ES2947566T3 - Sustratos de Mtg para la conjugación covalente de compuestos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un sustrato para transglutaminasa que comprende un péptido que tiene de 3 a 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos X_4X_3X_2 X -1QX+1X+2 X+3X+4, unido a una primera molécula. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sustratos de Mtg para la conjugación covalente de compuestos
Sector de la técnica:
La presente invención se refiere a péptidos que reaccionan selectiva y específicamente como donantes de glutamina con transglutaminasa.
La presente invención también se refiere a sustratos para transglutaminasa que comprenden estos péptidos unidos a una primera molécula y usos de los mismos.
Estado de la técnica:
La formación de enlaces covalentes entre proteínas y diversas moléculas pequeñas funcionales (por ejemplo, fluoróforo, ligandos), así como macromoléculas (por ejemplo, proteínas, polímeros, ácidos nucleicos) ha representado una base molecular importante para crear conjugados de proteínas empleados en biotecnología y aplicaciones biomédicas. Dicho enlace entre una proteína y una molécula funcional no debe afectar la función biológica de la proteína.
Para minimizar el efecto del enlace de una molécula funcional sobre la función biológica de proteínas diana, las rutas enzimáticas parecen ser una opción interesante.
Aprovechar las propiedades catalíticas de las enzimas es un campo de investigación que sigue recibiendo una atención cada vez mayor. Las transglutaminasas (TGasas) siempre han despertado un gran interés tanto en la investigación científica como en la aplicada debido a su capacidad para reticular sustratos proteicos con alta regio y estereoselectividad.
Las TGasas (EC 2.3.2.13) son una familia de enzimas ampliamente distribuida que catalizan la reticulación postraduccional de proteínas a través de la formación de enlaces isopeptídicos relativamente resistentes a proteasas. La etapa clave para la catálisis implica la interacción de un grupo E-carboxamida de un resto de glutamina (Gin) de un sustrato polipeptídico con el sitio activo de la TGasa, formando un resto de tioacilo reactivo al nivel de un resto de Cys y reaccionando después con un donante de amino, lo que da lugar a un nuevo enlace amida isopeptídico (FOLK JE, COLE PW. J Biol Chem. julio de 1965;240:2951-60).
El primer uso biocatalítico de las TGasas fue en la industria alimentaria (Zhu, Y.; Rinzema, A.; Tramper, J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, 44, 277-282). Desde entonces, las nuevas aplicaciones biotecnológicas han ampliado el uso de TGasas fuera del campo de los alimentos.
Kmiya et al. han informado la utilidad potencial de la TGasa en el etiquetado de proteínas covalentes (New fluorescent substrates of microbial transglutaminase and its application to peptide tag-directed covalent protein labelling, Kamiya N, Abe H., Methods Mol Biol. 2011;751:81-94 y Enzymatic single-step preparation of multifunctional proteins, Abe H, Goto M, Kamiya N., Chem Commun (Camb). 14 de octubre de 2010;46(38):7160-2).
En el documento WO2013/092983, también se divulgan métodos de funcionalización de inmunoglobulinas en particular con fármacos que utilizan TGasa. Este enfoque, describe el método para obtener un nuevo sitio mediante mutagénesis dirigida para generar un donante Q dentro de la cadena pesada del anticuerpo. Este método empírico necesita probar un gran número de mutantes, ya que las reglas que gobiernan la selección de restos de glutamina por parte de las TGasas para su modificación aún se desconocen en gran medida. En consecuencia, usar este método para crear nuevos anticuerpos que porten un donante Q requiere mucho tiempo y es rentable.
El documento WO2012/059882 divulga además conjugados polipeptídicos modificados por ingeniería genética específicos y métodos para preparar tales conjugados usando transglutaminasas.
El documento US 2013/230543 divulga conjugados polipeptídicos modificadas por ingeniería genética que comprenden etiquetas que contienen glutamina donante de acilo y agentes donantes de amina.
Kamiya Noriho et al. ("Site Specific cross-linking of functional proteins by tranglutamination"; ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, vol. 33, n.° 4, 10 de septiembre de 2003) divulga la aplicación de transglutaminasa microbiana (MTG, por sus siglas en inglés) para la preparación in vitro de una proteína de fusión bifuncional a partir de proteínas recombinantes obtenidas por separado.
Lin Chi-Wang et al: "Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol.128, n.°14, abril de 2006) informa sobre la unión catalizada por transglutaminasa (TGasa) de sondas funcionalizadas con cadaverina a proteínas de superficie celular recombinantes fusionadas con etiqueta Q utilizando los sustratos peptídicos con etiqueta Q PNPQLPF, PKPQQFM o GQQQLG.
El documento US 2008/234183 divulga un método para predecir el diseño, detección y/o verificación de un péptido de penetración celular que imita la actividad efectora celular y/o inhibe la actividad efectora celular.
Una dificultad al usar TGasa para el enlace covalente entre una proteína y una molécula funcional es diseñar un primer sustrato funcional que pueda usarse como conector general con una buena tasa de incorporación sin modificar la función o actividad de dicho primer sustrato.
Asimismo, una vez que la molécula funcional se ha unido a la proteína, tanto la primera proteína como la segunda molécula deben mantener su función o actividad.
Objeto de la invención:
La invención se define en las reivindicaciones.
Sumario de la divulgación:
El presente solicitante ha descubierto péptidos que, cuando se generan o se unen a una primera molécula, son un sustrato particularmente eficiente y específico para transglutaminasa.
Los sustratos para transglutaminasa que comprenden los péptidos descubiertos por el presente solicitante unidos a una primera molécula presentan una alta tasa de enlace covalente entre este sustrato y una segunda molécula.
Se ha demostrado que la tasa de enlace covalente es alta para una gran variedad de primeras moléculas, incluso para moléculas que se sabe que son difíciles de unir de manera eficaz con una segunda molécula (por ejemplo, inmunoglobulina, molécula inmovilizada en un soporte sólido).
Además de la capacidad de unir fácilmente una primera y una segunda molécula, el uso de dichos péptidos para la transglutaminación permite que tanto la primera como la segunda molécula mantengan sus propiedades funcionales originales.
También se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un sustrato para transglutaminasa que comprende:
- un péptido que tiene de 3 a 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos X-4X-3X-2 X 1QX+1X+2X+3X+4 , en donde:
- X-4 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido con carga negativa o un aminoácido no polar,
- X-3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido aromático, hidrófobo no polar y un no polar,
- X -2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos con carga negativa o no polares,
- X -1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, un aminoácido no polar y un aminoácido hidrófobo no polar,
- Q es glutamina,
- X -+1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, uno no polar hidrófobo y un aminoácido con carga negativa,
- X -+2 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido polar neutro, uno aromático, uno hidrófobo no polar y un aminoácido con carga positiva,
- X+3 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido no polar y
- X+4 está ausente o es cualquier aminoácido,
en donde dicho péptido está unido a una primera molécula.
En una realización específica, los sustratos según la divulgación, que no forman parte de la presente invención, pueden comprender el péptido anterior, en donde, bien,
(i) X-1 es serina y X+1 es histidina, tirosina, alanina o ácido glutámico;
(ii) X -1 es alanina o valina, y X+1 es lisina, arginina o alanina, en donde, cuando X -1 es alanina, X+1 es lisina o arginina; o,
(iii) X -1 es isoleucina y X+1 es arginina, lisina o ácido glutámico.
La presente divulgación también se refiere a un compuesto conjugado que comprende el sustrato para la transglutaminasa de la divulgación unido covalentemente a una segunda molécula que comprende al menos una alquilamina o una lisina.
La presente divulgación también se refiere al compuesto conjugado de la divulgación, en donde la primera molécula es un anticuerpo y la segunda molécula es un fármaco, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.
La presente divulgación también se refiere a un método para unir covalentemente el sustrato para la transglutaminasa de la divulgación a una segunda molécula que comprende al menos un resto de alquilamina o lisina que comprende la etapa de hacer reaccionar el sustrato para la transglutaminasa con la segunda molécula en presencia de una transglutaminasa.
La presente divulgación, que no forma parte de la presente invención, también se refiere a un péptido que tiene de 3 a 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos X-4X-3X -2 X-1QX+1X+2X+3X+4 , en donde:
- X-4 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido con carga negativa o un aminoácido no polar,
- X-3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido aromático, hidrófobo no polar y un no polar,
- X -2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos con carga negativa o no polares,
- X -1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, un aminoácido no polar y un aminoácido hidrófobo no polar,
- Q es glutamina,
- X -+1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, uno no polar hidrófobo y un aminoácido con carga negativa,
- X+z está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido polar neutro, uno aromático, uno hidrófobo no polar y uno con carga positiva,
- X+3 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido no polar y
- X+4 está ausente o es cualquier aminoácido.
La presente divulgación también se refiere al uso del péptido de la divulgación como conector para el acoplamiento covalente de moléculas.
La presente divulgación también se refiere a un método para unir covalentemente una primera molécula a una segunda molécula que comprende al menos una alquilamina o una lisina que comprende las etapas de:
- unir la primera molécula a un péptido de la divulgación para obtener un sustrato para transglutaminasa,
- hacer reaccionar el sustrato para transglutaminasa con la segunda molécula en presencia de una transglutaminasa, preferentemente transglutaminasa bacteriana, por ejemplo transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense (mTG, por sus siglas en inglés).
La presente divulgación también se refiere a una proteína de fusión, que comprende un péptido de la descripción fusionado con un polipéptido.
La presente divulgación también se refiere a un kit para marcar una molécula que comprende al menos una lisina o una alquilamina que comprende el sustrato de la divulgación en donde la primera molécula es un grupo indicador.
La presente divulgación también se refiere a un método para marcar una molécula que comprende al menos una alquilamina o una lisina que comprende la etapa de hacer reaccionar el sustrato de la divulgación en donde la primera molécula es un grupo indicador con la molécula para marcar en presencia de una transglutaminasa.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Según la presente divulgación, "anticuerpo" o "inmunoglobulina" tienen el mismo significado y se usarán igualmente en la presente divulgación. El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen una porción de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. De esta manera, el término anticuerpo abarca no solo moléculas de anticuerpo completas, sino también fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos o porciones de unión a antígeno, así como variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En los anticuerpos convencionales, las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera mediante un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadena pesada que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados conjuntamente CH). Las regiones variables de las cadenas tanto ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de la unión al antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren importantes propiedades biológicas tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión al complemento y unión a los receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte aminoterminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están compuestos por restos que provienen principalmente de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o hipervariables. Ocasionalmente, los restos de las regiones marco (FR) o no hipervariables influyen en la estructura general del dominio y, por tanto, en el sitio de combinación. Las regiones determinantes de la complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que definen juntas la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina natural. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Una porción de unión a antígeno, por consiguiente, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR procedente de cada región V de cadena pesada y ligera. Las regiones marco (Fr) se refieren a secuencias de aminoácidos intercaladas entre las CDR.
Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, o cualquier proteína de fusión que comprenda dicha porción de unión a antígeno.
Tal como se utiliza en el presente documento, los restos de anticuerpos se numeran según el esquema de Kabat.
La expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el que una porción sustancial de la molécula del anticuerpo se asemeja, en la secuencia o estructura de aminoácidos, a la de un anticuerpo procedente de origen humano.
Un "anticuerpo humano" puede considerarse más adecuado en los casos en los que es deseable reducir la inmunogenicidad del anticuerpo para su administración a seres humanos con fines terapéuticos.
El término "Fab" indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado aminoterminal de la cadena H y toda la cadena L, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, se unen entre sí a través de un enlace disulfuro.
El término "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región de bisagra, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, pepsina.
El término "Fab'" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región de bisagra del F(ab')2.
Un polipéptido Fv monocatenario ("scFv") es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que se expresa habitualmente a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL unidos por un conector que codifica un péptido. "dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFv monovalentes o pueden generarse por acoplamiento de scFv monovalentes mediante un conector peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un conector que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión a antígeno.
Por "purificado" y "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un polipéptido (es decir, un anticuerpo según la divulgación) o a una secuencia de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado", como se usa en el presente documento, significa que hay presentes preferentemente al menos un 75 % en peso, más preferentemente al menos un 85 % en peso, aún más preferentemente al menos un 95 % en peso, y lo más preferentemente al menos un 98 % en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo. Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente exenta de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afecten de forma perjudicial a las características básicas de la composición.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende como una cantidad mínima de agente activo que es necesaria para transmitir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" para un mamífero es una cantidad tal que induce, mitiga o causa de otro modo una mejora en los síntomas patológicos, progresión de la enfermedad o condiciones fisiológicas asociadas con o resistencia a sucumbir a un trastorno.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferentemente, un sujeto según la divulgación es un ser humano.
"Tratamiento o tratar" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (aminorar) la patología o el trastorno en cuestión. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que ha de prevenirse el trastorno. Por ende, el sujeto a tratar en el presente documento puede haberse diagnosticado como que tiene la enfermedad o puede estar predispuesto o ser susceptible a la enfermedad.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilamina" se refiere a un grupo de fórmula -NHR" (monoalquilamina) donde R" es un alquilo o un grupo de fórmula -NR"R" (dialquilamina), donde cada R" es independientemente un alquilo.
Como se usa en el presente documento, el término "aptámero" se refiere a oligo-ADN, oligo-ARN u oligo-ADN/ARN monocatenario o bicatenario o cualquier análogo del mismo que pueda unirse específicamente a una molécula diana, tal como una proteína o un péptido, más habitualmente a un péptido. De manera ventajosa, los aptámeros pueden mostrar una especificidad y una afinidad bastante altas (p. ej., K[A] en el orden de 1 x 109 M-1) para sus dianas. Se describe la producción de aptámeros, entre otros, en el documento US 5.270.163; Ellington & Szostak 1990 (Nature 346: 818-822); Tuerk & Gold 1990 (Science 249: 505-510); o "The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications", por Klussmann, ed., Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592.
Péptidos de la divulgación
La presente divulgación, que no forma parte de la presente invención, se refiere a un péptido que tiene de 3 a 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos X-4X-3X-2 X-1QX+1X+2X+3X+4 , en donde:
- X-4 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido con carga negativa o un aminoácido no polar,
- X-3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido aromático, hidrófobo no polar y un no polar,
- X -2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos con carga negativa o no polares,
- X -1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, un aminoácido no polar y un aminoácido hidrófobo no polar,
- Q es glutamina,
- X -+1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, uno no polar hidrófobo y un aminoácido con carga negativa,
- X+2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido polar neutro, uno aromático, uno hidrófobo no polar y uno con carga positiva,
- X+3 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido no polar y
- X+4 está ausente o es cualquier aminoácido.
Normalmente, el péptido de la divulgación puede tener una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos.
Preferentemente, el péptido puede tener 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos con carga negativa" se refiere preferentemente a los siguientes aminoácidos: Ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D).
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos aromáticos" se refiere preferentemente a los siguientes aminoácidos: Tirosina (Y), triptófano (W) y fenilalanina (F).
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos no polares" se refiere preferentemente a los siguientes aminoácidos: Isoleucina (I), prolina (P) y cisteína (C).
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos con carga positiva" se refiere preferentemente a los siguientes aminoácidos: Histidina (H), Lisina (K).
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos hidrófobos no polares" se refiere preferentemente a los siguientes aminoácidos: Leucina (L), Alanina (A) y Valina (V).
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos neutros polares" se refiere preferentemente a los siguientes aminoácidos: Serina (S) y glutamina (Q).
En una realización específica, que no forma parte de la presente invención, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos
X-4X-3X-2--1QX+1X+2X+3X+4 , en donde:
- X-4 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un ácido aspártico o una prolina,
- X-3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en tirosina, triptófano, fenilalanina, prolina, valina y leucina,
- X -2 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido glutámico, prolina, tirosina, triptófano, lisina, cisteína, leucina, histidina y serina,
- X -1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, histidina, isoleucina, valina y alanina, - Q es glutamina,
- X+1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina, lisina, histidina, ácido glutámico, serina y alanina,
- X+2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en histidina, tirosina, lisina, glutamina, leucina y serina,
- X+3 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente prolina, y
- X+4 está ausente o es cualquier aminoácido.
En una realización específica, X-3 es tirosina o triptófano.
En otra realización específica, X-2 es ácido glutámico o prolina.
En una realización preferida, X -1 es una serina, una alanina, una valina, una histidina o una isoleucina. En otra realización específica, X -1 es una serina, una alanina o una isoleucina. En otra realización específica, X-1 es isoleucina, alanina o valina.
En una realización preferida, X+1 es una histidina, un ácido glutámico o una serina. Más preferentemente X+1 es una serina. En otra realización preferida, X+1 es una lisina o una arginina.
En realizaciones preferidas relacionadas, X+1 es una lisina o una arginina, y X -1 es una alanina o una isoleucina.
En una realización preferida, X-3 es tirosina o triptófano, X-2 es ácido glutámico o prolina, X-1 es isoleucina, alanina o valina, X+1 es una lisina o una arginina.
En otras realizaciones preferidas, que no forman parte de la presente invención,
(i) X-1 es serina y X+1 es histidina, tirosina, alanina o ácido glutámico;
(ii) X -1 es alanina o valina, y X+1 es lisina, arginina o alanina, en donde, cuando X -1 es alanina, X+1 es lisina o arginina; o,
(iii) X -1 es isoleucina y X+1 es arginina, lisina o ácido glutámico.
En la presente invención el péptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
Las secuencias de aminoácidos se proporcionan en la tabla 1 a continuación. Solamente las SEQ ID NO: 29-33 forman parte de la presente invención.
Tabla 1
Figure imgf000007_0001
continuación
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En la presente invención, el péptido tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
La presente divulgación también se refiere al uso del péptido de la divulgación como conector para el acoplamiento covalente de moléculas.
La presente divulgación también se refiere al uso del péptido de la divulgación como conector para el acoplamiento covalente de proteína o anticuerpo a una segunda molécula, en donde la segunda molécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un fármaco, un ácido nucleico, un elemento radiactivo, un grupo indicador, una molécula estabilizadora y una molécula inmovilizada sobre un soporte sólido. La presente divulgación también se refiere a un método para unir covalentemente una primera molécula a una segunda molécula que comprende al menos un resto de alquilamina o una lisina que comprende las etapas de:
- unir la primera molécula a un péptido de la divulgación para obtener un sustrato para transglutaminasa, - hacer reaccionar el sustrato para transglutaminasa con la segunda molécula en presencia de una transglutaminasa.
Sustrato donante de glutamina para transglutaminasa de la divulgación
La presente divulgación, que no forma parte de la presente invención, se refiere a un sustrato para transglutaminasa, más específicamente, sustratos donantes de Q, que comprenden:
- un péptido que tiene de 3 a 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos X-4X-3X-2 X 1QX+1X+2X+3X+4 , en donde:
- X-4 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido con carga negativa o un aminoácido no polar,
- X-3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido aromático, hidrófobo no polar y un no polar,
- X -2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en una aminoácido con carga negativa o uno no polar,
- X -1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, un aminoácido no polar y un aminoácido hidrófobo no polar,
- Q es glutamina,
- X -+1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido neutro polar, uno con carga positiva, uno no polar hidrófobo y un aminoácido con carga negativa,
- X+2 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido polar neutro, uno aromático, uno hidrófobo no polar y uno con carga positiva,
- X+3 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un aminoácido no polar y
- X+4 está ausente o es cualquier aminoácido.
unido a: -una primera molécula.
La transglutaminasa (TGasa) puede ser, por ejemplo, una transglutaminasa tisular (TG2) (Gentile V., Saydak M., Chiocca E.A., Akande O., Birckbichler P.J., Lee K.N., Stein J.P., Davies P.J.A.J. Biol. Chem. 266:478-483 (1991) o una transglutaminasa microbiana (mTG) (Ando H, Adachi M, Umeda K, Matsuura A, Nonaka M, Uchio R, Tanaka H, Motoki M:. Agric Biol Chem 1989;53:2613-2617).
Preferentemente, la transglutaminasa es una transglutaminasa microbiana, por ejemplo transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense.
Normalmente, el péptido de la divulgación para su uso en los sustratos donantes Q, tiene una longitud de 3, 4, 56, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos.
Preferentemente, el péptido para su uso en los sustratos donantes de Q tiene 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. En una realización preferida, que no forma parte de la presente invención, el péptido para su uso en los sustratos donantes de Q comprende la secuencia de aminoácidos
X-4X-3X-2--1QX+1X+2X+3X+4 , en donde:
- X-4 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente un ácido aspártico o una prolina,
- X-3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, prolina, valina, tirosina, triptófano y leucina,
- X -2 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido glutámico, prolina, tirosina, triptófano, lisina, cisteína, leucina, histidina y serina,
- X -1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, histidina, isoleucina, valina y alanina, - Q es glutamina,
- X+1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, serina y alanina,
- X+2 está ausente o es cualquier aminoácido, y preferentemente seleccionado del grupo que consiste en histidina, tirosina, lisina, glutamina, leucina y serina,
- X+3 está ausente o es cualquier aminoácido, preferentemente prolina, y
- X+4 está ausente o es cualquier aminoácido.
En una realización específica, X-3 es tirosina o triptófano.
En otra realización específica, X-2 es ácido glutámico o prolina.
En una realización preferida, X -1 es una serina, una alanina, una valina, una histidina o una isoleucina. En otra realización específica, X -1 es una serina, una alanina o una isoleucina. En otra realización específica, X-1 es isoleucina, alanina o valina.
En una realización preferida, X+1 es una histidina, un ácido glutámico o una serina. Más preferentemente X+1 es una serina. En otra realización preferida, X+1 es una lisina o una arginina.
En realizaciones preferidas relacionadas, X+1 es una lisina o una arginina, y X -1 es una alanina o una isoleucina. En una realización preferida, X-3 es tirosina o triptófano, X-2 es ácido glutámico o prolina, X-1 es isoleucina, alanina o valina, X+1 es una lisina o una arginina.
En una realización preferida, que no forma parte de la presente invención, bien
(i) X-1 es serina y X+1 es histidina, tirosina, alanina o ácido glutámico;
(ii) X -1 es alanina o valina, y X+1 es lisina, arginina o alanina, en donde, cuando X -1 es alanina, X+1 es lisina o arginina; o,
(iii) X -1 es isoleucina y X+1 es arginina, lisina o ácido glutámico.
En la presente invención, el péptido para uso en sustrato donante de Q, comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, s Eq ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
En una realización preferida, la primera molécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un fármaco, un ácido nucleico, un elemento radiactivo, un grupo indicador, una molécula estabilizadora, un aptámero, una ribozima, un anticuerpo de dominio, un nanocuerpo, un armazón no inmunoglobulínico, una partícula vector y una molécula inmovilizada sobre un soporte sólido.
Los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, ADN, ARN o ARNip.
Las partículas vector pueden ser, por ejemplo, nanopartículas, vesículas, partículas de vectores virales o partículas similares a virus.
Los elementos radiactivos pueden ser, por ejemplo, radioyoduro o radioisótopos.
Los grupos de indicadores pueden ser, por ejemplo, compuestos radiactivos marcados, compuestos fluorescentes tal como isotiocianato (por ejemplo, FITC o TRITC), ésteres de succinimidilo (por ejemplo, NHS-fluoresceína), fluoróforos activados con maleimida (por ejemplo, fluoresceína-5-maleimida), una enzima tal como peroxidasa, una etiqueta de péptido de afinidad o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopía por NMR o ESR.
Las moléculas estabilizadoras pueden ser, por ejemplo, polímeros tales como PEG.
Los armazones no inmunoglobulínicos pueden ser, por ejemplo, adnectinas, anquirinas, lipocalinas, afilinas, miméticos de epítopos de proteínas y similares.
El fármaco puede ser péptidos y polipéptidos, entidades químicas relativamente grandes, entidades químicas cargadas negativamente y/o entidades químicas hidrófobas.
El fármaco es preferentemente un fármaco citotóxico. Los fármacos citotóxicos pueden ser, por ejemplo, duocarmicinas, maitansanoides, agentes alquilantes, taxanos, MMAE, MMAF.
En una realización más preferida, la primera molécula es un anticuerpo.
El péptido para su uso en sustrato donante de Q, está unido a la primera molécula.
Como se usa en el presente documento, el término "unido" se refiere a la unión que puede ser covalente, por ejemplo, por acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, etc.
Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, enlaces éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, imida, carbono-azufre, enlaces carbono-fósforo, y similares. El término también incluye el encierro, o el encierro parcial, de una sustancia. El término "unido" es más amplio e incluye términos como "acoplado", "fusionado", "encerrado", "empaquetado", "pseudotipado", "expresado en una bicapa lipídica" y "fijado".
En una realización preferida, el péptido está unido covalentemente a la primera molécula.
En una realización preferida, la primera molécula es un polipéptido y el péptido se fusiona con la primera molécula. Como se usa en el presente documento, el término "fusión" o "fusionado" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena polipeptídica mediante la combinación en marco de sus secuencias de nucleótidos codificantes. Debe señalarse que más de una secuencia de nucleótidos puede codificar una secuencia de aminoácidos determinada debido a la degeneración del código genético. El término "fusión" abarca explícitamente las fusiones internas, (es decir, inserción de secuencias de diferente origen dentro de una cadena polipeptídica, además de la fusión a uno de sus extremos).
Por consiguiente, en una realización, la presente divulgación también se refiere a una proteína de fusión, que comprende el péptido de la descripción fusionado con un polipéptido.
En una realización de la proteína de fusión, el polipéptido es un polipéptido de cadena ligera o pesada de un anticuerpo, o su porción de unión a antígeno, incluyendo, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio VH o VL. En una realización preferida de la proteína de fusión, las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo se fusionan con el péptido de la divulgación, en el extremo carboxiterminal o aminoterminal. En realizaciones específicas relacionadas de la proteína de fusión, las cadenas pesadas y/o ligeras se fusionan en el extremo carboxiterminal con un péptido seleccionado del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
En una realización, la proteína de fusión se conjuga además con una segunda molécula que comprende al menos un resto de alquilamina o una lisina.
La presente divulgación también se refiere a un método para unir covalentemente el sustrato para la transglutaminasa de la divulgación a una segunda molécula que comprende al menos un resto de alquilamina o una lisina que comprende la etapa de hacer reaccionar el sustrato para la transglutaminasa con la segunda molécula en presencia de una transglutaminasa.
La presente divulgación también se refiere a un kit para marcar una molécula que comprende al menos un resto de lisina o alquilamina que comprende el sustrato para la transglutaminasa de la divulgación en donde la primera molécula es un grupo indicador.
La presente divulgación también se refiere a un método para marcar una molécula que comprende al menos un resto de lisina o de alquilamina que comprende la etapa de hacer reaccionar el sustrato para la transglutaminasa de la divulgación en donde la primera molécula es un grupo indicador con la molécula para marcar en presencia de una transglutaminasa.
Compuesto conjugado de la divulgación
La presente divulgación también se refiere a un compuesto conjugado que comprende el sustrato para la transglutaminasa de la divulgación unido covalentemente a una segunda molécula que comprende al menos un resto de lisina o alquilamina.
Dichos compuestos conjugados son fáciles de producir mediante una reacción mediada por TG. Adicionalmente, la primera y la segunda moléculas mantienen sus propiedades funcionales específicas. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo que comprenda el péptido fusionado con su fragmento Fc, el anticuerpo conjugado mantiene las propiedades de unión al antígeno.
En una realización preferida, la segunda molécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un fármaco, un ácido nucleico, un elemento radiactivo, un grupo indicador, una molécula estabilizadora, un aptámero, una ribozima, un anticuerpo de dominio, un nanocuerpo, un armazón no inmunoglobulínico, una partícula vector y una molécula inmovilizada sobre un soporte sólido.
Las partículas vector pueden ser, por ejemplo, nanopartículas, vesículas o partículas de vectores virales, partículas similares a virus.
Los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, ADN, ARN o ARNip. Los elementos radiactivos pueden ser, por ejemplo, radioyoduro o radioisótopos. Los grupos de indicadores pueden ser, por ejemplo, compuestos radiactivos marcados, compuestos fluorescentes tal como isotiocianato (por ejemplo, FITC o TRITC), ésteres de succinimidilo (por ejemplo, NHS-fluoresceína), fluoróforos activados con maleimida (por ejemplo, fluoresceína-5-maleimida), una enzima tal como peroxidasa, una etiqueta de péptido de afinidad o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopía por NMR o ESR.
Las moléculas estabilizadoras pueden ser, por ejemplo, polímeros tales como PEG.
Los armazones no inmunoglobulínicos pueden ser, por ejemplo, adnectinas, anquirinas, lipocalinas, afilinas, miméticos de epítopos de proteínas y similares.
El fármaco puede ser péptidos y polipéptidos, entidades químicas relativamente grandes, entidades químicas cargadas negativamente y/o entidades químicas hidrófobas.
El fármaco es preferentemente un fármaco citotóxico.
Los fármacos citotóxicos pueden ser, por ejemplo, duocarmicinas, maitansanoides, agentes alquilantes, taxanos, monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF).
En una realización preferida, la segunda molécula es un fármaco, preferentemente un fármaco citotóxico.
En una realización más preferida, la primera molécula es un anticuerpo y la segunda molécula es un fármaco, preferentemente un fármaco citotóxico.
Los anticuerpos conjugados con agentes citotóxicos son compuestos terapéuticos prometedores. Sin embargo, son particularmente difíciles de producir. El método de divulgación permite producirlos fácilmente.
La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto conjugado de la divulgación y un transportador farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación también se refiere al compuesto conjugado de la divulgación para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.
La presente divulgación también se refiere a un método para el tratamiento de una afección o trastorno patológico en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz del compuesto conjugado de la divulgación.
La presente divulgación también se refiere al uso del compuesto conjugado de la divulgación para la preparación de un medicamento.
La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente divulgación.
Descripción de las figuras
Las figuras que divulgan péptidos que no se reivindican son figuras de referencia.
La figura 1 muestra la incorporación mediada por mTG de biotina-X-cadaverina (biot-cad) en péptidos acoplados en una placa covabtest.
La figura 2 muestra la incorporación de biotina-cadaverina mediada por TG2 en péptidos acoplados en una placa covabtest.
La figura 3 muestra la medición de la reacción de mTG usando sustratos preferidos y sus correspondientes análogos mutados en el resto Q que estaba reemplazado por N.
La figura 4 muestra el control de la especificidad de la reticulación mediada por mTG de biot-cad en el conjugado BSA-HH12Q11 ((A: BSA (pocilio de control); B, C: BSA-HH12Q11).
Se añadieron inhibidores de péptidos en C: HH12Q11.
La figura 5 muestra la medición de la incorporación de biot-cad en el conjugado IgG-HH12Q11 adsorbido y el control de IgG libre. Las condiciones experimentales se describen en B-1-3, B-I-4 y B-II-2.
La figura 6 muestra el análisis por transferencia western de la incorporación de biot-cad por mTG en IgG libre e IgG conjugada con péptido. La incorporación enzimática del sustrato de amina se incubó 2 horas a temperatura ambiente en tampón Tris pH 8 como se describe en B-II-5. Se indica la posición de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de IgG.
La figura 7 muestra el análisis por transferencia Western del estudio cinético de la incorporación de biot-cad en IgG conjugada con péptido e IgG libre. Se incubó mTG para la reacción catalítica a temperatura ambiente en tampón Tris pH 8 en el tiempo de reacción indicado. Se indica la posición de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de IgG.
La figura 8 es un esquema de la reacción catalizada por una transglutaminasa.
La figura 9 es un esquema de la formación de enlaces covalentes entre un sustrato para transglutaminasa y una segunda molécula.
