JPS62501449A - Ｐｅｇ修飾抗体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ２３、治療法が，がん化学療法或いは，放射線療法である請求の範囲第２２項の 方法。

２４、方法が．診断法である請求の範囲第２１項の方法。

２５、診断法が．ｍｓイメージング法である請求の範囲第２３項の方法。

２６１診断法或９は、治療法が、該抗体或いは、その複合体をヒトに投与するこ とを特徴とする請求の範囲第２１項の方法。

２７、該抗体或いは、その複合体が、異型（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　）の種 の抗体である請求の範囲第２６項の方法。

２８、該抗体或いは、その複合体が、薬剤、放射性核種、毒素（トキシン）、或 いは、螢光試薬であることを特徴とする請求の範囲第２１項の方法。

２９、ポリエチレン　グリコール反応剤が、′Ｊ＆本的に非−免疫ぶ性であり、 得られた修飾たんばく質は、基本的に非−毒性で、非−免疫原性であることを特 徴とする請求の範囲第１項の方法。

３０、非修飾の抗体に比べて、低減された非−特異反応性と、高められた特異反 応性とを有する。ポリエチレン　グリコールで共有結合的に修飾された。生物学 的に活性な抗体。

明細書 目標組織との抗体の免疫反応に依存しているタイプの診断法及び治療法は、治療 に適用中の試薬の免疫原性、及び杷砲表面Ｆｅ受容体への結合の両省により、し ばしば妨害されるものである。

抗体及び他の異種たんばく質に刻する免疫反応は、アレルギー現象とたんばく質 の不活性化との両者により特徴付けられ、ホスト免疫システムの刺激作用をｆ戊 するたんばく質装置により迎撃されなげればならない、一方、所望のたんばく賃 生物学的活性を保持している。更に、細胞表面受容体に対するＦｅ結合を減少或 いは、除去することにより、抗体特異性を増加せしめることが望ましい。

（２）可１玖卑二爬Ａ 種々のたんばく質修Ｓ処理法が、外部たんばく質の免疫原性を低減するために使 用いれてきた。特に、抗体活性を破壊しないで異種抗体に対するヒト免疫反応を 抑制することは、以前より１分子のＦｃ断片を分割する抗体の酵素消化により行 なわれてきた。

生成Ｆ（ａｂ）’断片は、抗原に対する結合使方を保持し、そして。

種々の化学剤と結合し、低い免疫原性の複合体を与えることができる。然し乍ら 、抗体のプロテアーゼ消化は、低い収率で遅い処理過程のものであり、生成断片 の分離を必要とするものである。

より魅力的な研究方法は、高い抗原結合活性と低い免疫原性を有し、そして、殆 ど毒性のない生成物を与える抗体の化学的な修飾法であった。このように提案さ れた修飾法は、治療上有用な酵素に対するポリエヴーレングリコール（ＰＥＧ） やポリビニルアルコールのような親水性ポリマーの既知免疫阻害性効果に広く基 づいていたものである０次のものを０且？＋　；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、−にす１ご ソーニー？」Σ？＝３５７８−３５８６（１９７７）；Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉ ｏ　ｈｖｓ、　Ａｃｔａ、　６６Ｑ：２９３−２９８（１９８１）：Ｃ１１ｎ、 Ｅｘｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４６：６４９−６５２（１９８１）：　Ｂｉｏｃｈｉ ｍ、Ｂｉｏ　ｓ。

Ａｃｔａ、　５７８：４７−５３（１９７９）；　Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａ１１ｃ ｒ　、」■１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５６：１５９−１７０（１９７８）：　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｍｏｌ、　１２６：４０６−４１３（１９８１）；及び匣Ａｒｃｈ 、　Ａ１１ｅｒ　、　Ａ１１ｅｒ　、Ａ　１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、６３：１−１ ３（Ｌ９８０）＊然し乍ら、これらの報告された修Ｓ処理法は、抗体に一般的に 適用きれなかった。例示的研究では、む旦蝕復口史史譚堕彪二［！回−Ｒａｄｉ ｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒｇ２．　Ｅｌｓａｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８３．に報告されるように、う きぎ抗ヒト血漿アルブミンの６０００のＰＥＧ誘導体を、ＰＥＧによるアーレブ ミンの修飾で月いたＵ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５２：３５７８−３５８ １．１９７７＞と同様な塩化シアヌル結合法を用いて製造した。その生成物は低 減された免疫原性を示したが、抗原に対する結合活性の損失は受け入れられない 程のものであった（結合容量が７０％近く減少した）、同様の結果が関連した研 究Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５９ｉ３２７（１９８３）でも 得られた、これは、塩化シアヌルにより媒介されたＩｇのＰＥＧ修飾処理が抗体 活性を破壊したものと結論するものである。

え旦Ω棗堅 本発明は、ポリエチレングリコール−たんばく賀詞導体に関し、たんばく質をポ リエチレングリコールにより、活性エステル中間体を用いて、共有結合的に修飾 処理することにより、良好な収率でその誘導体を製造する方法である。誘導体合 成された抗体は、抗原結合活性を保持していること、細砲表面Ｆｃ受容体の結合 容量が低いこと、免疫原性が低ｉすれていること、貯蔵安定性が優れていること 、及び毒性がないことにより特徴付けられてい。

モして１通常の免疫学的技法９例えば、腫瘍イメージング、化学療法、放射線療 法及び免疫組織化学処理法などに有用である。モノクロナール抗体及び酵素を含 む２診断用及び治療用たんばく質の広い範囲を９本発明方法により修飾でき、低 減きれた免疫原性と低い非特異性生物学的活性を有する修飾たんばく質を与える ことができるものである。

乳面の簡単な足ｌ ｖ、１図は＋　ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇコノ１り酸塩のＮ−ヒ１：ロキシーコ／１り酸エ ステルにより修飾きれたうさぎ抗−コナルプミンの５ＤＳ−ディスク　ゲル電気 １永勤分析を示す、このゲルζま、１オマシイ　ブル−　（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ 　ｂｌｕｅ）で若色されて、６００ｎｍでのデンシオメータでスキャンされたも のである０図中の数字ζまｍＰＥＧ修飾アミノ基のパーセントに相当するもので ある。

第２図は、Ｈａ／ＩＣＴマウスに対して与λ、られた５ｃｒｇのうさぎ抗−ＣＡ ＬＢの免疫原性を示し、第２ゴニ程として、うさぎ抗−マウス　ＩｇＧ−燐酸ア Ｊレカリ塩試薬でＥＩＡ滴定を用ν）て、評価したものである。免疫化時期は、 矢印で示ｔ、＄修飾のうξぎ抗−ＣＡＬＢにより引き出された抗−うさき°Ｉｇ Ｇ反応（士。

三角印で示きれる。ＰＥＧ修飾で引き出された反応（アミノ酸基の１８％）は丸 印で示される。

第３図は、免疫原性に対するうさぎ抗−コナルプミンのｍＰＥＧ−修飾の効果を 示すものである。スイス　マウス力（ＰＢＳ中の５０μ乙の抗原で免疫化され、 そして、抗イ本反応（よｉ夢素免疫−アッセイを用いて評価したものである。／ ＜ネル、ａ、ｉｉ、第１次免疫イヒ後１２日目の抗体滴定量を示し；／クネルＢ （士第１次免疫イヒ後１８日目、第２次免疫化後３Ｂ目の抗体滴定量を示し；そ して、／＜ネルＣは第１次免疫化後３５日目で第３次免疫イヒ後９日目の抗イ本 滴定量を示す。

第４図は、ｍＰＥＧ修飾されたうさぎ抗−ニーｐ＞レブミンで処理した効果を示 し、非修飾　うさぎ抗−コナルプミン番二対する抗イ本反応について示す、スイ ス　マウスにつｌ／％て非処理のもの（・）或いは、５ｃｒｇの非修飾　う妨ぎ 抗−コナルプミンで免疫イヒしたもの（ム）で、非修飾　うさぎ抗−コナＪレプ ミン５０μ匹で免疫化前５日及び２０日でのものである。（日数ｚＯ）拳？’７ ス抗−うきぎ免疫グロブリンの滴定量は、酵素−結合のアンセイを用いて浬り定 した。

第５図は、ＰＢＳ８．Ｄ１細胞に対する免疫複合体の結合性を示す。免疫複合体 はうさぎ抗−コナルプミンと螢光体（フルオレセイン）標識　ニワトリ卵フナル ブミン（３モルのフナルブミン／１モル抗体）から製造した。各　免疫複合体１ ０’個の細胞からのアリ′−Ｉ−１を３０分間横軸に示した免疫複合体の濃度で 培養した。螢光細胞の数は流動→ノイドメトリ（血球計数）により測定した。

第６図は、３モルの螢光体標識　ニワトリ卵フナルブミンと１モルのｍＰＥＧ　 ＊飾のう諮ぎ抗−コナルブミンとを用いて製造しｔ−免疫複合体の、ＰＢＳ８． Ｄ１細胞に対する結合性を示す。

各免疫複合体４０μｇ（第５図のデータより決めた）のアリコートを、１０″個 のＰＢＳ８．Ｄ１細胞で３０分間培養した。螢光細胞の数は流動血球種数により 渭１定した。％ｍＰＥＧ修飾はＴＮＢＳアミ７基分析により確立し、た。自己螢 光性は１７％の細胞に見られた。異なる符号は異なる日数で異なる試料ＰＥＧ− 修飾抗体により行なわれた実験を示す。

第７図は、１０１個のマウス肺臓細胞に対する螢光体標識のうさぎ抗−マウス免 疫グロブリン（ム）及びｍＰＥＧ−修飾された螢光体標識　アフィニティー精製 　う諮ぎ抗−マウス免疫グロブリン（・）の結合性を示すものである。パネルＡ は抗体濃度の関数と１７ての螢光細胞の数を示す、パネルＢは螢光強度が流動血 球計数上より消λる細胞の数を示す。

第８図は、マウス肺臓細胞に対する螢光体標識のう妨ぎ抗−マウス免疫グロブリ ンの結合性を競合的に抑制することを示す、横軸に示す量の精製マウスＸ　ｇ　 Ｇを８μｇの螢光体標識のうさぎ抗−マウス免疫グロブリン（ム）の存在下、或 いは、ｍＰＥＧ−修ｓされた同じ試薬８μｇ（・）の存在下で、そして、１Ｘ１ ０’ネズミの肺臓細胞存在で培養したものである。細胞をＰＢＳで洗浄した後、 螢光細胞の数をがｔ動血球計数によりｆｉｌ＋定した。この実験中、自己−螢光 が８％の細胞中に見られた。抑制剤の添加なしで、ｍＰＥＧ−修飾された抗体が 細胞の３９％そして一升修飾の抗体６５％を検出した。

第９図は、ｍＰＥＧ−修飾で、螢光体−標識　抗体の螢光発光スベク）・ルに対 する修ｆｌｉ処理の効果を示す−。グツイーディー精製うさぎ抗−マウス免疫グ ロブリン試薬を。ＦＩＴＣで、３．７（Ｎ）のＦ／Ｐ比に修飾したものである。

この試薬の分画をｍＰＥＧ（３０％のアミノ基修ｊ！ｆｆ１）で修飾し、そして 、ｍＰＥＧ−修飾の螢光体−標識　抗体の螢光発光スペクトル（ム）、及び非修 飾の螢光体−標識　抗体の螢光発光スペクトル（・）は、Ｏ，５０ｍｇ／ｍｌで 、０．３０ｅｒｎのキュベツト中で、４９３ｎｍの励起波長のＡＭＩＣＯ堡光分 析先光分析先光分析光度計した。

圧Ｉ焚に１塵に乳佐ａ閂星 本発明によると、異種たんばく質の、特に抗体の、免疫原性が、ポリエチレン　 グリ：１−ル（ＰＥＧ）により、ＰＥＧ活性エステル中間体を用い℃、たんばく 質の共有結合的修飾が行なわれることにより、低減され、或いは、除去されるも のである。既知の先行技術の修飾法とは逆に１本発明方法による抗体のＰＥＧ修 飾法により、抗原に対する結合活性を保持する一方、低減された免疫原性を有す る誘導体が供される０本発明の特別の利点は、特異性のない結合性が著しく低減 され、それは抗体分子のＦｅ部分を不活性化するに貢献するものと信じられるも のである。従って。

本方法は抗体の細胞表面Ｆｅ受容体に対［る結合性を基本的に除去し、そして、 腫瘍イメージング法及び免疫組織化学技法の如き応用に於て目標組織での抗体濃 度を増大するものである。

本発明方法で有用な特定ＰＥＧポリマーには、約１０００〜５０００の分子量を 有する置換或いは、非置換のＩ’ＥＧポリマーがあり、それ自体は低い免疫原性 であり、活性エステル中間体を用いてたんばく質と結合させることもでき；得ら れる修飾たんばく質は、生物学的に活性であり、基本的に非毒性で非免疫原性で な（ｊればならない。モノメトキシポリエチレングリコール（ｒｒｉＰＥＧ）は 、こｔ］らの基準を満足し、そして、特に抗体に対して適するグリコール（ｍＰ ＥＧ）である０本発明の活性エステル研究方法を用いて抗体の共有結合的ｍＰＥ Ｇ修飾が、結合活性を全部保持しながら達成され、そして、非常に予想可能で再 現可能な修飾処理が得られる。

本発明によるたんばく質修飾処理は、たんばく質分子上にＴＮＢＳ利用性（入手 性）（トリニトロベンゼン　スルボン酸−利用性）のアミン基へのＰＥＧの共有 結合的付加を通して生じるものである。ＰＥＧ−修飾の誘導体の免疫原性は、修 飾の程度により変わり、それは、活性エステル対たんばく質の比率を適当に選択 することにより容易に制御される。（利用できる修飾アミン基の約１０〜２０％ を典型的に有する）誘導体の生成の最適範囲において、多くの抗体が通常の診断 用或いは、治療用の量で修ＩＩ＋ｌｉ汐れた抗体にきらされることによる免疫反 応を生じないものである・修飾の高いときも低いときも、免疫原性は、たんばく 質及び使用したＰＥＧ修飾に依存して保持きれ或いは、高められもする。一般的 に、ｍＰＥＧで修飾きれたアミノ基１３〜１８％を有する免疫グロブリン分そは 検出可能な免疫原性に欠け、然し乍ら、修飾が低くても高くても、ｍＰＥＧ−抗 体複合体は、非修飾分子に対する免疫反応を誘導し、多くの場合、抗体反応の高 まりが見られる。本発明方法の抗体−ｍＰＥＧ誘導体は、３５％未満の修飾され たアミノ基を持つ完全な抗原結合活性を保持している；非常に過剰量の活性エス テルを用いても、ｍＰＥＧによる。約３５％以モノ利用できるアミン基を修飾す ることは、困難であると証されていルノテ、この点についてｍＰＥＧによる修飾 処理は自己規制的テアリ、有利なものである。利用できるように低減された免疫 原性をもつ多くのたんばく質−ｍＰＥＧ誘導体は、ｐｊＴ望の処理条件下で効果 的な抗原結合活性をも保持するものであることを目指すものである６本明細書に 述べた修飾生成物は１分子の分布を含めてのものであるので、述べた修飾の程度 はこの分布の平均値であることに注意すべきである。その範囲は精製の程度に依 存することができ、特に、利用できるように低減された免疫原性は、出発原料の 精製を高めると、より広い修Ｓ範囲にわたり得ることができるものである。

ＰＥＧは９本発明に従いたんばく質分子に次の如く共有結合的に付着芒れる： ｉ　）ＰＥＧ十カルボキシ化剤崎　ＰＥＧ−ＣＯＯＨ２）ＰＥＧ−ＣＯＯＨ＋カ ルボキシ基活性化剤→　ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＰＥＧ”　）の活性エステル３）た んばく質十ＰＥＧ”　→たんばく質−ＰＥＧこれらの式に要約されるように、Ｐ ＥＧはカルボキシル化され、そして、精製された生成物（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）は 適当なカルボキシル活性化剤でエステル化され、活性なエステルＰＥＧ”が形成 される０次に、この活性ニスデル中間体をたんばく質分子と結合せしめるが、活 性化部分の損失を伴うものである。上記のように、修飾処理は、たんばく質分子 の分布、ＰＥＧで種々に脩飾許れたたんばく質分子の分布を与えるものである； その生成物は、より正確には、たんばく質−（ＰＥＧ）ｘ（ｘは、たんばく質分 子上のＰＥＧ基の数である。）として示される。ＰＥＧ基の数Ｘは、たんばく質 分子上にある反応性アミン基の数により変化するものである。精Ｖされていない 反応生成物を用いるときは、置換詐れていないたんばく質（ｘ＝０）の量を小妨 ＜シ、裸のたんばく質分子に免疫反応が導入される可能性を回避することが重要 である。

ＰＥＧをカルボキシル Ｇを活性化し，活性エステル中間体ＰＥＧ’にすることは，当業者に既知の数種 の方法により達成できるものである．コハク酸無水塩の如きカルボギシル化剤を 用いるもの、ｖｉ化処理とウィリアムソンのエステル合成法の如き６典的教科書 的方法を含む方法により達成でさるものである。特に有用な具体例では１選択さ れたたんばく質種を先ず無水フハク酸でスクシニル化し、’ＰＥＧ−Ｃ００Ｈを 反応工８（１）により形成する。ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（スクシニル化された）を次 にＮ−スクシンイミドでエステル化し。

活性エステルＰＥＧ”を反応工程（２）により形成する。Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミド活性エステルを次に所望のたんばく質と反応せしめ、ＰＥＧ−たんばく 質接合体を反応工程（３）により形成！１．エステル化部分の損失を伴う、ＰＥ Ｇ−ＣＯＯＨを活性化するに有用なタイプのカルボキシル−活性化剤は、当業者 によく知られており二Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの他に、トリニトロフηノ ールはその１例である。ＰＥＧをたんばく質と結合させるための」−記のような 既知の先行技術とは逆に２本発明の方法は、生物学的特異性を保持しながら、し かし、基本的に非特異性の反応性をなくした活性の非毒性生成物を供するもので ある。

