KR19990071477A

KR19990071477A - 염증성질환의진단방법및매개체

Info

Publication number: KR19990071477A
Application number: KR1019980703748A
Authority: KR
Inventors: 샘패쓰 파타사르티; 러쎌 엠. 메드포드; 알. 웨인 알렉산더
Original assignee: 아테로제닉스, 인코포레이티드; 데니스 리오타; 에모리 유니버시티
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 1999-09-27
Also published as: JP2000500879A; EP0883811A1; SK66198A3; PL326750A1; US20020052000A1; CA2237191A1; NO982265L; HUP0102907A1; AU722625B2; NO982265D0; EA002520B1; NZ330475A; EA199800460A1; CZ146598A3; BG102541A; BR9710402A; AU4647397A; WO1998012561A1

Abstract

일차 아민과 지질 하이드로과산화물과의 반응에 의해 형성된 항원에 대한 항체와 숙주의 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 숙주의 산화 상태의 진단 및 정량, 더욱 구체적으로는 숙주의 지질 과산화도를 진단 및 정량화하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 이 방법은 숙주의 산화 위험도 및 산화에 의한 피해가 존재하는지를 평가한다. 본 발명은 또한 이러한 방법 및 키트에 유용하며 임의로 정제 또는 분리된 형태일 수 있는, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 및 항체 단편에 관한 것이기도 하다.

Description

염증성 질환의 진단 방법 및 매개체

산화적 스트레스 (oxidative stress)는 여러 가지 질병과 연관되어 있다. 산화-유도 질환을 매개하는 것으로 보여지는 산화적 스트레스의 생성물이 과산화 지질이다. 생체계에 있어서 지질 과산화물의 생성은 효소 (예컨대 리포옥시겐나제, 사이클로옥시겐나제, 퍼옥시다제, 및 기타 옥시겐나제류) 뿐만 아니라 세포내, 세포외, 또는 세포 표면의 반응성 산소의 생성을 통한 비효소적 수단을 비롯한, 여러 가지 원인에 의해 야기될 수 있다. 세포막과 세포외 주변의 산화된 지질은 세포 양상을 심각하게 변경시킬 수 있다. 과산화 지질의 해로운 효과 및 이들의 분해산물은 아테롬성 동맥경화증의 병원론에서 이미 잘 인식되어 있다 (Herttuala 외, Journal of Clinical Investigation, 84:1086-1095 (1989); Gonen 외, Atherosclerosis, 65:265-272 (1987); 및 Jurgens 외, Biochim. Biophys Acta, 875:104-114 (1986)). 이제 산화는 심장혈관계 질환의 잠재적인 위험 인자인 것으로 여겨지고 있다 (Palinski 외, Arteriosclerosis, 10:325-335 (1990)).

지질의 산화는 염증성 질환 및 심장혈관 질환과 연관이 있기 때문에, 어떤 숙주, 특히 인간에 있어서 지질의 산화 정도를 정량 및 평가하기 위한 신뢰할만한 시험법을 개발하는 것은 의료적으로 중요한 목표가 되고 있다.

어떤 숙주에 있어서 지질 하이드로과산화물 (lipid hydroperoxides)의 정량은 그 하이드로과산화물의 직접 측정 또는 그 하이드로과산화물의 분해 또는 반응산물에 기초할 수 있다. 다불포화 지방산 ("PUFAs": Polyunsaturated fatty acids)은 2개 이상의 이중 결합을 가지며, 15-20%는 3개 이상의 이중 결합을 갖는다. 자연발생적인 불포화 지방산은 전혀 콘쥬게이트 (conjugated)되어있지 않으며; 그 이중 결합은 적어도 하나의 메틸렌기에 의해 분리된다. 지질 하이드로과산화물로의 산화 공정이 진행되는 동안, PUFAs의 이중 결합은 콘쥬게이트될 수 있는데, 이는 가장 해로운 산화 경로 중 하나이다. PUFAs 산화의 초기 생성물은 지질 하이드로과산화물 (LOOH)과 그의 대부분이 콘쥬게이트 이중 결합을 함유하도록 변경된 지질 하이드로과산화물 자유 래디칼 (LOOH· 또는 LOO·)인 것으로 보여진다. 이러한 생성물들 또는 그들의 반응 또는 분해 산물들은 생물학적 시료에 있어서 지질의 산화 정도를 분석하는 데 이용되어 왔다.

예컨대, LOOH는 불활성인 LOH, 알코올로 생체내 환원될 수 있다. LOH는 알코올 분석법에 의해 검색가능하며, LOH가 콘쥬게이트된 것인 경우, 이중 결합 콘쥬게이션을 측정하는 여하한 방법으로도 검색가능하다. 그러나, 생물학적 시료에 있어서는, 여러 가지 알코올이나 콘쥬게이트된 이중 결합-함유 분자들이 있을 수 있기 때문에, 상기 중 어떠한 테스트법도 만족스러울 정도로 특이적이지 못하다.

다른 한편, LOOH는 금속에 의해 생체내 산화되어 매우 반응성이 좋은 이중 결합 에서 래디칼(LOOH·)을 형성할 수 있다. 이 분자는 종종 산화 위치에서 분해되어 2개의 알데히드를 함유하는 단편을 형성하거나, 또는 분해되지 않을 경우, 종종 케톤을 형성하게 된다. 이 분자는 비대칭 부분으로 분해될 수 있으며, LOOH가 두 개 이상의 이중 결합을 갖는 경우, 이것은 여러 가지 생성물을 형성할 수 있다. LOOH가 3개 이상의 이중 결합을 가지면, 말론디알데히드 (MDA)가 분해 생성물 중의 하나가 된다. 말론디알데히드의 존재는 티오바르비투르산 (TBA: thiobarbituric acid)을 이용하여 검색할 수 있는데, 이것은 MDA와 반응하여 측정 및 정량이 용이한 형광 화합물을 생산한다. TBA 반응성 기질은 "TBARS"라 칭한다. TBA 테스트는 다른 알데히드, 슈가 및 아미노산에 대해 거짓 양성반응을 나타내는 경향이 있기 때문에, 숙주의 지질 산화 상태를 테스트하는 데 이용하기에는 적절치 못하다. 따라서 이것은 샘플을 주의깊게 다루는 연구방식에서만 유용할 따름이다. 또한, 이 방법은 3개 이상의 이중 결합을 갖는 지질 과산화물의 양만을 측정해준다.

시료 중 LOOH를 측정하는 또 다른 수단은 이를 요오드화칼륨과 직접 반응시켜 측정 및 정량하기 쉬운 착색 복합체인 (I₂)KI를 생성시키는 것이다. 이 테스트의 보다 개선된 방식에서는 류코메틸렌 블루 (leukomethylene blue)를 사용하는데, 이것은 LOOH와 반응하여 착색 생성물을 형성한다. 이 분석은 Kamiya Biomedical Company에 의해 시판된다. TBA법과 마찬가지로, 이 방법은 실험실 시료를 분석하는데만 유용할 뿐이고, 수많은 교차반응 물질을 함유할 수 있는 생체액이나 세포 배양체를 분석하는 데는 이용할 수 없다.

지질 산화시에 생산된 알데히드는 체액 및 조직과 반응한다. 이 알데히드들은 단백질 티올, 리진, 히스티딘 및 기타 잔기를 쉽게 변형시킨다 (Jurgens 외, Biochemical Journal 265:605-608 (1990); Jessup, Biochemical Journal 234:245-248 (1986); Steinbrecher 외, J. Lipid Res. 25:1109-1116 (1984)). 이러한 알데히드 변형 단백질들은 항원성을 갖는다. 이러한 에피토프에 대한 항체들은 아테롬성 동맥경화증 동맥 중의 알데히드-변형 단백질을 검색하여 그의 위치를 찾아내는 강력한 도구가 된다 (Boyd, Am. J. Pathol. 135:815-825 (1980); Haberland 외, Science 241:215-218 (1988); Jurgens, Atheroscler. Throm. 13:1689-1699 (1993)). 그러나, 정상인이나 심지어 아테롬성 동맥경화증 환자에 있어서도, 알데히드-변형 단백질 항원은 혈장 중에 흔히 발견되지 않으며, 조직 중에서 저농도로만 발견될 뿐이다.

지질 하이드로과산화물은 본래 불안정하고, 결과적인 알데히드는 LOOH 분해의 대사 경로에 있어서 몇가지 중 하나에 지나지 않고 생산하는 데 시간이 걸림에 따라, 장기간 생체내에서 존재하지 않기 때문에, 과도적인 LOOH 자체와 근처 화합물과의 반응 산물은 알데히드보다 더 많은 양으로 존재할 수 있으며, 유력한 진단 표적 역할을 할 수 있을 것이다. 예컨대, 지질 과산화물은 지질, 친지질성 분자 및 단백질의 아미노기와 높은 반응성을 나타낸다. 이들의 막 단백질 및 아포단백질 (apoproteins)과의 밀접성은 이러한 변형이 생체계에 있어서 알데히드 유도 변형보다 더 관련성이 있을 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서 세포막 또는 아포단백질 상에서의 LOOH의 생성은 적어도 초기단계에 있어서는, 알데히드와 같은 광범위한 분해산물에 의해 변형된 단백질보다는 LOOH에 의해 직접 변형된 단백질의 생성으로 이어지는 것이다. 1992년 Fruebis, Parthasarathy 및 Steinberg는 폴리펩티드 또는 포스파티딜에탄올아민의 유리 아미노기와 지질 퍼옥시 래디칼 사이에 공조 반응이 일어나 미지 구조의 형광성 부가생성물을 생산한다는 증거를 발표한 바 있다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10588-10592 (1992). Fruebis 등은, 금속 이온 부재하에, 리놀레오일 하이드로과산화물을 폴리펩티드와 함께 또는 불포화 포스파티딜에탄올아민을 단독으로 인큐베이션시켰다. 결과적인 형광 생성물의 형성은 폴리펩티드 또는 포스파티딜에탄올아민을 알데히드, 4-하이드록시노넨알 (이것은 형광 Schiff 염기를 생산함)과 함께 인큐베이션시켜 생성된 경우보다 몇배 더 컸다. Fruebis 등은 두가지 가능한 반응 경로를 제시했는데, 두가지 모두 퍼옥시 래디칼과 유리 아미노기의 상호작용에 의해 개시되는 것이다. 이론적인 반응 경로는 5원환, 6원환 또는 7원환 구조를 생산하도록 서술되었다. 이 기사는 이러한 가설적 구조에 걸맞는 활성을 제시하고 있지 않을 뿐 아니라, 생체내에서 이러한 구조를 실제로 동정하지도 않았다.

Emory University가 출원한 PCT/US95/05880호에는 다불포화 지방산 ("PUFAs")과 그들의 하이드로과산화물 ("ox-PUFAs")이 인체 대동맥 상피세포에 있어서, 시토카인 또는 기타 비시토카인 시그날에 의해 매개되지 않는 메카니즘을 통해, 상피세포 표면 부착 분자 VCAM-1의 발현은 유도하지만, 세포내 부착 분자 (ICAM-1) 또는 E-셀렉틴의 발현은 유도하지 않음을 개시하고 있다. 특히, 리놀레산, 아라키돈산, 리놀레일 하이드로과산화물 및 아라키돈 하이드로과산화물은 VCAM-1의 세포 표면 유전자 발현은 유도하나, ICAM-1 또는 E-셀렉틴의 세포 표면 유전자 발현은 유도하지 않는다고 기재되어 있다. 포화 지방산 (예컨대 스테아르산)과 모노불포화 지방산 (예컨대 올레산)은 VCAM-1, ICAM-1 또는 E-셀렉틴의 발현을 유도하지 않는다. 이 문헌은 또한 PUFAs와 그의 지방산 하이드로과산화물에 의한 VCAM-1의 유도가 피롤리딘 디티오카바메이트 (PDTC)를 비롯한 디티오카바메이트에 의해 억압됨을 보고하여, 이러한 유도가 산화된 시그날 분자에 의해 매개됨과, 분자의 산화가 차단, 보류되거나, 또는 산화환원 변형 시그날이 그의 조절적 표적과 상호작용함으로써 달리 방지될 경우, 유도가 방지된다는 결론을 뒷받침하고 있다.

역시 Emory University가 출원한 PCT/US93/10496호에는, 디티오카르복실레이트, 특히 디티오카바메이트가 상피세포 표면 부착 분자 VCAM-1의 유도 발현을 차단하고, 따라서, 아테롬성 동맥경화증, 후-혈관형성 재협착, 관상동맥 질환 및 협심증과 같은 심장혈관 질환 뿐 아니라, VCAM-1에 의해 매개되는 비심장혈관 염증성 질환의 치료에도 유용하다고 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 숙주에 있어서의 산화-유도성 질환의 위험도를 평가하는 수단으로서, 그 숙주의 지질 과산화 상태를 평가하기 위한 방법 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주의 지질 과산화 상태를 평가하기 위한 상업적으로 경쟁력있는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산화-유도성 질환의 의학적 처치의 치료적 효과를 평가하기 위한 수단으로서, 숙주의 지질 과산화 상태를 평가하기 위한 방법 및 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 숙주의 지질 과산화 상태를 진단 및 정량화하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주의 지질 과산화 상태의 진단 및 정량화에 유용한 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주의 지질 과산화도를 저하시키기 위한 후보 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 응답의 새로운 매개자 (mediators)를 동정 및 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 염증성 응답의 매개에 대한 새로운 치료제 및 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환의 동정 및 정량화를 위한 조영제 및 조영법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자궁내막증을 비롯한 자기항체와 관련된 질환에 걸린 환자의 혈장 중에서 자기항체를 검색하기 위한 방법 및 키트를 제공하는 데 있다.

