FI112825B - Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus - Google Patents
Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus Download PDFInfo
- Publication number
- FI112825B FI112825B FI20011517A FI20011517A FI112825B FI 112825 B FI112825 B FI 112825B FI 20011517 A FI20011517 A FI 20011517A FI 20011517 A FI20011517 A FI 20011517A FI 112825 B FI112825 B FI 112825B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibody
- alcohol
- lipoprotein
- phosphatidyl
- identifies
- Prior art date
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 6
- -1 phosphatidyl alcohol Chemical compound 0.000 claims description 52
- JCABVIFDXFFRMT-DIPNUNPCSA-N [(2r)-1-[ethoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC JCABVIFDXFFRMT-DIPNUNPCSA-N 0.000 claims description 44
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 24
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 16
- 108010017342 very high density lipoproteins Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 10
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 5
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 description 4
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 208000028505 alcohol-related disease Diseases 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001606 Alcohol problem Diseases 0.000 description 2
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101150094024 Apod gene Proteins 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010009208 Cirrhosis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100440173 Mus musculus Clu gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101100049199 Xenopus laevis vegt-a gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 206010001584 alcohol abuse Diseases 0.000 description 1
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 1
- 208000025746 alcohol use disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010002 alcoholic liver cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical group C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000006203 ethylation Effects 0.000 description 1
- 238000006200 ethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- QKGYJVXSKCDGOK-UHFFFAOYSA-N hexane;propan-2-ol Chemical compound CC(C)O.CCCCCC QKGYJVXSKCDGOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/98—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving alcohol, e.g. ethanol in breath
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Liquid Crystal (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
Description
112825
MENETELMÄ ALKOHOLINKULUTUKSEN OSOITTAMISEKSI, MENETELMÄSSÄ KÄYTETTÄVIÄ VÄLINEITÄ SEKÄ NIIDEN VALMISTUS
Keksinnön ala 5 Keksintö liittyy menetelmään alkoholin kulutuksen osoittamiseksi näytteestä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö koskee menetelmää alkoholinkulutuksen osoittamiseksi henkilön kehonäytteestä, menetelmässä käytettävää vasta-ainetta sekä sitä sisältävää testipakkausta. Tässä kuvataan myös kyseistä vasta-ainetta tuottavaa hybridoomaa. Keksintö koskee myös menetel-10 mää kyseisen vasta-aineen valmistamiseksi sekä vasta-aineen käyttöä.
Keksinnön tausta
Runsas alkoholinkäyttö on terveysriski sekä yleinen ongelma terveydenhuollossa. Merkittävä osa terveyskeskusten ja sairaaloiden potilaista on alkoholin suurkuluttajia, joiden sairaudet saattavat johtua alkoholista, mutta 15 potilaat eivät itse nosta alkoholiongelmaansa esiin. Alkoholiongelman esilletulo voi kuitenkin olla ratkaisevaa potilaan hoitoa suunnitellessa, jotta ongelmien pahenemista alkoholinkäytön osalta voitaisiin estää tai ainakin vähentää ja tarvittaessa ohjata potilas tehokkaampaan hoitoon. Koska potilaat eivät yleensä kerro runsaasta alkoholinkäytöstään, lääkärin on voitava tunnistaa suurkulutus 20 muilla tavoin, esimerkiksi laboratoriotesteillä.
Pääosa nautitusta alkoholista (etanolista) hapettuu elimistössä ase-taldehydiksi ja asetaatiksi ja edelleen asetyyli-ko-entsyymi A:ksi (AcCoA). Pit-: käaikainen alkoholin suurkulutus saattaa aiheuttaa maksavaurion (rasvamak- · san, alkoholihepatiitin tai maksakirroosin), joka voidaan mahdollisesti todeta -! 25 muutoksina veren maksa-arvoissa.
·· Runsastakaan alkoholin käyttöä ei kuitenkaan aina voida osoittaa ··, tavanomaisin laboratoriokokein, kuten määrittämällä maksa-arvot. Siksi on jo pitkään yritetty kehittää parempia testejä tähän tarkoitukseen. Eräs vaihtoeh-toinen alkoholinkäytön määritysmenetelmä on kuvattu julkaisussa Stibler . : 30 1991. Siinä osoitetaan desialyloidun transferriinin määrä näytteessä kromato- grafisesti tai immunologisesti. Alkoholin käyttö lisää tämän transferriinityypin :,,.: määrää ja se on ilmeisesti tällä hetkellä paras alkoholikäytön indikaattori vaik- •; : kei menetelmä olekaan kovin spesifinen.
;·’ Toinen potentiaalinen alkoholikulutuksen indikaattori on fosfatidyyli- . 35 etanoli (PEth). Fosfatidyylietanoli on epänormaali fosfolipidi, jota muodostuu 2 112825 elimistössä vain alkoholin läsnäollessa. Sitä on myös löydetty alkoholia nauttineiden yksilöiden verestä (Varga et ai. 1998). Reaktiota katalysoi fosfolipaasi D, joka vaihtaa fosfatidyylikoliinin koliiniosan etanoliksi. Reaktio on esitetty kuvassa 1. Fosfatidyylietanolia on epäsuorasti käytetty alkoholikulutuksen mark-5 kerinä julkaisussa WO 90/07008 kuvatussa menetelmässä. Tässä menetelmässä eristetään veren lymfosyyttejä, jotka sitten viljellään etanolin ja soluja stimuloivan aineen, forboliesterin kanssa, jolloin lymfosyytit tuottavat fosfatidyylietanolia. Muodostunut radioaktiivinen fosfatidyylietanoli mitataan. Julkaisun mukaan alkoholiriippuvuuteen alttiilla henkilöillä on keskimääräistä suu-10 rempi kyky tuottaa fosfatidyylietanolia. Menetelmä on erittäin työläs ja saadut tulokset ovat ristiriitaiset. Gunnarsson et ai. (1998) ovat kuvanneet yksinkertaisemman menetelmän, jossa fosfatidyylietanoli määritetään suoraan verestä eikä lymfosyyttiviljelmästä. Menetelmässä heparinisoidusta verestä eristetään lipidifraktio heksaani-isopropanoliuutolla ja määritetään fosfatidyylietanolin läs-15 näolo joko massaspektrometristi tai nestekromatografisesti. Nämäkin tekniikat ovat liian monimutkaiset soveltuakseen rutiinityöskentelyyn.
Kumpikaan edellä mainituista menetelmistä fosfatidyylietanolin määrittämiseksi ei ole kovin luotettava osoittamaan alkoholin kulutusta. Lisäksi suuri työmäärä sekä monimutkaisuus tekevät menetelmistä sopimattomia klii-20 niseen rutiinityöskentelyyn. Yrityksistä huolimatta luotettavaa laboratorioiden rutiinikäyttöön soveltuvaa menetelmää ei ole onnistuttu kehittämään.
Immunomääritysmenetelmät soveltuvat usein hyvin kliinisiin labora-; toriotesteihin. Fosfatidyylialkoholin kohdalla ongelmana on kuitenkin ollut se, ; ; että pieniä molekyylejä vastaan on vaikea tuottaa vasta-ainetta. Perinteisesti *:·: 25 pieniä peptidejä tai steroidihormoneja kiinnitetään suurempiin kantajaproteii- : : neihin. Perinteiset kantajat sopivat kuitenkin huonosti lipidiantigeeneille. Nyt kuitenkin on yllättäen pystytty valmistamaan vasta-ainetta fosfatidyylialkoholia vastaan, mikä mahdollistaa huomattavasti yksinkertaisemman määritysmene-. . telmän alkoholin suurkulutuksen osoittamiseksi. Näin on keksitty osoittaa al- 30 koholin suurkulutus määrittämällä immunologisesti alkoholin käytön seurauksena elimistössä syntyvä fosfatidyylialkoholi.
: : Keksinnön mukaisen menetelmän etuja tunnettuun tekniikkaan : : nähden ovat luotettavuus, vähäinen työmäärä ja nopeus sekä se, ettei kalliita kromatografisia ja/tai spektrometrisiä laitteistoja tarvita. Menetelmä soveltuu 35 käytettäväksi rutiininomaisesti myös pienissä terveydenhuollon • : (päihdehuollon) yksiköissä, jolloin potilaan tilaa voidaan seurata joustavasti.
3 112825
Keksinnön mukaista vasta-ainetta voidaan myös käyttää muussa tutkimuksessa kuin alkoholisairauksien tutkimuksessa.
Yhteenveto keksinnöstä
Esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän alkoholinkulutuksen 5 osoittamiseksi henkilön kehonäytteestä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että näytteestä määritetään lipoproteiiniin liittynyt fosfati-dyylialkoholi sitä tunnistavan vasta-aineen avulla, jolloin fosfatidyylialkoholin läsnäolo näytteessä indikoi henkilön alkoholin kulutusta. Esillä oleva keksintö tarjoaa myös menetelmässä käyttökelpoisen vasta-aineen, jolle on tunnus-10 omaista, että se tunnistaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin. Keksintö tarjoaa myös testipakkauksen, jolle on tunnusomaista, että se sisältää keksinnön mukaisen vasta-aineen. Lisäksi kuvataan hybridooma, joka tuottaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin tunnistavaa vasta-ainetta.
Keksinnön piiriin kuuluu edelleen menetelmä fosfatidyylialkoholin 15 tunnistavan vasta-aineen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että immunisoidaan eläin lipoproteiiniin liittyneellä fosfatidyylialkoholilla; ja a) otetaan talteen eläimen tuottama vasta-aine, joka tunnistaa fosfatidyylialkoholin; tai b) fuusioidaan immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottavia soluja kuolemattoman solulinjan kanssa hybridooman tuottamiseksi; valitaan haluttua vasta-20 ainetta tuottava hybridooma; ja otetaan talteen sen tuottama vasta-aine. Keksinnön kohde on edelleen keksinnön mukaisen vasta-aineen käyttö immuno-määrityksessä. Myös edellä mainitulla menetelmällä valmistettu vasta-aine ku-* vataan.
Kuvien lyhyt kuvaus :“i 25 Kuva 1 kuvaa fosfatidyylietanolin (PEth) muodostumista fosfatidyy- ! -: likoliinista fosfolipaasi D:n katalysoimassa reaktiossa.
Kuva 2 kuvaa anti-PEth-vasta-aineen sitoutumista lipoproteiinipar- tikkeliin, johon PEth on liittynyt.
Kuva 3 kuvaa PEth:n määrittämisen ELISA-menetelmällä käyttäen 30 anti-PEth-vasta-ainetta ja toista vasta-ainetta, joka tunnistaa lipoproteiinin epi-toopin, joka on muu kuin PEth.
,,,: Kuva 4 kuvaa anti-PEth-vasta-aineen fosfolipidispesifisyyttä.
; ’ Kuva 5 esittää HDL-partikkelien PEth-pitoisuudet alkoholin suurku- luttajien (mustat neliöt) ja verrokkihenkilöiden (valkoiset neliöt) plasmassa . 35 osoitettuna käyttäen anti-PEth-vasta-ainetta radioimmunologisessa määrityk- ‘ ‘ sessä.
4 112825
Kuva 6 esittää HDL-partikkelien PEth-pitoisuudet alkoholin suurkuluttajien (mustat neliöt) ja verrokkihenkilöiden (valkoiset neliöt) plasmassa osoitettuna käyttäen anti-PEth-vasta-ainetta ELISA-määritysmenetelmässä.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5 Esillä oleva keksintö perustuu siihen, että nyt on onnistuttu tuotta maan vasta-aine fosfatidyylialkoholia vastaan. Tämä oli mahdollista liittämällä fosfatidyylialkoholi lipoproteiiniin ja käyttämällä tätä lipoproteiiniin liitettyä fosfatidyylialkoholia antigeeninä immunisaatiossa. Näin saadaan aikaan vasta-aine fosfolipidimolekyylin polaariselle osalle, tässä tapauksessa fosfatidyylial-10 koholille. "Fosfatidyylialkoholi” on fosfatidihapon esteri, jonka rasvahapot tässä tapauksessa yleensä ovat samat kuin luonnossa esiintyvän fosfatidyylikoliinin rasvahapot. "Lipoproteiinilla” tarkoitetaan yhdistettä, joka sisältää sekä proteiinia että lipidejä. Näitä esiintyy sekä solukalvoissa että elimistössä kiertävinä lipoproteiinipartikkeleina. Lipoproteiinipartikkelit sopivat hyvin fosfatidyylialko-15 holin kantajiksi. Fosfolipidien ja proteiinien lisäksi lipoproteiinipartikkelit sisältävät myös muita aineosia, kuten esimerkiksi triglyseridejä ja kolesterolia. Lipoproteiinipartikkelit luokitellaan mm. tiheytensä perusteella. Immunogeenin valmistuksessa voidaan käyttää esimerkiksi seuraavia lipoproteiinipartikkeleita: VLDL (very low density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein), HDL (high 20 density lipoprotein), VHDL (very high density lipoprotein), IDL (intermediate density lipoprotein) tai Lp(a) -lipoproteiinia. Hyviä tuloksia on saatu käyttämällä LDL:ää, HDL:ää ja VLDL:ää.
Fosfatidyylialkoholi, joka edullisesti on fosfatidyylietanoli, liuotetaan pieneen määrään liuotinta ja viedään vesipitoisessa liuoksessa olevaan li-25 poproteiiniin, jolloin liuotinpitoisuuden laimentuessa fosfatidyylialkoholi ha-; keutuu lipoproteiinin pinnalla olevien lipidien joukkoon. Immunisoitavan eläi men elimistö tunnistaa lipoproteiinin pinnalle tulleen pienimolekyylisen lipidin polaarisen tähteen (etanolin tapauksessa etyyliryhmän) vieraana aineena ja tuloksena saadaan vasta-aine. Kuvassa 2 esitetään LDL-lipoproteiinin pinnalla 30 olevan fosfatidyylietanolin vasta-aineen sitoutuminen. Immunogeenin antigee-nisyyttä on mahdollista lisätä käyttämällä oksidoituja (hapettuneita / hapetettuja) partikkeleita. Voidaan esimerkiksi liittää fosfatidyylietanoli tiukemmin lipoproteiiniin hapettamalla fosfatidyylin toinen rasvahappo ja syntyneen alde-hydin avulla muodostaa kovalenttinen sidos lipoproteiinin proteiiniosan ja fos-35 fatidyylialkoholin välille. Lisäksi voi olla mahdollista lisätä immunogeenisyyttä (ja jopa alkoholistin lipoproteiinin kaltaisuutta) modifioimalla lipoproteiinipartik- 5 112825 keliä myös muuten, kuten etyloimalla esim. asetaldehydi-käsittelyllä lipoprote-iinia ennen PEth-lisäystä (tai sen jälkeen). Mahdollista on myös desialyloida eli poistaa siaalihappoa lipoproteiineista, jolloin ne muistuttavat enemmän alkoholistin lipoproteiineja.
5 Edellä kuvattua lipoproteiiniin liitettyä fosfatidyylialkoholia voidaan käyttää antigeeninä sinänsä tunnetulla tavalla valmistettaessa keksinnön mukaista fosfatidyylialkoholia tunnistavaa vasta-ainetta. ’’Fosfatidyylialkoholia tunnistava vasta-aine” tarkoittaa vasta-ainetta, joka pystyy valikoivasti sitoutumaan fosfatidyylialkoholiin mukaanlukien kyseisen vasta-aineen sellaiset 10 fragmentit, jotka myös pystyvät valikoivasti sitoutumaan fosfatidyylialkoholiin. Tällaisia fragmentteja ovat esim. F(ab’)2 ja F(ab).
Immunologisesti reaktiivinen eläin immunisoidaan lipoproteiiniin liitetyllä fosfatidyylialkoholilla ja testataan antigeeniä kohtaan aiheutunut immuunivaste. Polyklonaalinen vasta-aine voidaan ottaa talteen positiivisen 15 vasteen antigeeniä kohtaan antavista eläimistä ja puhdistaa alan ammattimiesten yleisesti tuntemilla menetelmillä. Toisessa keksinnön suoritusmuodossa valmistetaan monoklonaalista vasta-ainetta. Immunisaatioiden jälkeen positiivisen vasteen antigeeniä kohtaan antavien eläinten vasta-ainetta tuottavat solut, yleensä pernasolut, fuusioidaan kuolemattoman solulinjan kanssa 20 vasta-ainetta tuottavan hybridooman saamiseksi. Vasta-aine eristetään positiivisten hybridoomien kasvatusalustasta ja puhdistetaan alan ammattimiesten yleisesti tuntemilla menetelmillä.
: Valmistetusta vasta-aineesta voidaan haluttaessa eristää fosfati- dyylialkoholin tunnistava fragmentti. Vaihtoehtoisesti tällainen fragmentti voi-25 daan tuottaa geeniteknisin menetelmin. Vasta-ainetta, mukaanlukien frag-.mentteja, voidaan edelleen muokata esimerkiksi liittämällä siihen havaitsemista helpottava merkkiaine, kuten radioaktiivinen isotooppi, metallipartikkeli tai fluoresoiva- tai entsyymimerkkiaine (esimerkiksi 3H, kolloidinen kulta, roda-miini, fluoreskeiini, peroksidaasi, alkaalinen fosfataasi) sinänsä tunnetuilla tek-30 nilkoilla.
Keksinnön mukainen vasta-aine mahdollistaa nyt fosfatidyylialkoho-Iin, ja erityisesti lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin osoittamisen immunologisesti. Immunologisesti osoitettava fosfatidyylialkoholi on edullisesti fosfatidyylietanoli ja erityisesti lipoproteiiniin liittynyt fosfatidyylietanoli. Immu-35 nologinen fosfatidyylialkoholin määritysmenetelmä on tarkoitettu erityisesti alkoholin suurkulutuksen luotettavaan osoittamiseen ja seurantaan. Alkoholin .112825 6 suurkulutukseksi voidaan katsoa kulutus, joka ylittää miehillä 24 ja naisilla 16 annosta viikossa tai vastaavasti kertakulutuksena miehillä yli 7 ja naisilla yli 5 annosta. Yksi annos alkoholia vastaa noin 12 grammaa puhdasta etanolia. Menetelmää voidaan myös käyttää apuna alkoholisairauksien toteamisessa 5 sekä tutkimuksessa. Alkoholin läsnäollessa elimistössä alkoholimolekyyli in-korporoituu fosfolipideihin fosfolipaasi D:n katalysoimassa reaktiossa, jossa normaalisti inkorporoituu vesi. Fosfatidyylialkoholin määrä elimistössä korreloi alkoholin kulutukseen ja fosfatidyylialkoholi säilyy kehossa ainakin 2 - 4 vrk kulutuksen jälkeen, ehkä pitempäänkin.
10 Fosfatidyylialkoholin tunnistavaa vasta-ainetta voidaan käyttää mis sä tahansa immunologisessa määritysmenetelmässä, joka perustuu antigeenin ja vasta-aineen välisen kompleksin osoittamiseen. Tämä kompleksi voidaan osoittaa joko suoraan tai epäsuorasti käyttäen sekundaarisia vasta-aineita. Usein immunomäärityksessä käytetään kiinteää kantajaa, jolloin joko 15 vasta-aine tai antigeeni sidotaan kantajaan. Kantajaan sidottu vasta-aine voi myös olla ns. sieppaava vasta-aine, jota käytetään välikonjugaattina primaari-vasta-aineen sitomiseksi kantajaan.
