CN104073478A - 杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途；所述酶抗生素为由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。本发明从猪链球菌基因组中筛选具有特定裂菌作用的基因，通过构建原核表达载体，获得具有裂菌活性的重组表达产物——酶抗生素，确定其抗菌活性、裂菌谱、裂菌效率，以及影响表达产物活性的最优裂解条件。酶抗生素特异性强，且不易使细菌产生抗性，也不会对宿主产生不良影响，是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法。

Description

杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途

技术领域

本发明属于微生物化学领域，涉及一种杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途。

背景技术

猪链球菌是一种人兽共患病原菌，可引起人脑膜炎、仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等疾病，严重的可致人死亡。现已发现该菌荚膜抗原血清型有35种以上，大多数致病性血清型在1-9型，其中猪链球菌2型为最常见和毒力最强的血清型，流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。目前，对于猪链球菌病的治疗主要是抗生素治疗。近几年由于养殖过程中抗生素的滥用，导致细菌的耐药性也逐渐加剧，因此抗生素治疗已面临巨大的挑战。

同样，金黄色葡萄球菌也是一种人兽共患病原菌，可致人和动物的多种疾病。多重耐药性金黄色葡萄球菌呈全球性扩散、传播，严重威胁着人类健康。由于金黄色葡萄球菌不断进化，对抗生素的耐药性越来越强，它的高扩散性和高致病性，已经导致世界各国出现越来越多的临床病例难以治愈，因而对人类健康的威胁也越来越大。因此，在抗生素对耐药性金黄色葡萄球菌无能为力的情况下，亟需一种全新的抗菌制剂来防控其感染与传播。

通过细菌基因组的分析，发现在细菌的全基因中还有很多基因的功能未知，有的大概预测了某个基因的功能，但并没有被开发利用。这些基因有的是细菌本身具有的，有的是细菌在漫长的进化过程中通过一些特定的基因重组事件获得的外源基因或构件。其中细菌中原噬菌体基因组构件的存在就是一个典型的基因重组案例，原噬菌体不但能够介导宿主菌生物学特性的改变，还能够影响宿主菌的繁殖周期，决定宿主菌的溶原和裂解状态。在裂解过程中噬菌体在感染细菌后期表达一类细胞壁水解酶，该酶可通过特异性水解氨基糖之间的糖苷键，即细胞壁肽聚糖上的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，达到裂解细菌的目的，因此也称为酶抗生素。与抗生素相比，这类水解酶特异性强，且不易使细菌产生抗性，也不会对宿主产生不良影响，是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法。然而目前所挖掘的具有实用性的水解酶还寥寥无几，且大多数这类酶活性低或难以大批量生产，特别是同时能特异性裂解多重耐药的链球菌和金黄色葡萄球菌的酶抗生素还未见报道，本发明的突出优势就是解决了以上这几个问题。

本发明通过基因筛选、克隆和表达获得了一种重组蛋白质，通过生物活性的检测，确定其对链球菌和金黄色葡萄球菌的裂解活性、裂菌谱以及裂菌效率，并优化了保持该重组蛋白最佳活性的缓冲液、pH值、保存温度等，确定该重组蛋白为特异、高效裂解多种血清型的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌的新型生物制剂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的缺陷，提供一种杀灭革兰氏阳性菌的酶抗生素及其制备、用途；具体是一种能够高效杀灭多种血清型猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及多重耐药的金黄色葡萄球菌的革兰阳性菌的酶抗生素的筛选、制备、生物特性、裂菌方法、裂菌条件优化及用途。本发明从猪链球菌基因组中筛选具有特定裂菌作用的基因，通过构建原核表达载体，获得具有裂菌活性的重组表达产物，确定其抗菌活性、裂菌谱、裂菌效率，以及影响表达产物活性的最优裂解条件，提供一种能够高效裂解多种血清型的多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌的新型裂菌制剂、用途。

本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质。该蛋白质，能够高效裂解多种血清型多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌，因此也称酶抗生素。

第二方面，本发明涉及一种编码如上述蛋白质的核苷酸。

优选地，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明涉及一种上述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：根据最新文献，在GenBank检索相应的基因序列，分析可疑编码裂解酶的基因，设计引物，以猪链球菌菌株基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增相应的基因片段，片段大小为738bp；

步骤二：采用原核表达系统pET-28a(+)，将步骤一扩增所得DNA序列构建重组质粒pET-28a(+)-LySS7；

步骤三：将步骤二的重组质粒转化到表达载体(大肠杆菌BL21(DE3))中，筛选阳性克隆进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白LySS7，重组蛋白分子量为29.8kDa；

步骤四：采用平板裂解实验，以一株猪链球菌2型为裂解菌，确定步骤三获得的重组蛋白LySS7的裂菌特性；

步骤五：高效诱导表达并纯化具有裂菌活性的重组蛋白，得到具有生物活性的酶抗生素，测得该酶抗生素的浓度为3.27mg/ml，产量为32.7mg/L。

上述新型酶抗生素的制备方法还包括对该酶抗生素进行性能验证的步骤，具体包括如下步骤：

步骤六：以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌采用浊度递减实验测定该酶抗生素的裂解效率、活性单位。酶活性单位为2¹¹unit/ml，626unit/mg，每单位所含的LySS7重组蛋白的量为1.60μg；

步骤七：确定该酶抗生素的裂菌谱，所用裂解菌为不同血清型的多重耐药的猪链球菌菌株、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌菌株、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。该酶抗生素对沙门氏菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌不具有裂解活性，对多种血清型的多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌均具有裂解活性；

步骤八：确定该酶抗生素发挥作用的最佳条件：最适裂解温度和最适裂解pH。最适裂解温度为37℃，最适裂解pH为5.5；

步骤九：确定该酶抗生素的稳定性，稳定性包括4℃下放置一个月的稳定性和-80℃与室温反复冻融10次后的稳定性。4℃放置一个月裂菌制剂的活性单位由2¹¹unit/ml降为2⁸unit/ml，-80℃与室温反复冻融10次后裂菌制剂的活性单位由2¹¹unit/ml降为2⁹unit/ml，说明该酶在4℃放置一个月和-80℃与室温反复冻融10次后仍具有很高的裂菌活性。

优选地，步骤一中，所述引物具体为：上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，步骤四中，所述平板裂解实验：以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌与获得的重组蛋白粗提液进行平板裂解实验，具体操作为将50ml OD₆₀₀＝1.0的HA9801菌液，PBS洗涤三次后用1mlPBS重悬获得细菌重悬液，将细菌重悬液与已融化的40℃左右的0.7％的THB上层琼脂混匀，制备双层琼脂平板，室温放置约20min至完全凝固，用打孔器在琼脂平板表面打孔，直径为10mm，共打6个孔，设置两个组，实验组和对照组，每组设置三个重复，加样时，实验组每孔加入40μL的重组蛋白粗提液，对照组每孔加入等量的空载体粗提液。37℃温箱放置4h左右，观察有无裂菌圈。实验结果显示实验组能够形成明显的裂菌圈，对照组不能够形成裂菌圈。该重组蛋白能够裂解猪链球菌，具有裂菌活性。

优选地，所述步骤六中测定该酶抗生素酶解活性具体为：倍比稀释该酶抗生素，分别取100μL不同稀释梯度的酶抗生素加入96孔板中，OD₆₀₀＝1.0的HA9801菌液，PBS洗涤三次后重悬至OD₆₅₀＝0.6，取100μL处理好的菌液与不同稀释梯度的酶抗生素混匀，测定混合物在650nm处的吸光值即OD₆₅₀作为初始值。将96孔板放置在37℃温箱中，孵育30min后，测定混合物在650nm处的吸光值作为终止值。根据两次读数计算细菌浊度下降的百分数，从而确定该酶抗生素的活性单位。该酶抗生素的活性单位为2¹¹unit/ml，626unit/mg，每单位所含的LySS7重组蛋白的量为1.60μg。

优选地，所述步骤七中确定酶抗生素的裂菌谱具体为：采用浊度递减实验，将等量的该酶抗生素与不同的裂解菌在37℃条件下孵育30min，计算细菌浊度下降的百分数，从而确定该酶抗生素对部分菌种的裂解活性。结果表明该酶抗生素不能够裂解大肠杆菌和李斯特菌，对多重耐药的猪链球菌2型、7型、9型、马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌都具有裂解作用，对猪链球菌2型中的大部分菌株裂菌活性较高。

优选地，所述步骤八中确定该酶抗生素发挥作用的最适裂解温度具体为：采用浊度递减实验，以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，分别测定在22℃、27℃、32℃、37℃和42℃条件下孵育30min后细菌浊度下降百分数，其中细菌浊度下降百分数最大的对应的孵育温度即为该酶抗生素的最佳作用温度。实验结果表明，37℃孵育时能够使细菌浊度下降百分数达到最大，该酶抗生素的最佳裂解温度为37℃。

优选地，所述步骤八中确定该酶抗生素发挥作用的最适裂解pH具体为：用pH4.5、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0和pH8.5的不同缓冲液处理该酶抗生素，采用浊度递减实验，以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，37℃条件下反应30min，计算细菌浊度下降百分数，能够使细菌浊度下降百分数达到最大的为该重组蛋白发挥作用的最适裂解pH。该重组蛋白对pH不敏感，在pH4.5的酸性条件和pH8.5的碱性条件下都具有较强的裂菌活性，pH5.5时细菌浊度下降百分数稍高于其它pH下的浊度下降百分数，所以该酶抗生素的最适裂解pH为5.5。

优选地，所述步骤九中确定该酶抗生素4℃稳定性具体为：将该酶抗生素在4℃冰箱中放置一个月，期间分别间隔5天、15天、20天、25天和30天的时候，取出部分酶抗生素，以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，采用浊度递减实验，测定该酶抗生素的活性单位，该酶抗生素在4℃冰箱放置一个月活性单位由2¹¹unit/ml降为2⁸unit/ml，表明该酶仍具有很高的裂菌活性。

优选地，所述步骤九中确定该酶抗生素-80℃与室温条件下反复冻融的稳定性具体为，将该酶抗生素放置在-80℃冰箱中30min至完全凝固，取出该酶抗生素，放置在室温条件下至完全融化，采用浊度递减实验以HA9801为裂解菌测定酶抗生素的活性单位，如此操作反复冻融10次，确定酶抗生素的稳定性，该酶抗生素经过-80℃和室温反复10次冻融后活性单位由原来的2¹¹unit/ml降为2⁹unit/ml，表明该酶仍具有很高的裂菌活性。

第四方面，本发明涉及一种上述的蛋白在制备革兰氏阳性菌裂解药物中的用途。

优选地，所述革兰氏阳性菌为多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌中的一种或几种。更优选为猪链球菌、马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌。

优选地，所述猪链球菌菌株有2型菌株：SS2-1、05-465、19-2(A)、5-2、ZY05719、HA9801、HA9802、HA05729-1、29、SS2-H、11-1、SS2-4、006731；7型菌株SS7和9型菌株SS9；马链球菌兽疫亚种菌株ATCC35246；金黄色葡萄球菌菌株有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株：PNB49、DL44-2、SD2-17-1、DL57-3、DZ92、PNB5、PNB25、PNB31、DL56-1和普通金黄色葡萄球菌菌株：05P361、05Q132、ATCC25913、05L189、K185、B52。

第五方面，本发明涉及一种使用上述的蛋白进行裂菌的方法，包括如下步骤：采用常规方法进行裂解；

其中，裂解使用的缓冲液包含PBS缓冲液、CH₃COOH-CH₃COONa缓冲液、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、HCl-Tris缓冲液；

缓冲液浓度为10～20mM；

裂解酸度为pH4.5～8.5；

裂解温度为22～42℃。

本发明的原理在于：根据该酶抗生素的基因序列设计引物，采用PCR技术扩增目的片断，将目的片断与pET-28a(+)载体连接，得到重组高效表达质粒，导入表达载体大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆检验获得阳性克隆，诱导，表达获得重组蛋白，通过Ni柱纯化获得纯化的酶抗生素，分子量为29.8kDa，命名为LySS7，在体外可高效裂解多种血清型多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种和金黄色葡萄球菌。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明通过原核表达系统高效表达了具有高效裂解多种病原细菌的酶抗生素，可大量获得纯化的有活性的酶抗生素，测定了最优的裂菌条件，该酶抗生素在体外高效、特异性裂解多种血清型多重耐药的猪链球菌、马链球菌兽疫亚种及金黄色葡萄球菌。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为采用SDS-PAGE鉴定纯化的重组表达蛋白LySS7的示意图；

图2为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，通过平板裂解实验检验LySS7重组蛋白粗提液活性的示意图；

图3为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白活性单位的示意图；

图4为通过浊度递减实验测定该重组蛋白的裂菌谱的示意图；

图5为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白的最适反应温度的示意图；

图6为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白最适反应pH的示意图；

图7为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白4℃条件下的稳定性示意图；

图8为以猪链球菌2型菌株HA9801为裂解菌，测定该重组蛋白-80℃和室温反复冻融10次后的稳定性的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、设计引物，PCR扩增目的基因片段

参考GenBank中猪链球菌菌株的基因序列，设计引物，以猪链球菌基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增目的基因，目的基因大小为738bp，具体操作如下：

设计引物，引物序列见表1，扩增目的基因，在上下游引物的5’端分别插入EcoR I和Hind III酶切位点。以猪链球菌菌株基因组DNA为模板，按照常规方法进行目的基因片段的扩增。PCR反应结束后，取10μL产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检验目的条带大小。利用胶回收试剂盒回收PCR产物。

表1PCR引物序列

实施例2、重组质粒pET-28a(+)-LySS7的构建

采用原核表达系统pET-28a(+)，将实施例1胶回收试剂盒所得目的基因构建重组质粒，进行序列分析和比对，确定获得正确序列的重组质粒pET-28a(+)-LySS7；具体操作如下：

将实施例1的胶回收产物连接到载体pET-28a(+)上测序。所设计的引物上下游分别包含EcoR I限制性核酸内切酶酶切位点和Hind III限制性核酸内切酶酶切位点。将EcoRI和Hind III酶切后的DNA和pET-28a(+)产物，在T₄DNA快速连接酶作用下(Fermentas公司)22℃连接30min。连接产物转入克隆载体大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，抽提质粒。用EcoR I和HindIII双酶切鉴定，鉴定的阳性重组质粒送生工生物工程股份有限公司测序，获得呈阳性的重组质粒pET-28a(+)-LySS7。

实施例3、重组质粒BL21/pET-28a(+)-LySS7的原核表达

将实施例2的重组质粒pET-28a(+)-LySS7转化到表达载体大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆BL21/pET-28a(+)-LySS7进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白，确定重组蛋白的分子量为29.8kDa；具体操作如下：

阳性重组质粒pET-28a(+)-LySS7，转入表达载体大肠杆菌BL21(DE3)中。获得阳性克隆BL21/pET-28a(+)-LySS7，挑取单菌落接种到5ml卡那霉素阳性(1∶1000)的LB液体培养基中过夜培养。过夜培养菌液按1∶100转接至1L卡那霉素阳性(1∶1000)的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养3-4h，至OD₆₀₀约为0.6。加入100mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)10mL至终浓度为1mmol/L，27℃120rpm诱导4-6h。取5ml菌液5000rpm离心2min，弃上清，沉淀用100μLPBS重悬，加入100μL2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，100℃沸水浴10min，5000rpm离心5min，取上清进行10％的SDS-PAGE凝胶电泳，通过SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况。未加诱导剂组和pET-28a(+)空载体组做如上处理后作为对照组进行SDS-PAGE电泳，获得的重组蛋白为29.8kDa。

实施例4、重组蛋白LySS7的纯化

纯化诱导表达的重组蛋白，得到纯化的酶抗生素，具体操作如下：

IPTG诱导的细菌1L，4℃条件下5000rpm离心10min，20mLPBS重悬后5000rpm离心10min，重复以上操作3次，最后用25mLPBS重悬，重悬后的细菌悬液采用超声波破碎，超生条件为：功率400w工作时间5s，间歇时间15s循环99次。破碎后的菌液在4℃条件下8000rpm离心20min取上清过0.45μm滤筛获得LySS7粗提液。以10倍柱体积的Bindingbuffer润洗Ni柱，将样品加入柱内，控制柱子流速＜1滴/min。分别用20mM和40mM的咪唑洗脱杂蛋白，用120mM咪唑洗脱目的蛋白，收集洗脱液，即为纯化的酶抗生素。1L菌液能够获得32.7mg纯化的酶抗生素。

图1为采用10％SDS-PAGE分析鉴定纯化的重组表达蛋白LySS7的示意图，由图1可知：M是标准Marker蛋白；1是诱导的细菌的表达产物；2是未诱导的细菌产物；3是空载体的细菌产物；4是细菌诱导产物的纯化获得酶抗生素，由图可以看出阳性克隆BL21(DE3)/pET-28a(+)-Ly7917的诱导产物纯化后可以得到大量的高纯度的酶抗生素。

实施例5、平板裂解实验

将实施例4获得的BL21(DE3)/pET-28a(+)-LySS7细菌粗提液进行平板裂解实验，检验裂菌活性，具体操作如下：

按照实施例4获得BL21(DE3)/pET-28a(+)-LySS7的细菌裂解液，以HA9801为指示菌做平板裂解试验。将50mL OD₆₀₀＝1的HA9801菌液PBS清洗三次后用1mLPBS重悬，将重悬后的菌液加入到琼脂糖浓度为0.7％的融化的THB半固体培养基中混匀，混合物倒入平皿中，冷却后在平皿上打孔，每孔直径10mm，共打6个孔，设置实验组和对照组分为两个组，每组设置三个重复，A、C、E为实验组，B、D、F为对照组。实验组每孔分别加入45μLBL21(DE3)/pET-28a(+)-LySS7的细菌裂解液，对照组每孔加入45μlBL21(DE3)/pET-28a(+)的细菌裂解液，37℃温箱培养4h后既可以明显的看到透明的裂菌圈。结果表明：加入BL21(DE3)/pET-28a(+)-LySS7的细菌裂解液的能够形成明显的裂菌圈，BL21(DE3)/pET-28a(+)-LySS7的细菌裂解液能够裂解HA9801；加入BL21(DE3)/pET-28a(+)的细菌裂解液的不能够形成透明的裂菌圈，BL21(DE3)/pET-28a(+)的细菌裂解液不能够裂解HA9801。

图2为LySS7重组蛋白粗提液平板裂解实验示意图，由图2可知：A、C、E：BL21(DE3)/pET-28a(+)-LySS7的细菌裂解液对HA9801具有裂解作用；B、D、F：BL21(DE3)/pET-28a(+)的细菌裂解液对HA9801没有裂解作用。

实施例6、蛋白制剂LySS7活性单位的测定

采用浊度递减实验测定实施例4获得的纯化的蛋白制剂Ly7917的酶活性单位，具体操作如下：

以新鲜培养的HA9801为裂解菌。HA980137℃200rpm生长至OD₆₀₀＝1.0，4℃5000rpm离心10min，弃上清，PBS(pH7.4)重悬，反复清洗三次，最后用PBS重悬至OD₆₅₀＝0.6。纯化的酶抗生素的浓度为3.27mg/ml，用Bindingbuffer在96孔板中进行倍比稀释至终体积为100μL，每个稀释孔中加入100μLHA9801细菌悬液，每个稀释度设置3个重复，细菌悬液和120mM咪唑的混合物以及细菌悬液和PBS的混合液作为空白对照组。读取混合物在650nm处的吸光值即OD₆₅₀，作为初始值。将96孔板放置在37℃温箱中孵育30min，再次读取混合物在650nm处读取吸光值，记录为终止值。根据两次读数计算细菌浊度下降百分数，能够使细菌浊度下降50％的蛋白制剂的最高稀释度的倒数定义为该蛋白制剂的一个活性单位(unit/mL)。在37℃条件下，当原浓度为3.27mg/ml的LySS7稀释倍数为1：2¹¹时，能够使HA9801的OD₆₅₀值下降50％，因此，Ly7917的活性为2048unit/mL，626unit/mg，每单位所含的LySS7重组蛋白的量为1.60μg。活性测定见图3。

实施例7、酶抗生素LySS7的高效裂菌谱

测定实施例4获得的纯化重组蛋白LySS7通过浊度递减实验测定裂菌谱，具体操作如下：

猪链球菌菌株包括2型菌株(SS2-1、05-465、19-2(A)、5-2、ZY05719、HA9801、HA9802、HA05729-1、29、SS2-H、11-1、SS2-4、006731)、7型菌株SS7、9型菌株SS9、马链球菌兽疫亚种标准株ATCC35246、金黄色葡萄球菌菌株包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(PNB49、DL44-2、SD2-17-1、DL57-3、DZ92、PNB5、PNB25、PNB31、DL56-1)和普通金黄色葡萄球菌菌株(05P361、05Q132、ATCC25913、05L189、K185、B52)、沙门氏菌菌株、枯草芽孢杆菌菌株和大肠杆菌标准株各50mL，生长至OD₆₀₀＝1.0，4℃5000rpm离心10min，弃上清，PBS重悬，反复清洗三次，最后用PBS重悬至OD₆₅₀＝0.6，分别加入96孔板中，每组设置3个重复，每孔加入3.27mg/mL的LySS7100μL至终浓度为1.635mg/mL，读取混合物在650nm处的吸光值即OD₆₅₀，记录为初始值。将96孔板放置在37℃温箱中孵育30min，再次读取混合物在650nm处的吸光度值，记录为终止值。根据两次读数计算细菌浊度下降百分数。结果表明，LySS7对沙门氏菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌不具有裂解活性，对多种血清型的多重耐药猪链球菌、马链球菌兽疫亚种标准株及金黄色葡萄球菌都具有裂解活性。裂菌谱测定结果见图4。

实施例8、酶抗生素LySS7最佳裂解条件的测定

探索实施例4获得的纯化的重组蛋白LySS7发挥活性的最佳条件，具体操作如下：

最佳裂解条件的测定包括：最适裂解温度和最适裂解pH，测定方法采用浊度递减试验，以HA9801作为裂解菌，确定最佳裂解条件。

最佳裂解温度：HA9801处理方法同上，将处理好的HA9801加入96孔板中，每组设置3个重复，每孔加入3.27mg/mL的LySS7100μL至终浓度为1.635mg/mL，在650nm处读取吸光值，记录初始值。将96孔板分别置于22℃、27℃、32℃、37℃、42℃温度下孵育30min，650nm处读取吸光值，记录为终止值。根据两次读数计算细菌浊度下降百分数。细菌浊度下降百分数最大的作为LySS7的最适反应温度。结果表明：42℃高温时细菌浊度下降百分数较低，22℃、27℃、32℃、37℃条件下细菌浊度下降百分数差距不明显，温度在22℃-37℃范围内浮动，LySS7裂菌活性影响不显著，37℃条件下，细菌浊度下降百分数最大，LySS7最适反应温度为37℃。见图5。

最佳裂解pH：生长至OD₆₀₀＝1.0的HA9801分别用不同pH的缓冲(见表二)液重悬至OD₆₅₀＝0.6，取100μL重悬菌液加入96孔板中，每组设置3个重复，每孔加入3.27mg/mL的Ly7917100μL至终浓度为1.635mg/mL，对照组每孔加入等量的不含LySS7蛋白制剂的Buffer，读取混合物在650nm处的吸光值即OD₆₅₀，记录为初始值。将96孔板放置在37℃温箱中孵育30min，再次读取混合物在650nm处的吸光值，记录为终止值。根据两次读数计算细菌浊度下降百分数。细菌浊度下降百分数最大的缓冲液对应的pH作为LySS7的最适pH。结果表明LySS7对pH不敏感，在pH4.5的酸性条件和pH8.5的碱性条件下都具有较强的裂菌活性，该蛋白制剂的等电点pI＝9.04，pH8.5靠近等电点时裂解活性有下降的趋势。pH5.5时细菌浊度下降百分数稍高于其它pH下的细菌浊度下降百分数，所以该重组蛋白的最适pH为5.5。见图6。

表二不同pH的缓冲液

实施例9、酶抗生素LySS7稳定性的测定

探索实施例4获得的纯化的蛋白制剂LySS7的稳定性；具体操作如下：

稳定性的测定包括：4℃放置一个月的稳定性和-80℃和室温反复冻融10次的稳定性。测定方法采用浊度递减试验，以HA9801作为裂解菌。

4℃放置一个月的稳定性：实施例4获得的蛋白制剂LySS7在4℃冰箱中放置一个月，分别在第5天、15天、20天、25天和30天取出部分重组蛋白，参考实施例六的操作步骤，测定重组蛋白的活性单位。结果表明4℃放置一个月裂菌制剂的活性单位由2¹¹unit/ml降为2⁸unit/ml。见图7，表明该酶仍具有很高的裂菌活性。

-80℃和室温反复冻融10次的稳定性：LySS7放于-80℃冰箱中约30min至完全凝固，取出置于室温下至完全融化，参考实施例六的操作步骤，测定重组蛋白的活性单位。反复冻融10次，分别测定LySS7的活性单位。结果表明反复冻融10次后，LySS7的活性单位由2¹¹unit/mL降至2⁹unit/mL，LySS7的活性并没有显著降低，而且一次反复冻融对LySS7的活性几乎没有影响，活性单位没有发生变化。见图8。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质。

2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的核苷酸。

3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种制备如权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，设计引物，以猪链球菌菌株基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增相应的基因片段，片段大小为738bp；

步骤二，采用原核表达系统，将步骤一所得基因片段构建重组质粒pET-28a(+)-LySS7；

步骤三：将步骤二的重组质粒转化到表达载体中，筛选阳性克隆进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白LySS7；

步骤四：采用平板裂解实验，确定步骤三获得的重组蛋白的裂菌特性；

步骤五：高效诱导表达并纯化具有裂菌活性的重组蛋白，得到具有生物活性的蛋白LySS7。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述引物具体为：上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种如权利要求1所述的蛋白在制备革兰氏阳性菌裂解药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为多重耐药菌株猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌中的一种或几种。

8.一种使用权利要求1所述的蛋白进行裂菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规方法进行裂解；

其中，裂解使用的缓冲液包含PBS缓冲液、CH₃COOH-CH₃COONa缓冲液、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、HCl-Tris缓冲液；

缓冲液浓度为10～20mM；

裂解酸度为pH4.5～8.5；

裂解温度为22～42℃。