발명의 요약

이 방법은 단백질과 기타 일차 아민 함유 화합물이 지질 하이드로과산화물에 의해 변형되면 항원성 에피토프가 생산된다는 발견에 기초한 것이다. 이러한 항체들은 정상적인 혈장중에도 존재하고, 산화-유도성 질환을 앓고 있는 환자의 혈장 중에서는 정상치 이상으로 더 많이 존재할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 환자의 생물학적 시료 중에서 지질 과산화물 수준을 시험하는 이 테스트는, 숙주 혈장 중에 상당량 존재하는 항원에 대해 분석을 행하고, 생체내 시료에 대해 신뢰할 수 있을 정도로 수행할 수 있다는 점에서, 기존의 시험법보다 우수하다. 이와 대조적으로, 항원성 알데히드-변형 단백질은 불안정 협심증과 같은 특이한 경우를 제외하고는, 알데히드-변형 단백질에 대한 항체에 의해 혈장 중에서 검색되지 않았다. 또한, 지질 하이드로과산화물에 의한 단백질 및 기타 일차 아민 함유 화합물의 변형에 대한 항체들은 알데히드 변형 단백질과 교차반응하지 않는다.

본 발명의 바탕이 되는 발견을 좀 더 이해하기 쉽게 설명하면 다음과 같다. 토끼의 혈청 알부민을 지질 과산화물을 이용하여 변형시킴으로써 폴리클로날 항체를 생산하였다. 이 폴리클로날 항체는 지질 과산화물에 의해 변형된 단백질은 인식하지만, 변형되지 않은 단백질들은 인식하지 못한다. 면역조직화학을 이용하자, 이 항체가 인체 아테롬성 동맥경화증 병변, 콜레스테롤이 주입된 원숭이의 아테롬성 동맥경화증 동맥 및 지질 과산화물과 함께 예비 인큐베이션된 RAW 대식세포 중에 존재하는 에피토프들을 인식하는 것으로 분석되었다. 항체는 웨스턴 블럿 분석에 유효하였으며 정상적인 혈장 중의 변형된 에피토프의 존재 여부를 검색하는 데도 이용가능하다.

본 발명은 고체 지지체 상에 고정될 수 있고 바람직하게는 검색가능한 물질에 의해 표지되어 있는 항체의 적정량을 포함하는, 숙주의 지질 과산화 상태를 분석하기 위한 키트 및 방법에 관한 것이기도 하다. 항체는 공지법에 의해 여러 가지 고체 기질에 고정시킬 수 있다. 적절한 고체 담체 기질에는 스틱, 비즈, 컵, 납작한 팩, 또는 기타 고체 담체에 의해 지지된 막 또는 코팅물을 갖는 물질이 포함된다. 기타 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 고분자 막을 들 수 있다. 항체는 플루오로크롬, 방사능 표지, 바이오틴, 또는 기타 효소, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제 및 2-갈락토시다제와 같이 검색용 물질로 표지시킬 수 있다. 검색용 물질이 효소인 경우, 검색용 물질을 검색하기 위한 수단을 키트와 함께 제공할 수 있다. 검색용 물질을 검색하기 위한 바람직한 수단은 효소 및 그 효소와 접촉시 색상 변화를 일으키는 효소 기질을 검색용 물질로 사용하는 것이다. 키트는 또한 예컨대 색상표, 또는 수치 참고표와 같이 분석결과를 평가하기 위한 수단을 포함할 수도 있다.

키트는 정성 또는 정량적으로 기능하도록 고안될 수 있다. 키트는 과학실험실, 의료실험실 또는 현장에서 사용가능하다.

지질 하이드로과산화물과 일차 아민과의 어떤 반응 생성물은 세포 응답의 매개자로 독립적인 생물활성을 나타낸다는 것이 추가로 밝혀졌다. "옥시킨(oxykine)"은 본문에서 지질 하이드로과산화물과 일차 아민의 반응에 의해 생성되고 표적 세포로부터 응답을 이끌어낼 수 있는 형광 단백질 또는 지질을 칭하는 것으로 한다. 옥시킨은 세포외 생산되거나 또는 세포막이나 심지어 세포내적으로 형성되어 세포 응답을 매개할 수 있다. 일차 아민을 갖는 생물학적으로 활성인 광범위한 분자들이 생물학적 활성을 갖는 옥시킨으로 전환될 수 있다.

옥시킨의 예로는 알부민 또는 폴리리진, 또는 포스파티딜에탄올아민과 같은 저분자 화합물 중 예컨대 리진과 같은 적절한 아미노기와 리놀레산 하이드로과산화물 (13-HPODE)과의 안정한 형광성 반응생성물을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 옥시킨은 선택적인 항산화제에 의해 억제될 수 있는 메카니즘을 통해 상피 VCAM-1 유전자 발현을 유도하는 강력한 염증 시그날로서 작용한다. 옥시킨에 의해 유도될 수 있는 기타 세포 응답으로는 MCP-1, IL-1, TNF-α, ICAM, MCSF, 및 E-셀렉틴의 생산 또는 활성화를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

모든 일차 아민이 지질 하이드로과산화물과 반응하여 숙주의 산화상태를 결정하는 항체를 생산하는 데 이용될 수 있는 항원을 형성할 수 있지만, 모든 펩티드나 생물학적으로 발생되는 일차 아민이 옥시킨을 형성하는 것은 아니다. 이것은 항체 응답을 이끌어내는 데 요구되는 것과 세포 응답을 매개하는 데 요구되는 것이 서로 다를 수 있기 때문이다.

다른 구체예에서는, 본 발명에 따라, 생물학적 시료 중 산화에 의한 손상을 평가하는 방법이 제공되는데, 이 방법은: (i) 일차 아민과 지질 하이드로과산화물과의 반응에 의해 형성된 항원을 분리하고 이어서; (ii) 그 일차 아민을 동정하는 단계를 포함한다. 어떤 환경에서는 아민의 특성이 산화적 장해가 일어나는 위치와 관련한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명은, 심장혈관 질환을 비롯한 염증성 질환의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.

도 1은 토끼의 혈청 알부민과, 지질 하이드로과산화물 변형된 토끼의 혈청 알부민의 실시예 4의 항체에 의한 인식을 405 nm에서의 광학밀도 대 나노그램 단백질로서 측정하여 나타낸 막대 챠트 그래프이다.

도 2는 실시예 4의 항체에 의한 산화-LDL의 인식을 마이크로그램 농도 대 광학 밀도 단위로 나타낸 막대 챠트 그래프이다.

도 3은 최대 TNF-α 유도 시그날의 백분율로서 표시한, 산화된 소의 혈청 알부민에 의한 VCAM-1 (A) 및 ICAM-1 (B)의 투여량-의존 유도를 나타낸 막대 챠트 그래프이다.

도 4는 지질 과산화물 생산 시스템을 이용한 13-HpODE 변형 옥시킨의 대규모 합성을 위한 개략적인 다이어그램이다. 표적 단백질은 10 kDa 분자량 컷 오프 (cut off) 막에 위치시키고 13-HpODE 생산 시스템은 매 8-16시간마다 교체하였다.

도 5는 sLO와 리놀레산이 oxSLO의 형성을 위해 최소 필요 조건임을 증명하는 웨스턴 블럿 다이어그램(Western blot diagram)이다.

도 6은 대량 반응으로 96 시간 후에 면역반응성을 갖는 13-HpODE 처리 샘플의 검측을 증명하는 웨스턴 블럿 다이어그램이다.

도 7은 시간에 걸친 TNF 퍼센트로서 나타낸 13-HpODE 처리 sLO에 의한 ICAM-1 유도의 그래프이다.

도 8은 13-HpODE 변성 sLO가 비처리된 sLO보다 큰 소수성을 갖는다는 것을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.

도 9는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 모아진 oxSLO의 단편들에 의한 ICAM-1 유도의 그래프이다.

도 10은 생물학적으로 활성인 단편 9 및 10이 겔 여과 크로마토그래피에 의해 용리된 총 단백질 부분으로만 이루어진다는 것을 나타내는, 겔 여과 크로마토그래피에 의해 모아진 oxSLO 단편 대 흡수도(280 nm)의 그래프이다.

도 11은 TNF에 의한 ICAM 유도의 퍼센트로서 대두 리포옥시겐나제(lipoxygenase), 리놀레산 및 산화 대두 리포옥시겐나제에 의한 ICAM-1 유도의 막대 그래프이다.

도 12는 인체 대동맥 내피 세포(HAEC: Human Aortic Endothelial Cells)내에서 대량 생산에 의해 합성된 산화된 대두 리포옥시겐나제 및 대두 리포옥시겐나제에 의한 ICAM-1 유도의 막대 그래프(TNF에 의한 퍼센트 유도의 작용으로서)이다.

도 13은 oxSLO가 세포 표면 ICAM 발현을 투여량 종속 방식으로 활성화시키는 것을 나타내는, 산화 대두 리포옥시겐나제 및 대두 리포옥시겐나제에 의한 ICAM-1 유도의 막대 그래프(TNF에 의한 퍼센트 유도의 작용으로서)이다.

도 14는 산화 대두 리포옥시겐나제에 의한 ICAM-1 유도의 막대 그래프(TNF에 의한 퍼센트 유도의 작용으로서)이다. 이 그래프는 oxSLO가 VCAM을 유도하는 것보다 큰 정도로 ICAM을 유도하는 것을 나타낸다.

도 15는 SLO가 아닌 oxSLO가 인체 대동맥 내피 세포(HAEC)에서 VCAM, ICAM 및 MCP-1 mRNA의 집적을 유도하는 것을 나타내는 노오쓴(Northern) 블럿이다.

도 16은 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)에서 VCAM, ICAM 및 MCP-1 mRNA의 신속한 집적을 나타내는 노오쓴(Northern) 블럿이다.

I. 숙주의 산화 상태의 진단 방법

A. 항체의 생성

(i) 지질 하이드로과산화물

지질은 클로로포름과 에테르와 같은 비극성 용매에 의해 세포 및 조직으로부터 추출되는 비수용성, 오일상 또는 그리스상의 유기 물질이다. 지질의 가장 많은 형태는 트리아실글리세롤이다. 지방산은 지질의 특징적인 구축 블록들이다. 지방산은 전형적으로 탄소 원자 4∼24 개로 이루어진 긴 사슬의 유기 카르복실산이다. 지방산은 전형적으로 세포 또는 조직내에서 유리되건 분해되지 않지만, 리포프로테인, 알부민, 트리아실글리세롤, 왁스, 포스포글리세라이드(예컨대, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜클로린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 또는 카디올리핀), 스핀고지질(예컨대, 스핀고미엘린, 세레브로시드 또는 강글리오시드) 또는 스테롤 및 그의 지방산 에스테르와 같은 좀더 큰 분자와 결합된다.

본문에 기재된 바와 같이, 폴리 불포화 지방산(PUFA)은 적어도 둘 이상의 알켄닐 결합으로 이루어진 지방산을 가르키는 것이며, 리놀산(C₁₈ㅿ), 리놀레산(C₁₈ㅿ), 아라키돈산(C₂₀ㅿ) 및 아이코사트리에노산(eicosatrienoic acid: C₂₀ㅿ)이 포함되는데, 이에 국한되는 것은 아니다.

본문에 사용된 용어로서, 지질 하이드로과산화물은 다음을 지칭한다:

1. (i) 폴리 불포화 지방산; 또는 (ii) 폴리 불포화 지방산의 잔기를 함유하는 분자이며;

2. 여기서, 적어도 알켄닐 결합 하나 이상이 하이드로과산화물로 전환되어 있다.

지질 하이드로과산화물의 비한정성 예로서는 다음을 들 수 있다:

지질 하이드로과산화물은 생체내에서 형성될 수도 있는데, 리포옥시겐나제, 사이클로옥시겐나제, 퍼옥시다제 또는 그외의 옥시겐나제 효소에 의해 불포화 지방산이나 PUFA 잔기를 함유하는 지질로부터 효소적으로 형성될 수 있을 뿐만 아니라, 세포내, 세포외 또는 세포 표면 반응성인 산소류의 발생을 통해 비효소적인 방법에 의해 형성될 수 있다. 지질 과산화물은 표준 방법을 이용하여 폴리 불포화 지방산이나 PUFA 잔기를 함유하는 지질의 산화 반응을 통해 화학적으로 생성시킬 수 있다.

광범위하게 다양한 지질 하이드로과산화물이 선정된 아민과 반응하여 에피토프를 생성하는 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 이같은 반응은 매우 비선택적임을 알 수 있는데; 사실상 그어떤 지질 하이드로과산화물이 일차 아민과 항원성으로 반응할 것이다.

(ii) 일차 아민

그어떤 일차 아민이라도 항원성 물질을 형성하는 지질 하이드로과산화물과 반응하는 데 사용될 수 있다. 이 아민이 소수성 및 친핵성이 클수록 반응에 좀더 유리하다는 것이 밝혀져 있다. 예를 들면, 벤질아민은 에틸아민보다 훨씬 신속하게 지질 하이드로과산화물과 반응한다. 이를 기초로 하여, C₁∼C₃알킬 아민 및 암모니아와 같은 작은 분자의 아민류는 바람직하지 못하다. 숙주에게 투여하기 위해서는, 바람직한 아민으론 단독으로든지 지질 하이드로과산화물과 반응 후에든지 독성이 나타나지 않는 것이여야만 한다. 이 아민은 좀더 큰 분자, 예컨대 헵텐에 부착되어, 경우에 따라 항원성 반응을 증진시킬 수 있다.

천연 일차 아민 함유 분자의 합성체, 예컨대 펩티드 및 단백질이 바람직하다. 그 예로서는, 말단 종결 아미노기, 리진 잔기(예컨대, 알부민 및 폴리리진) 또는 히스티딘 잔기를 함유하는 펩티드 또는 단백질을 들 수 있다. 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및 아민-종결된 호르몬 또한 적절하다.

지질 하이드로과산화물과 단백질의 반응은 생체내에서 자연적으로 발생된다는 것이, 보바인 혈청 알부민과 같은 시판 단백질에 지질 하이드로과산화물/아민 에피토프가 함유되어 있다는 사실에 의해 입증된다. 이 때문에, 항원 제조용 합성 펩티드 또는 단백질 및, 종국에는 품질 조정 목적을 위해 항체를 사용하는 것이 바람직하게 될 수 있다.

(iii) 지질 하이드로과산화물과 일차 아민의 반응

단백질과 반응하는 지질 하이드로과산화물의 성능은 Fruebis, Parthasarathy 및 Steinberg의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 89, pp 10588-10592, November 1992 Medical science에 의해 입증되었다. 이 논문에서는, 지질 하이드로과산화물을 대두 리포옥시겐나제를 갖는 리놀산 또는 리놀산의 포스포지질에 의해 제조한 후에, 이 과산화물을 금속 이온 없이 폴리펩티드로 배양시켰다. 논문에 개시된 일반적인 접근 방법 및 실험 조건들은 광범위한 지질 하이드로과산화물/아민 부가 생성물을 제조하는 데 사용할 수 있다.

지질 하이드로과산화물과 일차 아민 사이의 화학적 반응은 생체 조건과 유사하게, 중성이나 중성에 근사한 pH의 실온에서 실험실 단위나 제조용 플랜트 단위로 수행될 수 있다. 수용성 조건이 바람직하지만, 반응물 및 생성물이 유기적으로 충분히 가용된다면 유기 용매에서 수행할 수 있다. LOOH는 수용성 용매내에서보다 유기 용매내에서 한층 불안정하게 될 수도 있다. 반응 온도는 용매의 끓는점까지 원하는 바에 따라 상승시킬 수 있다. 반응 공정은 형광 분광기(fluoresecence spectro- photometry)에 의해 관찰할 수 있다. 생성물의 들뜸 현상은 전형적으로 330과 360 사이에서 발생하고 방사 현상은 전형적으로 420과 450 사이에서 발생한다. 샘플의 형광 분석에서 추가 증가 현상이 나타나지 않을 때, 반응을 종결한다. 전형적인 반응에서, 지질 하이드로과산화물과 아민은 대략 1.5 : 1의 비로 존재하지만, 경우에 따라 수율을 조절하거나 그 외의 목적을 위해 그외의 비율로 사용할 수도 있다.

(iv) 항체의 생성 및 용도

숙주의 지질 과산화 반응의 상태 진단용 방법 및 키트는 모노클로날이나 폴리클로날 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다 .

본문에 기재된 "항체"라 함에는 상기 에피토프와 특정적이지만 가역적으로 결합하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 및 항체 단편이 포함된다. 항체 또는 항체 단편이 모노클로날 항체 또는 항체 단편으로부터 유도되는 것이 바람직하다. 지질 하이드록 과산화물과 일차 아민의 반응에 의해 형성된 항원에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 제조는 어떠한 공지 방법을 이용하여서도 달성할 수 있는데, 이러한 방법들은 참고문헌으로서 첨부한 Zola, H.(1988)의 "Monoclonal Antibodies - Amanual of techniques" CRC Press, 및 Antibodies: A Labotory Manual, Harlow & Lane; Cold Spring Harbor(1988)에 개시되어 있다.

일례를 들면, 주로 실험용으로서, 동물들에게 이 항원 및 바람직하게는 부형제를 접종시켰다. 이차 접종은 일정한 주기를 두고 부형제와 혼합된 PBS내 항원을 임의로 연속 접종한다. 그리고나서, 접종후에 동물들을 채혈한다. 혈병과 파편들을 제거한 후에, 혈청을 ELISA로 분석할 수 있다. 매달, 또는 그 회의 주기로 적정 농도를 초기 면역화 후에 얻을 수 있다.

또는, 항원 및 바람직하게는 부형제를 접종한 동물들로부터 비장을 채취한다. 비장 세포들을 분리하고 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 불멸 세포와 융합(fused)시킨다. 용합된 하이브리도마 세포들을 선별하여 생체내에서 배양한다. 하이브리도마 세포 배양 유체는 바람직한 특성을 갖는 하이브리도마 항체의 존재에 대한 테스트를 실시한다. 적절한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 동정하는 선별 방법은 바람직한 면역 특이성을 얻는 데 중요한 점이다. 이 하이브리도마 세포들은 항원에 특정적인 항체들의 존재에 대해 테스트될 수 있는데, 예를 들면 표준 방법에 의해 수행되는 ELISA를 이용하여 테스트될 수 있다.

일반적으로, 선택된 지질 하이드로과산화물과 선택된 아민의 생성물이 한 가지의 에피토프를 갖는 항원을 함유한다면, 이 항원은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생성을 유도할 것이다. 다중 에피토프를 갖는 항원이나 다중 항원이 사용된다면, 폴리클로날 항체가 얻어질 것이다. 예를 들면, LOOH가 혈청 알부민과 반응하는 경우에, 알부민이 분자대 다양한 위치에 다수의 리진 잔기를 갖기 때문에 다중 에피토프를 갖는 항원이 생성된다. 이 항원은 폴리클로날 항체들의 생성을 유도할 것이다. 반면에, 간단한 아민과 LOOH와의 반응 생성물이 항원으로서 사용된다면, 이 항원은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들의 형성을 유도할 수 있다. 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민이 불포화 지질부를 함유하도록 선정된다면, 지질 성분과 아민 성분 모두로서 작용할 수 있다. 이러한 분자는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생성을 유도한다.

천연 원료로부터의 단백질이 소량의 LOOH/아민 항원을 함유할 수 있다는 것이 관찰되어 왔다. 이 때문에, 품질 조정을 목적으로 하여, 합성 펩티드 또는 합성 아민 함유 분자와 LOOH를 반응시켜 항체 제조용 항원을 형성시키는 것이 바람직하다.

이 항체의 가변성 무거운 영역(V_H) 및 가변성 가벼운 영역(V_L)이 항원 인식에 영향을 미치는데, 사실이 초기의 프로테아제 동화 작용 실험에 의해 먼저 인식된다. 추가 확정이 설치 동물 항체의 "인체 적합화"에 의해 발견되었다. 설치 동물원의 가변성 영역들은 인체원의 일정 영역들에 융합되어 생성된 항체가 설치 동물 발원성 항체의 항원 특이성을 갖도록 할 수 있다(Morrison et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855). "CDR 이식"은 설치 동물의 항체들은 인체 적합화하는 데 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 선택적으로, 재조합 모노클로날 항체들이 "영장류 적합화"될 수도 있다. 즉, 항체들이 형성되는데, 여기서 가변성 영역들이 두 가지의 다른 영장류 종으로부터 유도되고, 바람직하게는 짧은꼬리원숭이(macaque monkey)로부터의 항체의 가변성 영역 및 인체로부터의 일정 영역으로부터 유도된다. 이러한 항체들의 장점들은 인체 면역글로불린, 인체 작동체 작용의 존재, 감소된 면역성 및 좀더 긴 혈청 반감기에 대한 큰 상동성을 포함한다(Newman et al. (1992) Biotechnology 10, 1455).

항원에 특정적인 영역은 예컨대, McCafferty 등의 Nature 348: 552-554(1990)의 기술 방법을 사용하여 박테리오파지의 일부로서 발현될 수 있다. 본 발명의 항체-유사 분자들은 Griffiths 등의 EMBO J. 12, 725-734 (1993)에 개시된 방법을 이용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선정될 수 있는데, 항원들이 파지들을 선택하는 데 고정되어 사용된다. 또한, 분자막(monolayer)에서 생장하여 포르알데히드든지 글루타르알테하이드로 고정되거나, 고정되지 않은 적절한 세포들을 파지와 결합하는 데 사용할 수 있다. 부적절한 파지들은 씻어내고 결합된 파지들을 항원과의 그의 결합을 분해시키고 박테리아내에서 재증폭시킴으로써 회수되낟. 이같은 선별 및 증폭 공정은 수회 반복 실시하여 본 발명의 항체-유사 분자들인 그러한 분자들에 대한 파지 개체수가 풍부해지도록 한다.

항체 단편에는 Fab-유사 분자(Better et al. (1988) Science 240, 1041); Fv 분자(Skerra et al (1988) Science 240, 1038); V_H및 V_L파트너 영역들이 신축 가능한 올리고펩티드인 단일-사슬 Fv (ScFv: single-chain Fv) 분자(Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) 및 분리된 V 영역들로 이루어진 단일 영역 항체들(dAbs)(Ward et al. (1989) Nature 341, 544)가 포함된다. 그의 특정 결합 부위들을 포함하는 항체 단편들의 합성에 관련된 기술 방법들에 대한 일반적인 논술은 Winter & Milstein의 Nature 349, 293-299 (1991)에 개시되어 있다.

Fab, (Fab)₂, Fv, scFv 및 dAb 단편들을 포함한, 이에 국한되지는 않는 항체 단편들이 본 발명에 포함된다. 항체-유사 분자들은 국제공개공보 제 WO 84/03712 호의 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

항체 전부보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리할 수 있다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편들 모두가 E. coli에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어, 다량의 단편 생산이 용이하게 될 수 있다.

전체 항체들 및 F(ab')₂단편들은 "이가(bivalent)"이다. "이가"란, 이 항체들 및 F(ab')₂단편들이 두 가지의 항원 결합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 반대로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편들은 하나의 항원 결합 부위를 갖는 일가이다.

Tan L.K. 및 Morrison, S.L.의 Adv. Drug Deliv. Rev. 2: 129-142 (1988); Williams, G.의 Tibtech 6: 36-42 (1988); 및 Neuberger, M.S. 등의 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799 (1988)에 개시된 바와 같이(모두 참고문헌으로 첨부함), "항체 공학" 기술은 빠르게 진보되고 있으며, 본 발명의 항체들로부터 유도된 항체-유사 분자들을 제조하는 데 매우 적합하다.

이 항체들은 이들과 특정적으로 결합하는 항원의 연구, 국부화, 분리 및 정제에 관련된 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히, 항체들은 항원을 발현시키는 세포들의 이미지화 및 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 신티그래프적인 방사선 표지 약물, 방사선 동위원소 약물, 심장 혈관성 약물, 항염증 약물 또는 그외의 약물, 프로드러그 또는 그 외의 세포 공정 매개 화합물과 함께 프로드러그를 심장혈관성 약물, 항염증성 약물 또는 그외의 바람직한 약물로 전환시키기 위한 효소와 짝을 이룰 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는 "결합 부분"을 갖는데, 이는 본 발명의 항체로 구성되고, "작용 부분"을 갖는데, 이는 방사선 표지 약물이나 효소 등으로 이루어진다. 결합 부분 및 작용 부분은 연결부(linking moiety)에 의해 분리될 수 있다.

콘쥬게이트(또한, 펩티드 또는 폴리펩티드라면)의 결합 부분과 작용 부분은 가교 폴리펩티드의 통상적인 그어떤 방법으로도 함께 연결될 수 있는데, 이 방법들은 일반적으로 O'Sullivan 등의 Anal. Biochem. 100, 100-108 (1979)에 개시된 바와 같다. 예를 들면, 한 쪽 부분은 티올기로 풍부해질 수 있고, 나머지 다른 부분은 이러한 티올기와 반응할 수 있는 2 작용기성 물질, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)또는 요오드아세트산의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHIA)와 반응할 수 있다. 예를 들면, m-말레인요오드벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르로 달성되는 아미드와 티오에테르 결합은 일반적으로 디설파이드 결합보다 생체내에서 좀더 안정하다.

또는, 항체 또는 일부 항체 단편에 대한 경우일 수 있는 바와 같이, 결합 부분이 탄수화물을 함유한다면, 작용 부분은 EP 0 088 695에서의 연결 기술 방법을 이용하여 이 탄수화물 부분을 경유하여 연결될 수 있다.

이 콘쥬게이트의 작용 부분은 Bagshawe와 그의 동료들에 의해 개시된 바(Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531; Bagshawe et al (1988) Br. J. Cancer 58, 700; WO 88/07378)와 마찬가지의 기술 방법을 이용하여, 프로드러그를 약물로 전환시키는 효소가 될 수 있다.

반드시 전체 효소가 이 콘쥬게이트내에 존재할 필요는 없지만, 물론, 이 촉매 부분이 존재해야만 한다. 소위 "아브자임(abzymes)"이 사용될 수 있는데, 모노클로날 항체가 통상의 반응성 매개 상태를 촉매화하기 바라는 반응과 관련된 화합물로 상승된다. 그 후에, 생성되는 항체는 반응을 위한 효소로서 작용한다.

이 콘쥬게이트는 크기 배출 또는 친화도 크포마토그래피에 의해 정제되고, 이중 생물학적 활성도에 대해 테스트될 수 있다. 항원 면역 활성도는 살아 있는 세포 방사선 면역 분석으로, 및 고정된 항원을 갖는 효소-연결 면역 흡수 분석(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 측정될 수 있다. 효소 분석은 분광학적으로 405 nm에서 측정되는 2-니트로페놀을 방출시키는, ONPG(O-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드)와 같은, 글루코오스 잔기가 가수분해되는 경우에 흡수도에서 변화를 일으키는 기재를 사용하여 β-글루코시다제용으로 사용될 수 있다.

이 콘쥬게이트의 안정도는 크기 배출 FPLC 분석 이후에, 혈청내에서 37 ℃로 배양시킴으로써 초기에 생체외에서 테스트될 수 있다. 생체내 안정도는 이 콘쥬게이트를 주사한 후에 다양한 시간으로 혈청을 분석함으로써 마우스에서 동일한 방법으로 테스트될 수 있다. 추가로,¹²⁵I로 항체를 방사선 표지하고, 복합화 이전에¹³¹I로 효소를 방사선 표지하여 마우스내에서 이 콘쥬게이트, 유리 항체 및 유리 효소이 생체내 분포를 측정할 수 있다.

또는, 이 콘쥬게이트는 재조합 DNA 기술에 의해 융합 화합물로서 제조할 수 있는데, 이로써, DNA의 길이는 이 콘쥬게이트의 바람직한 특성들을 파괴하지 않는 연결체 펩티드를 코드화하는 영역에 의해 분리되거나, 다른 한 쪽 부근에 이 콘쥬게이트의 두 부분을 코드화하는 각각의 영역으로 이루어진다. 예상해보건데, 이 화합물의 두 가지 작용기 부분은 전체적으로나 부분적으로 중첩될 수 있다. 그 후에, DNA는 공지 방법으로 적절한 숙주에 발현된다.

항체들이나 그의 콘쥬게이트들은 그 어떤 적절한 방법으로, 통상적으로는 비경구적으로, 예컨대, 맥관내로, 복강내로, 및 희석제 및 담체, 예컨대 등장 식염수(맥관내로 투여되는 경우)와의 표준 멸균성, 비발열성 배합물로 투여될 수 있다. 이 콘쥬게이트가 표적 세포와 결합하고 혈류로부터 제거되기만 하면(가능하다면), 전형적으로 하루 정도가 걸리는데, 바람직하다면, 통상 단일 주입량으로서 프로드러그가 투여되거나 표적 부위를 이미지화할 수 있다. 필요한 경우에, 이 콘쥬게이트가 면역원성이기 때문에, 시클로스포린이나 그외의 일부 면역 억제제를 투여하여 좀더 장기간 치료법을 제공할 수 있긴 하지만, 통상적으로 필요한 것은 아니다.

이 콘쥬게이트의 질환을 앓는 조직/정상 조직의 비(적어도, 맥관 전달 이후)가 수일 후에 최고치를 갖는 반면에, 이 때에는, 그램당 주입된 투여량의 퍼센트 단위로 표적 조직과 결합한 콘쥬게이트의 절대량이 좀더 이전 시간들에서보다 낮기 때문에 콘쥬게이트 투여와 프로드러그 사이의 타이밍은 비독창적인 방식으로 조절될 수 있다. 그러므로, 콘쥬게이트와 프로드러그의 투여 사이의 적절한 시간 간격은 항체/효소의 피크 조직 농도와 감염되 조직과 정상 조직 사이의 가장 좋은 분포비 사이에서 타협될 것이다. 콘쥬게이트의 투여량은 통상적인 기준에 따라 의사에 의해 선택될 것이다. 그어떤 콘쥬게이트의 투여량도 정상 기준에 따라, 특히, 표적 조직의 타입, 조건 및 위치 및 환자의 체중을 참고로 하여 선택될 것이다. 치료 기간은 축합체에 대한 그어떤 면역 반응의 속도 및 정도에 따라 부분적으로 좌우될 것이다.

이축합체가 염증 진단용으로 사용되는 경우에 이 축합체의 작용 부분은 대개 시티그래프적인 연구용 방사활성 원자, 예컨대, 테크네튬 99m(^99mTc)이나 요오드-123(¹²³I), 또는 이미지화용의 핵자기공명(NMR; 또한 자기공명영상(MRI)으로도 알려짐)용의 스핀 표지, 예컨대 역시 요오드-123(¹²³I), 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 카본-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철로 구성되며, 이들로 구성되는 것이 좋다.

조직의 선택적 분포를 위해 콘쥬게이트에 사용되는 경우에, 작용 부분은 방사활성이 큰 원자, 예컨대 요오드-131, 레늄-186, 레늄-188, 이트륨-90 또는 납-212로 이루어질 수 있는데, 이웃한 세포들을 파괴하기에 충분한 에너지를 방출한다. 공지 방법으로 이 축합체에 방사능 표지나 기타 표지가 병용될 수 있다. 예를 들면, 이 표지는 수소 대신에 불소-19 등을 함유하는 적절한 반응물을 이용하여 합성할 수 있다.^99mTc,¹²³I,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re 및¹¹¹In 등의 표지들이 시스테인 잔기 펩티드를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리진 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODGEN 방법(Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys Res. Commun. 80: 49-57)을 요오드-123을 병합시키는 데 사용할 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscinti graphy" (Chatal, CRC Press 1989)에는 그 외의 다른 방법들이 상세히 개시되어 있다.

B. 항원 검측 방법

본 발명에는 알차 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응에 의해 생성되는 항원 검측 방법이 포함된다. 이 테스트는 실험실 샘플이나 생물학적 샘플에 대해 수행할 수 있다. 본문에 기재된 바와 같이, 생물학적 샘플이라 함은 예컨대, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 안액, 피부 조직, 복막액, 뇨, 담즙, 심장순환계, 호흡계, 위장계, 생식계, 자궁계, 중추신경 시스템 계통, 눈물, 태반, 배꼽, 탯줄 도관, 젖, 내피성 세포, 자궁내막 세포, 상피 세포, 종양 및 기관들이 포함되지만 이에 국한되지는 않는, 숙주, 전형적으로 인체로부터 분리된 조직이나 유체의 샘플을 이르는 것이며, 세포 배양 배지내에서 세포 생장으로부터 얻어지는 조건화된 배지를 포함하지만 이에 국한되지 않는 시험관내 세포 배양 성분들의 샘플 또한 이르는 것이다.

본 발명에 의하면, 숙주의 산화 상태, 특히 지질 과산화 상태는 숙주의 생물학적 샘플을 다음의 존재 및 그 레벨에 대한 테스트에 의해 측정된다: (I) 섹션 I. A.에 상기한 바와 같이 생성된 항체와 결합하는 항원; 또는 (ii) 섹션 I.A.에 상기한 바와 같이 생성된 항체들과 가교 반응성이 있는 항체. 건강한 사람까지 포함한 모든 숙주가 (I)과 (ii) 모두를 그들의 조직 및 유체내에 다양한 양으로 함유하는 것으로 검측되었다. 사실상, 시판되는 소의 혈청 알부민은 (I)를 함유하여서, 상기 섹션 I.A.에 따라 생성된 항체들에 노출에 대한 양성 반응을 나타낼 것이다. 따라서, 숙주내에서 (I) 또는 (ii) 미량의 존재는 그 자체로는 산화 반응-유도된 질환 상태의 표시가 되지 않는다. 그 대신에, 숙주내의 (I) 또는 (ii)의 레벨은 개체수 및 개별 표준치에 견주어 고려되어야만 한다. 따라서, 진단법은 콜레스테롤에 대한 것과 매우 유사한데, 숙주의 레벨은 통계 표준치와 비교된다. 추가로, 어떤 경우에서는, 콜레스테롤 테스트에서와 같이, 개별적인 레벨의 변화가 개별적인 레벨 그자체보다 중요한 진단 정보를 제공할 수 있다.

전형적으로, 콜레스테롤 테스트가 환자의 심장 질환에 대한 위험을 나타낸다면, 절대 혈청 HDH, LDL 및 트리아실글리세라이드 레벨들을 포함한, 좀더 많은 진단 정보를 얻을 수 있도록 일련의 이차 레벨 테스트를 수행한다. 동일한 콜레스테롤 수준에서, 각 성분들의 다양한 비가 뚜렷한 진단성 및 예후성 함의를 제공한다. 본 테스트는 이와 유사한데, 지질 하이드로과산화물의 레벨이 환자가 심장혈관게 이상을 포함한 염증성 질환에 위험이 있거나 이를 앓고 있다는 것을 나타내면, 이 진단을 확인하고 이 질환에 대해 좀더 많은 정보를 얻을 수 있도록 일련의 이차 레벨 테스트를 수행하는 것이 적합하다. 이같은 이차 레벨 테스트는 추정되는 질병의 다른 대용 마커의 존재 및/또는 양을 측정할 수 있다. 대용 마커들에는 LDL, HDL, 트리아실글리세라이드, L_(P)A(LDL과 단백질 a와의 반응에 의해 생성됨), VCAM(가용성, 순환 VCAM-1 레벨은 전신 계통의 염증 질환을 앓는 환자의 혈청내에서 상승됨), ICAM, E-셀렉틴(E-selectin), MCSF, G-CSF, TNF-α, IL-1 및 MCP-1이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 그 외의 다른 특정 질병의 대용 마커가 공지되어 있으며, 이들 마커에 대한 분석는 의약 실험실로부터 이용 가능하거나 상용화되어 있다.

또는, 표적 단백질에 특정적인 항체 및 산화된 대용 마커를 지질 과산화물 변형된 샘플 자체의 특정적인 성분들을 분석하는 데 사용하여, 일차 아민이 산화 반응 과정에 관련되어 있다는 데에 관한 좀더 많은 정보를 얻을 수 있다. 이는 아테롬성 동맥경화증 및 그외의 다른 염증성 질환들의 진단에 대한 부가적인 특정성 및 민감성을 제공하고, 만약 있다면 지질 과산화된 물질들이 옥시킨으로서 작용하고 있을 수 있다는 측정에 대한 정보를 제공할 수 있다. 표준 이중 항체 검측 기술 방법(예컨대, 면역침전법 및 웨스턴 블럿)을 사용하여, LDL, HDL, 트리아실글리세라이드, L(P)A, VCAM, ICAM, E-셀렉틴, MCSF, G-CSF, TNF-α, IL-1 및 MCP-1을 포함하는 지질 과산화물 변형된 아민이 조직이나 유체로부터 동정되고 정량화될 수 있다. 전체 지질 과산화물 상태의 이같은 성분은 아테롬성 동맥결화증으로 특징지워지는 지질 과산화물 매개 맥관 염증성 증상에 대해 특정적이며 민감한 마커를 표시할 수 있다. 마찬가지로, apo-B의 지질 과산화물 변형은 apo-B 항체와LOOH/아민 항체 모두를 이용하여 검측될 수 있다.

항체에 대한 항원의 결합을 측정하는 그어떤 테스트라도 본 발명에 따라 이 숙주의 생물학적 샘플내에서 항원이나 항체의 레벨을 평가하는 데 사용될 수 있다. 다수의 이러한 테스트들은 공지되어 있으며, 일반적으로 상용화되어 있다.

면역세포화학 및 면역조직화학은 항체를 이용하여 각각 용액내 세포 표면상에서, 또는 조직 부분상에서 항원을 동정하는 기술 방법이다. 면역세포화학은 표면 마커에 따라 개별적인 세포 개체수를 정량화하는 데 이용된다. 면역조직화학은 특정 세포 개체수 또는 항원들을 국부화하는 데 이용된다. 이같은 기술 방법들은 또한, 기질로서 추정되는 자기항원을 함유하는 조직이나 세포를 이용하여, 자기항체들의 동정을 위해서도 사용된다. 항체들은 RAW 항체에 대해 대개 효소-복합 항체를 이용하여 동정된 후에, 크로마겐(chromagen)이 후속되는데, 불용성 착색된 말단 생성물이 세포나 조직에 침착된다.

다른 통상적인 측정 방법은 방사선 면역 분석법인데, 항원 또는 항체를 검측하는 데 방사선 표지된 반응물을 사용한다. 항체는 항원으로 감작화된 플레이트를 이용하여 검측될 수 있다. 테스트 항체를 적용하여, 이 항체에 특정적인 방사선 표지된 리간드를 첨가함으로써 검측한다. 플레이트에 결합된 리간드의 양은 테스트 항체의 양에 비례한다. 이 테스트는 항원에 대한 테스트로 전환할 수 있다. 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays)은 경쟁성(competition) RIA, 직접 결합성 RIA, 포획성(capture) RIA, 샌드위치 RIA 및 면역방사분석법(RMA: immunoradiometric assay)이다.

효소 결합 면역 흡수 분석법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assays)은 항원 및 항체를 검측하기 위한 기술 방법 군에 광범위하게 사용된다. 그 원리는 방사활성물질보다 효소가 검측 시스템에 복합되어 있다는 것을 제외하고는 방사선 면역 분석법과 유사하다. 전형적으로 사용되는 효소는 과산화 효소, 알카리성 인산 효소 및 2-갈락토시다제이다. 이들은 무색 기질로부터 착색된 반응 생성물을 발생시키는 데 사용된다. 색의 밀도는 연구중 반응물의 양에 비례한다. 이같은 분석법은 RIA보다 좀더 편리하긴 하지만, 그보다 감작성이 떨어진다.

웨스턴 블럿팅(면역블럿팅: immunoblotting) 방법은 미지의 항원을 특징짓는 데 사용된다. 생물학적 샘플의 성분들은 겔 전기영동법에 의해 분리된다. SDS 겔은 분자량에 따라 분리하며, IEF 겔은 전류 특성에 따라 샘플을 분리한다. 분리된 단백질들은 막(블럿팅된)으로 옮겨져 면역 화학법에 의해 동정된다.

사용 빈도가 적은 것 중에서 적절한 측정 방법으로는 파아르 분석법(Farr assay: 방사선 표지된 리간드가 용액내 특정 항체와 결합하여, 석출되고 정량화됨); 침강소 반응법(항체와 항원들이 거대 격자로 교차 결합하여 불용성 면역 착화합물을 형성하고; 항원과 항체가 충분한 양, 거의 동량으로 존재하고, 격자 형성에 이용할 수 있는 충분한 에피토프가 있는 경우에 작동할 뿐임); 비탁계법(빛을 산란시키는 그 성능에 의해 용액내에서 생성된 면역 착화합물을 측정함); 면역확산법(우뭇가사리 겔로 항원과 항체를 검측함); 카운터-전류 전기영동법(전기 전류를 이용하여 항체와 항원을 함께 유도하고; 항원이나 항체의 저농도에 유용하다는 것을 제외하고는 면역확산법과 유사함); 단일 라디칼 면역확산법(SRID: Single Radical Immunodiffusion; 항원을 웰로부터 항체 함유 겔로 바깥쪽 확산시킴으로써 항원을 정량화함; 이 기술 방법은 미지 항체 용액을 항원 함유 웰로 확산시킴으로써 전환가능함); 로켓 전기영동법(전기장에 의해 테스트 항원을 겔로 옮기는 것을 제외하고는 SRID와 유사함); 및 면역형광법(효소 콘쥬게이트가 아닌 형광 물질이 사용되는 것을 제외하고는 면역화학법과 유사함)을 들 수 있다. 체액 샘플과 접촉하는 데 사용되는 항체는 바람직하게는 고체 기질상에 고정된다. 항체는 상기 인용 문헌Antibodies: A Laboratory Manual에 개시된 바와 같이, 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있다. 알맞은 고체 기질에는 막대, 합성 글래스, 아가로우스 비즈, 컵, 플랫 팩(flat packs) 또는 그외의 고체 지지체에 의해 지지되거나, 이러한 것들에 부착된 막이나 코팅을 갖는 것들이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막을 들 수 있다.

검측가능한 작용제로 항체를 표지하는 방법 또한 상기 인용 문헌 Antibodies: A Laboratory Manual에 개시되어 있다. 숙주 생물학적 샘플내의 항원의 양은 선정된 분석법에 따른 그 어떤 방법에 의해서도 측정할 수 있다. 예를 들면, 선정된 면역 분석법을 기지된 과량의 항원으로 수행하여 표준 곡선이나 칼라 챠트를 얻은 후에, 항원 기지량의 항원-항체 콘쥬게이트의 양과 관련된 표준 곡선이나 챠트와 테스트 결과를 비교함으로써 테스트 항원의 양을 검측할 수 있다. 숙주 생물학적 샘플내에 존재하는 것으로 측정된 항원의 양은 다수의 방법으로 환자의 이상을 검사하는 데 사용될 수 있다. 일차로, 항원의 레벨을 통계 데이타에 기초한 개체수 표준(population norm)과 비교할 수 있다. 이차로, 항원의 레벨은 항원 레벨의 환자 자신의 병력에 비추어 고려될 수 있다.

C. 키트

본 발명에는 샘플내의 지질 과산화 상태를 진단하기 위한 키트 또한 포함된다. 이 키트에는 생물학적 샘플내에서 발견되는 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응에 의해 생성된 에피토프와 반응하는 항체가 최적으로 포함된다. 샘플내 항원의 실질적인 전부와 결합하여 이를 검측하는 데 유효한 양으로 항체가 키트내에 존재한다. 바람직한 키트는 약 10 분 이내에 샘플내 항원의 실질적인 전량과 결합하기에 충분한 항체를 함유한다. 상기한 바와 같이, 항체는 고체 지지체상에 고정될 수 있으며, 검측가능 작용제로 표지될 수 있다. 이 키트에는 임의로, 검측가능 작용제를 검측하기 위한 수단이 포함된다. 항체가 형광 색소나 방사능 표지로 표지된다면, 사용자가 적합한 분광기, 신틸레이션 카운터 또는 현미경을 구비하고 있을 것이라 기대되기 때문에, 이 작용제 검측용 수단이 전형적으로 제공되지 않을 것이다. 검측가능 작용제가 효소라면, 이 검측가능 작용제를 검측하기 위한 수단이 키트에 장착될 수 있으며, 전형적으로 항원-항체 콘쥬게이트 전부를 검측할 수 있기에 충분한 양으로 효소용 기질이 포함될 것이다. 검측가능한 작용제를 검측하기 위한 바람직한 수단 중의 한 가지는 효소를 착색 생성물로 전환시키는 기질이 된다. 통상적인 예로는 2,2'-아지도-디-[3-에틸-벤조티아졸린 설포네이트] (ABTS)의 효소, 호스래디쉬 과산화 효소의 사용을 들 수 있다.

이 키트에는 임의로, 체액 샘플내에 존재하는 세포를 용해시키는 용해제를 함유할 수 있다. 적절한 용해제에는 Tween-80, Nonident P40 및 Triton X-100과 같은 계면활성제가 포함된다. 바람직하게, 용해제는 항체와 함께 고체 지지체 상에 고정된다.

또한, 키트에는 단계 사이에 기질을 씻기 위한 완충 용액이 포함된다. 완충 용액은 전형적으로 인산염 완충 용액, 생리식염수, 시트르산염 완충 용액 또는 트리스(Tris) 완충 용액과 같은 생리학적 용액이다.

키트에는 임의로, 이 분석 교정을 위해서 다양한 농도의 미리 성형된 항원을 포함할 수 있다. 이 키트에는 기준 목적용의 교정된 표준 분석에서 항원의 양들을 나타내는 시각적 또는 수치적 표시가 포함될 수 있다. 예를 들면, 분석법이 착색 생성물을 생성시키는 데 사용된다면, 항원의 다양한 양과 연관된 증가 강도의 표시를 제공하는 시트가 포함될 수 있다.

또는, 이 키트에는 생물학적 샘플내의 항체 레벨을 측정하기 위해 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응에 의해 형성된 항원이 포함될 수 있다.

키트에는 임의로, 검측 시스템에 두 가지 항체가 포함될 수 있다. 소량으로 존재하는 일차 항체는 분석하고자 하는 항원에 특정적이다. 좀더 많은 양으로 함유된 이차 항체는 일차 항체를 검측하는 데 사용된다. 예를 들면, 토끼 항체를 LOOH/아민 항원을 검측하는 데 사용한 후에, 안티-토끼 IgG 항체를 결합된 토끼 항체를 검측하는 데 사용할 수 있다. 염소 항체와 안티-항체도 통상적으로 사용된다.

비한정성 일례로서, LOOH/아민 항원에 특정적인 토끼 항체, 이 결합된 일차 항체를 검측하기에 충분한 양의 안티-토끼 IgG 항체, 이차 항체와 콘쥬게이트화되는 효소 및 효소에 노출되면 변색되는 효소에 대한 기질을 포함하는 환자의 지질 과산화 상태 검측용 키트가 제공된다.

D. 진단용 키트의 용도

본문에 기재된 진단용 방법 및 키트는, 산화-유도 증상에 의해서 및, 특히 지질 하이트로과산화물에 의해 매개되는, 광범위한 의약 이상 증상을 검측하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 지질 하이드로과산화물의 존재 및 고농도, 또는 일차 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응 생성물은, 아테롬성 동맥경화증을 포함하는 심장혈관 질환, 염증성 질환, 자궁내막증, 글라이메롤 신장염(glymerol nephritis), 자간전증, 지질 과산화 반응에 의해 매개되는 중추신경계 질환 알츠하이머병, 건선, 천식, 아토피성 피부염, 충실성 종양, 특발성 다발성 출형성 육종(Kaposi's sarcoma), 신경변성 질환, 소장염 질환(급성 국한성 소장염 - 크론병: Crohn's dseases), 류마티스성 관절염 및 허혈성 재관류(ischemia reperfusion)에 대한 초기 진단용 마커로서 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은 치료 질환을 기준하여 선정될 수 있다. 예를 들면, 질병이 조직 특정적인 것이라면, 감염 부위의 조직 표본이 최적 조건이 될 수 있다. 이같은 방법 및 키트가 숙주의 지질 과산화 상태의 높은 레벨이나 비정상적인 레벨을 나타낸다면, 특정적인 증상을 확인할 수 있도록 추가 테스트를 실시할 수 있다.

E. 숙주의 산화 상태의 측정 실시예

토끼 혈청 알부민(RSA: rabit serum albumin), 대두 리포옥시겐나제, 리놀레산, 알카리성 인산염과 콘쥬게이트를 형성한 염소 안티-토끼IgG, 옥틸글루코사이드, 테트라메톡시프로판 및 p-니트로페닐 인산염을 Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri)로부터 구입하였다. 노넨올은 Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI)에서 구매하였다. 무지방 분유는 Bio-Rad Chemical Company (Hercules, CA)에서 구매하였다. Tween-20 및 96 웰 마이크로 적정 플레이트는 Fisher Chemical Company (Pittsburgh, PA)에서 구입하였다. YVTKSYNETKIKFDKYKAEKAEKSHEDEL(여기서, K는 리진을 나타냄, SEQ I.D. No.1)의 서열을 갖는 아미노산 20 개로 이루어진 펩티드를 얻었다.

실시예 1 지질 과산화물 변형된 단백질의 제조 방법

상기 Fruebis, Parthasarathy 및 Steinberg에 의해 개시된 바와 같이, 대두 리포옥시겐나제(SLO)로 처리함으로써 리놀레산을 13-하이드로 과산화 리노렌산염으로 전환시켰다. 리놀레산 하이드로과산화물은 바로 면역글로불린-유리 RSA와 반응시키고, 37 ℃에서 2 시간 동안 숙성시켰다. 전형적인 반응으로는, 리놀레산 100 nmol을 인산염 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline) 1 mL내에서 SLO 30 units로 처리하고, 234 nm에서의 흡수도 증가를 측정하였다. 대개, 반응은 30 분 이내로 종결된다. 그 후에, 지질 하이드로과산화물(13-HPODE)을 EDTA 50 μL 존재 하에서 지질, IgG 및 그외의 다른 단백질이 없는 알부민 100 μg으로 37 ℃에서 2 시간 동안 처리하였다. 330 nm의 들뜸 파장 및 430 nm에서으 방사 항에서 형광을 측정함으로써 형광 생성물의 형성을 달성하였다. 생성물은 Bligh 및 Dyer의 방법(Bligh, et al., Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959))에 의해 클로로포름과 메탄올로 추출하여 미반응 LOOH를 제거한 후에, 얼음같이 찬 아세톤으로 수회 씻어주었다. 최종 생성물인 LOOH 변형된 RSA(LOOH/RSA)는 수용액에 가용성이며, 산화된 저밀도 리포프로테인(ox-LDL: oxidized low-density lipoproteins)과 유사한 형광 특성을 갖는다. LOOH의 생성 및 단백질의 변형은 알데히드의 생성을 제한하는, 부가 금속 그 어떤 것 없이 수행되었다.

실시예 2 산화된 LDL의 제조 방법

탁상용 Beckman TL-100 초원심분리기와 TLA-100.4 축차(Santanam et al., J. Clin. Invest 95:2594-2600; 1995)를 이용하여 정상인 수여자의 헤파린화된 혈장으로부터 LDL을 분리하였다. 단일-스핀 그레디언트를 사용하여 알부민 혼합물로부터 LDL을 정제하였다. 분리는 혈장을 얻는 3 시간 내에 종결되었다. 분리된 LDL을 인산염 완충 식염수(PBS)에 대해 4 ℃에서(200×부피) 6 시간 동안 투석시켰다. 분리된 LDL은 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석상에서 손상되지 않은 아포리포프로테인 B(apolipoprotein B)의 존재, 및 아가로오스 겔 전기영동분석상에서 단일 밴드가 존재에 의해 확인되었다. 분리된 LDL(100 μg/mL)를 5 μM 구리가 함유된 인산염 완충 식염수로 배양하고, 37 ℃에서 50 mm 플레이트에서 배양시켰다. 24 시간 배양 후에, 이 용액을 글래스 튜브에 옮겨담고, Bligh 및 Dyer의 방법에 의해 지질을 추출함으로써 제-지질화하였다. 제-지질화된 LDL 단백질을 Parthasarathy 등에 의해 개시된 바(Parthasaeathy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:537-540; 1987)와 같이 옥틸글루코사이드(1 N NaOH의 5 μL와 함께, 10 mg/mL의 100 μL를 단백질에 첨가함)에 용해시켰다.

실시예 3 알데히드 변형된 단백질의 제조 방법

PBS 100 μL내의 1 mg 단백질(또는, 그외의 다른 단백질)을 함유하는, 글로불린이 없는 RSA를 제조한 후에, 전체 부피를 PBS를 이용해 1 mL로 증가시켰다. 노넨올이나 헥산올(에탄올 용매로 25 mμM 100 μL)을 단백질에 첨가하고, 혼합하여 웰을 만들고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 얼음같이 찬 아세톤 4 mL를 이 용액에 첨가하고, 이 튜브를 냉장고에 한 시간 동안 넣어두었다. 4 ℃에서 10 분 동안 1500 rpm으로 원심분리한 후에, 상등액을 제거하였다. 이같은 단계를 3 회 이상 반복한 후에, 침전물을 진공 하에서 건조시켰다. PBS 1 mL를 이 튜브에 첨가하여 혼합한 후에, 용액을 효소 결합 면역 흡수 분석(ELISA)에 이용하였다.

말론디알데히드-변형된 단백질을 다음과 같이 제조하였다. 테트라메톡시프로판 샘플 100 μL 하나를 제조하고, 이 튜브에 6 N HCl 0.5 mL를 첨가하였다. 이 튜브를 60 ℃에서 30 분 동안 가열하였다. 4 N의 NaOH를 사용하여 pH를 6.4로 조정하고, 전체 부피를 PBS를 사용하여 2.7 mL로 조정하였다. 그 후에, 제조된 용액 25 μL를 글로불린이 없는 토끼 혈청 알부민 또는 그외의 단백질 2 mg에 첨가하고, 37 ℃에서 배양하였다. 배양 3 시간 후에, 용액을 PBS에 대해 투석하고, ELISA에 이용하였다.

