DE3876401T2

DE3876401T2 - N-terminale fragmente von menschlichem serumalbumin.

Info

Publication number: DE3876401T2
Application number: DE8888310000T
Authority: DE
Inventors: David James Ballance; Michael John Geisow; Edward Hinchliffe; Peter James Senior
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2008-10-26
Also published as: FI101381B; KR0153516B1; IE883280L; DK600688D0; EP0322094B1; FI101381B1; IL88223A; HUT47977A; EP0322094A1; CA1341298C; US5380712A; ES2053758T3; ATE82858T1; JPH02194A; GB8725529D0; GR3007162T3; FI884993A0; DE3876401D1; ZA888118B; KR890006668A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Polypeptidmolekül, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt und für viele der existierenden Anwendungen für menschliches Serumalbumin eingesetzt werden kann.
Humanserumalbumin (HSA) ist das am reichlichsten vorhandene Plasmaprotein und stellt 60% (Gew./Gew.) des gesamten Proteingehalts des Plasmas. Ein Molekül HSA besteht aus einer einzigen nicht-glycosylierten Polypeptidkette von 685 Aminosäuren mit einem formelmäßigen Molekulargewicht von 66 500. Die Aminosäuresequenz von HSA wurde durch Protein-Sequenzanalyse (Meloun et al, 1975, "Complete amino acid sequence of human serum albumin" FEBS. Letters: 58:1, 136-317; Behrens et al., 1975, "Structure of human serum albumin" Fed. Proc. 34, 591) und vor kürzerem durch genetische Analyse (Lawn et al., 1981, Nucleic Acids Research 9, 6102-6114) gesichert. Obwohl zwischen den publizierten Aminosäuresequenzen Diskrepanzen bestanden (die zum Teil Polymorphismen zugeordnet werden können), stellt Figur 1 die Aminosäuresequenz dar, die derzeit für den typischsten Vertreter des innerhalb der menschlichen Population vorhandenen HSA gehalten wird.
Wegen seines relativ geringen Molekulargewichts und seiner negativen Nettoladung bei physiologischem pH (Peters, 1970, "Serum albumin", Adv. Clin. Chem. 13, 37-111) trägt HSA 85% des osmotischen Effekts von normalem Plasma bei. Deshalb ist HSA der hauptsächliche Regulator für das Plasmavolumen. Eine zweite Rolle des HSA ist es, kleine, durch katabolischen Prozesse gebildete Moleküle (beispielsweise Fettsäuren und Bilirubin) zu binden. Albumin stellt das hauptsächliche Mittel für den Transport dieser Schlüsselmetaboliten dar, die bei physiologischem pH nur wenig löslich sind. Physikalische, chemische und immunologische Studien sowie Studien aufgrund limitierter Proteolyse von HSA haben gezeigt, daß das Molekül aus Regionen von Polypeptidketten besteht, die nach mit Hilfe enzymatischer Methoden erfolgter Trennung vom elterlichen Molekül ihre Konformation beibehalten. Diese Polypeptidketten behalten ihre Bindungsfähigkeiten, wodurch das Kartieren von Bindungsstellen für Bilirubin, Fettsäuren und andere kleine Moleküle an bestimmte Regionen der Polypeptidkette erleichtert wird (Kragh-Hansen, 1981, "Molecular aspects of ligand binding to serum albumin", A. Soc. Pharm. Expt. Ther. 33, 1, 17-53). Vieles der Information auf diesem Gebiet ist als Übersichtsartikel erschienen (Brown and Shockley, 1982, "Serum albumin: structure and characterisation of its ligand bindind sites").
Die Indikationen für die klinische Verwendung therapeutischer Konzentrate von HSA beziehen sich hauptsächlich auf seine onkotische Wirkung als Plasmavolumen-Expander. Konzentrate von HSA sind seit den 1940iger Jahren therapeutisch genutzt worden, insbesondere bei Fällen von Schock, Verbrennungen, Syndrom der respiratorischen Insuffizienz des Erwachsenen und kardiopulmonärem Bypass. Albumin wurde auch in Fällen von akutem Leberversagen, nachfolgender Entfernung von Aszites aus Patienten mit Zirrhose, nach chirurgischen Eingriffen, bei akuter Nephrose, bei Nierendialyse und als Transportprotein zum Entfernen toxischer Substanzen, beispielsweise bei schwerer Gelbsucht bei hämolytischer Erkrankung des Neugeborenen, eingesetzt.
Über seine Verwendung als therapeutisches Mittel hinaus ist HSA ein Hauptbestandteil von zu Medien zugesetztem Serum, das zur Unterstützung des Wachstums von Säugetierzellen in Gewebekulturen verwendet wird. Der Verbrauch an Serum und damit an Albumin ist über die letzten Jahre hinweg stark gestiegen, da biotechnologische und pharmazeutische Betriebe ihre Gewebekulturen für Forschung und Produktion ausgeweitet haben. Es besteht ein generelles Bedürfnis nach geringeren Kosten und besserer Regulation der Seren für diese Zwecke.
Es ist bekannt, die für HSA kodierende DNA-Sequenz zu manipulieren, um in Mikroorganismen ein rekombinantes Polypeptid zu exprimieren. Tatsächlich wurde ein solches rekombinantes HSA-Polypeptid in Bakterienarten wie z.B. Escherichia coli (GB-PS 2 147 903B) und Bacillus subtilis (europäische Patentanmeldung Nr. 86304656.1) und der Hefe Saccharomyces cerevisiae (europäische Patentveröffentlichung Nr. 201 239, Delta Biotechnolgy Ltd.) hergestellt; es ist also allgemein akzeptiert, daß ein rekombinantes Polypeptid, das im wesentlichen mit natürlichem HSA identisch ist, in einer Anzahl mikrobieller Wirte unter Einsatz bekannter Methoden erzeugt werden kann. In allen Fällen, in denen rekombinantes HSA hergestellt wurde, war es jedoch das Ziel, ein Molekül zu erzeugen, das in seiner Struktur und biologischen Funktion "naturidentisch" mit HSA ist.