Eräässä suoritusmuodossa käytetään radioimmunologista määritysmenetelmää (RIA), joka voidaan suorittaa niin, että fosfatidyylialkoholin 20 vastainen vasta-aine kiinnitetään suoraan tai välikonjugaatin avulla kantajaan. Potilasnäytteen lipoproteiinit leimataan radioisotoopilla sinänsä tunnetulla ta-• · valla ja näytteiden annetaan reagoida kantajaan kiinnitetyn vasta-aineen 1: ! kanssa. Fosfatidyylialkoholia sisältävien lipoproteiinien sitoutuminen kantajaan j osoitetaan mittaamalla radioaktiivisuus.
25 Erittäin sovelias immunomääritysmenetelmä alkoholikulutuksen ,,,,: osoittamiseen on ELISA-määritys (enzyme linked immuno sorbent assay), jos sa siis käytetään entsyymillä leimattua vasta-ainetta. Entsyymileima voidaan liittää joko suoraan keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen tai vaihtoehtoisesti sekundaariseen vasta-aineeseen. Eräs ELISA:an sopiva suoritusmuoto voi-30 daan toteuttaa kiinnittämällä keksinnön mukainen vasta-aine suoraan tai välikonjugaatin avulla kiinteään kantajaan, antamalla sen reagoida näytteen ; 1 ; kanssa ja osoittamalla sitoutunut liproproteiiniin liittynyt fosfatidyylialkoholi toi- ,: sella vasta-aineella, joka tunnistaa mainitun lipoproteiinin epitoopin, joka on muu kuin fosfatidyylialkoholi. Mainittuun toiseen vasta-aineeseen voi olla kiin-: " 35 nitetty entsyymileima tai mainittu toinen vasta-aine voidaan osoittaa leimaa si- 7 112825 sältävällä sekundaarisella vasta-aineella. Leima osoitetaan yleensä lisäämällä entsyymin substraattia ja osoittamalla muodostuneen tuotteen väri.
Kuvassa 3 on esitetty fosfatidyylietanolin pitoisuuden määrittäminen näytteestä ELISA-menetelmällä, jossa fosfatidyylietanolia vastaan kehitetyn 5 vasta-aineen lisäksi käytetään toista vasta-ainetta, joka tunnistaa fosfatidyylietanolia sisältävän lipoproteiinin proteiiniosan. A) kuvastaa anti-PEth-vasta-aineen kiinnittämisen kuoppalevyn kuoppien pohjaan. B) kuvastaa näytteen lisäämisen kuoppalevylle. Normaali HDL on avoin ympyrä ja PEth:a sisältävä HDL on harmaa ympyrä. C) kuvastaa PEth:a sisältävien HDL-hiukkasten mää-10 rän kvantitoimisen apoproteiini A-l vastaan kohdistetulla leimatulla vasta-aineella.
Määrityksessä käytettävä toinen vasta-aine on yleensä suunnattu fosfatidyylialkoholia sisältävän lipoproteiinin proteiiniosaa vastaan. Näitä ns. apolipoproteiineja on mm. apoAI, apoAII, apoBIOO, apoB-48, apoCI, apoCII, 15 apoCIII, apoD, apoE ja apoJ. LDL-partikkeli sisältää vain yhtä proteiinia apoB-100, jota on myös VLDL-partikkeleissa. HDL-partikkelit eivät sisällä apoB-100:a, vaan pääasiassa apoALtä ja apoAILta.
Keksinnön mukainen testipakkaus voi keksinnön mukaisen vasta-aineen lisäksi myös sisältää muita fosfatidyylialkoholin immunomääritykseen 20 tarvittavia reagensseja ja välineitä, kuten esimerkiksi muita määrityksessä käytettäviä, mahdollisesti leimattuja vasta-aineita ja reagensseja leiman havaitsemiseksi sekä tarvittavia puskureita ja/tai kantajia, kuten mikrotiitterilevyjä, i i joihin mahdollisesti on valmiiksi kiinnitetty reagenssit, kuten vasta-aine.
Immunologisella määritysmenetelmällä tutkittava kehonäyte voi olla : 25 esimerkiksi veri, plasma, seerumi, sylki, kudos tai lapsivesi tai jokin muu fosfa tidyylialkoholia sisältävä osa tai neste. Näyte voi olla myös oikeuslääketieteellinen näyte, post mortem -näyte tai sikiön kudoksista otettu näyte. ELISA- ja RIA-määrityksiin soveltuvat parhaiten nestenäytteet, kuten plasma, seerumi ja veri, joita voidaan käyttää määrityksessä sellaisenaan, ilman lipidifraktion 30 uuttoa tai liuotusta.
Fosfatidyylietanolin sijasta lipoproteiiniin voidaan liittää jonkin muun alkoholin fosfatidyyli, tämän alkoholin fosfatidyylin vastaisen vasta-aineen saamiseksi. Kyseeseen tulevat suoraketjuiset alkoholit, joissa on enintään kahdeksan, mieluummin 1 - 4 hiiliatomia, eli sellaiset alkoholit, jotka fosfoli-35 paasi D:n katalysoimassa reaktiossa muuttuvat fosfatidyylialkoholeiksi. Erilaisia fosfatidyylialkoholeja tunnistavia vasta-aineita voidaan siten käyttää myös 8 112825 potilaan nauttiman alkoholin laadun määrityksessä osoittamaan ei-nautittavaksi tarkoitettujen alkoholien, kuten etyleeniglykolin, isopropanolin, metanolin ja mahdollisesti myös propanolin, butanolin ja pentanolin käyttö, jolloin hoito voidaan sovittaa ongelman mukaisesti.
5 Keksinnön muihin suoritusmuotoihin lukeutuvat edelleen sellaiset immunologiset menetelmät, kuten vasta-ainepylväät, Western-blot ja immuno-histologiset menetelmät. Luonnollisesti fosfatidyylialkoholeja vastaan tuotettuja vasta-aineita voidaan käyttää myös biokemiallisessa perustutkimuksessa, kuten lipidimetabolian tutkimukseen. Epäsuorasti niitä voidaan myös käyttää 10 fosfolipaasi D:n aktiivisuuden ja sijainnin osoittamiseen esimerkiksi solu- tai kudosviljelmistä tai histologisista näytteistä
Keksintöä valaistaan seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä.
