JP4192092B2 - アルコール消費量を検出するための方法および手段 - Google Patents
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Description
免疫原の調製
リポタンパク質を健常なヒトの血漿から単離した。一晩絶食させた後に血液サンプルを採取し、血漿を遠心分離により分離した。リポタンパク質は密度に基づき連続超遠心により血漿から単離した。VLDL画分は密度1.006 g/mlから、LDL画分は密度1.019〜1.063g/mlから、およびHDL画分は密度1.063〜1.21g/mlから単離した。遠心分離後、リポタンパク質画分を、0.15 M NaCl, 0.01% EDTA, pH 7.4またはPBS, pH 7.4に対して+4℃にて透析した。
抗体の調製
抗PEthモノクローナル抗体を標準的プロトコール(Oi & Herzenberger 1980)を用いて調製した。6週齢のメスBalb/cマウスを、実施例1にしたがって調製したLDL粒子に取り込ませたホスファチジルエタノール抗原を用いて3週間間隔で免疫した。2回目の免疫後、陽性を示した血清サンプルを、直接ELISAアッセイ法を使用して同定した。この時、直接ELISAアッセイ法では、抗原、すなわちPEthリポタンパク質をウェルに結合し、試験しようとする血清を添加し、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を用いて結合抗体を測定した。抗原に対して陽性の応答を示したマウスの脾臓を単離し、ポリエチレングリコール (PEG 4000, Gibco, UK)を使用して、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3-X63-Ag8.653 (ATCC CRL-1580, American Type Culture Collection, USA)とを融合させた。ハイブリドーマ細胞を、HAT培地 [DMEM, 高濃度グルコース (Gibco, UK), 10% NCTC-135 (Gibco), 20% FBS (Bioclear, UK), 5% HFCS (Roche Molecular Biochemicals GmbH, Germany), HATサプリメント (Gibco) および ペニシリン/ストレプトマイシン 溶液 (Gibco) ]を含むウェルプレート上で選択した。ハイブリドーマ細胞を、上記のようにして、抗原に対する直接的ELISA法を利用してスクリーニングした。陽性を示すウェルについて限界希釈法を利用してクローニングし、単一のコロニーのみを有するウェルについて直接ELISA法を利用して再度スクリーニングした。陽性を示すハイブリドーマ培養液を回収し、Protein-G-Sepharose-アフィニティークロマトグラフィー(Pharmacia, Sweden)を用いてモノクローナル抗体を精製した。以下の試験においては、使用するハイブリドーマ抗体の種類を、抗Ig抗体ウェル(Biotop, Finland)での抗体補足を利用してIgG2bと決定した。
抗PEth抗体のリン脂質に対する特異性の測定
ラジオイムノアッセイを実施した。ウサギ抗マウスIgG 抗体 (Wallac, Delfia wells, Finland)でコーティングされたウェルを、PBS 溶液 (pH 7.4)で2回洗浄し、湿潤チャンバー内で+20℃にて30分間、ウェルあたり300μlの1% BSA-PBS 溶液で混和させながらブロッキングし、再度、PBS溶液で2回洗浄した。実施例2で調製し、1% BSA-PBS 溶液で50倍に希釈したマウス抗PEthモノクローナル抗体(その結果、抗体の量は1.4μg/mlである)を、ウェルあたり50μl添加し、湿潤チャンバー内で+4℃にて6時間混和させながらインキュベートし、PBS溶液で2回洗浄した。PBS 溶液で希釈し、かつ、HDLを3H コレステロールで標識した50μlの5-% リン脂質 HDL溶液 (タンパク質0.5 mg/ml、添加したリン脂質0.08.mg/ml)をウェルに抗原溶液として添加した。以下のリン脂質溶液について試験した:
PEth-HDL : 5% ホスファチジルエタノールを添加した3H-HDL溶液。
ホスファチジルエタノール測定のためのラジオイムノアッセイ(RIA)
平均アルコール消費量が一週間あたり96回分量のアルコール(55〜137回分量の範囲)であって、アルコール嗜癖から回復すべき旨が言い渡されているアルコールヘビーユーザー群と、平均アルコール消費量が一週間あたり9回分量のアルコール(4〜15回分量の範囲)である対照群とを、被験者として使用した。被験者は、検知し得るその他の健康上の問題は有していなかった。一晩絶食させた後、被験者から静脈血サンプルを採取し、血漿を遠心分離により分離した。リポタンパク質画分は、図1に記載されるようにして血漿から分離した。分離したHDL画分を3H-コレステロールエステル(Tollefson & Albers, 1986)を用いて標識した。
ホスファチジルエタノール測定のためのELISA法
平均アルコール消費量が一週間あたり81回分量のアルコール(44〜117回分量の範囲)であって、アルコール嗜癖から回復すべき旨が言い渡されているアルコールヘビーユーザー群と、平均アルコール消費量が一週間あたり13回分量のアルコール(1〜25回分量の範囲)である対照群とを、被験者として使用した。被験者は、検知し得るその他の健康上の問題は有していなかった。一晩絶食させた後、被験者から静脈血サンプルを採取し、血漿を遠心分離により分離した。
Gunnarsson, T., Karlsson, A., Hansson, P., Johnson, G., Alling, C., & Odham, G. (1998) Determination of phosphatidylethanol in blood from alcoholic males using high-performance liquid chromatography and evaporative light scattering or electrospray mass spectrometric detection, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 705: pp. 243-249.
Oi, V. T. & Herzenberger, L. A. (1980) Immunoglobulin-producing hybrid cell lines. In Selected Methods in Cellular Immunology, B. B. Mishell and Shiigi, S. M., editors. Freeman, San Francisco, pp. 351-372.
Stibler H. (1991) Carbohydrate-deficient transferrin in serum: A new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed, Clin. Chem. 12: pp. 2029-2037.
Tollefson, J. H. & Albers, J. J. (1986) Isolation, characterization, and assay of plasma lipid transfer proteins, Methods Enzymol. 129: pp. 797-816.
Varga, A., Hansson, P., Lundqvist, C., & Alling, C. (1998) Phosphatidylethanol in blood as a marker of ethanol consumption in healthy volunteers: comparison with other markers, Alcohol Clin. Exp. Res. 22: pp. 1832-1837.
Claims (16)
- ヒト身体から得たサンプルからアルコール消費量を検出する方法であって、該サンプルから、アルコール部分に4個以下の炭素原子を含み、かつリポタンパク質中に取り込まれたホスファチジルアルコールを、ホスファチジルアルコールを認識する抗体により測定し、サンプル中のホスファチジルアルコールの存在がそのヒトのアルコール消費量を示すことを特徴とする方法。
- 前記抗体に加えて、前記リポタンパク質のエピトープを認識する2次抗体を使用し、このエピトープがホスファチジルアルコール以外であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 2次抗体がリポタンパク質粒子HDL、LDLまたはVLDLのエピトープを認識することを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 2次抗体がリポタンパク質粒子タンパク質apoAIまたはapoB100を認識することを特徴とする、請求項3記載の方法。
- ELISAアッセイ法であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- モノクローナル抗体を使用することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ホスファチジルアルコールを血液、血漿または血清中で測定することを特徴とする、請求項6記載の方法。
- ホスファチジルエタノールを測定することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- アルコール部分に4個以下の炭素原子を含み、かつリポタンパク質中に取り込まれたホスファチジルアルコールを認識することを特徴とする抗体。
- モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項9記載の抗体。
- アルコール部分に4個以下の炭素原子を含み、かつリポタンパク質中に取り込まれたホスファチジルアルコールを認識する抗体を含んでなることを特徴とする検査キット。
- アルコール部分に4個以下の炭素原子を含み、かつリポタンパク質中に取り込まれたホスファチジルアルコールを認識する抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
- アルコール部分に4個以下の炭素原子を含み、かつリポタンパク質中に取り込まれたホスファチジルアルコールを用いて動物を免疫し;
a) 該動物により産生されたホスファチジルアルコール認識抗体を回収すること; または
b) 該抗体を産生する免疫動物の細胞と不死化細胞株とを融合させてハイブリドーマを生成させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、かつ、該ハイブリドーマにより産生される抗体を回収すること;
を特徴とする、ホスファチジルアルコールを認識する抗体の作製方法。 - リポタンパク質粒子HDL、LDLまたはVLDL中に取り込まれたホスファチジルアルコールを用いて免疫することを特徴とする、請求項13記載の方法。
- 請求項13または14記載の方法により産生される抗体。
- イムノアッセイにおける請求項9、10または15のいずれか1項に記載の抗体の使用。
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