FI112825B - Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus - Google Patents

Description

112825

MENETELMÄ ALKOHOLINKULUTUKSEN OSOITTAMISEKSI, MENETELMÄSSÄ KÄYTETTÄVIÄ VÄLINEITÄ SEKÄ NIIDEN VALMISTUS

Keksinnön ala 5 Keksintö liittyy menetelmään alkoholin kulutuksen osoittamiseksi näytteestä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö koskee menetelmää alkoholinkulutuksen osoittamiseksi henkilön kehonäytteestä, menetelmässä käytettävää vasta-ainetta sekä sitä sisältävää testipakkausta. Tässä kuvataan myös kyseistä vasta-ainetta tuottavaa hybridoomaa. Keksintö koskee myös menetel-10 mää kyseisen vasta-aineen valmistamiseksi sekä vasta-aineen käyttöä.

Keksinnön tausta

Runsas alkoholinkäyttö on terveysriski sekä yleinen ongelma terveydenhuollossa. Merkittävä osa terveyskeskusten ja sairaaloiden potilaista on alkoholin suurkuluttajia, joiden sairaudet saattavat johtua alkoholista, mutta 15 potilaat eivät itse nosta alkoholiongelmaansa esiin. Alkoholiongelman esilletulo voi kuitenkin olla ratkaisevaa potilaan hoitoa suunnitellessa, jotta ongelmien pahenemista alkoholinkäytön osalta voitaisiin estää tai ainakin vähentää ja tarvittaessa ohjata potilas tehokkaampaan hoitoon. Koska potilaat eivät yleensä kerro runsaasta alkoholinkäytöstään, lääkärin on voitava tunnistaa suurkulutus 20 muilla tavoin, esimerkiksi laboratoriotesteillä.

Pääosa nautitusta alkoholista (etanolista) hapettuu elimistössä ase-taldehydiksi ja asetaatiksi ja edelleen asetyyli-ko-entsyymi A:ksi (AcCoA). Pit-: käaikainen alkoholin suurkulutus saattaa aiheuttaa maksavaurion (rasvamak- · san, alkoholihepatiitin tai maksakirroosin), joka voidaan mahdollisesti todeta -! 25 muutoksina veren maksa-arvoissa.

·· Runsastakaan alkoholin käyttöä ei kuitenkaan aina voida osoittaa ··, tavanomaisin laboratoriokokein, kuten määrittämällä maksa-arvot. Siksi on jo pitkään yritetty kehittää parempia testejä tähän tarkoitukseen. Eräs vaihtoeh-toinen alkoholinkäytön määritysmenetelmä on kuvattu julkaisussa Stibler . : 30 1991. Siinä osoitetaan desialyloidun transferriinin määrä näytteessä kromato- grafisesti tai immunologisesti. Alkoholin käyttö lisää tämän transferriinityypin :,,.: määrää ja se on ilmeisesti tällä hetkellä paras alkoholikäytön indikaattori vaik- •; : kei menetelmä olekaan kovin spesifinen.

;·’ Toinen potentiaalinen alkoholikulutuksen indikaattori on fosfatidyyli- . 35 etanoli (PEth). Fosfatidyylietanoli on epänormaali fosfolipidi, jota muodostuu 2 112825 elimistössä vain alkoholin läsnäollessa. Sitä on myös löydetty alkoholia nauttineiden yksilöiden verestä (Varga et ai. 1998). Reaktiota katalysoi fosfolipaasi D, joka vaihtaa fosfatidyylikoliinin koliiniosan etanoliksi. Reaktio on esitetty kuvassa 1. Fosfatidyylietanolia on epäsuorasti käytetty alkoholikulutuksen mark-5 kerinä julkaisussa WO 90/07008 kuvatussa menetelmässä. Tässä menetelmässä eristetään veren lymfosyyttejä, jotka sitten viljellään etanolin ja soluja stimuloivan aineen, forboliesterin kanssa, jolloin lymfosyytit tuottavat fosfatidyylietanolia. Muodostunut radioaktiivinen fosfatidyylietanoli mitataan. Julkaisun mukaan alkoholiriippuvuuteen alttiilla henkilöillä on keskimääräistä suu-10 rempi kyky tuottaa fosfatidyylietanolia. Menetelmä on erittäin työläs ja saadut tulokset ovat ristiriitaiset. Gunnarsson et ai. (1998) ovat kuvanneet yksinkertaisemman menetelmän, jossa fosfatidyylietanoli määritetään suoraan verestä eikä lymfosyyttiviljelmästä. Menetelmässä heparinisoidusta verestä eristetään lipidifraktio heksaani-isopropanoliuutolla ja määritetään fosfatidyylietanolin läs-15 näolo joko massaspektrometristi tai nestekromatografisesti. Nämäkin tekniikat ovat liian monimutkaiset soveltuakseen rutiinityöskentelyyn.

Kumpikaan edellä mainituista menetelmistä fosfatidyylietanolin määrittämiseksi ei ole kovin luotettava osoittamaan alkoholin kulutusta. Lisäksi suuri työmäärä sekä monimutkaisuus tekevät menetelmistä sopimattomia klii-20 niseen rutiinityöskentelyyn. Yrityksistä huolimatta luotettavaa laboratorioiden rutiinikäyttöön soveltuvaa menetelmää ei ole onnistuttu kehittämään.