Esimerkki 1
Immunogeenin valmistus 15 Terveiden ihmisten plasmasta eristettiin lipoproteiinit. Verinäytteet otettiin yön paaston jälkeen ja plasma erotettiin sentrifugoimalla. Lipoproteiinit eristettiin plasmasta perättäisellä ultrasentrifugaatiolla tiheytensä perusteella. VLDL-fraktio eristettiin tiheydestä 1,006 g/ml, LDL-fraktio tiheydestä 1,019 -
1,063 g/ml ja HDL tiheydestä 1,063 - 1,21 g/ml. Sentrifugoinnin jälkeen li-20 poproteiinifraktiot dialysoitiin 0,15 M NaCI, 0,01 % EDTA, pH 7,4 tai PBS, pH
7,4 vastaan, +4 °C:ssa.
Lipoproteiinipartikkeleiden fosfolipidipitoisuus mitattiin ja tarvittava : fosfatidyylietanolimäärä laskettiin siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 5 % : fosfolipidien kokonaismäärästä. Fosfatidyylietanoli, joka oli 1,2-dioleoyyli-sn- • · j 25 glysero-3-fosfoetanolin natriumsuola (Avanti Polar Lipids, USA), liitettiin ihmi-sen eristettyihin HDL- tai LDL-partikkeleihin (5 % lipoproteiinien fosfolipideistä) seuraavan menetelmän mukaisesti: Mainittu fosfatidyylietanoli, joka oli liuotettu kloroformiin (10 mg/ml) kuivattiin ensin typpivirralla ja edelleen vakuumissa . , huoneen lämmössä yli yön. Kuiva lipidikalvo liuotettiin sitten pieneen tilavuu- 30 teen etanolia ja lisättiin (50 - 100 μΙ) tipoittain noin 1 ml:aan vesi-suolaliuosta (0,15 M NaCI, 0,01 % EDTA, pH 7,4), joka sisälsi HDL- tai LDL-partikkelit. Liu-*: oksia inkuboitiin yli yön kylmässä (+ 4°C) ja säädettiin sitten niiden tiheydet : 1,21 g/ml:ksi (HDL) tai 1,063 g/ml:ksi (LDL) NaBr-liuoksella ja sentrifugoitiin 114 000 g, 18 tuntia, +15 °C:ssa. Sentrifugoidut lipoproteiinifraktiot dialysoitiin 35 0,5 M NaCI, 0,01 % EDTA, pH 7,4 vastaan. Saatuja fosfatidyylietanolia sisäl- : täviä lipoproteiinipartikkeleita käytettiin immunogeeneinä.
9 112825
Esimerkki 2
Vasta-aineen valmistus
Monoklonaalinen anti-PEth -vasta-aine valmistettiin standardiproto-kollan mukaisesti (Oi & Herzenberger 1980). Kuusiviikkoiset naaraspuoliset 5 Balb/c hiiret immunisoitiin kolmen viikon välein LDL-partikkeleihin liittyneellä fosfatidyylietanoliantigeenillä, joka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti. Toisen immunisaation jälkeen positiiviset seeruminäytteet identifioitiin suoralla ELISA-määrityksellä, jossa antigeeni eli PEth-lipoproteiini sidottiin kaivoihin, lisättiin testattava seerumi, pestiin ja määritettiin sitoutunut vasta-aine anti-10 hiiren immunoglobuliinivasta-aineella, joka oli leimattu piparjuuriperoksidaasil-la. Positiivisen vasteen antigeeniä kohtaan antaneiden hiirten pernat eristettiin ja pernasolut fuusioitiin polyetyleeniglykolia (PEG 4000, Gibco, UK) käyttäen hiiren myeloomasolulinjan P3-X63-Ag8.653 kanssa (ATCC CRL-1580, American Type Culture Collection, USA). Hybridoomasoluja valittiin kuoppalevyllä 15 HAT-kasvatusalustalla [DMEM, korkea glukoosi (Gibco, UK), 10 % NCTC-135 (Gibco), 20 % FBS (Bioclear, UK), 5 % HFCS (Roche Molecular Biochemicals GmbH, Saksa), HAT-supplementti (Gibco) ja penisilliini/streptomysiini-liuos (Gibco)]. Hybridoomasoluja seulottiin käyttäen suoraa ELISA:a antigeeniä vastaan kuten edellä on kuvattu. Positiiviset kaivot kloonattiin käyttäen rajoit-20 tavaa laimennusmenetelmää ja ne kaivot, joissa oli vain yksi pesäke seulottiin jälleen suoralla ELISA:lla. Positiivisten hybridoomien kasvatusalustat kerättiin ja monoklonaalinen vasta-aine puhdistettiin proteiini-G-Sepharose-; affiniteettikromatografialla (Pharmacia, Ruotsi). Seuraavissa kokeissa käytetyn : hybridooman vasta-aineen luokaksi määritettiin lgG2b käyttäen vasta-aineiden 25 sieppausta anti-lg-vasta-ainekaivoihin (Biotop, Suomi).
Esimerkki 3
Anti-PEth-vasta-aineen fosfolipidispesifisyyden määrittäminen
Suoritettiin radioimmunomääritys. Kanin anti-hiiri-IgG-vasta-aineella päällystetyt kuopat (Wallac, Delfia kuopat, Suomi) pestiin kahdesti PBS-·’ 30 liuoksella (pH 7,4), blokattiin 1 % BSA-PBS-liuoksella, 300 μΙ/kuoppa, 30 min, ; + 20 °C kosteakammiossa sekoittaen ja pestiin uudelleen kahdesti PBS- liuoksella. Kaivoihin lisättiin 50 μΙ/kuoppa esimerkissä 2 valmistettua monoklo-.naalista hiiren anti-PEth-vasta-ainetta, joka oli laimennettu 1:50 1 % BSA-PBS-liuokseen, jolloin vasta-ainetta oli 1,4 μg/ml, ja inkuboitiin 6 tuntia 35 +4°C:ssa kosteakammiossa sekoittaen; pestiin kahdesti PBS-liuoksella. Kai-• voihin lisättiin antigeeniliuoksina 50 μΙ PBS-liuokseen laimennetut 5 - 10 112825 prosenttiset fosfolipidi-HDL-liuokset, joiden HDL oli leimattu 3H-kolesterolilla (0,5 mg/ml proteiinia, 0,08 mg/ml lisättyä fosfolipidiä). Seuraavia fosfolipidiliu-oksia testattiin: 5 PEth-HDL: 5% fosfatidyylietanoli lisättynä 3H-HDL-liuokseen PC-HDL: 5% fosfatidyylikoliini lisättynä 3H-HDL-liuokseen SM-HDL: 5% sfingomyeliini lisättynä 3H-HDL-liuokseen PE-HDL: 5% fosfatidyylietanoliamiini lisättynä 3H-HDL- liuokseen 10 PA-HDL: 5% fosfatidihappo lisättynä 3H-HDL-liuokseen PS-HDL: 5% fosfatidyyliseriini lisättynä 3H-HDL-liuokseen PI-HDL: 5 % fosfatidyyli-inositoli lisätty 3H-HDL-liuokseen LPC-HDL: 5% lysofosfatidyylikoliini lisättynä 3H-HDL-liuokseen 15 Inkuboitiin kylmähuoneessa kosteakammiossa sekoittaen yli yön.
