KR101729514B1

KR101729514B1 - 그람 양성균인 바실러스 세레우스로부터 고효율로 rna를 분리하는 방법

Info

Publication number: KR101729514B1
Application number: KR1020150181766A
Authority: KR
Inventors: 곽효선; 김순한; 이우정; 윤현진; 유상렬; 전지환; 나홍준
Original assignee: 대한민국(관리청: 특허청장, 승계청: 식품의약품안전처장); 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-04-24

Abstract

본 발명은 그람 양성균인 바실러스 세레우스로부터 고효율로 RNA를 분리·정제 할 수 있는 방법에 관한 것으로, '급속 동결 및 물리적 파쇄', 그리고 '화학적 단백질 변성'의 두 단계를 거쳐, 그람 양성균의 특징적인 세포벽 구성 성분인 펩티도글리칸을 효과적으로 용해하는 것과 동시에 RNA의 변성 또한 억제할 수 있어 고효율로 RNA를 분리할 수 있다.

Description

그람 양성균인 바실러스 세레우스로부터 고효율로 RNA를 분리하는 방법 {Method for isolation of high yield RNA from Gram positive bacteria, Bacillus cereus}

본 발명은 두꺼운 펩티도글리칸 (peptidoglycan) 구조를 갖는 그람 양성균, 바실러스 세레우스로부터 RNA를 분리하는데 활용할 수 있는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 '급속 동결 및 물리적 파쇄', 그리고 '화학적 단백질 변성'의 두 단계를 거쳐 그람 양성균의 특징적인 세포벽 구성 성분인 펩티도글리칸을 효과적으로 용해하는 것과 동시에 RNA의 변성도 억제할 수 있는 고효율 RNA 분리 정제법에 관한 것이다.

바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)는 그람 양성 간균으로, 사슬 형태로 배열하며, 편모가 있어 운동성이 있다. 포자를 형성하여 열에 대한 저항성이 강하고, 산소 공급 조건에서 잘 증식하는 호기성 세균이다.

바실러스는 자연계(토양, 먼지, 하수 등)에 널리 분포하며, 주로 곡물을 오염시켜 부패, 변패, 때로는 식중독을 일으킨다. 국내에서 현재까지 발생한 2015년 식중독 157건 중 11건, 약 7% 수준의 식중독이 바실러스 세레우스에 의한 것이다.

바실러스 세레우스에 의한 식중독은 치사율이 그리 높지는 않으나, 구토, 설사 등의 여러 가지 식중독 증상을 유발한다. 더욱이, 곡물섭취가 매우 많은 국내 식품 소비 형태상 바실러스 세레우스에 의한 감염에 대해 많은 주의가 요구되고 있다.

그동안 바실러스 세레우스에 의한 병원성에 관해 많은 연구가 이루어져 왔으며, 현재까지 알려진 바로는 바실러스 세레우스에서 식중독을 발생시키는 원인 유전자로 약 3가지의 독소가 알려져 있다. 이는 각각 사이토톡신 K (Cytotoxin K), 헤몰라이신 BL (Hemolysin BL), 논헤몰리틱 엔테로톡신 (nonhemolytic enterotoxin)으로, 해당 유전자들은 모두 바실러스 세레우스의 염색체 상에 존재하고 있으며, plcR 유전자에 의해 발현이 조절된다.

이들 세 종류의 독소는 모두 인간의 소장에서 발현되며, 세포에 구멍을 뚫는 포어-포밍(pore-forming) 활성을 갖고 있다. 이들 독소에 의해 인간의 장내 상피세포 세포막에 구멍이 생기고, 이로 인해 세포 내·외부의 전기화학전위 (electrochemical potential)가 무너지게 되어, 결국 상피세포의 사멸이 발생한다. 이는 설사와 같은 바실러스 세레우스 식중독의 주요 증상으로 이어지게 된다.

따라서, 바실러스 세레우스 식중독을 예방하고 바실러스 세레우스의 병원성 기작을 이해하기 위하여 바실러스 세레우스가 어떠한 상황에서 독소 유전자들을 활성화시키고, 병원성을 발휘하는지에 대한 연구가 진행되어 왔다. 연구를 위해서는 바실러스 세레우스 균이 특정 상황에서 특정 유전자를 얼마나 발현시키는지 그 발현 패턴을 관찰할 필요가 있으며, 그동안 마이크로어레이(microarray) 또는 총 RNA 시퀀싱 (total RNA sequencing)과 같은 여러 실험적 기법을 통해 이를 관찰하였다.

하지만, 이러한 모든 실험 기법들에 앞서, 바실러스 세레우스가 가진 모든 RNA를 순수하게 분리 정제할 필요가 있으며, 이를 위한 많은 기법 혹은 제품들 역시 개발되어 왔다.

가장 오래전부터 사용된 RNA 분리 방법은 에시딕 페놀 (acidic phenol)을 이용한 직접 추출법이다. 이는 DNA, RNA와 같이 친수성이 강한 핵산을 단백질, 지질과 같이 소수성이 있는 물질로부터 분리하는 기술로, 이들이 혼합된 용액에 페놀을 처리하면, 소수성이 있는 단백질과 지질은 페놀에 용해되고, 핵산은 물에 용해되는데, 이 상태에서 다시 물과 페놀을 분리하면 핵산의 정제가 가능하다. 또한, RNA 분리 정제시에는 pH가 낮은 에시딕 페놀 (acidic phenol)을 사용하는데, DNA가 낮은 pH에서 침전되는 현상을 이용하여 DNA와 RNA의 분리 역시 가능하다.

기술이 발달한 최근에는 RNA 분리를 위한 각종 키트(kit)가 개발되어 왔으며, 사용하는 시약의 종류가 조금씩 차이는 있으나, 대부분 RNA와 친화력이 강한 컬럼 (column)을 이용한다. 따라서, 이들 키트는 대부분 유사한 원리를 가지며, RNA 분자가 컬럼에 결합하게 하여 다른 물질과 분리하고, 컬럼에 결합된 RNA를 다시 물에 녹이는 형태를 취한다.

그런데, 에시딕 페놀 (acidic phenol)을 이용한 직접 추출법 또는 키트를 사용하는 방법 모두 RNA를 순수 분리하기 이전에 박테리아 세포의 용해 단계를 거쳐야 한다. 이를 위해 세포벽 분해 효소인 라이소자임 (lysozyme) 및 단백질 분해 효소인 프로티나아제 K (proteinase K)를 이용한 화학적 방법과 비드 비팅 (bead beating)을 이용한 물리적 방법이 널리 사용되고 있다.

그러나, 상기 두 가지 방법 모두 바실러스 세레우스와 같이 두꺼운 펩티도글리칸 세포벽을 갖는 박테리아에서는 효율이 떨어지는 문제점이 있다. 세포벽의 분해가 신속하게 이루어지지 않으면 많은 박테리아 세포가 생존한 상태로 반응물 속에 존재하게 되며, 스트레스를 받은 세포는 그 유전자 발현을 빠르게 바꾸게 되고, 심지어는 핵산 분해 효소를 만들기도 한다.

RNA는 단일 가닥으로 되어있는 매우 불안정한 분자로, 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되며, 이는 전체 RNA의 질을 떨어트리는 큰 요인이 된다. 이로 인해 그람 양성균의 전사체 연구는 그람 음성균의 그것에 비해 많은 어려움이 있다.

따라서, 기존의 방식과는 차별화되는 박테리아 세포벽 용해 기술로서, 그람 양성균의 RNA 정제에 있어 세포벽 용해의 효율성을 높일 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.

대한민국 특허공개번호 제10-2006-0020287호 (공개일자: 2006. 03. 06)에는, 미생물에 마이크로파를 조사하는 것을 포함하는 미생물 세포벽의 파쇄방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2004-0096000호 (공개일자: 2004. 11. 16)에는, 초음파로 자실체를 분해하여 고압열수로 세포벽을 분쇄하는 방법이 기재되어 있다.

본 발명은 그람 양성균인 바실러스 세레우스로부터 고수율로 RNA를 정제할 수 있는 새로운 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은, 막자사발에 액체질소를 넣고 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)를 떨어뜨려 바실러스 세레우스를 급속냉동시키는 단계 (a); 상기 냉동 후, 막자사발을 이용하여 바실러스 세레우스를 곱게 분쇄하는 단계 (b); 상기 분쇄 후, 분쇄된 시료를 튜브에 옮겨 담고, 구아니디니움 티오시아네이트 (guanidinium thiocyanate)이 함유되어 있는 페놀(phenol) 용액을 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 상기 반응 후, 반응물을 1차 원심분리하고, 상등액을 수득한 후, 이를 튜브(tube)에 분주하는 단계 (d); 상기 상등액이 분주된 튜브에 클로로포름(chloroform)을 넣고 혼합하여 반응시키고, 2차 원심분리하는 단계 (e); 상기 2차 원심분리 후, 하단의 붉은색의 페놀-클로로포름 층과 상단의 투명한 수용액 층, 그리고 그 사이의 혼탁한 계면 중, 상단의 투명한 수용액 층만을 회수하여 새로운 튜브로 옮기는 단계 (f); 상기 새로운 튜브로 옮겨진 투명한 수용액 층에 2-프로판올(2-isopropanol)과 트리소디움 시트레이트 및 NaCl로 구성된 고농도 침전용액을 넣고, 반응시킨 후, 3차 원심분리하는 단계 (g); 상기 3차 원심분리 후, 상등액을 제거하고, 에탄올(ethanol)을 첨가한 후, 4차 원심분리하는 단계 (h); 상기 4차 원심분리 후, 상등액을 제거하고 펠렛을 건조하는 단계 (i); 상기 건조 후, 건조된 펠렛에 예열한 RNase-프리 워터 (RNase-free water)를 넣고, 녹이는 단계 (j);를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법을 제공한다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 1차 원심분리는, 바람직하게 4℃에서 10,000×g의 속도로 3분 동안 수행하고, 상기 2차 원심분리는, 바람직하게 4℃에서 12,000×g의 속도로 15분 동안 수행하며, 상기 3차 원심분리는, 바람직하게 4℃에서 12,000×g의 속도로 10분 동안 수행하고, 상기 4차 원심분리는, 바람직하게 4℃에서 7,500×g의 속도로 5분 동안 수행하는 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)는, 바람직하게 바실러스 세레우스의 배양액으로부터 원심분리하여 회수한 바실러스 세레우스 펠렛(pellet)을 RNA 전용 Tris-EDTA 버퍼와 균일하게 혼합한 혼합액인 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 단계 (c)의 반응은, 바람직하게 25℃에서 5분간 수행하는 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 단계 (e)는, 바람직하게 수득한 상등액에 영하 20℃에서 보관한 RNA 전용 클로로포름(chloroform)을 넣고 혼합한 후, 25℃에서 3분 동안 반응시키고, 2차 원심분리를 하되, 반응 과정에서 붉은색의 페놀-클로로포름 층과 수용액 층이 분리되지 않도록, 반응 과정에서 간헐적으로 볼텍스 믹서로 혼합하는 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 단계 (g)의 2-프로판올은, 바람직하게 영하 20℃에서 보관한 것이 좋고, 상기 단계 (g)의 고농도 침전용액은, 바람직하게 4℃에서 보관한 것이 좋으며, 상기 단계 (g)의 반응은, 바람직하게 25℃에서 10분 동안 수행하는 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 단계 (h)의 에탄올은, 바람직하게 영하 20℃에서 보관한 75% 에탄올이고, 바람직하게 별도의 혼합과정 없이 첨가하는 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 단계 (i)는, 바람직하게 4차 원심분리 후, 펠렛을 건드리지 않도록 조심스럽게 상등액을 제거하는 것이 좋고, 바람직하게 펠렛을 25℃에서 3분 동안 건조하되, 펠렛이 완전히 건조되지 않도록 하는 것이 좋다.

한편, 본 발명 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법에 있어서, 상기 단계 (j)는, 바람직하게 건조된 펠렛에 60℃에서 예열한 RNase-프리 워터를 넣고, 60℃에서 10분 동안 녹이는 것이 좋다.

본 발명에서 사용한 액체질소 처리 기법은, 기존의 물리·화학적 세포벽 용해 기법이 RNA를 온전히 보전하면서 세포벽을 효과적으로 파괴하지 못하던 것과 달리, RNA의 변성 및 신규 전사를 억제하고, 효과적으로 고농도, 고순도의 RNA를 분리할 수 있게 한다.

기존의 물리적 용해 기법에서는 지르코늄 (zirconia)으로 이루어진 비드 (bead)와 세포를 혼합하고 충격을 가하는 방법으로 물리적 자극을 주어 세포벽을 용해하고자 하였으나, 이 과정에서 발생하는 미세한 열이나 기타 물리적 충격에 의해 RNA 분자가 파괴되어 순도(purity)가 매우 낮은 문제점이 있었다.

또한, 기존의 화학적 용해 기법에서 사용하던 라이소자임(lysozyme)은 바실러스 세레우스균의 세포벽을 충분히 용해하지 못하는 양상을 보였으며, 균에 처리하는 시간도 세포 내에서 RNA의 분해 및 전사가 일어나는 시간에 비해 길기 때문에 특정 시기의 전사체의 양상을 확인하기에 미흡하다는 문제점이 있었다.

또한, 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 (guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform)을 사용하는 방법에서도, 물리적 용해 기법과 동반되지 않았을 경우, 세포에서 용출되는 RNA의 절대량이 적기 때문에 고농도의 RNA를 분리하는 것은 무리가 있었다.

하지만, 본 발명의 방법은, 액체질소를 사용하여, 영하 196℃의 극저온 상태로 세포를 동결하므로, RNA를 변화가 생기기 전에 세포로부터 분리할 수 있다. 이를 통해 특정 시기의 전사체 발현 양상을 성공적으로 파악할 수 있고, 동결된 상태이기 때문에 물리적 용해 과정에서 발생하는 열에 의한 변성도 최소화할 수 있는 장점이 있다.

또한, 상기 물리적 처리 후, 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름을 처리함으로써, 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름이 세포막 단백질을 변성함으로써 세포벽의 전체적인 용해를 촉진하는 효과를 얻을 수 있고, 더 나아가 용해된 세포에서 용출된 RNA와 효소를 비롯한 여러 단백질들이 서로 반응하지 않도록 RNA를 보호하는 성질에 의해 RNA의 농도와 순도를 함께 향상시킬 수 있는 장점도 있다.

도 1은 본 발명 바실러스 세레우스 RNA의 정제·분리를 위한 실험 모식도이다.
도 2는 본 발명의 방법으로 분리·정제한 바실러스 세레우스 RNA의 정성 및 정량적 분석 결과이다.
도 3은 기존 실험법 (Ganesh Babu et al. Journal of Nanobiotechnology 2011, 9:49 / Maarten Mols et al. Environmental Microbiology 2010, 12:873-885)으로 분리·정제한 바실러스 세레우스 RNA의 정성 및 정량 분석 결과이다.

기존의 박테리아 RNA 분리 정제에 사용되는 키트 및 기타 시약 제품을 이용한 실험법은 박테리아 세포벽 용해 과정에서 펩티도글리칸 (peptidoglycan)을 화학적으로 분해하기 위해 라이소자임(lysozyme)을 처리하거나 비드 비터 (bead beater)를 이용하여 물리적으로 분해하는 방법을 제시하고 있다.

그러나, 라이소자임(lysozyme)에 내성을 가진 균을 다루거나 비드 비터 (bead beater)의 효율이 충분하지 않을 경우, RNA 자체가 분리되지 않는 문제가 있었다. 특히, 그람 양성균의 경우, 펩티도글리칸 세포벽이 매우 두꺼워 이러한 문제가 더욱 크게 대두되고 있었다.

본 발명에서 새롭게 제시한 그람 양성균의 RNA 분리·정제법은 기존 실험법의 세포벽 용해 과정에서 제시된 라이소자임(lysozyme)의 처리를 통한 화학적 용해나 비드 비터 (bead beater)를 사용하는 물리적 용해와 달리, 액체질소와 막자사발을 이용하여 바실러스 세레우스 균의 활성을 정지시킴과 동시에 세포벽에 물리적 스트레스를 가하였다. 이어서, 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 (guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform)을 처리하여 화학적 용해를 일으킴으로써 세포벽을 효과적으로 파괴하는 동시에, 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름가 RNA의 변성을 방지하는 성질을 이용함으로써, RNA 분리·정제의 수율과 분리된 RNA의 순도를 동시에 향상시킬 수 있었다.

정리하자면, 본 발명은 액체질소, 막자사발과 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름을 사용하여, 그람 양성균인 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 RNA를 분리·정제한다. 액체질소는 RNA를 추출할 균을 급속으로 동결하여, 대상 균의 전사체 변화를 최소화하고, 막자사발을 이용한 물리적인 분쇄를 용이하게 한다. 막자사발을 통한 물리적 압력은 급속 동결된 균을 미세하게 분쇄하여 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름과 균이 반응하는 표면적을 최대화함으로써 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름에 의한 세포벽 용해 및 용출되는 RNA의 변성 방지 효과를 극대화한다. 구아니디니움 티오시아네이트-페놀-클로로포름은 유기용매 성분에 의해 세포벽의 막 단백질 (membrane protein)을 변성하여 세포 구조를 약화시킴으로써 세포벽 용해를 촉진하고, RNA를 변성시키는 효소 및 기타 단백질을 효과적으로 제거하여 RNA의 순도를 높이는 역할을 한다.

도 1은 본 발명 바실러스 세레우스 RNA의 정제·분리를 위한 실험 모식도이다.

이하, 본 발명이 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 : 본 발명의 방법을 이용한 바실러스 세레우스균 ( B. cereus ) RNA의 분리 및 정제]

(1) 실험 기구의 전처리

주변의 거의 모든 환경에 RNA 분해 효소인 RNase가 존재하는 것으로 알려져 있고, RNase는 매우 안정한 효소이므로, 전처리를 통한 모든 실험 기구의 RNase 제거가 매우 중요하다. 모든 실험 기구는 사전에 오토클레이브(autoclave)를 수행하였고, 다시 'RNase wiper (인트론바이오테크놀로지, 성남, 대한민국)'를 처리함으로써, RNase를 제거하였다.

막자사발과 약숟가락은 3차 증류수로 세척한 이후 수분을 제거하였다. 이후, 알루미늄 호일로 밀봉하고, 121℃에서 50분 동안 멸균 및 RNA 분해효소 불활성화 과정을 거쳤다. 그 후, 60℃에서 12시간 이상 완전히 건조하고, 상온(25℃)에 보관하다가 실험을 수행하기 수 시간 전부터 영하 80℃에서 냉각과정을 거쳤다.

이외의 실험 기구 및 장비는 RNA 분해효소를 제거할 수 있는 제제를 표면에 처리하였다.

(2) 바실러스 세레우스균의 준비

영하 80℃에서 동결 보관되어 있는 바실러스 세레우스 (B. cereus)를 루프를 이용하여 아가영양배지 (Brain Heart Infusion, BHI agar)에 스트리킹하고, 37℃에서 8시간 동안 배양하였다.

배지에 단일 군집들이 형성되면, 그 중 하나를 루프로 취하여, 3 mL의 액체 배지 (BHI broth)에 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 6시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL를 취하여 액체 최소영양배지 (M9 minimal media, 0.05% casamino acid)로 2회 세척하고, 3 mL의 액체 최소영양배지에, 1/100 농도로 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 10시간 동안 배양하였다. 이때, 바실러스 세레우스 균의 최종 농도는 약 0.3×10⁷ CFU/mL가 되었다. 이후, 이를 50 mL의 최소영양배지에 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 5.5시간 동안 배양하여, 600 nm에서의 흡광도가 0.5~0.6이 되면, 사용하도록 하였다. 이때, 배양액 상의 균 농도는 약 0.6×10⁸ CFU/mL이었다.

(3) 바실러스 세레우스균 RNA의 분리

준비된 배양액 50 mL 전부를 25℃, 10,000×g 에서 1분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 펠렛(pellet)을 1 mL의 RNA 전용 Tris-EDTA 버퍼 (pH 8.0)와 균일하게 혼합하였다.

영하 80℃에서 냉각한 막자사발에 액체질소를 넣고, 마이크로 피펫을 이용해 균 용액을 액체질소에 한 방울씩 떨어트려 급속 동결한다. 액체질소가 전부 기화된 후, 동결된 균 용액을 고운 가루가 되도록 분쇄하였다.

분쇄한 시료를 새로운 50 mL 튜브에 옮긴 뒤, 2.1 mL의 구아니디니움 티오시아네이트-페놀 용액을 넣고, 균일하게 혼합하고, 25℃에서 5분간 반응시켰다.

시료와 구아니디니움 티오시아네이트-페놀 용액의 반응물을 4℃, 10,000×g 에서 3분 동안 원심분리하였다. 펠렛(pellet)을 건드리지 않도록 주의하며, 상등액을 1 mL씩 3개의 1.75 mL 규격의 원심분리 튜브 (microcentrifuge tube)에 분주하였다. 이후 과정은 시료 1개당 각 3개의 튜브로 진행하였다.

상등액이 들어있는 튜브에, 영하 20℃로 보관한 RNA 전용 클로로포름 (chloroform) 140 μL를 넣고, 15초 동안 볼텍스 믹서 (vortex mixer)로 상등액과 균일하게 혼합하고, 25℃에서 3분 동안 반응시켰다. 붉은색의 페놀-클로로포름 층과 수용액 층이 분리되지 않도록, 반응 과정에서 간헐적으로 볼텍스 믹서로 혼합하였다. 이후, 4℃, 12,000×g 에서 15분 동안 원심분리하였다.

원심분리한 튜브의 내부는 하단의 붉은색의 페놀-클로로포름 층과 상단의 투명한 수용액 층, 그리고 그 사이의 혼탁한 계면으로 나뉘는데, 이중 상단의 투명한 수용액 층만 500 μL를 조심스럽게 취하여 새로운 1.75 mL 마이크로센트리퓨즈 튜브 (microcentrifuge tube)로 옮겨 담았다.

새로운 튜브에 영하 20℃로 보관한 2-프로판올 (isopropanol) 175 μL와 4℃로 보관한 고농도 침전용액 (high salt precipitation solution, 0.8 M trisodium citrate & 1.2 M NaCl) 175 μL를 넣고, 조심스럽게 10번 인버팅(inverting)하여 혼합하고, 10분 동안 25℃에 반응시킨 후, 4℃, 12,000×g에서 10분 동안 원심 분리하였다.

상등액을 조심스럽게 제거하고, 영하 20℃로 보관한 75% 에탄올(ethanol) 700 μL를 별도의 혼합과정 없이 넣었다. 이후, 4℃, 7,500×g에서 5분 동안 원심분리하였다.

10 μL 마이크로 피펫으로 펠렛(pellet)을 건드리지 않도록 주의하며 잔여물이 없도록 상등액을 제거하였다. 이후, 25℃에서 3분 동안 건조하였다. 이때, 펠렛이 완전히 건조되지 않도록 주의해야 한다. 건조된 펠렛에 60℃에서 예열한 RNase-프리 워터 (RNase-free water) 10 μL를 넣고, 60℃에서 10분 동안 녹였다. 시료 1개당 각 3개의 튜브로 진행했으므로, 최종적으로 30 μL의 RNA 시료를 얻을 수 있었다.

도 2는 본 발명의 방법으로 분리·정제한 바실러스 세레우스 RNA의 정성 및 정량적 분석 결과이고, 도 3은 기존 실험법 (Ganesh Babu et al. Journal of Nanobiotechnology 2011, 9:49 / Maarten Mols et al. Environmental Microbiology 2010, 12:873-885)으로 분리·정제한 바실러스 세레우스 RNA의 정성 및 정량 분석 결과이다.

도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명을 이용할 경우 (도 2), 고순도로 RNA를 정제할 수 있었다.

Claims

막자사발에 액체질소를 넣고 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)를 떨어뜨려 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)를 급속냉동시키는 단계 (a);
상기 냉동 후, 막자사발을 이용하여 동결된 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)를 곱게 분쇄하는 단계 (b);
상기 분쇄 후, 분쇄된 시료를 튜브에 옮겨 담고, 구아니디니움 티오시아네이트 (guanidinium thiocyanate)이 함유되어 있는 페놀(phenol) 용액을 첨가하여 반응시키는 단계 (c);
상기 반응 후, 반응물을 1차 원심분리하고, 상등액을 수득한 후, 이를 튜브(tube)에 분주하는 단계 (d);
상기 상등액이 분주된 튜브에 클로로포름(chloroform)을 넣고 혼합하여 반응시키고, 2차 원심분리하는 단계 (e);
상기 2차 원심분리 후, 하단의 붉은색의 페놀-클로로포름 층과 상단의 투명한 수용액 층, 그리고 그 사이의 혼탁한 계면 중, 상단의 투명한 수용액 층만을 회수하여 새로운 튜브로 옮기는 단계 (f);
상기 새로운 튜브로 옮겨진 투명한 수용액 층에 2-프로판올(2-isopropanol)과 트리소디움 시트레이트 및 NaCl로 구성된 고농도 침전용액을 넣고, 반응시킨 후, 3차 원심분리하는 단계 (g);
상기 3차 원심분리 후, 상등액을 제거하고, 에탄올(ethanol)을 첨가한 후, 4차 원심분리하는 단계 (h);
상기 4차 원심분리 후, 상등액을 제거하고 펠렛을 건조하는 단계 (i);
상기 건조 후, 건조된 펠렛에 예열한 RNase-프리 워터 (RNase-free water)를 넣고, 녹이는 단계 (j);를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 1차 원심분리는, 4℃에서 10,000×g의 속도로 3분 동안 수행하고,
상기 2차 원심분리는, 4℃에서 12,000×g의 속도로 15분 동안 수행하며,
상기 3차 원심분리는, 4℃에서 12,000×g의 속도로 10분 동안 수행하고,
상기 4차 원심분리는, 4℃에서 7,500×g의 속도로 5분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)는,
바실러스 세레우스의 배양액으로부터 원심분리하여 회수한 바실러스 세레우스 펠렛(pellet)을 RNA 전용 Tris-EDTA 버퍼와 균일하게 혼합한 혼합액인 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (c)의 반응은,
25℃에서 5분간 수행하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (e)는,
수득한 상등액에 영하 20℃에서 보관한 RNA 전용 클로로포름(chloroform)을 넣고 혼합한 후, 25℃에서 3분 동안 반응시키고 2차 원심분리를 하되, 반응 과정에서 붉은색의 페놀-클로로포름 층과 수용액 층이 분리되지 않도록, 반응 과정에서 간헐적으로 볼텍스 믹서로 혼합하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (g)의 2-프로판올은, 영하 20℃에서 보관한 것이고,
상기 단계 (g)의 고농도 침전용액은, 4℃에서 보관한 것이며,
상기 단계 (g)의 반응은, 25℃에서 10분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (h)의 에탄올은, 영하 20℃에서 보관한 75% 에탄올이고, 별도의 혼합과정 없이 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (i)는,
4차 원심분리 후, 펠렛을 건드리지 않도록 조심스럽게 상등액을 제거하고, 펠렛을 25℃에서 3분 동안 건조하되, 펠렛이 완전히 건조되지 않도록 하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (j)는,
건조된 펠렛에 60℃에서 예열한 RNase-프리 워터를 넣고, 60℃에서 10분 동안 녹이는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)로부터 RNA의 회수방법.