Figura 10: Incorporación de biotina-x-cadaverina por mTG en (A) RecAb, (B) D1-3 y (C) Her2Ab.25 Los anticuerpos correspondientes sin etiquetar se usaron para el control de la especificidad de la reticulación de mTG
Figura 11: Cinética de incorporación de biotina-x-cadaverina por mTG en anticuerpo D1-3-tag.
Figura 12: Control por ELISA de la inmunorreactividad de anticuerpos recombinantes etiquetados en comparación con sus correspondientes anticuerpos no marcados. (A) anticuerpos antilisozima, (B y C) anticuerpos anti-her2. En A&B se usó anticuerpo anti IgGAM-HRP humano y en C se usó estreptavidina-HRP.
Ejemplos
Los ejemplos que contienen las secuencias actualmente reivindicadas forman parte de la presente invención, solamente.
Material y métodos
A) Materiales y reactivos
La albúmina de suero bovino (ref. A7906), IgG humana (ref. I4506), glutaraldehído (ref. G6257), espermina (sμm) (ref. S2876), borohidruro de sodio (ref. 21, 346-2), Clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDAC)(ref.E 7750), N-hidroxisuccinimida (NHS) (ref. 13,0672), membrana de celulosa para tubos de diálisis, ancho plano de 10 mm (ref.D9277) y Acrilamida/ Bis-acrilamida, solución al 30 % (refA3574), se adquirieron de Sigma Aldrich, Francia. Dutcher, Francia, proporcionó la membrana de nitrocelulosa HybondTM-C Extra Amersham (ref.RPN203E). Las placas de microtitulación de alta unión (Costar ref. 3590) son de Corning Inc, Francia. La transglutaminasa microbiana recombinante (mTG) (ref. opr 0054), transglutaminasa 2 humana recombinante (hTG2) (ref. opr 0027), biotina-X-cadaverina (ref.opr0007), estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (opr 0011), placa de amina Covabtest (ref. opr 0004), TMB-RTU (ref. opr 0052) se proporcionaron por Covalab, Francia. Todos los péptidos utilizados se sintetizaron por Covalab, Francia. La secuencia y la pureza de los péptidos se controlaron por HPLC (Water - Francia) y espectrofotómetro de masas.
Tabla 2: Listado de algunos de los péptidos seleccionados para sustratos preferidos de mTG y TG2. El donante de n n ri r . En l n i r m l z r N
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B) Métodos
B-I - Métodos para la preparación de sustratos conjugados
B-I-1: Preparación de péptidos de acoplamiento covalente a placas de microtitulación de 96 pocillos (péptido Covabtest)
El método de acoplamiento se describió previamente por el solicitante (V. Thomas et al, 2004) y también en la hoja de datos correspondiente de CovAbtest-plate™ que está disponible comercialmente de Covalab (Ref n.° opr0004). Brevemente, en tubos separados una mezcla de solución que contiene 150 μM de cada péptido disuelto en tampón de fosfato 10 mM pH 5, se incubaron SmM EDAC y SmM NHS durante 30 min con agitación suave. El resto NHS-carboxilo carboxiterminal activado resultante de cada péptido (15 nmoles) se usó para conjugarse en cada pocillo de CovAbtest-plate™ previamente desprotonado durante 15 min con 150 μl de bicarbonato de sodio al 0,6 % por pocillo. A continuación, la placa de microtitulación se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavó abundantemente con solución salina tamponada con Tris.
B-I-2: Preparación de péptidos de acoplamiento covalente a BSA (conjugado BSA-péptido)
Se disolvieron 2 mg de cada péptido en 1 ml de agua desionizada y se mezclaron 150 nmoles con 0,5 mg de BSA solubilizados en tampón bicarbonato 50 mM pH 9,5. Después de la agitación, se añadió glutaraldehído a una concentración final de 0,25 % (v/v). Las mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 16 horas con agitación suave. Al final de este tiempo de incubación, se añadió borohidruro de sodio a una concentración final de 10 mg/ml para estabilizar la reticulación entre BSA y los péptidos. Después de 2 horas, cada mezcla de péptido-BSA se dializó por separado en PBS para eliminar cualquier péptido libre.
B-I-3: Preparación de péptidos de acoplamiento covalente a IgG (conjugado IgG-péptido)
Se mezclaron 600 nmoles del péptido HH12Q11 solubilizado en agua desionizada con 60 μmoles de EDAC y 60 μmoles de NHS en tampón fosfato 0,2 M pH 5 para activar el carboxilo alfa del aminoácido carboxiterminal. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente con agitación suave, se añadieron 500μl de la solución peptídica a 0,5 mg de IgG humana diluida a 1 mg/ml en tampón fosfato 0,2 M pH 8,5. Después, la mezcla final se incubó a temperatura ambiente durante 16 horas y con agitación suave. Después, cada solución se dializó por separado en PBS como se describe en M-1.
B-I-4: Preparación de placas de microtitulación recubiertas con conjugados de BSA-péptido y hIgG-péptido
Se usaron placas de microtitulación de 96 pocillos de alta unión (Costar) para inmovilizar conjugados BSA-péptido y péptido-IgG humana preparados como se describe en M-4 y M-5. Para estos experimentos, los conjugados se prepararon a 50 μg/ml en tampón de carbonato de sodio 50 mM pH 9 y se dispensaron 100 μl de cada solución en el número de pocillos necesarios para el experimento. Después de la incubación durante la noche a 4 °C, las placas se lavaron abundantemente con solución salina tamponada con T ris (TBS) y quedaron listas para su uso para determinar la actividad TG.
B-I-5: Preparación de espermina de acoplamiento covalente a placas de microtitulación de 96 pocillos (Covabtest-sμm)
Para producir la placa Covabtest-sμm, se utilizó el procedimiento previamente descrito en Mily et al (2009).
B-II - Métodos para medir las actividades transglutaminasa
B-II-1: Incorporación mediada por transglutaminasa de biotina-X-cadaverina en péptidos acoplados en placas Covabtest (B-I-1).
Para este experimento se utilizaron los mismos procedimientos descritos por V Thomas et al (2004) y también en el kit comercializado por Covalab (opr0033). Brevemente, la transglutaminasa liofilizada se reconstituyó en tampón tris 40 mM pH 8 y se añadieron 50 μl de cada mTG a 200 ng/ml y a 40 ng/ml en los pocillos que contenían 50 μl de biotina-X-cadaverina. La mezcla enzimática se incubó durante 15 min a temperatura ambiente con agitación suave. Después, las placas se lavaron 3 veces con TBS-Tween20 seguido de la adición de 100 μl de estreptavidina marcada con HRP diluida (1/2000 en TBS Tween20, BSA al 0,5 %) en cada pocillo. Después de 30 min a temperatura ambiente y 3 lavados en TBS-Tween20,se añadieron 100μl de sustrato TMB y después de 5 min se detuvo la aparición de color utilizando 100 μl de ácido sulfúrico 0,5 M. Las absorbancias a 450 nm se midieron con un lector de microplacas (Multiskan, Labsystems, Helsinki, Finlandia).
B-II-2: Incorporación mediada por transglutaminasa de biotina-X-cadaverina en placa recubierta con BSA-péptido (B-I-2).
Se utilizó el mismo procedimiento que el descrito en B-II-1
B-II-3: Control de la especificidad de la reacción enzimática de transglutaminasa mediante ensayo de competencia utilizando el conjugado BSA-péptido (B-I-2).
En este experimento, el péptido-1 (TGpan (tabla 2)) se conjugó con BSA según el método descrito en B-I-2 y se usó para recubrir las placas de microtitulación de 96 pocillos como se describe en B-I-4. Después, los péptidos indicados en la tabla 2 (péptidos no biotinilados) se usaron como un supuesto competidor a la concentración de 600 μM en TB S 40 mM pH8. En cada pocillo se añadieron por duplicado los siguientes reactivos: 25 μl de péptidos competidores, 25 μl de mTG a 400ng/ml y 50 μl de biotina-X-cadaverina. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó 3 veces con TBS-Tween20 y se añadieron 100 μl de estreptavidina marcada con HRP siguiendo el procedimiento descrito en los métodos anteriores. Como control negativo se utilizó el péptido YV10 que no contiene ningún donante Glu (Q).