Kaivot pestiin neljästi PBS-liuoksella ja taputeltiin kuivaksi. Tämän jälkeen kaivot leikattiin erilleen toisistaan giljotiinilla ja pudotettiin 2 mliaan tui-kenestettä (OptiPhase Highsafe 3, Wallac). Vorteksoinnin jälkeen mitattiin radioaktiivisuus beta-laskijalla (Wallac) 3H-ohjelmalla käyttäen 5 minuutin mitta- 20 usaikaa. Tulokset esitetään sitoutuneen radioaktiivisuuden määränä (% dpm) kuvassa 4. Tulokset osoittavat, että käytetty anti-PEth-vasta-aine tunnistaa spesifisesti lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylietanolin.
11 112825
Esimerkki 4
Radioimmuunimääritys (RIA) fosfatidyylietanolin määrittämiseksi
Koehenkilöinä oli ryhmä katkaisuhoitoon hakeutuneita alkoholin 5 suurkuluttajia, joiden alkoholin keskikulutus oli 96 annosta alkoholia viikossa (välillä 55 - 137 annosta) sekä ryhmä verrokkihenkilöitä, joiden alkoholin keskikulutus oli 9 annosta alkoholia viikossa (välillä 4-15 annosta). Koehenkilöillä ei ollut (muita) havaittavia terveydellisiä ongelmia. Koehenkilöistä otettiin las-kimoverinäytteet yli yön paaston jälkeen ja erotettiin plasmat sentrifugoimalla. 10 Plasmasta erotettiin lipoproteiinifraktiot esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eristetyt HDL-fraktiot leimattiin 3H-kolesteroliesterillä (Tollefson & Albers, 1986).
Määrityksessä käytettiin kuoppalevyjä, joissa on irrotettavat kuopat 8 kuopan liuskoina (NUNC Lock Well MaxiSorp). Mikrotiitterilevyjen kaivot päällystettiin vuohen anti-hiiri-lgG (H+L)-vasta-aineella (Zymed Laboratories, 15 USA) 20 pg/ml (laimennettu PBS-liuokseen), 50 μΙ/kaivo ja inkuboitiin 24 h, +4 °C:ssa. Pestiin kahdesti PBS-liuoksella, minkä jälkeen lisättiin esimerkissä 2 valmistettua hiiren monoklonaalista anti-PEth-vasta-ainetta (100 μΙ/kaivo 1:50 laimennosta PBS-liuokseen 43 ng/μΙ kantaliuoksesta) ja annettiin vasta-aineen sitoutua tunnin ajan huoneen lämmössä. Kaivot pestiin kahdesti PBS-20 liuoksella ja blokattiin kahden tunnin ajan huoneen lämmössä 1% BSA-PBS-liuoksella tilavuudella 300 μΙ/kaivo, minkä jälkeen blokkaus poistettiin.
Alkoholin suurkuluttajien sekä verrokkihenkilöiden plasmasta eristettyjä 3H-kolesteroliesterillä leimattuja HDL-fraktioita sekä standardinäytteitä kutakin 50 μΙ/kaivo inkuboitiin kylmähuoneessa yli yön. Näytteet oli laimen-25 nettu näytepuskuriin (1xPBS, 1% BSA, 0,5% TritonX-100, 1 mM EDTA) pitoisuuteen 0,5 mg/ml proteiinia. Standardinäytteinä käytettiin 0%, 1% ja 10% PEth-HDL, joka oli tehty eri kontrollihenkilöiden HDL-fraktioista yhdistettyyn liuokseen. Tämän jälkeen kaivot pestiin neljä kertaa PBS-liuoksella, jossa oli 0,5% TritonX-100:a ja vielä kahdesti PBS:llä.
30 Kaivot taputeltiin kuivaksi ja pudotettiin tuikepulloihin, joissa oli kus sakin 2 ml tuikenestettä (OptiPhase Highsafe3, PerkinElmer Wallac Finland), vorteksoitiin 30 sekuntia ja mitattiin radioaktiivisuus Wallacin Rack-beta-; tuikelaskijalla (3H-laskennalla). Standardeja apuna käyttäen laskettiin näyttei den sisältämä PEth-pitoisuus. Tulokset on esitetty kuvassa 5. Kokeet osoitti-35 vat, että fosfatidyylietanolipitoisuus alkoholin suurkuluttajien HDL- .112825 12 partikkeleissa (2,75 ± 0,53 μηηοΙ/Ι) oli merkittävästi korkeampi kuin verrokki-ryhmässä (1,70 ± 0,43 μηιοΙ/Ι) (p < 0,01, Student’s t-test).
Esimerkki 5 ELISA-menetelmä fosfatidyylietanolin määrittämiseksi 5 Koehenkilöinä oli ryhmä katkaisuhoitoon hakeutuneita alkoholin suurkuluttajia, joiden alkoholin keskikulutus oli 81 annosta alkoholia viikossa (välillä 44-117 annosta) sekä ryhmä verrokkihenkilöitä, joiden alkoholin keskikulutus oli 13 annosta alkoholia viikossa (välillä 1-25 annosta). Koehenkilöillä ei ollut (muita) havaittavia terveydellisiä ongelmia. Koehenkilöistä otettiin 10 laskimoverinäytteet yli yön kestäneen paaston jälkeen ja erotettiin plasmat sentrifugoimalla.
Mikrotiitterilevyn (Delfia, Wallac, Suomi) kaivot päällystettiin kanin anti-hiiri-lgG(H+L)-vasta-aineella. Sitten kaivot pestiin kahdesti PBS-liuoksella. Kuhunkin kaivoon lisättiin esimerkissä 2 valmistettua hiiren monoklonaalista 15 anti-PEth-vasta-ainetta (100 μΙ/kaivo 1:50 laimennosta PBS-liuokseen 43 ng/μΙ kantaliuoksesta) ja annettiin reagoida tunnin ajan huoneen lämmössä. Kaivot pestiin kahdesti PBS-liuoksella ja blokattiin 1% BSA-PBS-liuoksella n. 350 μΙ/kuoppa puolen tunnin ajan huoneen lämmössä ja pestiin jälleen kahdesti PBS-liuoksella.