本発明５５法は、哺乳動物に、特に、ヒトに投与されたときに。

その免疫原性を低減できるたんば〈質の広い範囲に適用可能なものである６本方 法は特に異型（ｈａｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　）の種のたんばく質の免疫原性を低 減するには有用であり、一方１本方法はまた相同性の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　 ；同類の）種のたんばく質にも適用できる。抗体は本発明方法によるものと同じ ように特別の関心のたんばく質であり、そして、抗体分子の特異性及び結合活性 は保持しているものである。一方、抗体分子の細胞Ｆｅ受容体に対する非特異性 結合及び抗体の循環からの急速な浄化は、なくなる、薬剤、毒素、螢光物質、放 射性核種或いは、他の活性部分は１選択組織に、特に、腫瘍組織に２診断用或い は、治療用に分配するための当業者に理解できる原理に従いＰＥＧ置換基を通し て修飾抗体分子に容易に付着され得る。ＰＥＧ−修飾された抗体或いは他のたん ばく質により接合された活性部分を有する複合体は、非特異性の活性が低ｆ″ｉ 、きれていることに依存して７複合体の時期尚？−の解離が回がされ、そして、 高い選択的分配がユ仝成さＪ１イ）。

本発明により修飾されｔ−モＩすｔ：：＋−Ｊ−ル抗体は、ねずみ起ｄ９の非修 飾の八ＬＡｂｓを治療用にすると、増加し６．ポストの異種たんばく質に対す− ろ免疫反応であり。その両名は、ＭＡｂ炙不活性化し、アレルギー反応或いは血 清病を起Ｚ　ｉ−ｉｔ社カを有する。ヒト抗体を治療に使用すると、このような 免疫反応を部分的になくするができる：然し乍ら、ヒトＭＡｂは、免疫反応を刺 激できるアロタイプ及びイデオタイプのａｍ位置を有するものである８更に。

活性部分をイＸ１着した無傷のヒトλ４Ａｂで処理すると、ハブテン−接合のた んば〈質で免疫化すると同等であり、それは、抗ハブテン反応を刺激できたもの である。従って、ヒ１−及び動物のムｉＡｂの本発明に従う修ｉ！ｆｆｌ処理は 、これらの全ての免疫反応を消去“４ることを、特に、を図するものである。

本発明の修飾抗体は、また、既知の組織及び細Ｊ泡染色処理で。

無傷の抗体の置換物÷して、有用であり、細胞のＦｅ受容体と抗体のＦｅ部分と の間に干渉があることにより、１１＝−特異性の染色庖回避できるものである。

本発明により修飾できる他のたんばく質は、酵素、特に、置換治療に治療的に有 用である酵素を含む。

一般的に１本発明は、試験管内及び生体内の両方で用いられるたんば〈質に適用 できるものであり、そのとさ、免疫学的処理法は、たんばく質の、及び／或いは 、非−特異性の組織の結合の免疫原性により妨害される。

次の実施例は１本発明の実施を例示するものである。

天皇−例 凹一法 抗−コナルＬ肋と成体の製造 うさぎ抗体−コナルブミン　抗血清は、にわとり卵コナルプミン（ジグ７　、　 Ｓｔ、　Ｌｏｕｓ、　ＭＯ＞をフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）接合体（アジ誌 バンド）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　１５１ａｎ ｄ、　ＮＹ）により。

乳化し、ＰＥＧ中に溶解せしめ、　１、０ｍｇ／ｍ　Ｉ　、のｉｉ濃度のフナル ブミンを得ることにより製造された。うきぎは、そのフッドバッド中で乳化液１ ．０ｍｌのアリフートにより免疫化きれ、１２−１４日後に皮下注射により１　 ｍ　ｇの乳化抗原で促進された。免疫化うさぎから取った血液試料を１通常のよ うに、オフテロニー分析により抗体含有率について監視した。高い滴定量での、 後の過程でのみ、抗血清を残りの実験で用いた。

抗−コナルブミン　抗体が、ＣＭ−バイオゲル（パイオーラッド　ラボラ（・す ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｅｈｍｏｎｄ、　ＣＡ） 上のアフイニテイ　リロマトグラフィにより、うきぎ抗血清から単離された。そ れを、水溶性カルボジイミド処理（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂ、　Ｃｈｅｎ＋。

Ｄｉｖ、、　Ｔｅｃｈ、　Ｂｕｌ、　１０７５．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ＣＡ、　１ ９８０）を用いてコナルブミンに結合せしめた。簡略すれば、抗血清をアブィニ ティ　カラムにかけ、カラムを０．５Ｍチ１シアン酸ナトリウムで洗浄し、得ら れた抗体を同時に脱こし、　Ｍｉｃｒｏ　Ｐｒｏ　ｄｉ　Ｃａｎ装置（Ｂｉｏ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒｃ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ、　Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、　ＯＲ）を 用いて濃縮した。精製きれた抗体を４度で滅菌保存した。

抗−フナルブミン？耐１Δ匝冗 アフイニテイ精製され、そして、化学的に修飾された抗体の抗原結合活性は、う さぎ抗−コナルブミツーアルカリ　フォスフアーゼ接合体のフナルプミツー被覆 のミクロエリーサ　プレート（Ｖａｎｇａｒｄ、　Ｎｅｐｔｕｎｃ、ＮＪ）に対 する結合性を競合的に抑制する能力を評価することにより測定された。このアッ セイで酵素結合した抗体は、アバルメース（Ａｖｅｒｍｅａｓ：　Ｉｍｍｕｎｏ 、　Ｃｈｅｍ、　！：　４３．１９６９）により説明された方法の修飾処理によ り製造きれた。そして、最大感度を確認するために、アッセイで使用きれる前に 抗原被覆のプレートの上で滴定された。フナルブミン被覆のミクロエリーザ　プ レートは、フナルブミンを０、０５　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ中にｐ）ｌ　９．６テ１ ０工ｇ　／　ｍ　ｌに希釈し、室温で１８時間培培養ることにより製造した０次 に、適当な希釈度の、抗体と酵素接合体との等量を、抗原被覆プレート中に、室 温で２〜５時間定常的に髭合しながら、培養した−　Ｈ＋Ｏでそのプレートを洗 浄し、０．ＩＮのトリス−ｃｌ（Ｔｒｉｓ−ＣＩ）、ｐＨ１０中のｐ−＝ト１’ 　７　ｘ、　ニール　リオス７エ　ｈＯ。

