CN115209912A - 肽组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了抗微生物肽、编码所述肽的多核苷酸和含有所述肽的组合物。此外，本文描述了使用所述肽、所述多核苷酸和所述组合物用于研究和疗法的方法。

Description

肽组合物及其使用方法

关于联邦资助研究的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的授权号R01GM111824、R01GM60000和R21AI119104下受政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交并且据此以全文引用的方式并入本文。所述ASCII副本创建于2021年2月12日，命名为07005-021WO2_Sequence_Listing_2_12_2021_ST25，并且大小为17,555字节。

背景技术

随着抗生素耐受菌的迅速出现，新型抗生素的开发对于医学领域而言极为重要。抗微生物肽(AMP)的作用机制——质膜去稳定作用使得它们不太可能引发耐药表型。众所周知，革兰氏阴性菌很难用传统的小分子抗生素来治疗。因此，需要开发对难以治疗的微生物(特别是革兰氏阴性病原体)有效的新型肽。

发明内容

本公开的第一方面的特征在于与SEQ ID NO:3-29中任一者的序列具有至少85％(例如，至少90％、95％、97％或100％)的序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO:3-14中的任一者的序列具有至少85％(例如，至少90％、95％、97％或100％)的序列同一性。特别地，所述多肽具有SEQ ID NO:5的序列。所述多肽为抗微生物肽，诸如表现出破坏以下项的细胞膜的能力的多肽：微生物病原体(例如，不动杆菌属(鲍氏不动杆菌)、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属(万古霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、大肠杆菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌(包括β-内酰胺酶阳性分离菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、产酸克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、表皮葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌(青霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、酿脓链球菌或酿脓链球菌)；和/或真菌性病原体(例如，来自子囊菌门(例如，阿耶罗菌属、链格孢属、座壳孢属、曲霉属、节皮菌属、壳二孢属、平脐蠕孢属、芽生菌属、葡萄孢盘菌属(Botryotinia spp.)、毛壳菌属、枝孢属、球孢子菌属、弯孢属、裸孢壳属、金孢子菌属(Emmonsia spp.)、附球菌属、外瓶霉属、镰刀菌属、地丝霉属、地霉属、赤霉属、组织胞浆菌属、稻瘟菌属、绿僵菌属、红曲霉属、球腔菌属(Mycospaerella spp.)、丛赤壳属、新萨托菌属、脉孢菌属、拟青霉属、副球孢子菌属、青霉菌属、暗球腔菌属、单胞瓶梗孢子霉属(Phialemonium spp.)、柄孢壳菌属、核腔菌属、核盘菌属、帚霉属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、毛癣菌属、单端孢属、木霉属(Tricoderma spp.)、块菌属、Uncinocarpus属或轮枝菌属)、担子菌门(例如，丛梗霉皮伞属(Moniliophthora spp.)、掷孢酵母属、毛孢子菌属、黑粉菌属、隐球菌属或红酵母属)、壶菌门、接合菌门(例如，犁头霉属、淀粉霉属、Pilaira属、根毛霉属、根霉属或接合菌属)和茸鞭生物界中的卵菌门)。

所述多肽还可具有一种或多种D-氨基酸(例如，D-ALA、D-ARG、D-ASN、D-ASP、D-CYS、D-GLN、D-GLU、D-HIS、D-ILE、D-LEU、D-LYS、D-MET、D-PHE、D-PRO、D-SER、D-THR、D-TRP、D-TYR和D-VAL)、一种或多种L-氨基酸、或D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。所述多肽还可具有一种或多种衍生氨基酸(例如，N-im苄基组氨酸、4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸和鸟氨酸)。所述多肽还可具有化学部分(例如，胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基、甲酰基、羧基、甲酯、乙酯、酰肼、O-酰基和O-烷基。所述多肽可以为10个至20个氨基酸长度(例如，10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸)。所述多肽还可被环化。

本公开的第二方面的特征在于一种多核苷酸，其编码根据第一方面所述的多肽。

本公开的第三方面的特征在于一种载体，所述载体包含根据第二方面所述的多核苷酸,该多核苷酸编码根据第一方面所述的多肽。

本公开的第四方面的特征在于一种组合物，其包含根据第一方面所述的多肽、根据第二方面所述的多核苷酸或根据第三方面所述的载体。所述组合物还可包含药用载体、赋形剂或稀释剂。所述组合物可进一步包含治疗剂。特别地，所述治疗剂可以是抗微生物剂，诸如抗真菌剂(例如，三唑，诸如氟康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑；咪唑，诸如联苯苄唑、布康唑、克霉唑、依柏康唑、益康唑、芬替康唑、氟曲马唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑；和噻唑，诸如阿巴芬净)、多烯(例如，两性霉素B、杀念珠菌素、菲律宾菌素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素和龟裂杀菌素)、烯丙基胺(例如，阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬和特比萘芬)、棘球白素(例如，阿尼芬净、biafungin(例如，CD101)、卡泊芬净和米卡芬净)、羊毛甾醇去甲基化酶抑制剂(例如，VT-1161)和其他抗真菌剂，包括但不限于苯甲酸、环吡酮胺、恩夫马芬净(enfumafungin)(例如，SCY-078)、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、氯丙炔碘、托萘酯、氨基康定(aminocandin)、氯登妥因、氯苯甘醚、硝呋醛肟、十一碳烯酸和结晶紫，及其药用盐或酯。在一些实施方案中，根据第四方面所述的组合物为液体或固体。在某些实施方案中，根据本发明的第四方面所述的组合物中的所述多肽掺入所述组合物中或包被在所述组合物上。在一些实施方案中，根据第四方面所述的组合物掺入医疗装置、袖带、敷料材料、网眼织物、疝气贴片、伤口敷料、绷带、注射器、手套或家用产品、化妆品、药物产品、洗涤或清洁制剂、医疗装置表面、医疗装置材料、织物、塑料、塑料制品的表面、纸、非织造材料、木材、皮革或金属表面中。

本公开的第五方面的特征在于治疗微生物感染的方法，所述方法通过将根据第四方面所述的组合物施用于受感染的受试者(例如，人或动物，例如哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊和猫科动物)来实现。特别地，所述微生物感染可以是真菌感染(例如，尖孢镰刀菌、耶氏肺孢子虫、曲霉属、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌、念珠菌属、新型线黑粉菌、毛孢子菌、兔脑炎原虫、毕氏肠微孢子虫、卷枝毛霉、米根霉和伞状毛霉菌)或细菌感染(例如，鲍氏不动杆菌、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属、大肠杆菌、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和酿脓链球菌)。特别地，所述细菌感染是由鲍氏不动杆菌或肺炎克雷伯氏菌引起。所述受试者可以是例如人或其他非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。所述为牛非人类哺乳动物。所述牛可以患有乳腺炎。

本文所述的组合物(例如，含有一定量(例如，有效抗微生物量)的SEQ ID NO:3-29中任一者的肽(诸如SEQ ID NO:5的肽)的组合物)可用于治疗受试者(例如，人或其他哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物)的伤口。所述伤口可以是例如溃疡，诸如压疮(例如，褥疮)或糖尿病性溃疡(例如，糖尿病足溃疡)。所述受试者可以是糖尿病患者。本文所述的组合物可用治疗伤口(诸如溃疡，例如，糖尿病足溃疡)或减轻伤口严重程度的方法来施用。所述组合物和所述方法可用于治疗手术部位或外科伤口。所述组合物能够作为敷料(例如，作为绷带或伤口敷料)施用于手术部位或外科伤口。所述组合物能够直接施用于伤口(例如，作为液体(例如，喷雾剂)、乳液、糊剂或软膏)，或能够掺入敷料中或施用于敷料并施用于伤口。所述组合物能够全身施用以治疗伤口。

在一些实施方案中，可配制所述组合物用于局部施用。可将所述组合物局部施用于伤口，例如每天、每周、每两周或每月一次或多次。局部施用可每一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天进行一次或多次，或者直到伤口开始闭合(例如，在成熟期)。在某些实施方案中，局部施用进行1周至52周或更长时间(例如，2周、3周、4周、6周、8周、12周、24周或更长时间)。

本公开的第六方面的特征在于一种使用化学肽合成(例如，固相肽合成)制备多肽(例如，抗微生物肽，诸如SEQ ID NO:3-29的肽，例如，SEQ ID NO:5的肽)的方法。特别地，化学肽合成的方法的特征可在于Fmoc和/或Boc合成的使用。

本公开的第七方面的特征在于一种制备根据第一方面所述的多肽的方法，所述方法通过以下来实现：在已经用根据第二方面所述的多核苷酸(例如，所述多核苷酸可存在于根据第三方面所述的载体中)转化的细胞中表达所述多肽；然后从所述细胞(例如，大肠杆菌或真核细胞，诸如HeLa细胞、CHO细胞或HEK细胞)或所述细胞周围的培养基中回收所述多肽。

本公开的第八方面的特征在于一种试剂盒，所述试剂盒包含根据第一方面所述的多肽(诸如SEQ ID NO:3-29的肽，例如，SEQ ID NO:5的肽)、根据第二方面所述的多核苷酸、根据第三方面所述的载体或根据第四方面所述的组合物和任选地抗微生物剂(例如，抗细菌剂，诸如多粘菌素(例如，粘菌素)，或抗真菌剂)。试剂盒组分能够用于制备药物，所述药物用于治疗、预防受试者(例如，人或其他非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物)的(例如，伤口诸如溃疡(例如，足溃疡)的)微生物感染或降低受试者的微生物感染的严重程度。

定义

如本文所用，术语“酸性氨基酸”是指这样的氨基酸，其具有侧链，该侧链含有pKa在3.5至4.5之间的羧酸基。酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸。

术语“约”是指规定量的±10％。

如本文所用，术语“碱性氨基酸”是指这样的氨基酸，其侧链含有pKa在6.5至13之间(例如，在9.5至13之间)的氨基。碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸和精氨酸。

术语“类似物”包括具有与本文描述的多肽基本相同的氨基酸残基序列的任何多肽，其中一个或多个残基已经被功能类似的残基保守性替换，并且其显示如本文描述的多肽的功能方面。保守性替换的示例包括用一个非极性(疏水性)残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)替换另一个；用一个极性(亲水性)残基替换另一个，诸如在精氨酸与赖氨酸之间、在谷氨酰胺与天冬酰胺之间、在甘氨酸与丝氨酸之间进行替换；用一个碱性残基(诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)替换另一个；以及用一个酸性残基(诸如天冬氨酸或谷氨酸)替换另一个。短语“保守性替换”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基。

术语“化学衍生物”是指具有通过官能侧基的反应化学衍生的一个或多个氨基酸残基的受试多肽。此类衍生氨基酸的示例包括例如，其中游离氨基已经被衍生以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些氨基酸。此外，氨基酸的游离羧基可被衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。此外，某些氨基酸的游离羟基可被衍生以形成邻酰基或邻烷基衍生物。此外，组氨酸的咪唑氮可被衍生以形成N-im苄基组氨酸。还包括作为化学衍生物的含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些蛋白质或肽。例如，可用4-羟基脯氨酸替换脯氨酸，可用5-羟基赖氨酸替换赖氨酸，可用3-甲基组氨酸替换组氨酸，可用高丝氨酸替换丝氨酸，并且可用鸟氨酸替换赖氨酸。本文描述的多肽还包括相对于其序列在本文描述的任何一种多肽的序列具有残基的一个或多个添加和/或缺失的任何多肽。

如本文所用，“编码区”为核酸的一部分，该部分含有能被翻译成氨基酸的密码子。尽管“终止密码子”(TAG、TGA、TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。

术语“包含(comprising)”和“包括(including)”以及“具有(having)”和“涉及(involving)”(以及类似地“包含(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”和“涉及(involves)”)等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，其中的每个术语的定义与美国专利法对“包含(comprising)”的通用定义一致，并且因此被解释为意指“至少以下”的开放式术语，并且也被解释为不排除附加的特征、限制、方面等。因此，例如，“涉及步骤a、b和c的过程”意味着该过程至少包括步骤a、b和c。无论在何处使用术语“一个(a)”或“一个(an)”，都应理解为“一个或多个”，除非这种解释在上下文中是无意义的。

如本文所用，术语“持续时间”是指施用治疗剂(例如，本文描述的肽，或含有此类肽的组合物，或编码此类肽的多核苷酸)的时间长度或时间过程。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指能够被工程化以生成本文描述的抗微生物肽(AMP)的任何种类的细胞系统。

如本文所用，术语“非极性氨基酸”是指具有相对低的水溶性的氨基酸。非极性氨基酸为甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、缬氨酸和脯氨酸。

如本文所用，术语“百分比(％)同一性”是指在比对序列并引入缺口(如有必要)以达到最大百分比同一性后(例如，可在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入缺口以实现最佳比对，而为了比较的目的，可忽略非同源序列)，候选序列与参考序列的氨基酸残基(例如，本文公开的AMP)相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比同一性的目的，比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，给定候选序列相比给定参考序列、与给定参考序列或相对给定参考序列的百分比氨基酸序列同一性(其可另选地被表述为具有或包括相比给定参考序列、与给定参考序列或相对给定参考序列的一定百分比氨基酸序列同一性的给定候选序列)计算如下：

