CN112760312A - 一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用 - Google Patents

一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用，具体涉及基因工程领域。本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609，其特征在于，所述裂解酶plyssX609的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明所述裂解酶plyssX609具有稳定性强和裂解效率高的优势，且对多种革兰氏阳性菌具有裂解作用。

Description

一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用。
背景技术
链球菌是一种重要的人畜共患病病原，一般为溶血性兼性厌氧且具有生物被膜的革兰氏阳性菌。临床上具有很强的致病性，主要包括肺炎链球菌，化脓链球菌，无乳链球菌等。链球菌感染引起的疾病严重威胁畜牧生产行业，猪链球菌病是由猪链球菌病原引起的人畜共患病，为我国法定的二类患传染病。主要引起仔猪脑膜炎，关节炎和心内膜炎等。根据荚膜血清型不同，目前分为29种链球菌，猪链球菌 2型具有极强的致病性，我国主要流行1、2、7和9型。临床上治疗链球菌感染主要采用传统的抗生素疗法，近些年来，随着抗生素耐药性差问题的不断出现，亟待寻找一种新的高效的抗生素替代疗法，以应对日趋严重的细菌耐药性问题；并且现有技术中报道目前的裂解酶仍然存在裂解谱窄，裂解效率低、稳定性差的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用。本发明所述重组表达载体具有稳定性强和裂解效率高的优势，且利用重组菌表达的裂解酶plyssX609对多种菌具有裂解作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609，所述裂解酶plyssX609的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述裂解酶plyssX609的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种表达上述裂解酶plyssX609的重组表达载体，在pET28a的KpnI和HindIII酶切位点处连接SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种包含上述重组表达载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为基础菌。
本发明提供了上述重组菌的制备方法，包括以下步骤：
利用上述重组表达载体转化感受态细胞，提取质粒后导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌。
本发明提供了上述裂解酶plyssX609或上述重组表达载体或上述重组菌或利用上述制备方法制备得到的重组菌在制备裂解革兰氏阳性菌的试剂中的应用。
优选的，所述革兰氏阳性菌包括链球菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的试剂，所述试剂包括上述裂解酶plyssX609或上述的重组表达载体或上述重组菌或利用上述制备方法制备得到的重组菌。
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的药物，所述药物包括上述裂解酶plyssX609或上述的重组表达载体或上述重组菌或利用上述制备方法制备得到的重组菌。
有益效果：
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609。本发明所述裂解酶plyssX609具有稳定性好、裂解效率高、裂解谱广的优势，而且能够高效杀死链球菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等革兰氏阳性菌。实验结果表明：本发明提供的裂解酶plyssX609对多种血清型的链球菌具有较好的裂解效果，并且对293T细胞、A549细胞和Huh7细胞没有任何毒性。
本发明所述裂解酶plyssX609在4℃、16℃和37℃孵育条件下， 10min内即可发挥作用，并能保持较高裂解活性；裂解酶plyssX609 在孵育温度为4～50℃范围内具有高效的裂解活性，孵育温度55℃开始酶活性开始下降；该裂解酶plyssX609在pH值为6～8范围内具有高效的裂解活性，pH<5和pH>8条件下，酶活性会下降；高浓度的 EDTA溶液对裂解酶plyssX609的酶活有影响；裂解酶plyssX609保存第15天后，37℃储存条件下酶活会下降50％，4℃和-80℃储存条件下，裂解酶plyssX609酶活保持不变。
附图说明
图1为双酶切pET28a-plyssX609结果，M为DL5000 DNA marker，1为pET28a载体，2为双酶切pET28a-plyssX609片段大小为687bp；
图2为裂解酶plyssX609蛋白表达后，经过Ni柱纯化后， SDS-PAGE胶鉴定结果；M为EpiZyme WJ03 Marker，1为未纯化的 pET28a-plyssX609蛋白，2表示为纯化后的蛋白结果，蛋白大小为 25kDa；
图3为裂解酶plyssX609对ATCC43765链球菌、ATCC43138链球菌、ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCC BAA-853 链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC556链球菌、ATCC35246链球菌、 CVCC573链球菌、CVCC1941链球菌、CVCC1942链球菌、CVCC595 链球菌和CVCC1933链球菌多种血清型的猪链球菌裂解效率；
图4为裂解酶plyssX609对ATCC43765的浊度下降百分率；
图5为不同温度条件下裂解酶plyssX609的裂解效率变化；
图6为不同PH缓冲液条件下裂解酶plyssX609的裂解效率变化；
图7为不同浓度的EDTA溶液对于裂解酶plyssX609的活性影响；
图8为裂解酶plyssX609在不同环境温度下储存一定天数后的裂解效率变化；
图9为裂解酶plyssX609对293T细胞、A549细胞和Huh7细胞毒性实验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609，其特征在于，所述裂解酶plyssX609的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：atgacaacagcgaatgaagccgtcatgttcgtcactgacctggccaatcgtggtgcaggcgtgaactat gacggagcatacggtatgcaatgtgtggacttgccaaattggatttgcggaaaattttttggcaaaccctta tggggcaatgccattgatttgttagattcggctgaacaagttggttttgaggtacatcggttgccgacatca gcccatccaagacctggggcagtctttgtcaagaattactgggccagtgatggtgtcaattatgggcatac aggcgttatcatcggtgtagatggggatattgcccagaccgtagaacaaaacttggcaggcaatctctat gttggtagccctgcccagtatgctagccaacgaattagccaattggtgggttggttttatccaccgtatgaa gtagaagtagaacaaccagaagaaaagaaagtagaggaacaagatatgtttacaatttcagcaccagg acgagggattgcattagttgcaggcggtacattttacgctttgcttgacgcaaaagaccctgtcgcattttg ggacaagggtgtaccacatatgcaaatctcacaagcgacttttgataatttccaacacaagtcaaatctag accgcttggatgatgagacagttaacaaactaatcaaaggtctaaaataa；所述裂解酶 plyssX609的氨基酸序列优选如SEQ ID No.2所示： MTTANEAVMFVTDLANRGAGVNYDGAYGMQCVDLPNWICGKFFGKPLWGNAIDLLDSAEQVGFEVHRLPTSAHPRPGAVFVKNYWAS DGVNYGHTGVIIGVDGDIAQTVEQNLAGNLYVGSPAQYASQRISQ LVGWFYPPYEVEVEQPEEKKVEEQDMFTISAPGRGIALVAGGTFY ALLDAKDPVAFWDKGVPHMQISQATFDNFQHKSNLDRLDDETVN KLIKGLK。
本发明所述裂解酶plyssX609优选在孵育温度为4～50℃，且优选在4℃、16℃和37℃孵育条件下，10min内发挥作用；所述裂解酶 plyssX609优选在pH值为6～8；本发明若不及时使用裂解酶plyssX609 优选在4℃和-80℃条件储存，在此温度条件下，能够保证储裂解酶 plyssX609储存15天后酶活保持不变。
本发明一种表达裂解酶plyssX609的重组表达载体，在pET28a 的KpnI和HindIII酶切位点处连接编码裂解酶plyssX609的基因。
本发明对重组表达载体的构建方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可，在本发明实施例中，所述重组表达载体的构建方法优选包括以下步骤：
(1)从NCBI上下载链球菌序列，菌株Genbank号为 WP_161496994，通过武汉天一辉远公司进行基因组合成，序列两端分别带有HindIIII和KpnI酶切位点；
(2)对载体pET28a和步骤(1)中合成产物进行双酶切，转化入DH5α感受态，而后连接得重组表达载体；所述双酶切的酶切位点为KpnI和HindIII。
本发明提供了一种包含上述所述重组表达载体的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为基础菌。
本发明提供了上述所述重组菌的制备方法，包括以下步骤：
利用上述所述重组表达载体转化感受态细胞，提取质粒后导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，即重组大肠杆菌 BL21-pET28a-plyssX609。本发明所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)；所述转化方法优选为化学转化。
本发明提供了上述所述重组表达载体或上述所述重组菌或利用上述制备方法制备得到的重组菌在制备裂解革兰氏阳性菌的试剂中的应用。本发明提供的试剂具有稳定性好、裂解谱广的优势，而且能够高效杀死链球菌(ATCC43765链球菌、ATCC43138链球菌、ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCC BAA-853链球菌、 ATCC35246链球菌、CVCC556链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC573 链球菌、CVCC1941链球菌、CVCC1942链球菌、CVCC595链球菌和CVCC1933链球菌)、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等革兰氏阳性菌；并且对293T细胞、A549细胞和Huh7细胞没有任何毒性。
本发明所述革兰氏阳性菌优选包括链球菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌；所述链球菌优选包括ATCC43765链球菌、ATCC43138 链球菌、ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCC BAA-853 链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC556链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC573链球菌、CVCC1941链球菌、CVCC1942链球菌、CVCC595 链球菌和CVCC1933链球菌。
在本发明中，所述ATCC43765链球菌、ATCC43138链球菌、 ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCC BAA-853链球菌、 ATCC35246链球菌和ATCC35246链球菌购自于美国模式培养物集存库(ATCC)；所述CVCC556链球菌、CVCC573链球菌、CVCC1941 链球菌、CVCC1942链球菌、CVCC595链球菌和CVCC1933链球菌购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。
在本发明中，所述金黄色葡萄球菌优选包括ATCC43300金黄色葡萄球菌、ATCCBAA-2312金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-1707金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-1757金黄色葡萄球菌、ATCC700699金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-1769金黄色葡萄球菌、ATCC BAA44金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-2764金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-2762 金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-2313金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-1688金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-40金黄色葡萄球菌、ATCC700698金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-2763金黄色葡萄球菌、 ATCC BAA-1762金黄色葡萄球菌、ATCC BAA-1767金黄色葡萄球菌、ATCC 33591金黄色葡萄球菌和ATCC 25923金黄色葡萄球菌，购自于美国模式培养物集存库(ATCC)。
在本发明中，所述单增李斯特菌优选包括ATCC19111单增李斯特菌和ATCC15313单增李斯特菌，购自于美国模式培养物集存库 (ATCC)。
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的试剂，所述试剂包括上述重组表达载体或上述重组菌或利用上述制备方法制备得到的重组菌。
本发明提供了一种裂解革兰氏阳性菌的药物，所述药物包括上述重组表达载体或上述重组菌或利用上述制备方法制备得到的重组菌。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
裂解酶plyssX609重组表达载体构建
(1)从NCBI上下载链球菌序列，菌株Genbank号为 WP_161496994，由武汉天一辉远公司合成裂解酶片段，同时两端带有HindIIII和KpnI酶切位点。
(2)对载体pet28a和(1)中合成产物进行双酶切，酶切位点为 KpnI和HindIII，体系为40μl，其中：载体双酶切体系：载体pET28a 7μl，两个酶各1.5μl，10×buffer4μl，ddH2O26μl；回收产物双酶切体系：步骤(1)回收产物7μl，两个酶各1.5μl，10×buffer4μl和ddH2O26μl；37℃酶切2h。回收后，T4连接4℃过夜，体系20μl，其中载体pET28a40ng，步骤(1)回收产物120ng，T4酶1μl；10×T4 buffer 2μl，剩余用ddH20补齐至20μl。按照说明书进行操作(以上内切酶和T4连接酶均为Takara公司产品)，转化入DH5α感受态，连接得重组表达载体。
双切酶结果如图1所示，双酶切pET28a-plyssX609片段大小为 687bp。
实施例2
裂解酶plyssX609蛋白的表达与纯化
(1)将测序正确的pET28a-plyssX609采用化学转化入BL21 (DE3)感受态细胞中，扩大培养后，利用IPTG在16℃诱导18h，菌液离心后，PBS重悬，利用超声破碎仪破碎，超声3s，间歇6s。破碎后，12000rpm离心取上清后，通过0.22μm滤器过滤除菌，获得未纯化的裂解酶plyssX609蛋白。
(2)利用Ni-His亲和纯化，将未纯化的蛋白过HiTrap Q Sepharose FF column(GEHealthy Care)，咪唑梯度洗脱，收集流出液，将流出液通过透析袋在PBS中置换洗脱，除去残留的咪唑。最后通过3kDa超滤管进行超滤，获得浓缩后的已纯化蛋白。
将纯化蛋白用SDS-PAGE胶鉴定，鉴定结果如图2所示，纯化后的蛋白大小为25kDa。
实施例3
裂解酶plyssX609对不同血清型猪链球菌的裂解效果
将ATCC43765链球菌、ATCC43138链球菌、ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCC BAA-853链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC556链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC573链球菌、 CVCC1941链球菌、CVCC1942链球菌、CVCC595链球菌和 CVCC1933链球菌复苏后，用含有10％新生牛血清(四季青，杭州天航生物科技，货号230228615)的TSA培养基(美国BD公司，货号 9324671)过夜培养。5000rpm离心5min集菌后，PBS重悬细菌，使细菌的OD600为0.8。其中ATCC43765链球菌、ATCC43138链球菌、 ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCCBAA-853链球菌、 ATCC35246链球菌和ATCC35246链球菌购自于美国模式培养物集存库(ATCC)；CVCC556链球菌、CVCC573链球菌、CVCC1941链球菌、CVCC1942链球菌、CVCC595链球菌和CVCC1933链球菌购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。
取100μl上述OD600为0.8的细菌分别与100μl浓度为250ng/ml 的裂解酶plyssX609混合，37℃孵育30min，PBS组为阴性对照，浊度下降为0，测定细菌在OD600下吸光度，计算浊度下降比率，计算公式如下：浊度下降比率＝(OD600(PBS组)-OD600(加入酶组))/OD600(PBS)。
实验结果见图3：结果显示，裂解酶plyssX609对ATCC43765 链球菌、ATCC43138链球菌、ATCC700794链球菌、ATCC700796链球菌、ATCC BAA-853链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC556链球菌、ATCC35246链球菌、CVCC573链球菌、CVCC1941链球菌、 CVCC1942链球菌、CVCC595链球菌和CVCC1933链球菌等多种血清型的猪链球菌具有较好的裂解效果。
实施例4
裂解酶plyssX609在不同温度下的作用时间
将宿主菌ATCC43765过夜培养，离心后，用PBS集菌至OD600为0.8。
取100μl上述OD600为0.8的菌液和浓度为250ng/ml的100μl的裂解酶分别在4℃、16℃和37℃孵育，分别在10min、20min、30min、 60min、120min和240min，测定细菌在OD600下吸光度，PBS组为阴性对照，浊度下降为0，计算浊度下降比率，PBS组作为阴性对照。最终结果见图4：结果表明，在4℃，16℃和37℃条件下，裂解酶均在10min内即可发挥作用，并能保持较高裂解活性，37℃条件下杀菌效果低于4℃和16℃。
实施例5
温度对裂解酶plyssX609酶活影响
将宿主菌ATCC43765过夜培养，离心后，用PBS集菌至OD600为0.8。
将裂解酶plyssX609分别在4℃、20℃、37℃、50℃、55℃、60℃和70℃孵育1h，然后取100ul上述OD600为0.8菌液与浓度为250ng/ml 的的不同温度的裂解酶plyssX60937℃孵育30min，测定细菌在OD600下吸光度，计算浊度下降比率，PBS组作为阴性对照，浊度下降为0。结果见图5：结果表明，裂解酶在4～50℃范围内具有高效的裂解活性， 55℃酶活性开始下降。
实施例6
pH对裂解酶plyssX609的酶活影响
将宿主菌ATCC43765过夜培养，离心后，用PBS集菌至OD600为0.8。
用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的SM 缓冲液(NaCl 5.8g、MgSO4·7H2O 2g、Tris·HCl(1mol/L、pH 7.5) 50ml、2％gelatin 5ml，ddH2O补足1000ml)将裂解酶plyssX6092 倍比稀释至使用浓度，37℃孵育1h。取100μl菌液和相同浓度的裂解酶plyssX609在37℃孵育30min，PBS组作为阴性对照，浊度下降为 0，测定细菌在OD600下吸光度，计算浊度下降比率，PBS组作为阴性对照。结果见图6：结果表明，裂解酶在PH＝6～8范围内具有高效的裂解活性，过酸(PH<5)或者过碱(PH>8)条件下，酶活性会下降。
实施例7
EDTA对裂解酶plyssX609的酶活影响
将宿主菌ATCC43765过夜培养，离心后，PBS集菌至OD600为 0.8。向裂解酶中加入不同浓度的EDTA溶液，使得EDTA终浓度为 0.1mM/ml，1mM/ml，10mM/ml，37℃孵育30min。取100μl菌液与 100μl相同浓度的裂解酶在37℃孵育30min，PBS组作为阴性对照，浊度下降为0，测定细菌在OD600下吸光度，计算浊度下降比率，PBS 组作为阴性对照。结果见图7：结果表明，高浓度的EDTA溶液对裂解酶plyssX609酶活有影响，差异显著。
实施例8
不同温度下，储存时间对裂解酶plyssX609酶活性影响
将裂解酶plyssX609分别放置在4℃，37℃和-80℃，分别在1d、 3d、7d、15d取样100μl，与100μl过夜培养后，PBS重悬至OD600为0.8的菌液混合，37℃孵育30min。测定细菌在OD600下吸光度，计算浊度下降比率，PBS组作为阴性对照，浊度下降为0，-80℃保存的裂解酶作为阳性对照。如图8显示：结果表明，第15天后，37℃储存的裂解酶酶活下降50％，4℃和-80℃酶活保持不变。
实施例9
裂解酶plyssX609对细胞毒性的影响
将293T细胞、A549细胞和Huh7细胞培养至96孔板中，使得每孔细胞数量为5×103个。培养24～36h后，移除培养基，用PBS洗涤三次，加入相应的细胞培养基。实验组每孔加入裂解酶plyssX609，使终浓度为30μg/ml，37℃孵育。24h后，每孔加入20μlMTS试剂 (PromegaCell Titer 96TM Aquesous One Solution Cell Proliferation Assay)，3h后在OD490nm检测吸光度，结果图9所示：结果表明，加入裂解酶后，三种细胞的吸光度没有差异，表明裂解酶plyssX609 对三种细胞没有毒性。
实施例10
1.分别取表1中每种菌摇至对数期的菌液100μl，加入至TSA和 TSB(均购自美国BD公司)混合的培养基，其中TSA和TSB混合培养基的制备方法为每100ml水中加入1.5g TSA和1.5g TSB，分别倾倒至LA平板上制备双层培养基；
2.取10μl浓度为250mg/ml的裂解酶裂解酶plyssX609，滴加至双层平板上，待自然风干后，放置在37℃温箱进行培养过夜，观察是否存在噬菌斑，存在噬菌斑表明裂解酶对于该细菌有裂解作用，观察结果见表1，表1中的菌株菌购自于美国模式培养物集存库(ATCC)。
表1裂解酶plyssX609裂解金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的结果
Figure RE-GDA0003004610220000101
Figure RE-GDA0003004610220000111
注：+代表能够裂解，-表示不能。
由表1可知，表明裂解酶plyssX609对能够裂解多种金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌具有裂解作用。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacaacag cgaatgaagc cgtcatgttc gtcactgacc tggccaatcg tggtgcaggc 60
gtgaactatg acggagcata cggtatgcaa tgtgtggact tgccaaattg gatttgcgga 120
aaattttttg gcaaaccctt atggggcaat gccattgatt tgttagattc ggctgaacaa 180
gttggttttg aggtacatcg gttgccgaca tcagcccatc caagacctgg ggcagtcttt 240
gtcaagaatt actgggccag tgatggtgtc aattatgggc atacaggcgt tatcatcggt 300
gtagatgggg atattgccca gaccgtagaa caaaacttgg caggcaatct ctatgttggt 360
agccctgccc agtatgctag ccaacgaatt agccaattgg tgggttggtt ttatccaccg 420
tatgaagtag aagtagaaca accagaagaa aagaaagtag aggaacaaga tatgtttaca 480
atttcagcac caggacgagg gattgcatta gttgcaggcg gtacatttta cgctttgctt 540
gacgcaaaag accctgtcgc attttgggac aagggtgtac cacatatgca aatctcacaa 600
gcgacttttg ataatttcca acacaagtca aatctagacc gcttggatga tgagacagtt 660
aacaaactaa tcaaaggtct aaaataa 687
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Thr Ala Asn Glu Ala Val Met Phe Val Thr Asp Leu Ala Asn
1 5 10 15
Arg Gly Ala Gly Val Asn Tyr Asp Gly Ala Tyr Gly Met Gln Cys Val
20 25 30
Asp Leu Pro Asn Trp Ile Cys Gly Lys Phe Phe Gly Lys Pro Leu Trp
35 40 45
Gly Asn Ala Ile Asp Leu Leu Asp Ser Ala Glu Gln Val Gly Phe Glu
50 55 60
Val His Arg Leu Pro Thr Ser Ala His Pro Arg Pro Gly Ala Val Phe
65 70 75 80
Val Lys Asn Tyr Trp Ala Ser Asp Gly Val Asn Tyr Gly His Thr Gly
85 90 95
Val Ile Ile Gly Val Asp Gly Asp Ile Ala Gln Thr Val Glu Gln Asn
100 105 110
Leu Ala Gly Asn Leu Tyr Val Gly Ser Pro Ala Gln Tyr Ala Ser Gln
115 120 125
Arg Ile Ser Gln Leu Val Gly Trp Phe Tyr Pro Pro Tyr Glu Val Glu
130 135 140
Val Glu Gln Pro Glu Glu Lys Lys Val Glu Glu Gln Asp Met Phe Thr
145 150 155 160
Ile Ser Ala Pro Gly Arg Gly Ile Ala Leu Val Ala Gly Gly Thr Phe
165 170 175
Tyr Ala Leu Leu Asp Ala Lys Asp Pro Val Ala Phe Trp Asp Lys Gly
180 185 190
Val Pro His Met Gln Ile Ser Gln Ala Thr Phe Asp Asn Phe Gln His
195 200 205
Lys Ser Asn Leu Asp Arg Leu Asp Asp Glu Thr Val Asn Lys Leu Ile
210 215 220
Lys Gly Leu Lys
225

Claims (9)

1.一种裂解革兰氏阳性菌的裂解酶plyssX609，其特征在于，所述裂解酶plyssX609的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1裂解酶plyssX609，其特征在于，所述裂解酶plyssX609的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种表达权利要求1或2所述裂解酶plyssX609的重组表达载体，其特征在于，在pET28a的KpnI和HindIII酶切位点处连接SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一种包含权利要求1或2裂解酶plyssX609或权利要求3所述重组表达载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为基础菌。
5.权利要求4所述重组菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求3所述重组表达载体转化感受态细胞，提取质粒后导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌。
6.权利要求1或2所述裂解酶plyssX609或权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4所述重组菌或利用权利要求5所述制备方法制备得到的重组菌在制备裂解革兰氏阳性菌的试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括链球菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
8.一种裂解革兰氏阳性菌的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1或2所述裂解酶plyssX609或权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组菌或利用权利要求5所述制备方法制备得到的重组菌。
9.一种裂解革兰氏阳性菌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1或2所述裂解酶plyssX609或权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组菌或利用权利要求5所述制备方法制备得到的重组菌。
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