２５ｍｇ／ｍｌの３００ｍ１のアリニー１−を各試料に添加し、そして、適当に 培養した後に、ダイナデツグ　ミクロエリーサ（ｄｙｎａｔｅｅｈ　ｍｔｃｒｏ ｅｌｉｓａ）　３取計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｔａ、ＶＡ）を 用い、４１０ｍｍと６５０ｍの吸収を測定した。全てのテストで、修飾された抗 体は、非修飾のアフィニディ精製抗体の標準曲線で同時にアッセイされた。そし て、データは、比較１ｍｇ抗体／　ｍ　ｇたんばく質として示きれる。この結合 アッセイにおいて、非修飾のアフィニテイ精製抗体は、１ｍｇ抗体／　ｍ　ｇた んばく質の値を持つものとして定義される。抗原結合をブロックするが或いは。

抗体を変性する化学的修飾処理は、この数の減少により特性指摘がされる。

胤１’［ｊｔＫ（７）ユニ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｔｚａｔｉｏｎ）３つの異なる 測定法が、修飾抗体を特性指摘するために使用された。たんばく質濃度は、Ｅ％ ２８０ｎｍ＝１４と仮定し、２８’Ｏｎｍでの光学的濃度測定（Ｍｅｔｈｏｄｓ 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、２ｉ３４３．１９６８）により、 及び、染料結合アッセイ（釦す１工Ｊ知ｅｂｅｍ、　７２：２４ｇ、１９７６） をうさぎガンマ−グロブリンと共に使用することの両方法により、測定された。

標準の濃度は、ケルダール（Ｋ　ｊｃｌｄａｈｌ）消化のネスラー化（Ｓｔａｎ ｆｏｒｄ、　Ｍａｄ、　Ｂｕｌｌ、６：９７．１９４Ｂ）により評価された。た んばく質アミノ基は、　Ｈａｂｅｅｄ　（赳虱界工μ仝世恒より＝３２８、１９ ６６）により説明きれた１ＮＢ５滴定により測定された。ＰＥＧ修飾の程度は、 たんばく質の大きさの増加を測定することにより評価された。この測定のために 、たんばく質の太き汐は、６％不速続５ＤＳｔ気泳動ゲル　システムを用いて評 価きれた。然し乍ら１球状たんばく質の標準曲線に基づくポリマー修飾の免疫グ ロブリンのＳＤＳゲルの大きさの計算は、大きな誤差を含むものである。従って 、結果は、付加たんばく質標準なしで、移動距離を示すものとして報告される。

免疫原性の」俣 うさぎ抗体と七〇ＰＥＧ−修飾の訓導体の免疫原性は、ＰＥＧ中の５０μｇ抗原 （うきぎ抗体）を腹腔的注射に対するスイスマウスの抗体反応を？１１１１定す ることにより決定した。マウス抗体反応は、２段階酵素結合アッセイを用いて測 定された。簡単に云えば、マウス血清の２倍希釈したもの数個を、２〜５時間う さぎ免疫グロブリン被覆ミクロニリーサ　プレート上で培養した。よく洗浄した 後、プし・−トを、うさぎ抗−マウス　アルカリ　フォスファターゼ接合体で、 更に２〜５時間培養した。この第２の培養の後に、非結合の接合体を、Ｈｌｏで よく洗浄することにより除去した。そして、各試料プレートを３００ｍ１のｐ− ニトロフェニル　フＡスフ　ｙ、−ト、０．２５ｍｇ／ｍ　Ｉの０．ＩＮトリス −Ｃ１溶液（ｐＨ１０）で再充填した。２時間の培養時期の後に、４１０ｎｍと ６３０ｎｍの吸収率を前記の如く測定した。このシステムで、抗体滴定量は、最 大希釈のものとして規定され、ブレブリード　レヘル以上に顕著な吸収が読み取 れる。

似笠放贅を君 ２つの異なる研究法を、抗体のｍＰＥＧによる修飾に用いられた。モノメトキシ ポリエチレン　グリフール（ａｖ　ＭＷ＝５０００　）　（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ ｉｌｗａｕｋｅｅ、ＩＪＩ）を、アブチェウスキー（Ａｂｕｃｈｅｗｓｋｉ　： 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５２：３５７８．Ｌ９７７）により説明き れる塩化シアヌル酸（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｅｍうｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｈ ｅｓｔｅｒ、ＮＹ）処理法を用いて抗体に結合上しめた。更に、ｍＰＥＧも、活 性エステル中間体を用いて抗体に結合せしめるいこの誘導体を製造するために、 ｍＰＥＧを。乾燥ビリデン中の無水−１／）’）酸（Ａｌｄｒｉｅｈ）過剰量を 用いて、スクンール化せしめた。ビリデンは、フラッシュ蒸留と凍結乾燥の組合 わせにより除去１７た、そして、汚染コノ）り酸は、透析により除去した。精製 されたｍＰＥＧフハク酸塩は。凍結乾燥され、七しギュラー　ツーブ４　Ａ　（ Ｍａｔｈｅｓｏｎ　ＣｏｌｅｍＡｎ　＆　Ｂｅ１１．Ｎｏｄｉｒｏｏｄ、　０１ １　）、、、ｌ二の塩化メチレン中で乾燥された。ｍＰＥＧコハク酸塩を。

次に、　Ｄ　ＣＣ（Ａｌｄｒｉｅｈ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ａｌｄ ｒｉｅｈ）との等モル混合物中でエステル化した。そして、得られたＮ−ヒト［ １キンスクシンイミド　Ｊ〜ステルを２石油エーテル沈殿法により除去１．た、 ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　’：’ハタ酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド　」−ステル は１石油ニーチルでベンゼンの繰り返し再結晶化精製にＪ、り精製さねた。そし て９次に、乾燥ＤＭＦに溶解ゼしめ、抗体溶液と急速に混合せしめ、　０、７　 Ｍ　、　ＮａＨＣＯ，ｐ）！　９．６中で修飾上しめた。修飾の程度は、活性エ ステルと抗体との比率を変化せしめることにより、制御された。得られたｍＰＥ Ｇｗ！Ｅｆｆｉ抗体は、ＰＢＳに対しての完全透析により精製された。

Ｆｘ′ｒｃによるたんばく質の修飾 −〕ナルブミン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、ＬｏｕＳ 、ＭＯ）の試料及びアフイニテイ精製うさぎ抗−マウス免疫グ【コブリンを、ゴ デイング；Ｇｏｄｉｎｇ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、１．３Ｆ２１５ ．１９７６＞のづｉ法を用いて、ＦＩＴＣにより螢光体標識化を行なった。１モ ルのたんばく質当りに用いた。

ポリエチレン　グリコール　脩飾法 アフイニテイ精製う妨ぎ抗体を、モノメトキシポリエチレングリフール　フハク 酸塩のＮ−ヒトＩ」キンスクシンイミド　エステルを用いて、ポリエチレン　グ リコールで修飾した（平均分子量−５０００）。各修Ｓされた製造物に対して、 修飾の程度は、ＴＮＢＳアミノ基分析（Ａｎｌ　ｔ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、１４Ｆ ３２８．１９６６）及び６％ポリアクリルアミド　ゲル上の非還元性の５ＤＳ− ゲル　電気法細胞表面に対する。抗体製造物の免疫複合体の結合性を評価するた めに、１Ｘ１０’ｍ胞のアリコートを、ＰＢＳ中のテスト試薬で０度で３０分間 培養せしめた。この初期培養に続いて、非結合物質が、細胞を３回０度ＰＢＳで 洗浄することにより除去された。最終細胞ベレットは、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸 濁きれ、螢光活性化開眼ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　５ｕ ｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて細胞数が１分析された。各分析において、１０ ００以上の細胞が計数された。また、細胞は、螢光ｗ４微鏡で検査され、細胞表 面螢光が調査確認、できた、２つの細胞集団がこれらの実験に用いられた。ＩＦ ？臓細泊をスイス　マウス（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、　Ｍａｄｉｓｏｎ 、ｉＪＴ、）から得た。そしで、汚染１１’Ｐ臓細胞は、塩化アンモニウム技法 （Ｍｉｓｈｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ 　Ｃｅ１１５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆ　Ｃｅ１１ｕｌａｒ　ＩｍｍｕｎｏｌｏＨｙ　［Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　 ａｎｄ　Ｓ、　Ｓｈｉｉｇｉ、ｅｄｓ、コｕ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃ ｏ１６．　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐ、２３．１９８０）を用いて分析さ れた。

靴庭二ヱヱ ネズミ　マクロファージ　ライン　Ｐ３８Ｂ、Ｄｌを、実験室中で、アメリカン 　タイプ　ティッシニー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ ｓｕｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　） から当初得た株から成長せしめた。

氾、扱止盾作に対するｍＰＥＧ脩飼ｙ勲−ｉ塩化シアヌル酸及び活性エステル結 合法を用いて、抗体活性に対重るｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ修飾処理の効果を、第１及び２ 表に報告する。これらの結果から、低い修飾の程度でも、塩化シアヌル酸との抗 体結合活性が顕著に減少することがあることが明らかである。活性化ＰＥＧの速 度と形状を変化させる実験が９反応時間と温度を変化さ七る実験と並行させて行 なうが、活性抗体の回収率に顕著な向上はなかった。これに対して、ＰＥＧによ る抗体の修飾のために活性ニスデルを用いると、抗体滴定量或いは、抗体活性に 検知できる損失はなかった。

第１表 修飾　ｍｇ抗体／　ｍ　ｇたんばく質　Ａｂ活性の損失％０　１．００　０ ４　０．５０　５０ １４　０．１５　８５ ３５　０．０６　９４ 第２表 立上１！１す■直企門 ２２　１．０　０ ３０　１．０　０ 例」：来光ｙリニー従−？Ｊ−巳旦旦ぶＪ３勿ユ豆■生ニ失筏二麦未抗体がこの 処Ｆ１法により著しく修飾きれることを実証するために、全てのｍＰＥＧ−修飾 　抗体製造物を、ＳＤＳゲル　電気泳動分析により分析した。誘導体の１ンリ〜 ズの例を第１図に示す、この実験から得た結果により、その分布の殆ど或いは、 全ての分子が、修飾され、そして、見掛は分子量は、修飾処理につれて増大する ことが示きれる。然し乍ら、修飾きれたテスト抗体は、抗体当りＰＥＧ分子の異 なる数を含む各分子の分布であることを注意すべきである。従って、報告された 修飾％は、この分布の平均値である。

ｔｓｍ：４七発明によｉ隻儲贋−へ丸−乞ＬＬ−徂−）　ｆ　４ブミンの魚跨牲 非修飾のうさぎ抗体の免疫原性に比較して、ｍＰＥＧ　修飾うさぎ抗−：１ナル ブミン（修飾されたアミン基１８％）（活性エステル結合剤）の、スイス　マウ スの免疫原性が、第２図に示される。この図は、適切な修飾条件下で、うさぎ抗 体の免疫原性が基本的に消去され得ることを明示している。この実験中で試験さ れた修飾抗体は、完全な抗原結合活性を保持していた。修飾うさぎ抗体の、マウ ス中の免疫原性に対するｍＰＥＧ含有量の変化の効果が第３図に示される。同様 な結果が、第１次、第２次或いは、第３次の免疫化の後に見られ、これらの結果 は、塩化シアヌル酸処理法で製造したうさぎ抗体（例■）で見られるものと本質 的に同等のものである。塩化シアヌル酸で製造した誘導体と逆に。

この実験でテストした全てのうきぎ抗体が、完全な抗体活性を保持していたこと を強調すべきである。同様の結果が、抗−ヒト血清アルブミン抗体でも得られた 。

湾１；うさぎ抗体に対するマウス免　反、の評価Ａ　、ｍＰＥＧ−修飾　抗体に 対する反応がないことは、免疫的な許容量導入に、！：ることの可能性をなくす るために、スイス　マウスを、非免疫原性のｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ−修飾の抗体５０μ ｇで２回免疫化した。免疫化動物が７本発明に従い、ｍＰＥＧ′Ｔ′修飾された うさぎ抗体に対する反応がないことを１１１１定した後に、免疫動物及び、もと の参照動物に、修Ｓされていないうさぎ抗体５０１１ｇアリコートを注入した。

この注入後１２日口重マウス　抗−うさぎ免疫グロブリンを測定した。この実験 の結果は、第４図に示きれ、うさぎ抗体に対する２つの群の動物の反応に差がな かったことが示され、それは、ｍＰＥＧ−修飾の抗体は、実験動物を、寛容化（ 耐性化）も、ブライミング化もしないことを示唆している。

Ｂ、上記Ａで、ｍＰＥＧ−修飾のうさぎ抗体のいくつかにより導入された過応谷 性は、ＰＥＧの接合体特性を評価することにより研究された。スイス　マウスを 、存在ＰＥＧ濃度を１　ｍ　ｇ　／　ｍｌにまで変化さゼで、うさぎ免疫グロブ リン５０μ＆で免疫化し、１５日後に抗体反応性を測定した。この実験において 、ＰＥＧは、うきぎたんばく質に共有結合的に付若しなかった。その結果は（デ ータは示さず）、いかなる試料でも免疫原性に差異がないことを示し、ＰＥＧ自 体が接合体（アジュバント）でないことを示唆している。

Ａ、うさぎ抗−一ゴナルブミン抗体及び螢光体−標識の一］ナルブミンから製造 した免疫複合体の、ネズミ　マク１ゴフアージ　Ｐ２Ｓ５、Ｄ１細胞ラインに対 する結合性は、第５図に示される。これらのデータは、免疫複合体が、その集団 中のほとんどの細胞に結合するのは、濃度依存のものであることを示している。

この結合曲線は、免疫複合体が数種の抗原対抗体比率を用いて製造きれるときに 、著しく変化しなかった。

ｍＰＥＧ−修飾処理のＦｃ結合に対１″る効果を検査するために、免疫複合体の 濃度を、第５図の曲線から選択して、約７５％結合のものとし、この濃度を１次 の実験に用いた。第５図に説明したように、結合性実験を３本発明に従いｍＰＥ Ｇ−修飾抗体を用いて製造した免疫複合体で繰り返した。典型的な実験の結果を 第６図に示し、それは、２０％以下のアミン基がｍＰＥＧ−修飾されたとき、Ｆ ｃ結合を完全に抑制したことを示している。これらの実験で用いたｍＰＥＧ−修 飾の抗体は全て、競合する酵素−結合の免疫アッセイ中で測定して２その最初の 抗体活性を１００％維持していたことが強調されるべきである。異なるロットの ｍＰＥＧ−修飾の抗体から製造した免疫複合体を用いて、この実験を繰り返すと 、同様にＦｃ結合の抑制性が得られた。従って、免疫複合体にある抗体が活性エ ステル−媒介の反応物中で１５〜２０％のｍＰＥＧ−修飾のアミノ基を含むもの である場合、Ｆｃ結合性は、完全に抑制することができる。

Ｂ、更に、Ｆｃ結合のｍＰＥＧ−修飾処理の効果を調査するために、螢光体−修 飾のうさぎ抗−マウス　免疫グロブリン試料を、本発明に従いｍＰＥＧで修飾せ しめた。そして、この二重に修飾された試薬をマウス肺臓細胞でテストした。第 ７図は、マウス肺臓細胞に対する螢光化されたうさぎ抗体の滴定曲線を、ｍＰＥ Ｇ−修Ｓ処理の前及び後について、比較するものである。この図から９両方の試 薬とも、マウス肺臓細胞の検出には等しい感度を有すること（第７Ａ図）が分か る。然し乍ら、過剰の螢光化試薬を用いると、ｍＰＥＧ−修Ｓされた抗体により 検出きれた細胞は、細胞螢光強度に上限を有するようであり、それに対して、ｍ ＰＥＧ−修飾でない試薬により検出きれた細胞は、増大きれる螢光強度を示す（ 第７Ｂ図）。

Ｃ，’ｍＰＥＧ−修飾の試薬は、細胞表面免疫グロブリンに結合し、一方、非ｍ ＰＥＧ−修飾の試薬は、細胞表面Ｂ−ｃ（ｄｌ−容体に対する非特異性結合を有 することが、示きれていた。。（、発見を評価するために、精製マウス免疫グロ ブリンを使用し、マウス肺臓！Ｂ胞に対する両方の試薬の結合性を競合させて抑 制せしめた。この実験の結果は、第８図に示した。古典的な螢光化試薬（ｍＰＥ Ｇ−修飾のものでない）の結合性は、抗原により完全に抑制できなかったこと、 一方、ｍＰＥＧ−試薬の結合性は、完全に抑制されたことを明白に示している。

更に、マウス肺臓細胞に対するｍＰＥＧ−修飾の試薬の結合性を競合的に抑制す るに必要なマウス免疫グロブリンの量は、抑制できるようになるための理論的に 結合用に計算される（）のに基づいて予想される濃度に相当する。

Ｄ　、　ｂｆ、薬濃度を飽和する条件下で、古典的な試薬を用いて検出した細胞 は、ｍＰＥＧ−修飾の試薬を用いて検出した細胞より輝いているので、ｍＰＥＧ −修飾処理は、螢光体螢光を消光する可能性があった。この可能性を試験するた めに、螢光発光スペクトルを、うさぎ抗−゛７ウス　免疫グロブリン試薬につい て、ｍＰＥＧ−修１！＋５処理の前及び後に測定した。これらの発光スペクトル は、第９図に示される。ｍＰＥＧ−修飾処理の効果は１発光強度及びスペクトル のいずれにも見られない、これらのデータは、抗体を修飾するために実施例で使 用したｍＰＥＧの濃度において、ｐ！。