실시예 4 항체의 제조 방법

체중이 3-4 kg인 숫컷 토끼 3 마릴를 Myrtle Rabbitry (Thompson Station, TN)로부터 구입하였다. 일차 접좁을 위해, 지질 과산화물 변형된 토끼 혈청 알부민 1.5 mg/mL를 PBS에 용해시키고, 프로인트 완전 보조액(Freunds complete adjutant: Sigma, St. Louis, MO)와 혼합한 후에, 피하 주사하였다. 4 주 간격을 두고 프로인트 불완전 보조액과 혼합된, PBS내 항원으로 이차 접종을 계속하였다. 토끼들을 접종후에 10 내지 14 일째 채혈하고, 혈액을 실온에서 4 시간 동안 방치하고, 4 ℃에서 하룻밤을 보관하였다. 3000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여 혈병과 잔해(debris)를 제거한 후에, 혈청을 ELISA로 분석하고 -20 ℃에서 보관하였다. 매달 적정을 하고, 초기 접종 후 6 개월째에 혈액을 뽑아냈다. 동물내의 LOOH/RSA 항체 적정치가 시간에 따라 증가되었고 약 4 개월쯤에서 평탄한 상태가 되었다.

실시예 5 LOOH 변형된 단백질에 대한 ELISA 분석

ELISA를 사용하여, LOOH/RSA 항체가 LOOH/변형된 단백질을 인식하는지 변형되지않은 단백질을 인식하는지에 대해 연구하였다. 변형되지 않은 IgG 없는 RSA를 대조군으로 사용하였다.

지질 과산화물 변형된 RSA의 다양한 희석액, 웰당 50 μL로 ELISA 플레이트의 웰을 코팅하고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. PBS 용매의 0.05% Tween 20으로 플레이트를 3 회 씻어주고, PBS에서 0.05% Tween 20과 함께 1% 무지방 분유 300 μL로 3 시간 동안 블록킹하였다. 블록킹한 후에, 플레이트를 PBS내 0.05% Tween 20으로 3 회 씻어주고, 안티-LOOH/RSA 혈청을 1 : 250으로 희석시켰다. 50 μL를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 3 시간 동안 또는 하룻밤 동안 배양시켰다. PBS내 0.05% Tween 20으로 3 회 씻어준 후에, 알카리성 인산염과 콘쥬게이트를 형성한 안티-토끼 IgG를 1 : 38000으로 희석하고, 50 μL를 각 웰에 첨가한 후에 37 ℃에서 2 시간 동안 배양시켰다. PBS내 0.05% Tween 20으로 6 회 씻어준 후에, p-니트로페닐 인산염 50 μL를 각각의 웰에 첨가하고 37 ℃로 배양하였다. 플레이트를 15 분 간격으로 2 시간 동안 검측하였다. LOOH/RSA의 농도 대 OD 판독치를 도시하여 곡선을 완성하였다.

항원(LOOH/RSA, RSA, ox-LDL 및 그외의 다른 변형된 단백질)을 96 개의 웰 플레이트에 실온에서 하룻밤 동안 놓아두었다. 웰들을 PBS의 3% BSA로 2 시간 동안 블록킹하고, PBS로 3 회 씻어주었다. 안티-LOOH/RSA 항체를 3% BSA를 함유한 PBS에 1 : 250으로 희석하고, 각 웰에 첨가하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한 후에, 웰들을 PBS로 3 회 씻어주었다. 알카리성 인산염과 콘쥬게이트를 형성하는 염소 안티-토끼 IgG를 1 : 38000으로 희석한 후에 첨가하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한 후에, 웰을 다시 씻어주고 p-니트로페놀인산염을 첨가하였다. 플레이트 판독기(Anthos II)로 색 전개를 측정하였다.

도 1은 단백질 나노그램 대 405 nm에서의 광학 밀도로 측정된, 토끼 혈청 알부민과 지질 하이드로과산화물 변형된 토끼 혈청 알부민의 인식에 대한 막대 챠트 그래프이다. 도시된 바와 같이, 1 : 250 희석액에서의 항체가 농도-종속 방식으로 변형된 단백질을 선택적으로 인식하였다. RSA(2 nM 변형된 RSA 미만) 10 ng 정도의 미량이 대조군 단백질의 레벨보다 현저히 높은 레벨로 인식되었다. 변형되지 않는 대조군 단백질은 고농도에서도 항체에 의해 겨우 인식될 정도였다. 일차 또는 이차 항체가 없는 대조군은 항체에 의해 인식되지 않았다. 그 외의 다른 변형된 단백질(LOOH-변형된 소 및 인체의 혈청 알부민, 카탈라제 및 시토크롬 C) 또한 항체에 의해 인식되었다. LDL의 아포프로테인 B₁₀₀(apo B) 성분은 LDL 산화 반응 동안에 광범위한 변형을 진행한다. 많은 연구를 통해, 이 변형에는 알데히드에 의한 리진 잔기의 공유결합적 변형에 의해 생성되는 새로운 항원성 에피토프를 포함하는 것이 확증되었다.

ox-LDL이 또한 손상되지 않은 LOO에 의해 변형된 리진을 함유하는지를 측정하기 위해, LOOH/RSA에 대한 항체가 LDL 또는 ox-LDL을 인식하는지에 대해 연구하였다. 도 2는 광학 밀도 units 대 마이크로그램 농도로 측정된, 실시예 4의 항체에 의한 ox-LDL의 인식을 도시한 막대 챠트 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이, ox-LDL은 농도-종속 방식으로 항체에 의해 인식되었다. 항체는 ox-LDL 단백질 0.25 μg정도의 미량을 인식할 수 있었다. 부틸산염화된 하이드록시톨루엔(BHT) 의 존재 하에서 제조된, 천연 LDL은 2.5 μg 농도에서도 인식되지 않았다. 별도의 실험으로, ox-LDL의 지질 성분 또한 항체에 의해 인식되어, 포스파티딜에탄올아민과 같은 ox-LDL의 아미노 포스포지질을 마찬가지로 변형시키 수 있다는 것을 제시하였다.

실시예 6 면역조직화학

항체가 조직내에서 변형된 단백질을 인식할 수 있음을 다음 2 가지 조건 하에서 테스트하였다. 첫 번째 연구에서는, LOOH로 선배양된 RAW 세포를 사용하였다. 두 번째 연구에서는, 콜레스테롤을 주입한 원숭이의 아테롬성 동맥경화증성 동맥을 항체로 면역염색화하였다.

원래의 매크로파지를 다음과 같이 1, 2 또는 3 일 동안 13-HPODE 100 μM로 배양하였다. 6 웰 플레이트내의 융합성 세포들을 혈청이 없는 DMEM(Dulbecco의 변형된 Eagle 최소 필수 배지)13-HPODE로 1, 2 또는 3 일 동안 처리하였다. 새 13-HPODE를 이틀 및 사흘째에 각각의 셀 디쉬에 첨가하였다. 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 날의 끝에, 세포들을 부앵액(Bouins solution)에 10 분 동안 고정시키고, LOH/RSA에 대한 항체들을 이용하여 면역세포화학을 수행하였다. 고정 후에, 세포들을 PBS로 3 회 씻어주었다. 안티-LOOH/RSA 항체를 3% BSA를 함유한 PBS로 1 : 250으로 희석시키고, 각 웰에 첨가하였다. 네가티브 대조군의 경우, 일차 항체를 첨가하지 않았다. 실온에서 2 시간 배양 후에, 웰을 PBS로 3 회 씻어주고, 알카리성 인산염과 콘쥬게이트를 형성하는 염소 안티-토끼 IgG를 1 : 100으로 희석하여 첨가하였다. 실온에서 2 시간 동안 배양한 후에, 웰들을 다시 씻어주고 파스트적(fast red)으로 배양하였다. 색 전개 후에, 반응을 종결하고, 카메라가 부착된 Nikon 현미경을 이용하여 세포를 촬영하였다.

숫컷 시노몰구스 원숭이군으로부터의 비정상 동맥 냉각 표본을 면역조직화학적으로 검측하였다. 동물들을 건조 달걀 노른자 8.2%와 라드 10%로 제공되는 고단백 원숭이 사료로 이루어진 어느 정도의 고지방성 식이요법으로 사육되었다. 최종 식단에는 포화지방 37.5%, 모노불포화지방 44.9%, 콜레스테롤 0.25%의 폴리불포화지방 17.5%가 함유되었다. 이 동물들의 평균 혈청 레벨은 306 mg/dL이였다. 이같은 콜레스테롤 레벨은 원숭이에서 아테롬성 동맥경화 이상 범위를 제공하기에 충분하다. 아테롬성 동맥경화증 전개의 다양한 정도를 나타내는 인체 대동맥을 Emory university Human Subjects Committee의 승인으로 조직 채취 때 장기 기증자로부터 얻어 수집하였다. 인간 및 시노몰로구스 원숭이의 대동맥을 파라포르알데히드에 고정시키고, O.C.T.에서 냉각시킨 후에 저온유지장치상에서 5 ㎛로 절단하였다. 그 후에, 조직 섹션은 1 : 500 희석액의 항체와 후속, 1 : 200의 희석액으로 사용되는 비오틴기 치환된 염소 안티-토끼 IgG (Fisher Scientfic)를 이용하여 면역염색화하여, 착색소(chromagen)으로서 벡터 레드(Vector Red: Vector Laboratories)를 이용하여 벡터 ABC-AP 시스템에 의해 가시화되었다. 면역조직화학은 LOOH로 배양된 세포들을 항체로 면역염색화하고, 항원성 에피토프가 세포내에 존재한다는 것을 입증하였다. 일차 항체가 없는 대조군 및 대조군 세포는 면역활성을 나타내지 않았다.

이 동맥들은 강력한 면역활성을 나타내었다. 이 면역활성은 매크로파지용 카운터 염색에 의해 측정된 바처럼 포말 세포 매크로파지가 풍부한 부위에 국부화되었다.

실시예 7 웨스턴 블럿팅 분석법

웨스턴 블럿팅 분석법은 단백질 2.5 μg을 이용하여 7.5% 가교된 아크릴아미드 겔에서 단백질을 분리한 후에 수행하였다. 트랜스블럿팅된 샘플을 일차 항체로서 1 : 250으로 희석된 안티-LOOH/RSA, 이차 항체로서 과산화효소와 콘쥬게이트를 형성하는 안티-토끼 IgG를 이용하여 검측하였다. 가교 반응성 밴드는 화학 발광 검측에 의해 가시화되었다.

LDL 및 ox-LDL의 웨스턴 블럿팅 분석법을 이용하여, 상기 실시예 4의 항체가 천연 LDL이 아닌 ox-LDL을 인식할 수 있음을 확인하였다. 정상의 인체 혈장의 웨스턴 블럿팅 분석법은 적어도 3 가지 이상의 다양한 단백질이 항체에 의해 인식되는 것을 보여주었다. 혈장 샘플은 BHT의 존재 하에서 제조되었고, 이같은 에피토프가 생체 밖에서 생성되는 것은 어려울 것 같다. 겔상에서 이동성으로부터 이같은 단백질들이 알부민과 apo B 생성물을 나타낼 수 있다는 것이 추정됨에도 불구하고, 이같은 단백질의 동정법은 알려져 있지 않다.

실시예 8 알데히드 변형된 단백질과 실시예 7에 의한 항체의 교차-반응성

다수의 항체들이 알데히드-변형된 단백질용으로 개시되어 있다. 단백질에 의한 LOOH의 배양은 장기간이 소요되기 때문에, 알데히드가 항원성 에피토프의생성에 기여할 수도 있다는 것이 가능하다. LOOH/RSA에 대한 항체가 알데히드에 의해 변형된 단백질을 인식하는지를 확증하기 위해, YVTKSYNETKIKFDKYKAEKAEKSHEDEL(여기서, K는 리진을 나타냄, SEQ I.D. No. 1)의 서열을 갖는 아미노산 20 개로 이루어진 펩티드를 제조하였다. 시판되는 알부민과 같은 혈장 단백질이 생체내 생성 결과로서든지 생체 밖의 정제 공정중에 생성 결과로서든지, 유사한 에피토프를 이미 갖기 때문에, 이같은 펩티드가 사용되었다. MDA, 헥산알, 노넨알 및 LOOH-변형된 합성 펩티드의 ELISA로부터 얻은 데이타를 다음 표 1에 나타내었다. 항체는 그 어떤 현저한 정도까지에서도 합성 펩티드 또는 알데히드-변형된 그의 유도체를 인식하지 못하였다. 반대로, LOOH-변형된 합성 펩티드는 항체에 의해 매우 잘 인식되었다.

안티-LPPH/RSA 항체에 의한, LOOH-변형된 펩티드 및 알데히드 변형되지 않은 펩티드의 인식

μg 펩티드	천연 펩티드	LOOH-펩티드	MDA-펩티드	노넨알-펩티드	헥산알-펩티드
0	57	51	53	51	55
0.25	46	190	50	56	64
1.25	38	327	57	60	84
2.5	42	358	62	46	103

마이크로 적정 웰은 변형되지 않거나, 변형된 펩티드의 증가 농도로 코팅하였다. 무지방 분유로 웰을 블로킹한 후에, 안티-LOOH/RSA 항체의 1 : 250 희석액 100 μL을 각각의 웰에 첨가하였다. 씻어낸 후에, 알카리성 인산염과 콘쥬게이트를 형성하는 안티-토끼 IgG를 각각의 웰에 첨가하였다. 기질 p-니트로페닐 인산염을 첨가한 후에, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 405 nm에서 OD를 측정하였다. 수치는 적어도 2 회 이상의 별도 시도의 것으로부터 웰의 광학 밀도 판독의 3 회 반복 세트의 평균을 나타낸 것이다.

알데히드- 및 LOOH-변형된 펩티드의 웨스턴 블럿팅 분석법을 통해 알데히드-변형된 합성 단백질류가 그어떤 현저한 정도에서도 항체에 의해 인식되지 않는 반면에, LOOH-변형된 펩티드가 항체에 의해 인식되었다는 것을 확증하였다.

II. 옥시킨의 생물학적 활성도

A. 옥시킨의 정의

일차 아민과 지질 하이드로과산화물의 어떤 반응 생성물이 세포 반응의 매개체로서 독립적인 생물학적 활성도를 나타낸다는 것이 밝혀져 있다. 본문에 사용되는 "옥시킨(oxykine)"이라 함은 일차 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응에 의해 생성되고 표적 세포로부터 반응을 유도할 수 있는 형광 단백질 또는 지질에 관련된 것으로 사용된다. 옥시킨은 세포외에서 생성되거나 세포 반응을 매개하는 세포막에서 형성될 수 있다. 옥시킨은 세포내에서도 생성될 수 있다.

일차 아민을 갖는 광범위한 생물학적 활성 분자는 생물학적 활성도를 갖는 옥시킨으로 전환이 가능하다. 옥시킨의 일례로는 리놀레산 하이드로과산화물(13-HPODE)과, 알부민이나 폴리리진에서 리진과 같은 적절한 아미노산기와의 반응의 안정한 형광 생성물, 또는 포스파티딜에탄올아민과 같은 저분자량 화합물을 들 수 있다. 어떤 옥시킨은 선택적인 항산화제에 의해 억제될 수 있는 메카니즘을 통해 내인성 VCAM-1 유전자 발현을 유도하는 유력한 염증성 시그날로서 작용한다. 옥시킨에 의해 도출될 수 있는 다른 세포 반응은 MCP-1, IL-1, TNF-α, ICAM, MCSF 및 E-셀렉틴의 생성 및 활성화 반응을 들 수 있다.

지질의 산화 반응이 염증성 질환 및 심장혈관질환에 관련되어 있기 때문에, 옥시킨은 심장혈관 반응을 포함한, 세포 면역 반응의 매개체로서 사용될 수 있다. 사실사의 염증성 또는 심장혈관성의 특정 질환 상태에는 아테롬성 동맥경화증, 자궁내막증, 글라이메롤 신장염, 자간전증, 지질 과산화 반응에 의해 매개되는 중추신경계 이상, 알츠하이머 질환, 자기면역 이상, 건선, 천식, 아토피성 피부염, 피부암, 신경변성 질환, 급성국한성 소장염(크론병), 류마티스성 관절염, 허혈성 재관류, 골관절염, 천식, 피부염, 다발성 경화증, 혈관 재흡착증, 관상동맥 질환 및 협심증이 포함된다.

모든 일차 아민들이 지질 하이드로과산화물과 반응하여 숙주의 산화 상태를 측정할 수 있는 항체를 생성시키는 데 사용할 수 있는 항원성 종들을 형성시킬 것이지만, 모든 펩티드나 생물학적으로 생성된 일차 아민이 옥시킨을 형성하지는 않을 것이다. 이는 항체 반응을 도출시키는 데 한 가지 에피토프만이 필요하지만, 세포 반응을 매개하는 데, 반응 부위의 수와 위치가 수체에 대한 보완적인 결합에 대해 결정적이기 때문이다.

옥시킨 에피토프의 예가 참고문헌으로 첨부한, Proc. Natl. ACAD. Sci. USA, Volume 89, pp 10588-10592, November 1992 Medical Science에 개시되어 있는데, 이에 국한된 것은 아니다. 특히, 에피토프에는 다음이 포함된다:

.

본 발명의 항체들은 항원의 손상 활성도를 블록킹하는 데 사용할 수 있는데, 특히 세포 반응을 매개하는 그 성능을 물리적으로 방해함으로써 블록킹하는 데 사용할 수 있다.

B. 옥시킨의 생체외 합성 및 특징화

대두 리폭옥시겐나제(sLO)의 지질 변형은 Freubis, Parthasarathy 및 Steinberg의 변형 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10588-10592)지질 하이드로과산화물의 배양에 의해 달성되었다. 이같은 합성을 위해, 단백질에 대한 지질의 고비율이 중요하였다. 소량 반응에서, 리놀레산 250 μM을 실온에서 3 일 동안 sLO(50 units, 80 ng)으로 직접 배양하였는데; 반응에 공기를 주입하는 데 샘플을 젓어주는 것이 중요하였다. 모든 반응은 10 mM Tris, pH 8.0, 15 mm 염화나트륨으로 수행하였다. 비정제된 반응 혼합물을 산화력이 있게 변형된 대두 리포옥시겐나제 옥시킨(oxSLO)에 대한 토끼 폴리클로날 항체 및 마우스 모노클로날 항체를 생성시키는 데 사용하였다.

대량화 반응에서는, 불용성의 문제 때문에 단백질에 대한 지질의 고비율을 유지하는 것이 불가능하게 된다. 13-HpODE 변형된 리포옥시겐나제 옥시킨의 합성, 또는 "표적" 단백질의 변형을 위한 방법이 개발되었다(도 4 참조). 1.5 mL까지의 부피에서 표적 단백질, 1-3 mg을 10 kDa 분자량 컷 오프 막(cut off membrane)으로 분리하였다. 단백질 표적의 보류를 갖는 250 mL 지질 과산화물 생성 시스템의 연속 교환을 고려하였다. 대두 리포옥시겐나제의 촉매량, 1,260 U 및 리놀레산 800 μM을 과산화물 생성 시스템에 사용하여 13-하이드로퍼옥시-[S-(E,Z)]-9,11-옥타데카디엔노산을 생성시켰다. 생성 시스템은 170 시간 이상 동안 8 내지 16 시간마다 새로운 sLO/리놀레산으로 교환하였다. 10 mM Tris, pH 8.0, 15 mM 염화나트륨내에서 일정하게 교반시키면서 반응을 수행하였다. 대량 생산법의 장점중의 한 가지는 10 kDa보다 큰 어떠한 단백질이나 그의 혼합물이 표적 단백질으로서 사용될 수 있다는 것이다.

옥시킨으로 산화된 13-HpODE의 형성에 대한 표준 원칙에는 내인성 세포 기초 분석(하기 부분에 좀더 상세히 후술함)에서 ICAM-1의 유도 및 옥시킨 항체에 의한 면역 반응성의 유도가 포함된다. 옥시킨의 형성에 최소한의 조건은 소량 반응을 사용하여 검측하였다. 폴리클로날항체를 이용하여 웨스턴 분석법에 의해 관찰된 바와 같이, sLO과 리놀레산은 3 일 동안의 반응이 최소한의 조건이였다(도 5 참조). 반응을 쉐이킹하면 수율이 증가된다. SLO가 완충용액만으로 배양하였을 경우에 교차 반응성이 나타나지 않는다. 옥시킨의 형성에 대한 시간 경로를 면역반응성 및 생물학적 활성이 후속하였다(ICAM-1의 유도: 도 6 및 7 참조). 면역 반응성 활성도는 생물학적 활성도 이전에 관찰되었다. 웨스턴 블럿팅 분석에의해 관찰된 초기 생성물은 대략 80 kDa에서 고분자량 밴드 이동이었다. 이후 시점에서 관찰되는 반응 생성물은 약 25 kDa에서 현저한 종으로 사다리꼴을 형성하였다. 면역반응성 및 생물학적 활성도 모두에 의한 반응의 시간 경로는 지질의 농도에 종속되었는데; 리놀레산의 농도 증가는 반응 속도를 증가시켰다.

옥시킨 반응 생성물은 분석학적인 역상고성능액체크로마토그래피(RP-HPLC) 및 겔여과법에 의해 검측되었다. C18 컬럼을 이용한 HPLC 분석은 반응 생성물이 출발물질보다 소수성이 크다는 것을 나타내었는데, 이는 리포옥시겐나제에 지질을 첨가하는 반응과 일치하는 것이었다(도 8 참조). 예비 겔여과법은 옥시킨을 부분적으로 정제하는 데 사용되었다(도 9 및 10 참조). 단백질의 대부분이 다른 단편에서 관찰되었음에도 불구하고, 생물학적 활동도는 단편 9와 10에서 관찰되었다.

웨스텀 분석법에 의해 관찰된 바와 같이, 옥시킨의 안정도는 면역반응성 및 생물학적 활성도를 기초로 측정되었다. 옥시킨은 다수의 산성 및 염기성 조건, 및 환원제의 존재에 대해 안정하였다. 3.5 M MgCl₂, 10 mM 인산나트륨, pH 7.2; 5.0 M LiCl, 10 mM 인산나트륨, pH 7.2; 100 mM 트리에틸아민, pH 11.5; 및 100 mM 글리신, pH 2.5의 조건 하에서 예비 배양시켜, 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 면역반응성을 얻었다. 대조적으로, 3.5 M MgCl₂, 10 mM 인산나트륨, pH 7.2 조건 하에서 배양에 의해 생물학적 활성도의 상실이 야기된 반면에, 잔여 보관 조건은 유효성이 없었다. 활성도 상실이 단백질 형성에서의 변화, 산화 상태 또는 그 외의 다른 원인에 기인했던 것인지가 검측되어야할 채로 남아 있다. 생물학적 활성도는 열변성 및 디티오트레이톨의 존재 하에서 열변성 후에 유지되었다. EDTA, Trolox 및 프로부콜(probucol) 또한 ICANM-1 배양에 유효하지 못하였다. 단백질 산 가수분해 이후에, 생물학적 활성도가 상실되었다.

실시예 9 oxSLO의 생물학적 활성도의 특징화: 인체 동맥 내피 세포(HAEC)의 oxSLO 유도된 ICAM 발현

소량 단위 합성 반응에서, 실온 배양의 초기 한 시간 이내에 sLO는 250 μM 리놀레산(LA)을 13-HpODE로 전환시켰다. 후속 3 일간의 배양 동안, 도 11에 도시한 ELISA 분석에 나타낸 바와 같이, 13-HpODE는 아마도 HAEC상에 세포 표면 ICAM의 발현과 같은 생물학적 활성을 도출할 수 있는 효소상에 생성된 에피토프 및 효소를 산화적으로 변형시켰다. 마이크로 적정 플레이트 상에서 배양된 HAEC를 ELISA 분석 전에 16 시간 동안 처리하였다. 배양 3 일 후에 sLO 또는 LA만은 활성화되지 않았는데, sLO의 산화적 변형이 생물학적 활성 에피토프의 생성에 중요하다는 것을 제시하는 것이다. 대량 단위의 합성 반응에서는, 13-HpODE 생성 시스템의 존재 하에서만 도 12에 도시한 바와 같이 sLO가 활성화되었다. sLO 네가티브 대조군은 sLO 효소가 장기간 동안 완충 용액만으로 배양되었다는 것을 나타내었다. 양쪽의 방법에 의해 합성된 oxSLO가 기능적으로 및 면역학적으로 동일하다는 것을 확인하였다. 또한, 생물학적 활성도의 생성이 단백질 특정적이라는 것을 결정하였다. 다량 또는 소량의 옥시킨 반응을 이용한 토끼 혈청 알부민의 반응은 면역활서을 갖지만 생물학적으로 비활성인 생성물을 생성시킨다.

oxSLO 활성화된 세포 표면 ICAM 표현은 도 13에 나타낸 바와 같이 투여량 종속 방식에 속하였다. oxSLO 40 ng/mL는 표준 ELISA 분석상에서 현저한 시그날에 대해 충분하였다. 다시, 변형되지 않은 sLO의 동일량은 HAEC를 활성화시키지 못하였다. 유사한 결과 도 15에 나타낸 바와 같이 노오쓰런 블럿팅에서 관찰되었다.

실시예 10 HAEC에서 oxSLO 유도된 VCAM, E-셀렉틴 및 MCP-1 발현

oxSLO는 ICAM 및, 두 가지의 다른 부착성 분자들(도 15의 VCAM, 도 16의 E-셀렉틴) 및 한 가지 케모킨(chemokine) 분자(도 15 및 16의 MCP-1)를 유도하였다. 도 14는 ICAM 유도보다는 적은 정도지만, HAEC상에서 세포 표면 VCAM 발현의 유도를 보여주었다. ELISA 데이타는 도 15에 나타낸 바와 같이 노오쓰런 블럿팅 데이타에 의해 지지된다. oxSLO 처리 4 시간 후에 VCAM mRNA 집접량은 ICAM mRNA보다는 적었다. 또한, MCP-1 및 E-셀렉틴 mRNA 레벨은 TNF 유도만큼 높았는데, 이는 MCP-1 및 E-셀렉틴이 oxSLO 매개 시그날링 캐스케이드의 키(key) 성분이 될 수도 있다는 것을 제시한다. 이러한 프로-염증성 유전자들의 유도는 도 16에 나타낸 바와 같이 매우 신속하다. 자극 2- 6 시간 이내에, 표지된 유전자의 mRNA 레벨은 모두 안정 상태에 도달하였다.

