文所述的治疗或预防感染性心内膜炎的方法包括共施用治疗有效量的一种或多种抗生素和PlySs2溶素。在一些实施方案中，如本文所述的溶素或其活性片段或变体或其衍生物与一种或多种抗生素的共施用导致对革兰氏阳性菌比如金黄色葡萄球菌的协同杀菌和/或抑菌效果。通常，共施用导致对抑菌和/或杀菌活性的协同作用。在其它实施方案中，共施用用于抑制毒力表型，包括生物膜形成和/或凝集。在一些实施方案中，共施用用于减少受试者中生物膜的量。

适用于本发明方法的抗生素包括不同类型和种类的抗生素，比如β-内酰胺，包括青霉素类(比如甲氧西林、苯唑西林)、头孢菌素类(比如头孢氨苄和头孢克罗(cefactor))、单环内酰胺类(比如氨曲南)和碳青霉烯类(比如亚胺培南和恩他培南)；大环内酯类(比如红霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷类(比如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星)、糖肽类(比如万古霉素、替考拉宁)、噁唑烷酮类(比如利奈唑胺和替地唑胺)、脂肽类(比如达托霉素)和磺胺类(比如磺胺甲噁唑)。

通常，本发明方法使用万古霉素、达托霉素、利奈唑胺和苯唑西林。甚至更典型地，使用达托霉素。

剂量和施用

施用于对其有需要的受试者的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的剂量取决于多种因素，包括待治疗的感染的活性，待治疗的受试者的年龄、健康和一般身体状况，特定溶素或其活性片段或变体或其衍生物的活性，与根据本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物配对的抗生素(如果有的话)的性质和活性以及这种配对的组合效果。通常，待施用的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的有效量预期落在0.1-50mg/kg (或1至50 mcg/ml)的范围内。本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可根据任何所需的频率或持续时间施用。例如，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以在长达14天的时间段内每天施用1-4次。通常，仅施用单剂量。考虑到协同作用，抗生素可以标准给药方案或以较低量施用。然而，所有这样的剂量和方案(无论溶素或其活性片段或变体或其衍生物或与其联合施用的任何抗生素)都可进行优化。最佳剂量可通过进行如本领域技术范围内的体外和体内试验性药效实验来确定，但将本公开内容考虑在内。

通常，溶素或其活性片段或变体或其衍生物的剂量在约0.000025至约1.8 mg/kg的范围内，比如约0.0.05 mg/kg至约0.5 mg/kg或约0.1 mg/kg至约0.3 mg/kg。更典型地，在健康个体中剂量范围是约0.2 mg/kg至约0.3 mg/kg，比如0.25 mg/kg。在一些实施方案中，例如在患有中度和重度肾损害的个体中，剂量可能较低，比如0.1 mg/kg至0.2 mg/kg，比如0.12 mg/kg。在一些实施方案中，剂量(比如单剂量)在例如两小时的时间段内静脉内施用。

预期本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物提供杀菌效果，并且当以较少量使用时提供抑菌效果，且对一系列的抗生素抗性细菌均有活性，而与进化抗性无关。基于本公开，在临床环境中，当与某些抗生素(甚至细菌对其发展抗性的抗生素)组合时，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物是组合物的有效替代物(或添加剂或组分)，所述组合物用于治疗由抗药性和多重抗药性细菌引起的感染性心内膜炎。革兰氏阳性菌的现有抗性机制不应影响对本发明多肽的裂解活性的敏感性。

对于本公开的任何多肽，治疗有效剂量最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(通常为小鼠、兔、狗或猪)中估计。动物模型也可用于获得期望的浓度范围和施用途径。所获得的信息然后可用于确定人的有效剂量以及施用途径。然而，通常使用全身施用，特别是静脉内施用。可以进一步调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望的效果。可考虑在内的另外的因素包括患者的疾病状态的严重程度、年龄、体重和性别；饮食，期望的治疗持续时间，施用方法，施用时间和频率，药物组合，反应敏感性和对疗法的耐受性/反应以及治疗医师的判断。

治疗方案可涉及每日施用(比如每日一次、两次、三次等)，每隔一天(比如每隔一天一次、两次、三次等)，半周，每周，每两周一次，每月一次等。在一个实施方案中，治疗可作为持续输注给予。单位剂量可以多次施用。间隔也可以是不规则的，如通过监测临床症状所指示的。或者，单位剂量可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率可以根据患者而变化。本领域技术人员将理解，对于局部施用(比如鼻内、吸入、直肠等)，或对于全身施用(比如口服、直肠(比如经由灌肠剂)、i.m. (肌内)、i.p. (腹膜内)、i.v. (静脉内)、s.c. (皮下)和经尿道等)，这样的指导原则将被调整。

在一些实施方案中，以MIC量将本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物施用于对其有需要的受试者。如本领域已知，MIC值是指与对照相比足以抑制至少80％的细菌生长的肽的最小浓度。不受理论的限制，据信，当与一种或多种常规抗生素共同施用，当以MIC水平或更高施用本发明的溶素或其活性片段或其变体或衍生物时，可有效对抗感染性心内膜炎，并且可表现出对广泛范围的革兰氏阳性菌(包括如本文所述的金黄色葡萄球菌)的杀菌效果。此外，在一些实施方案中，以MIC水平或更高施用本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可用于根除受试者中的生物膜。