度の損失がないことを示唆している。

糀ス 本発明によるＰＥＧ−修飾　抗体は、著しく低減された免疫原性、細胞表面Ｆｃ 受受体体対する低い特異性結合能力、及び、抗原結合活性の保持を示すものであ る。抗体のｒｎ　Ｐ　Ｅ　Ｇ修飾処理も、また、Ｆｃ受容体結合を本質的に除去 する。うさぎ抗−コナルブミン抗体の１５％以上のアミン基がｍＰＥＧ″ｒｌ− 共有結合的に修飾聾れると、この抗体で製造された免疫複合体が、ネズミ　マク ロファージ細胞ライン、Ｐ３８Ｂ、ＤＩ上のＦｃ受容体に結合することを防ＩＦ −シた。同様の感受性が、ｍＰＥＧ−修飾された螢光体　標識の抗体にｎ泗きれ る。何故ならば、ｒｎＰＥＧ修Ｓ処理は、螢光体螢光を消失しないものであるか らである。螢光体標識のうさぎ抗−マウスの免疫グロブリンは、ｍＰＥＧ’″ｃ ′修１！′ｆｆ＋すれると、ネスミ　肺臓細胞Ｆｅ受容体に対する結合性が流動 血球計数による検出で検知さｔｌないものであ−）た、従って、ｍＰＥＧ−修飾 夕１理は、細胞及び組織染色１例λば、免疫組織化学処理に使用す−るＦｃ結合 をなくするための実際的な方法である。生体内でのＰＥＧ−修飾　たんばく質に 毒性がないことは、背景組織の結合を低１１するｔ−めの方法、並びに、ヒト中 の抗体の診断用及び治療用に」ｊける免疫原性を低減するための方法をも提供す るものであることを示唆している。

第２図 第４図 第Ｓ図 ％ｍＰＥＧ　’１％飾物 、２５　．５０　＋、０２．Ｏ屯０＆０第γ図 Ｐ９　免ルγＤプ゛す／ 第８図 第９図

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．カルボキシル化ポリエチレングリコールを，カルボキシル活性化剤と反応せ しめ，活性エステル中間体を形成せしめ，そして，該ポリエチレングリコール活 性エステル中間体をたんぱく質と反応せしめ，生物学的に活性なポリエチレング リコールーたんぱく質誘導体を形放せしめることによるたんぱく質のポリエチレ ングリコールによる共有結合的修飾方法。
2. ２．たんぱく質は抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項による方法。
3. ３．ポリエチレングリコールは，モノメトキシエチレングリコールであることを 特徴とする請求の範囲第１項による方法。
4. ４．ポリエチレングリコールは，モノメトキシエチレングリコールであることを 特徴とする請求の範囲第２項による方法。
5. ５．請求の範囲第１項によるポリエチレングリコールで共有結合的に修飾された たんぱく質。
6. ６．請求の範囲第１項によるポリエチレングりコールで共有結合的に修飾された 抗体。
7. ７．ポリエチレングリコールは，モノメトキシポリエチレングリコールであるこ とを特徴とする請求の範囲第５項によるたんはく質。
8. ８．該グリコールは，モノメトキシポリエチレングリコールであることを特徴と する請求の範囲第６項による抗体。
9. ９．請求の範囲第１項によるポリエチレングリコールにより修飾されたモノクロ ナール抗体。
10. １０．ポリエチレングリコールは，モノメトキシポリエチレングリコールである ことを特徴とする請求の範囲第９項によるモノクロナール抗体。
11. １１．請求の範囲第１項によるポリエチレングリコールにより共有結合的に修飾 された酵素。
12. １２．ポリエチレンは、モノメトキシポリエチレングリコールであることを特徴 とする請求の範囲編１１項による酵素。
13. １３．カルボキシル化されたポリエチレングリコールは，スクシニル化されたポ リエチレングリコールであり，カルボキシル活性化剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミドであることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。
14. １４．グリコールは，モノメトキシポリエチレングリコールであることを特徴と する請求の範囲第１３項の方法。
15. １５．たんぱく質は，抗体であり．修飾された抗体は，非修飾の抗体に比べて， 高められた生物学的特異性により特徴（特性）付けられることを特徴とする請求 の範囲第１３項の方法。
16. １６．請求の範囲第１項により抗体が修飾された，活性部分を有する抗体複合体 。
17. １７．該活性部分は，放射性核種，薬剤，毒素或いは，螢光試薬であることを特 徴とする請求の範囲第１６項の抗体複合体。
18. １８．抗体は，抗一腫瘍抗体であることを特徴とする請求の範囲第１７項の抗体 複合体。
19. １９．請求の範囲第１項により修飾された抗体を有する免疫組織化学法用の試薬 。
20. ２０．請求の範囲第１項により免疫グロブリンを修節することを特徴とする免疫 グロブリンのＦｃ結合活性を抑制する方法。
21. ２１．診断剤或いは．治療剤として，抗体或いは，その複合体が，免疫一反応中 に用いられ，請求の範囲第１項に従い修飾された抗体を，診断剤或いは．治療剤 として用いることを改良点とすることを特徴とするタイプの免疫学的な診断法或 いは，泊療法。
22. ２２．方法は，治療法であることを特徴とする請求の範囲第２１項の発明。
23. ２３．治療法が，がん化学療法或いは，放射線療法である請求の範囲第２２項の 方法。
24. ２４．方法が．診断法である請求の範囲第２１項の方法。
25. ２５．診断法が，腫瘍イメージング法である請求の範囲第２３項の方法。
26. ２６．診断法或いは，泊療法が，該抗体或いは，その複合体をヒトに投与するこ とを特徴とする請求の範囲第２１項の方法。
27. ２７．該抗体或いは，その複合体が，異型（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）の種の 抗体である請求の範囲第２６項の方法。
28. ２８．該抗体或いは，その複合体が，薬剤，放射性核種，毒素（トキシン），或 いは，螢光試薬であることを特徴とする請求の範囲第２１項の方法。
29. ２９．ポリエチレングリコール反応剤が，基本的に非一免疫原性であり，得られ た修飾たんぱく質は，基本的に非一毒性で，非一免疫原性であることを特徴とす る請求の範囲第１項の方法。
30. ３０．非修飾の抗体に比べて，低減された非一特異反応性と，高められた特異反 応性とを有する，ポリエチレングリコールで共有結合的に修飾された，生物学的 に活性な抗体。