Es ist nun gefunden worden, daß es vorteilhaft ist, kürzere Formen von HSA herzustellen.
Eine Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung stellt ein Polypeptid zur Verfügung, umfassend den N-terminalen Teil von Humanserumalbumin bis zu einem Aminosäurerest n, worin n 369 bis 419 ist, sowie Varianten desselben, jedoch ausschließlich HSA (1-387).
Die neuen erfindungsgemäßen Polypeptide werden hier im folgenden mit "HSA(1-n)" bezeichnet.
Der Ausdruck "Humanserumalbumin" soll bekannte oder noch aufzufindende polymorphe Formen von HSA einschließen (jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt sein). Beispielsweise besitzt Albumin Naskapi Lys-372 anstelle von Glu-372, und Pro-Albumin Christchurch weist eine veränderte Pro-Sequenz auf. Der Ausdruck "Varianten" soll kleinere artifizielle Variationen in den Resten 1 bis n umfassen (beispielsweise Moleküle, denen ein oder einige wenige Reste fehlen, solche mit konservativen Substitutionen oder kleineren Insertionen von Resten oder solche mit kleineren Variationen der Aminosäurestruktur) (ohne notwendigerweise darauf beschränkt zu sein). So werden Polypeptide, die 80%, vorzugsweise 85%, 90%, 95% oder 99% Homologie mit einer beliebigen HSA(1-n)-Verbindung als "Varianten" betrachtet. Solche Varianten sind vorzugsweise 360 bis 430 Aminosäuren lang, stärker bevorzugt 369 bis 419 Aminosäuren lang und am meisten bevorzugt 386 bis 388 Aminosäuren lang. "Varianten" besitzen darüber hinaus bei der Anwendung einen nutzbaren Grad an onkotischer Aktivität.
Darüber hinaus sollte jede mutmaßliche Variante, die pharmakologisch verwendet werden soll, in dem zu behandelnden Lebewesen (insbesondere Menschen) nicht immunogen sein.
Konservative Substitutionen sind solche, worin eine oder mehrere Aminosäure(n) durch andere mit ähnlichen Eigenschaften substituiert sind, so daß ein in der Polypeptidchemie bewanderter Fachmann erwarten könnte, daß zumindest die Sekundärstruktur und vorzugsweise die Tertiärstruktur des Polypeptids im wesentlichen unverändert ist. Derartige typische Substitutionen umfassen zum Beispiel Alanin oder Valin anstelle von Glycin, Arginin oder Asparagin anstelle von Glutamin, Serin anstelle von Asparagin und Histidin anstelle von Lysin. Den Varianten können alternativ oder zusätzlich im Vergleich mit einem gegebenen HSA(1-n) bis zu zehn (vorzugsweise nur ein oder zwei) Aminosäurereste fehlen; vorzugsweise treten solche Auslassungen im Molekülteil von 100 bis 369 auf (in Relation zu reifem HSA selbst). In ähnlicher Weise können bis zu zehn, vorzugsweise jedoch nur ein oder zwei Aminosäuren eingefügt werden, wieder in bevorzugter Weise im Teil von 100 bis 369. Der Ausdruck "physiologisch funktionelle Äquivalente" umfaßt auch größere Moleküle, die die genannte Sequenz von 1 bis n plus eine weitere Sequenz am N-Terminus enthalten (beispielsweise pro-HSA(1-n), pre-pro-HSA(1-n), met-HSA(1-n) und HSA(1-n) mit einer geeigneten Leader-Sequenz, die nicht notwendigerweise die natürliche für HSA ist).
Wenn das HSA(1-n) durch Kultivieren einer transformierten Hefe (S. cerevisiae) hergestellt werden soll, was weiter unten genauer beschrieben wird, kann die Leader-Sequenz beispielsweise diejenige sein, die natürlicherweise bei dem α-Faktor- Protein von Hefe gefunden wird. Es können C-terminale Fusionsprodukte mit anderen interessierenden Polypeptiden hergestellt werden. Bekannte Formen und Fragmente von HSA sind selbstverständlich als ausgeschlossen aus der obigen Definition anzusehen, beispielsweise HSA(1-387), welches ein in geringer Ausbeute hergestelltes peptisches Fragment war (Geisow und Beaven, "Biochem. J." 161, 619-624, 1977 und a.a.O. 163, 477- 484, 1977). Diese älteren Artikel identifizieren das Fragment als 1-386, jedoch wurde inzwischen offensichtlich (s. beispielsweise Lawn et al., a.a.0.), daß dies an der Verwendung einer inkorrekten veröffentlichten Sequenzinformation durch die Autoren liegt und daß das Fragment tatsächlich 1-387 war). Ähnlich wird ein C-terminales Fusionsprotein, welches HSA(1-n) und die restlichen HSA-Reste (Zahlen n+1 bis 585) enthält, nicht als Teil der Erfindung beansprucht.
Besonders bevorzugte neue HSA(1-n)-Verbindungen umfassen HSA(1-373) (d.h. C-terminales Val), HSA(1-388) (d.h. C-terminales Ile), HSA(1-389) (d.h. C-terminales Lys), HAS(1-390) (d.h. C-terminales Gln) und HSA(1-407) (d.h. C-terminales Leu).
Die HSA(1-n)-Moleküle werden vorzugsweise mittels rekombinanter DNA-Technologie (fakultativ mit anschließender proteolytischer Verdauung), was einem chemischen oder enzymatischen Abbau von natürlichem HSA vorzuziehen ist, oder durch Peptidsynthese hergestellt. Im Fall eines enzymatischen Abbaus spaltet beispielsweise ein trypsinartiges Enzym HSA zwischen Lys(389) und Gln(390), gleichzeitig jedoch auch an anderen Spaltstellen. Zukünftig könnte die Peptidsynthese auch für Moleküle mit einer Länge von 419 Aminosäuren leichter durchführbar werden, aber das ist derzeit kein praktikabler Vorschlag. Die Expression in Hefe ist besonders bevorzugt.