Immunomääritysmenetelmät soveltuvat usein hyvin kliinisiin labora-; toriotesteihin. Fosfatidyylialkoholin kohdalla ongelmana on kuitenkin ollut se, ; ; että pieniä molekyylejä vastaan on vaikea tuottaa vasta-ainetta. Perinteisesti *:·: 25 pieniä peptidejä tai steroidihormoneja kiinnitetään suurempiin kantajaproteii- : : neihin. Perinteiset kantajat sopivat kuitenkin huonosti lipidiantigeeneille. Nyt kuitenkin on yllättäen pystytty valmistamaan vasta-ainetta fosfatidyylialkoholia vastaan, mikä mahdollistaa huomattavasti yksinkertaisemman määritysmene-. . telmän alkoholin suurkulutuksen osoittamiseksi. Näin on keksitty osoittaa al- 30 koholin suurkulutus määrittämällä immunologisesti alkoholin käytön seurauksena elimistössä syntyvä fosfatidyylialkoholi.

: : Keksinnön mukaisen menetelmän etuja tunnettuun tekniikkaan : : nähden ovat luotettavuus, vähäinen työmäärä ja nopeus sekä se, ettei kalliita kromatografisia ja/tai spektrometrisiä laitteistoja tarvita. Menetelmä soveltuu 35 käytettäväksi rutiininomaisesti myös pienissä terveydenhuollon • : (päihdehuollon) yksiköissä, jolloin potilaan tilaa voidaan seurata joustavasti.

3 112825

Keksinnön mukaista vasta-ainetta voidaan myös käyttää muussa tutkimuksessa kuin alkoholisairauksien tutkimuksessa.

Yhteenveto keksinnöstä

Esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän alkoholinkulutuksen 5 osoittamiseksi henkilön kehonäytteestä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että näytteestä määritetään lipoproteiiniin liittynyt fosfati-dyylialkoholi sitä tunnistavan vasta-aineen avulla, jolloin fosfatidyylialkoholin läsnäolo näytteessä indikoi henkilön alkoholin kulutusta. Esillä oleva keksintö tarjoaa myös menetelmässä käyttökelpoisen vasta-aineen, jolle on tunnus-10 omaista, että se tunnistaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin. Keksintö tarjoaa myös testipakkauksen, jolle on tunnusomaista, että se sisältää keksinnön mukaisen vasta-aineen. Lisäksi kuvataan hybridooma, joka tuottaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin tunnistavaa vasta-ainetta.

Keksinnön piiriin kuuluu edelleen menetelmä fosfatidyylialkoholin 15 tunnistavan vasta-aineen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että immunisoidaan eläin lipoproteiiniin liittyneellä fosfatidyylialkoholilla; ja a) otetaan talteen eläimen tuottama vasta-aine, joka tunnistaa fosfatidyylialkoholin; tai b) fuusioidaan immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottavia soluja kuolemattoman solulinjan kanssa hybridooman tuottamiseksi; valitaan haluttua vasta-20 ainetta tuottava hybridooma; ja otetaan talteen sen tuottama vasta-aine. Keksinnön kohde on edelleen keksinnön mukaisen vasta-aineen käyttö immuno-määrityksessä. Myös edellä mainitulla menetelmällä valmistettu vasta-aine ku-* vataan.

Kuvien lyhyt kuvaus :“i 25 Kuva 1 kuvaa fosfatidyylietanolin (PEth) muodostumista fosfatidyy- ! -: likoliinista fosfolipaasi D:n katalysoimassa reaktiossa.

Kuva 2 kuvaa anti-PEth-vasta-aineen sitoutumista lipoproteiinipar- tikkeliin, johon PEth on liittynyt.

Kuva 3 kuvaa PEth:n määrittämisen ELISA-menetelmällä käyttäen 30 anti-PEth-vasta-ainetta ja toista vasta-ainetta, joka tunnistaa lipoproteiinin epi-toopin, joka on muu kuin PEth.

,,,: Kuva 4 kuvaa anti-PEth-vasta-aineen fosfolipidispesifisyyttä.

; ’ Kuva 5 esittää HDL-partikkelien PEth-pitoisuudet alkoholin suurku- luttajien (mustat neliöt) ja verrokkihenkilöiden (valkoiset neliöt) plasmassa . 35 osoitettuna käyttäen anti-PEth-vasta-ainetta radioimmunologisessa määrityk- ‘ ‘ sessä.

4 112825

Kuva 6 esittää HDL-partikkelien PEth-pitoisuudet alkoholin suurkuluttajien (mustat neliöt) ja verrokkihenkilöiden (valkoiset neliöt) plasmassa osoitettuna käyttäen anti-PEth-vasta-ainetta ELISA-määritysmenetelmässä.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5 Esillä oleva keksintö perustuu siihen, että nyt on onnistuttu tuotta maan vasta-aine fosfatidyylialkoholia vastaan. Tämä oli mahdollista liittämällä fosfatidyylialkoholi lipoproteiiniin ja käyttämällä tätä lipoproteiiniin liitettyä fosfatidyylialkoholia antigeeninä immunisaatiossa. Näin saadaan aikaan vasta-aine fosfolipidimolekyylin polaariselle osalle, tässä tapauksessa fosfatidyylial-10 koholille. "Fosfatidyylialkoholi” on fosfatidihapon esteri, jonka rasvahapot tässä tapauksessa yleensä ovat samat kuin luonnossa esiintyvän fosfatidyylikoliinin rasvahapot. "Lipoproteiinilla” tarkoitetaan yhdistettä, joka sisältää sekä proteiinia että lipidejä. Näitä esiintyy sekä solukalvoissa että elimistössä kiertävinä lipoproteiinipartikkeleina. Lipoproteiinipartikkelit sopivat hyvin fosfatidyylialko-15 holin kantajiksi. Fosfolipidien ja proteiinien lisäksi lipoproteiinipartikkelit sisältävät myös muita aineosia, kuten esimerkiksi triglyseridejä ja kolesterolia. Lipoproteiinipartikkelit luokitellaan mm. tiheytensä perusteella. Immunogeenin valmistuksessa voidaan käyttää esimerkiksi seuraavia lipoproteiinipartikkeleita: VLDL (very low density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein), HDL (high 20 density lipoprotein), VHDL (very high density lipoprotein), IDL (intermediate density lipoprotein) tai Lp(a) -lipoproteiinia. Hyviä tuloksia on saatu käyttämällä LDL:ää, HDL:ää ja VLDL:ää.

Fosfatidyylialkoholi, joka edullisesti on fosfatidyylietanoli, liuotetaan pieneen määrään liuotinta ja viedään vesipitoisessa liuoksessa olevaan li-25 poproteiiniin, jolloin liuotinpitoisuuden laimentuessa fosfatidyylialkoholi ha-; keutuu lipoproteiinin pinnalla olevien lipidien joukkoon. Immunisoitavan eläi men elimistö tunnistaa lipoproteiinin pinnalle tulleen pienimolekyylisen lipidin polaarisen tähteen (etanolin tapauksessa etyyliryhmän) vieraana aineena ja tuloksena saadaan vasta-aine. Kuvassa 2 esitetään LDL-lipoproteiinin pinnalla 30 olevan fosfatidyylietanolin vasta-aineen sitoutuminen. Immunogeenin antigee-nisyyttä on mahdollista lisätä käyttämällä oksidoituja (hapettuneita / hapetettuja) partikkeleita. Voidaan esimerkiksi liittää fosfatidyylietanoli tiukemmin lipoproteiiniin hapettamalla fosfatidyylin toinen rasvahappo ja syntyneen alde-hydin avulla muodostaa kovalenttinen sidos lipoproteiinin proteiiniosan ja fos-35 fatidyylialkoholin välille. Lisäksi voi olla mahdollista lisätä immunogeenisyyttä (ja jopa alkoholistin lipoproteiinin kaltaisuutta) modifioimalla lipoproteiinipartik- 5 112825 keliä myös muuten, kuten etyloimalla esim. asetaldehydi-käsittelyllä lipoprote-iinia ennen PEth-lisäystä (tai sen jälkeen). Mahdollista on myös desialyloida eli poistaa siaalihappoa lipoproteiineista, jolloin ne muistuttavat enemmän alkoholistin lipoproteiineja.

5 Edellä kuvattua lipoproteiiniin liitettyä fosfatidyylialkoholia voidaan käyttää antigeeninä sinänsä tunnetulla tavalla valmistettaessa keksinnön mukaista fosfatidyylialkoholia tunnistavaa vasta-ainetta. ’’Fosfatidyylialkoholia tunnistava vasta-aine” tarkoittaa vasta-ainetta, joka pystyy valikoivasti sitoutumaan fosfatidyylialkoholiin mukaanlukien kyseisen vasta-aineen sellaiset 10 fragmentit, jotka myös pystyvät valikoivasti sitoutumaan fosfatidyylialkoholiin. Tällaisia fragmentteja ovat esim. F(ab’)2 ja F(ab).

Immunologisesti reaktiivinen eläin immunisoidaan lipoproteiiniin liitetyllä fosfatidyylialkoholilla ja testataan antigeeniä kohtaan aiheutunut immuunivaste. Polyklonaalinen vasta-aine voidaan ottaa talteen positiivisen 15 vasteen antigeeniä kohtaan antavista eläimistä ja puhdistaa alan ammattimiesten yleisesti tuntemilla menetelmillä. Toisessa keksinnön suoritusmuodossa valmistetaan monoklonaalista vasta-ainetta. Immunisaatioiden jälkeen positiivisen vasteen antigeeniä kohtaan antavien eläinten vasta-ainetta tuottavat solut, yleensä pernasolut, fuusioidaan kuolemattoman solulinjan kanssa 20 vasta-ainetta tuottavan hybridooman saamiseksi. Vasta-aine eristetään positiivisten hybridoomien kasvatusalustasta ja puhdistetaan alan ammattimiesten yleisesti tuntemilla menetelmillä.

: Valmistetusta vasta-aineesta voidaan haluttaessa eristää fosfati- dyylialkoholin tunnistava fragmentti. Vaihtoehtoisesti tällainen fragmentti voi-25 daan tuottaa geeniteknisin menetelmin. Vasta-ainetta, mukaanlukien frag-.mentteja, voidaan edelleen muokata esimerkiksi liittämällä siihen havaitsemista helpottava merkkiaine, kuten radioaktiivinen isotooppi, metallipartikkeli tai fluoresoiva- tai entsyymimerkkiaine (esimerkiksi 3H, kolloidinen kulta, roda-miini, fluoreskeiini, peroksidaasi, alkaalinen fosfataasi) sinänsä tunnetuilla tek-30 nilkoilla.

Keksinnön mukainen vasta-aine mahdollistaa nyt fosfatidyylialkoho-Iin, ja erityisesti lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin osoittamisen immunologisesti. Immunologisesti osoitettava fosfatidyylialkoholi on edullisesti fosfatidyylietanoli ja erityisesti lipoproteiiniin liittynyt fosfatidyylietanoli. Immu-35 nologinen fosfatidyylialkoholin määritysmenetelmä on tarkoitettu erityisesti alkoholin suurkulutuksen luotettavaan osoittamiseen ja seurantaan. Alkoholin .112825 6 suurkulutukseksi voidaan katsoa kulutus, joka ylittää miehillä 24 ja naisilla 16 annosta viikossa tai vastaavasti kertakulutuksena miehillä yli 7 ja naisilla yli 5 annosta. Yksi annos alkoholia vastaa noin 12 grammaa puhdasta etanolia. Menetelmää voidaan myös käyttää apuna alkoholisairauksien toteamisessa 5 sekä tutkimuksessa. Alkoholin läsnäollessa elimistössä alkoholimolekyyli in-korporoituu fosfolipideihin fosfolipaasi D:n katalysoimassa reaktiossa, jossa normaalisti inkorporoituu vesi. Fosfatidyylialkoholin määrä elimistössä korreloi alkoholin kulutukseen ja fosfatidyylialkoholi säilyy kehossa ainakin 2 - 4 vrk kulutuksen jälkeen, ehkä pitempäänkin.

10 Fosfatidyylialkoholin tunnistavaa vasta-ainetta voidaan käyttää mis sä tahansa immunologisessa määritysmenetelmässä, joka perustuu antigeenin ja vasta-aineen välisen kompleksin osoittamiseen. Tämä kompleksi voidaan osoittaa joko suoraan tai epäsuorasti käyttäen sekundaarisia vasta-aineita. Usein immunomäärityksessä käytetään kiinteää kantajaa, jolloin joko 15 vasta-aine tai antigeeni sidotaan kantajaan. Kantajaan sidottu vasta-aine voi myös olla ns. sieppaava vasta-aine, jota käytetään välikonjugaattina primaari-vasta-aineen sitomiseksi kantajaan.

Eräässä suoritusmuodossa käytetään radioimmunologista määritysmenetelmää (RIA), joka voidaan suorittaa niin, että fosfatidyylialkoholin 20 vastainen vasta-aine kiinnitetään suoraan tai välikonjugaatin avulla kantajaan. Potilasnäytteen lipoproteiinit leimataan radioisotoopilla sinänsä tunnetulla ta-• · valla ja näytteiden annetaan reagoida kantajaan kiinnitetyn vasta-aineen 1: ! kanssa. Fosfatidyylialkoholia sisältävien lipoproteiinien sitoutuminen kantajaan j osoitetaan mittaamalla radioaktiivisuus.

25 Erittäin sovelias immunomääritysmenetelmä alkoholikulutuksen ,,,,: osoittamiseen on ELISA-määritys (enzyme linked immuno sorbent assay), jos sa siis käytetään entsyymillä leimattua vasta-ainetta. Entsyymileima voidaan liittää joko suoraan keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen tai vaihtoehtoisesti sekundaariseen vasta-aineeseen. Eräs ELISA:an sopiva suoritusmuoto voi-30 daan toteuttaa kiinnittämällä keksinnön mukainen vasta-aine suoraan tai välikonjugaatin avulla kiinteään kantajaan, antamalla sen reagoida näytteen ; 1 ; kanssa ja osoittamalla sitoutunut liproproteiiniin liittynyt fosfatidyylialkoholi toi- ,: sella vasta-aineella, joka tunnistaa mainitun lipoproteiinin epitoopin, joka on muu kuin fosfatidyylialkoholi. Mainittuun toiseen vasta-aineeseen voi olla kiin-: " 35 nitetty entsyymileima tai mainittu toinen vasta-aine voidaan osoittaa leimaa si- 7 112825 sältävällä sekundaarisella vasta-aineella. Leima osoitetaan yleensä lisäämällä entsyymin substraattia ja osoittamalla muodostuneen tuotteen väri.

Kuvassa 3 on esitetty fosfatidyylietanolin pitoisuuden määrittäminen näytteestä ELISA-menetelmällä, jossa fosfatidyylietanolia vastaan kehitetyn 5 vasta-aineen lisäksi käytetään toista vasta-ainetta, joka tunnistaa fosfatidyylietanolia sisältävän lipoproteiinin proteiiniosan. A) kuvastaa anti-PEth-vasta-aineen kiinnittämisen kuoppalevyn kuoppien pohjaan. B) kuvastaa näytteen lisäämisen kuoppalevylle. Normaali HDL on avoin ympyrä ja PEth:a sisältävä HDL on harmaa ympyrä. C) kuvastaa PEth:a sisältävien HDL-hiukkasten mää-10 rän kvantitoimisen apoproteiini A-l vastaan kohdistetulla leimatulla vasta-aineella.

Määrityksessä käytettävä toinen vasta-aine on yleensä suunnattu fosfatidyylialkoholia sisältävän lipoproteiinin proteiiniosaa vastaan. Näitä ns. apolipoproteiineja on mm. apoAI, apoAII, apoBIOO, apoB-48, apoCI, apoCII, 15 apoCIII, apoD, apoE ja apoJ. LDL-partikkeli sisältää vain yhtä proteiinia apoB-100, jota on myös VLDL-partikkeleissa. HDL-partikkelit eivät sisällä apoB-100:a, vaan pääasiassa apoALtä ja apoAILta.

Keksinnön mukainen testipakkaus voi keksinnön mukaisen vasta-aineen lisäksi myös sisältää muita fosfatidyylialkoholin immunomääritykseen 20 tarvittavia reagensseja ja välineitä, kuten esimerkiksi muita määrityksessä käytettäviä, mahdollisesti leimattuja vasta-aineita ja reagensseja leiman havaitsemiseksi sekä tarvittavia puskureita ja/tai kantajia, kuten mikrotiitterilevyjä, i i joihin mahdollisesti on valmiiksi kiinnitetty reagenssit, kuten vasta-aine.

Immunologisella määritysmenetelmällä tutkittava kehonäyte voi olla : 25 esimerkiksi veri, plasma, seerumi, sylki, kudos tai lapsivesi tai jokin muu fosfa tidyylialkoholia sisältävä osa tai neste. Näyte voi olla myös oikeuslääketieteellinen näyte, post mortem -näyte tai sikiön kudoksista otettu näyte. ELISA- ja RIA-määrityksiin soveltuvat parhaiten nestenäytteet, kuten plasma, seerumi ja veri, joita voidaan käyttää määrityksessä sellaisenaan, ilman lipidifraktion 30 uuttoa tai liuotusta.

Fosfatidyylietanolin sijasta lipoproteiiniin voidaan liittää jonkin muun alkoholin fosfatidyyli, tämän alkoholin fosfatidyylin vastaisen vasta-aineen saamiseksi. Kyseeseen tulevat suoraketjuiset alkoholit, joissa on enintään kahdeksan, mieluummin 1 - 4 hiiliatomia, eli sellaiset alkoholit, jotka fosfoli-35 paasi D:n katalysoimassa reaktiossa muuttuvat fosfatidyylialkoholeiksi. Erilaisia fosfatidyylialkoholeja tunnistavia vasta-aineita voidaan siten käyttää myös 8 112825 potilaan nauttiman alkoholin laadun määrityksessä osoittamaan ei-nautittavaksi tarkoitettujen alkoholien, kuten etyleeniglykolin, isopropanolin, metanolin ja mahdollisesti myös propanolin, butanolin ja pentanolin käyttö, jolloin hoito voidaan sovittaa ongelman mukaisesti.

5 Keksinnön muihin suoritusmuotoihin lukeutuvat edelleen sellaiset immunologiset menetelmät, kuten vasta-ainepylväät, Western-blot ja immuno-histologiset menetelmät. Luonnollisesti fosfatidyylialkoholeja vastaan tuotettuja vasta-aineita voidaan käyttää myös biokemiallisessa perustutkimuksessa, kuten lipidimetabolian tutkimukseen. Epäsuorasti niitä voidaan myös käyttää 10 fosfolipaasi D:n aktiivisuuden ja sijainnin osoittamiseen esimerkiksi solu- tai kudosviljelmistä tai histologisista näytteistä

Keksintöä valaistaan seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1

Immunogeenin valmistus 15 Terveiden ihmisten plasmasta eristettiin lipoproteiinit. Verinäytteet otettiin yön paaston jälkeen ja plasma erotettiin sentrifugoimalla. Lipoproteiinit eristettiin plasmasta perättäisellä ultrasentrifugaatiolla tiheytensä perusteella. VLDL-fraktio eristettiin tiheydestä 1,006 g/ml, LDL-fraktio tiheydestä 1,019 -

1,063 g/ml ja HDL tiheydestä 1,063 - 1,21 g/ml. Sentrifugoinnin jälkeen li-20 poproteiinifraktiot dialysoitiin 0,15 M NaCI, 0,01 % EDTA, pH 7,4 tai PBS, pH

7,4 vastaan, +4 °C:ssa.

Lipoproteiinipartikkeleiden fosfolipidipitoisuus mitattiin ja tarvittava : fosfatidyylietanolimäärä laskettiin siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 5 % : fosfolipidien kokonaismäärästä. Fosfatidyylietanoli, joka oli 1,2-dioleoyyli-sn- • · j 25 glysero-3-fosfoetanolin natriumsuola (Avanti Polar Lipids, USA), liitettiin ihmi-sen eristettyihin HDL- tai LDL-partikkeleihin (5 % lipoproteiinien fosfolipideistä) seuraavan menetelmän mukaisesti: Mainittu fosfatidyylietanoli, joka oli liuotettu kloroformiin (10 mg/ml) kuivattiin ensin typpivirralla ja edelleen vakuumissa . , huoneen lämmössä yli yön. Kuiva lipidikalvo liuotettiin sitten pieneen tilavuu- 30 teen etanolia ja lisättiin (50 - 100 μΙ) tipoittain noin 1 ml:aan vesi-suolaliuosta (0,15 M NaCI, 0,01 % EDTA, pH 7,4), joka sisälsi HDL- tai LDL-partikkelit. Liu-*: oksia inkuboitiin yli yön kylmässä (+ 4°C) ja säädettiin sitten niiden tiheydet : 1,21 g/ml:ksi (HDL) tai 1,063 g/ml:ksi (LDL) NaBr-liuoksella ja sentrifugoitiin 114 000 g, 18 tuntia, +15 °C:ssa. Sentrifugoidut lipoproteiinifraktiot dialysoitiin 35 0,5 M NaCI, 0,01 % EDTA, pH 7,4 vastaan. Saatuja fosfatidyylietanolia sisäl- : täviä lipoproteiinipartikkeleita käytettiin immunogeeneinä.

9 112825

Esimerkki 2

Vasta-aineen valmistus

Monoklonaalinen anti-PEth -vasta-aine valmistettiin standardiproto-kollan mukaisesti (Oi & Herzenberger 1980). Kuusiviikkoiset naaraspuoliset 5 Balb/c hiiret immunisoitiin kolmen viikon välein LDL-partikkeleihin liittyneellä fosfatidyylietanoliantigeenillä, joka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti. Toisen immunisaation jälkeen positiiviset seeruminäytteet identifioitiin suoralla ELISA-määrityksellä, jossa antigeeni eli PEth-lipoproteiini sidottiin kaivoihin, lisättiin testattava seerumi, pestiin ja määritettiin sitoutunut vasta-aine anti-10 hiiren immunoglobuliinivasta-aineella, joka oli leimattu piparjuuriperoksidaasil-la. Positiivisen vasteen antigeeniä kohtaan antaneiden hiirten pernat eristettiin ja pernasolut fuusioitiin polyetyleeniglykolia (PEG 4000, Gibco, UK) käyttäen hiiren myeloomasolulinjan P3-X63-Ag8.653 kanssa (ATCC CRL-1580, American Type Culture Collection, USA). Hybridoomasoluja valittiin kuoppalevyllä 15 HAT-kasvatusalustalla [DMEM, korkea glukoosi (Gibco, UK), 10 % NCTC-135 (Gibco), 20 % FBS (Bioclear, UK), 5 % HFCS (Roche Molecular Biochemicals GmbH, Saksa), HAT-supplementti (Gibco) ja penisilliini/streptomysiini-liuos (Gibco)]. Hybridoomasoluja seulottiin käyttäen suoraa ELISA:a antigeeniä vastaan kuten edellä on kuvattu. Positiiviset kaivot kloonattiin käyttäen rajoit-20 tavaa laimennusmenetelmää ja ne kaivot, joissa oli vain yksi pesäke seulottiin jälleen suoralla ELISA:lla. Positiivisten hybridoomien kasvatusalustat kerättiin ja monoklonaalinen vasta-aine puhdistettiin proteiini-G-Sepharose-; affiniteettikromatografialla (Pharmacia, Ruotsi). Seuraavissa kokeissa käytetyn : hybridooman vasta-aineen luokaksi määritettiin lgG2b käyttäen vasta-aineiden 25 sieppausta anti-lg-vasta-ainekaivoihin (Biotop, Suomi).

Esimerkki 3

Anti-PEth-vasta-aineen fosfolipidispesifisyyden määrittäminen

Suoritettiin radioimmunomääritys. Kanin anti-hiiri-IgG-vasta-aineella päällystetyt kuopat (Wallac, Delfia kuopat, Suomi) pestiin kahdesti PBS-·’ 30 liuoksella (pH 7,4), blokattiin 1 % BSA-PBS-liuoksella, 300 μΙ/kuoppa, 30 min, ; + 20 °C kosteakammiossa sekoittaen ja pestiin uudelleen kahdesti PBS- liuoksella. Kaivoihin lisättiin 50 μΙ/kuoppa esimerkissä 2 valmistettua monoklo-.naalista hiiren anti-PEth-vasta-ainetta, joka oli laimennettu 1:50 1 % BSA-PBS-liuokseen, jolloin vasta-ainetta oli 1,4 μg/ml, ja inkuboitiin 6 tuntia 35 +4°C:ssa kosteakammiossa sekoittaen; pestiin kahdesti PBS-liuoksella. Kai-• voihin lisättiin antigeeniliuoksina 50 μΙ PBS-liuokseen laimennetut 5 - 10 112825 prosenttiset fosfolipidi-HDL-liuokset, joiden HDL oli leimattu 3H-kolesterolilla (0,5 mg/ml proteiinia, 0,08 mg/ml lisättyä fosfolipidiä). Seuraavia fosfolipidiliu-oksia testattiin: 5 PEth-HDL: 5% fosfatidyylietanoli lisättynä 3H-HDL-liuokseen PC-HDL: 5% fosfatidyylikoliini lisättynä 3H-HDL-liuokseen SM-HDL: 5% sfingomyeliini lisättynä 3H-HDL-liuokseen PE-HDL: 5% fosfatidyylietanoliamiini lisättynä 3H-HDL- liuokseen 10 PA-HDL: 5% fosfatidihappo lisättynä 3H-HDL-liuokseen PS-HDL: 5% fosfatidyyliseriini lisättynä 3H-HDL-liuokseen PI-HDL: 5 % fosfatidyyli-inositoli lisätty 3H-HDL-liuokseen LPC-HDL: 5% lysofosfatidyylikoliini lisättynä 3H-HDL-liuokseen 15 Inkuboitiin kylmähuoneessa kosteakammiossa sekoittaen yli yön.

Kaivot pestiin neljästi PBS-liuoksella ja taputeltiin kuivaksi. Tämän jälkeen kaivot leikattiin erilleen toisistaan giljotiinilla ja pudotettiin 2 mliaan tui-kenestettä (OptiPhase Highsafe 3, Wallac). Vorteksoinnin jälkeen mitattiin radioaktiivisuus beta-laskijalla (Wallac) 3H-ohjelmalla käyttäen 5 minuutin mitta- 20 usaikaa. Tulokset esitetään sitoutuneen radioaktiivisuuden määränä (% dpm) kuvassa 4. Tulokset osoittavat, että käytetty anti-PEth-vasta-aine tunnistaa spesifisesti lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylietanolin.

11 112825

Esimerkki 4

Radioimmuunimääritys (RIA) fosfatidyylietanolin määrittämiseksi

Koehenkilöinä oli ryhmä katkaisuhoitoon hakeutuneita alkoholin 5 suurkuluttajia, joiden alkoholin keskikulutus oli 96 annosta alkoholia viikossa (välillä 55 - 137 annosta) sekä ryhmä verrokkihenkilöitä, joiden alkoholin keskikulutus oli 9 annosta alkoholia viikossa (välillä 4-15 annosta). Koehenkilöillä ei ollut (muita) havaittavia terveydellisiä ongelmia. Koehenkilöistä otettiin las-kimoverinäytteet yli yön paaston jälkeen ja erotettiin plasmat sentrifugoimalla. 10 Plasmasta erotettiin lipoproteiinifraktiot esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eristetyt HDL-fraktiot leimattiin 3H-kolesteroliesterillä (Tollefson & Albers, 1986).

Määrityksessä käytettiin kuoppalevyjä, joissa on irrotettavat kuopat 8 kuopan liuskoina (NUNC Lock Well MaxiSorp). Mikrotiitterilevyjen kaivot päällystettiin vuohen anti-hiiri-lgG (H+L)-vasta-aineella (Zymed Laboratories, 15 USA) 20 pg/ml (laimennettu PBS-liuokseen), 50 μΙ/kaivo ja inkuboitiin 24 h, +4 °C:ssa. Pestiin kahdesti PBS-liuoksella, minkä jälkeen lisättiin esimerkissä 2 valmistettua hiiren monoklonaalista anti-PEth-vasta-ainetta (100 μΙ/kaivo 1:50 laimennosta PBS-liuokseen 43 ng/μΙ kantaliuoksesta) ja annettiin vasta-aineen sitoutua tunnin ajan huoneen lämmössä. Kaivot pestiin kahdesti PBS-20 liuoksella ja blokattiin kahden tunnin ajan huoneen lämmössä 1% BSA-PBS-liuoksella tilavuudella 300 μΙ/kaivo, minkä jälkeen blokkaus poistettiin.

Alkoholin suurkuluttajien sekä verrokkihenkilöiden plasmasta eristettyjä 3H-kolesteroliesterillä leimattuja HDL-fraktioita sekä standardinäytteitä kutakin 50 μΙ/kaivo inkuboitiin kylmähuoneessa yli yön. Näytteet oli laimen-25 nettu näytepuskuriin (1xPBS, 1% BSA, 0,5% TritonX-100, 1 mM EDTA) pitoisuuteen 0,5 mg/ml proteiinia. Standardinäytteinä käytettiin 0%, 1% ja 10% PEth-HDL, joka oli tehty eri kontrollihenkilöiden HDL-fraktioista yhdistettyyn liuokseen. Tämän jälkeen kaivot pestiin neljä kertaa PBS-liuoksella, jossa oli 0,5% TritonX-100:a ja vielä kahdesti PBS:llä.

30 Kaivot taputeltiin kuivaksi ja pudotettiin tuikepulloihin, joissa oli kus sakin 2 ml tuikenestettä (OptiPhase Highsafe3, PerkinElmer Wallac Finland), vorteksoitiin 30 sekuntia ja mitattiin radioaktiivisuus Wallacin Rack-beta-; tuikelaskijalla (3H-laskennalla). Standardeja apuna käyttäen laskettiin näyttei den sisältämä PEth-pitoisuus. Tulokset on esitetty kuvassa 5. Kokeet osoitti-35 vat, että fosfatidyylietanolipitoisuus alkoholin suurkuluttajien HDL- .112825 12 partikkeleissa (2,75 ± 0,53 μηηοΙ/Ι) oli merkittävästi korkeampi kuin verrokki-ryhmässä (1,70 ± 0,43 μηιοΙ/Ι) (p < 0,01, Student’s t-test).

Esimerkki 5 ELISA-menetelmä fosfatidyylietanolin määrittämiseksi 5 Koehenkilöinä oli ryhmä katkaisuhoitoon hakeutuneita alkoholin suurkuluttajia, joiden alkoholin keskikulutus oli 81 annosta alkoholia viikossa (välillä 44-117 annosta) sekä ryhmä verrokkihenkilöitä, joiden alkoholin keskikulutus oli 13 annosta alkoholia viikossa (välillä 1-25 annosta). Koehenkilöillä ei ollut (muita) havaittavia terveydellisiä ongelmia. Koehenkilöistä otettiin 10 laskimoverinäytteet yli yön kestäneen paaston jälkeen ja erotettiin plasmat sentrifugoimalla.

Mikrotiitterilevyn (Delfia, Wallac, Suomi) kaivot päällystettiin kanin anti-hiiri-lgG(H+L)-vasta-aineella. Sitten kaivot pestiin kahdesti PBS-liuoksella. Kuhunkin kaivoon lisättiin esimerkissä 2 valmistettua hiiren monoklonaalista 15 anti-PEth-vasta-ainetta (100 μΙ/kaivo 1:50 laimennosta PBS-liuokseen 43 ng/μΙ kantaliuoksesta) ja annettiin reagoida tunnin ajan huoneen lämmössä. Kaivot pestiin kahdesti PBS-liuoksella ja blokattiin 1% BSA-PBS-liuoksella n. 350 μΙ/kuoppa puolen tunnin ajan huoneen lämmössä ja pestiin jälleen kahdesti PBS-liuoksella.

20 Sitten lisättiin 100 μΙ/kaivo 1:10 PBS-liuokseen laimennettua paas- toveriplasmaa, kaksi rinnakkaista kustakin näytteestä. Annettiin reagoida +4°C:ssa yön yli. Kaivot pestiin kahdesti PBS-liuoksella ja lisättiin 1:500 1% : BSA-PBS-liuokseen laimennettua lampaan anti-ihmisen-ApoAI-vasta-ainetta (Roche Diagnostic, Saksa) 100 μΙ kaivoa kohti ja annettiin reagoida huoneen : 25 lämmössä tunnin ajan. Sitten kaivot pestiin kolmesti PBS-liuoksella. Lisättiin kuhunkin kaivoon 100 μΙ 1:1000 1 % BSA-PBS-liuokseen laimennettua, perok-sidaasileimattua aasin anti-lammas-lgG(Fab)-POD-vasta-ainetta (Roche Diagnostic, Saksa) ja annettiin reagoida tunnin ajan huoneen lämmössä. PBS-pesujen jälkeen peroksidaasireaktio suoritettiin käyttäen substraattina 1,2-30 diaminobentseeniä (OPD) (Sigma). OPD tabletti liuotettiin juuri ennen käyttöä 20 ml:aan puskuria ja lisättiin 100 μΙ/kuoppa ja inkuboitiin 5-15 min huoneen lämpötilassa pimeässä. Reaktio pysäytettiin 3 M rikkihapolla 50 μΙ/kuoppa. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm.

Tulokset on esitetty kuvassa 6. Tulokset osoittavat, että fosfatidyy-35 lietanolipitoisuus alkoholin suurkuluttajien plasman HDL-partikkeleissa oli mer-’ kittävästi korkeampi kuin verrokkiryhmässä (p < 0,0001).

13 112825

Esimerkissä 2 valmistetun hiiren anti-ihmisen-PEth-lgG2b-vasta-aineen sitomat fosfatidyylietanolia sisältävät VLDL- ja LDL-partikkelit osoitettiin vastaavasti plasmasta käyttäen toisena vasta-aineena anti-ihmisen-apoB100-vasta-ainetta (Roche Diagnostic). Saadut tulokset olivat samansuuntaiset kuin 5 anti-ihmisen-ApoAI-vasta-aineella saaduissa kokeissa.

♦ : * » 14 112825

KIRJALLISUUSLUETTELO

Gunnarsson.T., Karlsson, A., Hansson, P., Johnson, G., Ailing, C., & Odham, G. (1998) Determination of phosphatidylethanol in blood from alcoholic males 5 using high-performance liquid chromatography and evaporative light scattering or electrospray mass spectrometric detection, J.Chromatogr.B Bio-med.Sci.Appl. 705:243-249.

Oi, V. T. & Herzenberger, L. A. (1980) Immunoglobulin-producing hybrid cell 10 lines. In Selected Methods in Cellular Immunology, B.B.Mishell and Shi-igi.S.M., editors. Freeman, San Francisco. 351-372.

Stibler H. (1991) Carbohydrate-deficient transferrin in serum: A new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed, Clin. Chem. 12: 2029 -15 2037

Tollefson, J. H. & Albers, J. J. (1986) Isolation, characterization, and assay of plasma lipid transfer proteins, Methods Enzymol. 129:797-816.

20 Varga, A., Hansson, P., Lundqvist, C., & Ailing, C. (1998) Phosphatidylethanol in blood as a marker of ethanol consumption in healthy volunteers: comparison with other markers, Alcohol Clin.Exp.Res. 22:1832-1837.

Claims (15)

15 1 12825

1. Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi henkilön keho-näytteestä, tunnettu siitä, että näytteestä määritetään lipoproteiiniin liitty- 5 nyt fosfatidyylialkoholi sitä tunnistavan vasta-aineen avulla, jolloin fosfatidyyli-alkoholin läsnäolo näytteessä indikoi henkilön alkoholin kulutusta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun vasta-aineen lisäksi käytetään toista vasta-ainetta, joka tunnistaa mainitun lipoproteiinin epitoopin, joka on muu kuin fosfatidyylialkoholi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että toinen vasta-aine tunnistaa lipoproteiinipartikkelin HDL:n, LDL:n tai VLDL:n epitoopin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen vasta-aine tunnistaa lipoproteiinipartikkelin proteiinin apoAI tai 15 apoBIOO.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä on ELISA-määritysmenetelmä.

6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään monoklonaalista vasta-ainetta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että lipoproteiiniin liittynyt fosfatidyylialkoholi määritetään verestä, plasmasta tai seerumista.

8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, ‘: tunnettu siitä, että määritetään fosfatidyylietanoli. • 25 9. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se tunnistaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin, ja että se on saatavissa immunisoimalla eläin lipoproteiiniin liittyneellä fosfatidyylialkoholilla ja a) ottamalla talteen eläimen tuottama vasta-aine, joka tunnistaa fosfatidyylialkoholin; tai 30 b) fuusioimalla immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottavia solu- • ‘ ja kuolemattoman solulinjan kanssa hybridooman tuottamiseksi; ja valitsemalla : ’ : haluttua vasta-ainetta tuottava hybridooma; ja ottamalla talteen sen tuottama ;· vasta-aine.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen vasta-aine, tunnettu sii- ' 35 tä, että se tunnistaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylietanolin. .112825

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on monoklonaalinen vasta-aine.

12. Testipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukaisen vasta-aineen.

13. Menetelmä fosfatidyylialkoholin tunnistavan vasta-aineen val mistamiseksi, tunnettu siitä, että immunisoidaan eläin lipoproteiiniin liittyneellä fosfatidyylialkoholil- la; ja a) otetaan talteen eläimen tuottama vasta-aine, joka tunnistaa fos-10 fatidyylialkoholin; tai b) fuusioidaan immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottavia soluja kuolemattoman solulinjan kanssa hybridooman tuottamiseksi; valitaan haluttua vasta-ainetta tuottava hybridooma; ja otetaan talteen sen tuottama vasta-aine.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunisoidaan fosfatidyylialkoholilla, joka on liitetty lipoproteiinipar-tikkeliin HDL, LDL tai VLDL.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukaisen vasta-aineen käyttö immunomäärityksessä. 4 · « ' » „ 112825