실시예 11 매크로파지에서 oxSLO IL-1β

도 2에 약술한 바와 같이 내피 세포에 대한 심도 있는 효과를 갖는 외에도, oxSLO는 도 14에 나타낸 바와 같이, 매크로파지 라인(RAW)에서 또다른 시토킨 IL-1β mRNA의 집적을 유도하였다. RAW 세포들은 4 시간 동안 oxSLO로 처리하고, 전체 RNA를 채취하고 분석하였다. 아테롬성 동맥경화증의 발달에서, 내피 세포 및 매크로파지 모두가 매우 중효한 것으로 나타났다. 생체외에서의 데이타는 지질 하이드록 과산화물 변형된 단백질, 지질 또는 옥시킨으로 정의되는 친지질성 분자들의 독특한 종류가 아테롬성 동맥경화증 손상 부위에서 프로-면역성 시그날을 매개할 수 있다 가설을 뒷받침하였다.

HAEC에서의 oxSLO 유도된 VCAM-1, ICAM-1 및 MCP-1 mRNA의 집적

처리법	VCAM-1(소정의 units)	ICAM-1(소정의 units)	MCP-1(소정의 units)
TNF (100 units/mL)	82.06	71.92	101.65
sLO (0.8 μg/mL)	3.36	3.14	12.34
sLO (0.08 μg/mL)	0.12	-0.09	3.1
sLO (0.008 μg/mL)	-0.14	-0.51	1.12
변성 sLO (1 μg/mL)	24.17	19.74	116.62
변성 sLO (0.2 μg/mL)	11.51	9.41	96.28
변성 sLO (0.04 μg/mL)	9.38	2.06	37.35

실시예 12 리놀레산 하이드로과산화물에 의한 토끼 혈처 알부민의 산화적 변형의 생성물의 생물학적 활성도

리놀레산 하이드로과산화물에 의한 토끼 혈청 알부민 RSA의 산화적 변형이 이같은 물질에서 요소(펩티드 또는 나노펩티드)의 구조적 또는 생물학적 특성을 변형시켜, 혈관 내피성 세포 염증성 시그날로서 생물학적 기능을 부여하는지에 대해 연구하였다. 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 제조된, 산화적으로 변형된 RSA (oxRSA)를 이용하여 배양된 인체 동맥 내피성 세포들을 12 시간 동안 1 내지 100 nM(나노몰) 정도의 oxRSA 농도 범위에 노출시키고, ELISA 분석에 의해 유도 가능한 부착성 분자 VACM-1, ICAM-1 또는 구성적으로 발현되는 부착성 분자 ICAM-2의 세포 표면 발형에 대해 분석하였다. 최대 TNF-α 유도 시그날의 퍼센트로서 표현된, 도 3에 나타낸 바와 같이, ox-RSA는 VCAM-1의 투여량 종속 유도를 최대 TNF-α 시그날의 40%까지, ICAM-1을 80 %까지 나타내었다. oxRSA의 대략적인 EC₅₀은 VCAM-1 및 ICAM-1 모두에 대한 10-15 nM이였다. 이같은 유도는 폴리믹신 B(10 μg/mL)가 LPS 유도를 완전히 억제하였지만, oxRSA 활성화에는 유효성이 없었던 바와 같이, 리포다당류를 오염시킨 데 기인하지 않는다. 게다가, oxRSA 제조물에서 LPS에 대한 리뮬러스(limulus) 분석은 다음 검측법과 같다. 구성적으로 발현된 ICAM-2는 비영향성이었다. 이같은 결과는 oxRSA가 저농도의 나노몰 범위에서 내인성 세포에 대한 중요한, 염증성 인자로서 투여량 반응성 방식으로 작용한다.

실시예 13 mRNA 집접에 대한 리놀레산 하이드로과산화물에 의한 토끼 혈청 알부민의 산화적 변형 생성물의 효과

다음에 oxRSA에 의한 VCAM-1 및 ICAM-1 세포 표면 발현의 유도가 적어도 일부가 mRNA 집적화로의 변화에 기인한 것인지에 대한 연구를 하였다. 노오쓰런 필터 분석을 TNF-α(100 U/mL) 또는 oxRSA(25 nM)로 4 시간 동안 노출시킨 HAEC로부터 분리된 RNA로 수행하였다. 단백질 레벨에서 관찰된 바와 유사하게, VCAM-mRNA 레벨은 TNF-α에 대해 관찰된 약 30-40%까지 레벨로 ox-RSA에 의해 유도되었다. ICAM-1 mRNA는 또한 ox-RSA에 의해 유도되었다.

실시예 14 NF-kB 유사 DNA 결합 착화합물을 통한 VCAM-12 프로모터의 전사 활성화에 대한, 리놀레산 하이드로과산화물에 의한 토끼 혈청 알부민이 산화적 변형 생성물의 효과

oxRSA가 산화 환원 감작성 VCAM-1 유전자 발현과 관련된 핵 조절성 이상을 모듈레이트했는지를 측정하기 위해, 배양된 인체 동맥 내피성 세포를 TNF-α(100 U/mL) 또는 옥시킨 RSA-LOOH(oxRSA) 25 nM에 대해 2 시간 동안 노출시키고, 핵 추출물을 제조하고,³²P-표지된 kLOkR, 인체 VCAM-1 프로모터의 직렬 NF-kB-유사 결합 부위를 이용하여 겔 이동성 쉬프트 분석을 수행하였다.

안티-p50 및 안티-p65 항혈청(R&D 시스템)를 이용하여, 적절한 냉각 경쟁자 및 수퍼쉬프트 대조군을 NF-kB 착화합물 밴드의 DNA 서열 결합 특정성을 설정하도록 수행하였다. TNF와 oxRSA 모두는 NF-kB 유사 DNA 결합 활성을 유도하였다. 이는 옥시킨류가 맥관 구조에서 NF-kB 매개 전사 활성 경로에 작용할 수도 있다는 것을 제시한다.

실시예 15 자궁내막증 및 대조군 환자들의 혈장 샘플의 자기항체 적정

자궁내막증 환자의 복강에서 발생하는 산화 반응이 변형된 프토테인에 대한 자기 항체의 존재를 초래할 수도 있고, 이러한 항체들이 자궁내막증 환자에게서 증가될 수도 있다. 이같은 자기항체들이 자궁내막증이라고 진단된 환자내에 존재하는지를 측정하기 위해, 이들 환자로부터 채취한 혈장 샘플을 세 가지 항원과 반응하는 항체가 존재하는지에 대해 측정하였다: 토끼 혈청 알부민과 지질 하이드로과산화물의 반응 생성물, LDL과 지질 하이드로과산화물과의 반응 생성물, MDA와의 반응 생성물.

ELISA 분석: ox-LDL, MDA-LDL 또는 지질 과산화물 변형된 알부민((LOOH-RSA) 양성 항원들) 및 LDL, 인체 알부민 및 아세틸 LDL (네가티브 대조군) 10 μg을 96 웰 마이크적정 플레이트에 100 μL 부피로 플레이트하였다. 4 ℃에서 하룻밤 배양한 후에, 2 시간 동안의 배양에 의해 플레이트들을 3% 분유로 배양시킴으로써 차단시켰다. 씻어낸 후에, 결합된 인체 IfF를 과산화 효소 또는 알카리성 인산효소와 콘쥬게이트를 형성한 안티-인체 IgG 항체를 이용하여 검측하였다. 결합된 효소 콘쥬게이트를 형성하는 IgG는 특정 기질을 이용하여 착색 검색에 의해 정량화되었다.

결과는 다음 표 3-5에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 대조군보다도 자궁내막증의 환자들에서 반응성 항체들의 레벨에서의 통계적 증가가 있었다.

항원: LOOH/RSA (200 μL 플라즈마 샘플).생성된 p-니트로페놀의 OD equivalents로 결과를 표시함.
t-테스트: 이-샘플 측정 비등가 편차(Two-sample Assuming Unequal Variences)
	자궁내막증	대조군
평균	0.493885	0.196313
편차	0.117233	0.023264
관찰치	63	32
P(T≤t) one-tail	3.74E-08
P(T≤t) two-tail	7.47E-08

항원: Ox-LDL (200 μL 플라즈마 샘플)
t-테스트: 이-샘플 측정 비등가 편차
	자궁내막증	대조군
평균	0.214741935	0.18009375
편차	0.005239014	0.006001378
관찰치	62	32
P(T≤t) one-tail	0.019975579
P(T≤t) two-tail	0.039951158

항원: MDA/LDL (200 μL 플라즈마 샘플)
t-테스트: 이-샘플 측정 비등가 편차
	자궁내막증	대조군
평균	0.213758065	0.165406
편차	0.005736645	0.003401
관찰치	62	32
P(T≤t) one-tail	0.000485039
P(T≤t) two-tail	0.000970078

본 발명은 바람직한 예를 참고로 하여 기술하였다. 방법, 키트 및 항체를 포함한 물질의 수정 및 변형이, 전술한 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게는 명백한 것이 될 것이다. 이같은 수정 및 변형 모두가 다음 청구범위의 범주에 속하도록 하였다.

Claims

일차 아민과 지질 과산화물의 반응에 의해 생성되는 항원과 결합하는 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것으로 이루어지는, 생물학적 샘플에서의 지질 과산화 반응의 검측 방법.
(I) 일차 아민과 지질 과산화물의 반응 생성물과 결합하는 항원 또는 항원의 단편, 또는

(ii) 상기 (I)의 항체와 결합하는 항체를 포함하는,

생물학적 샘플에서의 지질 과산화 반응의 검측용 키트.
일차 아민과 지질 하이드로과산화물와의 반응에 의해 생성된 항원과 결합하는, 정제된 항체.
일차 아민과 지질 하이드로과산화물과의 반응에 의해 생성된 항원과 결합하는 항체 단편.
제 3 또는 4 항에 있어서, 고체 지지체에 고정된 항체.
제 3 또는 4 항에 있어서, 검측가능한 물질로 표지된 항체.
제 5 항에 있어서, 상기 고체 지지체를 막대, 비즈, 컵 또는 납작한 팩에 부착되거나, 이에 의해 지지되는 막 및 코팅물로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항체.
제 5 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머 막으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항체.
제 3 또는 4 항에 있어서, 형광색소, 방사능 표지, 비오틴, 호스래디쉬 과산화효소, 알카리성 인산 효소, 2-갈락토시다제 또는 기타 효소로 이루어진 군 중에서 선택된 검측가능한 물질로 표지되는 항체.
제 3 항에 있어서, 콘쥬게이트인 항체.
제 3 또는 4 항에 있어서, 상기 항원이 리놀레산 하이드로과산화물 및 일차 아민의 반응 생성물인 항체.
제 11 항에 있어서, 상기 적절한 아미노산기가 알부민 또는 폴리리진, 또는 포스파티딜에탄올아민과 같은 저분자량 화합물 중의 리진과 같은 것인 항체.
제 3 또는 4 항에 있어서, 인체 적합화된 항체.

[청구항 14]

(I) 일차 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응에 의해 생성된 항원과 면역반응성인 항체와 결합하는 항원이나,

(ii) 일차 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응에 의해 생성되는 항원과 면역반응성인 항체와 교차반응성인 항체 또는 항체 단편 또는 콘쥬게이트와,

생물학적 샘플을 접촉시키는 것으로 이루어진, 생물학적 샘플에서의 지질 과산화반응 레벨의 검측 방법.
제 13 항에 있어서, 숙주내에서 상기 (I) 또는 (ii)의 레벨을 개체수 표준과 비교하는 방법.
(I) 일차 아민과 지질 하이드로과산화물과의 반응에 의해 생성되는 항원을 분리한 후에,

(ii) 일차 아민을 동정하는,

단계로 이루어진, 생물학적 샘플에서의 산화적 손상의 검측 방법.
일차 아민과 지질 하이드로과산화물과의 반응 생성물의 레벨을 검측하는 것으로 이루어진, 생물학적 샘플에서의 산화반응-연관성 이상 증상의 진단 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 산화반응-연관성 이상 증상이 심장혈관 질환, 아테롬성 동맥경화증, 염증성 질환, 자궁내막증, 글라이메롤 신장염, 자간전증, 지질 과산화 반응 매개된 중추신경계 이상, 알츠하이머병, 건선, 천식, 아토피성 피부염, 충실성 종양, 특발성 다발성 출혈성 육종, 신경변성 질환, 급성국한성 소장염(크론병), 류마티스성 관절염 및 허혈성 재관류로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
염증 효과를 유도하는 지질 하이드로과산화물과 일차 아민 사이의 반응의 형광성 생성물과 생물학적 샘플이나 숙주를 접촉시키는 것으로 이루어지는, 생물학적 샘플 또는 숙주에서의 염증 효과를 유도하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 리놀레산 하이드로과산화물이 13-HpODE인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 아민이 아미노산, 단백질, 펩티드 또는 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 염증 효과를 VCAM-1, MCP-1, IL-1, TNF-α, ICAM, MCSF 및 E-셀렉틴으로 이루어진 군 중에서 선택된 매개체의 유도에 의해 생성시키는 방법.
제 6 항에 있어서, 검측가능한 물질을 검측하는 수단이 병용되는 항체.
제 21 항에 있어서, 상기 검측가능한 물질 검측용으로 병용되는 수단이 검측가능한 물질로서의 효소와, 이 효소와 접촉시 색상 변화를 일으키는 효소 기질을 이용하는 것인 항체.
생물학적 샘플의 지질 과산화 반응의 상태를 낮추는 물질(substance)과 샘플을 접촉시키기 전후의, 숙주 샘플에서의 일차 아민과 지질 하이드로과산화물의 반응 생성물의 레벨을 비교하는 것으로 이루어지는, 생물학적 샘플의 지질 과산화 반응의 상태를 낮추는 물질의 성능 측정 방법.