100×(A/B的分数)

其中A是在候选序列和参考序列的比对中被评分为相同的氨基酸残基的数量，并且其中B是参考序列中氨基酸残基的总数。在一些实施方案中，其中候选序列的长度不等于参考序列的长度，候选序列相比参考序列的百分比氨基酸序列同一性将不等于参考序列相比候选序列的百分比氨基酸序列同一性。

如果两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸的序列在如上所述针对最大对应进行比对时相同，则称这两个序列是“相同的”。两个序列之间的比较通常通过以下方式来进行：在比较窗口上比较序列以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。如本文所用，“比较窗口”是指具有至少约5个连续位置、约10个连续位置、约15个连续位置或更多个连续位置的片段，其中在一个序列与具有相同数量的连续位置的参考序列被最佳比对后，可将这两个序列进行比较。

如本文所用，术语“药用载体”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。药用载体与制剂的其他成分相容并且对接受者无害。药用载体可以为组合物提供药学稳定性(例如，为AMP提供稳定性)，或可赋予另一种有益特征(例如，持续释放特征)。载体的性质可因施用模式而异。例如，对于静脉施用而言，通常使用水溶液载体；对于口服施用而言，固体载体可能是优选的。

如本文所用，术语“药物组合物”是指这样的医药制剂或药物制剂：其含有药用纯度的活性成分，以及使该活性成分适用于施用方法的一种或多种赋形剂和稀释剂。药物组合物包含与例如本文描述的AMP相容的药用组分。药物组合物可呈水溶液形式，例如用于静脉内施用或皮下施用，可呈片剂形式或胶囊形式，例如用于口服施用，或可呈乳膏形式，例如用于局部施用。

如本文所用，术语“极性氨基酸”是指这样的氨基酸：该氨基酸在其侧链中具有由带有不同电负性的原子诱导的化学极性。极性氨基酸的极性取决于氨基酸侧链原子间的电负性和侧链结构的不对称性。极性氨基酸为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人或其他非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。

如本文所用，术语“样品”是指获自或衍生自目标受试者和/或个体的组合物，其含有例如基于物理、生化、化学和/或生理特征待进行表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。样品包括但不限于组织样品、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、母乳、全血、血液衍生细胞、尿液、脑脊液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养基、组织提取物(诸如匀浆组织、肿瘤组织)、细胞提取物及其组合。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指本文描述的组合物(例如，含有AMP(诸如SEQID NO:3-29中任一者的肽，诸如SEQ ID NO:5的肽)的组合物或基于核酸(例如，具有编码AMP的核苷酸序列的核酸，诸如编码SEQ ID NO:3-29中任一者的肽(诸如SEQ ID NO:5的肽)的核酸)的组合物)的量(例如，药物剂量)，该量有效诱导受试者或受试者中的所需生物学效应，或者有效治疗患有本文描述的医学病症或疾患(例如，微生物感染)的受试者。治疗有效量可以是足以对一种或多种细菌菌株表现出抗微生物活性的量。治疗有效量可使用本领域已知的测定法(诸如最低抑菌浓度(MIC)测定法或Kirby-Bauer纸片扩散测试)来确定。在本文中还应理解，“治疗有效量”可被解释为给予所需治疗效果的量，其以一个剂量或以任何剂量或途径服用，单独服用或与其他治疗剂组合服用。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指减少或改善医学病症(例如，疾病(例如，败血症)或伤口(例如，糖尿病足溃疡))和/或与其相关联的症状(例如，微生物感染)。应当理解，治疗医学病症不需要与其相关联的疾患或症状被完全消除(尽管不排除)。减少或降低医学病症(诸如微生物感染)的副作用或者医学病症的风险或进展可相对于未接受治疗的受试者(例如，对照、基线)或者已知的对照水平或测量值而言。所述减少或降低可相对于未接受治疗的受试者(或对照、基线)或者已知的对照水平或测量值为例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或约100％，或者可以是受试者经历医学病症或相关症状期间的天数的减少(例如，减少1天至30天、2个月至12个月、2年至5年或6年至12年)。

本文中无论在何处使用表述“例如”、“诸如”、“包括”等中的任一者，都应理解为遵循表述“并且不限于”，除非另有明确说明。类似地，“示例”、“示例性”等应理解为非限制性的。

本文使用的术语“基本上”允许与描述词的偏差不会对预期目的产生负面影响。即使没有明确地叙述“基本上”这个词，描述性术语也可由术语“基本上”进行修饰。因此，例如，只要精确的竖直布置对于杠杆执行其功能而言不是必需的，则表述“其中杠杆竖直延伸”意指“其中杠杆基本上竖直延伸”。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅以彩色执行的绘图。带有彩色绘图的本专利或专利申请公开文件的副本将由专利局根据请求和必要费用的支付提供。

图1为示出被AMP D-CONGA和D-CONGA-Q7以及被常规抗生素灭菌的耐药分离菌的百分比的图。x轴代表以μM为单位的MIC。y轴为在给定的MIC下每种抗生素能够消除的耐药分离菌的百分比。

图2A至图2C示出了深度外科伤口感染的动物模型的时间进程。图2A示出了感染铜绿假单胞菌的两只小鼠的每日图像。图2B为示出来自感染铜绿假单胞菌的小鼠中的创面的每日测量的总积分辐射的图。图2C为示出来自感染MRSA的小鼠中的创面的每日测量的总积分辐射的图。示出了成对差异的统计显著性，其是在应用Bonferroni校正进行多重比较后通过对对数值的t检验确定的。

图3为在第3天从实验动物身上取出的戊二醛固定的TEGADERM^TM敷料的一组代表性扫描电子显微镜图像。所有图像中的比例尺均为5μm。顶部两张图像示出了从感染铜绿假单胞菌的经载体处理的对照动物身上取出的TEGADERM^TM。这些动物的数据示出在图2A和图2B中。这些图像中的黑色箭头示出了密集的棒状物体簇，这些棒状物体簇无法在大小和形状上在铜绿假单胞菌细菌与铜绿假单胞菌菌膜之间进行区分。底部两张图像示出了从感染铜绿假单胞菌的经肽处理的对照动物身上取出的TEGADERM^TM。这些动物的数据示出在图2A和图2B中。未观察到与铜绿假单胞菌细菌一致的物体。这些图像中的黑色箭头指示非细菌碎片。

图4A和图4B为示出在感染铜绿假单胞菌(图4A)或MRSA(图4B)期间每天监测的每只小鼠的伤口状况的图。使用从0到4的数字系统评估了伤口状况。0＝无炎症或分泌物，1＝有轻度炎症和轻微分泌物，2＝有明显炎症、分泌物和变色，3＝有中度炎症，4＝有重度炎症、变色和脓液。

具体实施方式

本文描述了抗微生物肽(AMP)，其能够破坏多种感染性病原体(例如，细菌性或真菌性)的细胞膜，并具有改善的血液相容性(例如，在人红细胞、人血清或人组织的存在下)。我们鉴定了这样的AMP，该AMP在高浓度红细胞的存在下保留相对细菌性病原体(包括多药耐药菌株)的活性。这些肽对广谱细菌种类显示出优异的抗微生物活性。此外，AMP在真核细胞的存在下保留这种活性，并且比许多先前描述的抗微生物肽毒性更小。此外，AMP在体外和体内均具有抗生物膜活性，并且不太可能在革兰氏阴性菌中诱导耐药性。

抗微生物肽(AMP)

特征在于这样的抗微生物肽(AMP)，其能够破坏多种病原体的细胞膜，并具有改善的血液相容性(例如，在人红细胞、人血清的存在下)。例如，本文描述的AMP可与表1中列出的一个或多个序列(例如，SEQ ID NO:3-29)或其任何片段(例如，长度为至少3个、5个、10个或更多个连续氨基酸的片段)具有至少85％或更多(例如，90％、95％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，特别地，AMP具有SEQ ID NO:5的序列。

表1：AMP序列的列表

X₁为A或不存在；X₂和X₃各自独立地为K、R或其衍生物；X₄为G、Q、β-A或不存在；X₅为A或不存在；X₆为K、R或不存在；并且X₇为D、E或不存在。

特征AMP具有约6个至约20个氨基酸(例如，约6个氨基酸至约18个氨基酸、约6个氨基酸至约16个氨基酸、约6个氨基酸至约14个氨基酸、约10个氨基酸至约18个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸、约12个氨基酸至约18个氨基酸或约12个氨基酸至约16个氨基酸)。

本文描述的AMP可与表1中列出的一个或多个序列(例如，SEQ ID NO:3-29)或其任何片段(例如，长度为至少3个、5个、10个或更多个连续氨基酸的片段)具有至少85％或更多(例如，90％、95％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，该AMP在其开头和/或结尾处含有两个带电残基(例如，R或K)(例如，该AMP以RR、RK、KR或KK开头和/或以RR、RK、KR或KK或其任何变体结尾)，并可具有AX₁AX₂基序，其中A为丙氨酸，并且X₁和X₂是自该AMP的N-末端或C-末端起的三个氨基酸(例如，一个、两个或三个氨基酸)内的芳香族残基(例如，苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)。

本文描述的AMP可以是基本上两亲的。此外，AMP可以是基本上阳离子的和两亲的。AMP可对细菌(例如，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)具有抑制细胞生长性、细胞毒性或两者兼有。AMP还可对病毒、真菌、原生动物、寄生虫或其组合具有抑制细胞生长性、细胞毒性或两者兼有。AMP可对肿瘤或癌细胞(例如，人肿瘤和/或癌细胞)具有细胞毒性、细胞毒性或两者兼有，从而基于多个参数(例如，脂质组成、膜流动性、跨膜电位范围和溶液中的肽自组装)区分正常细胞。AMP可局部施用于肿瘤部位以促进肿瘤靶向。另选地，可使用存在于载体表面上的靶向剂(例如，抗体或其特异性结合至肿瘤特异性抗原的抗原结合片段)将含有一种或多种AMP的载体(例如，包裹AMP的脂质体或纳米颗粒)靶向癌细胞。

AMP可制备为分泌肽(例如，用于在细胞中作为具有可切割信号肽的前蛋白进行表达)。AMP也可制备为环肽。

本文描述的AMP可以能够减少由以下项引起的感染：细菌性病原体(例如，不动杆菌属(鲍氏不动杆菌)、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属(万古霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、大肠杆菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌(包括β-内酰胺酶阳性分离菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、产酸克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、表皮葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌(青霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、酿脓链球菌或酿脓链球菌)；和/或真菌性病原体(例如，来自子囊菌门(例如，阿耶罗菌属、链格孢属、座壳孢属、曲霉属、节皮菌属、壳二孢属、平脐蠕孢属、芽生菌属、葡萄孢盘菌属(Botryotinia spp.)、毛壳菌属、枝孢属、球孢子菌属、弯孢属、裸孢壳属、金孢子菌属(Emmonsia spp.)、附球菌属、外瓶霉属、镰刀菌属、地丝霉属、地霉属、赤霉属、组织胞浆菌属、稻瘟菌属、绿僵菌属、红曲霉属、球腔菌属(Mycospaerella spp.)、丛赤壳属、新萨托菌属、脉孢菌属、拟青霉属、副球孢子菌属、青霉菌属、暗球腔菌属、单胞瓶梗孢子霉属(Phialemonium spp.)、柄孢壳菌属、核腔菌属、核盘菌属、帚霉属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、毛癣菌属、单端孢属、木霉属(Tricoderma spp.)、块菌属、Uncinocarpus属或轮枝菌属)、担子菌门(例如，丛梗霉皮伞属(Moniliophthora spp.)、掷孢酵母属、毛孢子菌属、黑粉菌属、隐球菌属或红酵母属)、壶菌门、接合菌门(例如，犁头霉属、淀粉霉属、Pilaira属、根毛霉属、根霉属或接合菌属)和茸鞭生物界中的卵菌门)。例如，本文描述的AMP(例如，SEQ ID NO:5的肽)可以能够通过引起病原体裂解和细胞生长抑制，将具有感染性的细菌性病原体和/或真菌性病原体的量减少约1％至约100％(例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)。可在含有病原体的样品(例如，血液样品或组织样品)中确定所述减少。另选地，医师或兽医可监测受试者(例如，人或其他哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物)的应答性，以使用已建立的程序用本文描述的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29的一种或多种肽，诸如SEQ ID NO:5的肽)进行治疗(例如，全身治疗和/或局部治疗)。可在体外监测感染性病原体(例如，细菌或真菌)对本文描述的AMP的应答性，其中采集病原体样品并在实验室环境中以各种浓度的AMP进行培养(参见例如，实例3、4、6和8)。细胞生长的抑制以及本领域技术熟练的医师或兽医对受试者的观察可用于指示感染对AMP的应答性。

此外，本文描述的AMP能够将由ESKAPE病原体(例如，粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌)引起的感染减少1％至100％(例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)，所述ESKAPE病原体通常与抗微生物药物耐药性相关联。例如，本文描述的AMP(例如，SEQ IDNO:3-29的一种或多种肽，诸如SEQ ID NO:5的肽)能够用于减少受试者中具有感染性的细菌性病原体和/或真菌性病原体的量(例如，人或其他哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物；例如，存在于受试者身体中或身体上的病原体的量)。可使用例如来自受试者的含有病原体的样品(例如，血液样品或组织样品)来检测所述减少。AMP可例如通过引起病原体裂解和细胞生长抑制，将受试者中的病原体的量减少约1％至约100％(例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)。

本文描述的AMP可以能够减少由真菌引起的感染。真菌可以是来自以下项的霉菌：子囊菌门(例如，阿耶罗菌属、链格孢属、座壳孢属、曲霉属、节皮菌属、壳二孢属、平脐蠕孢属、芽生菌属、葡萄孢盘菌属(Botryotinia spp.)、毛壳菌属、枝孢属、球孢子菌属、弯孢属、裸孢壳属、金孢子菌属(Emmonsia spp.)、附球菌属、外瓶霉属、镰刀菌属、地丝霉属、地霉属、赤霉属、组织胞浆菌属、稻瘟菌属、绿僵菌属、红曲霉属、球腔菌属(Mycospaerellaspp.)、丛赤壳属、新萨托菌属、脉孢菌属、拟青霉属、副球孢子菌属、青霉菌属、暗球腔菌属、单胞瓶梗孢子霉属(Phialemonium spp.)、柄孢壳菌属、核腔菌属、核盘菌属、帚霉属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、毛癣菌属、单端孢属、木霉属(Tricodermaspp.)、块菌属、Uncinocarpus属或轮枝菌属)、担子菌门(例如，丛梗霉皮伞属(Moniliophthora spp.)、掷孢酵母属、毛孢子菌属、黑粉菌属、隐球菌属或红酵母属)、壶菌门、接合菌门(例如，犁头霉属、淀粉霉属、Pilaira属、根毛霉属、根霉属或接合菌属)和茸鞭生物界中的卵菌门，其为1％至100％(例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)。

特征还在于本文描述的AMP的模拟肽，其包括经化学修饰的肽、含有非天然存在的氨基酸的肽样分子、类肽等。AMP模拟肽保留了本文描述的抗微生物肽的特征，例如，具有抗微生物活性。特别地，AMP模拟肽保留了其衍生所源自的肽的细胞毒性和/或抑制细胞生长特性(例如，相对以下项的活性：例如，细菌细胞(例如，不动杆菌属(鲍氏不动杆菌)、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属(万古霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、大肠杆菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌(包括β-内酰胺酶阳性分离菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、产酸克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、表皮葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌(青霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、酿脓链球菌或酿脓链球菌)；或真菌(例如，霉菌病原体，诸如来自子囊菌门(例如，阿耶罗菌属、链格孢属、座壳孢属、曲霉属、节皮菌属、壳二孢属、平脐蠕孢属、芽生菌属、葡萄孢盘菌属(Botryotinia spp.)、毛壳菌属、枝孢属、球孢子菌属、弯孢属、裸孢壳属、金孢子菌属(Emmonsia spp.)、附球菌属、外瓶霉属、镰刀菌属、地丝霉属、地霉属、赤霉属、组织胞浆菌属、稻瘟菌属、绿僵菌属、红曲霉属、球腔菌属(Mycospaerella spp.)、丛赤壳属、新萨托菌属、脉孢菌属、拟青霉属、副球孢子菌属、青霉菌属、暗球腔菌属、单胞瓶梗孢子霉属(Phialemonium spp.)、柄孢壳菌属、核腔菌属、核盘菌属、帚霉属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、毛癣菌属、单端孢属、木霉属(Tricoderma spp.)、块菌属、Uncinocarpus属或轮枝菌属)、担子菌门(例如，丛梗霉皮伞属(Moniliophthora spp.)、掷孢酵母属、毛孢子菌属、黑粉菌属、隐球菌属或红酵母属)、壶菌门、接合菌门(例如，犁头霉属、淀粉霉属、Pilaira属、根毛霉属、根霉属或接合菌属)和茸鞭生物界中的卵菌门)。此外，AMP模拟肽在真核细胞(例如，红细胞)的存在下表现出微生物特异性。因此，AMP及其模拟肽相对哺乳动物细胞表现出低的或不显著的特异性或活性。

特征还在于具有与本文描述的AMP基本相同的作用的AMP或其类似物。此类AMP包括但不限于本文描述的AMP的替换、添加或缺失突变体(例如，其中AMP(例如，SEQ ID NO:3-29的AMP)的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸替换、被删除，或者其中向多肽添加一个或两个氨基酸)。还包括与多肽基本上同源的肽。各种序列比对软件程序可用于本领域中，以促进确定任何蛋白质与本发明蛋白质的同源性或等效性。

在本文描述的一些AMP中，可代替L-氨基酸或作为对L-氨基酸的补充使用D-氨基酸。甘氨酸由于两个氢而不具有手性。然而，所有其他氨基酸可以是D-氨基酸，包括：D-ALA、D-ARG、D-ASN、D-ASP、D-CYS、D-GLN、D-GLU、D-HIS、D-ILE、D-LEU、D-LYS、D-MET、D-PHE、D-PRO、D-SER、D-THR、D-TRP、D-TYR和D-VAL。特别地，AMP的一种或多种或所有氨基酸可被D-氨基酸替换。

在本文描述的一些AMP中，可使用L-氨基酸。甘氨酸由于两个氢而不具有手性。然而，所有其他氨基酸可以是L-氨基酸，包括：L-ALA、L-ARG、L-ASN、L-ASP、L-CYS、L-GLN、L-GLU、L-HIS、L-ILE、L-LEU、L-LYS、L-MET、L-PHE、L-PRO、L-SER、L-THR、L-TRP、L-TYR和L-VAL。特别地，AMP的一种或多种或所有氨基酸可被L-氨基酸替换。在本文描述的一些AMP中，L-氨基酸可用于某些位置，并且D-氨基酸可用于其他特定位置。

本文公开的AMP是一组AMP，该组AMP通过在过量人类生物样品(例如，红细胞、血清)的存在下其透过病原体(例如，细菌性病原体，诸如铜绿假单胞菌和大肠杆菌，以及真菌性病原体)的细胞膜的能力，以及通过其针对病原体细胞膜的特异性和对哺乳动物细胞(诸如红细胞)的低细胞毒性来鉴定。AMP是有吸引力的候选药物，因为其具有强大的抗细菌活性和诱发抗生素耐药细菌表型的低倾向。此外，本文描述的AMP被合理地设计为即使在真核细胞的存在下也具有相对病原体的活性，并具有针对细菌性病原体的超过真核细胞的特异性。

多核苷酸

特征还在于编码本文描述的多肽(例如，与表1中列出的一种或多种多肽(例如，SEQ ID NO:3-29的多肽，诸如SEQ ID NO:5的肽)具有85％(例如，90％、95％、97％、99％或100％)序列同一性的多肽)的多核苷酸。术语“多核苷酸”被广泛使用并且是指任何长度的聚合核苷酸。作为示例而非限制，本发明的多核苷酸可具有编码AMP的全部或部分(例如，表1的肽，以及与其具有至少85％序列同一性的肽(例如，超过至少5个、10个或更多个氨基酸(例如，在整个氨基酸序列上)))的序列。本文描述的多核苷酸可以是例如线性的、环状的、超螺旋的、单链的、双链的、分支的、部分双链的或部分单链的。多核苷酸的核苷酸可以是天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸。

本文描述的多核苷酸编码这样的AMP，所述AMP在真核细胞的存在下维持相对微生物性病原体(例如，真菌性感染(例如，酵母或霉菌)和细菌性感染)的活性，并且表现出降低的溶血活性和相对真核细胞的毒性。

以下多核苷酸序列也可通过本领域已知的方法来鉴定：所述多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:3-29中的任一者具有85％序列同一性的肽变体，并且表现出本文描述的AMP的特征。各种序列比对软件程序可用于促进确定同源性或等效性。这些程序的非限制性示例为：BLAST系列程序，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX(BLAST可从万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/处获得)；FastA；Compare；DotPlot；BestFit；GAP；FrameAlign；ClustalW；和PileUp。其他类似的分析和比对程序能够从各个供应商购得，诸如DNA Star的MegAlign，或GeneJockey中的比对程序。另选地，序列分析和比对程序能够通过万维网网址进行访问，诸如sdsc.edufResTools/cmshp.html处的CMS Molecular Biology Resource和www.expasy.org/处的ExPASy Proteomics Server。含有对应于基因或其片段的DNA或蛋白质序列的任何序列数据库都能够用于序列分析。常用的数据库包括但不限于GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS。

用于确定由一种或多种上述比对程序提出的同源性程度的参数在本领域中是众所周知的。它们包括但不限于p值、序列同一性百分比和序列相似性百分比。P值是对准偶然产生的概率。对于单个对准，p值可根据Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87:2246,1990来计算。对于多个对准，可使用启发式方法(诸如在BLAST中编程的方法)计算p值。序列同一性百分比被定义为：当查询序列与已知序列最佳对准时，该两者之间的核苷酸或氨基酸匹配数的比率。序列相似性百分比的计算方式与同一性百分比相同，只是在计算相似性百分比时，将不同但相似的氨基酸评分为正。因此，在不改变功能的情况下频繁发生的保守变化，诸如从一种碱性氨基酸到另一种的变化或从一种疏水性氨基酸到另一种的变化，就好像它们是相同的一样进行评分。

表达载体

特征还在于表达载体，其含有编码本发明的肽或其片段(例如，保留相对病原体的活性的AMP的片段(例如，在真核细胞诸如红细胞的存在下))的至少一种多核苷酸。例如，表达载体包括这样的多核苷酸，该多核苷酸编码表1的一种或多种肽及其与其具有至少85％序列同一性的变体。表达载体在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于病毒载体和质粒。用于递送所需多核苷酸并在所需细胞中表达的基于病毒的载体在本领域中是众所周知的。示例性的基于病毒的载体包括但不限于：重组逆转录病毒(参见例如PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127)、腺病毒载体、基于甲病毒的载体(例如，辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒)、罗斯河病毒、腺相关病毒(AAV)载体(参见例如PCT公开号WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)、牛痘病毒(例如，改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)或禽痘)、杆状病毒重组系统和疱疹病毒。

非病毒载体(诸如质粒)在本领域中也是众所周知的，包括但不限于：原核载体和真核载体(例如，基于酵母的质粒和基于细菌的质粒)，以及用于在哺乳动物细胞中表达的质粒。将载体引入宿主细胞中并分离和纯化表达的蛋白质的方法在本领域中也是众所周知的(例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Sambrook,等人,1989,ColdSpring Harbor Press)。宿主细胞的示例包括但不限于：哺乳动物细胞，诸如NS0细胞、CHO细胞、HEK和COS；以及细菌细胞，诸如大肠杆菌。

例如，含有编码本文描述的AMP的多核苷酸的载体可进一步含有标签多核苷酸序列以促进蛋白质分离和/或纯化。标签的示例包括但不限于myc-表位、S-标签、his-标签、HSV表位、V5-表位、FLAG和CBP(钙调蛋白结合蛋白)。此类标签可商购获得或易于通过本领域已知的方法制备。

载体可进一步包括编码接头序列的多核苷酸序列。通常，连接序列位于载体中处于编码AMP的多核苷酸序列与多核苷酸标签序列(例如，纯化标签序列)之间。连接序列能够编码随机氨基酸或可含有功能位点。含有功能位点的连接序列的示例包括但不限于含有Xa因子切割位点、凝血酶切割位点和肠激酶切割位点的序列。

作为示例而非限制，可如本文所述使用哺乳动物细胞培养系统中的哺乳动物表达载体或细菌培养系统中的细菌表达载体生成AMP。引物可用于从模板扩增所需序列。

制备方法

本文描述的AMP能够通过化学肽合成来制备(诸如通过经由化学缀合将不同的氨基酸彼此偶联)。化学肽合成特别适用于包含例如D-氨基酸、具有非-天然存在的侧链的氨基酸和具有经修饰的侧链的天然氨基酸，诸如甲基化半胱氨酸。化学肽合成方法在本领域中是众所周知的。肽合成能够作为固相肽合成(SPPS)或与溶液相肽合成相反来执行。最广为人知的SPPS方法是tBoc和Fmoc固相化学，其为本领域技术人员所熟知。此外，肽能够使用连接策略(两个未受保护的肽片段的化学选择性偶联)彼此连接以形成更长的肽，如Kent最初所述(Schnolzer&Kent(1992)Int.J.Pept.Protein Res.40,190-193)并且例如在Tam等人(2001)Biopolymers 60,194-205中所审查。这提供了实现超出SPPS范围的蛋白质合成的潜力。通过该方法已成功合成了许多大小为100个至300个残基的蛋白质。由于SPPS的进步，合成肽在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学的研究领域中继续发挥着越来越重要的作用。

对于重组生产，可将编码AMP的一种或多种多核苷酸或其任何片段或变体或衍生物插入到一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。对于表达而言，提供了一种载体(例如，表达载体)，该载体含有本发明的一种或多种多核苷酸。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体，所述表达载体含有AMP的编码序列或其任何片段或变体或衍生物以及适当的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。参见例如以下文献中描述的技术：Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，其中编码AMP或其任何片段或变体或衍生物(例如，编码区)的多核苷酸被克隆为与启动子和/或其他转录控制元件可操作缔合。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如，在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如，在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体都可含有单个编码区，或可具有两个或更多个编码区，例如，本文描述的载体能够编码一种或多种多肽，所述一种或多种多肽在翻译后或翻译时经由蛋白水解切割被分离成最终的多肽。此外，本文描述的载体、多核苷酸或核酸可含有异源编码区，所述异源编码区与编码AMP的多核苷酸或其任何片段或变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括例如特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是以下情况：基因产物(例如，多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰待转录的DNA模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该多核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。多种转录控制区为本领域技术人员已知的。在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区的示例诸如但不限于来自以下项的启动子增强子片段：巨细胞病毒(例如，与内含子-A结合的立即早期启动子)、猿猴病毒40(例如，早期启动子)和逆转录病毒(例如，劳斯肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如，启动子诱导型四环素)。类似地，各种翻译控制元件为本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

一旦通过重组表达产生了AMP或其片段，就可通过本领域中已知的用于纯化肽分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和性以及大小区分柱色谱法)、离心、溶解度差异法，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，AMP或其片段可与本文描述或本领域其他已知的异源多肽序列融合，以促进纯化或产生治疗性肽。

一旦分离，如有需要，可例如通过高效液相色谱法(参见例如Fisher,LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(Work and Burdon编辑,Elsevier,1980)；其公开内容通过引用并入本文)或通过凝胶过滤色谱法(诸如在SUPERDEX^TM 75色谱柱(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)上)进一步纯化AMP或其片段。可对通过化学肽合成产生的AMP或其片段采取类似的纯化步骤。一旦将分离的AMP或其片段从树脂上切割下来，就可如上所述对其进行进一步纯化。

在一些情况下，本文描述的AMP为环状AMP。环肽为有价值的药物、生物技术产品和科学研究工具(Davies,J.S.Amino Acids,Peptides and Proteins,34,149-217,2003)。环肽可能具有优于它们的线性相关肽的以下优势：环肽采样了更加狭窄的构象和构型空间。(Payne等人Curr.Org.Chem.,6,1221-1246,2002)。源于这一基本特性，环肽通常具有更强的结合常数和良好的药理特性，诸如对蛋白酶的抗性(Fairlie,D.P.；Tyndall,J.D.A.等人J.Med.Chem.,43,1271-1281,2000)。合成系统和酶促系统以及该两者的组合可用于产生此类环肽(Davies等人J.Peptide Sci.,9,471-501,2003；Hahn等人Proc.Nat.Acad.Sci.,101,15585-15590,2004)。

药物组合物

本文描述的抗微生物肽和多核苷酸可制备为含有本领域中已知的药用载体、赋形剂或稳定剂的呈冻干制剂形式或为水溶液的组合物(Remington:The Science andPractice of Pharmacy第20版,2000,Lippincott Williams and Wilkins,编辑K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并可包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述药用赋形剂。

组合物(例如，当用于本文描述的方法中时)通常包括，作为示例但不限于，有效量(例如，足以减轻疾病、减轻疾病症状和/或预防或减少疾病进展的量)的AMP或其片段(例如，表1的AMP)，以及与其具有至少85％序列同一性的其变体，以及其类似物或衍生物。

例如，可将组合物配制为包含约1μg/mL至约1g/mL的AMP(例如，0.5μg/mL至300μg/mL、1μg/mL至50μg/mL、20μg/mL至120μg/mL、40μg/mL至200μg/mL、30μg/mL至150μg/mL、40μg/mL至100μg/mL、50μg/mL至80μg/mL、或60μg/mL至70μg/mL、或10mg/mL至300mg/mL、20mg/mL至120mg/mL、40mg/mL至200mg/mL、30mg/mL至150mg/mL、40mg/mL至100mg/mL、50mg/mL至80mg/mL或60mg/mL至70mg/mL的AMP)。

组合物(例如，当用于本文描述的方法中时)通常包括，作为示例但不限于，有效量(例如，足以减轻感染和/或预防或减少感染进展的量)的表1中的AMP，或与其具有至少85％序列同一性的其任何变体，以及其类似物。

药物组合物可进一步包含用于增强和/或补充所需效果的附加试剂。作为示例，为了增强作为药物组合物施用的所述一种或多种AMP或其片段或组合的功效，该药物组合物可进一步含有抗微生物剂(诸如抗细菌剂或抗真菌剂)。

例如，如本文所用，抗细菌剂可以是Afenide、阿米卡星、阿莫西林、氨苄青霉素、胂凡纳明、奥格门汀、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、巴氨西林、杆菌肽、巴洛沙星、贝西沙星、卷曲霉素、碳头孢烯(氯碳头孢)、羧苄青霉素、头孢乙腈(cephacetrile)、头孢氯嗪、头孢克洛、头孢羟氨苄(cefadroxyl)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢来星(cephaloglycin)、头孢洛宁(cephalonium)、头孢洛仑、头孢噻啶(cephaloradine)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢孟多、头孢派罗、头孢匹林(cephapirin)、头孢曲秦、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉(cephazolin)、头孢卡奈、头孢卡品、头孢克列定(Cefclidine)、头孢达肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢吡肟、头孢他美、头孢三唑、头孢维曲、头孢克肟、头孢瑞南、头孢替林(Cefmatilen)、头孢甲肟、头孢氯铵、头孢美唑、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢噻利、头孢噻肟、头孢替坦、头孢维星、头孢噁唑、头孢西丁、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢丙烯(头孢罗奇)、头孢喹肟、头孢拉定(cephradine)、头孢罗替、头孢沙定、头孢舒米、头孢洛林、头孢他啶、头孢他啶/阿维巴坦(Avibactam)、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢噻氧、头孢唑肟、头孢托罗、头孢曲松、头孢呋汀、头孢呋辛、头孢唑南、头孢氨苄、氯霉素、氯己定、环丙沙星、克拉霉素、克拉维酸、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、柯利霉素、考利司特、Colistimethate、粘菌素(Colistin)、普鲁卡因青霉素(Crysticillin)、环丝氨酸2、地美环素、双氯青霉素、地红霉素、多利培南、强力霉素、头孢丙烯(Efprozil)、依诺沙星、厄他培南、红霉素、乙胺丁醇、氟氯西林、氟甲喹、磷霉素、呋喃唑酮、加替沙星、格尔德霉素、吉米沙星、庆大霉素、糖肽、格帕沙星、除莠霉素、亚胺培南、异烟肼、卡那霉素、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、脂糖肽(Lipoglycopeptide)、洛美沙星、美罗培南、甲氧西林、甲硝唑、美洛西林、米诺环素、丝裂霉素、莫西沙星、莫匹罗星、那氟沙星、萘夫西林、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、噁唑烷酮、噁喹酸、土霉素、土霉素、巴龙霉素、帕珠沙星、培氟沙星、青霉素G、青霉素V、吡哌酸、哌拉西林、吡咯米酸、匹氨青霉素、匹美西林、平板霉素、多粘菌素B、普那霉素、百浪多息、普卢利沙星、匹氨西林(Pvampicillin)、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普丁、利福布汀、利福拉齐、利福平、利福霉素、利福喷丁、罗索沙星、罗红霉素、芦氟沙星、西他沙星、司帕沙星、壮观霉素、螺旋霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺异噁唑、磺胺、舒他西林、替考拉宁、特拉万星、泰利霉素、替马沙星、四环素、甲砜霉素、替卡西林、替加环素、替硝唑、妥布霉素、妥舒沙星、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、醋竹桃霉素、曲伐沙星、结核放线菌素(Tuberactinomycin)、万古霉素、紫霉素、或其药用盐、或上述各项的组合。

AMP的药物组合物可包含抗微生物剂。抗微生物剂可以是抗真菌剂。可与本文描述的组合物一起使用的抗真菌剂包括医疗专业人员用于治疗微生物感染(诸如念珠菌病)的那些，包括例如：唑(例如，三唑，诸如氟康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑；咪唑，诸如联苯苄唑、布康唑、克霉唑、依柏康唑、益康唑、芬替康唑、氟曲马唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑；和噻唑，诸如阿巴芬净)、多烯(例如，两性霉素B、杀念珠菌素、菲律宾菌素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素和龟裂杀菌素)、烯丙基胺(例如，阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬和特比萘芬)、棘球白素(例如，阿尼芬净、biafungin(例如，CD101)、卡泊芬净和米卡芬净)、羊毛甾醇去甲基化酶抑制剂(例如，VT-1161)和其他抗真菌剂，包括但不限于苯甲酸、环吡酮胺、恩夫马芬净(enfumafungin)(例如，SCY-078)、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、氯丙炔碘、托萘酯、氨基康定(aminocandin)、氯登妥因、氯苯甘醚、硝呋醛肟、十一碳烯酸和结晶紫，及其药用盐或酯。

在治疗伤口(例如，溃疡，例如糖尿病足溃疡)的实施例中，可配制药物组合物用于局部施用。因此，该组合物可配制为糊剂(例如，含药糊剂)、软膏、乳膏、粉剂等。该组合物可制备为光滑、柔软、湿润和/或油性的制剂，其可局部施用于皮肤以治疗感染。糊剂或软膏也可应用于无菌伤口敷料，诸如纱布，然后将其应用于皮肤，使得糊剂或软膏接触待治疗的伤口或溃疡。

本公开的局部组合物可配制为糊剂或软膏，其可通过将配制的糊剂置于无菌纱布上而施用于伤口。然后可将经糊剂浸渍的纱布放置在伤口上，使得含药糊剂与伤口和伤口边缘接触。本公开的局部组合物可配制为AMP和/或抗生素或抗真菌剂的混合物，其可应用或喷洒在伤口中，从而覆盖创面和伤口边缘。局部组合物的体积将取决于伤口的大小。

治疗方法

AMP

通常，可将含有AMP的组合物作为药物(例如，用于治疗医学病症(例如，微生物感染))(例如，静脉内)施用于受试者(例如，有此需要的人类患者或其他哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物)。医学病症可以是例如败血症(例如，感染性休克)、链球菌性咽喉炎、脑膜炎、肺结核、破伤风、尿路感染或消化系统疾患或食物中毒(例如，霍乱和憩室炎)。由于其年龄、免疫系统受损、糖尿病或其他自身免疫疾病、肾脏或肝脏疾病和/或在医疗保健机构住院(例如，重症监护室或长期医疗保健机构)，受试者可能处于微生物感染(例如，败血症)的风险，或者受试者可以是先前已接受过不能解决感染的抗微生物治疗(例如，抗生素和/或皮质类固醇)的受试者。感染也可能是由耐药病原体引起。受试者可以是正在经历严重器官问题(例如，器官衰竭，诸如肺、肾脏、膀胱和/或消化系统衰竭)或处于感染高风险的受试者，诸如正在经受手术、器官移植和/或化疗的受试者。例如，受试者可以是正在经受手术的受试者，并且施用AMP组合物以在手术前或手术后治疗微生物感染或降低微生物感染的风险。还可针对不同的病症(例如，癌症)治疗受试者，并且施用(例如，预防性地)AMP组合物以治疗微生物感染或降低微生物感染的风险。

受试者可以是非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。在某些特定实施例中，受试者为牛，例如母牛(例如，奶牛)。所述牛可能有微生物感染。微生物感染(例如，由如本文描述的细菌引起)可引起牛乳腺炎，即牛乳房组织的炎症。

例如，本文描述的AMP可通过各种途径施用于有此需要的受试者(例如，受试者，诸如已被诊断有医学病症的人或其他非人类哺乳动物(例如，牛、马、犬、羊或猫科动物))，诸如在受医学病症影响的部位处或附近局部施用(例如，在微生物感染部附近注射)、静脉内施用、肠胃外施用、皮内施用、透皮施用、肌肉内施用、鼻内施用、皮下施用、经皮施用、气管内施用、腹膜内施用、动脉内施用、血管内施用、吸入施用、灌注施用、灌洗施用、局部施用和口服施用。在任何给定情况下，最合适的施用途径可取决于施用的特定AMP或组合物、受试者、药物制剂方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、受试者的年龄、体重、性别、医学病症的严重程度(例如，微生物感染的严重程度)、受试者的饮食和受试者的排泄率。组合物可施用一次或多于一次(例如，每年一次、每年两次，每年、每两个月、每月、每两周、每周、每日数次，或每日多于一次)。对于局部施用，AMP可通过将AMP置于所需位置的任何方式施用，包括导管、注射器、分流器、支架、微导管、泵、用装置植入或用支架植入。

本文描述的方法可涉及以下项的协调施用：(i)AMP，和(ii)抗微生物剂(例如，治疗真菌感染(例如，酵母或霉菌)或细菌感染的试剂)。AMP和抗细菌剂通常如本文别处所述，但作为示例可以是本文描述的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)和/或其变体以及粘菌素。

有许多不同的方法来协调施用可用于干预感染的AMP和抗微生物剂。例如，该方法可包括在AMP施用之前用抗微生物剂治疗。采用这种方法有助于用抗微生物剂快速治疗急性发作，同时在解决急性发作时用AMP补充抗微生物剂的作用。

在一个示例中，在AMP施用之前用抗微生物剂治疗受试者1至4次(例如，2至3次)，并且抗微生物治疗发生在例如AMP施用之前1周、2周或3周的时间范围内。因此，在一个具体示例中，可在相对于第0天(其为进行AMP施用的那一天)的第-14天、第-11天和第-8天进行抗微生物剂治疗。抗微生物治疗和/或AMP治疗中的任一者都可在上述天数之前或之后变化(例如，1天或2天)。

在另一个示例中，根据例如如上所述的计划，除了(或代替)先前的抗微生物治疗之外，抗微生物治疗与AMP施用同时进行。因此，在一个具体示例中，抗微生物治疗在第-14天、第-11天和第-8天(针对每个施用日±1天或2天)以及第0天(AMP施用的同一天)进行。可以继续用本文描述的抗微生物剂和AMP同时进行治疗，并由本领域技术人员监测，直到有效治疗感染。

本文描述的AMP可用于在用传统的抗微生物剂治疗失败后治疗感染。

可使用各种已知的途径和技术将本文描述的组合物递送至哺乳动物受试者(例如，人或其他哺乳动物)。例如，组合物可作为可注射溶液、悬浮液或乳液提供，并可使用常规方法(诸如注射器)或使用液体喷射注射系统，经由肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、腔内注射、肠胃外注射、表皮注射、动脉内注射、腹膜内注射或静脉内注射施用。组合物也可局部施用至皮肤或粘膜组织，诸如经鼻、气管内、经肠、经直肠或经阴道，或作为适用于呼吸施用或肺部施用的精细喷雾剂提供。其他施用模式包括口服施用、栓剂以及主动或被动透皮递送技术。

本文描述的组合物可以这样的量施用于受试者(例如，人类受试者或其他哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物，其具有或处于发生微生物感染的风险)，该量与剂型相容并且在预防上和/或在治疗上将是有效的。适当的有效量将落入相对宽的范围内，但可由本领域技术人员通过常规试验容易地确定。“Physician's Desk Reference”和“Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapies”可用于确定所需量。本文描述的活性抗微生物剂的足够剂量可取决于各种因素而变化，诸如制备方法、施用方法、症状的严重程度、施用时间、施用途径、排泄率和应答性等。通常，抗微生物剂将根据相关监管机构批准的标签进行施用。本文描述的AMP的足够剂量可取决于施用途径、受试者的年龄、感染的严重程度和感染病原体的特性而变化。具有本领域普通技术的医师或兽医可确定对治疗有效的施用剂量。

伤口愈合

本文描述的组合物(例如，含有SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP(诸如SEQ IDNO:5的AMP)的组合物和/或其变体)可施用于有此需要的受试者，以治疗(例如，治愈)或者减少或预防伤口或溃疡的发展。本文描述的组合物可配制为局部组合物以治疗皮肤伤口和外部溃疡，诸如压疮、褥疮(bed sore)(例如，褥疮(decubitus))、足溃疡、糖尿病足溃疡、外科伤口以及由气性坏疽引起的溃疡。

如本文所公开的，本公开的局部组合物和治疗方法可用于治疗糖尿病伤口或糖尿病性溃疡。例如，本文公开的局部组合物和治疗方法可用于治疗发炎或感染的糖尿病性溃疡。在一些情况下，本文公开的局部组合物和治疗方法可用于预防或治疗伤口或溃疡的感染。例如，本文公开的局部组合物和治疗方法可用于预防或治疗由如本文描述的细菌或真菌引起的溃疡或伤口的感染。在某些实施例中，所述方法用于治疗由以下项引起的伤口或溃疡：例如，葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、链球菌和/或假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)。

在其他示例中，本文公开的局部组合物和治疗方法可防止或减少对手术清创或截肢的需要。本文公开的局部组合物和治疗方法可用于治愈这样的溃疡，所述溃疡由于例如自身免疫病症(诸如糖尿病和系统性红斑狼疮)引起。本文公开的局部组合物和治疗方法可用于治愈由例如气性坏疽引起的溃疡。在许多示例中，与本领域中已知的其他伤口愈合方法相比，本文公开的局部组合物和治疗方法可减少治疗时间并增加愈合时间。

可在手术治疗之前或之后(例如，在手术部位处)应用局部组合物，以便治疗由病原体引起的感染或降低由病原体引起感染的风险。

在一些实施例中，本文描述的方法减小伤口或溃疡的大小，例如，(例如，相对于伤口或溃疡的原始大小)减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或100％。

剂量和施用

本文描述的药物组合物可以各种方式施用于受试者(例如，人或其他哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物)。例如，药物组合物可配制用于和/或口服施用、含服施用、舌下施用、肠胃外施用、静脉内施用、皮下施用、髓内施用、鼻内施用、作为栓剂施用、使用快速制剂施用、局部施用、皮内施用、皮下施用、经由肺递送施用、经由动脉内注射施用、眼科施用、光学施用、鞘内施用或经由粘膜途径施用。

一般而言，本文描述的药物组合物或药物组合物中的活性剂(例如，本文描述的AMP，诸如SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP，例如SEQ ID NO:5的AMP，和/或其变体)的剂量可在约1pg至约10g的范围内(例如，1pg至10pg，例如2pg、3pg、4pg、5pg、6pg、7pg、8pg、9pg、10pg；例如，10pg至100pg，例如20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg；例如，100pg至1ng，例如200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng；例如，1ng至10ng，例如2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng、10ng；例如，10ng至100ng，例如20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng；例如，100ng至1μg，例如200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg；例如，1μg至10μg，例如1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg；例如，10μg至100μg，例如20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg；例如，100μg至1mg，例如200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg；例如，1mg至10mg，例如2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg；例如，10mg至100mg，例如20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg；例如，100mg至1g，例如200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g；例如，1g至10g，例如2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g)。例如，AMP可以1μL至500mL范围内的体积(例如，1μL至10μL，例如1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL；例如，10μL至100μL，例如20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL；例如，100μL至1mL，例如200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL；例如，1mL至10mL，例如2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL；10mL至100mL，例如20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL；例如，100mL至500mL，例如200mL、300mL、400mL、500mL)以任何上述量施用。

药物组合物也可以单位剂型或以约0.01mg/kg至约100mg/kg的每受试者质量或体重剂量施用(例如，0.01mg/kg至0.1mg/kg，例如0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg；例如，0.1mg/kg至1mg/kg，例如0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg；例如，1mg/kg至10mg/kg，例如1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg；例如，10mg/kg至100mg/kg，例如20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg)。该剂量也可以每单位天每受试者质量或体重剂量施用(例如，0.1mg/kg/天至10mg/kg/天)。

给药方案可通过正在解决的临床适应症以及通过各种受试者变量(例如，体重、年龄、性别)和临床表现(例如，疾病的程度或严重程度)来确定。此外，药物组合物可连续施用或分成每给定时间范围给予的剂量。该组合物可例如每小时、每天、每周、每月或每年一次或多次施用(例如，全身)或应用(例如，应用于伤口部位)。

在治疗伤口(例如，溃疡，例如糖尿病足溃疡)的实施例中，可配制组合物用于局部施用。可每天、每周、每两周或每月一次或多次将所述组合物局部施用于伤口。局部施用可每一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天进行一次或多次。局部施用可进行1周至52周或更长时间(例如，2周、3周、4周、6周、8周、12周、24周或更长时间)。

试剂盒

AMP

特征还在于含有本文描述的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP(诸如SEQ ID NO:5的AMP)，和/或其变体)的试剂盒，其例如用于本发明方法。本发明的试剂盒包括：一个或多个容器，所述一个或多个容器包含例如AMP、编码一种或多种AMP的多核苷酸、其组合及其片段；以及任选地针对根据本文描述的任何方法进行使用的说明。

通常，这些说明包含对施用的描述或针对测定的执行的说明。所述容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明，但是也设想了机器可读的说明(例如，在磁性或光学存储盘上携带的说明)

试剂盒可以合适的包装提供。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还设想了与特定装置组合使用的包装，所述特定装置诸如吸入器、鼻施用装置(例如，雾化器)或输注装置(诸如微型泵)。试剂盒可具有无菌接入端口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋，或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可具有无菌接入端口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋，或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可任选地提供附加组件，诸如缓冲液和解释信息。通常，试剂盒包括容器，以及在该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页。

试剂盒还可包括配制用于局部施用的组合物(例如，作为糊剂(例如，含药糊剂)、软膏、乳膏、粉剂等)。该组合物可存在于试剂盒中的管子、喷雾瓶、罐子或其他容器中。

实例

提出以下实例以向本领域普通技术人员提供对本文描述的组合物和方法可如何使用、制备和评估的描述，并且旨在仅作为本发明的示例，而并不旨在限制本发明人认为的其发明范围。

实例1.AMP合成

在TentaGel-S-ram树脂上使用固相肽合成法合成AMP。由HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐，六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲)、HOBt(羟基苯并三唑)和DIPEA(二异丙基乙胺)催化受FMOC保护的氨基酸的偶联。偶联后，通过哌啶于二甲基甲酰胺中的溶液除去FMOC。用含有水、酚和三异丙基硅烷的三氟乙酸完成侧链保护基团的切割和肽从树脂中的释放。通过反相高压液相色谱法进行纯化。通过将N-末端氨基直接偶联到C-末端羧基(CONGA-OH)或C-末端谷氨酸酰胺(CONGA-E)的侧链进行环化。使用标准肽合成偶联试剂进行偶联。

实例2.AMP变体保留活性

测试了D-CONGA(SEQ ID NO:1)的肽变体相对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌的活性。通过肉汤稀释法在96孔板中测量最低抑菌浓度(MIC)。将肽在缓冲液或含有1x10⁹个人RBC/ml的缓冲液中连续稀释。孵育1小时后，在生长培养基中添加细菌，并将板在37℃下孵育过夜。灭菌后对孔进行鉴定以确定MIC。通过以下操作来测量溶血：将1x10⁸个人RBC与经连续稀释的肽一起孵育30分钟，然后对细胞离心，并通过410nm处的吸光度测量上清液中的释放的血红蛋白。通过用去污剂Triton-X100处理确定了100％溶血的值。通过在SYTOX Green(其是通过膜透化报告细胞死亡的一种DNA结合染料)的存在下将经连续稀释的肽与WI38人成纤维细胞一起孵育来测量毒性。通过相对SYTOX Green荧光示出50％细胞毒性的肽浓度表示为EC50。

表2提供了示出以下项的数据：在不存在和存在浓缩人RBC时的MIC值，100微摩尔肽时的溶血，以及相对人成纤维细胞(WI-38细胞)的毒性的EC₅₀。这些数据表明，在浓缩宿主细胞的存在下，D-CONGA(SEQ ID NO:1)的肽变体保留了相对临床相关感染性病原体(例如，大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌)的活性。

实例3.RBC存在时AMP的最低灭菌浓度

为了确定在RBC的存在下能够有效限制细菌生长的AMP(例如，本公开的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP))的最低浓度，可执行改良的肉汤稀释测定。本公开的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者)和小分子抗生素(例如，万古霉素和链霉素)可以0.025％乙酸H₂O溶液中所需的最终浓度的5倍来制备。AMP和抗生素可在96孔标准底板上(每孔25μL)以2:3的倍数水平连续稀释。可为对照物保留一个柱。可将0个细胞/mL和2.5x10⁹个细胞/mL下的RBC以50μL等分部分添加到适当的孔中。孵育30分钟后，可将接种了5x10⁵CFU/mL的50μL TSB生长培养基添加到所有孔中，并可将板在37℃下孵育过夜。为了评估细菌生长，可在将10μL溶液从原始板添加到100μL无菌TSB中的情况下执行AMP和小分子抗生素的第二次接种。在37℃下过夜孵育后，可测量OD600(小于0.1的值被认为已灭菌)。

实例4.RBC存在时的径向扩散

为了进一步确定在RBC的存在下AMP(例如，本公开的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP))的活性，可执行改良的径向扩散测定。可将AMP引入琼脂糖板的小孔中，并可允许其扩散到周围的介质中。该板(其可接种细菌细胞)可孵育过夜，并可检查微生物生长的程度，并且如果AMP有效的话，则孔周围会有明显的小的生长抑制区。可通过将5g低EEO琼脂糖和0.03g TSB添加到500mL 10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中来制备底层琼脂糖。可通过将5g低EEO琼脂糖和30g TSB添加到500mL 10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中来制备覆盖层琼脂糖。两种溶液都可被加热直到琼脂糖熔化，然后可被高压灭菌。可向矩形单孔板中添加20mL底层琼脂糖，其接种有8x10⁶CFU的细菌。来自Sigma-Aldrich的无菌96孔板复制器可设置在熔化的琼脂糖中，并在琼脂糖凝固后立即取出。抗生素(例如，万古霉素和链霉素)可以最终所需浓度的4倍制备。对于抗生素标准品，在96孔板上进行3:4的连续稀释，然后用PBS进行1:4的稀释。除此以外，可使用RBC和/或血清将AMP稀释至20μM，以提供2％(1x10⁸个细胞/mL)至20％(1x10⁹个细胞/mL)的浓度。在将10μL AMP或小分子抗生素添加到孔中的底层中之前，将溶液在37℃下轻轻摇动孵育30分钟。将倒置板在37℃下孵育3小时。添加覆盖层，并可将板倒置孵育过夜。可清除表面生长，可使用25％甲醇和5％乙酸对板消毒。AMP抑制细菌生长的能力可通过分析抑制区来评估，可使用ImageJ对其进行拍照和分析。

实例5.溶血测定

体内大量血细胞的破坏可能会给宿主带来问题，导致诸如贫血和黄疸等病症，因此在体外测量潜在治疗剂的溶血非常重要。本公开的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)可在PBS中以100μM的浓度开始连续稀释。每个孔中每个AMP的最终体积可以为50μL。可向每个孔添加浓度为2x10⁸个细胞/mL的50μL RBC的PBS溶液。作为阳性裂解对照，可使用1％TRITON^TM。可将混合物在37℃下孵育1小时，然后可将其以1000xg离心5分钟。离心后，可将10μL上清液转移到新鲜的96孔板中的90μL DI H₂O中。可记录释放的血红蛋白在410nm处的吸光度，并可基于100％和0％裂解对照计算溶血分数，以鉴定AMP的潜在毒性。较大的溶血分数评分表示较高的溶血毒性。

实例6.CFU减少测定

为了更好地了解在RBC的存在下AMP的行为，可执行具有RBC的改良菌落形成单位(CFU)减少测定。与观察全有或全无生长/灭菌的肉汤稀释测定不同，CFU测定观察在使用AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)的固定孵育期后保持悬浮的活细菌细胞的数量。通过AMP减少的CFU可通过在混合物的稀释液中平板接种并计数CFU来进行计算。可在0.025％乙酸中以最终浓度的5倍制备AMP，并可将30μL添加到96孔板的单个孔中。可在PBS中以2.5x10⁹个细胞/mL制备细菌悬浮液。可将2.5x10⁹个细胞/mL的PBS或RBC添加到60μL体积的肽中。然后可将板在37℃下孵育1小时。然后可将混合物连续稀释为1:10，并可在TSB琼脂上点滴稀释液。琼脂板可在37℃下孵育过夜，并可于次日对菌落进行计数，以确定在存在和不存在RBC的情况下AMP的功效。

实例7.肽提取

通过将少量甲醇添加到树脂珠池中并使其蒸发，可将珠子固定在培养皿上。珠子可通过暴露在紫外线下五小时而被“预切割”。在用于抗微生物测定之前，可将30μL的0.025％乙酸添加到在96孔板的每个孔中。可使用镊子从培养皿中取出各个珠子并放入孔中(每孔一个珠子)。可向每个孔中添加30μL HFIP，然后将板在紫外光下摇动孵育2小时(或直到溶剂蒸发)。接下来，可将35μL PBS添加到所有孔中，并可将板放在摇床上过夜。在测定之前，可将肽溶液转移到新鲜的96孔板中以从合成树脂中分离肽溶液，并可储存提取板用于索引。提取肽的平均浓度可以为约15μM。

实例8.混合径向扩散肉汤稀释筛

混合径向扩散肉汤稀释筛突出了肉汤稀释测定和径向扩散测定的益处(分别为实例3和实例4)。可向96孔板中的30μL提取肽中添加6μL的6x10⁹个细胞/mL的RBC，然后将板在室温下摇动孵育1小时。孵育后，可将板以1000xg离心五分钟以使细胞沉淀。可从板中取出五微升上清液，并将其添加到第二个板中的60μL PBS中。可在410nm处针对溶血读取该板。接下来，可重新悬浮细胞，并可将10μL溶液添加到含有大肠杆菌的径向扩散板中。这些板可如上文实例4中所述进行处理。可向剩余的20μL肽/RBC溶液中添加20μL的5x10⁵CFU/mL的铜绿假单胞菌的1％TSB的PBS溶液。可允许板在37℃下孵育3小时。孵育后，可添加40μL的2xTSB，并可将板在37℃下孵育过夜。由于存在致密的RBC，细菌生长的抑制最初可通过孔中缺乏脱氧来检测(如通过RBC着色所证明)。可从疑似已被抑制的孔中取出等分部分并铺在TSA板上。这些板可在37℃下孵育，以验证微生物的存在/不存在。

实例9.细胞毒性测定

可测试本文描述的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)的对哺乳动物细胞(例如，人细胞)的毒性。上皮肝癌细胞，例如，CCLP-1细胞，可在T-75烧瓶中的完全DMEM(10％FBS)中生长至融汇。在细胞毒性实验的前一天，可对细胞进行胰蛋白酶消化，从烧瓶中取出，并以1000xg进行沉淀。可丢弃胰蛋白酶和用过的培养基，并可将细胞重新悬浮在完全DMEM中。可使用标准血细胞计数器获得细胞计数。然后可将细胞以3.5x104个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。在单独的96孔板中，AMP(例如，本公开的AMP(例如，SEQ IDNO:3-29中的任一者的AMP))可从100μM的浓度开始在无血清DMEM中连续稀释。每个孔中肽的最终体积可以为100μL。为了执行细胞毒性测定，可从孔中取出培养基并用肽/DMEM溶液代替。无血清培养基中的无肽、SEQ ID NO:1和2的AMP和20μM蜂毒肽可分别用作阴性对照和阳性对照。可将细胞在标准组织孵育箱中孵育一小时。该孵育后，可将10μL

检定试剂添加到板中的每个孔中，然后可将板放回孵育器中。额外孵育两小时后，可读取板的荧光，其中激发波长为530nm，并且发射波长为590nm。可基于100％和0％裂解对照计算细胞毒性。

实例10.使用AMP治疗感染

患有由病原体引起的感染的受试者(例如，不动杆菌属(鲍氏不动杆菌)、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属(万古霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、大肠杆菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌(包括β-内酰胺酶阳性分离菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、产酸克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、表皮葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌(青霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、酿脓链球菌或酿脓链球菌)可使用AMP(SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)进行治疗。如果感染是在伤口中，则可以适当的剂型(例如，溶解在缓冲液中，或掺入乳膏或其他局部组合物中)施用AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP，诸如SEQ ID NO:5的AMP，和/或其变体)。施用后，AMP靶向并裂解微生物细胞，从而抑制生长并治疗感染。施用AMP后，本领域技术人员可通过各种方法监测受试者对AMP疗法的应答方面的改善。

实例11.预防免疫受损受试者的感染

免疫受损的受试者(例如，患有癌症、正在经受化疗的受试者)可在手术后用本文描述的抗微生物肽(例如，SEQ ID NO:3-29)进行治疗，以治疗感染和/或抑制病原体的生长(例如，不动杆菌属(鲍氏不动杆菌)、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属(万古霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、大肠杆菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌(包括β-内酰胺酶阳性分离菌)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、产酸克雷伯氏菌(包括产生ESBL和KPC的分离菌)、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、表皮葡萄球菌(甲氧西林敏感分离菌和耐药分离菌)、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌(青霉素敏感分离菌和耐药分离菌)、酿脓链球菌或酿脓链球菌)，包括耐药形式(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌)，从而治疗受试者和/或预防受试者感染。

实例12.使用AMP对表面进行消毒

表面(例如，手术台或工具台)可通过应用含有本文描述的AMP(SEQ ID NO:3-29)的合适组合物持续合适的持续时间来消毒以除去病原体(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。多药耐药病原体在医院环境中变得越来越普遍，并且是一个日益严重的问题。AMP(具有其引发抗生素耐药性细菌表型的低倾向)可用于对具有微生物病原体(例如，细菌或真菌)的医院表面进行消毒，包括多药耐药病原体(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。

实例13.针对耐药性的诱导测试AMP

已知会发生相对肽抗生素的细菌耐药性，尽管据报告它比相对常规小分子抗生素的耐药性更难诱导。铜绿假单胞菌可通过选择具有改变的外膜组成的变体来获得对一些AMP的耐药性。铜绿假单胞菌可用于筛选以相对快速耐药性进行选择。本公开的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)可进行测试以确定它们是否避免产生铜绿假单胞菌相对本文描述的AMP的耐药性，并可将它们与铜绿假单胞菌在相同条件下适应常规抗生素(例如，小分子抗生素)的能力进行比较。对于十次连续传代，肉汤灭菌测定可使用2/3连续稀释的抗生素进行过夜生长。对于每次传代，在最高抗生素浓度下生长的细菌可用于过夜扩增以供后代使用。

实例14.针对伤口微生物感染的治疗测试AMP

可使小鼠的深度伤口感染铜绿假单胞菌的发光菌株，并使用整个动物成像进行监测。可从感染后2小时开始，用合适的媒介(例如，0.025％乙酸)中的AMP(例如，本公开的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP))每日两次进行治疗。AMP D-CONGA和L-CONGA(分别为SEQ ID NO:1和2)可用作阳性对照。动物可在第0天、第1天和第2天进行治疗。可监测经治疗的小鼠的总行为评分(行为评分量表为0(正常)至3(最大异常)，其各自针对的是活动/筑巢、运动、握力、皮毛状况和姿势，以确定AMP治疗的功效。最高分(最差状况)＝15)。

实例15.通过铜绿假单胞菌吸气诱导的急性肺炎的AMP治疗

可从Charles River Laboratories获得五周龄的雌性C57BL/6小鼠。收到后，可允许它们至少有一周的时间从运输中恢复并适应新的居住环境。小鼠可被维持标准的食物饮食。可用不小于六周且不大于九周的小鼠进行实验。铜绿假单胞菌PA01可在37℃的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中培养过夜，并以220RPM摇动。在使小鼠感染之前，可将过夜培养物稀释100倍为25mL的新鲜TSB。在可确定光密度之前，可使培养物生长三小时。先前的生长曲线实验可允许将这种新扩展的培养物稀释至1.4x10⁸CFU/mL。为了使动物感染，可使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并可经由气管内滴注施用50μL细菌悬浮液(7x10⁶CFU)。简而言之，可将经麻醉的小鼠通过它们的前脚悬挂在线材上，并可使用钝钳来提取舌头。可将舌头拉出并拉下。可使用微量移液器将细菌悬浮液沉积在喉咙后部。然后可在小鼠从麻醉中恢复时覆盖该动物的鼻孔。可轻轻揉胸以促进吸气。可让小鼠吸气15次，然后可松开舌头，并将小鼠从线材上移开。然后可允许所述动物一分钟完全醒来，然后放回它们的笼子。

然后可使用本文描述的AMP(例如，SEQ ID NO:3-29中的任一者的AMP)来治疗小鼠，并且AMP D-CONGA(SEQ ID NO:1)和L-CONGA(SEQ ID NO:2)可用作阳性对照，可将其滴注到气管中，正如上文针对细菌感染的施用所述那样。在尝试治疗肺部的铜绿假单胞菌感染之前，可确定经由吸气施用AMP的安全剂量。基于体外毒性数据，给药方案可例如为每8小时施用一次，持续3天(9剂)。作为无治疗对照，可以按相同计划施用等体积的PBS。

为了监测毒性，可测量动物行为和体重变化。这些研究可表明，小鼠可以能够耐受口服剂量的AMP。

实例16

我们鉴定了AMP，诸如D-CONGA，其在RBC和血清的存在下，在体外相对所有ESKAPE病原体都非常有效。该肽还在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中具有抗生物膜活性，并在小鼠伤口感染模型中显示出相对革兰氏阴性耐药菌和革兰氏阳性耐药菌及其生物膜的效力。

在这里，我们合成了13种D-CONGA变体，它们大致可分为4类，插入、缺失、交换和环化。然后针对以下来表征这些变体：在存在和不存在RBC的情况下，它们相对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的活性。还测量了它们相对哺乳动物成纤维细胞、WI-38和RBC中的溶血的细胞毒性。然后针对14种临床分离菌对最佳变体AMP进行了测试，其中包括来自囊性纤维化症患者的肺炎克雷伯氏菌、PDR鲍氏不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的耐药菌株。将该肽的抗微生物活性与D-CONGA和来自四个不同类别的八种常规抗生素进行了比较。我们已经确定了相对于传统抗生素而言，AMP表现出相对MDR细菌菌株提高的活性。

方法和材料

肽和抗生素.

肽在实验室中使用固相肽合成(SPSS)方法合成，或从Bio-Synthesis Inc.(Lewisville,Texas)获得。通过HPLC，它们具有>95％的纯度。抗生素是从不同的供应商处获得的。除非另有说明，否则所有溶液都是通过将冻干的肽或抗生素粉末溶解在0.025％(v/v)乙酸中制备的，并通过280nm处的吸光度确定浓度。

肉汤稀释测定.

抗微生物肽和常规抗生素制备为0.025％乙酸中所需的最终浓度的5倍。抗生素在来自Corning的96孔板上(每孔25μL)以2:3的倍数水平连续稀释。为对照物保留一个柱。针对在RBC的存在下执行的测定，将0个细胞/mL或2.5x10⁹个细胞/mL的O+型人RBC以50μL等分部分添加到所有孔中。孵育30分钟后，将接种有5×10⁵CFU/mL的50μL TSB添加到所有孔中，并将板在37℃下孵育过夜。在37℃下孵育过夜后，测量OD600(小于0.1的值被认为已灭菌)。为了评估RBC测定中的细菌生长，在接种第二天后测量OD600，其中将来自原始板的10μL溶液添加到100μL无菌TSB中，然后孵育过夜。

溶血.

肽在PBS中以100μM的浓度开始连续稀释。每个孔中肽的最终体积为50μL。向每个孔添加浓度为2x10⁸个细胞/mL的50μL RBC的PBS溶液。作为阳性裂解对照，使用了1％triton。将混合物在37℃下孵育1小时，然后将其以1000g离心5分钟。离心后，将10μL上清液转移到新鲜的96孔板中的90μL DI H₂O中。记录释放的血红蛋白在410nm处的吸光度，并基于100％和0％裂解对照计算溶血分数。

Sytox Green细胞毒性测定.

WI-38细胞在T-75烧瓶中的完全DMEM(含有15％FBS，加上抗生素和非必需氨基酸)中生长至融汇。在细胞毒性实验的前一天，对细胞进行胰蛋白酶消化，从烧瓶中取出，并进行沉淀。将细胞重新悬浮在完全DMEM中，并使用细胞计数器获得细胞计数。然后将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。次日，在单独的96孔板中，将肽在含有0.1％SYTOX^TM Green的完全DMEM中从浓度100μM(第1孔)、50μM(第2孔)开始连续稀释，然后在板上以2:3的倍数进行水平连续稀释。为了执行细胞毒性测定，从过夜细胞培养板的孔中取出培养基，用PBS洗涤一次，并用50μl肽和SYTOX^TM Green混合物处理。在385nm的激发波长和530nm的发射波长下，针对荧光每5分钟读取一次板，持续一小时。MelP5是一种有效的MPP，可导致100％SYTOX^TM Green进入细胞，其用作阳性对照，以使测试的肽的细胞毒性归一化。

伤口感染模型.

所有动物研究都严格遵守杜兰医学院鼠类机构动物护理和使用委员会批准的131号议定书。经由腹膜内注射剂量分别为90mg/kg和10mg/kg的氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉8至12周龄的雌性CD1小鼠。使用电动剃须刀对它们的背部表面进行脱毛，并用氯己定溶液擦洗。使用5mm活检穿孔器(Integra)生成全层活检伤口。为了用作伤口的夹板，将0.5mm厚、具有10mm的外径和直径为5mm的孔的硅(Invitrogen)环放置在伤口上，并用外科粘合剂固定在皮肤上。然后用TEGADERM^TM(3M)覆盖整个硅环，并使用4-0编织丝中断缝合线(Ethicon)进一步粘附。小鼠在手术后立即服用0.05mg/kg丁丙诺啡，并且在接下来的两天每日服用，以减轻手术带来的疼痛。通过以下操作来使创面感染：用胰岛素注射器穿透TEGADERM^TM，并将悬浮在10μL无菌PBS中的1x10⁴菌落形成单位(CFU)的铜绿假单胞菌(PA01)和MRSA直接注射到创面上。

在感染前的早期指数生长期期间，所有使用的细菌都被沉淀。感染四小时后，小鼠用20μL体积的2mM D-CONGA-Q7或0.025％乙酸(媒介物对照)局部治疗，方法是用胰岛素注射器穿透TEGADERM^TM并将治疗物直接注射到创面上。在感染的前5天，每8小时施用一次治疗。使用体内成像系统(IVIS)-XMRS(PerkinElmer)每日对小鼠进行成像，持续两周，并以辐射值(光子/秒/厘米²/球面度)量化从细菌生成的生物发光。在整个实验期间每日监测体重、活动、姿势、皮毛状况和伤口状况，以确保每只小鼠的健康。

结果

合成了D-CONGA的13种合理变体(表1)。D-CONGA具有13个残基并具有RR的末端基本盒。九个残基核心由第3位、第4位和第7位至第11位处的疏水残基以及第5位和第6位处的两亲R组成。为了测试D-CONGA的中央疏水核心是否促进其抗微生物活性，通过在D-CONGA的第7位插入非手性G、βA和极性Q来分离核心，以形成三个变体D-CONGA-G7、D-CONGA-βA7和D-CONGA-Q7。通过删除第4位和第10位中的A以形成D-CONGA-ΔA4和D-CONGA-ΔA10也降低了核心疏水性。为了验证每个疏水核心残基的位置是否影响D-CONGA的活性，将第7位至第11位处的氨基酸(LAFAF)和第3位至第6位处的氨基酸(WARR)的氨基酸互换以形成D-CONGA-FLIP。通过删除C末端处的R(这导致了D-CONGA-ΔR13的形成)来测试基本末端盒的重要性。此外，还通过将第5位处的残基R和第10位处的A变为L氨基酸(其形成D-CONGA-L(R5,A10))来测试D-CONGA的柔性变化对其活性的影响。我们已经证明，D型抗微生物肽(包括D-CONGA)比它们的L型对应物更有效。为了测试这是由于蛋白水解引起的理论，构建了具有除第1位和第13位的末端D-R之外的所有L残基的L-CONGA-D(R1,R13)。接下来，通过环化L-CONGA来测试肽的线性结构的重要性。使用C-末端处的OH将线性L-CONGA转化为环化形式以形成环化的L-CONGA-OH。对于另一种环化形式，环化的L-CONGA-E，将残基E添加到C末端以促进环化。最后，为了确定第5位和第6位处两亲R对D-CONGA活性的必要性，将残基交换为极性更大的高精氨酸或极性更小的去甲精氨酸，以获得最后两个D-CONGA变体，D-CONGA-HomoR和D-CONGA-NorR。所有肽都在C-末端处酰胺化。

表3：以μM肽报告相对革兰氏阴性大肠杆菌(EC)、铜绿假单胞菌(PA)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(SA)的MIC值。

以μM肽报告相对革兰氏阴性大肠杆菌(EC)、铜绿假单胞菌(PA)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(SA)的MIC值。每个生物体下的两列针对在不存在(-)和存在(+)1x10⁹个人RBC/ml的情况下执行的测定。“>30”表示在30μM(测试的最高浓度)处未观察到灭菌。标有“溶血”的列是1x10⁸个人RBC/ml在100μM肽时的溶血分数，其从自100μM开始的对连续稀释肽的测量确定。标有“EC 50”的列含有杀死50％的WI-38人成纤维细胞的肽的浓度，其通过进入SYTOX^TM Green DNA结合染料进行测定。

表4.D-CONGA和D-CONGA-Q7的抗微生物活性

将D-CONGA和D-CONGA-Q7的抗微生物活性与来自四个不同类别的八种常规抗生素相对从医院获得的14株耐药细菌菌株进行了比较。这些分离菌包括：来自囊性纤维化病患者的肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和泛耐药鲍氏不动杆菌的革兰氏阴性细菌菌株，以及革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

表5：D-CONGA和D-CONGA-Q7以及八种常规抗生素的MIC值

D-CONGA和D-CONGA-Q7以及八种常规抗生素的MIC值以μM肽针对耐药细菌菌株的14种临床分离菌进行了报告。“>150”表示在150μM(测试的最高浓度)处未观察到灭菌，并且菌株对所使用的抗生素具有耐药性。细菌分离菌的来源：KP＝肺炎克雷伯氏菌。菌株6、46、NDM-1、ST396、ST258C2、St258C3、ST258I2、398和CRE由杜兰大学的J.Kolls博士从囊性纤维化病患者的肺痰中分离出来。PA＝铜绿假单胞菌。杜兰大学的J.Kolls博士从囊性纤维化病患者的肺痰中分离出类粘蛋白和非类粘蛋白菌株。肺炎克雷伯氏菌(Morici)是ATCC#33495，由杜兰大学的L.Morici博士提供。MRSA是多药耐药金黄色葡萄球菌菌株SAP400，是团体获取的MRSA的USA400菌株。AB＝鲍氏不动杆菌是2015年在杜兰医院分离出的泛耐药(PDR)菌株。

如图1所示，其描绘了被AMP和常规抗生素灭菌的耐药分离菌的百分比，AMP D-CONGA和D-CONGA-Q能够以最高测试浓度对所有耐药分离菌进行灭菌。

图2A至图2C所示的数据提供了来自深度外科伤口感染的动物模型的结果。在健康的成年CD1小鼠中通过手术创建圆形背侧穿刺伤口，用缝合的硅环固定并用TEGADERM^TM敷料覆盖，以更好地模拟人的感染和伤口愈合。用发光铜绿假单胞菌使伤口感染，并且每8小时用D-CONGA-Q7肽或媒介物对照治疗一次，直到第4天。感染后13天期间，使用IVIS全动物成像仪每天一次测量所有动物的发光。图2A至图2C表明，与媒介物对照相比，肽治疗能够减少感染。

我们还检查了在上述深度外科伤口感染模型中测试的成年CD1小鼠身上取出的TEGADERM^TM敷料。TEGADERM^TM敷料用戊二醛固定并扫描。图像显示，D-CONGA-Q7抑制了生物膜形成，并显著消除了感染性铜绿假单胞菌(参见图3)。图3顶部两个图像上的黑色箭头显示了在所有样品中具有丰富生物膜和棒状铜绿假单胞菌的媒介物对照。图3底部两个图像中的黑色箭头指出TEGADERM^TM来自每天用D-CONGA-Q7肽治疗3次的伤口。图像显示很少有单个细菌。重要的是，没有观察到生物膜，并且只有TEGADERM^TM粘合剂可见。

我们还在整个深度外科伤口感染实验中每天监测每只小鼠的伤口状况。伤口状况按从0(表示没有炎症或分泌物)到4(表示有显著炎症和分泌物)的量表进行分级。如图4A和图4B所示，用D-CONGA-Q7治疗的小鼠的伤口状况在感染铜绿假单胞菌(图4A)或MRSA(图4B)后的8天内降至0，表明没有炎症或分泌物。

结论

我们已经证明D-CONGA的序列和结构的变化可影响其抗微生物活性。我们对D-CONGA所做的一些改变保留了原始D-CONGA肽的活性，而其他改变导致肽具有显著提高的杀菌活性和降低的细胞毒性。在我们合成和表征的13种变体中，有11种被评估了它们的细胞毒性作用。11种变体中有10种显示出相对WI-38细胞的较低毒性。13种变体中有11种的最小溶血低于1％。在存在和不存在RBC的情况下执行的实验表明，大多数变体具有相对革兰氏阴性细菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌的出色的活性。尽管如此，13种变体中只有5种可对浓度低于10uM的革兰氏阳性金黄色葡萄球菌进行灭菌。基于最小溶血和低毒性的13种变体中最好的肽是D-CONGA-G7、D-CONGA-Q7和D-CONGA-βA7。因此，D-CONGA疏水核心的分裂导致细胞毒性降低。尽管D-CONGA-βA7是变体中毒性最小的，但它完全失去了其对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的活性。另外两种具有相似的抗菌活性，但D-CONGA-Q7的毒性较小，这暗示了序列组成在AMP功能中的重要性。甚至与D-CONGA相比，D-CONGA-Q7也具有相对所有测试细菌菌株的更好的活性，以及相对人成纤维细胞WI-38细胞的更低的细胞毒性。事实上，D-CONGA-Q7相对WI-38细胞的EC50是D-CONGA的四倍。因此，与前导肽D-CONGA不同的D-CONGA-Q7在第7位只有一个氨基酸，表现出广谱活性、低细胞毒性和最小溶血。

D-CONGA-Q7代表了一种针对医院环境中经常遇到的耐药细菌的新的、有效的、广谱的治疗方法。在使用D-CONGA和八种常规抗生素相对耐药细菌菌株的14株临床分离菌的头对头评估中，我们证实了D-CONGA-Q7优越的抗微生物活性。这八种抗生素属于五种不同的类别：青霉素(氨苄青霉素)、氨基糖苷类(庆大霉素和妥布霉素)、头孢菌素(头孢他啶和头孢曲松)、碳青霉烯(美罗培南)和嘧啶抑制剂(甲氧苄啶)。14株耐药细菌菌株获自临床分离菌，主要来自新奥尔良杜兰医院的患者。临床分离菌由以下项组成：来自囊性纤维化病患者的10株肺炎克雷伯氏菌菌株、MRSA菌株、PDR鲍氏不动杆菌菌株以及粘液和非粘液铜绿假单胞菌各一株。D-CONGA-Q7在体外的表现优于D-CONGA以及主要的常规抗生素。D-CONGA-Q7甚至对两种肺炎克雷伯氏菌菌株(对所有抗生素都耐药)都进行了灭菌，并且在D-CONGA的浓度低于15uM的情况下具有高MIC。D-CONGA-Q7出色的杀菌活性优于先导肽D-CONGA。预期D-CONGA-Q7对生物膜表现出类似的优越活性，并在体内在动物伤口模型中抑制细菌感染。综上所述，结果证明了D-CONGA-Q7能够对几种不同的耐药细菌菌株进行灭菌。因此，可施用D-CONGA-Q7以治疗对其他已知抗菌疗法表现出抗生素耐药性的细菌菌株。

其他实施例

尽管已经结合本发明的特定实施例对本发明进行描述，但是应当理解，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖以下任何变型、用途或改编，通常，本发明的原理以及包括与本发明的此类偏离均落入本发明所属领域的已知或惯常实践之内，并且可以应用于前文阐述的基本特征，并落入权利要求的范围内。本说明书上文中提及的所有出版物、专利和专利申请均据此通过引用并入本文，并入程度如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用以其整体并入一样。

本文提供了一个或多个优选实施例的详细描述。然而，应当理解，本发明可以以各种形式体现。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制性的，而是作为权利要求的基础和作为教导本领域技术人员以任何适当方式使用本发明的代表性基础。

其他实施例在权利要求的范围内。

序列表

<110> 杜兰教育基金管理者（The Administrators of the Tulane EducationalFund）

<120> 肽组合物及其使用方法

<130> PPI22171488US

<150> US 62/976,694

<151> 2020-02-14

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Arg

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<220>

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

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<220>

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 4

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(12)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 6

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<221> MISC_FEATURE

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

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<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<400> 9

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg Glu

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-高精氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 12

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-去甲精氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 13

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Ala或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Lys, Arg,或其衍生物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Lys, Arg,或其衍生物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly, Gln,β-丙氨酸,或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是Ala或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa是Lys, Arg,或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是Asp, Glu,或不存在

<400> 14

Arg Arg Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala Phe Xaa Phe Arg Xaa Xaa

1 5 10 15

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 16

Xaa Arg Trp Ala Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Arg Xaa

1 5 10

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Gly Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是β-丙氨酸

<400> 18

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Xaa Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Gln Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

Arg Arg Trp Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 21

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Leu Ala Phe Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Trp Ala Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

Arg Arg Trp Ala Arg Arg Leu Ala Phe Ala Phe Arg

1 5 10

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa是D-Glu

<400> 24

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(13)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 25

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是高精氨酸

<400> 26

Arg Arg Trp Ala Xaa Xaa Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是去甲精氨酸

<400> 27

Arg Arg Trp Ala Xaa Xaa Leu Ala Phe Ala Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<400> 28

Arg Arg Trp Ala Xaa Arg Leu Ala Phe Xaa Phe Arg Arg

1 5 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> Xaa是D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是D-Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是D-Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是D-Arg

<400> 29

Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg

1 5 10

Claims (127)

1.一种与SEQ ID NO:3-29中的任一者的序列具有至少85％序列同一性的多肽。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:3-29中的任一者具有至少90％、95％、97％或100％序列同一性。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:5的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽是抗微生物肽。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽破坏微生物病原体的细胞膜。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含一种或多种D-氨基酸、一种或多种L-氨基酸、或D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述一种或多种D-氨基酸独立地选自由以下项组成的组：D-ALA、D-ARG、D-ASN、D-ASP、D-CYS、D-GLN、D-GLU、D-HIS、D-ILE、D-LEU、D-LYS、D-MET、D-PHE、D-PRO、D-SER、D-THR、D-TRP、D-TYR和D-VAL。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含一种或多种衍生氨基酸。

9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述一种或多种衍生氨基酸选自由以下项组成的组：N-im苄基组氨酸、4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸和鸟氨酸。

10.根据权利要求8或9所述的多肽，其中所述衍生氨基酸具有选自由以下项组成的组的化学部分：胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基、甲酰基、羧基、甲酯、乙酯、酰肼、O-酰基和O-烷基。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述多肽的长度为10个至20个氨基酸。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽是环化多肽。

13.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的多肽。

14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的多核苷酸。

15.一种组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的多肽、根据权利要求13所述的多核苷酸或根据权利要求14所述的载体。

16.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含药用载体、赋形剂或稀释剂。

17.根据权利要求15或16所述的组合物，其进一步包含治疗性化合物。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述治疗性化合物为抗微生物剂。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述治疗性化合物为抗真菌剂。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物为液体或固体。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的组合物，其中所述多肽掺入所述组合物中或包被在所述组合物上。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物为医疗装置、袖带、敷料材料、网眼织物、疝气贴片、伤口敷料、绷带、注射器、手套或家用产品、化妆品、药物产品、洗涤或清洁制剂、医疗装置表面、医疗装置材料、织物、塑料、塑料制品的表面、纸、非织造材料、木材、皮革或金属表面。

23.一种治疗微生物感染的方法，其包括：将根据权利要求15至20中任一项所述的组合物施用于有此需要的受试者。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述微生物感染为真菌感染或细菌感染。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细菌感染是由选自由以下项组成的组的细菌引起：鲍氏不动杆菌、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属、大肠杆菌、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和酿脓链球菌。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌感染是由鲍氏不动杆菌引起。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌感染是由P.肺炎链球菌引起。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述真菌感染是由选自由以下项组成的组的真菌引起：尖孢镰刀菌、耶氏肺孢子虫、曲霉属、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌、念珠菌属、新型线黑粉菌、毛孢子菌、兔脑炎原虫、毕氏肠微孢子虫、卷枝毛霉、米根霉和伞状毛霉菌。

29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。

30.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述受试者为非人类哺乳动物。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述非人类哺乳动物为牛、马、犬、羊或猫科动物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述非人类哺乳动物为牛。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述牛患有乳腺炎。

34.根据权利要求23至33中任一项所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的伤口。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述伤口为溃疡或外科伤口。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述溃疡为褥疮。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述受试者为糖尿病患者。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病性溃疡。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述糖尿病性溃疡为糖尿病足溃疡。

40.根据权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述组合物局部施用。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述组合物每天、每周、每两周或每月一次或多次局部施用于所述伤口。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述局部施用每一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天进行一次或多次。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述局部施用进行1周至52周或更长时间。

44.一种制备根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的方法，其包括化学合成所述多肽。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述化学合成包括固相肽合成。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述固相肽合成包括Fmoc合成。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述固相肽合成包括Boc合成。

48.根据权利要求45所述的方法，其中所述固相肽合成包括Fmoc和Boc合成。

49.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO:1或其序列具有至少85％序列同一性，但与SEQ ID NO:1不具有100％序列同一性。

50.一种制备根据权利要求1至12中任一项所述的多肽的方法，其包括以下步骤：在已经用编码所述肽的多核苷酸转化的细胞中表达所述多肽；以及从所述细胞或所述细胞周围的培养基中回收所述多肽。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞为：原核细胞，诸如，例如大肠杆菌；真核细胞，诸如HeLa细胞、CHO细胞或HEK细胞。

52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述多核苷酸在载体中。

53.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的多肽和任选地抗微生物剂。

54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述抗微生物剂为抗细菌剂或抗真菌剂。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中所述抗细菌剂为多粘菌素。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述多粘菌素为粘菌素。

57.根据权利要求15至22中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者的微生物感染的药物中的用途。

58.根据权利要求57所述的用途，其中所述受试者为人。

59.根据权利要求57所述的用途，其中所述受试者为非人类哺乳动物。

60.根据权利要求59所述的用途，其中所述非人类哺乳动物为牛、马、犬、羊或猫科动物。

61.根据权利要求15至22中任一项所述的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的微生物感染。

62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述受试者为人。

63.根据权利要求61所述的组合物，其中所述受试者为非人类哺乳动物。

64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述非人类哺乳动物为牛、马、犬、羊或猫科动物。

65.根据权利要求61至64中任一项所述的组合物，其中所述治疗包括根据权利要求23至29中任一项所述的方法。

66.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽为抗微生物肽。

67.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽破坏微生物病原体的细胞膜。

68.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含一种或多种D-氨基酸、一种或多种L-氨基酸、或D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。

69.根据权利要求68所述的多肽，其中所述一种或多种D-氨基酸独立地选自由以下项组成的组：D-ALA、D-ARG、D-ASN、D-ASP、D-CYS、D-GLN、D-GLU、D-HIS、D-ILE、D-LEU、D-LYS、D-MET、D-PHE、D-PRO、D-SER、D-THR、D-TRP、D-TYR和D-VAL。

70.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含一种或多种衍生氨基酸。

71.根据权利要求70所述的多肽，其中所述一种或多种衍生氨基酸选自由以下项组成的组：N-im苄基组氨酸、4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸和鸟氨酸。

72.根据权利要求70所述的多肽，其中所述衍生氨基酸具有选自由以下项组成的组的化学部分：胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基、甲酰基、羧基、甲酯、乙酯、酰肼、O-酰基和O-烷基。

73.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的长度为10个至20个氨基酸。

74.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽为环化多肽。

75.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的多肽。

76.一种载体，其包含根据权利要求75所述的多核苷酸。

77.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的多肽。

78.根据权利要求77所述的组合物，其进一步包含药用载体、赋形剂或稀释剂。

79.根据权利要求77所述的组合物，其进一步包含治疗性化合物。

80.根据权利要求79所述的组合物，其中所述治疗性化合物为抗微生物剂。

81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述治疗性化合物为抗真菌剂。

82.根据权利要求77所述的组合物，其中所述组合物为液体或固体。

83.根据权利要求77所述的组合物，其中所述多肽掺入所述组合物中或包被在所述组合物上。

84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述组合物为医疗装置、袖带、敷料材料、网眼织物、疝气贴片、伤口敷料、绷带、注射器、手套或家用产品、化妆品、药物产品、洗涤或清洁制剂、医疗装置表面、医疗装置材料、织物、塑料、塑料制品的表面、纸、非织造材料、木材、皮革或金属表面。

85.一种治疗微生物感染的方法，其包括：将根据权利要求77所述的组合物施用于有此需要的受试者。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述微生物感染为真菌感染或细菌感染。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述细菌感染是由选自由以下项组成的组的细菌引起：鲍氏不动杆菌、狄氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌属、大肠杆菌、迟缓真杆菌、梭杆菌属、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体属、消化链球菌属、不解糖卟啉单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗维登斯菌、斯氏普罗维登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和酿脓链球菌。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述细菌感染是由鲍氏不动杆菌引起。

89.根据权利要求87所述的方法，其中所述细菌感染是由P.肺炎链球菌引起。

90.根据权利要求85所述的方法，其中所述真菌感染是由选自由以下项组成的组的真菌引起：尖孢镰刀菌、耶氏肺孢子虫、曲霉属、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌、念珠菌属、新型线黑粉菌、毛孢子菌、兔脑炎原虫、毕氏肠微孢子虫、卷枝毛霉、米根霉和伞状毛霉菌。

91.根据权利要求85所述的方法，其中所述受试者为人。

92.根据权利要求85所述的方法，其中所述受试者为非人类哺乳动物。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述非人类哺乳动物为牛、马、犬、羊或猫科动物。

94.根据权利要求93所述的方法，其中所述非人类哺乳动物为牛。

95.根据权利要求94所述的方法，其中所述牛患有乳腺炎。

96.根据权利要求85所述的方法，其中所述方法治疗所述受试者的伤口。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述伤口为溃疡或外科伤口。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述溃疡为褥疮。

99.根据权利要求96所述的方法，其中所述受试者为糖尿病患者。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病性溃疡。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述糖尿病性溃疡为糖尿病足溃疡。

102.根据权利要求85所述的方法，其中所述组合物局部施用。

103.根据权利要求102所述的方法，其中所述组合物每天、每周、每两周或每月一次或多次局部施用于所述伤口。

104.根据权利要求103所述的方法，其中所述局部施用每一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天进行一次或多次。

105.根据权利要求103所述的方法，其中所述局部施用进行1周至52周或更长时间。

106.一种制备根据权利要求1所述的多肽的方法，其包括化学合成所述多肽。

107.根据权利要求106所述的方法，其中所述化学合成包括固相肽合成。

108.根据权利要求107所述的方法，其中所述固相肽合成包括Fmoc合成。

109.根据权利要求107所述的方法，其中所述固相肽合成包括Boc合成。

110.根据权利要求107所述的方法，其中所述固相肽合成包括Fmoc和Boc合成。

111.根据权利要求106所述的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO:1或其序列具有至少85％序列同一性，但与SEQ ID NO:1不具有100％序列同一性。

112.一种制备根据权利要求1所述的多肽的方法，其包括以下步骤：在已经用编码所述肽的多核苷酸转化的细胞中表达所述多肽；以及从所述细胞或所述细胞周围的培养基中回收所述多肽。

113.根据权利要求112所述的方法，其中所述细胞为：原核细胞，诸如，例如大肠杆菌；真核细胞，诸如HeLa细胞、CHO细胞或HEK细胞。

114.根据权利要求112所述的方法，其中所述多核苷酸在载体中。

115.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的多肽和任选地抗微生物剂。

116.根据权利要求115所述的试剂盒，其中所述抗微生物剂为抗细菌剂或抗真菌剂。

117.根据权利要求116所述的试剂盒，其中所述抗细菌剂为多粘菌素。

118.根据权利要求117所述的试剂盒，其中所述多粘菌素为粘菌素。

119.根据权利要求77所述的组合物在制备用于治疗受试者的微生物感染的药物中的用途。

120.根据权利要求119所述的用途，其中所述受试者为人。

121.根据权利要求119所述的用途，其中所述受试者为非人类哺乳动物。

122.根据权利要求121所述的用途，其中所述非人类哺乳动物为牛、马、犬、羊或猫科动物。

123.根据权利要求77所述的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的微生物感染。

124.根据权利要求123所述的组合物，其中所述受试者为人。

125.根据权利要求123所述的组合物，其中所述受试者为非人类哺乳动物。

126.根据权利要求125所述的组合物，其中所述非人类哺乳动物为牛、马、犬、羊或猫科动物。

127.根据权利要求61所述的组合物，其中所述治疗包括根据权利要求85所述的方法。

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