CN110343697B - 一种植物病害菌总dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体而言，涉及一种植物病害菌总DNA提取方法，包括：菌体样本经过液体培养基培养、溶菌酶溶解、CTAB/NaCl溶液分离DNA、氯仿及苯酚‑氯仿多次萃取，得到含有DNA的提取液，除去该提取液中的杂质即得病害菌总DNA。所述的DNA提取方法，细胞破壁效果好，酚氯仿分层萃取率高，尤其适合于水稻、小麦、番茄和黄瓜等果蔬的细菌类病原菌的DNA提取。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体涉及一种植物病害菌总DNA提取方法。
背景技术
现代生物技术为进一步认识生命活动的本质，更好地利用其规律为人类服务提供了重要手段。但DNA分离是成功利用这戏技术的第一步，也是非常重要的一步，DNA的质量直接决定后续实验的成败。目前植物病害菌基因组DNA的提取方法很多，但是易受到提取液等杂质的污染，提取的纯度、浓度、产量都不高，使得后续测序实验结果不稳定，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物病害菌总DNA提取方法，所述的DNA提取方法可有效地去除杂质，提取出高浓度高纯度且稳定的DNA基因组。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案
一种植物病害菌总DNA提取方法，包括以下步骤：
1)取菌体样本在LB+0.4％Gly液体培养基中混合36～60h后，3000～5000rpm 离心收集菌体，用15～20ml STE缓冲液洗涤菌体，得悬浮液。
2)在上述得到的悬浮液0.5～1g，加入15mL STE缓冲液，涡旋混匀；称取溶菌酶粉末溶解于悬液，使其浓度为2.8～3.4mg/mL，混匀，放到37℃、200rpm 恒温培养箱中反应3～4h，得混合液Ⅰ。
3)在上述所得到的混合液Ⅰ中同时加入200μL 10mg/mL的蛋白酶K和20％SDS1.5mL，混匀后，放入50～70℃水浴中反应1h以上，得混合液Ⅱ。
4)在上述所得到的混合液Ⅱ中加入2.5～3.5mL的5M NaCl，充分混匀，使NaCl 的最终浓度为0.8M，得混合液Ⅲ。
5)在上述所得到的混合液Ⅲ中加入1.90～2mL CTAB/NaCl溶液，在68℃水浴下充分混匀10min，得混合液Ⅳ。
6)在上述所得混合物Ⅳ加入等体积量的氯仿混匀，离心后将取上清液Ⅰ。
7)在上述所得上清液Ⅰ中加入等体积量的苯酚-氯仿混匀，离心，用剪枪头小心的吸取上清液，重复上述动作2次，得上清液Ⅱ。
8)在上述所得上清液Ⅱ加入等体积量的氯仿混匀，离心后取上清液Ⅲ。
9)在上述所得上清液Ⅲ中加入3M NaAc(pH5.2)、异丙醇、70％的乙醇、1×TE 缓冲液、10％SDS、10mg/mL蛋白酶K以及无水乙醇，除去所述上清液Ⅲ中的杂质，得到病害菌总DNA。
所述LB+0.4％Gly液体培养基为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠 (NaCl)10g/L，用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4,加入0.4％Gly溶解所得；
所述STE缓冲液为20mM Tris-HCl、10mM EDTA、100mM NaCl、pH＝7.5；
所述20％SDS溶液为20gSDS、100ml蒸馏水，溶解所得；
所述10％SDS溶液为10gSDS、100ml蒸馏水，溶解所得；
所述CTAB/NaCl溶液为10％的CTAB溶解于0.7M的NaCl；
所述苯酚-氯仿为250ml Tris饱和酚与250ml氯仿混合均匀，置于4℃冰箱分层，备用；
所述1×TE缓冲液为10mMTris-HCl、1mM EDTA、PH＝8.0。
所述步骤9)除去所述上清液中的杂质的操作具体包括以下步骤：
A)上清液中加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2已预冷)，混匀后加等体积异丙醇 (已预冷)混匀，放在冰上使DNA螺旋成白色的团，其间小心的上下翻动；
B)用枪头挑出DNA放入2mL的EP管中，用1.5mL 70％的乙醇洗涤2～3次，晾至半干状态，用1mL 1×TE缓冲液溶解DNA，加入5μL 10mg/mL的RNA酶，放在 4℃冰箱过夜溶解；
C)将溶解好的DNA从4℃冰箱拿出来，加入2μL 10％SDS及8μL 10mg/mL蛋白酶K，55℃水浴反应1h以上。冷却至室温后，加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2已预冷)混匀后，加入2倍体积的无水乙醇在冰上沉淀得DNA。
优选的，在所述步骤6)、7)、8)中所述混匀为上下颠倒混匀变成一相。
优选的，在所述步骤6)、7)、8)中，在转速12000～14000rpm下离心10～ 15min。
本发明提取病害菌总DNA的方法中所述菌体在LB+0.4％Gly液体培养基中 Gly作为重要的有机氮源，对其培养物的生长有良好的促进作用，从而促进菌体的生长。STE缓冲溶液下DNA呈稳定状态，最少限度受到破坏。
其中所述溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，所述蛋白酶K和SDS在高温(50～70℃)下具有很高的活性，溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，因而溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞的核蛋白，能与蛋白质变性沉淀下来，使DNA游离在溶液中。
其中所述CTAB/NaCl溶液，在低离子强度的溶液中CTAB沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。DNA充分溶解，存在于液相中。
其中所述氯仿可加速有机相与液相分层，氯仿抽提两次，除去CTAB及过多的多糖，苯酚-氯仿抽提两次，去除蛋白质，再用氯仿抽提一次，以防止苯酚的残留，萃取率高，杂质少。
其中步骤9)的步骤A)中异丙醇来沉淀DNA，NaAc则是提供钠盐环境，促进DNA沉淀，效果明显；步骤B)中，RNA酶有效降解DNA制备物中的RNA 分子；步骤C)更进一步提纯了DNA。
与现有技术相比，本发明提取病害菌总DNA的方法中菌体在LB+0.4％Gly 液体培养基中培养，Gly作为重要的有机氮源，对其培养物的生长有良好的促进作用，从而促进菌体的生长；STE缓冲溶液下DNA呈稳定状态，最少限度受到破坏，由此获取DNA的产量提高；采用氯仿及苯酚-氯仿多次抽提离心，可有效防止苯酚残留，萃取率高，杂质少。应用紫外分光光度计和荧光定量仪测试所得的DNA，显示了采用本发明方法提取的DNA产量和纯度都有所提高，实验结果更加稳定。
附图说明
图1基因组DNA样本的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：1.取菌体样本在LB+0.4％Gly液体培养基中混合48h后，用50mL 灭菌离心管4000rpm收集菌体。用15mL STE缓冲液洗涤菌体，得悬浮液。
2.取0.7g悬浮液，加入15mL STE缓冲液，涡旋混匀；称取溶菌酶粉末溶解于悬液，使其终浓度为3mg/mL，混匀；放到37℃，200rpm恒温培养箱中反应3.5h 得混合液Ⅰ。
3.反应结束后，菌液呈现均匀粉粒状，同时加入200μL 10mg/mL的蛋白酶 K和20％SDS 1.5mL，混匀后，放入55℃水浴中反应1h以上，每隔10min摇均匀一次。
4.加入3mL的5M NaCl，充分混匀，使得NaCl的终浓度为0.8M。加入 1.95mLCTAB/NaCl溶液，充分混匀在68℃下水浴10min。
5.用等体积的氯仿抽提两次，除去CTAB及过多的多糖，加入氯仿后上下颠倒混匀成一相，离心后将上清转移至新的离心管中。用等体积的苯酚-氯仿抽提两次，去除蛋白质。加入苯酚-氯仿后上下颠倒混匀变成一相，12000rpm离心 15min，用剪枪头小心的吸取上清液。在两次苯酚/氯仿抽提后，再用等体积的氯仿抽提一次，以防止苯酚的残留。
6.加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2已预冷)，混匀后加等体积异丙醇(已预冷)混匀，放在冰上使DNA螺旋成白色的团，其间小心的上下翻动。
7.用枪头挑出DNA放入2mL的EP管中，用1.5mL 70％的乙醇洗涤2-3 次，晾至半干状态，用1mL 1×TE缓冲液溶解DNA，加入5μL 10mg/mL的RNA 酶，放在4℃冰箱过夜溶解。
8.将溶解好的DNA从4℃冰箱拿出来，加入2μL 10％SDS及8μL 10mg/mL 蛋白酶K，55℃水浴反应1h以上。冷却至室温后，加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2已预冷)混匀后，加入2倍体积的无水乙醇在冰上沉淀DNA，即得。
对所得DNA进行测试，采用NanoDrop紫外分光光度计、Qubit荧光定量仪、琼脂糖凝胶电泳进行测定结果如下表1和图1所示。
由表1数据可得采用本发明提取方法所提取的细菌基因组DNA的 260nm/230nm、260nm/280nm吸光度的比值更高，产量很高，琼脂糖凝胶电泳图验证基因组DNA的纯度，凝胶电泳带结果如附图1所示，应用本发明的细菌基因组DNA提取方法实施例2进行提取，凝胶电泳显示条带更加一致。证明本发明的植物病害菌总DNA抽提方法，很好的避免了有机物与无机物污染，所获得基因组DNA纯度更高。可知DNA更纯净，浓度高，产量高，结果更稳定。
表1
Claims (3)
1.一种植物病害菌总DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1取菌体样本在LB+0.4%Gly液体培养基中混合36～60h后，3000～5000rpm离心收集菌体，用15～20ml STE缓冲液洗涤菌体，得悬浮液；
S2取S1得到的悬浮液0.5～1g，加入15mL STE缓冲液，涡旋混匀；称取溶菌酶粉末溶解于悬浮液，使其浓度为2.8～3.4 mg/mL，混匀，放到37℃、200rpm恒温培养箱中反应3～4h，得混合液Ⅰ；
S3在S2得到的混合液Ⅰ中同时加入200μL 10mg/mL的蛋白酶K和20%SDS 1.5mL，混匀后，放入50～70℃水浴中反应1h以上，得混合液Ⅱ；
S4在S3得到的混合液Ⅱ中加入2.5～3.5 mL的5M NaCl，充分混匀，使NaCl的最终浓度为0.8M，得混合液Ⅲ；
S5在S4得到的混合液Ⅲ中加入1.90～2mL CTAB/NaCl溶液，在68℃水浴下充分混匀10min，得混合液Ⅳ；
S6在S5得到的混合液Ⅳ加入等体积量的氯仿混匀，离心后将取上清液，重复上述动作2次，得上清液Ⅰ；
S7在S6得到的上清液Ⅰ中加入等体积量的苯酚-氯仿混匀，离心，用剪枪头小心的吸取上清液，重复上述动作2次，得上清液Ⅱ；
S8在S7得到的上清液Ⅱ加入等体积量的氯仿混匀，离心后取上清液Ⅲ；
S9在S8得到的上清液Ⅲ中加入3M NaAc pH5.2、异丙醇、70%的乙醇、1×TE缓冲液、10%SDS、 10 mg/mL蛋白酶K以及无水乙醇，除去所述上清液Ⅲ中的杂质，得到病害菌总DNA；
所述LB+0.4%Gly液体培养基为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物 5g/L、氯化钠NaCl 10g/L，用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4,加入0.4%Gly溶解所得；
所述STE缓冲液为20 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、100 mM NaCl、pH=7.5；
所述20%SDS溶液为20gSDS、100ml蒸馏水，溶解所得；
所述10%SDS溶液为10gSDS、100ml蒸馏水，溶解所得；
所述CTAB/NaCl溶液为10 %的CTAB溶解于0.7 M的NaCl；
所述苯酚-氯仿为250 ml Tris 饱和酚与250 ml 氯仿混合均匀，置于4℃冰箱分层，备用；
所述1×TE缓冲液为10mMTris-HCl、1mM EDTA、 PH=8.0；
在所述S9中，除去所述上清液Ⅲ中杂质的操作具体包括以下步骤：
A.上清液中加入1/10体积3M NaAc，pH 5.2已预冷，混匀后加等体积异丙醇已预冷混匀，放在冰上使DNA螺旋成白色的团，其间小心的上下翻动；
B.用枪头挑出DNA放入2 mL的EP管中，用1.5 mL 70%的乙醇洗涤2～3次，晾至半干状态，用1mL 1×TE缓冲液溶解DNA，加入5μL 10 mg/mL的RNA酶，放在4℃冰箱过夜溶解；
C.将溶解好的DNA从4℃冰箱拿出来，加入2μL 10%SDS及8μL 10 mg/mL蛋白酶K，55℃水浴反应1 h以上，冷却至室温后，加入1/10体积3M NaAc，pH 5.2已预冷，混匀后，加入2倍体积的无水乙醇在冰上沉淀得DNA。
2.如权利要求1所述的一种植物病害菌总DNA的提取方法，其特征在于，在所述S6、S7、S8中所述混匀为上下颠倒混匀变成一相。
3.如权利要求1所述的一种新型的植物病害菌总DNA的提取方法，其特征在于，在所述S6、S7、S8中，12000～14000rpm离心10～15 min。
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| 菜豆萎蔫病菌的PCR检测技术;张晓梅等;《南京农业大学学报》;20040730(第03期);第43页第1.2节 * |
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