EA002520B1 - Выделенное антитело и его фрагмент, способы и набор для оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце и способ диагностики заболеваний, обусловленных перекисным окислением липидов - Google Patents

Abstract

Предложены способ и набор для диагностики и количественного определения состояния окисления и, более конкретно, уровня перекисного окисления липидов в организме хозяина, который включает осуществление контакта биологического образца хозяина с антителом к антигену, образующемуся в реакции гидроперекиси липида с первичным амином. Способ позволяет оценить риск или существование окислительного повреждения организма хозяина. Настоящее изобретение включает также моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты антител необязательно в очищенной и выделенной форме, которые можно использовать в рассматриваемом способе и наборе.

Description

Настоящее изобретение относится к области воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, а также к способам их диагностики.

Целый ряд заболеваний связан с окислительным стрессом. Продуктом окислительного стресса является переокисленный липид, который, по-видимому, служит медиатором вызванного окислением заболевания. Образование перекисей липидов в биологических системах является сложным процессом, который может происходить различными способами, например, за счет ферментов (включая липооксигеназы, циклооксигеназы, пероксидазы и другие оксигеназы), а также неферментативно, например, за счет образования внутриклеточных, внеклеточных или расположенных на поверхности клеток реакционноспособных кислородных соединений. Окисленные липиды клеточной мембраны и внеклеточной среды могут вызвать основательные изменения в поведении клетки. Вредное действие перекисных липидов и их продуктов разложения хорошо известно в патогенезе атеросклероза (НейиаПа е! а1., 1оитпа1 о£ Сйшса1 1иуе8Йда!юи, 84:1086-1095 (1989); Ооиеи е! а1., Л1йего8с1его8к, 65:265-272 (1987); и 1игдеи8 е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Ас!а, 875:104-114 (1986)).

В настоящее время окисление признано потенциальным фактором риска для возникновения сердечно-сосудистых заболеваний (Ра11и§к1 е! а1., АШетоксктокк, 10:325-335 (1990)). Так как окисление липидов связано с воспалительными состояниями и сердечно-сосудистыми заболеваниями, для медицины важным является наличие надежного теста, позволяющего количественно определить и оценить степень окисления липидов в организме хозяина и, в частности, человека.

Количественное определение гидроперекисей липидов в организме хозяина может быть основано на непосредственном измерении гидроперекиси или на определении продуктов реакции или разложения гидроперекиси. Полиненасыщенные жирные кислоты (РИЕАк) содержат, по крайней мере, две двойные связи, а 15-20% из них содержат три или более двойных связей. Встречающиеся в природе ненасыщенные жирные кислоты никогда не бывают сопряженными; двойные связи в них разделены, по крайней мере, одной метиленовой группой. Во время процесса окисления в гидроперекиси липидов двойные связи РИГА могут стать сопряженными, что является одной из основных схем повреждающего окисления. Начальные продукты окисления РИГА, по-видимому, являются гидроперекисями липидов (ЬООН) и свободными радикалами гидроперекисей липидов (ЬООН· или ЬОО·), причем большинство из них изменилось таким образом, что они содержат сопряженные двойные связи. Эти продукты или продукты их последующих реакций, или продукты разложения были использованы для анализа степени окисления липидов в биологических образцах.

Так например, ЬООН можно восстановить ίη у1уо до спирта ЬОН, который является инертным. ЬОН можно определить любым из способов, в котором анализируется спирт, и если ЬОН конъюгирован, любым способом, в котором определяется сопряжение двойных связей. Ни один из этих тестов не является чрезвычайно специфичным, однако, так как речь идет о биологическом образце, возможно наличие любого количества спиртов или молекул с сопряженными двойными связями.

В другом варианте ЬООН может быть окислен металлом ίη у1уо с образованием радикала по двойной связи (ЬООН·), который является чрезвычайно реакционноспособным соединением. Такая молекула часто разлагается по месту окисления с образованием альдегидсодержащих фрагментов или, если она не разлагается, она часто образует кетон. Молекула может разделиться на несимметричные части и, если ЬООН содержит более двух двойных связей, она может привести к образованию различных продуктов. Если в ЬООН содержится три или более двойных связей, одним из продуктов разложения является малондиальдегид. Присутствие малондиальдегида можно определить с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТВА), которая реагирует с МДА с образованием флуоресцентного соединения, присутствие которого можно легко определить и измерить количественно. ТВА-реакционноспособные вещества обозначают как ТВАКк. Тест ТВА не подходит для использования в качестве диагностического теста для определения состояния окисления липидов хозяина, так как он может фальсифицировать положительные результаты, учитывая другие альдегиды, сахара и аминокислоты. Тест этот подходит только для исследовательских целей при использовании тщательно контролируемых образцов. Далее, он только измеряет количество перекисей липидов, которые содержат три или более двойные связи.

Другим способом измерения ЬООН в образцах является реакция их непосредственно с иодидом калия с образованием окрашенного комплекса (1₂)К1, который можно легко измерить и определить количественно. Усовершенствование этого теста предусматривает использование лейкометилена синего, который реагирует с ЬООН с образованием окрашенного продукта. Материалы для такого анализа продаются Каш1уа Вюшебюа1 Сотрапу. Подобно способу ТВА, этот способ пригоден только для анализа лабораторных образцов и не может быть использован для анализа биологических жидкостей или клеточных культур, которые могут содержать множество перекрестнореакционноспособных веществ.

Образовавшиеся при реакции окисления липидов альдегиды реагируют с жидкостями и тканями организма. Эти альдегиды легко модифицируют протеинтиолы, лизин, гистидин и другие остатки (1шдеп8 е! а1., Вюсйетка1 1оигпа1, 265:605-608 (1990); 1еккир. ВюсЬетса1 1оигиа1, 234:245-248 (1986); 81ешЬгесйег е! а1., 1. И1р1б Век., 25:1109-1116 (1984)). Такие модифицированные альдегидами протеины являются антигенными. Антитела к таким эпитопам, как было показано, представляют мощный инструмент для определения и локализации модифицированных альдегидом протеинов в атеросклеротических артериях (Воуб, Ат. 1. Ра11ю1.. 135:815-825 (1989); НаЬег1аиб е! а1., 8с1еисе, 241:215-218 (1988); 1игдеик, А1йегокс1ег. Тйгот., 13:1689-1699 (1993)). Однако у здорового или даже у пациента с атеросклерозом протеиновые антигены, модифицированные альдегидами, обычно нельзя обнаружить в плазме, а только лишь в малых количествах в ткани.

Так как гидроперекиси липидов не существуют ίη у1уо в течение длительного времени из-за своей природной нестабильности, а образующиеся альдегиды представляют лишь один из путей метаболического разложения ЬООН и для их образования необходимо время, продукты реакций короткоживущих ЬООН с соседними соединениями могут присутствовать в гораздо больших количествах, нежели альдегиды, и могут представлять привлекательные диагностические мишени. Так например, перекиси липидов высоко реактивны с аминогруппами протеинов, липидов и липофильных молекул. Их тесная близость с мембранными протеинами и апопротеинами липопротеинов предполагает возможность того, что эти модификации могут быть более уместны в биологических системах, нежели альдегидами индуцированные модификации. Образование ЬООН на клеточной мембране или липопротеине, по-видимому, более вероятно создает, по крайней мере, на начальных стадиях протеины, которые непосредственно модифицированы ЬООН, нежели протеины, которые модифицированы их продуктами экстенсивного разложения, такими как альдегиды. РгиеЬ1к, РагЙакагаНу и 81ешЬегд в 1992г опубликовали доказательство предположения, что согласованная реакция происходит между перекисными радикалами липидов и свободными аминогруппами полипептидов или фосфатидилэтаноламина с образованием флуоресцирующих аддуктов неизвестной структуры. Ргос. Иаб. Асаб. 8с1. И8А, 89:10588-10592 (1992). РгиеЬ1к с сотр. инкубировали гидроперекись линолеоила с полипептидами и с одним ненасыщенным фосфатидилэтаноламином в отсутствии ионов металла. Образование флуоресцирующих продуктов оказалось во много раз сильнее, нежели в случае образования их при инкубировании полипептидов или фосфатидилэтаноламина с альдегидом, 4-гидрокси ноненалом (который приводит к образованию флуоресцирующих оснований Шиффа). РгиеЬ1к с сотр. предположили наличие двух возможных схем реакции, причем в обоих случаях инициирование происходит за счет взаимодействия свободной аминогруппы с перекисным радикалом. Теоретические схемы реакций предполагают образование пяти-, шести- или семичленных циклических структур. В статье нет предположений об активности этих гипотетических структур, а также нет реальной идентификации таких предполагаемых структур ίη у1уо.

В РСТ/И895/05880, поданной Итогу Итуег511у. раскрывается, что полиненасыщенные жирные кислоты (РИРАк) и их гидроперекиси (ох-БИРАк) вызывают экспрессию адгезионных молекул УСАМ-1 эндотелиальных клеток поверхности, но не внутриклеточных адгезионных молекул (1САМ-1) или Е-селектина в эндотелиальных клетках аорты у человека, за счет механизма, медиаторами которого не являются цитокины или другие нецитокинные сигналы. Более конкретно, раскрыто, что линолевая кислота, арахноидоновая кислота, гидроперекись линолеила и арахидоновая гидроперекись индуцируют экспрессию клеточной поверхности УСАМ-1, но не 1САМ-1 или Е-селектин. Насыщенные жирные кислоты (такие как стеариновая кислота) и мононеасыщенные жирные кислоты (такие как олеиновая кислота) не индуцируют экспрессию УСАМ-1, 1САМ-1 или Еселектина. Сообщалось также, что индуцирование УСАМ-1 за счет РИРАк и их гидроперекисей жирных кислот подавляется дитиокарбаматами, включая пирролидиндитиокарбамат (РИТС), что подкрепляет вывод о том, что индуцирование опосредствовано окисленной сигнальной молекулой и что индуцирование предотвращается, если окисление этой молекулы блокировано, полностью изменено, или если каким-либо другим образом предотвращено взаимодействие окислительно-восстановительного модифицированного сигнала с его регуляторной мишенью.

РСТ/И8 93/10496, также поданная Итогу ип1уегк11у, раскрывает, что дитиокарбоксилаты, и особенно дитиокарбаматы, блокируют индуцированную экспрессию адгезионных молекул УСАМ-1 эндотелиальной клеточной поверхности и поэтому могут использоваться при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклерозы, рестенозы после ангиопластики, болезни коронарных артерий и стенокардию, а также не сердечно-сосудистые воспалительные заболевания, медиаторами которых служат УСАМ-1.

Целью настоящего изобретения является создание способа и набора для определения состояния переокисления липидов у пациента, как средства оценки риска возникновения у пациента заболевания, вызванного окислением.

Другой целью настоящего изобретения является создание коммерчески ценного способа и набора для оценки состояния переокисления липидов у пациента.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа и набора для оценки состояния переокисления липидов у пациента, как средства для оценки терапевтической эффективности медикаментозного лечения заболеваний, вызванных окислением. Еще одной целью изобретения является создание набора для диагностики и количественной оценки состояния переокисления липидов у пациента.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание материалов, которые можно использовать для диагностики и количественной оценки состояния переокисления липидов у пациента.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа оценки способности предполагаемого лекарства понижать состояние переокисления липидов у пациента.

Еще одной целью настоящего изобретения является идентификация и предложение новых медиаторов клеточных реакций.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение новых терапевтических агентов и способов опосредствованного воздействия на воспалительные реакции.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание агентов и способов для идентификации и количественного определения воспалительных нарушений.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа и набора для определения аутоантител в плазме пациентов с заболеваниями, которые препятствуют выработке аутоантител, включая эндометриозы.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое взаимодействует с антигеном, образовавшимся в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, и при этом в какой-либо значительной степени не связывается с альдегид-модифицированным белком, или его фрагменту.

Настоящее изобретение также относится к способу оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, заключающемуся в том, что обеспечивают взаимодействие образца с указанным антителом или его фрагментом и определяют наличие комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного окисления липидов.

Настоящее изобретение также относится к способу оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, заключающемуся в том, что обеспечивают контактирование образца с антителом или его фрагментом или их конъюгатом, которые перекрестно связываются с указанным антителом или его фрагментом, и определяют наличие комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного окисления липидов.

Настоящее изобретение также относится к набору для оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце, содержащему указанное антитело или его фрагмент.

Настоящее изобретение также относится к способу диагностики заболеваний, обусловленных перекисным окислением липидов, заключающемуся в том, что осуществляют оценку уровня перекисного окисления липидов в полученном от пациента биологическом образце в соответствии с описанными выше способами.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет в виде прямоугольников диаграмму распознавания альбумина кроличьей сыворотки и альбумина кроличьей сыворотки, модифицированного гидроперекисью липида, антителом примера 4; по оси абсцисс отложены нг протеина, а по оси ординат - оптические плотности, измеренные на 405 нм.

Фиг. 2 представляет в виде прямоугольников диаграмму распознавания оксисленныхЕОЬ антителом примера 4, как единицы оптической плотности в зависимости от концентрации в мкг.

Фиг. 3 представляет график дозозависимого индуцирования УСАМ-1 (А) и

1САМ-1 (В) за счет оксиленного альбумина бычьей сыворотки, выраженное как процент максимального ΤΝΡ-α индуцированного сигнала.

Фиг. 4 представляет схематичную диаграмму крупномасштабного синтеза 13-ΗρΘΌΕ модифицированного оксикина, использующего систему образования перекиси липидов. Мишеневый протеин помещают в мембрану с отсечением 10 кДа, и 13-ΗρΘΌΕ вырабатывающую систему заменяют каждые 8-16 ч.

Фиг. 5 представляет диаграмму Вестернблоттинга, которая демонстрирует, что §ЬО и линолевая кислота являются минимальными требованиями для образования ох8ЬО.

Фиг. 6 представляет диаграмму Вестернблоттинга, которая демонстрирует определение иммунореактивных 13-ΗρΟΌΕ обработанных образцов после 96 ч в крупномасштабной реакции.

Фиг. 7 представляет график индуцирования 1САМ-1 за счет 13-ΗρΟΌΕ, обработанных &ЬО, как процент от ΤΝΕ индуцирования во времени.

Фиг. 8 представляет ИРЬС хроматограмму, которая показывает, что 13-ΗρΟΌΕ, модифицированные кЬО, более гидрофобны, нежели необработанные кЬО.

Фиг. 9 представляет график индуцирования 1САМ-1 фракциями ох8ЬО, собранными с помощью гель-фильтрационной хроматографии. На графике видно, что десятая фракция наиболее сильно индуцирует 1САМ-1.

Фиг. 10 представляет график поглощения (на 280 нм) в зависимости от фракций охБЬО, полученных с помощью гель-фильтрационной хроматографии, на котором видно, что фракции 9 и 10 включают лишь часть полного количества протеина, разделенного с помощью гельфильтрационной хроматографии.

Фиг. 11 представляет график в виде прямоугольников индуцирования 1САМ-1 соевой липооксигеназой, линолевой кислотой и окисленной соевой липооксигеназой в виде процента индуцирования 1САМ за счет ΤΝΓ.

Фиг. 12 представляет диаграмму (в виде прямоугольников) индуцирования 1САМ-1 (как функцию процента индуцирования за счет ΤΝΓ) соевой липооксигеназой и окисленной соевой липооксигеназой, синтезированной крупномасшабным способом в эндотелиальных клетках аорты человека (НАЕС).

Фиг. 13 представляет диаграмму (в виде прямоугольников) индуцирования 1САМ-1 (как функцию процента индуцирования за счет ΤΝΕ) соевой липооксигеназой и окисленной соевой липооксигеназой, на которой видно, что охБЬО активирует экспрессию 1САМ поверхности клеток зависимым от дозы образом.

Фиг. 14 представляет диаграмму (в виде прямоугольников) индуцирования 1САМ-1 (как функцию процента индуцирования за счет ΤΝΕ) окисленной соевой липооксигеназой. На графике видно, что охБЬО индуцирует 1САМ в большей степени, нежели УСАМ.

Фиг. 15 представляет результаты Норзернблоттинга, из которых видно, что именно охБЬО, а не 8ЬО, индуцирует накопление УСАМ, 1САМ и МСР-1 мРНК в эндотелиальных клетках аорты человека (НАЕС).

Фиг. 16 представляет результаты Норзернблоттинга, из которых видно быстрое накопление УСАМ, 1САМ и МСР-1 в эндотелиальных клетках.

Подробное описание изобретения

1. Способ оценки окислительного состояния организма хозяина.

А. Выработка антитела (1) Гидроперекись липида

Липид нерастворим в воде и представляет собой маслянистое или жирное вещество, которое экстрагируется из клеток и тканей такими неполярными растворителями, как хлороформ и эфир. Наиболее распространенной формой липидов является триацилглицерин. Жирные кислоты являются характерными строительными блоками липидов. Жирная кислота представляет собой длинноцепочечную органическую карбоновую кислоту, которая обычно содержит от четырех до двадцати четырех атомов углерода. Жирные кислоты обычно не существуют в свободном виде или, если они не включены в клет ки или ткани, напротив, они связаны в крупные молекулы, такие как липопротеин, альбумин, триацилглицерин, воск, фосфоглицериды (например, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, или кардиолипин), сфинголипид (например, сфингомиелин, цереброзиды или ганглиозиды) или стерин и его сложные эфиры жирных кислот. Такие материалы, под общим названием цероиды и липофусцины, включают жирные кислоты.

В том смысле, как здесь использован, термин полиненасыщенная жирная кислота (РИГА) относится к жирной кислоте (обычно С8-С24), которая содержит, по крайней мере, две алкенильные связи и включает, (но не ограничивается ими) линолевую (С1₈А), линоленовую (С1₉А), арахидоновую (С₂₀А) и эйкозатриеновую (С₂₀А) кислоты. Гидроперекись липида, в том смысле, как этот термин использован здесь, относится к

1. (1) полиненасыщенной жирной кислоте; или (й) к молекуле, которая содержит остаток полиненасыщенной жирной кислоты;

2. в которой, по крайней мере, одна из алкенильных связей была превращена в гидроперекись.

Нелимитирующими примерами гидроперекисей липидов являются

15-НРЕТЕ

'ООН

13-НРООЕ

ООН

Гидроперекиси липидов можно получить ίη νίνο ферментативно из полиненасыщенных жирных кислот или липидов, содержащих РИГА остаток, с помощью липооксигеназы, циклооксигеназы, пероксидазы или других оксигеназных ферментов, а также неферментативными способами за счет создания внутриклеточных, внеклеточных или расположенных на поверхности клеток реактивных кислородных соединений. Перекиси липидов можно получить химически с помощью окисления полиненасыщенной жирной кислоты или липид-содержащего РИГА остатка, используя стандартные способы.

По-видимому, для создания антитела, которое реагирует с выбранным амином с образованием эпитопа, можно использовать различные гидроперекиси липидов. По-видимому, такая реакция совершенно неселективна; фактически, любая гидроперекись липида будет реагировать антигенно с первичным амином.

(ίί) Первичный амин

Для осуществления взаимодействия с перекисью липида, которая образует антигенный материал, можно использовать любой первичный амин. Было обнаружено, что чем более гидрофобен и нуклеофилен амин, тем легче идет реакция. Так например, бензиламин реагирует с гидроперекисью липида более быстро, нежели этиламин. На этом основании, такие небольшие амины, как С1-С₃алкиламины, и аммиак нежелательно использовать. Для введения хозяину предпочтительным амином является такой амин, который демонстрирует слабую токсичность либо один, либо после реакции с гидроперекисью липида. Такой амин может быть присоединен к более крупной молекуле, например к гаптену, при желании, для усиления антигенной реакции.

Предпочтительны синтетические варианты встречающихся в природе молекул, содержащих первичные амины, таких как пептиды и протеины.

Примеры включают такие пептиды или протеины, которые содержат концевую аминогруппу, лизиновый остаток (например, альбумин и полилизин) или гистидиновый остаток.

Можно также использовать фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и гормоны с концевыми аминами.

То, что реакция гидроперекиси липида и протеинов в природе происходит ίη νινο, демонстрируется тем фактом, что такие коммерчески доступные протеины, как альбумин бычьей сыворотки, содержат эпитоп гидроперекиси липида/амина. Поэтому предпочтительно использовать синтетический пептид или протеин для получения антигена и, в конечном счете, антитела для целей качественного контроля.

(ш) Реакция гидроперекиси липида с первичным амином

Способность гидроперекиси липида реагировать с протеином была продемонстрирована ЕгиеЬ18, РаййакагаШу и 81с1пЬсгд ίη Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, Уо1.89, рр.10588-10592, ^ешЬег 1992, Меб1са1 8с1епсе5. В этой статье описывается получение гидроперекиси липида с помощью реакции линолевой кислоты или фосфолипида линолевой кислоты с соевой липооксигеназой, а затем эту гидроперекись инкубируют с полипептидами без ионов металлов. Общий подход и условия эксперимента, изложенные в этой статье, можно использовать для получения широкого круга аддуктов гидроперекиси липида и амина.

Химическая реакция между гидроперекисью липида и первичным амином может быть осуществлена в лаборатории или на фабрикеизготовителе, при комнатной температуре, при нейтральных или близких к нейтральным значениях рН, которые симулируют ίη νινο условия. Предпочтительны водные условия, однако, реакция может протекать в органическом растворителе, если реагенты и продукт достаточно растворимы в органике. ЬООН может быть менее стабильна в органическим растворителе, нежели в водном растворителе. При желании можно повысить температуру реакции, вплоть до температуры кипения растворителя. За ходом реакции можно следить с помощью флуоресцентной спектрометрии. Возбуждение продукта обычно происходит в интервале от 330 до 360 нм, а эмиссия наблюдается в интервале от 420 до 450 нм. Реакция завершается, когда интенсивность флуоресценции образца больше не повышается. В условиях обычной реакции гидроперекись липида и амин присутствуют в отношении, примерно, 1,5:1, однако, при желании, можно использовать и другие отношения для оптимизации выхода или для других целей.

(ίν) Выработка и использование антител

Способ и набор для оценки состояния переокисления липида в организме хозяина может включать либо моноклональные и поликлональные антитела, либо фрагменты антител.

Термин антитело в том смысле, как здесь использован, включает моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты антител, которые связываются специфически, но обратимо, с нужным эпитопом. Предпочтительно, чтобы антитело или фрагмент антитела были получены из моноклонального антитела или фрагмента антитела. Получение моноклональных или поликлональных антител к антигену, полученному в реакции гидроперекиси липида с первичным амином, можно обеспечить, используя любой известный способ, например те, которые раскрыты у Ζοΐα, Н. (1988) Мопос1опа1 АпйЬоб1е8 - А тапиа1 о! 1ес11пк.|ие5 СКС Рге§8 апб АпИЬоб1е8: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Наг1о\у & Ьапе; Со1б 8рппд НагЬог (1988) (включено сюда по ссылке).

В одном из вариантов, преимущественно для лабораторного использования, животных иммунизовали антигеном и, предпочтительно, адъювантом. Бустерные иммунизации необязательно продолжали антигеном в РВ8 и смешанным с адъювантом с периодическими интервалами. Затем у животных брали кровь после иммунизаций. После удаления сгустков и частиц сыворотку можно было анализировать с помощью ЕЬ18А. Ежемесячно, или с другими интервалами, титры можно получать после начальной иммунизации.

В другом варианте у животных забирают селезенки: у тех животных, которые были иммунизованы антигеном и, предпочтительно, адъювантом. Клетки селезенки выделяют и гибридизуют с бессмертными миеломными клетками, используя полиэтиленгликоль. Гибридизованные гибридомные клетки отбирают и культивируют 1п νίΙΐΌ. Культуральные жидкости гибридомных клеток тестируют на наличие гибридомных антител с нужной специфичностью. Методика отбора для идентификации подходящего моноклонального или поликлонального антитела является важным аспектом достижения нужной иммуноспецифичности. Гибридомные клетки можно тестировать на присутствие антител, специфичных для антигена, например, с помощью ЕЬ18А, проводимого стандартными способами.

Обычно, если продукт выбранной гидроперекиси липида и выбранного амина содержит антиген с одним эпитопом, этот антиген будет выявлять получение моноклонального или поликлонального антитела. Если же используют множество антигенов или антиген с множеством эпитопов, будет получено поликлональное антитело. Так например, если ЬООН реагирует с альбумином сыворотки, получают антиген с множеством эпитопов, так как альбумин содержит ряд лизиновых остатков в различных участках молекулы. Такой антиген выявит продуцирование поликлональных антител. Если, напротив, используют продукт реакции простого амина с ЬООН в качестве антигена, тогда антиген может вызвать образование моноклонального или поликлонального антител. Так например, если выбирают фосфатидилэтаноламин, который содержит ненасыщенный липидный фрагмент, он может действовать и как липидная компонента и как компонента амина. Такая компонента может вызвать продуцирование моноклональных или поликлональных антител.

Наблюдалось, что протеины из нормальных источников могут содержать небольшое количество ЬООН/амин антигена. Из-за этого, для целей качественного контроля, предпочтительно подвергать взаимодействию синтетический пептид или синтетическую аминсодержащую молекулу с ЬООН для образования антигена для получения антител.

Вариабельные тяжелые (У_Н) и вариабельные легкие (У_ь) домены антитела участвуют в распознавании антигена, факт, который впервые был обнаружен в ранних экспериментах протеазного переваривания. Первое подтверждение было обнаружено при гуманизации антител грызунов. Вариабельные домены, полученные от грызунов, можно гибридизовать с постоянными доменами человеческого происхождения таким образом, что полученное антитело сохраняет антигенную специфичность антитела грызуна (Мопкоп е! а1., (1984), Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8Л, 81, 6851-6855). СИВ трансплантацию можно использовать для гуманизации антител грызунов. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантные моноклональные антитела можно приматизировать, то есть получить антитела, в которых вариабельные участки получены от двух различных видов приматов, предпочтительно вариабельные участки антитела от обезьяны макаки, а постоянные участки от человека. Преимущества таких антител включают высокую гомологичность с иммуноглобулином человека, присутствие эффекторных функций человека, пониженную иммуногенность и длительный срок полураспада сыворотки (Иетешаи е! а1., (1992) Вю!есйпо1оду, 10,

1455).

Участок, специфичный для антигена, можно экспрессировать как часть бактериофага, например, используя способ МсСаГГейу е! а1., (1990) Иа!иге, 348:552-554. Похожие на антитела молекулы настоящего изобретения можно выбрать из фаговых библиотек, используя способы, раскрытые у бпГГИЬз е! а1., (1993) ЕМВО 1., 12, 725-734, когда антигены иммобилизованы и их используют для отбора фагов. Кроме того, для связывания фагов можно использовать подходящие клетки, выращенные в монослоях и либо фиксированные формальдегидом или глутаральдегидом, либо нефиксированные. Ненужные фаги смывают, а связанные фаги выделяют, разрушая их связывание с антигеном и реамплифицируя в бактерии. Такой процесс отбора и амплификации осуществляют несколько раз для обогащения популяции фагов для тех молекул, которые представляют собой похожие на антитела молекулы настоящего изобретения.

Фрагменты антител включают ЕаЬподобные молекулы (Ве!!ег е! а1., (1988) 8с1еисе, 240, 1041); Ε_ν молекулы (8кетга е! а1., (1988) 8аепсе, 240, 1038); Одноцепочечные Ε_ν (8сЕД молекулы, в которых У_Н и У_ъ партнерные домены, связаны гибким олигопептидом (Впб е! а1., (1988) 8с1епсе, 242, 423; Нийоп е! а1., (1988) Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 85, 5879) и антитела с одним доменом (бАЬ§), включающие выделенные У домены (\Уагб е! а1., (1989) Иа!иге, 341, 544). Общий обзор методик, применяемых для синтеза фрагментов антител, которые сохраняют свои специфические сайты связывания, можно найти у \Уш1ег & МПйеш. (1991), Иа!иге 349, 293-299.

Фрагменты антител включают (но ими не ограничиваются) ЕаЬ, (ЕаЬ)₂, Εν, 8сЕу и бАЬ фрагменты - фрагменты, которые включены в настоящее изобретение. Подобные антителам молекулы можно получить, используя методики рекомбинантных ДНК в соответствии с \¥О 84/03712.

Может оказаться выгодным использовать скорее фрагменты антител, а не целые антитела. ЕаЬ, Εν, 8сΕν и бАЬ фрагменты антител все можно экспрессировать в и секретировать из Е. со11, тем самым обеспечивая облегченное продуцирование больших количеств фрагментов.

Целые антитела и Е(аЬ')₂ фрагменты являются бивалентными. Под термином бивалентный подразумевают, что антитела и Е(аЬ')₂ фрагменты имеют два антигеновых объединяющих сайта. Напротив, ЕаЬ, Εν, 8сΕν и бАЬ фрагменты являются одновалентными и содержат только один антигеновый объединяющий сайт.

Искусство конструирования антител быстро развивается, как раскрыто у Тап Ь.К. апб

Мотлкоп 8.Ь., (1988) Абν. Эгид ИеНу. Кем.,

2:129-142; МШатз О. (1988) Т1Ь!есй 6:36-42 и ЫеиЬегдег М.8. е! а1., (1988) 8(Н 1п!етпайопа1 В1о!есйпо1оду 8утрозшт Рай 2, 792-799 (все включены сюда для ссылки) и хорошо приспособлено для получения антитело-подобных молекул, полученных из антител настоящего изобретения.

Антитела можно использовать для различных целей, относящихся к исследованию, локализации, выделению и очистке антигена, с которым они специфически связываются. В частно сти, антитело можно использовать для визуализации и обработки клеток, демонстрирующих антиген. Антитело настоящего изобретения можно объединить со сцинтиграфической радиометкой, радиоизотопом, сердечнососудистым, противовоспалительным или каким-либо другим лекарством, ферментом, превращающим пролекарство в сердечнососудистое, противовоспалительное или какоелибо другое необходимое лекарство, наряду с пролекарством, или другим соединением, которое является медиатором клеточного процесса. Такие конъюгаты содержат связывающий участок, который состоит из антитела настоящего изобретения, и функциональный участок, который состоит из радиометки, лекарства или фермента и т.п. Связывающий участок и функциональный участок могут быть разделены связывающим фрагментом.

Связывающий участок и функциональный участок конъюгата (также пептида или полипептида) могут быть связаны друг с другом любым из обычных способов сшивания полипептидов, например таких, которые раскрыты у О'8и1йуап е! а1., (1979) Апа1. Вюсйет., 100, 100108. Так например, один участок может быть обогащен тиольными группами, а другая часть может прореагировать с бифункциональным агентом, способным реагировать с этими тиольными группами, например Ν-гидроксисукцинимидным сложным эфиром или иодоуксусной кислотой (ΝΗΙΑ), или Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионатом (8ΡΌΡ). Амидные и тиоэфирные связи, например, образуются за счет м-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидного сложного эфира и обычно более стабильны ш у1уо, нежели дисульфидные связи.

В другом варианте, если связывающая часть содержит углеводы, как это бывает в случае антител или некоторых фрагментов антител, функциональная часть может быть связана через углеводную часть с использованием способов связывания, изложенных в ЕР 0 088695.

Функциональная часть конъюгата может быть ферментом для превращения пролекарства в лекарство с использованием способа, аналогичного способу, описанному Вадзйатее и его коллегами Вадзйатее е! а1., (1987) Вт.! Сапсег 56,

531; Вадзйатее е! а1., (1988) Вг. 1. Сапсег 58, 700;

МО 88/07378.

Может оказаться вовсе необязательным, чтобы весь фермент присутствовал в конъюгате, но, естественно, должна присутствовать его каталитическая часть. Можно использовать так называемые абзимы, в которых моноклональное антитело выработано против соединения, участвующего в реакции, которую нужно катализовать, обычно реакционно промежуточное состояние. Затем полученное антитело будет функционировать как фермент для реакции.

Конъюгат можно выделить с помощью афинной хроматографии или хроматографии с исключением по размерам и протестировать на двойственные биологические активности. Иммунореактивность антигена можно измерить, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ЕБ18А) с иммобилизованным антигеном и в радиоиммуноанализе в живых клетках. Ферментный анализ можно использовать для βглюкозидазы, используя субстрат, поглощение которого меняется по мере гидролиза глюкозных остатков, так, например, о№С (онитрофенил-в-О-глюкопиранозид), высвобождает 2-нитрофенол, который можно измерить спектрометрически на длине волны 405 нм.

Стабильность конъюгата можно протестировать ш уйго, инкубируя вначале при 37°С в сыворотке, а затем используя для анализа высокоэффективную жидкостную хроматографию с исключением по размерам.

Стабильность конъюгата ш у1уо можно тестировать аналогичным способом, анализируя сыворотку мышей в различные моменты времени после инъекций конъюгата. Кроме того, можно ввести в антитело радиометку ¹²⁵1, и в фермент ¹³¹1 до конъюгации и определить биораспределение конъюгата, свободного антитела и свободного фермента в мыши.

В другом варианте конъюгат можно получить в виде гибридного соединения с помощью рекомбинантной техники, когда длина ДНК включает соответствующие участки, кодирующие две части конъюгата, либо расположенные рядом, либо разделенные участком, кодирующим линкерный пептид, который не нарушает желательных функций конъюгата. Понятно, что две функциональные части соединения могут перекрываться полностью или частично. Затем ДНК экспрессируют в подходящего хозяина известными способами.

Полученные антитела или их конъюгаты можно вводить любыми подходящими способами, обычно парэнтерально, например, внутривенно или внутрибрюшинно, в виде стандартных стерильных непирогенных композиций с разбавителями и носителями, например, в изотоническом физиологическом растворе (при внутривенном введении). После того, как конъюгат связан с мишеневыми клетками и очищен от потока крови (при необходимости), что обычно занимает день или около этого, можно вводить лекарство, обычно в виде одноразового вливания дозы, или целевой участок можно визуализировать. При необходимости, так как конъюгат может быть иммуногенным, можно вводить циклоспорин или некоторые другие иммуносупрессанты для обеспечения более длительного периода обработки, но обычно этого не требуется.

Промежуток времени между введением конъюгата и пролекарства можно оптимизировать неинвентивным способом, так как отношения больная ткань/здоровая ткань конъюгата (по крайней мере, после внутривенного введения) выше после нескольких дней, тогда как к этому моменту абсолютное количество конъюгата, связанного с мишеневой тканью, выраженное в процентах от введенной дозы в граммах, будет ниже, нежели в начальные моменты времени. Поэтому, оптимальный интервал между введением конъюгата и пролекарства будет компромиссом между пиковой концентрацией в ткани антитела/фермента и наилучшим распределением отношения между поврежденной и нормальной тканями. Дозу конъюгата должен выбирать врач в соответствии с обычными критериями. Дозу любого конъюгата следует выбирать в соответствии с нормальными критериями, особенно принимая во внимание тип, состояние и локализацию мишеневой ткани, и вес пациента. Длительность лечения будет зависеть частично от скорости и длительности любой иммунной реакции на конъюгат.

Функциональная часть конъюгата, если конъюгат используют для диагностики воспалений, обычно включает и может состоять из радиоактивного атома для сцинтиграфических исследований, например, может быть использован технеций 99м (^99мТс) или иод-123 (¹²³1), или может быть введена метка для получения изображения методом ядерного магнитного резонанса, например: иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

При использовании в конъюгате для селективного разрушения ткани функциональная часть может содержать такие высокорадиоактивные атомы, как иод-131, рений-186, рений188, иттрий-90 или свинец-212, которые выделяют достаточно энергии для разрушения соседних клеток. Радио- или другие метки можно включить в конъюгат известными способами. Так например, метку можно синтезировать, используя подходящие реагенты, которые содержат, например, фтор-1 9 вместо водорода. Такие метки, как ^99мТс, ¹²³1, ¹⁸⁶ВЬ, ¹⁸⁸Вй и ^ш1и, можно присоединить с помощью пептидов цистеинового остатка. Иттрий-90 можно присоединить через лизиновый остаткок. Способ ΙΘΌΘΟΕΝ (Етакет е1 а1., (1978) Вшсйет. Вюрйук. Век. Соттип., 80:49-57) можно использовать для включения иода-123. Остальные способы подробно описаны в Мопос1опа1 ЛпбЬоФек ίη 1ттипоксшбдгарйу (СНа1а1. СВС Ргекк 1989).

В. Способ детектирования антигена

Настоящее изобретение включает способ детектирования антигена, образуемого в реакции гидроперекиси липида с первичным амином. Этот тест можно осуществить на лабораторном образце или на биологическом образце. В том смысле, как здесь использован, термин биологический образец относится к образцу ткани или жидкости, выделенному из хозяина, обычно человека, и включает (но ими не ограничивается) плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфу, глазную жидкость, ткань кожи, внутрибрюшинную жидкость, урину, желчь, кусочки сердечно-сосудистой, респираторной, кишечной, центральной нервной системы, гениталий, матки, слезы, плаценту, пуповину, молоко, эндотелиальные клетки, эндометриальные клетки, эпителиальные клетки, опухоли и органы, а также образцы ш νίΙΐΌ культур составляющих, включая (но не ограничиваясь ими) кондиционную среду, полученную при размножении клеток в клеточной культуральной среде.

В соответствии с настоящим изобретением состояние окисления и, в частности, состояние переокисления липида в организме хозяина оценивают, тестируя биологический образец хозяина на присутствие и уровень содержания либо: (Ι) антигенов, которые связываются с антителом, образующимся, как указано в разделе Ι.Α; либо (ίί) антител, которые перекрестно реактивны с антителами, образующимися, как указано в разделе Ι.Α. Было определено, что у каждого хозяина, даже у здоровых персон, имеются как (I), так и (ίί) в тканях и жидкостях в различных количествах. На деле, коммерчески доступный альбумин бычьей сыворотки содержит (Ι) и, таким образом, дает положительную реакцию при экспонировании антителам, образовавшимся в соответствии с разделом Ι.Α. Поэтому, сам по себе факт существования (Ι) или (ίί) в организме не указывает на вызванное окислением болезненное состояние. Вместо этого, уровень (I) или (ίί) в организме хозяина следует рассматривать в свете популяции и индивидуальных норм. Таким образом, диагностика весьма близка к диагностике для холестерина, когда уровень холестерина в организме хозяина сравнивают со статистическими нормами. Далее, как и в случае теста на холестерин, в некоторых случаях изменения в индивидуальных уровнях могут предоставить более важную диагностическую информацию, нежели сами индивидуальные уровни.

Обычно, если тест на холестерин указывает, что пациент может быть подвержен риску заболевания, предпринимают серию тестов второго уровня для получения большей диагностической информации, включая определение абсолютных уровней в сыворотке НИН, ЕИЬ и триацилглицеридов. При одном и том же уровне холестерина различные отношения каждой из компонент определяют различные диагностические предположения и прогнозы. Рассматриваемый тест аналогичен этому в том, что, если уровень гидроперекисей липидов указывает на возможность воспалительного заболевания у пациента, включая сердечно-сосудистые заболевания, может быть необходимым провести серию тестов второго уровня для подтверждения диагноза и для получения более подробной информации относительно заболевания. Эти тесты второго уровня могут оценить присутствие и/или количество других суррогатных маркеров подразумеваемого заболевания. Суррогатные маркеры включают (но не ограничиваются ими) ЬПЬ, НЭЬ, триацилглицериды, Ь(_Р)А (образующийся при взаимодействии ЬПЬ с протеином а), УСАМ (уровни растворимых, циркулирующих 1САМ-1 оценивают в сыворотке пациентов с системными воспалительными заболеваниями), 1САМ, Е-селектин, МС8Е, С-С8Е, ΤΝΡ-α, 1Ь-1 и МСР-1 . Суррогатные маркеры других специфических заболеваний известны, и анализы для этих маркеров коммерчески доступны или их можно получить из медицинских лабораторий.

В другом варианте антитела, специфические для мишеневых протеинов и окисленных суррогатных маркеров, можно использовать для анализа специфических компонентов самих модифицированных образцов перекиси липидов для получения большей информации относительно того, какие первичные амины участвуют в процессе окисления. Это обеспечивает дополнительную специфичность и чувствительность для диагностики атеросклероза и других воспалительных заболеваний и может предоставить информацию для определения, какой (если какой-либо есть) из материалов перекисей липидов может действовать как оксикины. Используя стандартные двойные методики детектирования антител (например, иммуноосаждение и Вестернблоттинг), можно идентифицировать и количественно определить в тканях или жидкостях амины, модифицированные перекисью липида, включая ЬВЬ, НОЬ, триацилглицериды, Ь_(Р)А, УСАМ, 1САМ, Е-селектин, С-С8Е, МС8Е, ΤΝΡ-α, 1Ь-1 и МСР-1. Эта компонента общего состояния перекисей липидов может представлять чувствительный и специфический маркер для сосудистых воспалений, характерных для атеросклероза, медиатором которых является перекись липида. Аналогично, модифицированные липидами аро-В можно детектировать, используя как аро-В антитело, так и ЬООН/амин антитело.

Любой из тестов, в котором определяют связывание антигена с антителом, можно использовать для оценки уровня содержания антигена или антитела в биологическом образце хозяина в соответствии со способом настоящего изобретения. Ряд таких тестов известен и обычно используется коммерчески.

Иммуноцитохимия и иммуногистохимия представляют методики, в которых используют антитела для идентификации антигенов на поверхности клеток в растворах или на срезах тканей, соответственно. Иммуноцитохимические методики используют для количественного определения индивидуальных клеточных популяций в соответствии с поверхностными маркерами. Иммуногистохимические способы используют для локализации конкретных клеточных популяций или антигенов. Эти способы используют также для идентификации аутоантител, используя ткани или клетки, которые содержат предполагаемый аутоантиген в качестве субстрата. Антитела обычно идентифицируют, используя фермент-конъюгированные антитела к исходному антителу, с последующей обработкой хромагеном, который осаждает нерастворимый окрашенный конечный продукт на клетки или ткани.

Другим общим способом оценки является радиоиммуноанализ, в котором радиомеченые реагенты используют для детектирования антигена или антитела. Антитело можно детектировать, используя пластины, сенсибилизированные антигеном. Тестируемое антитело наносят и детектируют с помощью добавления радиомеченого лиганда, специфичного для этого антитела. Количество лиганда, связанного с пластиной, пропорционально количеству тестируемого антитела. Этот тест можно обратить, и тогда тестировать антиген. Вариантами радиоиммуноанализа являются конкурентный ΡΙΛ. ΡΙΛ непосредственного связывания, К1А захвата, сэндвичный Р1А и иммунорадиометрический анализ (КМА).

Твердофазные иммуносорбентные анализы (ЕЬ18А) представляют широкую группу методик для определения антигена и антител. Эти принципы аналогичны принципам радиоиммуноанализа, за исключением того, что фермент конъюгирован скорее с системой детектирования, а не с радиоактивной молекулой. Типичные ферменты, которые используют, представлены пероксидазой, щелочной фосфатазой и 2галактоаидазой. Их можно использовать для создания окрашенных продуктов реакции из бесцветных субстратов. Плотность окраски пропорциональна количеству исследуемого реагента. Эти анализы более удобны, нежели К1А, но менее чувствительны.

Метод Вестернблоттинга (иммуноблоттинга) используют для характеризации неизвестных антигенов. Компоненты биологического образца разделяют с помощью гель-электрофореза. 8Ό8 гели разделяют по молекулярным весам, а ΙΕΕ гели разделяют образцы в соответствии с зарядами. Разделенные протеины переносят на мембраны (подвергают блоттингу) и идентифицируют иммуноцитохимическими способами.

Реже используемые, но подходящие, методики оценки включают анализ Фарра (Рагг) (в котором радиомеченые лиганды связывают с детектируемым специфическим антителом в растворе, и их осаждают и количественно определяют), реакции осаждения (в которых антитела и антигены сшивают в крупные решетки с образованием нерастворимых иммунных комплексов; этот способ работает только в тех случаях, когда антиген и антитело присутствуют в достаточных количествах, почти в эквивалентных, и если присутствует достаточное количество эпитопов, доступных для образования решетки); нефелометрию (измеряет иммунные комплексы, образовавшиеся в растворе по их способности рассеивать свет); иммунодиффузию (детектирование антигенов и антител в агарных гелях); электрофорез в противотоке (аналогичен иммунодиффузии, за исключением того, что для того, чтобы заставить двигаться антитело и антиген вместе, используют электрический ток; метод подходит в случае низких концентраций антигена и антитела); простую радиальную иммунодиффузию (8Κ.ΙΌ) (количественно определяет антигены, позволяя им диффундировать наружу из ячейки в гель, содержащий антитело; метод можно обратить, заставляя диффундировать растворы неизвестных антител в антиген-содержащую ячейку); рокет (тоске!) электрофорез (аналогичен 8Κ.ΙΌ, за исключением того, что тестируемый антиген заставляют двигаться в гель за счет электрического поля); и иммунофлуоресценцию (аналогична иммунохимическим методикам, за исключением того, что используют флуоресценцию, а не конъюгаты с ферментами). Антитела, которые используют для контактирования образца биологической жидкости организма, предпочтительно иммобилизуют на твердом субстрате. Антитело можно иммобилизовать, используя различные средства, как раскрыто в АпНЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, цитировано ранее. Подходящие твердые субстраты включают те, которые имеют мембрану или покрытие, нанесенное на или прикрепленное к палочкам, синтетическому стеклу, агарозным шарикам, чашкам, плоским упаковкам или другим твердым подложкам. Другие твердые субстраты включают пластины для клеточных культур, пластины ЕБ18Л. ампулы и полимерные мембраны.

Средства для введения меток в антитела в виде детектируемых агентов также раскрыты в АпНЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1. Количество антигена в биологическом образце хозяина можно определить любыми способами, связанными с селективным анализом. Так например, селективный иммуноанализ можно осуществить, используя известные увеличивающиеся количества антигена для получения стандартной кривой или цветной карты, а затем количество тестируемого антигена можно определить, сравнивая результаты теста со стандартной кривой или картой, которые коррелируют количество комплекса антиген-антитело с известными количествами антигена. Количество антигена, которое, как определено, присутствует в биологическом образце хозяина, можно использовать для оценки состояния пациента различными способами. Во-первых, уровень антигена можно сравнить с популяционной нормой на основании статистических данных. Во-вторых, уровень антигена можно рассматривать в свете собственной предыстории пациента на антигенном уровне.

С. Наборы

Настоящее изобретение включает также наборы для диагностики состояния переокисления липидов в образце. Оптимально набор включает антитело, которое реагирует с эпитопом, образованным в реакции гидроперекиси липида с амином, присутствующим в биологическом образце. Антитела присутствуют в наборе в количестве, эффективном для связывания с и детектирования практически всех антигенов в образце. Предпочтительный набор содержит достаточно антител для связывания практически всех антигенов в образце в течение примерно 10 мин или менее. Антитело может быть иммобилизовано на твердом носителе и может быть помечено детектируемым агентом, как указано ранее. Оптимально набор содержит средства для детектирования детектируемого агента. Если антитело мечено флуорохромом или радиоактивной меткой, обычно не предоставляется средств для детектирования агента, так как пользователь, как ожидается, должен иметь подходящий спектрофотометр, сцинтилляционный счетчик или микроскоп. Если детектируемым агентом является фермент, средства для детектирования детектируемого агента могут поставляться в наборе, и обычно они включают субстрат для фермента в количестве, достаточном для детектирования всех комплексов антиген-антитело. Одним из предпочтительных средств для детектирования детектируемого агента является субстрат, который превращается за счет фермента в окрашенный продукт. Общим примером является использование фермента пероксидазы хрена с 2,2'-азино-ди-[3этилбензолтиазолинсульфонатом] (АВТ8).

Набор может необязательно содержать лизирующий агент, который подвергает лизису клетки, присутствующие в образце биологической жидкости организма. Подходящие лизирующие агенты включают такие поверхностноактивные агенты, как Т\\ееп-80. Ыошбе! Р40 и Тгйоп Х-100. Предпочтительно, чтобы лизирующий агент был иммобилизован на твердом носителе вместе с антителом.

Набор может также содержать буферный раствор для промывки субстрата между стадиями. Буферный раствор обычно представляет такой физиологический раствор, как фосфатный буфер, физиологический солевой раствор, цитратный буфер или Тп8 буфер.

Набор необязательно включает различные концентрации предварительно полученного антигена для калибровки анализа. Набор может дополнительно содержать визуальное или численное представление количеств антигена в калибровочном стандартном анализе для целей сравнения. Так например, если используют анализ, в котором получают окрашенный продукт, может быть приложен лист, на котором изображены возрастающие интенсивности, связанные с различными количествами антигена.

В другом варианте, набор может включать антиген, полученный в результате реакции гидроперекиси липида с амином для оценки уровня антител в биологическом образце.

Набор может необязательно включать два антитела в системе детектирования. Первое антитело, которое присутствует в небольших количествах, специфично для анализируемого антигена. Второе антитело, представленное в большем количестве, используют для детектирования первого антитела. Так например, кроличье антитело можно использовать для детектирования ЬООН/амин антигена, а затем антикроличий 1§С антитело можно использовать для детектирования связанного кроличьего антитела. Обычно также используют козьи антитела и анти-антитела.

В качестве одного нелимитирующего примера предложен набор для определения состояния переокисления липидов у пациента, который включает кроличье антитело, специфичное для ЬООН/амин антигена, антикроличий 1д6 антитело в достаточном количестве для детектирования первого связанного антитела, фермент, конъюгированный со вторым антителом, и субстрат для фермента, который изменяет цвет при экспонировании ферменту.

Ό. Использование диагностических наборов

Диагностический метод и наборы, описанные здесь, можно использовать для оценки широкого крута медицинских состояний, медиаторами которых являются акты, вызванные окислением, и, в частности, гидроперекисями липидов. Так например, присутствие повышенных концентраций гидроперекисей липидов или продуктов реакций гидроперекисей липидов с первичными аминами, можно использовать в качестве начального диагностического маркера для сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклерозы, воспалительные заболевания, эндометриоз, гломерулонефриты, преэклампсию, нарушения центральной нервной системы, медиаторами которых является переокисление липидов, болезнь Альцгеймера, псориазы, астму, атонические дерматиты, твердые опухоли, саркому Капоши, нейродегенеративные заболевания, воспаления кишечника (болезнь Крона (Стойи'з), ревматоидные артриты и ишемическую реперфузию. Биологический образец можно выбрать с учетом подлежащего лечению заболевания. Так например, образец ткани из пораженного участка может быть оптимальным, если заболевание тканеспецифично. Если рассматриваемый способ и набор показывают повышенный или ненормальный уровень переокисления липидов в организме хозяина, дополнительные тесты можно использовать для подтверждения специфического нарушения.

Е. Примеры оценки окислительного состояния организма хозяина

Альбумин кроличьей сыворотки (К8А), липооксигеназа сои, линолевая кислота, козлиный антикроличий 1д6, конъюгированный со щелочной фосфатазой, октилглюкозид, тетраметоксипропан и р-нитрофенилфосфат были получены от 81дта Сйет1са1 Сотрапу (81. Ьош8 Μ188оип). Ноненол был закуплен у А1йпс11 Сйет1са1 Сотрапу (МП\\аикее. XVI). Обезжиренный молочный порошок был закуплен у Вю-Кай С11ет1са1 Сотрапу (Негси1е8, СА), Т\гееп-20 и 96-ячеечные микротитровальные пластины были закуплены у Б18Йет Сйет1са1 Сотрапу (ΡΐΐΐδЬигд, РА). Пептидная последовательность из 20 аминокислот, ΥνΤΚδΥΝΕΤΚΙΚΡΌΚΥΚΑΕΚ8ΗΕΌΕΕ (где К представляет лизин) (последовательность ΙΌ № 1) была получена.

Пример 1. Препарат протеина, модифицированного перекисью липида.

Линолевую кислоту превращают в 13гидропероксилинолеат в результате обработки липооксигеназой сои (8ЬО) по способу БтиеЬ18, РаПйа8ата1йу и 81етЬетд, см. ранее. Гидроперекись линолевой кислоты сразу же подвергают взаимодействию с не содержащей иммуноглобулина К8А и инкубируют при 37°С в течение 2 дней. В типичной реакции 100 нмолей линолевой кислоты обрабатывают 30 ед. 8ЬО в 1 мл буферированного фосфатом физиологического раствора (РВ8) и после реакции измеряют усиление поглощения на 234 нм. Обычно реакция завершается за 30 мин. Гидроперекись липида (13-ΗΡΟΌΕ) обрабатывают затем 100 мкг липида, ΙβΟ и другим альбумином, не содержащим протеина, в присутствии 50 мкМ ЕДТА в течение 2 дней при 37°С. Образование флуоресцирующих продуктов устанавливают, измеряя флуоресценцию при возбуждении на длине волны 330 нм, и измерении эмиссии на 430 нм. Этот продукт экстрагируют хлороформом и метанолом по способу Вйдй и Эует (В1ф11 е! а1., Ь. Сап. 1. Вюсйет. Вюрйу8., 37:911-917 (1959)) для удаления непрореагировавшей ЬООН, а затем несколько раз промывают охлажденным льдом ацетоном. Конечный продукт, ЬООН, модифицированная К8А (БООН/К8А) растворим в водном растворе и его характеристики флуоресценции аналогичны характеристикам окисленных липопротеинов низкой плотности (Ох-БЭБ). Образование ЬООН, также как модификацию протеина, осуществляют в отсутствии каких23 либо добавок металлов для ограничения образования альдегидов.

Пример 2. Получение окисленных БЭБ.

БЭБ выделяют из гепаринизированной плазмы нормальных людей-доноров, используя настольную ультрацентрифугу Весктап ТЬ-100 и ТЬЛ-100,4 ротор (8ап1апат с1 а1.. I. С1т. Ιηνβδΐ., 95:2594-2600, 1995). Односпиновый градиент используют для очистки БЭБ от альбуминовых примесей. Выделение завершают за три часа после получения плазмы. Выделенный БЭБ диализуют против буферированного фосфатом физиологического раствора (РВ8) при 4°С (200 х объемы) в течение 6 ч. Чистоту выделенного БЭБ подтверждают наличием одной полосы при проведении электрофореза в агарозном геле и по интактному аполипопротеину В при проведении электрофореза в натрийдодецилсульфатном полиакриламидном геле. Выделенный БЭБ (100 мкг/мл) инкубируют в буферированном фосфатом физиологическом растворе с 5 мкМ меди и инкубируют в 50 мм пластине при 37°С. Спустя 24 ч инкубирования раствор переносят в стеклянную ампулу и удаляют липиды экстракцией по способу В1щ11 и Эуег. Делипидированный БЭБ протеин растворяют в октилглюкозиде (100 мкл, 10 мкг/мл добавляют к протеину, вместе с 5 мкл 1н. №1ОН). как указано РаййакагаШу (РатШакатаШу с1 а1.. Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А 84: 537-540; 1987).

Пример 3. Получение модифицированных альдегидом протеинов.

Приготавливают не содержащий глобулина К.8А, содержащий 1 мг протеина (или другие протеины) в 100 мкл РВ8. а затем полный объем увеличивают до 1 мл за счет РВ8. К протеину добавляют ноненол или гексанол (100 мкл 25 мкМ в этаноле). хорошо перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 24 ч. 4 мл охлажденного льдом ацетона добавляют к раствору, и ампулу хранят в морозильнике в течение одного часа. После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин при 4°С надосадочную жидкость удаляют. Эту стадию повторяют еще трижды, а затем осадок сушат в вакууме. 1 мл РВ8 добавляют в ампулу и после перемешивания полученный раствор используют в твердофазном иммуносорбентном анализе (ЕБ18А).

Модифицированные малондиальдегидом протеины приготавливают следующим образом. Один образец в 100 мкл тетраметоксипропана приготавливают, а затем в ампулу добавляют 0.5 мл 6н. НС1. Ампулу нагревают при 60°С в течение 30 мин. рН устанавливают 6.4. используя 4н. ЫаОН, и полный объем доводят до 2.7 мл, используя РВ8. Затем 25 мкл приготовленного раствора добавляют к 2 мг свободного от глобулина альбумина сыворотки кролика или других протеинов и инкубируют при 37°С. Через 3 ч инкубирования полученный раствор диализуют против РВ8 и используют в ЕБ18А.

Пример 4. Получение антитела.

От Мутбе ВаьЬйту (Тйотркоп δΐηΐίοη. ΤΝ) получают трех кроликов-самцов. Для первичной иммунизации 1.5 мг/мл альбумина кроличьей сыворотки модифицированного перекисью липида, растворяют в РВ8. смешивают с неполным адъювантом Фреунда (Бтеипб). а затем вводят подкожно. Бустерную иммунизацию продолжают антигеном в РВ8 и смешивают с неполным адъювантом Фреунда, с четырехнедельными интервалами. Кровь у кроликов отбирают на 10-14 дни после иммунизации, и кровь оставляют выстаиваться в течение 4 ч при комнатной температуре и при 4°С в течение ночи. После удаления сгустков и частиц с помощью центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об/мин, сыворотку анализируют с помощью ЕБ18А и хранят при -20°С. После этого проверяют ежемесячно титры и в конце кровь спускают через 6 месяцев после начальной иммунизации. Титр БООН/В8А антитела у животного возрастает со временем и выходит на плато примерно через 4 месяца.

Пример 5. Анализ ЕБ18Л для протеинов, модифицированных ЬООН.

Используя ЕБ18А. провели исследование того факта, действительно ли БООН/К.8А антитело распознает ЬООН/модифицированный протеин и немодифицированный протеин. В качестве контроля используют немодифицированный К.8А, не содержащий 1дО.

Ячейки пластин ЕБ18А покрывают 50 мкл на ячейку различных разбавлений К.8А модифицированного перекисью липидов и инкубируют при 37°С в течение 3 ч. Пластины трижды промывают 0.05% Т\тееп 20 в РВ8 и блокируют на 3 ч 300 мкл 1% обезжиренного молочного порошка вместе с 0.05% Т\тееп 20 в РВ8. После блокирования пластины трижды промывают 0.05% Т\тееп 20 в РВ8 и анти-БООН/Е8Л сыворотку разбавляют в отношении 1:250. 50 мкл добавляют в каждую ячейку и инкубируют при 37°С в течение 3 ч или в течение ночи. После троекратной промывки 0.05% Т\тееп 20 в РВ8 антикроличий 1дО, конъюгированный со щелочной фосфатазой, разбавляют в отношении 1:38000 и по 50 мкл добавляют в каждую ячейку и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После шестикратной промывки 0.05% Т\тееп 20 в РВ8 в каждую ячейку добавляют 50 мкл рнитрофенилфосфата и инкубируют при 37°С. Пластины проверяют с 15-ти минутными интервалами в течение 2 ч. Строят кривую зависимости значений ОП (оптической плотности) от концентрации БООН/К.8А.

Антигены (БООН/К.8А. И8А. Ох-БЭБ и другие модифицированные протеины) высевают на 96-ячеечные пластины на ночь при комнатной температуре. Ячейки блокируют 3% В8А в

РВ8 на 2 ч и промывают трижды РВ8. АнтиБООН/В8А антитело разбавляют в отношении

1:250 РВ8. содержащим 3% В8А. и добавляют в каждую ячейку. После 2 ч инкубирования при 37°С ячейки промывают РВ8 трижды. Козий антикроличий 1§С. конъюгированный со щелочной фосфатазой, разбавляют в отношении 1:38000 и добавляют. После 2 ч инкубирования при 37°С ячейки снова промывают и добавляют р-нитрофенолфосфат. Проявленную окраску определяют с помощью считывающего с пластин устройства (Ληΐΐιοκ II).

Фиг. 1 представляет график (в виде прямоугольников) распознавания альбумина кроличьей сыворотки и альбумина кроличьей сыворотки, модифицированного гидроперекисью липида, где по оси абсцисс отложены нанограммы протеина, а по оси ординат - оптическая плотность на 405 нм. Как видно, антитело при разбавлении в отношении 1:250 селективно распознает модифицированный протеин зависимым от концентрации образом. Даже столь малое количество, как 10 нг Κ5Α (менее чем 2 нм модифицированной Κ8Α) распознается с гораздо более высокими уровнями, нежели эти уровни для контрольного протеина. Немодифицированный контрольный протеин едва распознается антителом даже при высоких концентрациях. Контрольные образцы без первичных или вторичных антител не распознаются антителом. Другие модифицированные протеины (альбумин бычьей и человеческой сыворотки, модифицированные ЬООН, каталаза и цитохром С) также распознаются антителом. Компонента ЬОЬ-апопротеин В₁₀₀ (аро В) претерпевает существенную модификацию в процессе окисления ЬОЬ. Ряд исследований продемонстрировал, что эта модификация включает новые антигенные эпитопы, образующиеся за счет ковалентной модификации лизинового остатка альдегидами.

Для определения того, содержит ли ОхЬОЬ также и лизины, модифицированные интактной ЬООН. исследуют, распознает ли антитело к ЬООН/РБА ЬОЬ или Ох-ЬЭЬ. Фиг. 2 представляет график (в виде прямоугольников), который иллюстрирует распознавание О.х-ЬОЬ антителом примера 4. что выражено в концентрации в микрограммах от единиц оптической плотности. Как видно из фиг. 2. О.х-ЬОЬ распознается антителом концентрационно-зависимым образом. Антитело способно распознавать даже столь малые количества, как 0.25 мкг О.х-ЬОЬ протеина (менее 0.5 нМ аро В). Нативный ЬОЬ. полученный в присутствии бутилированного гидрокситолуола (ВНТ). не распознается даже при 2.5 мкг концентрациях. В отдельных экспериментах определено, что липидная компонента О.х-ЬОЬ также распознается антителом, что дает возможность предположить, что аминофосфолипиды О.х-ЬОЬ. такие как фосфатидилэтаноламин, могут быть модифицированы аналогичным образом.

Пример 6. Иммуногистохимия.

Способность антитела распознавать модифицированные протеины тестируют в двух условиях. В первом исследовании используют клетки ΡΑ\ν. предварительно инкубированные с ЬООН. Во втором исследовании атеросклеротические артерии обезьян, которых кормили холестерином, иммуноокрашивают антителом.

ΚΑν макрофаги инкубируют со 100 мкМ 13-НРОЭЕ в течение 1. 2. или 3 дней следующим образом. Конфлюэнтные клетки в 6ячеечных пластинах обрабатывают 13-НРОДЕ в течение 1. 2 или 3 дней в ΌΜΕΜ, не содержащей сыворотки (Дюльбекко модифицированная минимальная необходимая среда Игла). На второй и третий день добавляют свежую 13НРОИЕ в соответствующие чашки с клетками. В конце первого, второго и третьего дней клетки фиксируют раствором Вошпк в течение 10 мин и осуществляют иммуноцитохимическую обработку, используя антитела против ЬООН/ΚδΑ. После фиксации клетки трижды промывают РВ8. Анти-ЬООН/КБА антитело разбавляют в отношении 1:250 РВ8. содержащим 3% В8А, и добавляют в каждую ячейку. Для негативного контроля первичное антитело не добавляют. После 2 ч инкубирования при комнатной температуре ячейки промывают трижды РВ8 и добавляют козий антикроличий 1д6, конъюгированный со щелочной фосфатазой, разбавленный до 1:100. После 2 ч инкубирования при комнатной температуре ячейки снова промывают и инкубируют с быстрым красным. После проявления цвета реакцию останавливают и клетки фотографируют, используя микроскоп ΝίΕοη с присоединенной камерой.

Замороженные сегменты абдоминальной аорты от группы самцов обезьян циномолгус оценивают иммуногистохимически. Животных предварительно кормили пищей с умеренно высоким содержанием жира в течение более пяти лет, причем рацион состоял из обычного корма для обезьян, дополненного 8.2% сушеного яичного желтка и 10% лярда. В итоге рацион состоял из 37.5% насыщенных жиров, 44.9% мононенасыщенных жиров, 17.5% полиненасыщенных жиров с 0.25% холестерина. Средний уровень сыворотки у этих животных составлял 306 мг/БЬ. Эти уровни холестерина достаточны для образования у обезьян ряда атеросклеротических поражений. Человеческие аорты с различными степенями развития атеросклероза были получены от доноров органов в момент отбора тканей и были собраны с разрешения Етогу Ишуегайу Нитап 8иЬ|сс1к Соттйсс. Аорты людей и обезьян циномологус были фиксированы в параформальдегиде и заморожены в О.С.Т. до нарезания на кусочки до 5 мкм на криостате. Срезы тканей затем иммуноокрашивали, используя антитело при разбавлении 1:500. а затем биотинилированный козий анти-кроличий !§С (Ещйег δοίοηΙίΠο) использовали при разбавлении 1:200 и визуализировали системой УесЮг АВСАР, используя Уее!ог Веб в качестве хромагена (УесЮг ЬаЬогаЮпех). Иммуногистохимические исследования показывают, что клетки, инкубированные с ЬООН были иммуноокрашены антителом и антигенные эпитопы присутствуют внутри клеток. Контрольные клетки и контроли без первичных антител не продемонстрировали иммунореактивности.

Эти артерии продемонстрировали интенсивную иммунореактивность. Иммунореактивность была локализована на участках с высоким содержанием пенных клеточных макрофагов, о чем свидетельствует обратное окрашивание для макрофагов.

Пример 7. Вестренблоттинг.

Анализ Вестернблоттинг осуществляют после разделения протеинов в 7,5% сшитых акриламидных гелях, используя 2,5 мкг протеина. Трансблоттированные образцы детектируют, используя 1:250 разбавленную анти-ЬООН/КБА в качестве первичного антитела и конъюгированный с пероксидазой козий антикроличий 1§С в качестве вторичного антитела. Перекрестнореактивные полосы визуализируют хемилюминесцентным детектором.

Используя анализ Вестернблоттинга ЬЭЬ и Ох-ЬЭЬ удалось подтвердить, что антитело примера 4 способно распознавать Ох-ЬЭЬ. но не нативный ЬЭЬ. Вестренблоттинг плазмы здорового человека показывает, что, по крайней мере, три различные протеина распознаются антителом. Образцы плазмы приготавливают в присутствии ВНТ, и не похоже, что эти эпитопы образовались ίη уйго. Тип этих протеинов неизвестен, хотя, учитывая их мобильность на геле, можно предположить, что эти протеины могут представлять альбумин и аро В продукты.

Пример 8. Перекрестная реактивность антитела примера 7 и альдегидом-модифицированных протеинов.

Целый ряд антител был описан для альдегид-модифицированных протеинов. Так как инкубирование ЬООН с протеином занимает много времени, имеется вероятность того, что альдегиды вносят свой вклад в образование антигенных эпитопов. Для того, чтобы установить, действительно ли антитело к ЬООН/КБА распознает протеины, модифицированные альдегидами, приготовили пептид, состоящий из двадцати аминокислот, с последовательностью

ΥνΤΚδΥΝΕΤΚΙΚΡΌΚΥΚΑΕΚδΗΕΌΕΕ, где К представляет лизин) (последовательность 1Ό № 1). Этот пептид используют, так как протеины плазмы, такие как альбумин из коммерческих источников, уже могут обладать аналогичными эпитопами, либо в результате ίη νί\Ό образования, либо в результате образования в процессе ίη уйго процедур очистки. Данные ЕБ1БА для МДА, гексанала, ноненала и ЬООНмодифицированного синтетического пептида представлены в табл. 1. Антитело не распознает синтетический пептид или его альдегидмодифицированные производные в какой-либо значительной степени. Напротив, ЬООНмодифицированный синтетический пептид эффективно распознается антителом.

Таблица 1. Распознавание анти-ЬООН/К8Л антителом ЬООН-модифицированного пептида и нераспознавание альдегид-модифицированных пептидов

мкг пептида	Нативный пептид	1.ООН- пептид	ΜΏΑпептид	Ноненалпептид	Гексаналпептид
0	57	51	53	51	55
0,25	46	190	50	56	64
1,25	38	327	57	60	84
2,5	42	358	62	46	103

Микротитровальные ячейки покрывают возрастающими концентрациями немодифицированного или модифицированного пептида. После блокирования ячеек обезжиренным порошком молока в каждую ячейку добавляют 100 мкл 1:250 разбавления анти-ЬООН/КБА антитела. После промывки в каждую ячейку добавляют антикроличий 1§С. конъюгированный со щелочной фосфатазой. После добавления субстрата, р-нитрофенилфосфата, на длине волны 405 нм измеряют оптическую плотность, используя считывающее с микропластин устройство. Величины представляют среднее из трех измерений оптической плотности ячеек из одного, по крайней мере, 2, отдельных опытов.

Вестернблоттинг альдегид- и ЬООНмодифицированных пептидов подтверждает, что ни один из альдегид-модифицированных синтетических протеинов не распознается до какой-либо значительной степени, тогда как ЬООН-модифицированный пептид распознается антителом.

II. Биологическая активность оксикинов

А. Определение оксикинов

Было обнаружено, что некоторые продукты реакции гидроперекисей липидов и первичных аминов демонстрируют независимую биологическую активность как медиаторы клеточных реакций. Термин оксикин используют здесь для обозначения флуоресцентного протеина или липида, который образуется в реакции гидроперекиси липида и первичного амина и который может вызывать реакцию мишеневой клетки. Оксикины могут образовываться внеклеточно или могут образоваться на клеточной мембране для опосредствования клеточной реакции. Оксикины могут также образовываться внутриклеточно.

Широкий круг биологически активных молекул, которые содержат первичные амины, можно превратить в оксикины, которые также будут обладать биологической активностью. Одним из примеров оксикинов является стабильный флуоресцентный продукт реакции линолевой гидроперекиси (13-НРОЭЕ) и соответствующей аминокислотной группы, например лизина, в альбумине или полилизине, или такого низкомолекулярного соединения, как фосфатидилэтаноламин. Некоторые оксикины действуют как потенциальные воспалительные сигналы, которые вызывают экспрессию эндотелиального УСАМ-1 гена за счет механизма, который можно подавить селективными антиоксидантами. Другие клеточные реакции, которые могут вызывать оксикины, представляют образование или активацию МСР-1, 1Ь-1, ΤΝΡ-α, I САМ, МС8Р и Е-селектина.

Оксикины можно использовать как медиаторы клеточных воспалительных реакций, включая реакции сердечно-сосудистой системы, так как окисление липидов связано с воспалительными и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Специфические болезненные состояния, которые являются по своей природе воспалительными или сердечно-сосудистыми, включают атеросклерозы, эндометриоз, гломерулонефрит, преэклампсию, нарушения центральной нервной системы, медиатором которых является переокисление липидов, болезнь Альцгеймера, аутоиммунные нарушения, псориаз, астму, атопический дерматит, рак кожи, нейродегенеративные заболевания, воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона), ревматоидные артриты, ишемическую реперфузию, остеоартриты, астму, дерматиты, рассеянный склероз, рестеноз после ангиопластики, болезнь коронарных артерий и стенокардию.

Хотя все первичные амины будут реагировать с гидроперекисями липидов с образованием антигенных соединений, которые можно использовать для выработки антител, для определения окислительного состояния организма хозяина, не все пептиды или биологически существующие первичные амины будут образовывать оксикины. Это объясняется тем, что для того, чтобы вызвать реакцию антитела, необходим только один эпитоп, однако для передачи клеточной реакции целый ряд положений прореагировавших сайтов является критическим для комплементарного связывания с рецептором.

Нелимитирующие примеры эпитопов оксикинов раскрыты в Ргос. Жа!1. Асад. 8οΐ. и8А, Уо1ише 89, ρρ. 10588-10592, ЖоуешЬег 1992 Мед1са1 8с1епсе; включено сюда для ссылки. В частности, эпитопы могут включать

В. Ιη уйго синтез и характеризация оксикина.

Липидную модификацию липооксигеназы сои (8РО) осуществляют за счет инкубирования гидроперекиси липида с липооксигеназой, используя модифицированный метод РгеиЬЕ, РагШазагаШу апд 81етЬегд (Ргос. Жад. Асад. 8ст и8А 89, 10588-10592). Для такого синтеза важно поддерживать высокое отношение липида к протеину. В реакциях в малом объеме (1 мл) 250 мкМ линолевой кислоты инкубируют непосредственно с 8РО (50 ед., 80 нг) при комнатной температуре в течение трех дней; важно перемешивание образца для подачи воздуха в реакцию. Все реакции ведут в 10 мМ Тп§, рН 8.0, 15 мМ хлорида натрия. Неочищенную реакционную смесь используют для выработки кроличьих поликлональных антител и мышиных моноклональных антител против окислительно модифицированного соевой липооксигеназой оксикина (охЗЬО).

Увеличивая масштабы реакции, становится невозможным поддерживать высокое отношение липида к протеину, так как возникают проблемы несмешиваемости. Разработан способ синтеза 13-ΗρΟ^Ε модифицированного оксикина липооксигеназы или модификации мишеневого протеина (см. фиг. 4). Мишеневый протеин, 1-3 мг в объеме вплоть до 1,5 мл, выделяют в мембране с отсечением по молекулярному весу 10 кДа. Это предусматривает непрерывный обмен 250 мл системы для образования перекиси липида с удержанием целевого протеина. Каталитические количества липооксигеназы сои, 1,260 Ед, и 800 мкМ линолевой кислоты используют в системе создания перекиси для катализа образования 13-гидроперокси-[8(Е,2)]-9,11 -октадекадиеновой кислоты. Генерирующую систему заменяют свежей 8ЬО/линолевой кислотой каждые 8-16 ч в течение, по крайней мере, 170 ч. Реакцию ведут в 10 мМ Τπ§, ρΗ 8.0, 15 мМ хлорида натрия при постоянном перемешивании. Одним из преимуществ крупномасштабного метода является то, что любой протеин, крупнее 10 кДа, или смесь протеинов можно использовать в качестве мишеневого протеина.

Критерии для образования 13-ΗρΟ^Ε окисленных оксикинов включают индуцирование 1САМ-1 в анализе на базе эндотелиальных клеток (будет обсуждаться далее более подробно) и иммунореактивность с антителами оксикина. Минимальные требования для образования оксикина оценивают, используя реакцию в малом масштабе. Как показал Вестернблоттинг, используя поликлональное антитело, 8РО и линолевая кислота являются минимальными требованиями для трехдневной реакции (см. фиг. 5). Встряхивание реактора повышает выход. Если 8ЬО инкубировать только с одним буфером, перекрестной реактивности не наблюдается. За временным ходом образования оксикина в крупномасштабной реакции следует

Антитела настоящего изобретения можно использовать для блокирования повреждающей активности антигена, особенно за счет физического прерывания его способности служить медиатором клеточных реакций.

исследование иммунореактивности и биологической активности (индуцирование 1САМ-1; см. фиг. 6 и 7). Активность иммунореактивности наблюдают до биологической активности. Начальный продукт, анализированный с помощью Вестернблоттинга, представляет высокомолекулярный продукт, полоса которого выходит примерно у 80 кДа. Продукты реакции, наблюдаемые в более поздние моменты времени, образуют лестницу с преимущественным соединением примерно на 25 кДа. Временной ход реакции, как по данным иммунореактивности, так и по биологическим активностям, зависит от концентрации липида; увеличение концентрации линолевой кислоты приводит к повышению скорости реакции.

Продукты реакции оксикина исследуют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (КР-НРЬС) и гель-фильтрации. ВЭЖХ анализ с использованием С18 колонки показал, что продукты реакции более гидрофобны, нежели исходный материал, что согласуется с добавлением липида к липооксигеназе (см. фиг. 8). Препаративную гель-фильтрацию используют для частичной очистки оксикина (см. фиг. 9 и 10). Биологическая активность была обнаружена во фракциях 9 и 10, хотя основная часть протеина была обнаружена в других фракциях.

Стабильность оксикина оценивают на основании иммунореактивности и биологической активности. Оксикин оказывается стабильным в ряде кислотных и щелочных условий и в присутствии восстанавливающих агентов, что показывает Вестернблоттинг. После преинкубирования с 3,5М МдС1₂, 10 мМ фосфата натрия рН 7.2; 5,0М ЫС1, 10 мМ фосфата натрия, рН 7.2; 100 мМ триэтиламина, рН 11.5; и 100 мм глицина, рН 2.5, иммунореактивность с поликлональными и моноклональными антителами сохраняется. Напротив, инкубирование с 3,5М МдС1₂, 10 мМ фосфата натрия, рН 7.2 вызывает потерю биологической активности; при этом остальные условия хранения влияния не оказывают. Связана ли потеря активности с изменением конформации протеина, состоянием окисления или другими причинами, остается определить. Биологическая активность сохраняется после термоденатурации и термоденатеруции в присутствии дитиотреитола. Добавление ЕДТА, Тго1ох и пробукола также не оказывает влияния на индуцирование 1САМ-1. После кислотного гидролиза протеина биологическая активность утрачивается.

Пример 9. Характеризация биологической активности ох8ЬО: ох8ЬО индуцированная 1САМ экспрессия в эндотелиальных клетках аорты человека (НАЕС).

В маломасштабной синтетической реакции

8ЬО превращают 250 мкМ линолевой кислоты (ЬА) в 13-НрОЭЕ в течение первого часа при инкубировании при комнатной температуре. Во время последующих 3 дней инкубирования 13ΗρΟΌΕ предположительно окислительно модифицирует фермент и образующиеся эпитопы на ферменте, которые могут вызвать такую биологическую активность, как экспрессию клеточных поверхностных 1САМ на НАЕС, как показано в ЕЫ8А анализе и представлено на фиг. 11. НАЕС, выращенные на микротитровальных пластинах, экспонируют для обработки в течение 16 ч перед ЕЫ8А анализом. 8ЬО или ЬА отдельно после трех дней инкубирования не становятся активными, что позволяет предположить, что окислительная модификация 8ЬО существенна для создания биологически активного эпитопа. В крупномасштабном синтезе только в присутствии 13-НрОДЕ образующая система активизирует 8ЬО, как представлено на фиг. 12. 8ЬО негативный контроль представляет 8ЬО фермент, инкубированный с одним только буфером в течение длительного промежутка времени. Было подтверждено, что ох8ЬО, синтезированные любым способом, функционально и иммунологически идентичны. Более того, было определено, что возникновение биологической активности является протеинспецифическим. Реакция альбумина кроличьей сыворотки с использованием крупномасштабных или маломасштабных реакций оксикинов приводит к образованию иммунореактивных, но не биологически активных продуктов.

Экспрессия ох8ЬО активированных 1САМ клеточной поверхности зависит от дозы, как видно из фиг. 13. 40 нг/мл ох8ЬО оказывается достаточно для значительного сигнала в стандартном ЕЫ8А анализе. И снова, эквивалентное количество немодифицированного 8ЬО не может активировать НАЕС. Аналогичный результат наблюдается при Норзернблоттинге, как видно на фиг. 15.

Пример 10. ох8ЬО индуцированная экспрессия в НАЕС, УСАМ, Е-селектина и МСР-1.

ох8ЬО не только индуцирует 1САМ, но также две другие адгезионные молекулы (УСАМ на фиг. 15, Е-селектин на фиг. 16) и одну молекулу хемокина (МСР-1 на фиг. 15 и 16). Фиг. 14 представляет индуцирование экспрессии на НАЕС УСАМ клеточной поверхности, хотя и до меньшей степени, нежели 1САМ индуцирование. Данные ЕЫ8А подтверждаются данными Норзернблоттинга, как представлено на фиг. 15. Количество УСАМ мРНК, накопившееся после 4 ч ох8ЬО обработки, было меньше, чем 1САМ мРНК. Далее, уровни МСР-1 и Еселектина мРНК были столь же высоки, как при ΤΝΡ индуцировании, что позволяет предположить, что может быть МСР-1 и Е-селектин представляют ключевые компоненты ох8ЬО опосредствованного сигнального каскада. Индуцирование этих провоспалительных генов происходит очень быстро, что видно на фиг. 16. За 2-6 ч стимуляции уровень мРНК указанных генов для всех достигает равновесного состояния.

Пример 11. охБЬО 1Ь-1 β экспрессия в макрофаге.