Es ist gefunden worden, daß zumindest in manchen Situationen, in denen die HSA(1-n)-Verbindung durch Kultivieren eines transformierten Wirts erzeugt wird, manche HSA(1-n)-Verbindungen, die länger als HSA(1-387) sind, durch die im System natürlicherweise vorhandenen Enzyme proteolytisch zurück zu HSA(1-387) verdaut werden. So kann man, wenn es erwünscht ist, eine Nukleotid-Sequenz, die einer gegebenen HSA(1-n)-Verbindung entspricht, einsetzen, um eine andere HSA(1-n)-Verbindung herzustellen.
Die hier beschriebenen neuen Moleküle können als wirksames Substitut für entweder natürliches HSA oder naturidentisches rekombinantes HSA als Plasmavolumen-Expander eingesetzt werden. Ein Vorteil von HSA-(1-n) im Vergleich zu natürlichem HSA und rekombinantem, naturidentischem HSA steht im Zusammenhang mit der Wirksamkeit des Anhebens des kolloidosmotischen Drucks von Blut. Das geringere Molekulargewicht (ungefähr 44 Kilodalton) des erfindungsgemäßen Proteins bedeutet, daß eine einzelne Proteindosis von nur der Hälfte bis zu zwei Dritteln derjenigen von natürlichem HSA oder naturidentischem rekombinantem HSA für den äquivalenten kolloidosmotischen Effekt erforderlich sein wird. Folglich kann jedes beliebige Verfahren für die Herstellung dieses neuen Polypeptids mit Hilfe von rekombinanter DNA-Technologie deutliche ökonomische Vorteile im Vergleich zu bekannten Verfahren für die Herstellung von naturidentischem rekombinantem HSA bieten, da wesentlich weniger Proteinmaterial für eine wirksame Dosis hergestellt werden muß.
So stellt eine zweite Ausgestaltung der Erfindung ein Arzneimittel zur Verfügung, umfassend HSA(1-n)plus, worin HSA(1-n)plus HSA(1-n) wie oben definiert ist oder beliebige HSA(1-n)-Moleküle bedeutet, die als solche bekannt sind, jedoch bisher nicht für eine pharmazeutische Verwendung vorgeschlagen wurden.
HSA(1-387), das, wie oben diskutiert, ein zufällig in einer früher bekannt gewordenen peptischen Verdauung von HSA erzeugtes Fragment war, ist als das HSA(1-n)plus in einem solchen Arzneimittel besonders bevorzugt. Die Zusammensetzung kann "Varianten" von HSA(1-387), wie oben definiert, umfassen.
Eine dritte Ausgestaltung stellt ein Verfahren zum Behandeln eines Menschen bei Schock, Verbrennungen oder anderen Zuständen bereit, in welchen Albumin angezeigt ist, umfassend das intravenöse Verabreichen einer bezüglich der Vermehrung des Blutvolumens oder der Blutreinigung wirksamen, nicht-toxischen Menge einer sterilen, pyrogenfreien Lösung eines Polypeptids, umfassend HSA(1-n)plus.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung umfassen
(a) Vektoren, Plasmide und transformierte Mikroorganismen, einschließlich Zellinien, die für die HSA(1-n)-Expression kodieren;
(b) Verfahren für die Herstellung von HSA(1-n)plus, umfassend die Fermentation eines Mikroorganismus' (einschließlich einer Zellinie) unter geeigneten Bedingungen, der so transformiert ist, daß er HSA(1-n)plus exprimieren kann; und
(c) HSA(1-n)plus enthaltende Labormedien.
Ein weiterer Vorteil von zumindest einigen HSA(1-n)plus- Molekülen im Vergleich zu naturidentischem, rekombinantem HSA ist, daß, wie man gefunden hat, ihre geringere Größe und ihr demzufolge verminderter Aminosäuregehalt zu einem Anstieg der in mikrobiellen Wirten gewonnenen Ausbeute (Moleküle pro Zell- Trockengewicht) führt, im Vergleich zu derjenigen, die man derzeit für naturidentisches, rekombinantes HSA erhält. So wurde nicht nur gefunden, daß der Verfahrensmaßstab verkleinert werden kann, sondern auch, daß die Produktivität im rekombinanten Wirtsorganismus erhöht werden kann.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als das Blutvolumen vermehrende (plasmaexpandierende) Mittel auf vergleichbaren Wegen und in vergleichbaren Formulierungen wie HSA selbst verwendet werden, mit der Ausnahme, daß die Dosis der HSA(1-n)plus-Verbindung (ausgedrückt bezogen auf das Gewicht) im allgemeinen geringer sein wird als diejenige von HSA, da die onkotische Wirkung der ersteren größer ist. Der als Pharmazeut oder Kliniker bewanderte Fachmann wird leicht in der Lage sein, mittels routinemäßigen und nicht-erfinderischen Experimentierens die optimale Dosis der HSA(1-n)plus-Verbindung zu bestimmen. Im allgemeinen wird die verabreichte Menge an HSA(1-n)plus etwa zwei Drittel der Menge an HSA betragen, die verabreicht werden würde.
HSA(1-n)plus-Verbindungen können auch verwendet werden als:
(1) Substitute für HSA oder, eher üblich, Rinderserumalbumin (BSA) in Medien für Gewebekulturen, wobei das Risiko einer Kontamination des Mediums mit beispielsweise Viren und Mykoplasmen verringert wird;
(2) Substitute für BSA in der stationären Phase bei der Flüssigkeitschromatographie für die Auflösung von Enantiomeren usw.

BEISPIELE

Die Erfindung wird nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert werden, worin:
Figur 1 die Aminosäuresequenz darstellt, die man derzeit für den typischsten Vertreter von natürlichem HSA hält, mit (im Kästchen) den alternativen C-Termini von HSA(1-n);
Figur 2 die DNA-Sequenz darstellt, die für reifes HSA kodiert;
Figur 3 in Form eines Diagramms die Konstruktion von mHOB16 darstellt;
Figur 4 in Form eines Diagramms die Konstruktion von pHOB31 erläutert; und
Figur 5 die Kopie eines Rocket-Elektrophoretogramms ist, die die erhöhte Ausbeute an HSA(1-389) im Vergleich zu vollständigem HSA zeigt.
Die rekombinanten DNA-Standardverfahren sind die von Maniatis et al. (1982) beschriebenen, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Konstruktion und Analyse von rekombinanten M13-Klonen erfolgte wie von Messing (1983) und Sanger et al. (1977) beschrieben.
Die für Humanserumalbumin kodierende Sequenz, die für die Konstruktion der folgenden Moleküle verwendet wurde, stammt aus dem Plasmid M13mp19.7 (europäische Patentanmeldung Nr. 201 239, Delta Biotechnology Ltd.) oder aus der Synthese von Oligonukleotiden, die Teilen dieser Sequenz äquivalent sind. Oligonukleotide wurden mit Phosphoramidit-Chemie auf einer Applied Biosystems 380B Oligonukleotid-Syntheseeinrichtung nach den Empfehlungen des Herstellers synthetisiert (AB Inc., Warrington, Cheshire, England).

Beispiel 1: HSA (1-389)

Ein Expressionsvektor wurde konstruiert, worin für das HSA-Sekretionssignal und reifes HSA bis zu und einschließlich der 389ten Aminosäure, Lysin, kodierende DNA stromabwärts vom Promotor des S. cerevisiae-Phosphoglyceratkinase-Gens (PGK) angeordnet wurde, gefolgt von einem Stopcodon und dem PGK-Terminator der Transkription. Dieser Vektor wurde dann durch Transformation in S. cerevisiae eingeführt und bewirkte die Expression eines Moleküls, welches die N-terminalen 389 Aminosäuren von HSA verkörpert, und dessen Sekretion aus den Zellen.
Ein Oligonukleotid wurde synthetisiert (Linker 1), welches einen Teil der bekannten, für HSA kodierenden Sequenz (Fig. 2) von der PstI-Schnittstelle (1092, Fig. 2) bis zum Codon für Valin 381 darstellte, worin dieses Codon von GTG in GTC umgewandelt worden war: Linker 1
Der Linker 1 wurde in den Vektor M13mp19 (Norrander et al., 1983) ligiert, der mit PstI und HincII verdaut worden war, und die Ligierungsmischung wurde für die Transfektion des E. coli-Stamms XL1-Blue (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) verwendet. Rekombinante Klone wurden anhand ihrer Unfähigkeit identifiziert, in Gegenwart von IPTG (Isopropylthio-β-galaktosid) auf den chromogenen Indikator X- gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid) enthaltendem Medium blaue Farbe zu entwickeln. Die DNA-Sequenzanalyse von Matrizen-DNA, hergestellt aus Bakteriophagen-Teilchen rekombinanter Klone, identifizierte ein Molekül mit der erforderlichen DNA-Sequenz, bezeichnet als mHOB12 (Fig. 3).
M13mp19.7 besteht aus der kodierenden Region von reifem HSA in M13mp19 (Norrander et al., 1983) derart, daß das Codon für die erste Aminosäure von HSA, GAT, mit einer einzelnen XhoI-Schnittstelle folgendermaßen überlappt:
(EPA Nr. 210239 A1). M13mp19.7 wurde mit XhoI verdaut, durch Behandlung mit S1-Nuklease glattendig gemacht und dann mit dem folgenden Oligonukleotid (Linker 2) ligiert: Linker 2
Die Ligierungsmischung wurde dann zur Transfektion von E. coli XL1-Blue verwendet, und Matrizen-DNA wurde aus verschiedenen Plaques gewonnen und dann durch DNA-Sequenzierung analysiert, wobei ein Klon, pDBD1 (Fig. 4) mit der korrekten Sequenz identifiziert wurde.
Ein 1.1 kB langes HindIII bis PstI Fragment, welches das 5'-Ende der für HSA kodierenden Region und eine Hälfte des insertierten Oligonukleotid-Linkers darstellt, wurde aus pDBD1 mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit doppelsträngigem, zuvor mit HindIII und PstI verdautem mHoB12 ligiert, und die Ligierungsmischung wurde dann für die Transfektion von E. coli XL1-Blue verwendet. Einsträngige Matrizen-DNA wurde aus reifen Bakteriophagen-Teilchen verschiedener Plaques hergestellt. Die DNA wurde in vitro durch Extension eines daran gebundenen Sequenzprimers mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten doppelsträngig gemacht. Eine Restriktionsenzym-Analyse dieser DNA erlaubte die Identifizierung eines Klons mit der korrekten Konfiguration, mHOB15 (Fig. 4).
Das folgende Oligonukleotid (Linker 3) erstreckt sich vom Codon für die 382ste Aminosäure von reifem HSA (Glutamat, GAA) bis zum Codon für Lysin 389, welchem ein Stopcodon (TAA) und eine HindIII-Schnittstelle und dann ein BamHI-Kohäsivende folgt: Linker 3
Dieses wurde in doppelsträngiges mMOB15 ligiert, welches zuvor mit HincII und BamHI verdaut worden war. Nach der Ligierung wurde die DNA mit HincII verdaut, um alle nicht-rekombinanten Moleküle zu zerstören, und dann zur Transfektion von E. coli XL1-Blue verwendet. Einsträngige DNA wurde aus Bakteriophagen-Partikeln einer Anzahl von Klonen gewonnen und der DNA-Sequenzanalyse unterworfen. Ein Klon mit der korrekten DNA-Sequenz wurde mit mHOB16 (Fig. 4) bezeichnet.
Durch Insertion von Linker 4: Linker 4
in mit BamHI und XhoI verdautes M13mp19.7 wurde unter Bildung von pDBD2 ein Molekül erzeugt, worin die für das reife HSA kodierende Region mit dem HSA-Sekretionssignal fusioniert war (Fig. 5). In diesem Linker war das Codon für die vierte Aminosäure nach dem Anfangsmethionin, ACC für Threonin in der HSA-pre-pro-Leader-Sequenz (Lawn et al., 1981) gegen AGC für Serin ausgetauscht, um eine HindIII-Schnittstelle zu erzeugen.
Das 5'-Ende dieser Konstruktion wurde als Fragment von BamHI bis PvuII entfernt und mit dem Fragment von PvuII bis BamHI von doppelsträngigem mHOB16 (welches das 3'-Ende des verkürzten HSA-Gens darstellt) an der BglII-Schnittstelle in pMA91 (Mellor et al., 1983) ligiert, wobei pHOB31 gebildet wurde (Fig. 4). Dieses Molekül enthält die für das verkürzte HSA kodierende Region mit dem HSA-Sekretionssignal zwischen dem S. cerevisiae PGK-Gen-Promotor und -Terminator derart, daß das 5'-Ende des Gens an den Promotor angrenzt. Das Molekül enthält weiterhin einen selektierbaren Marker für Hefetransformation, LEU2, und einen Teil des Hefe-2um-Plasmids, um autonome Replikation in Hefe zu ermöglichen.
Das Plasmid pHOB31 wurde durch standardmäßige Transformation (Beggs, 1978) in S. cerevisiae AH22 (Hinnen et al., 1978) eingeführt. Gereinigte Transformanten wurden in YEPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) 3 Tage lang bei 30ºC gezüchtet, und dann wurde der Kulturüberstand mit Hilfe von Rocket-Gelelektrophorese erfolgreich auf das Vorhandensein von HSA-verwandtem Material analysiert. Fig. 5 zeigt das Elektrophoretogramm: Die Ausbeute an HSA-verwandtem Material aus Transformanten, die ein für HSA (1-389) kodierendes Plasmid beherbergen, ist nachweislich höher als die Ausbeute aus einer Transformante, die reifes, natürliches HSA sezerniert.
Die Erzeugung von HSA (1-389) lieferte jedoch ein von HSA (1-387) (s. Beispiel 2) weder durch aminoterminale noch carboxyterminale Sequenzanalyse unterscheidbares Produkt. Dies läßt sich wahrscheinlich durch die wirksame Entfernung der COOH-terminalen Sequenz Ile-Lys erklären.

Beispiel 2: HSA (1-387)

Die Konstruktion eines für HSA (1-387) kodierenden Plasmids war mit dem Verfahren für die Konstruktion des HSA (1- 389)-Plasmids, pHOB31, identisch, mit der Ausnahme, daß der Linker 3 durch den Linker 5 (unten dargestellt) ersetzt wurde, der die Region vom Codon für die 382ste Aminosäure von reifem HSA (Glutamat, GAA) bis zum Codon für Leucin 387, welcher ein Stopcodon und eine HindIII-Schnittstelle und dann ein BamHI- Kohäsivende folgt, verkörpert: Linker 5
Die anderen Teile der Konstruktion entsprachen den obigen Angaben für pHOB31 und führten zum Plasmid pDBD5.

Beispiel 3: (1-369)

Um ein für HSA (1-369) kodierendes Plasmid zu konstruieren, wurde ein Linker synthetisiert, der den Bereich von der PstI-Schnittstelle von reifem HSA (Position 1092, Fig. 3) bis zum Codon für Cystein 369 und im Anschluß daran ein Stopcodon (TAA), eine HindIII-Schnittstelle und dann ein BamHI- Kohäsivende verkörpert: Linker 6
Dieser Linker wurde mit dem BamHI-PstI-Fragment von pDBD2, welches den 5'-Teil von preproHSA bildet, an der BglII- Schnittstelle in pMA91 ligiert. Ein Plasmid mit der korrekten Konfiguration wurde mit pDBD3 bezeichnet (Fig. 6).
Die Produktion von HSA (1-369) durch Kultivieren von mit pDBD3 transformierter S. cerevisiae lieferte geringe Ausbeuten, was anzeigt, daß das Produkt in dem verwendeten Hefe-Expressionssystem inastabil gewesen sein könnte.

Beispiel 4: HSA (1-419)

Für die Konstruktion eines für HSA (1-419) kodierenden Plasmids wurde das BamHI - HincII-Fragment von pDBD2 mit einem annealten, selbstkomplementären Oligonukleotid (Linker 7) ligiert:

Linker 7

5' ATAAGCTTGGATCCAAGCTTAT 3',
und dann wurde die Ligierungsmischung mit BamHI verdaut, und das Fragment wurde unter Bildung von pDBD4 in pMA91 ligiert (Fig. 7). In diesem Konstrukt erzeugt die HincII-Schnittstelle (1256, Fig. 3) von pDBD2 ein stumpfes Ende nach der zweiten Base des Codons für Serin 419, und dieses Codon wird durch den Linker 6 so wieder hergestellt, daß auf dieses Codon ein Stopcodon, eine HindIII-Schnittstelle und eine BamHI-Schnittstelle folgen.
Die Expression von HSA (1-419) über das Plasmid pDBD5 in S. cerevisiae erzeugte ein Molekül mit der korrekten aminoterminalen Sequenz (Asp-Ala-His.......), jedoch bildete Leucin und nicht Serin den COOH-terminalen Rest. Versuche zum Isolieren des COOH-terminalen Peptids unter Verwendung einer covalenten Markierung, die an Cystein 392 binden sollte, waren ebenfalls erfolglos. Daraus wurde geschlossen, daß Proteolyse eines Teils des COOH-Terminus' von HSA (1-419) erfolgte. Dies stimmt mit der Beobachtung einer geringprozentigen Proteolyse von in der Länge vollständigem HSA an derselben Position überein, welches auf analoge Art in Hefe hergestellt worden war (Sleep et al., 1988).

Beispiel 5

Fermentierung von HSA(1-n)plus-produzierender Hefe

Ein Laborfermenter wird bis zur Hälfte seines nominalen Arbeitsvolumens mit einem ersten "Batch"-Medium gefüllt, das 50 ml/l einer Salzmischung enthält (enthaltend 114 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 12 g/l MgSO&sub4;, 3,0 g/l CaCl&sub2; 6H&sub2;O, 2,0 g/l Na&sub2; EDTA: 10 ml/l einer Spurenelement-Lösung, enthaltend 3 g/l ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 10 g/l FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 3,2 g/l MnSO&sub4; 4H&sub2;O, 79 mg/l CuSO&sub4; 5H&sub2;O, 1,5 g/l H&sub3;BO&sub3;, 0,2 g/l KI, 0,5 g/l Na&sub2;MoO&sub4; 2H&sub2;O, 0,56 g/l CoCl&sub2; 6H&sub2;O, 75 ml/l H&sub3;PO&sub4;: 20 g/l Saccharose: 50 ml/l einer Vitaminmischung, enthaltend 1,6 g/l Ca-Pantothenat, 1,2 g/l Nikotinsäure, 12,8 g/l m Inositol, 0,32 g/l Thiamin HCl und 8 mg/l Pyridoxin HCl und 8 mg/l Biotin. Das gleiche Volumen "Nähr"medium, enthaltend 100 ml/l der Salzmischung, 20 ml/l der Spurenelement-Lösung, 500 g/l Saccharose und 100 ml/l Vitaminlösung wird in einem separaten Behälter gehalten, der über eine Dosierpumpe mit dem Fermenter verbunden ist.
Der Fermenter wird mit Saccharomyces cerevisiae beimpft, welche, wie oben angegeben, mit dem Plasmid pDBD3 aus Beispiel 2 transformiert war. Der pH wird durch automatische Zugabe von Ammoniak oder Schwefelsäure bei 5,7 ± 0,2 gehalten, die Temperatur wird auf 30ºC eingestellt, und die Rührgeschwindigkeit wird so eingeregelt, daß eine Spannung an gelöstem Sauerstoff (DOT) von > 2o% Luftsättigung bei 1 v/v/min Luftdurchflußgeschwindigkeit erreicht wird. Wenn das anfängliche Substrat verbraucht ist, wird die Dosierpumpe eingeschaltet und eine Wachstumsgeschwindigkeit von ungefähr 0,15h&supmin;¹ aufrechterhalten. Die Pumpgeschwindigkeit wird gesteigert, um diese Wachstumsrate aufrechtzuerhalten, bis die Rührergeschwindigkeit ihren Maximalwert erreichte, wobei es an diesem Punkt nicht möglich ist, die Pumpgeschwindigkeit noch weiter zu erhöhen, ohne daß die DOT unter 15% Luftsättigung fällt, den geringsten Wert, der noch auftreten darf. PPG 2000 wird als Reaktion auf eine Schaumsonde zugesetzt. Es wird keines zugegeben, bis über 50% der Nährlösung zugesetzt worden sind. Der Endwert für den Zusatz beträgt 0,2 g/l.
HSA (1-387) wird in das Medium sezerniert.

Beispiel 6

Bindung von Bilirubin an HSA(1-387)

Die Bindung des Häm-Metaboliten Bilirubin an HSA(1-387) wurde mit Hilfe einer Fluoreszenzsteigerungs-Methode (Beaven und Gratzen (1973) Eur. J. Biochem. 33, 500-510) durchgeführt. Fig. 8 zeigt, daß die Steigerung der Bilirubin-Fluoreszenz als Funktion des Verhältnisses Protein/Bilirubin für HSA(1-387) und HSA mit klinischem Reinheitsgrad ununterscheidbar ist.
Die Interaktion zwischen HSA und Bilirubin ist in sehr empfindlicher Weise abhängig von der Konformation des Proteins (Beaven und Gratzen, a.a.O.) und diese Ergebnisse zeigen, daß durch die Expression eines kürzeren Moleküls keine bedeutende Veränderung der Konformation derjenigen Region von HSA aufgetreten ist, die von HSA (1-387) gebildet wird.

Beispiel 7

Onkotisches Verhalten von HSA(1-387)

HSA(1-387) wurde in einer 0,9%igen w/v Salzlösung auf eine Protein-Endkonzentration von 54 mg/ml konzentriert. Verdünnungen dieses Konzentrates wurden zusammen mit Verdünnungen eines HSA mit klinischem Reinheitsgrad (100 mg/ml) bezüglich des osmotischen Effekts in einem Kolloid-Osmometer verglichen. Fig. 9 zeigt, daß bei einer gegebenen Proteinkonzentration HSA (1-387) einen kolloidosmotischen Druck liefert, der ungefähr um ein Drittel höher ist als der von HSA voller Länge. Dabei ist von Bedeutung, daß der Anstieg des kolloidosmotischen Drucks über einen Bereich von bis zu 5% w/v, der die Konzentration im Plasma vorstellt, mit der Proteinkonzentration ungefähr linear ist.
Dies zeigt, daß HSA(1-387) innerhalb eines Konzentrationsbereichs, der für das klinische Arbeiten einsetzbar ist, nicht bemerkenswert selbst assoziiert.

Beispiel 8

Formulierungen für die Injektion

Das erfindungsgemäße HSA(1-n)plus kann in Behältergrößen im Bereich von 20 ml bis 500 ml mit (in typischer Weise) unterschiedlichen Konzentrationen desselben von 2% bis 17%, beispielsweise 3%, 13% oder 17%, angeboten werden.
Die Verabreichungslösung ist steril und pyrogenfrei. Eine 3%ige Lösung ist osmotisch vergleichbar mit menschlichem Plasma. Mindestens 96% des Gesamtproteins ist vorzugsweise Albumin. Der Natriumionen-Gehalt liegt im allgemeinen zwischen 130 - 160 mmol/l und der Kaliumionen-Gehalt ist im allgemeinen nicht höher als 2 mmol/l. Der pH-Wert wird auf 6, 9 ± 0,5 eingestellt. Die Citratkonzentration beträgt im allgemeinen nicht mehr als 20 mmol/l und kann insgesamt fehlen.
Stabilisatoren können verwendet werden, beispielsweise entweder 0,16 Millimol Natriumacetyltryptophanat oder 0,08 Millimol Natriumacetyltryptophanat und 0,08 Millimol Natriumcaprylat pro Gramm HSA(1-n)plus.

Literaturhinweis

J.D. Beggs (1978), Nature, 275, 104-109.
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D.Sleep, G.P.Belfield und A.R.Goodey (1988), Yeast 4, S168.

Claims

1. Polypeptid, umfassend den N-terminalen Teil von reifem Humanserumalbumin bis zu einem Aminosäurerest n, worin n = 369 bis 419, oder einer Variante desselben, wobei die Varianten mindestens 80% Homologie mit diesem N- terminalen Teil aufweisen und bei Verabreichung in den Blutstrom eines Säugetiers einen geeigneten Grad an onkotischem Potential besitzen, ausschließlich des N- terminalen Teils mit n = 387.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe HSA (1-373), HSA (1-388), HSA (1-389), HSA (1-390) und HSA (1-407) sowie Varianten desselben, die den genannten beiden Kriterien genügen.

3. Arzneimittel mit einem Polypeptid, umfassend den N-terminalen Teil von reifem Humanserumalbumin bis zu einem Aminosäurerest n, wobei n = 369 bis 419, oder einer Variante desselben, wobei die Varianten mindestens 80% Homologie mit dem N-terminalen Teil aufweisen und bei Verabreichung in den Blutstrom eines Säugetiers einen geeigneten Grad an onkotischem Potential aufweisen.

4. Mittel nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid aus HSA (1-387) oder einer genannten Variante desselben besteht.

5. Nukleotidsequenz mit Codierung für ein Polypeptid, umfassend den N-terminalen Teil von reifem Humanserumalbumin bis zu einem Aminosäurerest n, worin n = 369 bis 419, oder einer Polypeptidvariante desselben, die mindestens 80% Homologie mit dem N-terminalen Teil aufweist und bei Verabreichung in den Blutstrom eines Säugetiers einen geeigneten Grad an onkotischem Potential besitzt, wobei die Nukleotidsequenz nicht an seinem 3'- Ende mit einer weiteren Sequenz mit Codierung für den C-terminalen Teil von reifem Humanserumalbumin von einem Aminosäurerest n+1 bis 585 verknüpft ist.

6. Nukleotidsequenz nach Anspruch 5, worin n = 387.

7. Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 oder 6, die an ihrem 5'-Ende mit einer weiteren Nukleotidsequenz mit Codierung für ein Peptid entsprechend der Pro-, Prä- oder Prä-Pro-Stellung von HSA, einem Methioninrest oder einer weiteren Leader-Sequenz verknüpft ist.

8. Expressionsvektor mit der Eignung zur Transformation eines und Expression in einem ausgewählten Wirt(s), umfassend eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei der es sich um eine DNS-Sequenz handelt.

9. Mit einem Vektor nach Anspruch 8 transformierter Wirtorganismus.

10. Wirtorganismus nach Anspruch 9, nämlich Saccharomyces cerevisiae.

11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend die Züchtung eines Wirtmikroorganismuses nach Anspruch 9 oder 10 unter geeigneten Bedingungen, wobei das Polypeptid durch die Nukleotidsequenz codiert wird.

12. Labormedium für das Wachstum von Mikroorganismen, umfassend ein Polypeptid mit dem N-terminalen Teil von reifem Humanserumalbumin bis zu einem Aminosäurerest n, worin n = 369 bis 419, oder eine Variante desselben, wobei die Varianten mindestens 80% Homologie mit dem N- terminalen Teil aufweisen und bei Verabreichung in den Blutstrom eines Säugetiers einen geeigneten Grad an onkotischem Potential besitzen.

13. Medium nach Anspruch 12, worin n = 387.