B-II-4: Selección de los sustratos preferidos para mTG
Para la selección del péptido enumerado en la tabla 2 (péptidos biotinilados), se utilizó el ensayo colorimétrico de los presentes inventores para medir la actividad de reticulación de la transglutaminasa 2 (TG2) (Mily et al, 2009) y se comercializaron con la referencia opr0033 en la que se utilizó mTG en lugar de TG2. y se describe en esta experiencia. El principio del método se basa en la actividad de transamidación de mTG, utilizando espermina acoplada covalentemente a placas de poliestireno sustituido con carboxi y péptidos biotinilados. El ensayo consiste en la incorporación del grupo glutamina gamma-carboxamida en la espermina inmovilizada. La cantidad de péptido biotinilado unido a la placa, medida por la actividad de estreptavidina-peroxidasa, es directamente proporcional a la actividad TG. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando el lector de microplacas.
Para comparar la afinidad de mTG con el sustrato preferido, los péptidos se usaron a diferentes concentraciones que oscilan desde 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 y 0 μM. Después se determinaron las Km aparentes para cada péptido y se calcularon por el método de Lineweaver-Burk (1/Absorbancia = f(1/[mTG (μM)]).
B-II-5: Análisis por transferencia Western de la incorporación enzimática de biotina-X-cadaverina en IgG humana por mTG
20 μg de IgG conjugada con péptido (IgG-YV10, IgG-CW9Q3 e IgG-HH12Q11) e IgG libre (control) se mezclaron con 13 nmoles de biotina-X-cadaverina y 0,6 ng de mTG en un volumen final de 150 μl. Las mezclas de reacción se incubaron 2 horas a temperatura ambiente para los experimentos de criterios de valoración y 0, 10, 20 y 60 min para el estudio cinético. Al final de cada ciclo, se transfirieron 20 μl de cada solución a un tubo que contenía 4 μl de tampón de carga de electroforesis (Tris HCl 0,3 M pH 6,8, ditiotreitol 0,6 M, SDS al 12 %, azul de bromofenol al 0,6 % y glicerol al 50 %) y se hirvieron a 90 °C durante 5 min. Se usó electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en condiciones desnaturalizantes para separar la mTG y las diferentes subunidades de la hIgG como se describe por Laemmli et al., 1970. Brevemente, Se cargaron 15 μl (1,3 μg) de cada muestra en gel de poliacrilamida al 10 % y se realizó la migración durante 1h a 100V. Al final de este período, la transferencia de las proteínas del gel SDS-poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa transferencia Western-C Hybond (Amersham Life Science, UK) se realizó durante 1h a 100V utilizando el método de Towbin et al, 1979. Para detectar biotina-X-cadaverina acoplada covalentemente a hIgG, la membrana se incubó durante 1 hora a 37 °C en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía BSA al 0,5 %, a continuación se sondó con estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante diluida a 1/2000 en TBS, Tween-20 al 0,5 %, BSA al 0,5 %. Después de 30 min de incubación a 37 °C, la membrana se lavó 3 veces con TBS, Tween-20 al 0,5 % y 2 veces en PBS. Para detectar la actividad de la peroxidasa, la membrana se incubó durante 2 min en el reactivo quimioluminiscente Covalighte y finalmente se analizó utilizando un generador de imágenes de transferencia Western.
Los resultados de la transferencia Western en este estudio son representativos de múltiples determinaciones.
B-III-1 Anticuerpos etiquetados con péptido Q recombinante
Se produjeron tres anticuerpos recombinantes etiquetados con péptido Q diferentes. El anticuerpo RecAb-Tag es un anticuerpo recombinante humano antiRhD1 (IgG1) Siberil S. Clin Immunol. (2006) 118:170-9; Saurabh K. Gupta, JBC; (2007); 282, 29431-29440 que porta la etiqueta del péptido Q DHQ6Q7 (sEq ID NO: 7) en el extremo carboxilo de la cadena pesada. El anticuerpo D1-3-tag es un anticuerpo (IgG2) antilisozima recombinante humano que porta la etiqueta del péptido Q (SEQ ID NO: 32) en el extremo carboxílico de la cadena pesada. El anticuerpo Her2-tag es un anticuerpo (IgG2) anti-Her2 humano recombinante que porta la etiqueta del péptido Q (SEA ID NO: 32) en el extremo carboxílico de la cadena pesada. Ambos anticuerpos se produjeron según Chapple SD, BMC Biotechnol. 22 de diciembre (2006); 6:49; Martin CD, BMC Biotechnol. 7 de diciembre (2006); 6:46.
B-III-2 Análisis por transferencia Western de la incorporación enzimática de biotina-X-cadaverina en la etiqueta del péptido Q de la IgG recombinante mediante mTG
Se mezclaron 20 μg de IgG recombinante (anticuerpos etiquetados y sin etiquetar) con 13 nmoles de biotina-xcadaverina y 0,6 ng de mTG en un volumen final de 150 μl. Las mezclas de reacción se incubaron 15 min a temperatura ambiente para los experimentos de criterios de valoración y 5, 15, 60 min y durante la noche para el estudio cinético.
Al final de cada ciclo, se transfirieron 20 |jl de cada solución a un tubo que contenía 4 |jl de tampón de carga de electroforesis (Tris HCl 0,3 M pH 6,8, ditiotreitol 0,6 M, SDS al 12 %, azul de bromofenol al 0,6 % y glicerol al 50 %) y se hirvieron a 90 °C durante 5 min. Se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y transferencia Western como se describe en B-II-5.
B-III-3: Control de la inmunorreactividad antilisozima de IgG recombinante por ELISA
Se recubrieron con 1 jg/pocillo de lisozima de huevo de gallina (ref L6876-1G; Sigma-Aldrich; Francia) diluida en NaHCO3/Na2CO3 50 mM, pH 9,5,placas de microtitulación de 96 pocillos (alta unión, Costar). Tras 16 horas de incubación a 4 °C, se añadieron 150 jl/pocillo de una solución de PBS que contenía BSA al 0,5 % para evitar la unión no específica. Esta solución se incubó 30 min a 37 °C y las placas se lavaron dos veces con PBS. Después, se incubaron 100 j l de anticuerpos recombinantes antilisozima D1-3 etiquetado y D1-3 sin etiquetar a 10, 5, 2,5, 1,25 jg/m l durante 1 hora. Se usó IgG humana irrelevante (ihIgG) como control negativo. Después de 3 lavados con TBS tween-20, se incubaron 100 jl/pocillo de anticuerpo anti-IgGAM humana marcado con peroxidasa de rábano picante (PARIS, Francia) diluido a 1/1000 durante 30 min a 37 °C. Después de un abundante lavado con TBS Tween 20, se midió la actividad peroxidasa usando sustrato TMB/H2O2 (Covalab, Francia) como se describe en B-II-I.
B-III-4: Control de la inmunorreactividad de IgG recombinante anti-Her 2 por ELISA
Se recubrieron con 0,1 g/pocillo de proteína ErbB-2/HER2 humana recombinante (Biaffin Gmb, Alemania) diluida en NaHCO3/Na2CO350 mM, pH 9,5, placas de microtitulación de 96 pocillos (alta unión, Costar). Tras 16 horas de incubación a 4 °C, se añadió BSA como se describe en B-III-3. Después, se incubaron durante 1 hora 10, 5, 2,5, 1,25 jg/m l en 100 jl/pocillo de Rec-Her2 y antilisozima AD1-3 etiquetados (como IgG irrelevante etiquetada) tratados o no tratados con mTG/biotina-x-cadaverina. Después de 3 lavados con TBS tween-20, en un experimento se añadió anticuerpo anti-IgGAM humana marcado con peroxidasa de rábano picante para detectar la presencia de los anticuerpos primarios y en otro experimento se añadió estreptavidina-HRp (1/2000 en TBS-Tween20) para detectar biotina-x cadaverina incorporada por mTG. Después, se midieron las actividades de HRP se midieron como se describe en B-II-1
Resultados^
En todos los experimentos, los presentes inventores utilizaron mTG (transglutaminasa microbiana/bacteriana) como enzima diana y los péptidos GS12Q7 y su derivado biotinilado bGS12Q7 descritos por Sato et al (2001) como sustrato patrón para comparar la reactividad y la especificidad de los nuevos sustratos peptídicos. También se usó TG2 (transglutaminasa tisular) cuando era apropiado para comparar la reactividad enzimática con mTG y también para controlar la especificidad de los sustratos peptídicos.
R-1: Selección de sustratos de mTG preferidos según el método descrito en B-II-1.
Para seleccionar la biblioteca de péptidos (Covalab) e identificar los supuestos nuevos sustratos de mTG, se utilizó Covabtest-péptido (descrito en B-I-1) en el que los péptidos se acoplaron covalentemente en las placas y el sustrato de amina biotina-cadaverina (biot-cad ) estaba libre en solución. En este experimento se conjugaron covalentemente 15 nmoles de cada péptido (tabla 2) a placa de microtitulación y se determinó la incorporación de biot-cad (0,1 mg/ml) catalizada por mTG (10 ng/pocillo) siguiendo el experimento descrito en B-II -1. Entre todos los péptidos analizados, solo algunos péptidos fueron reconocidos por mTG como donante de Gln (Q) para incorporar biot-cad, como se muestra en la figura 1. La actividad enzimática fue diferente entre los sustratos peptídicos. Los péptidos FE5Q4, HH12Q11 y DH6Q7 se descubrió que eran buenos sustratos para mTG con mejor reactividad de los péptidos FE5Q4 y HH12Q11. Cuando Q se reemplazó por N (péptido HH12N11) no se observó reactividad de la mTG, lo que confirma la especificidad de la enzima por el donante de Gln. Por otra parte, si la reactividad de los 4 péptidos (HH12Q11, DH6Q7, HG14Q11 y WG10Q7) se compara, se puede observar que la reactividad de la Gln depende de su posición en la secuencia peptídica. En los péptidos más reactivos, Q se encuentra en el extremo C. Los péptidos GS12Q7 y TGpan conocidos por ser buenos sustratos para las transglutaminasas mostraron una baja reactividad a mTG en comparación con los otros péptidos. YV10 es un péptido de control negativo sin Q en su secuencia. Los otros péptidos enumerados en la tabla 1 no mostraron ninguna reactividad con mTG.
R-2: Selección de sustratos de TG2 preferidos según el método descrito en B-II-1.
En un segundo experimento, se analizaron los mismos péptidos descritos anteriormente utilizando la enzima TG2 en las mismas condiciones que para mTG. Los resultados presentados en la figura 2 muestran claramente que TGpan es un buen sustrato para TG2, lo que confirma su especificidad para esta enzima. HH12Q11 muestra menos reactividad con TG2 que mTG. En esta condición experimental, ninguno de los otros péptidos reacciona con la enzima y no puede usarse como sustrato para TG2. Estos resultados indican que la posición del donante de glutamina y el aminoácido que rodea a la glutamina son importantes para la especificidad de las enzimas.
R-3: Determinación de la afinidad de los péptidos seleccionados
La tabla 3 a continuación divulga la determinación de la Km aparente de los sustratos peptídicos de mTG ((b) péptido etiquetado con biotina, (nr) péptido no reconocido por la enzima). El donante de Q está en negrita y subrayado. En algunos péptidos Q se reemplazó por N
Tabla 3
Figure imgf000016_0001
En los experimentos anteriores, se demostró que algunos de los péptidos resultaron ser buenos sustratos de mTG. En este estudio, los presentes inventores han determinado la secuencia óptima de los péptidos que contienen el resto de Gln que no se sabe que sean sustrato de mTG. Con ese fin, se produjeron varios péptidos en los que se añadió Q en diferentes posiciones de los péptidos y variaron los aminoácidos que rodeaban al donante de Gln (véase la tabla 1).
En este experimento, se conjugó espermina en la placa como se describe en B-II-4. Los péptidos biotinilados descritos en la tabla 3 se incubaron con mTG a diferentes concentraciones (160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 y 0 μM). Para comparar la afinidad de la mTG con los sustratos se determinaron las Km aparentes para cada péptido y se calcularon por el método de Lineweaver-Burk (1/Absorbancia = f(1/[mTG (μM)]). De la tabla 3 queda claro que los péptidos HH12Q11 y sus derivados cortos (WH8Q7 y DH6Q5) son altamente reactivos con mTG. En estos péptidos, el donante de Gln está rodeado de serina (en la posición X-1) e histidina (en la posición X+1) que son esenciales para el reconocimiento por mTG. Cuando la histidina (en X+1) se cambia a ácido glutámico (E) en DE6Q5, la reactividad parece perderse. Se obtuvieron los mismos resultados con los péptidos PH6Q4 y PS6Q4. Incluso si E parece abolir la reactividad de los péptidos, esto no puede deberse únicamente a la carga negativa, sino también a la naturaleza de los aminoácidos en la posición X 1, X+2 y X+3. De hecho, el péptido FE5Q4 que tiene E en X+1 muestra una alta reactividad con mTG debido al entorno de los aminoácidos en el otro lado del péptido. Esto se confirma con el péptido LN-11Q8Q10. Para este péptido, solamente Q en la posición 8 es sustrato de mTG ya que su reemplazo por S en LN11Q10 inhibe completamente la reactividad del péptido.
La tabla 3 también muestra que los péptidos de las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32 y 33 son sustratos excelentes para las transglutaminasas.
Para los otros péptidos de esta tabla no se obtuvo reactividad debido a la posición de la Gln y los aminoácidos que la rodean.
R-4: Control de la especificidad de los péptidos seleccionados para la reacción enzimática de mTG
Para confirmar la especificidad de la reacción de mTG en el péptido altamente reactivo HH12Q11 y sus pequeños derivados DH6N5, los inventores sintetizaron los péptidos análogos mutados en los que los donantes de Gln (Q) se reemplazaron por asparagina (N). La figura 4 muestra los resultados obtenidos con estos péptidos (HH12Q11/HH12N11 y DH6Q5/DH6N5). Los resultados son concluyentes ya que la sustitución de Q por N en estos mejores sustratos preferidos de mTG anula totalmente la reactividad enzimática.
R-5: La BSA conjugada con el sustrato de mTG preferido se convierte en un buen sustrato de la enzima.
En la bibliografía se conoce bien que muchas proteínas no son sustrato de la transglutaminasa incluso si están presentes muchos restos de glutamina en sus estructuras (Gorman JJ, Folk JE. J Biol Chem. 25 de jul de 1984;259(14):9007-10). La albúmina de suero bovino (BSA) y las inmunoglobulinas (Ig) se encuentran entre estas proteínas. En este experimento se verificó si la enzima puede reconocer la BSA conjugada con el sustrato de mTG. Para ello, el péptido HH12Q11 se conjugó covalentemente con BSA como se describe en B-I-2. Después, se recubrieron con 1 μg/ml de BSA no modificado y conjugado de BSA-HH12Q11 placas de microtitulación de 96 pocillos para la incorporación de biot-cad mediante mTG. En otro ensayo, se añadió HH12Q11 libre en la mezcla de reacción para analizar su efecto de inhibición sobre mTG. Para mayor claridad de este ensayo de competencia, se utilizó mTG a 100 ng/ml y 150 μM de péptido libre y 0,1 mg/ml de biotina-cad.
Los resultados en la figura 4 muestran que se obtuvo una buena incorporación de biot-cad con el conjugado BSA-HH12Q11 y ninguna reactividad con BSA libre, confirmando que BSA no es sustrato de mTG. La reactividad de mTG sobre BSA-HH12Q11 disminuyó cuando se añadió el péptido libre demostrando la especificidad de la enzima a este péptido y confirmando los resultados obtenidos en R1.
R-6: La IgG humana conjugada con el sustrato de mTG preferido se convierte en un buen sustrato de la enzima.
En este experimento, el péptido sustrato preferido HH12Q11 se acopló covalentemente a IgG humana como se describe en B-1-2 y con su control (IgG libre) se recubrió (1 mg/ml) una placa de microtitulación de 96 pocillos como se muestra en B-I-4. Se estudió la incorporación de biot-cad (0,1 mg/ml) usando diferentes cantidades de mTG como se muestra en la figura 5.
Los resultados muestran claramente que la IgG humana libre no es sustrato de mTG y cuando se conjuga con el péptido HH12Q11 se obtiene una fuerte incorporación de la amina primaria (biot-cad). Las bajas densidades ópticas obtenidas con IgG libre son equivalentes a los niveles de fondo obtenidos sin la adición de mTG.
R-7: Análisis por transferencia Western de la incorporación enzimática de biotina-cadaverina en conjugado IgG humana-HH12Q11 por mTG
Para determinar si la IgG humana se puede utilizar como portador del sustrato de mTG, HH12Q11 y FE5Q4 (sustratos peptídicos de mTG) e YV10 (control peptídico) se conjugaron con IgG humana y se analizaron mediante transferencia Western como se describe en B-II-5.
Los resultados presentados en la figura 6 muestran que tanto la IgG conjugada con los péptidos HH12Q11 y FE5Q4 pudieron incorporar biotina-cadaverina después de 2 horas de incubación con mTG. IgG-HH12Q11 parece incorporar más biot-cad como indica la intensidad de la tinción.
Además, IgG-HH12Q11 tiene más afinidad por mTG que IgG-FE5Q4 ya que la incorporación del sustrato de amina comenzó en la reacción enzimática inicial (TO) (flecha). La IgG libre y la IgG conjugada con el control peptídico (YV10) no mostraron tinción alguna. Estos resultados confirman los resultados anteriores de los presentes inventores mencionados en R-3.
Los resultados del estudio cinético presentado en la figura 7 muestran que tanto el conjugado de IgG con HH12Q11 como con FE5Q4 incorporan biotina-cadaverina rápidamente en menos de 10 minutos y esta incorporación se incrementó durante el tiempo con alta incorporación en 1 hora. De nuevo, la IgG libre y la IgG conjugada con el control peptídico (YV10) no mostraron ninguna tinción, lo que indica que la IgG libre no es sustrato de mTG.
R-8: Anticuerpos etiquetados recombinantes
Se diseñaron y produjeron en células HEK-293 tres anticuerpos diferentes que contenían una etiqueta de péptido Q en el extremo carboxiterminal de su cadena pesada. El péptido Q (SEQ ID NO:7) se fusionó en el extremo carboxílico de la cadena pesada del anticuerpo (IgG1) anti-RhD1 recombinante humano. En otro experimento, se utilizó el péptido Q de la SEQ ID NO: 32 para etiquetar y construir anticuerpos antilisozima humana (D1-3) y anti-Her2 humana recombinantes. La etiqueta se fusionó en el extremo C de su cadena pesada. A continuación, se examinó si mTG es capaz de incorporar biotina-x-cadaverina en anticuerpos etiquetados con péptidos Q. Los resultados de la transferencia western en la figura 10 muestran una tinción clara de la cadena pesada de los anticuerpos etiquetados con la SEQ ID NO: 7 (fig. 10A) y con la SEQ ID NO: 32 (fig. 10B y 10C) mientras que los anticuerpos sin etiquetar no se tiñeron. Estos hallazgos confirman que las secuencias de péptido Q son buenos sustratos de mTG, incluso cuando están fusionados en secuencias de anticuerpos de longitud completa. La diferencia de intensidad de la tinción se debe a la cantidad de anticuerpos cargados en los geles.
R-9: Estudio cinético de la incorporación de biotina-x-cad por mTG
En este experimento, el anticuerpo antilisozima humano recombinante (D1-3) marcado con la SEQ ID 10 NO:32 se incubó con mTG y biotina-x-cadaverina durante 0, 15 y 120 min y la reacción de reticulación enzimática se midió con estreptavidina peroxidasa como se describe en material. y método. Los resultados en la fig. 11 muestran que la incorporación de la biotina-X-cadaverina por mTG es rápida y el máximo (>50 %) de la incorporación (estimado por la intensidad de la señal en la fig. 11) se obtuvo en 15 min. Esta buena y específica reactividad de mTG confirma los resultados obtenidos con las secuencias HH12Q11 y FE5Q4 mostradas en la figura 7.
R-10: Control de la inmunorreactividad de las IgG recombinantes antilisozima y anti-Her2 por ELISA
Es bien conocido que la polihistidina y otros péptidos pueden usarse para etiquetar anticuerpos sin ningún efecto sobre su inmunorreactividad. En este experimento, se midió la inmunorreactividad de los anticuerpos antilisozima (D1-3) y anti-Her2 etiquetados de los presentes inventores en sus proteínas correspondientes mediante ELISA como se describe en los métodos B-III-3 y B-III-4. Los resultados en la figura 12A muestran claramente que tag-D1-3 tiene una inmunorreactividad comparable a la del anticuerpo de control D1-3 que no tiene etiqueta. hIgG se utilizó como control de anticuerpos negativo. En la figura 12B, se obtuvieron los mismos resultados con anti-Her2 etiquetado en comparación con su anticuerpo sin etiquetar. En la figura 12C, se confirmó la estabilidad de la inmunorreactividad del anticuerpo anti-HER2 cuando se conjuga con X-biotina cadaverina, a través de mTG. El control de la prueba ELISA se realizó utilizando antilisozima etiquetada y sin etiquetar. A partir de estos experimentos, se confirmó que la adición de una secuencia peptídica pequeña como sustrato de mTG en el extremo carboxiterminal de la cadena pesada de los anticuerpos no tiene efecto sobre su inmunorreactividad.
REFERENCIAS
A lo largo de la presente solicitud, describen el estado de la técnica diversas referencias a la que pertenece esta invención.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un sustrato para transglutaminasa que comprende un péptido seleccionado de las secuencias de aminoácidos que consisten en las SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:32 y SEQ ID NO:33 y en donde dicho sustrato está unido a una primera molécula.
2. El sustrato según la reivindicación 1, en donde la primera molécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un fármaco, un ácido nucleico, un elemento radiactivo, un grupo indicador, una molécula estabilizadora, un aptámero, una ribozima, un anticuerpo de dominio, un nanocuerpo, un armazón no inmunoglobulínico, una partícula vector y una molécula inmovilizada sobre un soporte sólido.
3. El sustrato según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la primera molécula es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo.
4. Un compuesto conjugado que comprende el sustrato para transglutaminasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unido covalentemente a una segunda molécula que comprende al menos un resto de alquilamina o lisina.
5. El compuesto conjugado según la reivindicación 4, en donde la segunda molécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un fármaco, un ácido nucleico, un elemento radiactivo, un grupo indicador, una molécula estabilizadora, un aptámero, una ribozima, un anticuerpo de dominio, un nanocuerpo, un armazón no inmunoglobulínico, una partícula vector y una molécula inmovilizada sobre un soporte sólido.
6. El compuesto conjugado según la reivindicación 4 o 5, en donde la primera molécula es un anticuerpo y la segunda molécula es un fármaco, preferentemente un fármaco citotóxico.
7. El compuesto conjugado según la reivindicación 6 para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.
8. Un método para unir covalentemente el sustrato de transglutaminasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, a una segunda molécula que comprende al menos un resto de alquilamina o lisina que comprende la etapa de:
- hacer reaccionar el sustrato de transglutaminasa con la segunda molécula en presencia de una transglutaminasa, preferentemente transglutaminasa bacteriana, por ejemplo transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense (mTG).
9. Un péptido que tiene de 5 a 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
10. Una proteína de fusión, que comprende un péptido según la reivindicación 9 fusionado con un polipéptido.
11. La proteína de fusión de la reivindicación 10, que comprende, la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o sus regiones de fragmentos variables, tal como Fab o (Fab)'2, en donde dichas cadenas pesadas y/o ligeras o sus fragmentos variables, se fusionan con un péptido según la reivindicación 9.
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