Помимо того, что охБЬО оказывает огромное влияние на эндотелиальные клетки, как представлено в табл. 2, охБЬО вызывает накопление другого цитокина !И-1 β мРНК в клеточной линии макрофага (К.А\У). как видно на фиг. 14. Κ.Λ\ν клетки обрабатывают охБЬО в течение 4 ч, и полную РНК собирают и анализируют. В развитии атеросклероза, как эндотелиальные клетки, так и макрофаги, как было показано, являются чрезвычайно важными. Полученные авторами результаты ίη νίίτο существенно подкрепляют представление о том, что уникальный класс модифицированных гидроперекисью липида протеинов, липидов или липофильных молекул, которые определяют как оксикины, может служить медиатором провоспалительного сигнала в участках атеросклеротических поражений.

Таблица 2. охБЬО индуцированное накопление УСАМ-1, 1САМ-1 и МСР-1 мРНК в НАЕС

Обработка	УСАМ-1 (произв. ед.)	1САМ-1 (произв. ед.)	МСР-1 (произв. ед.)
ΤΝΡ (100 ед/мл)	82.06	71.92	101.65
8ЬО (0.8 мкг/мл)	3.36	3.14	12.34
8ЬО (0.08 мкг/мл)	0.12	-0.09	3.1
8ЬО (0.008 мкг/мл)	-0.14	-0.51	1.12
модифиц. Б1.О (1 мкг/мл)	24.17	19.74	116.62
модифиц. Б1.О (0.2 мкг/мл)	11.51	9.41	96.28
модифиц. Б1.О (0.04 мкг/мл)	9.38	2.06	37.35

Пример 12. Биологическая активность продукта окислительной модификации альбумина кроличьей сыворотки линолевой гидроперекисью.

Проводилось исследование того, может ли окислительная модификация альбумина кроличьей сыворотки КБА линолевой гидроперекисью изменить структурные или биологические свойства элемента (пептида или непептида) в этом материале, придавая ему биологическую функцию сигнала воспаления эндотелиальной клетки сосуда. Используя окислительно модифицированные КБА (охКБА), полученные по способу примера 1, культивируемые эндотелиальные клетки аорты человека экспонируют в течение 12 ч набору охКБА концентраций от 1 до 100 нМ (наномолярных), и анализируя экспрессию клеточной поверхности индуцируемых адгезионных молекул УСАМ-1, 1САМ-1 или конституитивно экспрессированных адгезионных молекул 1САМ-2 с помощью ЕЫБА. Как представлено на фиг. 3, выраженные как процент от максимального ΤΝΡ-α индуцируемого сигнала, ох-КБА демонстрирует зависимое от дозы индуцирование УСАМ-1 до 40%, а 1САМ1 до 80% от максимального ΤΝΡ-α сигнала. Примерное значение ЕС₅₀ для охКБА составляет 10-15 нМ как для УСАМ-1, так и для 1САМ-1. Настоящее изобретение не связано с таким при месным липополисахаридом, как полимиксин В (10 мкг/мл), полностью ингибирующим ЬР8 индукцию, но не оказывающим влияния на охКБА активацию. Более того, 11ти1и8 анализ для ЬР8 в охКБА препаратах был ниже пределов детектирования. Конституитивно экспрессированные 1САМ-2 были не затронуты. Этот результат предполагает, что охКБА функционирует зависящим от дозы образом как потенциальный воспалительный фактор для эндотелиальных клеток в низком наномолярном интервале значений.

Пример 13. Влияние продукта окислительной модификации альбумина кроличьей сыворотки за счет линолевой гидроперекиси на накопление мРНК.

Следующей задачей исследователей было определить, связано ли индуцирование экспрессии УСАМ-1 и 1САМ-2 поверхностей клеток за счет охКБА, по крайней мере частично, с изменениями в накоплении мРНК. Анализ на Норзерн-фильтрах осуществляют для РНК, выделенных из НАЕС, экспонированных в течение 4 ч либо ΤΝΡ-α (100 ед/мл) либо охКБА (25 нМ). Аналогично тому, что наблюдается на протеиновом уровне, УСЛМ-мРНК уровни индуцируются ох-КБА до уровней примерно 30-40% от тех, которые наблюдаются для ΤΝΡ-α. 1САМ-1 мРНК также индуцируется за счет ох-КБА.

Пример 14. Влияние продукта окислительной модификации альбумина кроличьей сыворотки за счет линолевой гидроперекиси на транскрипционную активацию УСАМ-12 промотора через ΝΡ-кВ подобный ДНК связывающий комплекс.

Для определения того, действительно ли ох-КБА модулирует ядерные регуляторные акты, связанные с окислительно-восстановительно чувствительной УСАМ-1 генной экспрессией, культивируемые эндотелиальные клетки аорты человека экспонируют (или не экспонируют (СТЬ)) в течение 2 ч ΤΝΡ-α (100 ед/мл) или 25 нМ оксикина КБА-ЬООН (ох-КБА); приготавливают ядерные экстракты и осуществляют анализ сдвига гель-подвижности, используя ³²Рмеченый кЬОкК, тандем №кВ-подобных связывающих сайтов УСАМ-1 промотора человека. Соответствующий холодный компетитор и контроли суперсдвига, используя анти-р50 и антир65 антисыворотку (К & Ό Буйетк), осуществляют для установления связывающей специфичности ДНК последовательности полосы ΝΡкВ комплекса. Как ΤΝΡ, так и охКБА индуцируют ΝΡ-кВ подобную ДНК связывающую активность. Это предполагает, что оксикины могут играть роль в ΝΡ-кВ опосредствованных транскрипционных активационных схемах в сосудистой системе.

Пример 15. Титры антител образцов плазмы от пациентов, страдающих эндометриозом, и здоровых персон.

Окисление, происходящее в брюшной полости пациентов с эндометриозом, может привести в присутствии аутоантител к образованию модифицированных протеинов, и такие антитела могут быть в повышенном количестве у пациентов, страдающих эндометриозом. Для определения того, присутствуют ли такие антитела у пациентов с диагнозом эндометриоз, образцы плазмы, полученные от таких пациентов, оценивают по присутствию антител, которые реагируют с тремя антигенами: продуктом реакции гидроперекиси липида с альбумином кроличьей сыворотки, продуктом реакции гидроперекиси липида с ЬОЬ и его с МИА.

ЕЫ8А анализ: 10 мкг ох-ЬВЬ, МПА-ΕΌΕ или перекисью липида модифицированный альбумин (ЬООН-К8А) позитивные антигены)) и БЕЕ альбумин человека и ацетил-ЬПЕ (негативный контроль) помещают в 100 мкл объеме в 96-ячеечные микротитровальные пластины. После инкубирования в течение ночи при 4°С пластины блокируют за счет инкубирования с 3% молочным порошком в течение 2 ч. После промывок связанный ИЕ человека детектируют, используя античеловеческий 1дС антитело, конъюгированное с пероксидазой или щелочной фосфатазой. Связанный фермент-конъюгированный 1дС количественно определяют по окрашиванию, используя специфические субстраты.

Полученные результаты представлены в табл. 3-5. Как видно, существует статистическое повышение уровней реактивных антител у пациентов с эндометриозом по сравнению с контрольными.

Таблица 3. Антиген: БООН/К8А (200 мкл плазмы, образцы). Результаты выражены как ОП эквиваленты образовавшегося р-нитрофенола т-Тест: Два-образца, учитывая неравные дисперсии

	Эндометриоз	Контроль
Среднее	0.493885	0.196313
Дисперсия	0.117233	0.023264
Наблюдения	63	32
Р(Т<т) один хвост	3.74Е-08
Р(Т<т) два хвоста	7.47Е-08

Таблица 4. Антиген: х-1.1)1. (образцы по 200 мкл плазмы) т-Тест: Два образца, учитывая неравные дисперсии

	Эндометриоз	Контроль
Среднее	0.214741935	0.18009375
Дисперсия	0.005239014	0.006001378
Наблюдения	62	32
Р(Т<т) один хвост	0.019975579
Р(Т<т) два хвоста	0.039951158

Таблица 5. Антиген МОА-Т1)1. (образцы по 200 мкл плазмы) т-Тест: Два образца, учитывая неравные дисперсии

	Эндометриоз	Контроль
Среднее	0.213758065	0.165406
Дисперсия	0.005736645	0.003401
Наблюдения	62	32
Р(Т<т) один хвост	0.000485039
Р(Т<т) два хвоста	0.000970078

Настоящее изобретение раскрыто со ссылкой на его предпочтительные варианты воплощения. Варианты и модификации способа, набора и материалов, включая антитела, будут очевидны специалистам из предшествующего подробного описания изобретения. Следует учитывать, что все эти варианты и модификации включены в объем прилагаемой формулы изобретения.

Claims (18)

1. Выделенное антитело, которое взаимодействует с антигеном, образовавшимся в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, и при этом в какой-либо значительной степени не связывается с альдегидмодифицированным белком.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что конъюгировано с дополнительным агентом.

3. Антитело по п.2, отличающееся тем, что дополнительный агент представляет собой детектируемую метку.

4. Антитело по п.3, отличающееся тем, что метка представляет собой флуорохром, радиоактивный изотоп, биотин, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, 2-галактозидазу или другой фермент.

5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что дополнительно связано с твердой подложкой.

6. Антитело по п.5, отличающееся тем, что твердая подложка представляет собой мембрану или покрытие, нанесенное на палочки, шарики, чашки или полоски, или прикрепленное к ним.

7. Антитело по п.5, отличающееся тем, что твердая подложка представляет собой культуральный планшет, планшет для осуществления ЕЬКА, пробирку или полимерную мембрану.

8. Антитело по п.1, отличающееся тем, что антиген является продуктом реакции гидроперекиси линолевой кислоты и первичного амина.

9. Антитело по п.8, отличающееся тем, что первичный амин находится в аминокислотной группе, например, лизиновой аминогруппе альбумина или полилизина или такого низкомолекулярного соединения, как полифосфатидилэтаноламин.

10. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой гуманизированное антитело.

11. Фрагмент антитела по любому из пп.1-10 формулы.

12. Способ оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, заключающийся в том, что обеспечивают взаимодействие образца с антителом или его фрагментом по любому из пп.1-11 формулы и определяют наличие комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного окисления липидов.

13. Способ оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце путем выявления антигена, образовавшегося в результате реакции гидроперекиси липида с первичным амином, заключающийся в том, что обеспечивают контактирование образца с антителом или его фрагментом или их конъюгатом, которые перекрестно связываются с антителом или его фрагментом по любому из пп.1-11 формулы, и определяют наличие комплекса антиген-антитело, по количеству которого оценивают уровень перекисного окисления липидов.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что уровень перекисного окисления липидов сравнивают с нормой для популяции.

15. Набор для оценки уровня перекисного окисления липидов в биологическом образце, содержащий антитело или его фрагмент по любому из пп. 1-11 формулы.

16. Набор по п.14, дополнительно содержащий второе антитело, взаимодействующее с анти- телом или его фрагментом по любому из пп.1-11 формулы.

17. Способ диагностики заболеваний, обусловленных перекисным окислением липидов, заключающийся в том, что осуществляют оценку уровня перекисного окисления липидов в полученном от пациента биологическом образце в соответствии со способом по любому из пп.12, 13 формулы.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что заболевание выбрано из группы, включающей заболевание сердечно-сосудистой системы, центральной нервной системы, атеросклероз, нейродегенеративное или воспалительное заболевание, в частности, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона), эндометриоз, гломерулонефрит, преэклампсию, болезнь Альцгеймера, псориаз, бронхиальную астму, атопический дерматит, солидную опухоль, саркому Капоши, ревматоидный артрит или ишемическую реперфузию.