可通过任何合适的方法测定MIC。例如，可使用根据临床和实验室标准研究所方法(CLSI)的肉汤微量稀释法(2018, Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 第11版, Clinical andLaboratory Standards Institute, Wayne, PA)测定MIC值。在一些实施方案中，使用100%人血清或用马血清补充至25%的终浓度和用二硫苏糖醇(DTT)补充至0.5 mM的终浓度的阳离子调节的Mueller Hinton II肉汤测试溶素或其活性片段或变体或其衍生物的MIC值，以测定适合体内环境的MIC值。

在一些实施方案中，溶素或其活性片段或变体或其衍生物还可以通过以亚MIC水平(比如以范围从0.9×MIC至0.0001×MIC的亚MIC水平)施用此类生物制剂而有效地用于治疗或预防感染性心内膜炎，包括其复发。在这样的亚MIC水平，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物通常用于抑制革兰氏阳性菌的生长、减少凝集和/或抑制生物膜形成或减少或根除生物膜。

不受理论的限制，亚MIC剂量的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物导致对细胞被膜的非致死性损伤，其由溶素或其活性片段或变体或其衍生物的肽聚糖水解活性介导。在一些实施方案中，细胞被膜中产生的物理和功能变化解释了生长延迟。这种物理和功能变化包括比如细胞壁的不稳定、膜渗透性的增加和膜电位的消散。尽管本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物不直接作用于细菌细胞膜，但对细胞膜渗透性和静电势的任何影响都可能是由在非常低的浓度下溶素的肽聚糖水解活性(和细胞被膜的不稳定)诱导的渗透应激的结果。还假定局部细胞壁水解可导致内膜的挤出和孔的形成以及细胞合成和水解的解偶联，细胞壁厚度的变化导致随后的生长停滞。

在一些实施方案中，亚MIC浓度的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物损害细菌细胞被膜，导致与不存在亚MIC剂量的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物相比，细菌对常规抗生素更敏感。

在一些实施方案中，亚MIC水平的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的功效可使用体外药效学(PD)参数来测定，如例如由Jun Oh和Raymond Schuch在2017年6月2日在洛杉矶新奥尔良的美国微生物学学会(ASM)Microbe上的标题为“The Sub-MICEffect of Lysin CF-301 on Staphylococcus aureus (S. aureus).”的海报展示中所述。另见万维网，网址：contrafect.com/technology/publications-posters

page=2。上述海报展示通过引用整体并入本文。

简言之，包括抗生素后效应(PAE)，PA亚MIC效应(PA-SME)和亚MIC效应(SME)的体外药效学(PD)参数允许测定短持续时间和/或亚MIC暴露对细菌生长的影响。根据定义，PAE是细菌生长的抑制期，其在初始暴露于抗微生物剂(常常以超-MIC水平)之后持续，直到除去抗微生物剂之后恢复正常的细菌生长。PA-SME是在PAE期暴露于亚MIC期间被抑制的生长；因此PA-SME表示包括PAE加上被亚MIC抑制生长期间的另外时间的时间间隔。由于在治疗环境中给药后可能存在亚抑制浓度，因此PA-SME可以比PAE更接近地反映体内情况。与PA-SME相反，SME测量亚抑制水平对先前未暴露于比如溶素或抗生素的细菌生长的影响。

可以通过将革兰氏阳性菌培养物在37℃搅拌下，以例如4×MIC，用目的溶素处理比如1小时来测定体外PAE。暴露后，通过比如1:1,000稀释到新鲜制备的培养基中除去溶素，而随后在37℃下以200 rpm搅拌进一步孵育24小时。对于每个PAE测试培养物，在稀释前和稀释后立即通过定量铺平板测定细菌浓度；随后可以通过以比如1小时的间隔进行定量铺平板，持续比如24小时来跟踪生长。PAE定义为T-C；其中T是暴露于抗生素或溶素的培养物的生存力计数相对于在除去溶素后立即的计数增加1-log₁₀所需的时间，而C是未暴露于溶素的生长对照的对应时间。

体外PA-SME可以如下测定。在用溶素诱导PAE 1小时之后，将培养物样品以比如1:1,000稀释到含有四种不同亚MIC浓度的溶素的培养基的等分试样中，并且在37℃下以225rpm搅拌进一步孵育24小时。可以如上对于体外PAE测定所述，测定生存力。PA-SME定义为T _pa -C；其中T _pa是先前暴露于溶素而随后暴露于不同亚MIC浓度的培养物相对于在除去溶素后立即的计数增加1-log₁₀所需的时间，而C是未暴露于溶素的生长对照的对应时间。

体外SME可以与PA-SME相同的方式诱导，而无PAE的预先诱导。在1小时生长期(无溶素)后，将培养物样品以1:1,000稀释到含有不同亚MIC浓度的溶素的100％人血清中，且随后在37℃下以225 rpm搅拌进一步孵育高达24小时。如上对于体外PAE测定所述，测定生存力计数。SME定义为T _s -C；其中T _s是仅暴露于亚MIC浓度的培养物相对于在稀释后立即的计数增加1-log₁₀计数所需的时间；C是未暴露对照的对应时间。

在一些实施方案中，亚MIC值的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的功效可通过使用比如中性粒细胞减少的小鼠大腿模型测定体内PA-SME值来评估。该模型测试了在溶素水平降至低于MIC后的革兰氏阳性菌再生长抑制，并被认为主要提供了进一步受体内感染情况(包括体内生物膜形成)的影响的亚MIC效应的描述。可以使用以下等式PAE=T-C-M来测定PA-SME，其中M表示血清水平超过MIC的时间，T是经治疗的小鼠的大腿中的CFU比时间M处增加超过1-log₁₀计数所需的时间，而C是未经治疗的对照的大腿中的CFU比T=0小时处增加1-log₁₀的活菌计数所需的时间。

在一些实施方案中，亚MIC和/或MIC水平剂量的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物能够减少生物膜，特别是体内生物膜。如本领域已知的，体内生物膜可在结构上不同于体外生物膜。通常，体外生物膜和体内生物膜之间的差异(比如与慢性感染相关的差异)的原因是体外生物膜系统中缺乏防御机制暴露。在大多数体内生物膜环境中，可能存在吞噬细胞甚至噬菌体，以及存在脓和其它分泌的液体和聚合物。这样的可变因素在体外模型系统中一般是避免的，它们在体外模型系统中难以控制或复制。在一些实施方案中，本发明方法有利地用于根除或减少结构更复杂的体内生物膜。

在一些实施方案中，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物降低了杀菌和/或抑菌活性所需的抗生素的MIC。可以使用任何已知的方法来评估MIC。在一些实施方案中，使用棋盘试验来测定溶素对抗生素浓度的影响。棋盘试验基于通过如本文所述的肉汤微量稀释进行MIC测定的CLSI方法的改良。

通过首先制备比如96孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘，其中每个孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在单独的板中，制备类似的行，其中每个孔具有相同量的沿垂直轴稀释比如2倍的溶素。然后组合溶素和抗生素稀释液，使得每列具有恒定量的抗生素和加倍稀释的溶素，而每行具有恒定量的溶素和加倍稀释的抗生素。因此，每个孔都具有溶素和抗生素的独特组合。例如，将细菌以在比如用马血清补充至25%的终浓度和用二硫苏糖醇(DTT)补充至0.5 mM的终浓度的阳离子调节的Mueller Hinton II肉汤中1×10⁵ CFU/ml的浓度加入药物组合中。然后在比如37℃下在环境空气中16小时后记录每种药物单独和组合的MIC。计算每种药物的累加部分抑制浓度(Summation fractional inhibitoryconcentrations) (∑FIC)，并使用最小∑FIC值(∑FICmin)测定溶素/抗生素组合的效果。

在一些实施方案中，以MIC水平或高于MIC水平向对其有需要的受试者施用本公开的一种或多种抗生素，比如1×MIC、2×MIC、3×MIC和4×MIC。在其它实施方案中，以亚MIC水平施用抗生素(比如从0.9×MIC至0.0001×MIC)。

在一些实施方案中，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和本发明方法的一种或多种抗生素比如达托霉素同时施用。在其它实施方案中，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和本发明方法的一种或多种抗生素比如达托霉素，以任何顺序连续施用，比如顺序施用。在一些实施方案中，在施用护理标准抗生素治疗(比如两周疗程的苯唑西林和庆大霉素或达托霉素)期间或之后施用溶素。本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和本发明的一种或多种抗生素可以单剂量或多剂量、单独或组合施用。

本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和一种或多种抗生素可以通过相同施用模式或通过不同施用模式施用，并且可以一次、两次或多次，一种或多种以组合或单独施用。因此，本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以以初始剂量施用，然后施用随后的一个或多个剂量，特别是取决于反应，比如杀菌和/或抑菌效果和/或对凝集和/或生物膜形成或减少的影响，并且可以与抗生素剂量组合或交替。通常，以单次推注施用溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后是常规剂量和施用模式的本公开的一种或多种抗生素。

在更典型的实施方案中，向受试者单次推注的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后施用常规方案(比如护理标准(SOC)剂量)的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)。在其它典型的实施方案中，向受试者施用本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)，然后单次推注本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后以常规剂量施用另外剂量的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)。甚至更典型地，向受试者施用单一亚MIC剂量的溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后施用常规方案的一个或多个剂量的本公开的一种或多种抗生素。在其它甚至更典型的实施方案中，以常规剂量向受试者施用本公开的一种或多种抗生素比如达托霉素，然后以亚MIC剂量单次推注本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后以常规剂量施用另外剂量的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)。

在其它实施方案中，向受试者施用单次亚MIC剂量的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后施用一个或多个剂量的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)，其中抗生素剂量也以亚MIC水平施用。

在其它实施方案中，以亚MIC剂量向受试者施用一种或多种本公开的抗生素比如达托霉素，然后单次推注亚MIC剂量的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物，然后以亚MIC剂量施用一个或多个另外剂量的本公开的一种或多种抗生素比如达托霉素。

制剂

本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可与本文所述的一种或多种抗生素一起施用。溶素或其活性片段或变体或其衍生物和抗生素可以各自包含在单一药物制剂中或分别配制成溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂、片剂、丸剂、团粒、胶囊、含有液体的胶囊、粉末、缓释制剂、栓剂、棉塞施用乳液、气溶胶、喷雾剂、混悬剂、锭剂、糖锭、糖果、注射剂、口香糖、软膏、涂片、定时释放贴片、液体吸收擦拭物及其组合的形式。

在一些实施方案中，药物制剂的施用可包括全身施用。全身施用可以是肠内或口服即经由消化道给予物质，胃肠外施用即通过消化道以外的其它途径给予物质，比如通过注射或吸入。因此，本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素可以经口服、肠胃外、通过吸入、局部、经直肠、经鼻、经颊或经由植入的储库或通过任何其它已知方法施用于受试者。本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素还可以通过缓释剂型的手段施用。

对于口服施用，本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素可以配制成固体或液体制剂，例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液和分散体。在一些实施方案中，本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素可以与赋形剂(比如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、明胶、马铃薯淀粉、海藻酸和/或硬脂酸镁)一起配制。

为了制备固体组合物比如片剂和丸剂，将本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素与药物赋形剂混合以形成固体预配制组合物。如果需要，片剂可以通过标准技术包被糖衣或包被肠溶衣。片剂或丸剂可经包被或以其它方式复合以提供给予延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分，后者是前者的被膜形式。两种剂量组分可通过肠溶层分开，肠溶层用于抵抗在胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸和聚合酸与比如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。

在另一个实施方案中，本公开的药物制剂被配制为可吸入组合物。在一些实施方案中，本发明的药物制剂有利地配制为干燥的可吸入粉末。在具体的实施方案中，本发明的药物制剂可进一步与用于气溶胶递送的推进剂一起配制。合适的推进剂的实例包括但不限于：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和二氧化碳。在某些实施方案中，制剂可以雾化。

在一些实施方案中，可吸入药物制剂包括赋形剂。合适的赋形剂的实例包括但不限于：乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯；中链、短链或长链脂肪酸的甘油三酯，或其任何组合；全氟二甲基环丁烷；全氟环丁烷；聚乙二醇；薄荷醇；月桂醇；二甘醇单乙醚；中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯；醇类；桉树油；短链脂肪酸；及其组合。

可将表面活性剂加入本公开的可吸入药物制剂中以降低药物和推进剂之间的表面和界面张力。表面活性剂可以是与本发明多肽无反应性的任何合适的无毒化合物。合适的表面活性剂的实例包括但不限于：油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯；十六烷基吡啶氯化物；大豆卵磷脂；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚氧乙烯(10)硬脂基醚；聚氧乙烯(2)油基醚；聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；蓖麻油乙氧基化物；及其组合。

在一些实施方案中，本公开的药物制剂包括鼻用制剂。鼻用制剂包括，例如鼻喷剂、鼻滴剂、鼻软膏剂、鼻洗剂、鼻注射剂、鼻填塞剂、支气管喷雾剂和吸入剂，或间接通过使用咽喉锭剂、漱口剂或含漱剂，或通过使用涂抹于鼻孔或面部的软膏剂，或这些和类似应用方法的任何组合。

本公开的药物制剂更典型地通过注射施用。例如，药物制剂可以肌内、鞘内、真皮下、皮下或静脉内施用以治疗革兰氏阳性菌的感染，通常为由金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA))引起的感染性心内膜炎。药学上可接受的载体可包含蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合。此外，肠胃外注射的药物制剂可包含pH缓冲溶液、佐剂(比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、混悬剂或乳剂以及用于在临用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。

在肠胃外注射是所选施用方式的情况下，通常使用等渗制剂。一般地，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液比如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂可包括明胶和白蛋白。可以向制剂中加入血管收缩剂。根据这类应用的药物制剂以无菌和无热原提供。

本公开的药物制剂可以以单位剂型存在并且可以通过本领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、接受者暴露于感染性细菌的持续时间、受试者的大小和重量以及特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将一般是产生治疗效果的每种化合物的量。一般地，在100％中，活性成分的总量将从约1％至约99％变化，通常为从约5％至约70％，最通常为从约10％至约30％。

实施例

实施例1. 本公开的溶素对与感染性心内膜炎相关的葡萄球菌和链球菌物种的体外功效。

针对一系列最常见的与感染性心内膜炎相关的菌种(如本文所述和表2所示)评价CF-301 (exebacase)和比较抗生素(比如达托霉素和万古霉素)的体外活性。从美国、欧洲和亚洲的收藏和储存库中获得各种菌株和分离株。按每个来源在物种水平上确认菌株和分离株。大多数分离株分离自一系列感染类型，包括菌血症(和心内膜炎)，皮肤和软组织感染和呼吸道感染。包括一系列感染类型以确保每种目标物种有足够数量的分离株。

使用非标准抗微生物敏感测试(AST)培养基，通过肉汤微量稀释(BMD)测定exebacase对葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC)，所述非标准抗微生物敏感测试培养基包含用马血清(Sigma Aldrich)和二硫苏糖醇(DTT; Sigma Aldrich)分别补充至25%和0.5 mM的终浓度的阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(caMHB)。该培养基被称为caMHB-HSD，被临床和实验室标准协会(CLSI)批准用于exebacase AST (CLSI. 2017, January 16-17. ASTSubcommittee Working Group Meetings and Plenary. AST Meeting Files &Resources, clsi.org/education/microbiology/ast/ast-meeting-files-resources/)。如CLSI所建议，包括另外补充2.5％的裂解的红细胞(Remel™, ThermoFisher)用于链球菌分离株的分析。参见CLSI, 2015. Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically,第10版. Clinical andLaboratory Standards Institute, Wayne, PA。

按照各自的参考BMD方法测试达托霉素(Sigma Aldrich)和盐酸万古霉素(SigmaAldrich)。参见CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial SusceptibilityTests for Bacteria That Grow Aerobically,第10版. Clinical and LaboratoryStandards Institute, Wayne, PA.。

首先使用73个MSSA和74个MRSA分离株的组确认exebacase活性，所述分离株分别表现0.5/0.5 µg/mL和0.5/1 µg/mL的MIC_50/90值以及0.25-1 µg/mL和0.5-2 µg/mL的范围(表3)。接下来对于每种凝固酶阴性葡萄球菌物种观察到类似的活性水平，包括表皮葡萄球菌(MIC_50/90 = 0.5/0.5 µg/mL)、路邓葡萄球菌(MIC_50/90 = 1/1 µg/mL)、溶血葡萄球菌(MIC_50/90 = 0.5/1 µg/mL)、头状葡萄球菌(MIC_50/90 = 1/2 µg/mL)和沃氏葡萄球菌(MIC_50/90= 0.5/1 µg/mL)。测试了仅很少与IE相关的人葡萄球菌(n=2种菌株)，并表明了0.125 µg/mL和0.25 µg/mL的exebacase MIC值(数据未示出)。还测试了其它葡萄球菌物种，包括假中间葡萄球菌(MIC = 0.25 µg/mL, n=6种分离株中的每一个)、松鼠葡萄球菌(MIC = 2 µg/mL, n=3种分离株)、拟葡萄球菌(MIC = 0.125 µg/mL, n=1种分离株)和猪葡萄球菌(MIC =0.25 µg/mL, n=1种分离株)。对于所有测试的葡萄球菌，观察到达托霉素和万古霉素的MIC分别在0.125-2 µg/mL和0.5-4 µg/mL的范围内，与预期范围一致。参见Sader等人, 2019,J. Antimicrob. Chemother. doi:10.1093/jac/dkz006 and Pfaller et al., 2018,Int. J. Antimicrob. Agents. 51:608-611。

除肺炎链球菌和粪肠球菌(以前的D群链球菌)之外，测试的绿色链球菌的大多数都表现出对exebacase的高度可变和低水平的易感性，MIC值范围高达8至大于512 µg/mL(表4)。值得注意的例外包括中间链球菌、化脓链球菌(兰斯菲尔德A群)、无乳链球菌(兰斯菲尔德B群)和停乳链球菌(兰斯菲尔德G群)，MIC范围分别为0.06-0.5 µg/mL、0.5-4 µg/mL、0.25-4 µg/mL和1-2 µg/mL。不像许多主要引起亚急性IE的绿色链球菌和粪肠球菌，中间链球菌(绿色群物种)和无乳链球菌和停乳链球菌二者都与葡萄球菌引起的且本领域已知导致心内膜的快速破坏的更具侵袭性的急性疾病相关。

总之，本文提供的数据证明了exebacase对所有葡萄球菌物种和包括与急性IE相关的链球菌的子集的有效体外活性。考虑到葡萄球菌IE感染的发病率增加和与绿色链球菌群相关的感染的发病率降低，这些发现特别重要。

表2 检查人类感染性心内膜炎病原体的7项研究的数据汇总

^a每项研究的参考文献如下所示(N=每项研究中患者的数量)：1a. Yuan SM,2014, Int. J. Clin. Exp. Med. 7:199-218, 1b. Murdoch等人. 2009, Arch. Intern. Med. 169:463-73, 1c. Farag等人,2017, Med. Sci. Monit. 23:3617-3626, 1d. Munoz等人. Spanish Collaboration on Endocarditis-Grupo de Apoyo al Manejo de laEndocarditis 1e. Infecciosa en E. 2015. Current Epidemiology and Outcome ofInfective Endocarditis: A Multicenter, Prospective, Cohort Study. Medicine(Baltimore) 94:e1816, 1e. Xu H.等人, 2016. PLoS One 11:e0166764, 1f. Selton-S等人. 2012, Clin. Infect. Dis. 54:1230-9, 1g. Yombi等人, 2017, Acta. Clin. Belg. 72:417-423.

^b这里的一些研究将表皮葡萄球菌和路邓葡萄球菌与其它IE相关的较不常见的CoNS生物体(包括头状葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和溶血葡萄球菌)进行了区分(Petti等人,2008, J. Clin. Microbiol. 46:1780-4, Farag等人, 2017, Med. Sci. Monit. 23:3617-3626和Kuvhenguhwa等人, 2017. Cardiol. Res. 8:236-240).

^c引起IE的绿色链球菌群包括：缓症链球菌、血链球菌、变形链球菌、唾液链球菌、戈登链球菌、中间链球菌和血管病链球菌。参见Cunha等人, 2010, Heart Lung 39:64-72,Kim等人, 2018, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 91:269-272, Naveen等人, 2014,Int. J. Med. Microbiol., 304:262-8和Dadon等人, 2017, Ann. Clin. Microbiol.Antimicrob., 16:68.

^d在指定的研究中，绿色链球菌被称为口腔链球菌.

^e未提供物种，然而粪肠球菌引起约97%的与肠球菌相关的IE病例。参见Baddour等人, 2015, Circulation, 132:1435-86.

^f这些研究将所有的CoNS物种归为一类。

表3 葡萄球菌物种对exebacase和比较抗生素的敏感性^a

^aMIC值以µg/mL表示

^b对于表皮葡萄球菌DAP和VAN数据的MIC值未测定(n.d.)。

实施例2. 在感染性心内膜炎兔模型中CF-301与达托霉素连续施用的效果。

材料与方法

在低于人治疗剂量(HTD)当量的达托霉素剂量存在下评价PlySs2 (CF-301)对经典金黄色葡萄球菌“生物膜”感染模型的体内功效。达托霉素剂量的选择理由如下。在下述感染性心内膜炎兔模型中，在1 mg/kg至10 mg/kg的范围内进行达托霉素试验性剂量-反应实验，静脉内给药，每天一次，持续4天，所述感染性心内膜炎兔模型由MRSA菌株MW2引起。图2描述了个体动物的数据，以治疗方案对log₁₀ CFU/g组织作图(示出平均值±SEM)。从这些研究中，定义了达托霉素剂量-反应。选择4 mg/kg的达托霉素(低于HTD当量的剂量)，以探索加入达托霉素的CF-301疗法的协同益处。在兔感染性心内膜炎模型中，与媒介物治疗的对照相比，静脉内施用的4mg/kg的单独达托霉素剂量提供约0.25至1.45 log₁₀的细菌负荷减少。经治疗的动物仍然具有约5-7 log₁₀的负荷，提供了动态范围，在该动态范围内观察CF-301在该治疗方案中的潜在增加效果。

在兔中使用充分描述的经颈动脉留置左心室导管诱导的主动脉瓣感染性心内膜炎模型。参见Xiong等人, 2011, AAC, 55:P5325-5330。在导管放置后48小时，通过静脉内接种约2×10⁵CFU诱导感染性心内膜炎(在该模型中诱导MRSA菌株MW2的ID95)。在感染后24小时，将动物随机分成7组：i)缓冲控制；或ii)-iv)在达托霉素施用前1或4小时，对比达托霉素施用后即刻或达托霉素施用后2或4小时(4 mg/kg静脉内)，以单次静脉内剂量(5-10分钟输注)施用CF-301 (0.09 mg/kg的亚MIC剂量)。继续每天一次施用达托霉素，持续4天。最后一剂达托霉素后24小时，对动物进行人道安乐死，并无菌取出心脏赘生物、肾脏和脾脏并进行定量培养。不同治疗组的每个器官的细菌密度计算为平均log₁₀ CFU/g组织(±95％置信区间)。

结果

与对照和单独的达托霉素相比，在测试的所有时间点(开始用达托霉素治疗之前或之后)将单剂量的CF-301加入达托霉素方案显著降低了所有三种靶组织中的MRSA密度(图3和表3)。用CF-301和达托霉素组合治疗的任何组都没有观察到统计学显著差异(表4)。

表3. 靶组织中的MRSA密度

表4. 治疗组的统计学比较*

*使用GraphPad Prism通过Student T-检验分析数据，并分级为P值大于0.05的无显著性(NS)，P值<0.05至0.001的统计学显著性。

这些结果表明，在不同的时间点(在达托霉素前对比与达托霉素相同时间和达托霉素施用之后长达4小时)向达托霉素中加入单剂量的CF-301显著降低了该模型中所有相关靶组织内的MRSA密度。令人惊讶的是，这些结果表明共同施用CF-301和达托霉素可用于在体内生物膜环境的背景中有效治疗MRSA。这些数据还表明，相对于常规抗葡萄球菌抗生素(比如达托霉素)的施用，CF-301的最佳和有效施用具有相对宽的时间窗。

实施例3. 治疗金黄色葡萄球菌菌血症(包括成人心内膜炎)的CF-301和背景护理标准(SOC)抗菌疗法。

材料和方法

七十一(71)例确诊为金黄色葡萄球菌菌血症/心内膜炎的患者，除了背景SOC抗菌疗法外还接受单次2小时的CF-301输注(CF-301治疗组)，比如静脉内万古霉素或达托霉素(6 mg/kg，静脉内，每天一次，持续6周)，和45例确诊为金黄色葡萄球菌菌血症/心内膜炎的患者仅接受护理标准抗生素(安慰剂组)。这116名患者构成了微生物意向治疗(mITT)II期临床研究的人群，且是主要疗效分析人群。主要疗效终点是第14天的临床应答率(CRR)。诊断和临床结果由盲法裁决委员会确定。

结果

平均患者为白人、男性，且约56岁(67.8％)。总计分别有38.8％的CF-301治疗患者和35.5％的安慰剂患者患有MRSA感染。两个治疗组中的大多数患者都患有菌血症(治疗组的77.5％和安慰剂组的86.7％)；然而，治疗组之间的左侧心内膜炎患者分布不均。与安慰剂患者的6.7％相比，总计15.5%的CF-301治疗患者患有左侧心内膜炎。CF-301治疗组的CRR为70.4％，而安慰剂组为60％(p=0.314)。

在MRSA感染患者的预先指定的分析中，用CF-301和护理标准抗生素治疗的组中的CRR比单独用护理标准抗生素治疗的患者中的CRR高约40% (74.1%对31.3%; p=0.01)。对于CF-301治疗组和安慰剂组，患有菌血症/右侧心内膜炎亚组的CRR分别为80%和59.5% (p=0.028)。在仅患有菌血症的患者中，对于CF-301治疗组和安慰剂组，CRR分别为81.8%和61.5% (p=0.035)。在接受CF-301的患者中，治疗突发不良事件(TEAE)的发生率在组间平衡(治疗组的88.9％和安慰剂组的85.1％)，严重TEAE也是如此(治疗组的47.2％和安慰剂组的51.1％)。19.4％的治疗组和14.9％的安慰剂组在从研究的药物施用到护理标准抗生素治疗结束后28天期间死亡。在任一治疗组中均未报告对CF-301过敏，且患者均未停止研究的药物。

该实施例的结果表明，与单独使用抗生素治疗MRSA菌血症(包括心内膜炎)相比，在护理标准抗生素治疗过程中加入单剂量的CF-301在应答率方面提供了临床上有意义的改善。此外，向护理标准抗生素方案中加入CF-301是良好耐受的。

本公开不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，根据前面的描述，除了本文描述的那些之外，其中使用的方法和组分的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其它材料通过引用并入本文。

实施例4. 加入DAP的CF-301的剂量施用在由MRSA引起的实验性感染性心内膜炎(IE)模型中的影响。

材料和方法

使用兔中由MRSA引起的左侧导管诱导IE模型来检查单独的CF-301和DAP以及CF-301与DAP组合的功效。该实施例中使用的MRSA菌株是MW2 (CA-MRSA; USA400; MIC (µg/ml)-DAP (0.5) CF-301 (1.0)，参见Indiani等人. Antimicrob. Agents Chemother.2019, 63 doi:10.1128/AAC.02291-18和Schuch等人. The Journal of infectiousdiseases 2014, 209, 1469-1478)。

简言之，对雌性新西兰白兔(Harlan Laboratories；体重2.3至2.5 kg)进行经颈动脉-经主动脉瓣膜导管术，并且在导管术后48小时(h)通过约1-2×10⁵ cfu的MW2的IV感染诱导IE。感染后24小时，将动物随机分到15组中的一个：1)对照；2)每天给予一次(QD)的媒介物对照；3-15)单独的DAP (4mg/kg，iv QD×4天；该剂量在实验性IE中产生显著但适度的MRSA清除率)；DAP+CF-301(在DAP治疗的第一天以IV剂量仅通过5-10分钟缓慢推注给予(mg/kg)：0.70 QD、0.35 Q12 、0.23 Q8h、0.35 QD、0.175 Q12h、0.117 Q8h、0.09 QD、0.045Q12h、0.03 Q8h、0.06 QD、0.03 Q12h或0.03 QD。另见图4。

在第5天，处死动物，取出靶组织(心脏赘生物、肾脏和脾脏)并定量培养。组织MRSA计数以平均log₁₀ CFU/g组织±SD给出。

使用双尾Student’s t检验分析不同组之间的组织MRSA计数。P值<0.05被认为是显著的。本研究中报告的所有P值均未进行调整。

结果

与媒介物对照相比，单独用DAP治疗导致所有三种靶组织中MRSA密度降低约2-3log₁₀ cfu/g。与单独的DAP(约3 log₁₀ cfu/g )和媒介物对照组(约6 log₁₀ cfu/g )相比，除DAP之外还给予所有CF-301剂量，甚至在最低CF-301剂量(0.03mg/kg)下，在所有靶组织中进一步显著降低MRSA密度。图5A-5D和表5。通常，以单剂量(“SD”)给予的DAP加CF-301令人惊讶地趋向于比在Q12h或Q8h给予的CF-301更好的微生物功效，尽管该差异在统计学上不显著。

这些结果表明，除亚致死性DAP之外还以多剂量策略和不同剂量方案给予的CF-301在进一步降低IE模型中相关靶组织中MRSA 密度方面具有显著功效(与单独的DAP和未治疗对照相比)。DAP 加上单剂量的CF-301倾向于比当以分次剂量策略施用时更好的功效。

表5. 兔IE模型中其他组织(肾脏和脾脏)的平均(± SD) MRSA密度

粗体字表示与单独DAP相比P <0.05；

^a与媒介物相比，P <0.01

实施例5 CF-301的目标实现以确定患有金黄色葡萄球菌(S. aureus)血流感染(菌血症)，包括心内膜炎的成年患者的最佳剂量

用来自患有金黄色葡萄球菌菌血症感染的72名人类患者的数据开发群体药代动力学(PPK)模型，以测定CF-301最佳剂量的目标实现(TA)模拟。向患者施用CF-301和护理标准抗生素。对于肌酸清除率小于60 mL/分钟的患者(包括透析患者)，以0.25 mg/kg或0.12mg/kg的单次2小时输注施用CF-301。PPK模型用于各种静脉内输注方案的TA模拟，如下所述。

确定三室模型以最佳拟合数据，并充分估计参数。清除率为4.2升(L)/小时(hr)，具有5.5％的相对标准误差(RSE)，且中心室(V_c)为4.5 L，具有8.2％的RSE。总体积分布为20.2升。数值低于先前在健康受试者中估计的数值，CL=7.1 L/hr 和体积分布(V_d) 27.7L。肌酸清除率是临床上有意义的协变量。预期中重度肾损伤患者的AUC_0-24或C_max为正常肾功能患者的AUC_0-24或C_max的1.3至2倍。年龄对外周清除率具有统计学显著性，但不具有临床意义(对AUC_0-24或C_max的影响小于4％)。

通过在固定剂量和基于体重的剂量范围内进行的肾功能对TA模拟进行分层。在具有正常肾功能或轻度损伤的患者中，18 mg 2小时IV输注的剂量分别导致1254 ng/ml和3026 ng*hr/mL的C_max和AUC_0-24。末期肾病(ESRD)患者，包括血液透析，8 mg 2小时IV输注的剂量导致C_max和AUC_0-24分别为910 ng/mL和3109 ng*hr/mL。这些暴露使>99％的受试者高于在动物中确定的AUC/MIC>0.2的预期有效阈值。

PPK模型充分描述了CF-301在患者中的PK。估计CL和V_d分别比健康受试者的低40％和17％。CrCl被确定为需要剂量调整的唯一具有临床意义的协变量。TA评估确定了达到最低功效的剂量。

Claims

1.一种治疗或预防受试者中由革兰氏阳性菌引起的感染性心内膜炎的方法，所述方法包括：

施用治疗有效量的一种或多种抗生素和包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其与SEQ ID NO: 2具有至少80％同一性的变体的PlySs2溶素的组合，其中所述变体包含对革兰氏阳性菌的杀菌和/或抑菌活性，并且其中所述一种或多种抗生素和所述PlySs2溶素以任何顺序同时或依次施用于对其有需要的受试者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PlySs2溶素或其变体以低于最小抑制浓度(MIC)剂量的剂量施用。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种抗生素以低于MIC剂量的剂量施用。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述PlySs2溶素和/或其变体和所述一种或多种抗生素以低于最小抑制浓度(MIC)剂量的剂量施用。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PlySs2溶素或其变体以单剂量施用于所述受试者。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素包括β-内酰胺、氨基糖苷、糖肽、噁唑烷酮、脂肽和磺酰胺中的一种或多种。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素包括糖肽、脂肽、噁唑烷酮和β-内酰胺中的一种或多种。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素的活性由于PlySs2溶素的存在而协同增强。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中变体PlySs2溶素包含SEQ ID NO. 3-17中的任一氨基酸序列。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述变体PlySs2溶素具有与SEQ IDNO: 2的多肽至少80％的同一性，并且包含在一种或多种抗生素存在下对革兰氏阳性菌的抑菌活性。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌是链球菌属(streptococcus)物种。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌是抗生素抗性的革兰氏阳性菌。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述心内膜炎是右侧心内膜炎。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述心内膜炎是人工瓣膜心内膜炎。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用步骤进一步包括每天施用多剂量的所述一种或多种抗生素。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括抑制革兰氏阳性菌的生长。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是静脉内药物使用者。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述感染性心内膜炎包含生物膜。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素是糖肽，且其中所述糖肽是万古霉素。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素是β-内酰胺，且其中所述β-内酰胺是青霉素。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素是青霉素，且其中所述青霉素是苯唑西林。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素是脂蛋白，且其中所述脂蛋白是达托霉素。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素是噁唑烷酮，且其中所述噁唑烷酮是利奈唑胺。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述CoNS包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominus)和沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)中的一种或多种。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MSSA)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)和猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)的一种或多种。

28.根据权利要求1-24和27中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌。

29.根据权利要求1-24和27中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌。

30.根据权利要求1-24和27中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。

31.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括溶血葡萄球菌。

32.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括沃氏葡萄球菌。

33.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括链球菌属细菌。

34.根据权利要求1-23和33中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括戈登链球菌(Streptocococcus gordonii)、缓症链球菌(Streptocococcus mitis)、口腔链球菌(Streptocococcus oralis)、中间链球菌(Streptocococcus intermedius)、唾液链球菌(Streptocococcus salivarius)、化脓链球菌(Streptocococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptocococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptocococcus dysgalactiae)、肺炎链球菌(Streptocococcus pneumoniae)和血链球菌(Streptocococcus sanguinis)中的一种或多种。

35.根据权利要求1-23、33和34中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌包括中间链球菌、化脓链球菌(兰斯菲尔德A群)、无乳链球菌(兰斯菲尔德B群)和停乳链球菌(兰斯菲尔德G群)中的一种或多种。

36.根据权利要求1-28或31-35中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌是抗生素抗性革兰氏阳性菌。

37.根据权利要求1-28或31-35中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌是抗生素敏感革兰氏阳性菌。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PlySs2溶素作为单剂量的剂量部分施用于受试者。

39.根据权利要求38所述的方法，其中每个剂量部分每8小时施用一次，持续1天。

40.根据权利要求38所述的方法，其中每个剂量部分每12小时施用一次，持续1天。

41.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者正在接受或已经接受抗生素治疗，且其中所述治疗进一步包括施用治疗有效量的包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其变体的PlySs2溶素。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述PlySs2溶素或其变体以单剂量静脉内施用。

43.根据权利要求42所述的方法，其中剂量范围为0.1 mg/kg至约0.3 mg/kg。