20 Sitten lisättiin 100 μΙ/kaivo 1:10 PBS-liuokseen laimennettua paas- toveriplasmaa, kaksi rinnakkaista kustakin näytteestä. Annettiin reagoida +4°C:ssa yön yli. Kaivot pestiin kahdesti PBS-liuoksella ja lisättiin 1:500 1% : BSA-PBS-liuokseen laimennettua lampaan anti-ihmisen-ApoAI-vasta-ainetta (Roche Diagnostic, Saksa) 100 μΙ kaivoa kohti ja annettiin reagoida huoneen : 25 lämmössä tunnin ajan. Sitten kaivot pestiin kolmesti PBS-liuoksella. Lisättiin kuhunkin kaivoon 100 μΙ 1:1000 1 % BSA-PBS-liuokseen laimennettua, perok-sidaasileimattua aasin anti-lammas-lgG(Fab)-POD-vasta-ainetta (Roche Diagnostic, Saksa) ja annettiin reagoida tunnin ajan huoneen lämmössä. PBS-pesujen jälkeen peroksidaasireaktio suoritettiin käyttäen substraattina 1,2-30 diaminobentseeniä (OPD) (Sigma). OPD tabletti liuotettiin juuri ennen käyttöä 20 ml:aan puskuria ja lisättiin 100 μΙ/kuoppa ja inkuboitiin 5-15 min huoneen lämpötilassa pimeässä. Reaktio pysäytettiin 3 M rikkihapolla 50 μΙ/kuoppa. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm.
Tulokset on esitetty kuvassa 6. Tulokset osoittavat, että fosfatidyy-35 lietanolipitoisuus alkoholin suurkuluttajien plasman HDL-partikkeleissa oli mer-’ kittävästi korkeampi kuin verrokkiryhmässä (p < 0,0001).
13 112825
Esimerkissä 2 valmistetun hiiren anti-ihmisen-PEth-lgG2b-vasta-aineen sitomat fosfatidyylietanolia sisältävät VLDL- ja LDL-partikkelit osoitettiin vastaavasti plasmasta käyttäen toisena vasta-aineena anti-ihmisen-apoB100-vasta-ainetta (Roche Diagnostic). Saadut tulokset olivat samansuuntaiset kuin 5 anti-ihmisen-ApoAI-vasta-aineella saaduissa kokeissa.
♦ : * » 14 112825
KIRJALLISUUSLUETTELO
Gunnarsson.T., Karlsson, A., Hansson, P., Johnson, G., Ailing, C., & Odham, G. (1998) Determination of phosphatidylethanol in blood from alcoholic males 5 using high-performance liquid chromatography and evaporative light scattering or electrospray mass spectrometric detection, J.Chromatogr.B Bio-med.Sci.Appl. 705:243-249.
Oi, V. T. & Herzenberger, L. A. (1980) Immunoglobulin-producing hybrid cell 10 lines. In Selected Methods in Cellular Immunology, B.B.Mishell and Shi-igi.S.M., editors. Freeman, San Francisco. 351-372.
Stibler H. (1991) Carbohydrate-deficient transferrin in serum: A new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed, Clin. Chem. 12: 2029 -15 2037
Tollefson, J. H. & Albers, J. J. (1986) Isolation, characterization, and assay of plasma lipid transfer proteins, Methods Enzymol. 129:797-816.
20 Varga, A., Hansson, P., Lundqvist, C., & Ailing, C. (1998) Phosphatidylethanol in blood as a marker of ethanol consumption in healthy volunteers: comparison with other markers, Alcohol Clin.Exp.Res. 22:1832-1837.
Claims (15)
15 1 12825
1. Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi henkilön keho-näytteestä, tunnettu siitä, että näytteestä määritetään lipoproteiiniin liitty- 5 nyt fosfatidyylialkoholi sitä tunnistavan vasta-aineen avulla, jolloin fosfatidyyli-alkoholin läsnäolo näytteessä indikoi henkilön alkoholin kulutusta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun vasta-aineen lisäksi käytetään toista vasta-ainetta, joka tunnistaa mainitun lipoproteiinin epitoopin, joka on muu kuin fosfatidyylialkoholi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että toinen vasta-aine tunnistaa lipoproteiinipartikkelin HDL:n, LDL:n tai VLDL:n epitoopin.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen vasta-aine tunnistaa lipoproteiinipartikkelin proteiinin apoAI tai 15 apoBIOO.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä on ELISA-määritysmenetelmä.
6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään monoklonaalista vasta-ainetta.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että lipoproteiiniin liittynyt fosfatidyylialkoholi määritetään verestä, plasmasta tai seerumista.
8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, ‘: tunnettu siitä, että määritetään fosfatidyylietanoli. • 25 9. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se tunnistaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylialkoholin, ja että se on saatavissa immunisoimalla eläin lipoproteiiniin liittyneellä fosfatidyylialkoholilla ja a) ottamalla talteen eläimen tuottama vasta-aine, joka tunnistaa fosfatidyylialkoholin; tai 30 b) fuusioimalla immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottavia solu- • ‘ ja kuolemattoman solulinjan kanssa hybridooman tuottamiseksi; ja valitsemalla : ’ : haluttua vasta-ainetta tuottava hybridooma; ja ottamalla talteen sen tuottama ;· vasta-aine.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen vasta-aine, tunnettu sii- ' 35 tä, että se tunnistaa lipoproteiiniin liittyneen fosfatidyylietanolin. .112825
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on monoklonaalinen vasta-aine.
12. Testipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukaisen vasta-aineen.
13. Menetelmä fosfatidyylialkoholin tunnistavan vasta-aineen val mistamiseksi, tunnettu siitä, että immunisoidaan eläin lipoproteiiniin liittyneellä fosfatidyylialkoholil- la; ja a) otetaan talteen eläimen tuottama vasta-aine, joka tunnistaa fos-10 fatidyylialkoholin; tai b) fuusioidaan immunisoidun eläimen vasta-ainetta tuottavia soluja kuolemattoman solulinjan kanssa hybridooman tuottamiseksi; valitaan haluttua vasta-ainetta tuottava hybridooma; ja otetaan talteen sen tuottama vasta-aine.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunisoidaan fosfatidyylialkoholilla, joka on liitetty lipoproteiinipar-tikkeliin HDL, LDL tai VLDL.
15. Jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukaisen vasta-aineen käyttö immunomäärityksessä. 4 · « ' » „ 112825
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20011517A FI112825B (fi) | 2001-07-11 | 2001-07-11 | Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus |
| US10/483,663 US20040203070A1 (en) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | Method and means for detecting alcohol consumption |
| JP2003515859A JP4192092B2 (ja) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | アルコール消費量を検出するための方法および手段 |
| AT02748901T ATE408830T1 (de) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | Verfahren und antikörper zum nachweis von alkoholkonsum |
| PCT/FI2002/000626 WO2003010539A1 (en) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | Method and means for detecting alcohol consumption |
| ES02748901T ES2312597T3 (es) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | Procedimiento y anticuerpo para detectar el consumo de alcohol. |
| EP02748901A EP1412747B1 (en) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | Method and antibody for detecting alcohol consumption |
| DE60228973T DE60228973D1 (en) | 2001-07-11 | 2002-07-10 | Onsum |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20011517A FI112825B (fi) | 2001-07-11 | 2001-07-11 | Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus |
| FI20011517 | 2001-07-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20011517A0 FI20011517A0 (fi) | 2001-07-11 |
| FI20011517L FI20011517L (fi) | 2003-01-12 |
| FI112825B true FI112825B (fi) | 2004-01-15 |
Family
ID=8561635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20011517A FI112825B (fi) | 2001-07-11 | 2001-07-11 | Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040203070A1 (fi) |
| EP (1) | EP1412747B1 (fi) |
| JP (1) | JP4192092B2 (fi) |
| AT (1) | ATE408830T1 (fi) |
| DE (1) | DE60228973D1 (fi) |
| ES (1) | ES2312597T3 (fi) |
| FI (1) | FI112825B (fi) |
| WO (1) | WO2003010539A1 (fi) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2346525A4 (en) * | 2008-10-02 | 2012-05-09 | Celtaxsys Inc | METHODS OF MODULATION OF NEGATIVE CHIMOTAXIA OF IMMUNE CELLS |
| WO2013188879A1 (en) | 2012-06-16 | 2013-12-19 | Atherotech, Inc. | Measurement of serum lipoproteins |
| US9239280B2 (en) * | 2012-06-16 | 2016-01-19 | Atherotech, Inc. | Measurement of serum lipoproteins |
| CN111710098A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-09-25 | 深圳神盾卫民警用设备有限公司 | 一种戒毒药物的供应和回收装置 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4459362A (en) * | 1982-02-02 | 1984-07-10 | Hana Biologics, Inc. | Immunoassay of phospholipid, such as phosphatidyl choline, in fluids such as amniotic |
| US4388412A (en) * | 1982-02-02 | 1983-06-14 | Hana Biologics, Inc. | Immunoassay of phospholipid, such as phosphatidylcholine, in fluids such as amniotic |
| US5066583A (en) * | 1988-12-21 | 1991-11-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for distinguishing alcoholics from non-alcoholics |
| GB9207731D0 (en) * | 1992-04-07 | 1992-05-27 | Proteus Molecular Design | Improvements in or relating to vaccines |
| US5698721A (en) * | 1992-12-17 | 1997-12-16 | Megabios Corporation | Catonic amphiphiles |
| US5856196A (en) * | 1993-10-25 | 1999-01-05 | Beth Israel Hospital | Processes for quantitating phosphoglycerides in a lipid mixture and diagnostic uses therefor |
-
2001
- 2001-07-11 FI FI20011517A patent/FI112825B/fi not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-07-10 ES ES02748901T patent/ES2312597T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-10 EP EP02748901A patent/EP1412747B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-10 WO PCT/FI2002/000626 patent/WO2003010539A1/en active IP Right Grant
- 2002-07-10 DE DE60228973T patent/DE60228973D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-10 AT AT02748901T patent/ATE408830T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-07-10 JP JP2003515859A patent/JP4192092B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-10 US US10/483,663 patent/US20040203070A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1412747B1 (en) | 2008-09-17 |
| EP1412747A1 (en) | 2004-04-28 |
| FI20011517A0 (fi) | 2001-07-11 |
| WO2003010539A1 (en) | 2003-02-06 |
| JP4192092B2 (ja) | 2008-12-03 |
| FI20011517L (fi) | 2003-01-12 |
| JP2004536322A (ja) | 2004-12-02 |
| ES2312597T3 (es) | 2009-03-01 |
| ATE408830T1 (de) | 2008-10-15 |
| US20040203070A1 (en) | 2004-10-14 |
| DE60228973D1 (en) | 2008-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Niemelä et al. | Antibodies against acetaldehyde‐modified protein epitopes in human alcoholics | |
| JP5710699B2 (ja) | オートタキシン測定による慢性肝疾患の検査方法および検査薬 | |
| EP0166623A2 (en) | Antibody lectin sandwich assay | |
| JP3673522B2 (ja) | 抗アネキシンｖモノクローナル抗体並びにその利用及びそれを産生するハイブリドーマ細胞系 | |
| US7052855B2 (en) | Anti-APO-B-48 monoclonal antibody, hybridoma producing the same, and method for measuring APO-B-48 using the same | |
| US4778752A (en) | Receptors specific for hapten-modified self proteins | |
| US6492185B1 (en) | Immunoassay for detection of very low density lipoprotein and antibodies useful therefor | |
| JP2002539458A (ja) | 唾液中のａｐｏａおよびａｐｏｂ、ならびにそれらの比を検出するための方法およびデバイス | |
| EP3640644B1 (en) | Target marker gp73 for detecting steatohepatitis and detection application method | |
| FI112825B (fi) | Menetelmä alkoholinkulutuksen osoittamiseksi, menetelmässä käytettäviä välineitä sekä niiden valmistus | |
| WO1987003377A1 (en) | Monoclonal antibody against glutathione s-transferase and process for its preparation | |
| EP0554458B1 (en) | Immunoassay and monoclonal antibody for determining diarrheal shellfish poisons | |
| US6210906B1 (en) | Specific antibodies to kringle 5 of apo(a) and methods of use therefor | |
| JP5329994B2 (ja) | 試料中のエクオールの免疫測定法 | |
| CA2281262C (en) | Anti-human medullasin monoclonal antibody, process for producing the same and immunoassay using the same | |
| US6767709B1 (en) | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same | |
| JP2004069672A (ja) | 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
| JP2007314493A (ja) | モノクローナル抗体、その製造方法、及び用途 | |
| Latvala et al. | Assays for Acetaldehyde‐Derived Adducts in Blood Proteins Based on Antibodies Against Acetaldehyde/Lipoprotein Condensates | |
| Thompson | Immunoprecipitation and blotting: the visualization of small amounts of antigens using antibodies and lectins | |
| EP2006682A1 (en) | Diagnosis of acute enteritis by determination of intestinal fatty acid-binding protein in the blood | |
| JP4037586B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
| JP2007279066A (ja) | 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
| JP2001305141A (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
| Krahn et al. | 28 anti-hepatitis B core immunoglobulin Mdetermination in the serological evaluation of hepatitis B infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |