CN112118861A - 修饰的PlySs2溶素及其用途 - Google Patents

修饰的PlySs2溶素及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112118861A
CN112118861A CN201980027962.7A CN201980027962A CN112118861A CN 112118861 A CN112118861 A CN 112118861A CN 201980027962 A CN201980027962 A CN 201980027962A CN 112118861 A CN112118861 A CN 112118861A
Authority
CN
China
Prior art keywords
modified lysin
lysin polypeptide
seq
amino acid
certain embodiments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980027962.7A
Other languages
English (en)
Inventor
R·舒赫
C·因迪亚尼
M·维特金德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Contrafect Corp
Original Assignee
Contrafect Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contrafect Corp filed Critical Contrafect Corp
Publication of CN112118861A publication Critical patent/CN112118861A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/335Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425Thiazoles
    • A61K31/429Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/24Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462Lysozyme (3.2.1.17)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017Lysozyme (3.2.1.17)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24075Lysostaphin (3.4.24.75)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00Bacteriophages
    • C12N2795/00011Details
    • C12N2795/00022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本文公开了其修饰的溶素多肽,其与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代,其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域和/或所述SH3b结构域中,且其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。本文进一步公开了包含修饰的溶素多肽的组合物,以及包含编码所述修饰的溶素多肽的核酸分子的载体。本文还公开了抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的方法,治疗细菌感染的方法以及加强抗生素的效力或减少抗生素抗性的发展的方法。

Description

修饰的PlySs2溶素及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求在2018年2月26日提交的美国临时专利申请号62/635,515的权益,且依靠其提交日,所述申请的全部公开内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有序列表,该序列表已经以ASCII格式电子提交,并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本,在2019年2月22日创建,命名为0341_0004-PCT_SL.txt,且大小为36,153字节。
公开领域
本公开总体上涉及抗细菌剂,并且更具体地涉及修饰的、非天然存在的溶素多肽,尤其是修饰的PlySs2裂解酶,以及这些肽在杀死革兰氏阳性细菌和对抗细菌感染和污染中的用途。
发明背景
抗生素抗性在全世界增加,尤其受到以下影响:(a)增加和长期使用经施用以治疗各种疾病和其他病况的抗生素;(b)患者依从性差;和(c)缺乏针对对现有抗生素发展抗性的病原体进行配置的新的抗微生物剂。
细菌噬菌体内溶素(溶素)代表一种有前途的替代或补充方法,以对抗细菌感染和克服细菌抗性。溶素是可以由细菌噬菌体自然产生的肽聚糖水解酶。当接触来自外部的细菌时,重组产生的溶素多肽直接裂解并杀死细菌[1], [2]。溶素还可以通过促进抗生素药剂接近病原体来克服抗生素抗性。几项研究近来已经表明,这些酶在人和兽医中具有强大的潜力,以控制粘膜表面上、器官限制的感染中和全身感染中的病原体。
革兰氏阳性细菌被含有多肽和多糖的细胞壁包围。革兰氏阳性细胞壁显现为宽、致密的壁,其可能为约20-80 nm厚,并且含有许多相互连接的肽聚糖层。革兰氏阳性细胞壁的60%至90%是肽聚糖,提供细胞形状、刚性结构以及对渗透压的抗性。细胞壁不排除革兰氏染色结晶紫,允许细胞被染色为紫色,且因此被分类为“革兰氏阳性”。
细菌噬菌体裂解酶已经被确立为可用于通过各种施用途径特异性治疗受试者中的各种类型的感染。参见例如美国专利号5,985,271;6,017,528;6,056,955;美国专利号6,248,324;美国专利号6,254,866;和美国专利号6,264,945。授予Fischetti等人的美国专利9,034,322(其在此通过引用以其整体并入)涉及源自猪链球菌细菌的细菌噬菌体溶素,包括溶素PlySs2。这些溶素多肽表明针对多种细菌(包括革兰氏阳性细菌,诸如葡萄球菌属、链球菌属B群、肠球菌属和李斯特氏菌属细菌菌株)的广泛的杀伤活性。
PlySs2溶素能够在动物模型中杀死金黄色葡萄球菌细菌,与抗生素协同作用并克服(或预防)抗生素抗性。已显示PlySs2针对抗生素抗性金黄色葡萄球菌(诸如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌(VRSA))是有效的。
通过治疗性蛋白引发炎性免疫应答是不期望的[6], [8]。对于外源蛋白和肽,蛋白免疫原性可能使人忧虑,无论它们是源自合成来源还是生物学(诸如重组)来源。在一些情况下,治疗性蛋白已引起严重的不良事件(例如,贫血、血小板减少症、过敏反应和先天性免疫应答),其在某些情况下甚至可能是致命的。众所周知的实例包括在诱导与功能性非冗余内源性EPO交叉反应的中和抗体后,用促血小板生成素治疗的患者中的血小板减少症和用批准的促红细胞生成素(EPO)产品EPREX®治疗的慢性肾病患者中的纯红细胞发育不全。由于已经对于各种产品、包括单克隆抗体、血栓激酶和PULMOZYME® (链球菌DNA酶α)报道了免疫原性,免疫原性继续受到监管机构、行业和临床医生的极大关注。由于潜在的细菌感染,在已经经历炎性应答的患者中,此类免疫应答可能加重。
由于溶素、诸如PlySs2是蛋白,它们当施用于宿主时具有引发免疫应答的潜力。除了引起严重的不利影响以外,如上所讨论,此类免疫应答还可以降低溶素的裂解活性。实际上,已经在具有其他类型的溶素(诸如Cpl-1)的动物中观察到一些免疫应答,其引起裂解活性的降低,但基本上没有抑制它。然而,其他研究人员观察到,Cpl-1的施用伴随着炎性细胞因子分泌的大量增加[9]。
已经开发了计算机芯片上、计算机指导的工具,以促进鉴定蛋白的表位区域,和设计不易具有免疫原性的变体[11]-[18]。尽管此类技术可能有帮助,但它们具有一些限制。这些限制可能包括,例如:抗原加工,其可以消除一些推定的T-细胞表位;由于T-细胞受体的多形性和三维复杂性,无法使用计算机芯片上方法预测T-细胞受体亲和力;无法预测T-细胞表位表型;考虑患者群体对个体患者设计的统计技术的适用性的局限性以及翻译后因素的影响;和计算机芯片上技术的固有限制以及它们潜在的假设[8]。因此,在降低肽的免疫原性的努力中仍然存在尝试和错误以及不确定性。
因此,发现保留期望的抗细菌活性、但具有降低的免疫原性的修饰的溶素、诸如修饰的PlySs2溶素会是有益的。
发明概述
本申请公开了修饰的溶素多肽,其相对于对应的野生型PlySs2溶素具有至少一个氨基酸取代,同时保留抗细菌活性和有效性。通常,与对应的野生型PlySs2溶素相比,修饰的溶素多肽还具有降低的免疫原性。野生型PlySs2溶素具有半胱氨酸、组氨酸依赖性的酰胺水解酶/肽酶(CHAP)内肽酶结构域(其为PlySs2多肽的酶促活性结构域(EAD))以及C-末端SH3b_5 (SH3b)细胞壁结合结构域(CBD)。在某些方面,所述修饰的溶素多肽包含CHAP中的至少一个氨基酸取代和/或SH3b中的一个或多个氨基酸取代。
在一个方面,本公开涉及修饰的溶素多肽,其与野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代,其中所述野生型PlySs2溶素多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)结构域和细胞壁结合(SH3b)结构域,且其中至少一个氨基酸取代在CHAP结构域和/或SH3b结构域中,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。通常,与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代在CHAP结构域中。在某些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代在SH3b结构域中。在某些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代在CHAP结构域和SH3b结构域中。
在某些实施方案中,所述至少一个取代在CHAP结构域中的至少一个选自SEQ IDNO:1的氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中。在某些实施方案中,所述至少一个取代在SH3b结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中。在某些实施方案中,修饰的溶素多肽具有在CHAP结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸35、92、104、128和137的位置中的至少一个取代和在SH3b结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸164、184、195、198、204、206、212和214的位置中的至少一个取代。
在一些实施方案中,CHAP结构域中的至少一个氨基酸取代选自R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中,SH3b结构域中的至少一个氨基酸取代选自Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G。
在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽具有CHAP结构域中的至少一个选自R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S的氨基酸取代和SH3b结构域中的至少一个选自Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G的氨基酸取代。
在还有其他实施方案中,所述修饰的溶素多肽在CHAP结构域中具有至少两个氨基酸取代;在还有其他实施方案中,所述修饰的溶素多肽在SH3b结构域中具有至少两个氨基酸取代;在其他实施方案中,所述修饰的溶素多肽在SH3b结构域中具有至少三个氨基酸取代。在还有其他实施方案中,所述修饰的溶素多肽具有在CHAP和SH3b结构域之间分布的5、6、7或8个氨基酸取代,且在某些实施方案中,SEQ ID NO:1的氨基酸序列通过选自以下的氨基酸取代中的3-9个进行修饰:R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。
在某些实施方案中,相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:(i) L92W、V104S、V128T和Y137S (pp55);(ii) Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E (pp388);(iii) L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E (pp61);(iv)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A (pp65);(v) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q (pp296);(vi) V128T、Y137S和Y164K (pp616);(vii) R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S (pp400);(viii) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E(pp628);(ix) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E (pp632);(x) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和N184D (pp324);(xi) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E (pp325);(xii) L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A (pp341);(xiii) L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K (pp619);(xiv) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G (pp642);和(xv) L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H(pp338)。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽具有选自SEQ ID NO.3-17之一的氨基酸序列。
在某些实施方案中,相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中,相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q (pp296)。
还公开了本文公开的修饰的溶素多肽的活性片段,其中所述活性片段包括CHAP结构域和/或SH3b结构域中的一个或多个氨基酸取代。
还公开了嵌合溶素,其包含如本文所公开的修饰的PlySs2 CHAP结构域,以及如本文所公开的另一种溶素的结合结构域或另一种溶素的催化结构域和修饰的PlySs2 SH3b结构域。
在一些实施方案中,所述修饰的溶素多肽针对以下中的一种或多种具有的最小抑制浓度(MIC)为野生型PlySs2溶素(SEQ ID NO:1)的MIC的不大于约2倍、或约3倍或约5倍,诸如不大于约3倍、不大于约4倍或不大于约5倍:金黄色葡萄球菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,凝固酶阴性葡萄球菌(包括至少40种公认的物种,其来自,但不限于,表皮葡萄球菌组,腐生葡萄球菌组,模仿葡萄球菌组,中间葡萄球菌组,松鼠葡萄球菌组,猪葡萄球菌组,和被称为来自“未指定物种组”的任何分离株),猪链球菌,化脓性链球菌,无乳链球菌,停乳链球菌,肺炎链球菌,绿色链球菌组中包括的任何额外物种(包括,但不限于咽峡炎链球菌组、缓症链球菌组、血链球菌组、牛链球菌(现在是解没食子酸链球菌)组、唾液链球菌组和变异链球菌组中包括的所有物种和菌株),粪肠球菌,和屎肠球菌。在某些实施方案中,针对以下中的一种或多种的MIC为野生型PlySs2溶素(SEQ ID NO:1)的MIC的不大于约2倍、不大于约3倍、不大于约4倍或不大于约5倍:金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和无乳链球菌。
在一些实施方案中,与野生型PlySs2溶素(SEQ ID NO:1)相比,本文公开的修饰的溶素多肽降低免疫原性和/或降低炎性应答相关的毒性。在本公开的某些实施方案中,在体外评价抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,作为MIC和/或最小生物膜根除浓度(MBEC)。
另一个方面涉及包含可接受的载体和如本文所公开的修饰的溶素多肽的组合物。在某些实施方案中,所述组合物是药物组合物,且所述载体是药学上可接受的载体。
在本文公开的组合物的具体实施方案中,所述修饰的溶素多肽的量有效地抑制革兰氏阳性细菌的一种或多种物种、诸如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌的生长,减少革兰氏阳性细菌的一种或多种物种、诸如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌的种群或杀死革兰氏阳性细菌的一种或多种物种、诸如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌。在某些实施方案中,所述组合物是溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂。在某些实施方案中,所述组合物进一步包含一种或多种适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素。
在又另一个方面,提供了编码如本文所公开的修饰的溶素多肽的核酸分子。
另一个方面涉及载体,其包含编码如本文所公开的修饰的溶素多肽的核酸分子。在一些实施方案中,所述载体是质粒。在一些实施方案中,所述核酸分子可操作地连接至异源启动子。
在另一个方面,提供了用于抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的方法,所述方法包括使革兰氏阳性细菌的至少一种物种与包含抗细菌有效量的如本文所公开的修饰的溶素多肽的组合物接触。
在又另一个方面,提供了用于预防或治疗由革兰氏阳性细菌的至少一种物种引起的细菌感染的方法,其包括向被诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用(1)第一量的如本文所公开的修饰的溶素多肽;和(2)第二量的适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素。
在一些方法实施方案中,所述抗生素是甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素中的一种或多种。在某些实施方案中,所述抗生素是甲氧西林、万古霉素和达托霉素中的一种或多种。
在一些实施方案中,在前述方法中使用的修饰的溶素多肽的量可以低于当在抗生素不存在的情况下使用时导致浓度等于修饰的溶素多肽的MIC的量(即,亚MIC溶素量”);可替代地或另外地,在前述方法中使用的抗生素的量可以低于对应的量,即当在修饰的溶素多肽不存在的情况下使用时导致浓度等于抗生素的MIC的量(即,“亚MIC抗生素量”)。
在又另一个方面,提供了用于加强适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素的效力的方法,其包括共同施用所述抗生素与如本文所公开的修饰的溶素多肽的组合,其中与单独施用抗生素或修饰的溶素多肽相比,共同施用更有效地抑制革兰氏阳性细菌的生长,减少革兰氏阳性细菌的种群或杀死革兰氏阳性细菌。在某些实施方案中,所述抗生素选自甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素。
在另一个方面,提供了组合产品,其中所述组合产品包含修饰的溶素多肽和抗生素。在某些实施方案中,在组合产品中有效的修饰的溶素多肽、抗生素或两者的最小量低于修饰的溶素多肽和/或抗生素的相应MIC量。在一些实施方案中,修饰的溶素多肽和抗生素在相同的组合物中提供,且在某些实施方案中,修饰的溶素多肽和抗生素在不同的组合物中提供。
在一些实施方案中,提供了用于预防、破坏、分散或处理表面上的含有葡萄球菌属或链球菌属细菌的生物膜的方法,其包括向所述表面递送单独或与抗生素组合的有效量的如本文所公开的修饰的溶素多肽,其中有效地预防、破坏、分散或处理所述生物膜。在某些实施方案中,所述表面是医疗装置的表面。在还有其他实施方案中,所述医疗装置用于人体(包括但不限于血液或其他体液)内或与人体(包括但不限于血液或其他体液)接触。此类装置的非限制性实例包括吸入器、插管设备、瓣膜、导管、结肠造口术装置或其他假体装置。
在某些实施方案中,可以在体外评价修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的活性,诸如该肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的活性,例如,作为MIC和/或最小生物膜根除浓度(MBEC)。在某些实施方案中,可以例如通过小鼠中性粒细胞减少性大腿感染(MNTI)模型在体内评价修饰的溶素多肽的活性。在进一步实施方案中,本文公开的修饰的溶素多肽与适合于治疗革兰氏阳性感染的抗生素、例如甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素中的一种或多种的协同活性可以使用棋盘测定来评价。
在一些某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽可以展示与野生型PlySs2溶素的抗生素抗性概况相当的抗生素抗性概况。因此,提供了用于抑制对适合于治疗葡萄球菌属或链球菌属感染的抗生素的抗性的发展的方法,其包括共同施用抗生素与一定量的如本文所公开的修饰的溶素多肽,所述量有效地避免、减少或延迟对抗生素的抗性的发展。
在进一步实施方案中,通过单独的连续传代抗性或通过与抗生素、诸如例如甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素组合的连续传代抗性来评价抗生素抗性概况。
附图简述
图1是如实施例3中所述的修饰的溶素多肽pp53、pp55、pp61、pp65和pp296以及对照、野生型PlySs2溶素蛋白pp1149(纯化至GMP级)的纯化过程的最后步骤期间从大小排阻柱洗脱的级分的SDS-PAGE凝胶的描绘。在该最终的纯化步骤中将画圈中包括的级分合并在一起。
图2是如实施例7中所述的野生型PlySs2溶素(命名为CF-301)和对照、野生型PlySs2多肽pp1149以及修饰的溶素多肽pp55、pp61、pp65和pp296在小鼠中性粒细胞减少性大腿感染体内模型中的杀细菌效力的剂量应答图。将细菌负荷(菌落形成单位/g处理的大腿)针对施用的溶素剂量(mg/kg)作图。
图3A-3C是描绘如实施例6中所述的经传代的21天或26天每种指示药剂的MIC随时间的倍数变化的一系列连续传代抗性测定结果。在图3A中,对于用pp296(分别称为“pp296-1”、“ pp296-2”和“ pp296-3”)处理的三个独立谱系以及用野生型PlySs2溶素(称为CF-301)或溶葡萄球菌素(LSP)处理的单个谱系显示MIC的倍数变化(测量为MIC的增加)。在图3B中,对于用DAP与固定亚MIC量(1/16x MIC)的pp296的组合(称为“DAP+pp296-1”、“DAP+pp296-2”和“DAP+pp-296-3”)和用单独的DAP处理的三个独立谱系显示达托霉素(DAP)的MIC的倍数增加。在图3C中,对于用VAN与固定亚MIC量(1/8x MIC)的pp296的组合(称为“VAN+pp296-1”、“VAN+pp296-2”和“VAN+pp-296-3”)和用单独的VAN处理的三个独立谱系显示万古霉素(VAN)的MIC的倍数增加。
详述
定义
除非上下文另外明确指明,否则本文使用的以下术语及其同源词应具有以下含义:
“载体”是指与活性化合物一起施用的溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。此类载体可以是无菌液体,诸如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油类,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
“药学上可接受的载体”是指生理上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。载体必须是在通常用于药物中的量下不对待治疗的受试者有害的意义上是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其他成分相容,而不使组合物不适合于其预期目的。此外,药学上可接受的载体适用于本文所提供的受试者,而没有不适当的不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)。当其风险超过组合物所提供的益处时,副作用是“不适当的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体,诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂、诸如油/水乳剂和微乳剂。合适的药物载体描述于例如E.W. Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版。
“杀细菌的”是指在18-24小时时段内在初始细菌群体中至少减少3-log10(99.9%)或更好的减少的程度上具有细菌死亡或能够杀死细菌的特性。
“抑细菌的”是指抑制细菌生长(包括抑制细菌细胞的生长),因此在18-24小时时间段内在初始细菌群体中引起减少2-log10 (99%)或更好的减少并且减少最多达略低于3-log的特性。
“抗细菌剂”是指抑细菌剂和杀细菌剂两者。
“抗生素”是指具有对细菌具有负面影响的特性(诸如致死性或生长减少)的化合物。抗生素可以对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或两者具有负面影响。通过实例的方式,抗生素可以影响细菌中的细胞壁肽聚糖生物合成、细胞膜完整性或DNA或蛋白合成。针对革兰氏阳性细菌有活性的抗生素的非限制性实例包括甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星、溶葡萄球菌素、青霉素类、氯洒西林、红霉素、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素和非达霉素。
“药物抗性的”通常是指对药物的抗细菌活性具有抗性的细菌。当以某些方式使用时,药物抗性可以具体地是指抗生素抗性。在一些情况下,通常对特定抗生素敏感的细菌可对抗生素发展抗性,由此成为药物抗性的微生物或菌株。“多药抗性的” (“MDR”)病原体是已经对各自用作单一疗法的至少两类抗微生物药物发展抗性的病原体。例如,已经发现金黄色葡萄球菌的某些菌株对几种抗生素(包括甲氧西林和/或万古霉素)具有抗性(Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department ofHealth and Services, Centers for Disease Control and Prevention)。本领域技术人员可使用确定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术容易确定细菌是否是药物抗性的。
“有效量”是指当以适当的频率或给药方案应用或施用时足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷或预防被治疗的病症(例如,细菌病原体生长或感染)、减少或改善其发作、严重程度、持续时间或进展、预防所治疗的病症的发展、引起所治疗的病症的消退、或者增强或改善另外的疗法(诸如抗生素或抑细菌疗法)的预防或治疗效果的量。
“共同施用”意欲包括以依次的方式分开施用两种药剂、诸如溶素肽和抗生素或任何其他抗细菌剂,以及以基本上同时的方式施用这些药剂,诸如在单一混合物/组合物中或以分开给予的剂量,但仍基本上同时施用于受试者,例如在同一天或24小时时段中的不同时间。溶素肽与一种或多种额外的抗细菌剂的这样的共同施用可作为持续最多达数天、数周或数月的持续治疗而提供。另外,取决于用途,共同施用不需要是连续的或同时的(coextensive)。例如,如果用途是作为局部抗细菌剂以治疗例如细菌性溃疡或感染的糖尿病性溃疡,则可以仅在第一次抗生素使用的24小时内开始施用溶素多肽,且然后抗生素使用可以继续而不进一步施用溶素多肽。
“受试者”是指哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物或细胞培养物。例如,术语“受试者”意欲包括易感或患有细菌感染、例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染的生物体,例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物,例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中,受试者是人,例如患有革兰氏阳性细菌感染、处于患有革兰氏阳性细菌的风险中、或易于被革兰氏阳性细菌感染的人,无论这种感染是全身性的、局部的还是以其他方式集中或局限于特定的器官或组织。
“多肽”与术语“蛋白”、“肽”可互换使用,并且是指由氨基酸残基构成的聚合物。在一个实施方案中,所述多肽具有至少约30个氨基酸残基。该术语可以不仅包括分离形式的多肽,而且还包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还涵盖包含如本文所述的修饰的溶素多肽并维持溶素功能的融合蛋白或融合多肽。取决于背景,多肽可以是天然存在的多肽或者重组、工程改造或合成产生的多肽。特定的溶素多肽可以例如通过酶促或化学切割从天然蛋白衍生或移取,或者可以使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(诸如Sambrook, J. 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中公开的那些)制备,或者可策略性地将其截短或分段,产生维持针对相同或至少一种常见靶标细菌的裂解活性的活性片段。
“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段的融合产生的表达产物,导致融合表达产物通常具有两个或更多个具有不同特性或功能的结构域或区段。在某些实施方案中,术语“融合多肽”还指包含直接或经由氨基酸或肽接头共价连接的两个或更多个异源多肽或肽的多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常被C-末端至N-末端连接,尽管它们也可以被C-末端至C-末端、N-末端至N-末端或N-末端至C-末端连接。术语“融合多肽”与术语“融合蛋白”可互换使用。因此,开放式表述“包含”某种结构的“多肽”包括比所记载的结构、诸如融合多肽或构建体更大的分子。本文所提及的构建体可以制成融合多肽或缀合物(通过连接两个或更多个部分)。
“异源的”是指非天然连续的核苷酸、肽或多肽序列。例如,在本公开的上下文中,术语“异源的”可以用于描述两个或更多个肽和/或多肽的组合或融合,其中该融合肽或多肽通常在自然界中未发现,诸如例如修饰的溶素多肽和阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide)(Ding等人,Cell Mol Life Sci.,65(7-8):1202-19(2008))、防卫素肽(Ganz,T. Nature Reviews Immunology 3,710-720(2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽,其可具有增强的裂解活性。该定义中包括两个或更多个溶素多肽或其活性片段。这些可用于制备具有裂解活性的融合多肽。
“活性片段”是指多肽的一部分,其保留从其中获取片段的分离多肽的一种或多种功能或生物活性。如本文所用,修饰的溶素多肽的活性片段抑制至少一种革兰氏阳性细菌物种、诸如金黄色葡萄球菌的生长,或减少至少一种革兰氏阳性细菌物种、诸如金黄色葡萄球菌的种群,或杀死至少一种革兰氏阳性细菌物种、诸如金黄色葡萄球菌。
“两亲性肽”是指具有亲水和疏水性官能团两者的肽。在某些实施方案中,二级结构将疏水和亲水性氨基酸残基置于两亲性肽的对侧(例如,当所述肽在溶剂、诸如水中时,内侧相对于外侧)。在某些实施方案中,这些肽可以采用螺旋二级结构,诸如α-螺旋二级结构。
“阳离子肽”是指具有高百分比的带正电荷的氨基酸残基的肽。在某些实施方案中,阳离子肽具有8.0或更高的pKa-值。在本公开的上下文中,术语“阳离子肽”还涵盖聚阳离子肽,其为由主要带正电荷的氨基酸残基(诸如赖氨酸和/或精氨酸残基)构成的合成产生的肽。不带正电荷的氨基酸残基可以是带中性电荷的氨基酸残基、带负电荷的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基。
“疏水性基团”是指对水分子具有低亲和力或不具有亲和力、但对油分子具有更高亲和力的化学基团,诸如氨基酸侧链。疏水性物质倾向于在水或水相中具有低溶解度或不具有溶解度,并且通常是非极性的,但倾向于在油相中具有更高的溶解度。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。
如本文所用的“加强”是指药剂的活性、诸如抗微生物活性的程度高于其否则的情况。“加强”涵盖加性以及协同(超加性)作用。
“协同”或“超加性”是指由两种物质组合产生的有益作用,其超过两种药剂独立起作用的作用的总和。在某些实施方案中,协同或超加性作用显著、即统计学显著超过两种药剂独立起作用的作用的总和。一种活性成分或活性成分两者可以在亚阈值水平(即,如果活性物质单独使用则不产生或产生非常有限的效果的水平)下使用。可通过测定、诸如此处所述的棋盘测定来测量效果。
“治疗”是指任何过程、作用、应用、疗法等,其中使受试者(包括人类)经受医疗救助,目的是直接或间接地治愈病症、根除病原体、或改善受试者的状况。治疗还指降低发病率、减轻症状、消除复发、预防复发、预防发生、减少发生的风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”可以进一步涵盖减少受试者中细菌的种群、生长速率或毒力,且由此控制或减少受试者中的细菌感染或者器官、组织或环境的细菌污染。因此,降低发病率的“治疗”有效抑制至少一种革兰氏阳性细菌在特定环境(无论它是受试者还是环境)中的生长。另一方面,已经确定的感染的“治疗”是指减少造成感染或污染的革兰氏阳性细菌的群体,杀死造成感染或污染的革兰氏阳性细菌,抑制造成感染或污染的革兰氏阳性细菌的生长,和/或根除造成感染或污染的革兰氏阳性细菌。
术语“预防”包括预防病症、诸如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或确立。无意于将本公开限制为感染的完全预防或感染的确立的预防。在一些实施方案中,发作被延迟,或者随后感染的疾病的严重程度或感染其的机会被降低,并且这样构成了预防的实例。特别是关于生物膜预防,该术语包括防止生物膜的形成,例如通过干扰细菌在目标表面、诸如医疗装置(例如,吸入器、导管、插管、瓣膜或其他假体)的表面上的粘附。
“感染的疾病”是指表现出临床或亚临床症状的疾病,诸如发烧、败血症或菌血症的检测,以及当尚未表现出与这种病理学相关的症状时可以通过细菌病原体(例如培养物中)的生长检测的疾病。关于医疗装置,具体而言,感染的疾病应当包括含有细菌、诸如葡萄球菌属或链球菌属且在使用这种装置时形成的生物膜。
肽或多肽(其如本文所述包括活性片段)的上下文中的术语“衍生物”意欲涵盖例如经修饰以含有除氨基酸以外的基本上不会不利地影响或破坏多肽的活性、诸如裂解活性的一个或多个化学部分的多肽。化学部分可以与肽共价连接,例如经由氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基,或在内部氨基酸残基处。此类修饰可以是天然或非天然的。在某些实施方案中,非天然修饰可以包括在反应性部分上添加保护或加帽基团、添加可检测标记物、诸如抗体和/或荧光标记物、添加或改变糖基化、或添加填充基团(bulking group)、诸如PEG(聚乙二醇化)和本领域技术人员已知的其他变化。在某些实施方案中,非天然修饰可以是加帽修饰,诸如N-末端酰化和C-末端酰胺化。可以添加至溶素多肽的示例性保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记物蛋白诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry,是可以共价或非共价结合至溶素多肽或融合至溶素多肽而不干扰细胞蛋白的正常功能的紧凑蛋白。在某些实施方案中,编码荧光蛋白的多核苷酸插入溶素多核苷酸序列的上游或下游。这将产生不干扰与其附接的溶素多肽的细胞功能或功能的融合蛋白(例如,溶素多肽:: GFP)。聚乙二醇(PEG)与蛋白的缀合已被用作延长许多药物蛋白的循环半衰期的方法。因此,在溶素多肽衍生物的上下文中,术语“衍生物”涵盖通过共价附接一个或多个PEG分子而化学修饰的溶素多肽。预期聚乙二醇化溶素多肽与未聚乙二醇化溶素多肽相比将表现出延长的循环半衰期,同时保留生物学和治疗活性。另一个实例为“artilysin”的使用,由此短的聚阳离子和两亲性α螺旋被附加到溶素多肽的N-或C-末端以改善体外抗细菌活性,诸如附加到链球菌溶素的N-或C-末端以改善体外抗链球菌活性。
“百分比氨基酸序列同一性”是指在比对序列和(如果必要的话)引入缺口以获得最大百分比序列同一性,并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后,候选序列中与参考多肽序列、诸如溶素多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现,例如,使用可公开获得的软件、诸如BLAST或可例如自DNASTAR商业获得的软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100%同一性的任何一处,或其之间的任何整数值。在本公开的上下文中,当至少80%的氨基酸残基(优选至少约85%、至少约90%、并且优选至少约95%、至少约98%或至少99%)相同时,两个多肽是“基本上相同的”。如本文所述的术语“百分比(%)氨基酸序列同一性”也适用于肽。因此,术语“基本上相同的”将涵盖分离的多肽和肽、诸如本文所述的那些的突变、截短、融合或在其他方面的序列修饰的变体及其活性片段,以及相比于参考(野生型或其他完整)多肽具有基本上的序列同一性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性,如通过例如上文提到的一种或多种方法所测量)的多肽。当至少约80%的氨基酸残基(优选至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%同一性或至少约99%同一性)相同或代表保守取代时,两个氨基酸序列是“基本上同源的”。当多肽、诸如本文所述的溶素和/或融合多肽的一个或多个、或几个、或至多10%、或至多15%或至多20%的氨基酸被相似或保守的氨基酸取代进行取代时,本公开的序列或多肽是基本上同源的,并且其中所得多肽、诸如本文所述的溶素和/或融合多肽具有参考多肽、诸如本文所述的溶素和/或融合多肽的至少一种活性、抗细菌作用和/或细菌特异性。
如本文所用,“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的取代。具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸),具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸),具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸),具有β-支链侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
“可吸入组合物”是指被配制用于在常规或辅助呼吸期间或与常规或辅助呼吸相结合而直接递送至呼吸道(例如通过气管内支气管、肺、和/或鼻腔施用)的本公开的药物组合物,包括但不限于雾化、喷洒、干粉和/或气雾化制剂。
“生物膜”是指附着至表面并聚集在水合聚合物基质中的细菌,该基质可以由细菌和/或宿主来源的组分构成。生物膜为微生物的聚集体,其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞通常被嵌入包含(但不限于)胞外聚合物质(EPS)的基质内。生物膜EPS也称为粘液(尽管并非所有描述为粘液的东西均为生物膜)或菌斑,为一种通常由胞外DNA、蛋白和多糖构成的聚合物团聚物。在某些实施方案中,所述生物膜可以含有葡萄球菌属和/或链球菌属细菌。
在适用于针对某些细菌的抗生素使用的上下文中,“适合”是指即使抗性随后发展也被发现针对那些细菌有效的抗生素。
“野生型PlySs2溶素”和“ PlySs2溶素”是指具有以下氨基酸序列的多肽:
MTTVNEALNNVRAQVGSGVSVGNGECYALASWYERMISPDATVGLGAGVGWVSGAIGDTISAKNIGSSYNWQANGWTVSTSGPFKAGQIVTLGATPGNPYGHVVIVEAVDGDRLTILEQNYGGKRYPVRNYYSAASYRQQVVHYITPPGTVAQSAPNLAGSRSYRETGTMTVTVDALNVRRAPNTSGEIVAVYKRGESFDYDTVIIDVNGYVWVSYIGGSGKRNYVATGATKDGKRFGNAWGTFK (SEQ ID NO:1;245个氨基酸残基,包括初始的甲硫氨酸残基,其在翻译后加工期间被除去,留下244个氨基酸的肽)。
如本文所用的“修饰的溶素多肽”是指野生型PlySs2溶素的非天然存在的变体(或其活性片段)。所述修饰的溶素多肽在CHAP结构域和/或SH3b结构域中具有至少一个氨基酸取代,并且抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种、诸如金黄色葡萄球菌的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种、诸如金黄色葡萄球菌的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种、诸如金黄色葡萄球菌。
“免疫原性的”或“免疫原性”意指通过建立(例如,通过计算机指导的计算机芯片上方法)一个或多个T-细胞表位的存在而被预测为免疫原性的或具有免疫原性。如本文所公开的修饰的溶素多肽的免疫原性可以通过TCE评分使用任何可用的计算机芯片上计算机指导的用于获得这种评分的方法来测量,并且与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2溶素的类似推导的TCE评分进行比较。或者,如本文所公开的修饰的溶素多肽的免疫原性可以通过体外T细胞应答来测量。通过延伸,“较低的免疫原性”、“降低的免疫原性”等意指预计通过耗竭(其包括通过氨基酸替换来消除或减弱)一个或多个T-细胞表位(即,与参考多肽相比具有较低的TCE评分)而是免疫原性较低的或具有降低的免疫原性,或者如本文所公开的修饰的溶素多肽引发降低的T细胞应答。因此,如本文所用,如果修饰的溶素多肽具有1)比具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2溶素更低的TCE评分或2)降低的T细胞应答,则修饰的溶素多肽是“免疫原性较低的”或具有“降低的免疫原性”等。
“降低的T细胞应答”意指修饰的溶素多肽与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2溶素相比诱导的较低的T细胞活化,如通过体外T细胞增殖(3{H}-胸苷并入)测定使用CD8+耗竭的人外周血单核细胞(其中人外周血单核细胞暴露于荧光素异硫氰酸酯标记的抗细胞因子抗体并测量应答)所测量。
在本公开的修饰的溶素多肽的裂解活性(抗微生物活性)的上下文中,“基本上”意指野生型PlySs2溶素的抗细菌活性的至少相当大的部分,使得,基于这种活性,修饰的溶素多肽可单独或与其他抗微生物剂(诸如一种或多种抗生素和/或溶葡萄球菌素)一起使用,以通过杀死这些细菌来抑制、对抗或消除葡萄球菌或链球菌细菌感染。与野生型PlySs2溶素相比的这种基本上活性的非限制性实例包括野生型溶素的MIC的不超过约5倍,诸如不超过约4倍,不超过约3倍或不超过约2倍。活性的其他量度可以是例如最小生物膜消除浓度(MBEC)或使用例如动物模型、诸如小鼠中性粒细胞减少性大腿感染模型(MNTI)的体内效力。还有其他量度可以是与抗生素、诸如万古霉素或达托霉素协同作用的能力,或改善、预防或延迟抗生素、诸如万古霉素或达托霉素的细菌抗性的发展的能力,与野生型PlySs2溶素相似。在降低的免疫原性的上下文中使用的相同术语“基本上”意指具有野生型PlySs2溶素的免疫原性的最多65%,诸如最多50%,最多40%,最多30%或最多25%,如例如通过TCE评分所测量[19]。
修饰的溶素多肽
在一方面,本公开涉及修饰的溶素多肽,其具有裂解活性和与野生型PlySs2溶素相比降低的免疫原性。如本文所用,“裂解活性”涵盖溶素杀死细菌、减少细菌的种群或抑制细菌生长的能力。裂解活性还涵盖除去或减少生物膜的能力和/或减少抗生素的最小抑制浓度(MIC)的能力。
通常,本发明的修饰的溶素多肽能够降解肽聚糖,细菌细胞壁的主要结构组分,导致细胞裂解。与野生型PlySs2溶素相比,所述修饰的溶素多肽进一步能够降低免疫原性和/或降低炎性应答相关的毒性。
用于评价如本文所公开的修饰的溶素多肽的活性的合适方法是本领域中众所周知的,并且描述于实施例中。简而言之,可以测定修饰的溶素多肽的MIC值(即,与对照相比足以抑制细菌生长的至少80%的肽的最小浓度),并且与例如野生型PlySs2溶素或无活性的化合物进行比较。例如,可以测定修饰的溶素多肽针对例如在例如Mueller-Hinton培养液或补充有血清、诸如马血清的Mueller-Hinton培养液中的实验室金黄色葡萄球菌菌株的MIC值。
在一些实施方案中,本发明的修饰的溶素多肽能够减少生物膜。用于评价修饰的溶素多肽的最小生物膜根除浓度(MBEC)的方法可以使用具有修改的培养液微量稀释MIC方法的变体来测定(参见Ceri等人 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776,其通过引用以其整体并入本文,和Schuch等人, 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61,第1-18页,其通过引用以其整体并入本文)。在该方法中,将细菌、例如金黄色葡萄球菌、诸如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的菌落悬浮于培养基、例如磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,例如在TSBg (补充有0.2%葡萄糖的胰蛋白酶大豆培养液)中1:100稀释,作为例如0.15 ml等分试样添加至Calgary Biofilm Device (具有携带96个聚碳酸酯孔塞的盖的96孔板;lnnovotech Inc.)中,并在37℃下孵育例如24小时。然后洗涤生物膜,并用例如溶素在TSBg中的2倍稀释系列在例如37℃下处理24小时。处理后,将孔洗涤,在例如37℃下风干,并用例如0.05%结晶紫染色10分钟。染色后,将生物膜在例如33%乙酸中脱色,并测定例如提取的结晶紫的OD600。每份样品的MBEC是通过结晶紫定量评价的除去>95%的生物膜生物量所需的最小溶素浓度。
在一些实施方案中,本发明的修饰的溶素多肽降低抗生素的最小抑制浓度(MIC)。可以使用任何已知的评价MIC的方法。在一些实施方案中,棋盘测定法用于测定溶素对抗生素浓度的作用。棋盘测定法基于通过培养液微量稀释测定MIC的CLSI方法的修改(参见临床和实验室标准协会(CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-第10版. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 其通过引用以其整体并入本文,以及Ceri等人1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776,其也通过引用以其整体并入本文)。
通过首先准备例如96-孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘,其中每个孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在分开的板中,准备可比较的行,其中每个孔具有相同量的沿垂直轴稀释例如2倍的溶素。然后将溶素和抗生素稀释液合并,使得每列具有恒定量的抗生素和溶素的两倍稀释液,而每行具有恒定量的溶素和抗生素的两倍稀释液。因此,每个孔具有溶素和抗生素的独特组合。将细菌以给定浓度添加至药物组合中。然后,例如在37℃在环境空气中16小时后,记录单独和组合的每种药物的MIC。计算每种药物的分数抑制浓度总和(∑FICs),并使用最小∑FIC值(∑FICmin)来测定溶素/抗生素组合的作用。
本文公开的溶素多肽已由野生型PlySs2溶素修饰。PlySs2是一种细菌噬菌体溶素,其可以源自猪链球菌细菌。PlySs2证明针对多种细菌(包括革兰氏阳性细菌,包括葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和李斯特氏菌属细菌菌株,包括抗生素抗性金黄色葡萄球菌,诸如MRSA和万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌(VRSA))的广泛杀伤活性。野生型PlySs2具有以下氨基酸序列:
Figure 909435DEST_PATH_IMAGE002
Figure 780571DEST_PATH_IMAGE004
。SEQ ID NO:1具有245个氨基酸残基,包括起始的甲硫氨酸残基,其在翻译后加工期间被除去,剩下244个氨基酸的多肽。斜体的氨基酸指示CHAP结构域(氨基酸1至146),且虚线下划线指示SH3b结构域(氨基酸157至245)。两个结构域之间的天然存在的接头是PPGTVAQSAP (SEQ ID NO:2)。
如本文所公开,野生型PlySs2包含CHAP结构域和SH3b结构域两者,其各自进而包含多个T-细胞表位(TCE)。TCE 1、TCE 2、TCE 3和TCE 4位于CHAP结构域中,而TCE 5、TCE 6、TCE 7和TCE 8位于SH3b结构域中。TCE 1对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基32-45。TCE 2对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基84-98。TCE 3对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基100-112。TCE 4对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基128-145。TCE 5对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基164-170。TCE 6对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基172-187。TCE 7对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基189-201,且TCE 8对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基204-221。
在某些实施方案中,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,修饰的溶素多肽包含至少一个取代,其中所述至少一个取代在TCE 1、TCE 2、TCE 3或TCE 4中的一个或多个中,其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,修饰的溶素多肽包含至少一个取代,其中所述至少一个取代在TCE 5、TCE 6、TCE 7或TCE 8中的一个或多个中,其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,修饰的溶素多肽包含至少第一取代和至少第二取代,其中所述至少第一取代在TCE 1、TCE 2、TCE 3或TCE 4中的一个或多个中,且所述至少第二取代在TCE 5、TCE 6、TCE 7或TCE 8中的一个或多个中,其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。通常,与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2相比,修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。
在某些实施方案中,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,修饰的溶素多肽包含至少两个取代,其中所述至少两个取代在TCE 4中。在某些实施方案中,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,修饰的溶素多肽包含至少四个取代,其中至少一个取代在TCE 2中,至少一个取代在TCE 3中,且至少两个取代在TCE 4中。
在某些实施方案中,如本文所公开的修饰的溶素多肽可以通过如下修饰SEQ IDNO:1的氨基酸序列而产生:在CHAP结构域中的至少一个选自氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中的氨基酸取代,和/或在SH3b结构域中的至少一个选自氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中的氨基酸取代。因此,在某些实施方案中,本文公开了修饰的溶素多肽,其与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比具有至少一个氨基酸取代,其中所述修饰的溶素多肽包含:在CHAP结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中的至少一个氨基酸取代,和/或在SH3b结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中的至少一个氨基酸取代,其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽在SEQ ID NO:1的92、104、128和137的氨基酸残基中包含氨基酸取代。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽在SEQ ID NO:1的氨基酸残基92、104、128、137、164、184和198中包含氨基酸取代。通常,与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。
在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽可以含有至少3个氨基酸取代,诸如至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个氨基酸取代。在某些实施方案中,相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽可以含有3-9个氨基酸取代,诸如4-9、5-9、6-9、7-9、8-9或9个氨基酸取代。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽可以在CHAP结构域中相对于SEQ ID NO:1包含至少两个、诸如至少三个或至少四个氨基酸取代,且在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽可以在SH3b结构域中相对于SEQ ID NO:1包含至少两个、诸如至少三个或至少四个氨基酸取代。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽可以由CHAP结构域中相对于SEQ ID NO:1的两个、三个或四个氨基酸取代组成,且在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽可以由SH3b结构域中相对于SEQ ID NO:1的两个、三个或四个氨基酸取代组成。
在某些实施方案中,相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代中的一个或多个:R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含:位于CHAP结构域中的以下氨基酸取代中的一个或多个:R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S,和/或位于SH3b结构域中的以下氨基酸取代中的一个或多个:Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G,其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。通常,与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2相比,修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。
本文的取代使用以下单字母氨基酸代码指定:被替代的SEQ ID NO:1中的原始氨基酸,随后为SEQ ID NO:1中的氨基酸位置,随后被取代为序列以产生所述修饰的溶素多肽的氨基酸。因此,通过实例的方式,R35E指示其中SEQ ID NO:1的氨基酸编号35处的精氨酸被谷氨酸替代的取代。
示例性的修饰的溶素多肽在本文中被公开为pp55、pp61、pp65、pp296、pp324、pp325、pp341、pp338、pp388、pp400、pp616、pp619、pp628、pp632和pp642。
示例性的修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸取代,如下表1中所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 153783DEST_PATH_IMAGE006
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp55,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp61,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少80%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:4具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,其修饰的溶素多肽是pp65,且相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:5具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp296,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:6具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp324,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K和N184D。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:7具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp325,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:8具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp381,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:9具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp341,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少80%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:10具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp388,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:11具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp400,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:12具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp616,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:V128T、Y137S和Y164K。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp619,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:14具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp628,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ IDNO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:15具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp632,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少99%序列同一性。
在本文公开的某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽是pp642,且相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ IDNO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQID NO:17具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少99%序列同一性。
除了CHAP和/或Ch3b结构域中的至少一个取代,所述修饰的溶素多肽还可以包括一个或多个氨基酸插入和/或缺失,条件是那些修饰不干扰所述修饰的溶素多肽的裂解活性和/或降低的免疫原性。
还公开了嵌合的溶素多肽。嵌合的溶素多肽是本领域中已知的。例如,ClyF是一种嵌合溶素,其组合Ply187溶素的催化结构域(N-末端157个氨基酸残基)与PlySs2的结合结构域(C-末端99个残基)[10]。在某些实施方案中,所述嵌合的溶素多肽包含如本文所公开的修饰的PlySs2 CHAP结构域和另一种溶素的结合结构域。在某些实施方案中,所述嵌合的溶素多肽包含另一种溶素的催化结构域和修饰的PlySs2 SH3b结构域,如本文所公开。
在一些实施方案中,获得修饰的溶素多肽的活性片段。术语“活性片段”是指全长溶素的一部分,其保留参考溶素的一种或多种生物学活性。因此,如本文所用,修饰的溶素多肽的活性片段抑制至少一种革兰氏阳性细菌物种的生长,或减少至少一种革兰氏阳性细菌物种的种群,或杀死至少一种革兰氏阳性细菌物种。
多核苷酸
在一个方面,本公开涉及分离的多核苷酸,其包含编码如本文所公开的修饰的溶素多肽的核酸分子,其中所述修饰的溶素多肽具有裂解活性和与野生型PlySs2溶素(SEQ IDNO:1)相比降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽在TCE 1、TCE 2、TCE 3或TCE 4中的一个或多个中包含至少一个取代。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽在TCE 5、TCE 6、TCE 7或TCE 8中的一个或多个中包含至少一个取代。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽包含至少第一取代和至少第二取代,其中所述至少第一取代在TCE 1、TCE 2、TCE 3或TCE 4中的一个或多个中,且所述至少第二取代在TCE 5、TCE 6、TCE 7或TCE 8中的一个或多个中。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽包含至少两个取代,其中所述至少两个取代在TCE4中。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽包含至少四个取代,其中至少一个取代在TCE2中,至少一个取代在TCE3中,且至少两个取代在TCE4中。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽包含至少一个氨基酸取代,其中所述修饰的溶素多肽包含:在CHAP结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中的至少一个氨基酸取代,和/或在SH3b结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中的至少一个氨基酸取代。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽在SEQ IDNO:1的92、104、128和137的氨基酸残基中包含氨基酸取代。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽在SEQ ID NO:1的氨基酸残基92、104、128、137、164、184和198中包含氨基酸取代。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代中的一个或多个:R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含:位于CHAP结构域中的以下氨基酸取代中的一个或多个:R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S,和/或位于SH3b结构域中的以下氨基酸取代中的一个或多个:Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:3具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:4具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:4具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:4具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:5具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:5具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:5具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:6具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:6具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:6具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K和N184D。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQID NO:7的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:7具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:7具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:7具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQID NO:8的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:8具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:8具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:8具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQID NO:9的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:9具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:9具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:9具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:10具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:10具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:10具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:11具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:11具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:11具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:12具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:12具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:V128T、Y137S和Y164K。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:13具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:13具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:14具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:14具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:15具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:15具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:15具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:16具有至少99%序列同一性。
在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中相对于SEQ ID NO:1,所述修饰的溶素多肽包含以下氨基酸取代:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述核酸分子编码修饰的溶素多肽,所述修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少80%序列同一性,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,且任选地,其中与野生型PlySs2 (SEQ ID NO:1)相比,所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少85%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO:17具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQID NO:17具有至少98%序列同一性。在某些实施方案中,编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO:17具有至少99%序列同一性。
载体和宿主细胞
在另一个方面,本发明涉及载体,所述载体包含含有编码本文公开的任何修饰的溶素多肽的核酸分子的分离的多核苷酸或本发明的分离的多核苷酸的互补序列。在一些实施方案中,所述载体是质粒或粘粒。在其他实施方案中,所述载体是病毒载体,其中可以将额外的DNA区段连接至病毒基因组中。在一些实施方案中,所述载体可以在其引入的宿主细胞中自主复制。在一些实施方案中,所述载体可以在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中,且由此与宿主基因组一起复制。
在一些实施方案中,特定载体,在本文中称为“重组表达载体”或“表达载体”,可以指导与其可操作连接的基因的表达。当多核苷酸序列被置于与另一核苷酸序列的功能关系中时,其被“可操作连接”。例如,如果启动子或调节DNA序列和编码RNA和/或蛋白的DNA序列可操作连接或定位成使得所述启动子或调节DNA序列影响编码或结构DNA序列的表达水平,则所述启动子或调节DNA序列被称为“可操作连接”至编码RNA和/或蛋白的DNA序列。可操作连接的DNA序列通常但不一定是连续的。
通常,适合于在宿主中维持、繁殖或表达多肽的任何系统或载体都可用于表达本文公开的修饰的溶素多肽或其片段。可以通过任何各种众所周知和常规的技术、诸如例如Sambrook等人, 编, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), Vols. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory (2001)中所述的那些将适当的DNA/多核苷酸序列插入表达系统中。另外,也可以将标签添加至本公开的修饰的溶素多肽中以提供方便的分离方法,例如c-myc、生物素、多-His等。用于此类表达系统的试剂盒是商业可得的。
各种各样的宿主/表达载体组合可用于表达编码本发明的修饰的溶素多肽的多核苷酸序列。大量的合适载体是本领域技术人员已知的,并且是商业可得的。例如在Sambrook等编辑,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory(2001)中提供了合适的载体的实例。此类载体尤其包括,染色体、附加体和病毒衍生的载体,例如,衍生自以下的载体:细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒、诸如杆状病毒、乳多空病毒(papova virus)、诸如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒,以及衍生自其组合的载体,诸如衍生自质粒和细菌噬菌体遗传元件、诸如粘粒和噬菌粒的载体。
此外,所述载体可以提供本公开的修饰的溶素多肽的组成型或诱导型表达。合适的载体包括但不限于SV40的衍生物和已知的细菌质粒,例如大肠杆菌质粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9和它们的衍生物,质粒、诸如RP4、pBAD24和pBAD-TOPO;噬菌体DNAS,例如噬菌体A的许多衍生物,例如NM989和其他噬菌体DNA,例如M13和丝状单链噬菌体DNA;酵母质粒、诸如2D质粒或其衍生物;可用于真核细胞中的载体,诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体;衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体,诸如已经修饰为使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒;等等。上述载体中的许多可从供应商、诸如New England Biolabs Inc.、Addgene, Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等商业可得。
另外,载体可以包含各种调节元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、用于控制表达水平的各种顺式元件),其中载体根据宿主细胞而构建。各种各样的表达控制序列(控制与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的序列)中的任何一种可用于这些载体中以表达编码本公开的修饰的溶素多肽的多核苷酸序列。有用的控制序列包括但不限于:SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统的早期或晚期启动子、噬菌体A的主要操作子和启动子区域、fd包衣蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酯激酶或其他糖分解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母交配因子的启动子、用于在细菌中表达的大肠杆菌启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他启动子序列,及其各种组合。通常,编码修饰的溶素多肽的多核苷酸序列可操作地连接至异源启动子或调节元件。
在另一个方面,本公开涉及分离的宿主细胞,其包含本文公开的任何载体,包括包含编码本公开的修饰的溶素多肽的多核苷酸序列的表达载体。各种各样的宿主细胞可用于表达本发明的多肽。适用于表达本发明的多肽的宿主细胞的非限制性实例包括众所周知的真核和原核宿主,诸如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属的菌株,真菌,诸如酵母,和动物细胞,诸如CHO、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS1、COS7、BSCl、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养物中的人细胞和植物细胞。
尽管表达宿主可以是任何已知的表达宿主细胞,但在一个典型的实施方案中,表达宿主是大肠杆菌菌株之一。这些包括但不限于商业可得的大肠杆菌菌株、诸如Top10(ThermoFisher Scientific, Inc.)、DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.)、XLI-Blue (Agilent Technologies, Inc.)、SCSllO (Agilent Technologies, Inc.)、JM109(Promega, Inc.)、LMG194 (ATCC)和BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)。使用大肠杆菌作为宿主系统存在几个优点,包括:快速生长动力学,其中在最佳环境条件下,其倍增时间为约20分钟(Sezonov等人, J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)),容易实现高密度培养,用外源DNA容易且快速转化等。关于大肠杆菌中蛋白表达的详细信息,包括质粒选择以及菌株选择,由Rosano, G.和Ceccarelli, E.,Front Microbial., 5: 172 (2014)详细讨论。
本发明的修饰的溶素多肽的有效表达取决于各种因素,诸如最佳表达信号(均处于转录和翻译水平)、正确的蛋白折叠和细胞生长特征。关于用于构建载体的方法和用于将构建的重组载体转导入宿主细胞的方法,可以使用本领域中已知的常规方法。尽管理解并非所有载体、表达控制序列和宿主将同样良好地发挥功能以表达编码本公开的修饰的溶素多肽的多核苷酸序列,但在不脱离本公开的范围的情况下,本领域技术人员将能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主,而无需过多实验以完成期望的表达。
通过众所周知的方法,包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱,可以从重组细胞培养物回收和纯化本公开的修饰的溶素多肽。高效液相色谱也可用于溶素多肽纯化。
或者,用于产生本公开的修饰的溶素多肽的载体系统可以是无细胞表达系统。各种无细胞表达系统是商业可得的,包括但不限于可得自Promega、LifeTechnologies、Clonetech等的那些。
包含修饰的溶素多肽的组合物
本文公开的修饰的溶素多肽可以单独或与一种或多种常规抗生素和其他杀细菌剂一起并入抗微生物和杀细菌组合物及其单位剂型中。
通常,所述组合物含有有效杀死选自以下的革兰氏阳性细菌的量的如本文所公开的修饰的溶素多肽:金黄色葡萄球菌;单核细胞增多性李斯特氏菌;凝固酶阴性葡萄球菌,诸如来自表皮葡萄球菌组,腐生葡萄球菌组,模仿葡萄球菌组,中间葡萄球菌组,松鼠葡萄球菌组和猪葡萄球菌组;猪链球菌;化脓性链球菌;无乳链球菌;停乳链球菌;肺炎链球菌;绿色链球菌组、诸如咽峡炎链球菌组、缓症链球菌组、血链球菌组、牛链球菌组、唾液链球菌组和变异链球菌组中包括的物种;粪肠球菌;和屎肠球菌。
本文公开的组合物可以采取溶液剂、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、丸粒、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、粉剂、缓释制剂、栓剂、棉塞应用、气溶胶、喷雾剂、锭剂、糖锭剂、糖果、注射剂、口香糖、软膏、涂布剂、定时释放贴剂、吸收液体的抹布及其组合的形式。因此,所述组合物可以用作固体,诸如片剂,用于重构的冻干粉末,脂质体或胶束,或者所述组合物可以用作液体,诸如溶液,悬浮剂,含漱剂,乳液,或填充固体或液体的胶囊剂,诸如用于经口使用。在某些实施方案中,所述组合物可以呈用于直肠施用的栓剂或胶囊的形式,或者呈用于肠胃外(包括例如静脉内或皮下)或局部、诸如真皮、鼻、咽或肺使用的无菌可注射或可吸入溶液或悬浮液的形式。此类组合物包括药物组合物,并且其单位剂型可以以常规或特殊比例包含常规或新成分,具有或不具有额外的活性化合物或成分。此类单位剂型可以含有与待采用的预期每日剂量范围相称的任何合适有效量的活性成分。
载体和赋形剂可以选自各种各样对于人或兽医学使用可接受的物质。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体,诸如磷酸盐缓冲盐水溶液,水,多元醇,二糖或多糖,以及乳剂,诸如油/水乳剂和微乳剂。其他稳定赋形剂包括稳定和保护溶液(SPS)、环糊精和重组人白蛋白(rHSA)的专有共混物。其他赋形剂可以包括填充剂,缓冲剂,张力调节剂(例如盐和氨基酸),表面活性剂,防腐剂,抗氧化剂和共溶剂。对于包含本文公开的修饰的溶素多肽的固体口服组合物,合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于淀粉,糖,稀释剂,制粒剂,润滑剂,粘合剂,崩解剂等。对于液体口服组合物,合适的药学上可接受的赋形剂可包括但不限于水,二醇,油,醇,调味剂,防腐剂等。对于局部固体组合物,诸如乳膏,凝胶,泡沫,软膏或喷雾剂,合适的赋形剂可以包括但不限于乳膏,纤维素或油性基质,乳化剂,硬化剂,流变改性剂或增稠剂,表面活性剂,润肤剂,防腐剂,保湿剂,碱化或缓冲剂和溶剂。
例如,本文公开的修饰的溶素多肽可以与将液体悬浮液、溶液或乳液的pH维持在基本上不影响修饰的溶素多肽的活性的范围内的缓冲剂组合。例如,其中在施用后发现活性成分的组合物或环境的期望的pH范围可以在约4.0和约9.0之间,例如在约4.5和约8.5之间。
可以任选地包括稳定缓冲剂以允许修饰的溶素多肽以优化的方式发挥其活性。缓冲剂可以含有还原试剂,诸如二硫苏糖醇。稳定缓冲剂也可以是或包括金属螯合试剂,诸如乙二胺四乙酸二钠盐,或者其可以含有磷酸盐或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂,或任何其他缓冲剂,诸如Tris或琥珀酸盐。
可以以有效增强组合物中使用的修饰的溶素多肽的治疗效果的量在药物组合物中包括温和表面活性剂。合适的温和表面活性剂可以尤其包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇和脂肪酸的酯(诸如Tween系列),辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(诸如Triton-X系列),正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷,正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷,正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷,正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷,泊洛沙姆,聚山梨醇酯20,聚山梨醇酯80,聚乙二醇和生物学存在的表面活性剂,例如脂肪酸,甘油酯,甘油单酸酯,脱氧胆酸酯和脱氧胆酸酯的酯。
防腐剂也可以用于本文公开的组合物中,并且可以例如占总所述组合物的约0.05重量%至约0.5重量%。防腐剂的使用可以确保,如果产品被微生物污染,则制剂将防止或减少微生物生长(或减弱制剂的功效)。示例性防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯,对羟基苯甲酸丙酯,对羟基苯甲酸丁酯,氯二甲苯酚,苯甲酸钠,DMDM乙内酰脲,氨基甲酸3-碘-2-丙基丁酯,山梨酸钾,洗必太二葡萄糖酸盐或其组合。
对于口服施用,可以将本文公开的修饰的溶素多肽配制成固体或液体制剂,例如片剂,胶囊剂,粉剂,溶液剂,悬浮剂和分散剂。对于片剂或胶囊剂形式的口服施用,可以将活性成分与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合,所述赋形剂诸如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉,聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充剂(例如乳糖,蔗糖,葡萄糖,甘露醇,山梨糖醇,其他还原性和非还原性糖,微晶纤维素,硫酸钙或磷酸氢钙);润滑剂(例如硬脂酸镁,滑石粉,二氧化硅,硬脂酸,硬脂富马酸钠,山嵛酸酸甘油酯,硬脂酸钙等);崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠);润湿剂(例如月桂基硫酸钠),着色剂和调味剂,明胶,甜味剂,天然和合成树胶(诸如阿拉伯树胶,黄原胶或藻酸盐),缓冲盐,羧甲基纤维素,聚乙二醇,蜡等。对于液体形式的口服施用,可以将药物组分与无毒的药学上可接受的惰性载体(例如乙醇,甘油,水),悬浮剂(例如山梨醇糖浆,纤维素衍生物或氢化食用脂肪),乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶),非水性媒介物(例如杏仁油,油性酯,乙醇或分馏植物油),防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等。也可以添加稳定剂、诸如抗氧化剂(例如,BHA、BHT、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠或柠檬酸)以稳定剂型。
在某些实施方案中,可以通过本领域中众所周知的方法将片剂包衣。本文公开的组合物还可以引入微球或微胶囊,例如由聚乙醇酸/乳酸(PGLA)制成。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液剂,糖浆剂,乳剂或悬浮剂的形式,或者它们可以呈现为干燥产品,用于在使用前用水或其他合适的媒介物重构。可以合适地配制用于口服施用的制剂以给出活性化合物的受控或延迟释放。
活性剂也可以以脂质体递送系统(诸如小的单层囊泡、大的单层囊泡和多层囊泡)的形式施用。如众所周知,脂质体可以由各种磷脂(诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱)形成。
为了制备固体组合物、诸如片剂和丸剂,可以将如本文所公开的修饰的溶素多肽与药物赋形剂混合以形成固体预配制组合物。如果期望,片剂可以通过标准技术被糖包衣或肠溶包衣。片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式复合以提供赋予延长或延迟作用的优点的剂型。例如,片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分,后者呈前者上的包膜的形式。两种组分可以通过肠溶层分开,所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或进一步延迟释放。各种材料可用于此类肠溶层或包衣,此类材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。类似地,口服施用的药物可以以时间控制释放媒介物(包括扩散控制系统、渗透装置、溶出控制基质和易受腐蚀/可降解基质)的形式施用。
如本文所公开的局部组合物可以进一步包含药学上或生理学上可接受的载体,诸如皮肤病学或耳可接受的载体。在皮肤病学可接受的载体的情况下,此类载体可以与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容,并且可以包括满足这些要求的任何常规使用的皮肤病学载体。在耳可接受的载体的情况下,载体可以与耳朵的所有部分相容。本领域普通技术人员可以容易地选择此类载体。用于局部施用本文公开的化合物的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯和/或聚氧丙烯化合物、乳化蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。在配制皮肤软膏剂时,本公开的活性组分可以配制在油质烃基质、无水吸收基质、油包水吸收基质、水包油水可移除基质和/或水溶性基质中。在配制耳用组合物时,本公开的活性组分可以配制在包括载体的水性聚合悬浮液中,所述载体诸如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、Gelrite®、纤维素聚合物、诸如羟丙基甲基纤维素和含羧基聚合物、诸如丙烯酸的聚合物或共聚物,以及其他聚合缓和剂。如本文所公开的局部组合物可以呈适合于局部应用的任何形式,包括水性、水性-醇性、或油性溶液;洗剂或精华液分散体;水性、无水或油性凝胶,通过将脂肪相分散于水相中(O/V或水包油)或相反,将水相分散于脂肪相中(W/O或油包水)获得的乳液、微乳液或者可替代地微囊、微粒或者离子型和/或非离子型的脂质囊泡分散体,乳膏,洗剂,凝胶剂,泡沫剂(其可以使用加压罐、合适的涂抹器、乳化剂和惰性推进剂),香精,奶类产品,悬浮剂或贴剂。本文公开的局部组合物还可以含有助剂,诸如亲水或亲脂胶凝剂、亲水或亲脂活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香味剂、填料、防晒剂、气味吸收剂和染料。在一个进一步方面,本文公开的局部组合物可以与能够粘附或以其他方式与受试者的皮肤或其他组织或器官缔合的装置、诸如经皮贴片、敷料、垫、包裹物、基质和绷带结合施用,能够递送治疗有效量的如本文所公开的一种或多种修饰的溶素多肽。
在一些实施方案中,本文公开的局部组合物另外包含用于治疗局部烧伤的一种或多种组分。此类组分可以包括但不限于丙二醇水凝胶;二醇、纤维素衍生物和水溶性铝盐的组合;防腐剂;抗生素;和皮质类固醇。还可添加湿润剂(诸如固体或液体蜡酯)、吸收促进剂(诸如亲水性粘土、或淀粉)、粘性增加剂(viscosity building agent)和皮肤保护剂。局部制剂可以呈漂洗剂、诸如漱口水的形式。参见例如WO2004/004650。
本文公开的修饰的溶素多肽还可以通过注射包含适量的修饰的溶素多肽和载体的治疗剂而施用。例如,可通过肌内、脑室内、鞘内、真皮下、皮下、腹膜内、静脉内或通过直接注射或连续输注施用修饰的溶素多肽以治疗细菌、诸如革兰氏阳性细菌的感染。载体可以由蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合构成。另外,肠胃外注射的药物组合物除了包含以下的一种或多种外,还可以包含修饰的溶素多肽的药学上可接受的水性或非水性溶液:pH缓冲溶液、助剂(例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、稳定剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、悬浮液和乳液,以及用于在临使用前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
在某些实施方案中,用于注射的制剂可以以单位剂型(例如在安瓿中或在多剂量容器中)呈现,并且在某些实施方案中可以包括添加的防腐剂。所述组合物可以采取诸如油性或水性媒介物中的赋形剂、悬浮剂、溶液或乳液的形式,并且可以含有配制剂,诸如悬浮剂、稳定剂、填充剂和/或分散剂。活性成分可以呈粉末形式,用于在使用前用合适的媒介物、例如无菌的无热原水重构。缓冲剂的实例可以包括组氨酸、Tris、磷酸盐、琥珀酸盐柠檬酸盐、甲硫氨酸、胱氨酸、甘氨酸、温和表面活性剂、钙和镁。还可以包括还原剂,诸如二硫苏糖醇。
在肠胃外注射是所选择的施用模式的情况下,可以使用等渗制剂。通常,用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下,可以使用等渗溶液、诸如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂可以包括组氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、精氨酸、明胶和白蛋白,诸如人或牛血清白蛋白。普通技术人员将容易理解,许多前述赋形剂也可用于注射用组合物中。
可以将血管收缩剂添加至本文公开的组合物中。在某些实施方案中,可以提供无菌且无热原的组合物。
在另一个实施方案中,本文公开的组合物可以是干燥的可吸入粉末或其他可吸入组合物,诸如气溶胶或喷雾剂。本文公开的可吸入组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。为了通过吸入施用,可以使用合适的推进剂,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体,以气溶胶喷雾呈现的形式从诸如吸入器、加压气溶胶分配器或喷雾器的装置中方便地递送修饰的溶素多肽。在加压气溶胶的情况下,可以通过提供阀来递送计量的量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒,其含有活性成分和合适的粉末基质、诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
在一个实施方案中,本文公开的修饰的溶素多肽可以配制为干燥的可吸入粉末或气溶胶或喷雾剂。在具体实施方案中,修饰的溶素多肽吸入溶液可以进一步与用于气溶胶递送的推进剂一起配制。在某些实施方案中,溶液可以被雾化。本领域中有许多分配装置可用于通过吸入递送药物组合物,包括多肽。这些包括雾化器、加压气溶胶分配器和吸入器。
可以将表面活性剂添加至如本文所公开的可吸入药物组合物中以降低药物和推进剂之间的表面和界面张力。在药物、推进剂和赋形剂要形成悬浮液的情况下,可以需要或不需要表面活性剂。在药物、推进剂和赋形剂要形成溶液的情况下,表面活性剂可以是或不是必要的,这部分取决于特定药物和赋形剂的溶解度。表面活性剂可以是任何合适的无毒化合物,其与药物无反应性并且降低药物、赋形剂和推进剂之间的表面张力和/或充当阀润滑剂。
合适的表面活性剂的实例包括但不限于:油酸;脱水山梨糖醇三油酸酯;氯化鲸蜡基吡啶;大豆卵磷脂;聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯;聚氧乙烯(10)硬脂基醚;聚氧乙烯(2)油基醚;聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物;聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯;聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯;聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物;蓖麻油乙氧基化物;及其组合。
合适的推进剂的实例包括但不限于:二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷和二氧化碳。
用于可吸入组合物中的合适的赋形剂的实例包括但不限于:乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯;中链、短链或长链脂肪酸的甘油三酯,或其任何组合;全氟二甲基环丁烷;全氟环丁烷;聚乙二醇;薄荷醇;丙二醇单月桂酸甘油酯(lauroglycol);二甘醇单乙基醚;中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯;醇;桉树油;短链脂肪酸;及其组合。
在一些实施方案中,本文公开的组合物包括鼻应用。鼻应用包括例如鼻用喷雾剂、滴鼻剂、鼻用软膏剂、洗鼻液、鼻用注射液、鼻用填充物、支气管喷雾剂和吸入器、或间接通过使用咽喉锭剂、漱口水或漱口剂、或通过使用涂敷至鼻孔或面部的软膏,或这些和类似应用方法的任何组合。
还可以配制本文公开的组合物用于直肠施用,例如作为栓剂或保留灌肠剂(例如,含有常规的栓剂基质,诸如可可脂或其他甘油酯)。
在某些实施方案中,本文公开的组合物可以进一步包含至少一种抗生素,诸如至少一种有效抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的抗生素。在某些实施方案中,所述至少一种抗生素针对以下中的一种或多种是有效的:金黄色葡萄球菌;单核细胞增多性李斯特氏菌;凝固酶阴性葡萄球菌,诸如来自表皮葡萄球菌组,腐生葡萄球菌组,模仿葡萄球菌组,中间葡萄球菌组,松鼠葡萄球菌组和猪葡萄球菌组;猪链球菌;化脓性链球菌;无乳链球菌;停乳链球菌;肺炎链球菌;绿色链球菌组、诸如咽峡炎链球菌组、缓症链球菌组、血链球菌组、牛链球菌组、唾液链球菌组和变异链球菌组中包括的物种;粪肠球菌;和屎肠球菌。
在本文公开的组合物的某些实施方案中,修饰的溶素多肽与至少一种抗生素的组合可以表现出协同作用,例如在修饰的溶素多肽或抗生素抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的能力中的协同作用。协同作用可以指两种活性剂的组合的抑制活性,其中该组合的分数抑制浓度(FIC)指数小于1,且对于强协同作用,则该组合的分数抑制浓度(FIC)指数小于或等于0.5。药剂的FIC是当与另一种药剂组合使用时杀死细菌的该药剂的最小浓度除以当单独使用第一药剂时具有相同作用的第一药剂的浓度。A和B的组合的FIC指数是它们单独的FIC值的总和。
协同作用可以在棋盘测定中评估(并且可以通过时间-杀死曲线来验证)。每种棋盘测定生成许多不同的组合,并且按照惯例,最有效组合的FIC值用于计算FIC指数。FIC指数定义相互作用的性质。具有加性相互作用的抗细菌剂具有1的FIC指数;<1的FIC指数定义协同相互作用;具有>1的FIC指数的组合是拮抗性的。FIC指数越低,组合的协同作用越大。参见,例如,Singh, P.K. 等人, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L799–L805, 2000。协同作用对于一种基于修饰的溶素多肽和抗生素的共同施用的有效的、新的通用抗感染策略有意义。具体而言,可以以降低的剂量和量施用修饰的溶素多肽和抗生素中的每一种和二者,其具有增强的杀细菌和抑细菌活性且具有降低的抗性发展的风险。换言之,协同作用的益处不仅当以亚MIC浓度使用一种或两种药剂时实现,尽管可以通过用亚MIC浓度的每种药剂进行测试来揭示协同作用的存在。
方法
由于它们的高活性程度和它们的低毒性,同时呈现有利的治疗指数,可以将本文公开的修饰的溶素多肽施用于有此需要的受试者,例如,活体动物(包括人),用于治疗、缓解或减轻、缓和或消除易受其影响的适应症或病况。
因此,本公开的修饰的溶素多肽可以在体内使用,以例如治疗受试者中由于革兰氏阳性细菌、诸如金黄色葡萄球菌导致的细菌感染,以及在体外使用,以例如减少例如在医疗装置的例如表面上的细菌污染水平。
例如,在一些实施方案中,本发明的修饰的溶素多肽可用于预防、控制、破坏和治疗由革兰氏阳性细菌形成的细菌生物膜。当微生物细胞彼此粘附并嵌入表面上的细胞外聚合物质(EPS)的基质中时,生物膜形成发生。微生物在富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白)和营养素的这种受保护环境中的生长允许增强的微生物串扰(cross-talk)和增加的毒力。生物膜可以在任何支持环境(各种活体和非生命体表面、诸如CF肺的粘液栓、污染的导管、植入物、隐形眼镜等)中发展(Sharma等人. Biologicals, 42(1):1-7 (2014),其通过引用以其整体并入本文)。因为生物膜保护细菌,它们经常对传统的抗微生物治疗更有抗性,使它们成为严重的健康风险,其通过每年报告的超过100万例导管相关的尿路感染(CAUTI)病例来证明,其中许多可以归因于生物膜相关的细菌(Donlan, RM (2001) Emerg Infect Dis7(2):277-281;Maki D和Tambyah P (2001) Emerg Infect Dis 7(2):342-347)。
因此,在一个实施方案中,当革兰氏阳性细菌被细菌生物膜保护时,本公开的修饰的溶素多肽可用于预防、控制、破坏和治疗由于革兰氏阳性细菌导致的细菌感染。
在一个方面,本公开涉及治疗由如本文所述的革兰氏阳性细菌的一种或多种物种引起的细菌感染的方法,其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者施用如本文所述的药物组合物。
术语“感染”和“细菌感染”意在包括呼吸道感染(RTI),诸如患者中的呼吸道感染,所述患者具有囊性纤维化(CF),下呼吸道感染,诸如慢性支气管炎的急性恶化(ACEB),急性鼻窦炎,社区获得性肺炎(CAP),医院获得性肺炎(HAP)和医院呼吸道感染;性传播疾病,诸如淋球菌性宫颈炎和淋球菌性尿道炎;尿道感染;急性中耳炎;败血症,包括新生儿败血症和导管相关的败血症;和骨髓炎。还考虑由药物抗性细菌和多药抗性细菌引起的感染。
由革兰氏阳性细菌引起的感染的非限制性实例可以包括:A)医院感染:1.呼吸道感染,特别是在囊性纤维化患者和机械通气患者中;2.菌血症和败血症;3.伤口感染,尤其是烧伤受害者的那些;4.泌尿道感染;5.侵入性装置上的手术后感染;6.静脉内施用受污染的药物溶液引起的心内膜炎;7.具有获得性免疫缺陷综合征、癌症化疗、类固醇疗法、血液恶性肿瘤、器官移植、肾脏替换疗法和具有严重中性粒细胞减少症的其他病况的患者中的感染。B)社区获得性感染:1.社区获得性呼吸道感染;2.脑膜炎;3.由受污染的水引起的毛囊炎和耳道感染;4.老年人和糖尿病患者中的恶性外耳炎;5.儿童中跟骨的骨髓炎;6.通常与被污染的隐形眼镜相关的眼部感染;7.皮肤感染,诸如手经常暴露于水的人中的指甲感染;8.胃肠道感染;和9.肌肉骨骼系统感染。
本方法的革兰氏阳性细菌的一种或多种物种可以包括如本文所述或本领域中已知的革兰氏阳性细菌的物种中的任一种。通常,革兰氏阳性细菌的物种可以包括单核细胞增多性李斯特氏菌,金黄色葡萄球菌,凝固酶阴性葡萄球菌(包括至少40种公认的物种,包括,但不限于,表皮葡萄球菌组,腐生葡萄球菌组,模仿葡萄球菌组,中间葡萄球菌组,松鼠葡萄球菌组,猪葡萄球菌组,和被称为来自“未指定物种组”的任何分离株),猪链球菌,化脓性链球菌,无乳链球菌,停乳链球菌,肺炎链球菌,绿色链球菌组中包括的任何额外物种(包括,但不限于咽峡炎链球菌组、缓症链球菌组、血链球菌组、牛链球菌(现在是解没食子酸链球菌)组、唾液链球菌组和变异链球菌组中包括的所有物种和菌株),粪肠球菌,和屎肠球菌。革兰氏阳性细菌的其他实例包括但不限于放线菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属和梭状芽胞杆菌属。
在另一个方面,本公开涉及预防或治疗细菌感染的方法,其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用第一有效量的含有有效量的如本文所述的修饰的溶素多肽的组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素的组合。
如在本领域的技术之内,本公开的修饰的溶素多肽可以与标准护理抗生素或与最后手段的抗生素单独或以各种组合共同施用。针对革兰氏阳性细菌使用的传统抗生素在本文描述,并且可以包括,例如,甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星、溶葡萄球菌素、青霉素类、氯洒西林、红霉素、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素和非达霉素。
组合本公开的修饰的溶素多肽与抗生素提供了有效的抗细菌方案。在一些实施方案中,本公开的修饰的溶素多肽与一种或多种抗生素的共同施用可以在修饰的溶素多肽或抗生素中的任一或两者的降低的剂量和量、和/或降低的频率和/或治疗持续时间下实施,具有加强的杀细菌和抑细菌活性、降低的抗生素抗性风险,并具有降低的有害的神经或肾脏副作用(诸如与粘菌素或多粘菌素B使用有关的那些)的风险。如本文所用,术语“减少的剂量”是指与用相同活性成分的单一疗法相比的组合中的一种活性成分的剂量。在一些实施方案中,组合中修饰的溶素多肽或抗生素的剂量相比于各自的单一疗法可以是次优的或甚至亚阈值的。
在一些实施方案中,本公开提供了通过向受试者施用本文公开的一种或多种修饰的溶素多肽连同目标抗生素,与单独使用的一种或多种抗生素的活性相比,加强所述抗生素针对革兰氏阳性细菌的抗生素活性的方法。该组合针对细菌是有效的并允许克服针对该抗生素的抗性和/或以较低剂量使用该抗生素,减少不期望的副作用。
在又另一个方面,本公开涉及抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,或减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的方法,所述方法包括使所述细菌与含有有效量的如本文所述的修饰的溶素多肽的组合物接触,其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,或减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。
在一些实施方案中,抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,或减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种包括使细菌与如本文所述的修饰的溶素多肽接触,其中所述细菌存在于例如医疗装置、医院和其他健康相关或公共使用建筑中的地板、楼梯、墙壁和工作台面的表面以及手术室、急诊室、病房、诊所和浴室等中的设备的表面上。
可使用本文所述的修饰的溶素多肽保护的医疗装置的实例包括但不限于管道和其他表面医疗装置,诸如导尿管、粘液提取导管、抽吸导管、脐带插管、隐形眼镜、子宫内装置、阴道内和肠内装置、气管内管、支气管镜、牙齿假体和牙齿矫正装置、手术器械、牙科器械、管道、牙科用水线、织物、纸张、指示条(例如纸指示条或塑料指示条)、粘合剂(例如水凝胶粘合剂、熔融粘合剂或基于溶剂的粘合剂)、绷带、组织敷料或愈合装置和闭塞贴片,以及医疗领域中使用的任何其他表面装置。装置可以包括各种类型的电极、外部假体、固定带、压迫绷带和监视器。医疗装置还可以包括可以放置在插入或植入部位处的任何装置,所述部位诸如插入或植入部位附近的皮肤,并且其可以包括易感于革兰氏阳性细菌的定殖的至少一个表面。
剂量和施用
施用的剂量取决于许多因素,诸如所治疗的感染的活性;待治疗的受试者的年龄、健康和一般身体状况;特定的修饰的溶素多肽的活性;根据本公开的修饰的溶素多肽与其配对的抗生素(如果有的话)的性质和活性;以及这种配对的组合效果。在某些实施方案中,待施用的修饰的溶素多肽的有效量可以落入约0.1-100 mg/kg(或1至100微克/ml)、诸如0.5mg/kg至30 mg/kg的范围内。在某些实施方案中,可以每天1-4次施用所述修饰的溶素多肽,持续范围为1至14天的时段。如果还使用抗生素,则可以以标准给药方案或鉴于任何协同作用以较低量施用抗生素。然而,所有此类剂量和方案(不论是修饰的溶素多肽还是与其结合施用的任何抗生素)都进行优化。可以通过进行体外和体内试验性效力实验确定最佳剂量,如在本领域的技能之内,但将本公开纳入考虑。
考虑本文公开的修饰的溶素多肽可以提供快速的杀细菌作用,并且当以亚MIC量使用时,可以提供抑细菌作用。进一步考虑本文公开的修饰的溶素多肽可以针对一定范围的抗生素抗性细菌有活性。基于本公开,在临床环境中,本发明的修饰的溶素多肽可以是用于单独或与抗生素(包括已对其发展抗性的抗生素)一起治疗由药物抗性和多药抗性细菌引起的感染的有效替代物(或添加剂)。
在一些实施方案中,暴露于本文公开的修饰的溶素多肽的时间可影响每ml的活性多肽单位的期望浓度。被分类为“长”或“慢”释放载体(诸如例如某些鼻用喷雾剂或锭剂)的载体可以具有或提供每ml的更低浓度的多肽单位,但经历更长时间段,而“短”或“快”释放载体(诸如例如漱口液)可以具有或提供每诸如的高浓度的多肽单位(微克),但经历更短时间段。存在这样的情况,其中具有更高的单位/诸如剂量或更低的单位/诸如剂量可以是期望的。
对于本公开的修饰的溶素多肽,可以在细胞培养测定中或在动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中初始地估计治疗有效剂量。动物模型也可用于获得期望的浓度范围和施用途径。获得的信息然后可用于确定有效剂量以及在人中的施用途径。可以进一步调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望效果。可以纳入考虑的额外的因素包括疾病状态的严重程度;患者的年龄、重量和性别;饮食;期望的治疗持续时间;施用方法;施用的时间和频率;药物组合;反应灵敏度;对疗法的耐受性/应答;以及治疗医师的判断。
治疗方案可以使得有必要每日(例如,每天一次、两次、三次等),每隔一天(例如每隔一天一次、两次、三次等)、每半周、每周、每两周一次、一个月一次等施用。在一个实施方案中,可以作为连续输注给予治疗。单位剂量可以在多个时机施用。如通过监测临床症状所示,间隔也可以是不规则的。或者,可以作为缓释制剂施用单位剂量,在这种情况下可以使用较少频率的施用。剂量和频率可以根据患者变化。本领域技术人员将理解,此类指南将根据局部施用,例如鼻内、吸入、直肠等,或全身施用,例如口服、直肠(例如经由灌肠)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.),经尿道等而调整。
实施例
结合以下实施例将更好地理解本文所述的修饰的溶素多肽及其制备、表征和用途,所述实施例意欲作为本公开的范围的举例说明而不是限制。
本文使用以下缩写:
CHAP 溶素分子的半胱氨酸组氨酸依赖性的酰胺水解酶/肽酶(CHAP)内肽酶结构域(酶促活性结构域或EAD)
SH3b 溶素分子的C-末端SH3b_5 (“SH3b”)细胞壁结合结构域(或CBD)
MIC 最小抑菌浓度,通常以微克/毫升测量,表明足以抑制对照中观察到的细菌生长的至少80%的最小浓度。
X#Y 突变的符号。该数字表示具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2溶素的序列中的位置;X是野生型溶素中的原始氨基酸残基,且Y是修饰的溶素多肽中的替换氨基酸残基
VAN 万古霉素
DAP 达托霉素
WT 野生型
TCE T-细胞表位
实施例1 - 修饰的溶素多肽的选择
本文公开的修饰的溶素多肽由大型筛选程序产生,所述大型筛选程序涉及计算机芯片上、计算机指导鉴定野生型PlySs2溶素的推定T-细胞表位(TCE)的核心序列以及将任意TCE评分分配给野生型PlySs2溶素。在商业(按服务收费)基础上使用计算机芯片上筛选方法和算法,以鉴定野生型PlySs2溶素序列的潜在免疫原性相关区段(推定的T细胞表位),和靶向这些片段用于突变。鉴定经设计以破坏预测的TCE的突变。商业可得的服务可用于评价每种修饰的溶素多肽的免疫原性潜力。可以基于破坏的TCE向修饰的溶素多肽分配免疫原性评分。
然后计算机设计经设计以减弱或缺失推定的TCE的突变位点,并计算机选择替代氨基酸以降低TCE区段的TCE评分。在鉴定的TCE 1、TCE 2和TCE 3各自中选择七个氨基酸位置用于突变,并且在鉴定的TCE 4中选择47个氨基酸位置。生成总共16,121种仅在CHAP结构域中具有突变的变体。以类似的方式,分别在鉴定的SH3b TCE 5、6、7和8中选择5、8、19和21个氨基酸残基用于潜在的替代,并且生成总共15,960种在SH3b结构域中具有突变的变体。然后使用覆盖测试针对切割细菌细胞壁的肽聚糖的能力筛选每组突变体的文库(CHAP结构域和SH3b结构域文库)。
如下表2中所示,鉴定具有SEQ ID NO:1的序列的PlySs2的野生型氨基酸序列的以下区段(分别位于催化和细胞壁结合结构域中)作为推定的T-细胞表位(“ TCE”)的构建核心区段,或作为一个或多个T-细胞表位的可能形成部分。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
然后鉴定被预测为通过“耗竭”(消除或减弱)一种或多种假定的TCE而降低所得多肽的TCE评分的突变。将涵盖最多达16,121种CHAP结构域变体和15,960种SH3b结构域变体的文库克隆至pBAD24表达载体中,转化至大肠杆菌Top10细胞中,并在初步筛选中进行表征,以鉴定具有溶菌活性的修饰的溶素。裂解活性的初步筛选使用基于板的溶源性培养液(LB)软琼脂覆盖方法进行,所述方法先前开发以使用表达溶素的克隆检测溶素杀伤活性,而无需首先纯化。然而,可以使用任何其他确定裂解活性的方法。
简而言之,将所有文库成员(即,克隆)和载体对照菌株贴至补充有氨苄青霉素的LB玻璃板上,且然后通过用0.2%阿拉伯糖蒸气雾化1小时来诱导所得菌落。诱导后,将板孵育过夜以使得重组蛋白能够表达。表达后,将文库暴露于氯仿蒸气30分钟,以透化大肠杆菌细胞壁,风干,且然后用含有75 μl金黄色葡萄球菌菌株MW2于LB中的过夜培养物的熔融软LB琼脂覆盖。使覆盖的板在室温下放置15分钟,且然后在37℃下孵育16-24小时。金黄色葡萄球菌在表达活性溶素的克隆上的覆盖层中的限制性生长条件使得能够出现有助于溶素鉴定的独特的清除区域。载体对照没有清除区域。
在筛选的某些实施方案中,蛋白可以过表达,并且在某些实施方案中,蛋白可以不过表达。同样,在某些实施方案中,可以纯化蛋白,并且在某些实施方案中,可以不纯化蛋白。在一个示例性实施方案中,该蛋白可以过表达且不纯化。
将阳性克隆(即与独特的清除区域相关的克隆)传代培养以确保克隆纯度,且然后测序以证实独特序列并确定活性变体的脱免疫(DI)评分。以这种方式鉴定超过1000种具有一定范围的DI评分的活性变体。具有最低DI评分的活性克隆使用pBAD24表达载体在大肠杆菌Top10细胞中以高水平表达,通过柱色谱法纯化,并进一步基于信息的组合(包括Mueller-Hinton培养液和100%人血清两者中的MIC值,琼脂板上的大清除区域,热稳定性和易于纯化)进行选择。
基于这些标准,鉴定了36种CHAP变体和66种SH3b结构域变体。然后将36种CHAP结构域各自和66种SH3b结构域各自的序列修饰组合在单一大肠杆菌文库中,以得到总共最多达2376个克隆,其组合每个结构域的修饰。然后如上所述,使用软琼脂覆盖方法筛选合并的文库,鉴定530种表达溶菌活性的“组合的”突变体/变体。突变体可以称为嵌合的或改组的,因为它们组合来自一种变体的催化结构域与另一种变体的结合结构域。鉴定每种克隆的序列,并且对各自的推定的蛋白序列针对免疫原性进行评分。用于预测各种T-细胞表位突变的去免疫潜能的几种计算机芯片上计算方法是已知的,并且可以例如从公司诸如StealthBiologics, LLC商业可得[18]。然后选择具有最低DI评分的活性克隆用于过表达,纯化,进一步表征以及使用MIC测定法测试溶菌活性。进一步测试其子集在小鼠中性粒细胞减少性大腿感染模型(MNTI)中的体内效力。基于体外活性(低MIC值),使用类似于野生型蛋白的MNTI的体内效力,高热稳定性,高纯化产率和低TCE评分(例如比42的野生型(TC)TCE评分低至少25%,诸如低至少40%,然后选择活性最高的修饰的溶素多肽。最终选择的修饰的溶素多肽的氨基酸序列(参考与SEQ ID NO:1的差异和其氨基酸残基的位置)概述于下表3中(使用一个字母的氨基酸代码),如下:
Figure 752255DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
*在C-末端具有额外的赖氨酸残基,总共246个氨基酸。
**指示CHAP结构域和SH3b结构域中8个指示的TCE各自的DI(去免疫)评分。
在上表中,提供了每种变体的8个假定的TCE各自的总DI评分。对于测试的变体,在表中报告了MIC值。值范围为0.125 μg/mL至64 μg/mL。与变体相似,小规模纯化的野生型溶素具有1 μg/mL的MIC,而GMP级的野生型溶素具有0.5 μg/mL的MIC。尽管不希望受到理论的束缚,但野生型活性的差异可能归因于纯度差异。
使用棋盘测定法进行适合于治疗革兰氏阳性细菌的抗生素(例如达托霉素(DAP)和万古霉素(VAN))的协同研究。对于修饰的溶素多肽pp296和抗生素组合,测定针对5种甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)和5种甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)分离株的分数抑制浓度(FIC)指数值。≤0.5的FIC指数值可以解释为两种药剂之间的强烈协同作用,而0.5和1之间的值仍可被视为协同作用。鉴于pp296在催化结构域中具有四个氨基酸替代,pp296与抗生素协同作用的能力是出乎意料的。因此,本公开证明修饰的溶素多肽和适合于革兰氏阳性细菌的抗生素组合针对敏感细菌的显著有效性和协同作用。根据本公开,在使用其他去免疫活性变体、诸如pp55、pp61、pp65、pp400和pp619进行相似的测定后,可以预期定性相似的结果。
修饰的溶素多肽pp296与达托霉素和万古霉素两者的FIC指数值主要为0.5,并且与野生型几乎相同,表明pp296与达托霉素和万古霉素两者的协同活性与野生型溶素的协同活性几乎相同。参见以下实施例5。根据本公开,在使用其他去免疫活性变体、诸如pp55、pp61、pp65、pp400和pp619进行相似的测定后,可以预期定性相似的结果。
进一步的研究比较变体pp296的抗生物膜活性(测量为MBEC)与野生型PlySs2的抗生物膜活性(测量为MBEC)。各自都针对由17种MSSA和20种MRSA分离株形成的1日龄生物膜以96-孔培养液微稀释形式进行测试。修饰的溶素多肽pp296的MBEC值表明,与野生型PlySs2相比,修饰的溶素多肽针对大多数、但不是全部测试的MSSA和MRSA分离株更有活性。总之,修饰的溶素多肽pp296的体外活性概况可以与野生型PlySs2的体外活性概况相当和/或更好。参见以下实施例6。这些结果表明,本发明的修饰的溶素多肽保留或提高野生型PlySs2破坏、分散、抑制和处理生物膜及其形成的能力。因此,预期该活性将与抗生素组合持续。本公开还考虑用本文公开的修饰的溶素多肽处理医疗装置(诸如假体装置;瓣膜,诸如机械心脏瓣膜;导管;结肠造口术装置;乳房植入物;关节假体;心室分流器;起搏器;除颤器;心室辅助装置;隐形眼镜;和隐形眼镜盒)以避免细菌附着至此类装置的表面,这可能导致在使用此类装置后形成生物膜。
对来自表3的选择的修饰的溶素多肽进行进一步测试,如在随后的实施例中更详细描述。使用体内MNTI模型确定展示较低的MIC值(体外较高的活性)的这些修饰的溶素多肽中的几种的剂量应答,如下所述。在MNTI中测试的所有肽在较高剂量(15 mg/kg或更高)下表现令人满意,但仅pp296在较低剂量(0.5 mg/kg)下表现与野生型相当。除了野生型对照(CF-301和pp1149)以外,还在小鼠毒性筛选中测试表3中的15种修饰的溶素多肽中的一些,以查看它们是否具有与野生型蛋白相似的毒性概况。选择的器官的完全总体尸检和组织病理学评估揭示,在高达30 mg/kg的剂量下,修饰的溶素多肽pp296不引起外膜发现。相同的30 mg/kg剂量的PlySs2引起外膜发现的100%发生率,这指示潜在的毒性。
两项进一步毒性研究的结果是一致的。第一项研究涉及评估当向Sprague Dawley大鼠作为单次2小时静脉内输注施用时pp296的潜在毒性和毒物动力学概况。观察到恢复,如在最少3天恢复期后任何效果的持续性或进展一样。在这项研究中,评估临床体征、体重、体重增加、食物消耗、临床病理参数(血液学、凝血、血清化学和尿液分析)、总体尸检发现和组织病理学发现。研究发现以5、25、50和100 mg/kg的剂量水平向大鼠单次静脉内输注pp296被良好耐受,其中在所有剂量下均无不良应答。
第二项研究涉及动物延长和重复暴露于pp296并评估由该暴露导致的毒性。具体地,每天通过经由尾静脉输注2小时,施用0.5、2.5或10 mg/kg/天,持续连续7天。未发现毒性,如实施例10中所详述。
另外,评价当暴露于单独的修饰的溶素多肽时细菌发展对修饰的溶素多肽的抗性的能力以及当在亚MIC量的修饰的溶素多肽存在的情况下暴露于抗生素时细菌发展对DAP或VAN的抗性的能力。结果显示于图3A中,其中使用三种不同的复制谱系(称为pp296-1、pp296-2和pp296-3)未观察到修饰的溶素多肽pp296的MIC的增加或观察到修饰的溶素多肽pp296的MIC的非常少的增加。结果也显示于图3B和图3C中,其中在亚MIC量的修饰的溶素多肽pp296存在的情况下,没有观察到DAP或VAN的MIC的增加或观察到DAP或VAN的MIC的非常少的增加。抑制DAP抗性所需的pp296的量为0.125μg/mL,其为单独的pp296的MIC的1/16;在三种不同的重复谱系(称为pp296-1、pp296-2和pp296-3)中观察到DAP抗性的抑制。抑制VAN抗性的发展所需的pp296的量为0.25μg/mL,其为单独的pp296的MIC的1/8;在三种不同的重复谱系(称为pp296-1、pp296-2和pp296-3)中观察到VAN抗性的抑制。因此,修饰的溶素多肽pp296,如野生型溶素PlySs2,抑制抗生素抗性的发展,并且甚至在亚MIC量下也有效地做到这一点。为了抑制这种发展的目的,不需要使用比导致亚MIC浓度的溶素更高的量的溶素。然而,考虑使用更高量的溶素。基于上述结果,预期,当与细菌已对其发展抗性的抗生素组合施用时,pp296将能够克服抗生素抗性。
本文公开的修饰的溶素多肽的特征
本文所述的修饰的溶素多肽具有某些相似性,其在于催化结构域中替代的氨基酸残基大部分集中于TCE 2、TCE 3和TCE 4中,其中最后候选者中只有一者还具有在TCE 1处的取代。此外,替代的残基甚至更受限制,其中除两个以外的所有最终候选者在TCE 2中具有修饰L92W且在TCE 3中具有V104S,并且除一个以外的所有最终候选者还具有取代V128T和Y137S中的每一个。而且,似乎在TCE 2、3和4中的这四个取代是足够的(在结合结构域中没有任何取代或具有最小取代以基本上降低免疫原性而基本上不影响(并且事实上有时增加)活性。参见,例如,pp55、pp400、pp619和pp388。因此,在两个结构域中都不必与野生型发生变异。在催化结构域中的额外的取代,R35E,得到具有良好活性和基本上(超过50%)降低的免疫原性的多肽(pp400)。进一步值得注意的是,修饰的溶素多肽pp400在结合结构域中没有取代。然而,通常,单独的催化结构域中的突变可能不足以使溶素充分去免疫。
在TCE评分的方面,野生型溶素的推定的T细胞表位具有以下TCE评分,这使得CHAP结构域成为比SH3b结构域更重要的对免疫原性的总体贡献者:TCE1 = 4;TCE2 = 4, TCE3= 7;TCE 4 = 10;TCE5 = 4;TCE6 = 3;TCE7 = 4;且TCE8 = 6。
通常,催化结构域耐受更受限的各种取代。
转向结合结构域,再次观察到两个结构域中的取代都是不必要的。参见,例如,修饰的溶素多肽pp388。与催化结构域可能是对免疫原性的更重要的贡献者的观察一致,与在CHAP结构域中包含取代的活性的修饰的溶素多肽相比,没有CHAP结构域取代的修饰的溶素多肽pp388表现出免疫原性的较少的降低。
SH3b结构域的TCE 5、6、7和8中的取代被限制如下:TCE 5中的Y164N或Y164K(统称为Y164N/K);TCE 6中的N184D;TCE 7中的R195E、S198H或S198Q (S198H/Q);以及在TCE 8中的组合V204A/K和V212A/E或单独或与V214G组合的I206E。
综上所述,已经证明可以通过替代CHAP结构域的位置35、92、104、128或137中的一个或多个中的一个或多个氨基酸残基和/或SH3b结构域的位置164、184、195、198、204、206、212或214中的一个或多个氨基酸残基(该位置根据具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型溶素的序列编号)来产生溶素PlySs2的变体,以便与野生型溶素的免疫原性和/或毒性相比降低修饰的溶素多肽的免疫原性和/或毒性,同时维持针对野生型溶素的一种或多种靶标微生物的实质性裂解活性。免疫原性可以通过TCE评分使用任何可用的计算机芯片上计算指导的用于获得此类评分的方法(例如,在按服务收费的基础上商业可得的那些)来测量,并将其与亲本溶素的类似得到的TCE评分进行比较。例如,Stealth Biologics、ProImmune、Creative Biolabs、Epivax和其他公司可能进行此类研究,并且其中的几个可能对其进行体外和体内测试。或者,可以通过多种体外或体内免疫测定法中的任一种来评价免疫原性,诸如混合淋巴细胞反应或PBMC增殖测定法(以及评价增殖,例如通过检测和定量响应于用所测试多肽的刺激而分泌的一种或多种促炎性细胞因子)。最终,可以针对人免疫系统评价免疫原性。为此,存在许多可公开获得和监管机构认可的策略[6]。
如从表3可见,免疫原性可能仅部分涉及数字。一般而言,随着额外的T-细胞表位被耗竭或减弱,免疫原性可能降低,条件是停止基本上损害裂解活性的情况(通过使用任何可用的测试,诸如上述MIC测定法测试去免疫变体的活性)。然而,可能在给定的参数和指导范围内进行策略化,使得较小数目的氨基酸取代可以产生期望的效果,如例如pp55、pp616和pp388中所示。基于上述数据,推理CHAP结构域中的最佳取代数例如在TCE 2、TCE 3和TCE4位置中可以是三个。然而,修饰的溶素多肽还可以在CHAP结构域中容纳多于三个取代。
实施例2:修饰的溶素多肽的表达
野生型PlySs 2可以如例如授予Fischetti等人的美国专利9,034,322中所述获得。遵循相似的程序(可用阿拉伯糖诱导的质粒pBAD24),从突变体多核苷酸的文库表达本公开的修饰的溶素多肽。还通过用于纯化修饰的溶素多肽的方法纯化野生型PlySs2溶素样品,并将纯化的野生型PlySs2用作额外的阳性对照。ThermoFisher (InvitroGen)生成所有可能的CHAP结构域和SH3b变体的文库。具有基于SEQ ID NO:1的序列且具有表3中鉴定的修饰的修饰的溶素多肽可以例如通过从野生型PlySs2溶素进行定点诱变来生成。
将修饰的溶素多肽克隆至pBAD24载体中,并在大肠杆菌Top 10细胞中转化。pBAD24编码β-内酰胺酶(编码氨苄青霉素抗性),并且使得能够紧密控制阿拉伯糖诱导的转录。使重组大肠杆菌菌株在LB板上生长,用阿拉伯糖蒸气诱导,并用含有金黄色葡萄球菌菌株MW2的软琼脂覆盖层覆盖(Schuch, R.等人, 2009, Methods Mol Biol. 2009; 502:.doi:10.1007/978-1-60327-565-1_18)。如果修饰的溶素多肽有活性,则在大肠杆菌菌落周围出现清除区域(基于板的LB软琼脂覆盖方法)。
如下按比例放大生产:将来自-80℃储备物的转化的含有pBAD24_变体质粒的大肠杆菌新鲜划线,接种至含有100μg/mL羧苄西林和0.2%葡萄糖的LB培养基中,并生长过夜。第二天,将离心且重悬浮于PBS中的过夜培养物的50个稀释液中的1个接种至2升含有100μg/mL羧苄西林的LB培养基中。将培养物在37℃下生长3小时,然后添加阿拉伯糖至0.2%的最终浓度,并在25℃下过夜诱导16 +/- 3小时。将培养物以4000 rpm无菌离心20分钟。将沉淀物悬浮于Tris缓冲液pH 7.2 (细胞悬浮液)中至30 mL的体积,并且添加5µl 250 U/µlbenzonase (总共1250 U)和蛋白酶抑制剂的一个完整的不含EDTA的片剂(Roche)。然后将混合物超声处理,并通过以18,000 rpm离心30分钟进行澄清。然后将所得上清液用1份dH2O和1份25 mM Tris缓冲液pH 7.2(总体积90-100mL) 1:3稀释,并通过0.22微米膜,然后开始纯化过程。
实施例3:修饰的溶素多肽的纯化
野生型PlySs2和修饰的溶素多肽的纯化通过离子交换色谱、随后最终的大小排阻色谱进行。简而言之,首先将重悬浮的细胞裂解物通过5 mL Hi Trap DEAE柱(弱阴离子交换),然后用盐梯度从5 mL Hi Trap Capto MMC柱(弱阳离子交换柱,具有额外的疏水和H-键相互作用)洗脱。通过OD280定量级分,并通过SDS-PAGE凝胶电泳评价其纯度。合并含有蛋白的级分,并针对25 mM Tris缓冲液pH 7.4透析。透析后,将蛋白级分装载至5 mL Hi Trap QFF柱(强阴离子交换柱)上,并且收集流出液,并装载至第二个Capto MMC柱上,并通过盐梯度洗脱。合并含有蛋白的洗脱液,并针对磷酸盐盐水缓冲液透析,并使用HiLoad 16/600Superdex 75pg柱通过凝胶过滤(大小排阻)进一步纯化。所有纯化的样品都储存于Demo缓冲液 (7.67 mM磷酸二氢钠二水合物,7.33 mM磷酸氢二钠一水合物,150 mM NaCl,pH 7.2。对于纯化的修饰的溶素多肽中的一些,包括pp1149、pp53、pp55、pp61、pp65和pp296(而不是对于获得自合同制造商的已经纯化的野生型PlySs2),在大小排阻色谱(纯化方法的最后步骤)的洗脱峰下的级分的SDS-PAGE凝胶显示于图1中。
将如图1中所示的在圆圈中分组的修饰的溶素多肽的级分合并在一起。
纯化产率范围为每2L批次培养物的4和94克蛋白之间。纯化的修饰的溶素多肽和野生型对照具有以下特征,如下表4中所示:
Figure 35469DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 806066DEST_PATH_IMAGE012
实施例4:修饰的溶素多肽的热稳定性
通过在各种升高的温度 (在约30℃至60℃的范围内)下将固定浓度为128 µg/mL的溶素多肽在Tris缓冲液pH 8.0中孵育30分钟、然后评价活性来评价热稳定性。然后将样品在冰上冷却2分钟,且然后通过体外溶解测定通过将Tris缓冲液中的细菌接种物(OD600 ~0.5-1.2)暴露于每个样品的2倍稀释系列(沿96孔微量滴定板的x-轴从128-0.25 µg/mL稀释)来评价活性。在室温下追踪光密度的损失15分钟,并且基于使得在15分钟时光密度的损失50%的酶浓度测定比活性。将每种变体的酶活性与野生型、CF-301酶(GMT-级PlySs2蛋白)进行比较,以计算一定温度范围内的野生型活性的%。
将野生型、CF-301的热稳定性任意设置为100。示例性的修饰的溶素多肽在37℃的单一温度下的结果在下表5中列出:
表5
野生型或变体编号 在37℃下的%野生型活性
WT CF-301 100
WT pp1149 95.6
pp53 149.4
pp55 122, 146
pp61 258
pp65 220
pp296 205
在另一项实验中,在不同温度下评价修饰的溶素多肽的热稳定性,并将其与野生型、CF-301的热稳定性(设置为100)进行比较。对于修饰的溶素多肽中的几种(包括pp296),在42℃及以下的温度下的稳定性基本上高于野生型溶素的稳定性,且在45℃及以上的温度下的稳定性基本上低于野生型溶素的稳定性,如下表6中所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE013
实施例5:修饰的溶素多肽的体外裂解活性,与抗生素的协同作用以及不发展抗性
针对100%人血清(HuS)中的金黄色葡萄球菌分离株CFS-860 (CAIRD-426)评价所有PlySs2变体的体外活性,并将其与野生型PlySs2 (CF-301)和实验室中纯化的PlySs2 (称为pp1149)进行比较。根据用于评价MIC的CLSI(临床和实验室标准协会)培养液微量稀释方法测试所有变体,如下。
通过将划线分离株铺板在具有5%绵羊血液的BBL™ trypticase™大豆琼脂II板上在37℃下持续18-24小时,从80℃细菌储备物培养甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA菌株MW2),以获得单一菌落。将针对均匀外观选择的菌落接种至2.5 mL Mueller Hinton培养液(MHB)中。在室温下将浊度调节至0.5 McFarland标准单位(5 × 105菌落形成单位[CFU]/mL)。将标准化培养物在100%人血清中1:150稀释,然后在96-孔圆底、聚苯乙烯微量滴定板(BD)中暴露于野生型PlySs2或修饰的溶素多肽的2倍系列稀释液。将板在37℃下孵育16小时,然后确定抑制生长所需的最小溶素浓度。
针对补充有25%马血清和0.5 mM DTT的阳离子调节的Mueller Hinton培养液(CAMHB-HSD)中的一定范围的51种MSSA和51种MRSA分离株评价修饰的溶素多肽pp296的体外活性,并与WT GMP级PlySs2 (CF-301)进行比较。将CF-301和pp296各自稀释至CAMHB-HSD中。对于每种溶素,设置稀释系列,使得在板的每个孔的两倍稀释后,最终浓度含有:64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。针对每种菌株,一式两份测试每种溶素。将制备物孵育过夜。生长被显现为直径近似2 mm的增长按钮。产生≥80%生长抑制的最高稀释度被称为最小抑制浓度(MIC)。pp296的活性在一个2倍稀释度下与CF-301的活性非常相似,如下表7中所示。
Figure 541941DEST_PATH_IMAGE014
在另一项实验中,使用棋盘分析评价修饰的溶素多肽pp296与达托霉素和万古霉素协同作用的能力。对于pp296和抗生素组合确定针对5种MSSA和5种MRSA分离株的FIC(分数抑制浓度)指数值。将总共50 μl的Mueller-Hinton培养液(BBL)分配至微量稀释板的每个孔中。组合的第一种抗生素沿纵坐标系列稀释,而第二种药物沿横坐标稀释。从MHB中的每个金黄色葡萄球菌分离株制备等于0.5 McFarland浊度标准的接种物。向每个微量滴定孔接种100 μl 5 × 105 CFU/ml的细菌接种物,并将板在有氧条件下在37℃下孵育18 h。所得的棋盘含有两种抗生素的每种组合,并且在对角具有含有最高浓度的每种抗生素的孔。根据培养液微量稀释的CLSI指南,MIC被定义为用肉眼所检测的完全抑制生物体的生长的抗生素的最低浓度。为了定量所测试的抗生素之间的相互作用,对于每种菌株和抗生素组合,计算FIC指数(产生与单独的抗生素的MIC的最大变化的抗生素的组合)值,如下:
(A/MICA)+(B/MICB) =FICA +FICB=FIC指数,
其中A和B是组合中的每种试剂在单个孔中的MIC;当单独使用时,MICA和MICB是每种药物的MIC)。当FIC指数≤0.5时,该组合被认为是强烈协同作用的;并且当FIC指数> 0.5- <1时,该组合被认为是协同作用的。
使用pp296与达托霉素或万古霉素的组合生成针对5种MRSA菌株(MW2、JMI-5675、JMI-4408、JMI-6181和JMI-6182)和5种MSSA菌株(ATCC 29213、JMI-40979、JMI-43257、JMI-41293和JMI-49315)的棋盘。协同作用被定义为抑制活性大于通过一起添加两种组分所预期的抑制活性。对于万古霉素,修饰的溶素多肽pp296和CF-301针对所检查的10株菌株中的6种表现出相同的0.5的FIC指数值,表明强烈的协同作用。针对一种MRSA (JMI-6182)和一种MSSA菌株(JMI-40979),与CF-301的FIC指数值(0.5的FIC指数值)相比,pp296表现出0.375的稍微优异的FIC指数值。针对一种MSSA (ATCC 29213)和一种MRSA (JMI-41293)菌株,与CF-301针对两种菌株的0.5的FIC指数值相比,pp296还表现出0.625和0.75的稍微更高的FIC指数值。这些发现表明pp296表现出与达托霉素和万古霉素的协同作用水平,与CF-301非常相似。
在另一项实验中,确定在与亚MIC量的pp296组合的抗生素存在的情况下连续传代21-26天后,细菌(MRSA菌株MW2)没有发展对抗生素达托霉素和万古霉素的抗性,细菌在没有pp296的抗生素存在的情况下连续传代的情况也是如此。
使用MRSA菌株MW2在pp296稀释系列和抗生素稀释系列存在的情况下和亚MIC量的pp296存在和不存在的情况下在连续传代18天中进行细菌抗性的分析。简而言之,使用培养液微量稀释MIC格式,其中在固定亚MIC量的pp296存在和不存在的情况下将单独的pp296或抗生素的2倍稀释范围与MHB中的细菌(5x105 CFU/ml起始浓度)在37℃下培养20小时。然后将具有最高浓度的修饰的溶素多肽的孔(其中看到细菌生长)用作第二天传代的接种物,并在21至26天时段内重复该过程。记录每个每日时间点的MIC,并以MIC的逐步增加来测量抗性。在测定中,未观察到对pp296的抗性。此外,亚MIC量的pp296抑制达托霉素和万古霉素的出现。结果图示描绘于图3A-3C中。
实施例6:修饰的溶素多肽的抗生物膜活性
针对由17种MSSA和20种MRSA分离株形成的1日龄生物膜以96孔培养液微量稀释形式测定pp296的抗生物膜活性。与野生型PlySs2 (CF-301)相比,通过以下标准方法测定pp296的最小生物膜根除浓度(MBEC)值。将细菌悬浮于PBS (0.5 McFarland单位)中,在TSBg(66%胰蛋白酶大豆培养液,0.2%葡萄糖)中1:100稀释,作为0.15 mL等分试样添加至96-孔聚苯乙烯微板中,并在37℃下孵育24小时。然后洗涤生物膜,并在37℃下用CF-301或pp296于TSBg中的2倍稀释系列处理24小时。一式三份地检查所有样品。处理后,将孔洗涤,在37℃下风干,并用0.05%结晶紫染色10 min。视觉评价生物膜生物量的损失,并通过溶解在33%(体积/体积)乙酸中来定量结晶紫。使用SpectraMax M3 Multimode微板阅读器测定600 nm的光密度(OD600)。每个样品的MBEC是通过结晶紫定量评价的除去> 95%的生物膜生物量所需的最小溶素浓度。使用MBEC测定,与野生型PlySs2相比,确定pp296针对测试的大多数(但不是全部)MSSA和MRSA分离株更有活性。因此,pp296抗生物膜活性总体稍微好于野生型溶素的活性,如下表8中所示。
表8
pp296与CF-301相比的抗生物膜活性
Figure DEST_PATH_IMAGE015
实施例7:修饰的溶素多肽的体内效力
在使用小鼠中性粒细胞减少性大腿感染(MNTI)模型的剂量应答(0-60 mg/kg)测定中,将四种修饰的溶素多肽的效力与野生型PlySs2进行比较。
通过使细菌细胞在MHB中生长至指数相、直到它们在600 nm处达到约0.5的光密度(OD)来生成细菌接种物。彻底洗涤细菌细胞,重悬浮于0.9%氯化钠USP中,并稀释至3.9x108菌落形成单位(CFU)/mL的当量。如下所述将细胞在0.9%氯化钠USP中进一步稀释,并维持在湿冰上。
分别地,通过腹膜内(ip)施用150 mg/kg和100 mg/kg的环磷酰胺在雌性BALB/cByJ小鼠(5-7周,Jackson Laboratories)中诱导中性粒细胞减少症,4天和1天后接种细菌。将细菌接种物(金黄色葡萄球菌分离株CFS-860,100 µl 107 CFU/ml溶液)肌肉内(IM)注射至每只小鼠的两条后大腿中。在ip注射后2小时开始,向小鼠静脉内(0、5、15、30、60mg/kg)给药野生型PlySs2溶素和修饰的溶素多肽pp1149、pp55、pp61、pp65和pp296(每个剂量2只小鼠)。在接种后2小时(早期对照)和治疗开始后24小时,将动物安乐死(CO2窒息),并无菌移取大腿。称重每条大腿,置于4ml无菌盐水中,并使用Precellys24高通量组织匀浆器(Bertin Corp, Rockville, MD)在7ml裂解管中匀浆。将匀浆的稀释液铺板在胰蛋白酶大豆血琼脂板(Becton Dickinson)上,并在CO2培养箱中在37℃下孵育过夜。计数细菌负荷,并表示为log10 CFU/g大腿重量,并与感染后2小时收获的对照动物(早期对照)和用媒介物处理的动物(晚期对照)进行比较。
代表小鼠大腿细菌负荷的数据描绘于图2中。y-轴上的上点是单独的媒介物,且y-轴上的下点是早期对照。实际上,pp1149也是实验室中过表达和纯化的野生型溶素连同其他修饰的溶素多肽,并用作额外的阳性对照。
在图2中可见,四种变体(pp55、pp61、pp65和pp296)具有与野生型PlySs2溶素相当的活性,且pp296是优异的,因为其活性与野生型PlySs2溶素的活性相当,甚至在使用的最低剂量(5 mg/kg)下。
实施例8:小鼠中的毒性筛选
小鼠毒理学筛选显示,用30 mg/kg野生型PlySs2给药的小鼠发展混合的炎性细胞种群的血管周围浸润,伴随腹部和胸主动脉以及心脏基部的主动脉根部中的外膜损伤(或外膜发现)。在用30 mg/kg野生型PlySs2和野生型PlySs2 (pp1149)给药的所有小鼠中观察到外膜发现。在用30 mg/kg剂量的pp53处理的4只小鼠中的3只中,观察到外膜病变,所述pp53与PlySs2野生型溶素的区别仅在于在C-末端位置246处的额外的赖氨酸氨基酸残基。用≥30mg/kg剂量的剩余修饰的溶素多肽施用的小鼠没有任何外膜发现。
在该实验中未导致外膜损伤的四种修饰的溶素多肽(pp55、pp61、pp65和pp296)在催化结构域中具有相同的突变(L92W、V104S、V128T和Y137S),表明野生型溶素中的相应位置可能促成观察到的不良效果。用pp53给药的小鼠中存在外膜损伤表明,在PlySs2溶素的C-末端处的额外的赖氨酸残基不足以防止毒性。
其他轻度病理发现偶尔存在于不同组的小鼠中,但不能归因于溶素施用。在来自不同剂量组的小鼠中观察到肾脏中的最小变化,并且尽管不希望受到理论的束缚,但这种差异可能与测试多肽的纯度相关,因为野生型PlySs2 (CF-301)不导致肾脏发现,而在用野生型PlySs2 (pp1149)施用的4只小鼠中的1只中注意到肾脏改变。在任何事件中,病理的发生是轻微的,不一致的,并且也不值得关注。
基于这些实验,pp296似乎具有最期望的特征组合,包括与野生型溶素的活性相当的体内和体外活性,与野生型溶素相比,具有降低的免疫原性和降低的毒性,如通过外膜发现的发生率所测量。
预言例9:体外免疫原性评价
对来自不同供体的外周血单核细胞(PBMC)进行HLA分型并进行评估,以证实在全球人群中的广泛代表性。PBMC将与蛋白或对照或者不暴露于变体的情况下一起培养。将PBMC样品培养14天,在第4、7和11天进行培养基更换和细胞因子支持。在第14天,将收获来自每种培养物的PBMC样品,并等分至用针对目标细胞因子的抗人抗体预先包被的FluoroSpot®板。在板孵育之前,将每个样品用变体或野生型溶素刺激(作为阳性对照)(作为攻击或首次暴露),或不用蛋白刺激(作为阴性对照)。
24小时后,将通过添加FITC标记的抗细胞因子抗体(例如抗IFN-γ抗体)来使FluoroSpot®板显色。抗FITC-490抗体的添加将使斑点出现在膜上,其将在Zeiss自动化FluoroSpot®阅读器系统上进行计数。
将基于每种变体或对照的暴露和未暴露样品之间的斑点计数的差异来确定阳性应答(Student氏T-检验)。将评估不同变体间的应答的统计显著性(p <0.05)。
实施例10:大鼠中的毒性研究
该研究的目的是评估当向Sprague Dawley大鼠作为单次2小时静脉内输注施用时pp296的潜在毒性和毒物动力学概况,以及评估最少3天恢复期后的任何效果的恢复、持久性或进展。
下表9和10呈现研究组安排。A阶段中每组存在5只雄性和5只雌性大鼠。
表9 - 研究设计 –A阶段
组编号 处理 剂量水平           (mg/kg) 浓度         (mg/mL) 剂量体积           (mL/kg/hr)
1 媒介物<sup>a</sup> 0 0 5
2 pp296 5 0.5 5
3 pp296 25 2.5 5
4 pp296 50 5.0 5
5 pp296 100 10 5
a媒介物是20mM L-组氨酸,5% D-山梨醇(w/v),pH 7.0 (± 0.1)。
表10 - 研究设计- B阶段毒物动力学组
Figure 944104DEST_PATH_IMAGE016
b B阶段毒物动力学组6-8以与对于A阶段组1-5相同的方式给药(以上述指定的剂量体积静脉内输注2小时)。每组存在6只雄性和6只雌性大鼠。
对于主要阶段(A阶段)和毒物动力学阶段(B阶段),动物接受单次2小时静脉内输注。A阶段动物接受递增剂量的单次2小时静脉内输注,直至确定最大耐受剂量(MTD)直至100 mg/kg的高剂量。每个pp296剂量之间允许最少3天的观察。在剂量施用结束后近似72小时,对分配至第2组至第5组的动物进行尸检。
在该研究中评估以下参数和终点:临床体征,体重,体重增加,食物消耗,临床病理参数(血液学,凝血,血清化学和尿液分析),总体尸检发现和组织病理学检查。
基于该研究的结果,向Crl:CD(SD)大鼠以5、25、50和100 mg/kg的剂量水平的pp296的单次静脉内输注被良好耐受,其中在所有剂量下都没有不良发现。因此,未观察到的不良效果水平(NOAEL)被认为> 100 mg/kg,因为在最高测试剂量(100 mg/kg)下未观察到毒性。
实施例11:大鼠中的额外毒性研究
该研究的目标是评估当连续7天每天向Sprague Dawley大鼠通过2小时输注施用时修饰的溶素多肽pp296的潜在毒性和毒物动力学概况。
实验程序、动物和治疗概述于下表11中。
表11
组编号 处理 剂量水平 (mg/kg/天) 剂量体积<sup>a</sup>  (mL/kg) 浓度  (mg/mL) 剂量速率 (mL/kg/hr) 动物数目  雄性/雌性
1 媒介物 0 10 0 5 5/5
2 pp296 0.5 0.5 1 0.25 5/5
3 pp296 2.5 2.5 1 1.25 5/5
4 pp296 10 10 1 5 5/5
在第8天将所有存活的动物进行尸检(终末安乐死)。进行尸检,并由测试设施人员收集器官重量。器官重量数据的统计分析由在按服务收费的商业基础上参与的测试机构进行。将显微镜评估所需的组织修剪,常规处理,包埋在石蜡中,并由Charles RiverLaboratories Ashland, LLC用苏木精和伊红染色。由委员会认证的兽医病理学家对来自第1组至第4组中的所有动物的所选方案指定的组织以及来自所有动物的全部总体病变进行显微镜评估。通过光学显微镜评估组织。
当连续7天经由尾静脉每天通过2小时输注施用时,Sprague Dawley大鼠耐受0.5、2.5或10 mg/kg/天的剂量的修饰的溶素多肽pp296。在整个研究中没有计划外的死亡,并且没有pp296相关的总体、显微镜或器官重量发现。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围中。实际上,除了本文描述的那些之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将从前面的描述变得显而易见。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料都在此通过引用并入。
参考文献
(1)Fischetti VA, Nelson D, Schuch R. Reinventing phage therapy:are theparts greater than the sum
Figure DEST_PATH_IMAGE018A
Nat Biotechnol. 2006;24:1508-1511.
(2)Louie L, Kaw P, Liu W, Jumbe N, Miller MH, 和Drusano GL.Pharmacodynamics of Daptomycin in a Murine Thigh Model of Staphylococcusaureus Infection. AAC 2001:45(3), 845-851.
(3)Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteriathat grow aerobically; approved standard-第10版. Wayne (PA): Clinical andLaboratory Standards Institute (US); 2015 Jan. 35(2). Report No: M07-A10.
(4)Schuch R, Lee HM, Schneider BC, Sauve KL, Law C, Khan BK, Rotolo JA,Horiuchi Y, Couto DE, Raz A, Fischetti VA, Huang DB, Nowinski RC, 和WittekindM. JID. Combination Therapy With Lysin CF-301 and Antibiotic Is Superior toAntibiotic Alone for Treating Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus–Induced Murine Bacteremia. 2014; 209:1469–78.
(5)VanScoy B, Mendes RE, Nicasio AM,Castanheira M,Bulik CC, Okusanya OO,Bhavnani SM, Forrest A, Jones RN, Friedrich LV, Steenbergen JN, 和Ambrose PG.Pharmacokinetics-Pharmacodynamics of Tazobactam in Combination withCeftolozane in an In Vitro Infection Model. AAC 2013:57, 2809–2814.
(6)Wadhwa, M. 等人, “Immunogenicity assessment of biotherapeuticproducts: An overview of assays and their utility,” Biologicals, 2015, 43:298 – 306; doi.org/10.1016/j.biologicals.2015.06.004.
(7)Soria-Guerra, S.E. 等人, An overview of bioinformatics tools forepitope prediction: Implications on vaccine development, J. Biomed.Informatics 53 (2015) 405–414.
(8)Jawa V. 等人, Clinical Immunology (2013) 149, 534–555.
(9)Entenza JM 等人., “Therapeutic effects of bacteriophage Cpl-1 lysinagainst Streptococcus pneumoniae endocarditis in rats,” Antimicrob Agents Chemother. 2005 Nov;49(11):4789-92.
(10)Yang, H. 等人, Sci Rep. 2017 Jan 9;7:40182. doi: 10.1038/srep40182.
(11)Mazor, R. 等人, “Dual B- and T-cell de-immunization of recombinantimmunotoxin targeting mesothelin with high cytotoxic activity,” 2016,Oncotarget, 7(21): 29916.
(12)Blazanovic, K. 等人, “Structure-based redesign of lysostaphin yieldspotent antistaphylococcal enzymes that evade immune surveillance,” 2015, Mol. Ther.—Meths & Clin. Dev. (2015) 2, 15021; doi:10.1038/mtm.2015.21.
(13)Zhao, H 等人, “Depletion of T cell epitopes in lysostaphin mitigatesanti-drug antibody response and enhances antibacterial efficacy in vivo,”Chem Biol., 2015, 22(5): 629–639. doi:10.1016/j.chembiol.2015.04.017.
(14)De Groot, A 等人, “Prediction of immunogenicity: in silico paradigms,ex vivo and in vivo correlates,” Curr. Opin. Pharmacol., 2008, 8:1–7.
(15)Parker AS, 等人., “Structure-guided deimmunization of therapeuticproteins,” J. Comput. Biol. 2013, 20:152–165.
(16)King, C 等人., “Removing T-cell epitopes with computational proteindesign,” 2014, PNAS 111(23): 8577-8582.
(17)Mazor, R. 等人, PNAS | June 10, 2014 | vol. 111, no. 23: 8571–8576.
(18)Griswold, K. 等人, Curr Opin Struct Biol. 2016 Aug; 39: 79–88; 2016年6月17日在线公开. doi: 10.1016/j.sbi.2016.06.003。
Figure IDA0002739704070000011
Figure IDA0002739704070000021
Figure IDA0002739704070000031
Figure IDA0002739704070000041
Figure IDA0002739704070000051
Figure IDA0002739704070000061
Figure IDA0002739704070000071
Figure IDA0002739704070000081
Figure IDA0002739704070000091
Figure IDA0002739704070000101
Figure IDA0002739704070000111
Figure IDA0002739704070000121
Figure IDA0002739704070000131
Figure IDA0002739704070000141
Figure IDA0002739704070000151
Figure IDA0002739704070000161
Figure IDA0002739704070000171
Figure IDA0002739704070000181
Figure IDA0002739704070000191
Figure IDA0002739704070000201
Figure IDA0002739704070000211
Figure IDA0002739704070000221

Claims (34)

1.修饰的溶素多肽,其与野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代,所述野生型PlySs2溶素多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)结构域和细胞壁结合(SH3b)结构域,其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域和/或所述SH3b结构域中,其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群,或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。
2.权利要求1的修饰的溶素多肽,其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中和/或在所述SH3b结构域中的至少一个选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中。
3.权利要求2的修饰的溶素多肽,其中所述CHAP结构域中的至少一个氨基酸取代是以下中的至少一个:R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。
4.权利要求2的修饰的溶素多肽,其中所述SH3b结构域中的至少一个氨基酸取代是以下中的至少一个:Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G。
5.权利要求2的修饰的溶素多肽,其中所述修饰的溶素多肽具有所述CHAP结构域中的至少一个选自R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S的氨基酸取代和所述SH3b结构域中的至少一个选自Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G的氨基酸取代。
6.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其在所述CHAP结构域中包含至少两个氨基酸取代。
7.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其在所述SH3b结构域中包含至少两个氨基酸取代或至少三个氨基酸取代。
8.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其中与SEQ ID NO:1相比,所述修饰的溶素多肽包含3-9个氨基酸取代,其中所述3-9个氨基酸取代选自:R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。
9.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其中所述至少一个氨基酸取代包含L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q。
10.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其中所述CHAP结构域中的至少一个氨基酸取代包含L92W、V104S、V128T和Y137S。
11.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其中所述至少一个氨基酸取代选自:
(i) L92W、V104S、V128T和Y137S;
(ii) Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E;
(iii) L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E;
(iv) L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A;
(v) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q;
(vi) V128T、Y137S和Y164K;
(vii) R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S;
(viii) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E;
(ix) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E;
(x) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和N184D;
(xi) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E;
(xii) L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A;
(xiii) L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K;
(xiv) L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G;和
(xv) L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H。
12.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其针对以下中的一种或多种具有的最小抑制浓度(MIC)为野生型PlySs2溶素的最小抑制浓度(MIC)的不大于约2倍、约3倍或约5倍:金黄色葡萄球菌;单核细胞增多性李斯特氏菌;金黄色葡萄球菌;凝固酶阴性葡萄球菌,诸如来自表皮葡萄球菌组,腐生葡萄球菌组,模仿葡萄球菌组,中间葡萄球菌组,松鼠葡萄球菌组和猪葡萄球菌组;猪链球菌;化脓性链球菌;无乳链球菌;停乳链球菌;肺炎链球菌;绿色链球菌组、诸如咽峡炎链球菌组、缓症链球菌组、血链球菌组、牛链球菌组、唾液链球菌组和变异链球菌组中包括的物种;粪肠球菌;和屎肠球菌。
13.权利要求12的修饰的溶素多肽,其中针对以下中的一种或多种的MIC为野生型PlySs2溶素的MIC的不超过约5倍:金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和无乳链球菌。
14.权利要求12或13的修饰的溶素多肽,其中所述MIC为野生型PlySs2溶素的MIC的不超过约4倍。
15.权利要求12-14的修饰的溶素多肽,其中所述MIC为野生型PlySs2溶素的MIC的不超过约2倍。
16.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其中与野生型PlySs2溶素相比,所述修饰的溶素多肽降低免疫原性和/或降低炎性应答相关的毒性。
17.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽,其中在体外评价抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长,减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种,作为MIC和/或最小生物膜根除浓度(MBEC)。
18.组合物,其包含可接受的载体和抗细菌量的根据前述权利要求中任一项所述的修饰的溶素多肽。
19.权利要求18的组合物,其中所述组合物是药物组合物,且所述载体是药学上可接受的载体。
20.权利要求18或19的组合物,其中所述抗细菌量的所述修饰的溶素多肽有效地抑制一种或多种革兰氏阳性细菌的生长,或减少一种或多种革兰氏阳性细菌的种群,或杀死一种或多种革兰氏阳性细菌,所述革兰氏阳性细菌选自:金黄色葡萄球菌;单核细胞增多性李斯特氏菌;凝固酶阴性葡萄球菌,诸如来自表皮葡萄球菌组,腐生葡萄球菌组,模仿葡萄球菌组,中间葡萄球菌组,松鼠葡萄球菌组和猪葡萄球菌组;猪链球菌;化脓性链球菌;无乳链球菌;停乳链球菌;肺炎链球菌;绿色链球菌组、诸如咽峡炎链球菌组、缓症链球菌组、血链球菌组、牛链球菌组、唾液链球菌组和变异链球菌组中包括的物种;粪肠球菌;和屎肠球菌。
21.权利要求18-20中任一项的组合物,其中所述革兰氏阳性细菌是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌或万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌。
22.权利要求18-21中任一项的组合物,其为溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂。
23.权利要求18-22中任一项的组合物,其进一步包含一种或多种适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素。
24.核酸分子,其编码权利要求1-17中任一项的修饰的溶素多肽。
25.载体,其包含权利要求24的核酸分子。
26.权利要求25的载体,其中所述载体是质粒,且所述核酸可操作地连接至异源启动子。
27.抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的方法,所述方法包括使所述细菌与权利要求18-23中任一项的组合物接触。
28.预防或治疗由革兰氏阳性细菌的至少一种物种引起的细菌感染的方法,所述方法包括向被诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用(1)第一量的权利要求1-17中任一项的修饰的溶素多肽;和(2)第二量的适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素。
29.权利要求28的方法,其中所述适合于治疗革兰氏阳性细菌感染的抗生素选自甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素。
30.用于加强适合于治疗细菌感染的抗生素的效力的方法,所述方法包括共同施用所述抗生素与权利要求1-17中任一项的修饰的溶素多肽的组合,其中与单独施用所述抗生素或所述修饰的溶素多肽或其片段相比,共同施用更有效地抑制所述细菌的生长,减少所述细菌的种群或杀死所述细菌。
31.权利要求30的方法,其中所述抗生素选自甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素。
32.减少在被葡萄球菌属或链球菌属细菌感染的受试者中的葡萄球菌属或链球菌属细菌中的抗生素抗性的发展的方法,所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-17中任一项的修饰的溶素多肽和选自甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星和溶葡萄球菌素的抗生素的组合。
33.权利要求32的方法,其中所述修饰的溶素多肽以对应于低于所述修饰的溶素多肽的最小抑制浓度(MIC)的浓度的量施用。
34.权利要求32或33的方法,其中所述修饰的溶素多肽中的至少一个氨基酸取代包括L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A。
CN201980027962.7A 2018-02-26 2019-02-26 修饰的PlySs2溶素及其用途 Pending CN112118861A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862635515P 2018-02-26 2018-02-26
US62/635515 2018-02-26
PCT/US2019/019638 WO2019165454A1 (en) 2018-02-26 2019-02-26 Modified plyss2 lysins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112118861A true CN112118861A (zh) 2020-12-22

Family

ID=67687985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980027962.7A Pending CN112118861A (zh) 2018-02-26 2019-02-26 修饰的PlySs2溶素及其用途

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210032294A1 (zh)
EP (1) EP3758738A4 (zh)
JP (1) JP2021513865A (zh)
KR (1) KR20200124724A (zh)
CN (1) CN112118861A (zh)
AU (1) AU2019224160A1 (zh)
BR (1) BR112020017219A2 (zh)
CA (1) CA3092109A1 (zh)
IL (1) IL276807A (zh)
MX (1) MX2020008860A (zh)
RU (1) RU2020128276A (zh)
WO (1) WO2019165454A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3136461A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 Contrafect Corporation Method of treating and preventing bone and joint infections
WO2021236636A1 (en) * 2020-05-19 2021-11-25 Contrafect Corporation MODIFIED PlySs2 LYSINS AND ANTIBIOTIC COMBINATIONS FOR USE AGAINST GRAM-POSITIVE BACTERIA
WO2023049747A1 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Elanco Us Inc. Streptococcus suis lytic enzyme compositions and methods of use thereof
WO2023081691A1 (en) * 2021-11-04 2023-05-11 Contrafect Corporation Method of treating and preventing bone and joint infections

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103703127A (zh) * 2011-05-04 2014-04-02 迈克瑞欧斯人体健康有限公司 一种多肽
CN103857410A (zh) * 2011-04-21 2014-06-11 洛克菲勒大学 用于革兰氏阳性菌检测和治疗的链球菌属细菌噬菌体溶素
CN104736172A (zh) * 2012-05-09 2015-06-24 康特拉费克特公司 针对革兰氏阳性细菌的噬菌体溶素和抗生素组合

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102084388B1 (ko) * 2012-05-09 2020-03-06 콘트라펙트 코포레이션 박테리오파지 리신을 이용한 생물막의 예방, 붕괴 및 치료
CN104073478A (zh) * 2014-06-13 2014-10-01 上海交通大学 杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途
BR112018073205A2 (pt) * 2016-05-12 2019-02-19 Contrafect Corporation método de microdiluição em caldo para avaliação e determinação da concentração inibitória mínima de polipeptídeos antibacterianos

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103857410A (zh) * 2011-04-21 2014-06-11 洛克菲勒大学 用于革兰氏阳性菌检测和治疗的链球菌属细菌噬菌体溶素
CN103703127A (zh) * 2011-05-04 2014-04-02 迈克瑞欧斯人体健康有限公司 一种多肽
CN104736172A (zh) * 2012-05-09 2015-06-24 康特拉费克特公司 针对革兰氏阳性细菌的噬菌体溶素和抗生素组合

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021513865A (ja) 2021-06-03
BR112020017219A2 (pt) 2020-12-22
AU2019224160A1 (en) 2020-09-10
WO2019165454A1 (en) 2019-08-29
IL276807A (en) 2020-10-29
EP3758738A1 (en) 2021-01-06
EP3758738A4 (en) 2021-12-08
RU2020128276A (ru) 2022-03-29
MX2020008860A (es) 2020-12-10
CA3092109A1 (en) 2019-08-29
KR20200124724A (ko) 2020-11-03
US20210032294A1 (en) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108348574B (zh) 具有对抗革兰氏阴性菌的活性的溶素多肽
CN112118861A (zh) 修饰的PlySs2溶素及其用途
JP2024010053A (ja) シュードモナス・エルギノーサに対する殺菌活性を有する溶解素及びその誘導体の特定
CN112368376A (zh) 溶素-抗微生物肽(amp)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核苷酸及其用途
US20210260070A1 (en) Lysin cf-301 resensitizes methicillin-resistant staphylococcus aureua (mrsa) to penicillin derivatives and first generation cephalosporins
KR20200045468A (ko) 용균 단백질 항균 활성의 혈액 성분 강화 및 이의 방법 및 용도
US20220160842A1 (en) Method of treating infective endocarditis
JP2023526386A (ja) グラム陽性細菌に対して使用される修飾PlySs2溶解素及び抗生物質の組合せ
RU2807688C9 (ru) Идентификация лизинов и их производных, обладающих антибактериальной активностью против pseudomonas aeruginosa
US20220160843A1 (en) Lysins and derivatives thereof with bactericidal activity against pseudomonas aeruginosa, in the presence of human serum
CN117377680A (zh) 针对革兰氏阴性细菌有活性的amurin溶素和溶素-抗微生物肽(AMP)构建体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination