DE1189674B

DE1189674B - Verfahren zur Isolierung von alpha-Antitrypsin

Info

Publication number: DE1189674B
Application number: DEB72263A
Authority: DE
Inventors: Dr Hermann Edward Schultze; Dr Norbert Heimburger
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1963-06-12
Filing date: 1963-06-12
Publication date: 1965-03-25
Also published as: BE649238A; NL6406622A; AT255027B; CH443561A; US3293236A; GB1062434A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Nummer: Aktenzeichen: Anmeldetag: Auslegetag:

A61k

Deutsche Kl.: 30 h - 2/04

1189 674
B 72263IV a/30 h 12. Juni 1963 25. März 1965

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von «!-Antitrypsin, insbesondere aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, unter Verwendung von mit Carboxymethylgruppen verätherten, vernetzten Dextranen.

Es ist schon versucht worden, das «j-Antitrypsin mittels DEAE-Cellulose (J. Biol. Chem., 235, S. 56 [I960]) oder Dowex-Säulen (J. Biol. Chem., 236, S. 2672 [1961]) zu isolieren. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie nur bei Verwendung von über mehrere Stufen vorgereinigten Fraktionen möglich sind, daß sie eine sehr niedrige Ausbeute liefern und dadurch eine Herstellung von «!-Antitrypsin in größeren Mengen unwirtschaftlich machen. Bei den mehrstufigen Verfahren treten infolge der Labilität des Äj-Antitrypsins außerdem große Aktivitätsverluste auf. Häufig ist bei nach den vorerwähnten Verfahren erhaltenen Präparaten noch eine Nachreinigung erforderlich.

Es wurde nun gefunden, daß man ocj-Antitrypsin in einfacher Weise dadurch isolieren kann, daß man eine *_rAntitrypsin enthaltende Lösung auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und 5,5 und eine Molarität von 0,005 bis 0,05 einstellt, diese mit einem mit Carboxymethylgruppen verätherten, vernetzten Dextran behandelt, die «_rAntitrypsin enthaltende Lösung von dem Dextranpräparat abtrennt, gegebenenfalls aus der so erhaltenen Lösung das Puffersalz in an sich bekannter Weise entfernt und gegebenenfalls das A₁-AnU-trypsin in an sich bekannter Weise isoliert.

Als «_X-Antitrypsin enthaltende Lösungen, wie sie erfindungsgemäß zum Einsatz gelangen, kommen menschliche oder tierische Körperflüssigkeiten, insbesondere Humanserum, tierische Seren und Ascitesflüssigkeit in Frage, die zuvor auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 und eine Molarität von 0,005 bis 0,05 eingestellt wurden. Zur Einstellung der Lösungen kann man so verfahren, daß man z. B. gegen eine 0,005- bis 0,05molare, vorzugsweise 0,01 molare Pufferlösung vom pH-Wert 5,0 bis 5,5, vorzugsweise 5,3, dialysiert, daß man mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 5,0 bis 5,5, vorzugsweise 5,3, auf die Molarität von 0,005 bis 0,05 verdünnt, daß man einen Kationenaustauscher benutzt oder daß man mittels des Verfahrens der USA.-Patentschrift 3 148 141 unter Zugabe einer 0,005- bis 0,05molaren vorzugsweise 0,01 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 5,0 bis 5,5, vorzugsweise 5,3, die nicht erwünschten niedermolekularen Substanzen entfernt. Geeignete Pufferlösungen sind z. B. Phosphatpuffer, Acetatpuffer, vorzugsweise verwendet man etwa 0,01 molaren Citratpuffer vom pH-Wert 5,3. Die Einstellung der Lösungen auf den gewünschten Verfahren zur Isolierung von «!-Antitrypsin

Anmelder:

Behringwerke Aktiengesellschaft,

Marburg/Lahn

Als Erfinder benannt:
Dr. Hermann Edward Schultze,
Dr. Norbert Heimburger,
Marbach bei Marburg/Lahn

pH-Wert und die gewünschte Molarität wird zweckmäßig bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen 0 und 10⁰C, und die Dialyse unter Rühren durchgeführt. Bei der Dialyse hat es sich als vorteilhaft erwiesen, ein Volumverhältnis von «j-Antitrypsinlösung zu Pufferlösung von 1:25 bis 1: 200, vorzugsweise 1: 50 bis 1 : 100, einzuhalten. Man dialysiert zweckmäßig etwa 4 bis 6 Stunden.

An Stelle der vorgenannten nativen Seren können auch solche «χ-Antitrypsin enthaltende Lösungen, die z. B. in an sich bekannter Weise durch Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat oder Alkohol aus nativen Seren erhältlich sind, nach Vornahme der oben beschriebenen Maßnahmen zur Einstellung des gewünschten pH-Wertes und der gewünschten Molarität für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Außerdem kann auch gegebenenfalls aus nach den eingangs erwähnten Verfahren hergestellten unreinen «j-Antitrypsinlösungen der Wirkstoff nach dem Verfahren gemäß der Erfindung isoliert werden.

Die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zweckmäßig in der Weise, daß man die — wie oben beschrieben — dialysierten, auf pH 5,0 bis 5,5

+0 und eine Molarität von 0,005 bis 0,05 eingestellten wäßrigen Lösungen des «!-Antitrypsins mit einem mit Carboxymethylgruppen verätherten, vernetzten Dextran behandelt, indem man entweder die Lösung in einer Säule, die mit einem Dextranabkömmling beschickt und zweckmäßig mit der z. B. zur Dialyse verwendeten Pufferlösung angefeuchtet ist, chromatographiert oder die Lösung im sogenannten Batchverfahren, zweckmäßig unter mechanischem Rühren, mit dem Adsorptionsmittel in Kontakt bringt. Die Begleitstoffe werden von dem Adsorptionsmittel gebunden, während das %-Antitrypsin nicht adsorbiert wird. Beim Säulenverfahren läuft die gereinigte

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«i-Antitrypsinlösung am Fuß der Säule ab und wird dort aufgefangen. Zweckmäßig wäscht man die Säule mit einer Pufferlösung gleicher Zusammensetzung, wie sie z. B. zur Dialyse verwendet wurde, nach. Beim Batch-Verfahren trennt man die wäßrige Phase in an sich bekannter Weise, z. B. durch Filtration oder Zentrifugation, ab. Aus der so erhaltenen Lösung werden anschließend die Puffersalze in an sich bekannter Weise, z. B. durch Dialyse, entfernt. Die Isolierung des «j-Antitrypsins aus der dialysierten Lösung erfolgt zweckmäßig durch Gefriertrocknung.

Neu im Sinne der Erfindung ist die Isolierung des fl^-Antitrypsins mit Hilfe von mit Carboxymethylgruppen verätherten, vernetzten Dextranen. Es war überraschend, daß es möglich ist, aj-Antitrypsin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu isolieren, nachdem alle vorbekannten Verfahren ^! nicht zum Ziele geführt haben.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß es schnell und unter schonenden, vor allem sterilen Bedingungen vorgenommen werden kann und die Isolierung des «i-Antitrypsins in guten Ausbeuten auch als Rohserum gestattet. Die biologische Aktivität bleibt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren voll erhalten. Ein weiterer besonderer Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist darin zu erblicken, daß bei Verwendung des Serums als Ausgangsmaterial die übrigen biologisch wertvollen Serumproteine, wie Gammaglobulin, Albumin u. a., vom Austauscher eluiert und ebenfalls gewonnen werden können.

Das Verfahrenserzeugnis erweist sich immunoelektrophoretisch gegen Antihumanserum vom Kaninchen als einheitlich.

Das erfindungsgemäß erhaltene «j-Antitrypsin bindet das Trypsin, Plasmin oder Chymotrypsin und hemmt dadurch die Aktivität des Trypsins, Plasmins und Chymotrypsins. Auf Grund dieser Eigenschaft hat das ■Xj-Antitrypsin therapeutische Bedeutung bei Pankreatitiden und Verbrennungsschäden, da es die enzymatische Aktivität des Trypsins zu hemmen vermag. (Plasmin kommt im Blut vor und spielt bei der Blutgerinnung eine Rolle.)

Beispiel 1

Eine Chromatographiesäule mit einem inneren Durchmesser von 2,3 cm und einer Länge von 40 cm wird mit einem mit Carboxymethylgruppen verätherten, vernetzten Dextran (CM-Sephadex® C-50) — nachfolgend mit CMD bezeichnet — bis zu einer Höhe von 30 cm beschickt, mit 0,01 molarem Natriumcitratpuffer vom pH-Wert 5,25 äquilibriert und dann 12 ml Hnmanserum, das zuvor 5 Stunden lang bei O⁰C und unter Rühren gegen 1200 ml des Äquilibrierpuffers dialysiert worden war, beladen. Anschließend wird mit 100 ml 0,01molarem Natriumcitratpuffer vom pH-Wert 5,25 nachgewaschen. Die «i-antitrypsinhaltige Lösung wird anschließend gegen Wasser vom pH 7 dialysiert und schließlich lyophilisiert. Die Ausbeute aus 12 ml Humanserum beträgt 38 mg reines «j-Antitrypsin.

Beispiel 2

Eine analog Beispiel 1 mit CMD beschichtete und äquilibrierte Säule (2,3 · 50 cm) wird mit 20 ml frischem Humanserum beladen, das zuvor 5 Stunden lang bei 0⁰C und unter Rühren gegen 2 Liter 0,01 molaren Natriumpuffer vom pH 5,3 dialysiert worden war. Die Ausbeute an immunoelektrophoretisch einheitlichem «!-Antitrypsin beträgt 66 mg.

Beispiel 3

Eine analog Beispiel 1 mit CMD gefüllte und äquilibrierte Säule (34 · 2,3 cm) wird mit 10 ml einer 3,6%igen Serumproteinlösung, die durch Fraktionierung mit Ammonsulfat aus Humanserum gewonnen und zuvor gegen 500 ml 0,01molaren Natriumcitratpuffer von pH 5,3 dialysiert worden war, beschickt und wie im Beispiel 1 behandelt. Die Ausbeute an «j-Antitrypsin beträgt 45 mg.

Beispiel 4

15 ml zuvor bei O⁰C und unter Rühren gegen 1500 ml 0,01 molaren Natriumeitratpuffer vom pH 5,3 dialysiertes Humanserum werden mit 100 g CMD, das mit 0,01 molarem Natriumeitratpuffer vom pH 5.3 getränkt worden war, versetzt; das Gemisch wird 20 Minuten gerührt und die «j-antitrypsinhaltige Lösung durch Zentrifugation gewonnen. Sie wird — wie im Beispiel 1 beschrieben — dialysiert und lyophil getrocknet. Die Ausbeute beträgt 33 mg tvj-Antitrypsin.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Isolierung von «j-Antitrypsin, insbesondere aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine «!-Antitrypsin enthaltende Lösung auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und 5,5 und eine Molarität von 0,005 bis 0,05 einstellt, diese mit einem mit Carboxymethylgruppen verätherten, vernetzten Dextran behandelt, die %-Antitrypsin enthaltende Lösung von dem Dextranpräparat abtrennt, gegebenenfalls aus der so erhaltenen Lösung das Puffersalz in an sich bekannter Weise entfernt und gegebenenfalls das _\j-Antitrypsin in an sich bekannter Weise isoliert.

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