JP2001305141A - ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗ヒトメダラシン抗体を用いて血液中
の顆粒球等に存在し、その増減により多発性硬化症の発
現の把握に利用可能な血液中のヒトメダラシンの濃度を
より正確に測定することが可能な方法を提供する。 【解決手段】 抗ヒトメダラシン抗体を用いて血液中
のヒトメダラシンを測定する際に、溶血剤を含有する水
性液体で血液試料を処理して白血球を完全に破壊した
後、前記抗体を用いて血液中のヒトメダラシンの含有量
を再現性良く正確に測定する免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液中のヒトメダ
ラシンの免疫学的測定方法に関するものであり、さらに
詳しくは、血液中のヒトメダラシンの含有量を正確に測
定するための血液試料の前処理を含む免疫学的測定方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】セリンプロテアーゼの一種であるメダラ
シンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を
含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じてい
ると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性
疾患の増悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性
硬化症の患者では増悪する数日前に著増し、寛解に先行
して正常化することが認められている。多発性硬化症
は、中枢神経系の白質における限局性の脱髄巣とグリオ
ーシスの出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら
進行し、多くは、10年〜15年の経過で死亡すると云う慢
性炎症性の難病である。多発性硬化症の原因について
は、未だ、はっきりとは解明されていないが、ウィルス
や細菌が免疫系を刺激して抗体が自らの神経組織を攻撃
する自己免疫疾患の一種ではないかと考えられている。
また、その診断法はなかなか難しく、核磁気共鳴造影法
（ＭＲＩ）等によって行なわれているのが現状である
が、ＭＲＩ等の方法は非常に大がかりな装置を用い、測
定操作も熟練を要し、経費もかかるので、簡便な検査で
病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法
の開発が検討された結果、血液中の顆粒球メダラシン活
性の測定方法が研究され、簡便に測定できる免疫学的測
定方法の開発が行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血液中
のメダラシン含有量の免疫学的測定方法において、血液
試料を水性媒体で稀釈して測定する際に、顆粒球中に存
在するメダラシンを完全に顆粒球の外に放出させるよう
な処理を施すことなく測定を行うとその測定値の再現性
が必ずしも良くなく、測定値にばらつきを生じる現象が
認められた。従って、血液中のヒトメダラシンを免疫学
的に再現性良く測定する測定方法の開発が望まれていた
が、本発明は、上記事情に鑑みヒト血液試料に特定の前
処理を施すことを含むヒト血液試料中のヒトメダラシン
を再現性良く正確に測定できる免疫学的測定方法を提供
することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記目的を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒ
ト血液試料を、ヒト血液の浸透圧と異なる特定のより浸
透圧を有する水性液体で処理して白血球を完全に破壊し
た後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシン
を免疫学的に測定することにより、血液中のヒトメダラ
シンを再現性良く正確に測定できることを見い出し、こ
れらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものであ
る。

【０００５】即ち、本発明の第一は、ヒト血液試料を、
溶血剤を含有する水性液体で処理して白血球を完全に破
壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラ
シンを定量することを特徴とする血液試料中のヒトメダ
ラシンの免疫学的測定方法に関するものである。

【０００６】また、本発明の第二は、ヒト血液試料を、
溶血剤を含有する水性液体で処理して白血球を完全に破
壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン
抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗
体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラ
シンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を
定量することにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシン
を定量することを特徴とするヒト血液試料中のヒトメダ
ラシンの免疫学的測定方法に関するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に
おいて測定されるべきヒト血液試料中のヒトメダラシン
の大部分は、血液中に存在する白血球成分の一つである
顆粒球の内部に存在しているので、顆粒球を完全に破壊
してヒトメダラシンを全て細胞外に放出させてから測定
することが正確な測定値を得るための必須要件である。
従って、この必須要件が完全に満たされない場合には測
定値はバラツキが大きく、再現性の乏しいデータしか得
られないという難点が生ずる。

【０００８】血液試料中の顆粒球を完全に破壊する方法
としては、機械的方法、超音波による方法、凍結融解を
繰り返す方法、浸透圧の異なる水性液体で処理する方
法、及び酵素類、補体等で細胞膜を破壊する方法等を挙
げることができるが、本発明者らの広範な検討の結果、
これらの方法に比較してさらに測定精度が高く、比較的
簡便に実施できる実用的方法として、細胞膜を穏和な条
件で破壊することができる薬剤である溶血剤を含有する
水性液体で血液試料を処理する方法に着目したものであ
る。

【０００９】溶血剤としては、高級脂肪酸塩、アルキル
アリールスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキ
ル硫酸エステル塩等の陰イオン性界面活性剤、アルキル
ピリジニウム塩、アルキルトリメチルアンモニウム塩等
の陽イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の
非イオン性界面活性剤、アルキルベタイン等の両性界面
活性剤、サポニン、レシチン、コール酸等の天然界面活
性物質、ヘビ毒、ハチ毒、プロテアーゼ等の酵素類、補
体等の生体成分等がその具体例として非限定的に挙げら
れる。このような溶血剤は、0.0001重量％〜10重量％、
好ましくは 0.001重量％〜 5重量％、特に好ましくは
0.005重量％〜１重量％の水性液体として用いることが
できる。水性液体の媒体としては、水又は水と混和する
有機溶媒との混合媒体等を挙げることができる。また、
該水性液体の使用量は、血液試料に対して容積単位で５
０倍〜１０万倍、好ましくは１００倍〜１万倍、特に好
ましくは５００倍〜２千倍である。

【００１０】このようにして得られた顆粒球を完全に破
壊したヒト血液試料の水性稀釈液を試料とするヒトメダ
ラシンの免疫学的測定方法は、測定試料を標識化した抗
原又は抗体の存在下に抗ヒトメダラシン抗体と接触さ
せ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉す
る免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中
に存在する標識物質を用いて測定する検出段階とからな
る。

【００１１】前段の免疫反応段階を構成する抗原抗体反
応の方法は任意である。例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後に標識化抗体を反応させる抗体−抗原−
抗体からなるサンドイッチ錯体を形成させるサンドイッ
チ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第
二抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を標識化抗原（例えばペルオキシダーゼ酵素により標
識）の存在下で反応させる競合法、 測定すべき抗原を含有する試料にこれらと特異的に反
応する標識化抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心
分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する
凝集沈殿法、更に、 ビオチン標識化抗体に標識化アビジンを反応させるビ
オチン−アビジン法等を非限定的に用いることができ
る。

【００１２】本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方
法において不溶性担体を用いる場合には、不溶性担体と
しては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ
素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分
子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれら
の組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状
としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤
状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々
のものを採用することができる。

【００１３】また、これら不溶性担体への抗原又は抗体
の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合
法、イオン結合法等を用いることができる。なお、本発
明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法において用いら
れる抗体類のクラスは任意であるが、IgG クラスの抗体
が好適に用いられる。抗体はモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のいずれをも使うことも可能である
が、モノクローナル抗体が好ましい。また、その形態と
しては全抗体又はF(ab')₂ 、Fab 等の断片を用いること
ができる。抗体の起源は任意であるが、マウス、ラッ
ト、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いら
れる。

【００１４】次いで、このようにして捕捉されたヒトメ
ダラシンの標識化免疫複合体を検出段階で測定するため
の標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放
射性物質等を使用するのが好適である。このような酵素
としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、
フルオレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイ
ン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン
類、アクリジニウム塩類等、放射性物質としては
¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、 ¹¹¹Ｉｎ、 ^99mＴｃ等を非限定的に挙
げることができる。標識物質が酵素である場合には、そ
の活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光
剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキシ
ダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を用
い、発色剤として2,2'−アジノジ[3−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ)、5−ア
ミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、4−アミノ
アンチピリン、3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン
等、蛍光剤としては 4−ヒドロキシフェニル酢酸、 3−
(4−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤とし
てはルミノール類、ルシゲニン電荷移動錯体（例えば、
国際公開公報ＷＯ００／０９６２６号参照。）等を用い
ることができる。また、酵素としてアルカリホスファタ
ーゼを用いる場合には、基質として4−ニトロフェニル
ホスフェート、4−メチルウムベリフェリルホスフェー
ト、コルチゾール−21−ホスフェート等、酵素としてβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、2−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、4−メチルウムベリ
フェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、3−(2'−スピロアダ
マンタン)−4−メトキシ−4(3''−β−Ｄ−ガラクトシ
ルオキシフェニル)−1,2−ジオキセタン(ＡＭＰＧＤ)等
を用いることができる。

【００１５】本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方
法に使用することができるポリクローナル抗体は、従来
公知の方法でヒトメダラシンを抗原として動物に免疫し
て得られる抗ヒトメダラシン抗血清の抗体成分として分
離精製されたものを用いることができる。なかでも例え
ば、山羊抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体、兎抗
ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体等が好適に用いら
れる。また、モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては、先に出願された特開平11−151085公報に詳細に
説明されている。

【００１６】本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方
法に使用することのできる抗ヒトメダラシンモノクロー
ナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽出し
たヒトメダラシンで免疫した動物から採取した抗体産生
細胞とミエローマ細胞との細胞融合により作製されるハ
イブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に
投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から
採取することにより製造することができる。即ち、抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマは、いわゆる細胞融合により得られるものであり、
抗原としてヒトメダラシンを用いて免疫した動物から抗
体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させ
ることにより得られたハイブリドーマを選択的に増殖さ
せ、該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリドーマを検
索しクローニングにより目的とするモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを製造することができる。

【００１７】抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラ
シン又はこれを含有する組成物又は細胞を投与して免疫
した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リ
ンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウス、
ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。
免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当なア
ジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に約１
μｇ／回〜１ｍｇ／回を１回／月〜２回／月、１ケ月間
〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細
胞の分離は、最終免疫から２日後〜４日後に免疫動物か
ら採取することにより行なわれる。

【００１８】ミエローマ細胞としては、マウス、ラット
由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞と
ミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好まし
い。細胞融合の方法は任意であるが、例えばダルコッペ
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細
胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融
合促進剤の存在下で混合することにより行なうことがで
きる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠
心分離し、得られた沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸
濁して培養することによりハイブリドーマを選択する。
次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハ
イブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニン
グを行ない、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを得ることができる。

【００１９】このようにして得られた抗体産生ハイブリ
ドーマを利用してモノクローナル抗体を製造するには、
該ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクロ
ーナル抗体を該培養物から採取する。モノクローナル抗
体を大量に製造するには、該ハイブリドーマをミエロー
マ細胞の由来細胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その
腹水中にモノクローナル抗体を蓄積させ、腹水から採取
する方法を採取することが好ましい。培養物又は腹水か
らのモノクローナル抗体の分離は、IgG 精製に通常使用
される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、
Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なう
ことができる。

【００２０】上記の如くして得られた抗ヒトメダラシン
モノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマ
の種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ
１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体
は、いずれもグロブリンクラスは IgGで、サブクラスは
IgG₁ であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダラシ
ンと特異的に反応し、ヒトメダラシンの免疫学的測定方
法には有用である。

【００２１】

【実施例】以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を
具体的に説明する。もっとも本発明は実施例等に限定さ
れるものではない。尚、実施例中の％は重量％を意味す
る。

【００２２】〔参考例１〕 精製ヒトメダラシンの調製 健常人血液 400mlに、デキストラン（分子量 200,000〜
300,000 ）の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン
水溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき
混ぜてから、４℃〜８℃の温度で約１時間静置した後、
沈殿した赤血球を上清と分離し、この上清を 15,000rpm
で遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、こ
の白血球に1mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩
（ＥＤＴＡ）、1mM ｐ−クロロマーキュリー安息香酸
（ＰＣＭＢ）を含む pH7.0の1Mリン酸カリウム緩衝液
（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、撹拌下に37℃の
温度で20分間インキュベートした後、15秒間超音波破砕
機にかけて完全に細胞を破砕し、更に、37℃の温度で20
分間インキュベートしてから、４℃の温度において 12,
000rpmで10分間遠心分離して上清を採取し、この上清を
蒸留水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回
繰り返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を 50m
M ＰＫＢ (pH6.0)で平衡化したＣＭ−セファロースゲル
カラムに通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、 1M Ｐ
ＫＢ (pH6.0)で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対し
て一晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮する
ことにより、精製ヒトメダラシン 1.5mgが得られた。

【００２３】〔参考例２〕 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の調製 (1)抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハ
イブリドーマの作製 参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシ
ンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢の
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に50μg/匹の量で投与した。
そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追
加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大したこと
を確認した後、更に、その７日後に最終免疫として抗原
を腹腔に50μg/匹の量で投与した。一方、20％の牛胎児
血清を添加したダルコッペ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培
地中で、マウスミエローマ細胞 P3-X63-Ag8-U1（Ｐ３Ｕ
１）を維持培養しておき、最終免疫の３日後、このマウ
スから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコ
ール4000を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、96穴マイク
ロプレートに撒いた。細胞融合後、培地を 100μMヒポ
キサンチン、 0.4μM アミノプテリン、16μM チミジン
を添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して、２〜３
週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞
との融合体であるハイブリドーマが得られた。

【００２４】(2)抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリ
ドーマのスクリーニング 次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、Ｅ
ＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でス
クリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ
用のマイクロプレートに吸着させ、pH7.4 の10mMリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に２％の牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なっ
た後、ハイブリドーマ培養液50μl をこのマイクロプレ
ートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培
養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山
羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体の 2μg/mlＰＢＳ溶液
100μl を添加し、37℃で１時間反応させた。次いで、
この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、0.05％ＡＢ
ＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む 0.1M リン酸クエ
ン酸緩衝液(pH4.6) を 200μl 添加して発色させること
により抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選
別した。

【００２５】(3)抗体産生株のクローニング及びモノク
ローナル抗体の作製 この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液
を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最
終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。こ
のハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗
体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に50％飽和
硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢ
Ｓに溶解させ、3M NaCl 含有50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH7.8)に対して透析してから、プロテインＡ−セファ
ロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた
後、吸着した抗体を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液 (pH5.0)
で溶出し中和して精製することにより3F03、3GO3、2E0
4、及び1G12からなる４種類のモノクローナル抗体を得
た。

【００２６】(4)モノクローナル抗体の性質 〔ウェスタンブロッティング法〕モノクローナル抗体に
特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblo
tting ）法を用いて固定した。先ず、ヒト顆粒球由来メ
ダラシンをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた後、電解液バッファーに25mMグリシン、及び20％
メタノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が７Ｖ／cm、２
時間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシ
ートへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レー
ンを切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染
色し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即
ち、２％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１
次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗
体を加え、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗
マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体を加えて反応させ、洗浄し
てから、0.04％ 3,3'-ジアミノベンジジン、及び0.0034
％過酸化水素を含むＰＢＳからなる基質溶液を加えて発
色させることにより、４種のマウス抗ヒトメダラシンモ
ノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識
することが確認された。

【００２７】〔インヒビション・アッセイ法〕ＥＬＩＳ
Ａ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対し
て、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を
共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼ
を反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液
の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定
するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法
により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン
化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクロ
ーナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部
位）を認識することが確認された。

【００２８】〔実施例１〕 ヒトメダラシン測定用検量線の作成 (1)モノクローナル抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６mm）をよく洗浄してか
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E0
4）10μg/mlを含むＰＢＳ (pH7.4)溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶
液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施
すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られ
た。

【００２９】(2)ペルオキシダーゼ標識モノクローナル
抗体の調製 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）1.
0mg/mlを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息
香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の10mg
/ml の濃度のジメチルホルムアミド溶液 0.1mlを添加
し、25℃の温度で30分間反応させる。次いで、この反応
混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用
い、0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.O)でゲル濾過を行ない、マ
レイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離
した。一方、ペルオキシダーゼとしてホースラディッシ
ュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0mg/mlのＰＢＳ溶
液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10 mg／mlの濃度の
エタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させ
る。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を
充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液 (pH4.5)でゲル
濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有す
る画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷
冷下に約10倍に濃縮する。次に、これに 0.1M ジチオス
レイトールを含有する 0.1M 酢酸緩衝生理食塩水(pH4.
5) １mlを添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲ
Ｐ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した
後、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填した
カラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有す
る画分が得られた。次に、マレイミド化モノクローナル
抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバック
を用いて氷冷下に４mg/ml の蛋白質濃度まで濃縮し、４
℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ44（SEPRAC
OR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキ
シダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。

【００３０】(3)ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免
疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を
固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン
（標準物質）0, 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml
の濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液50μl と、
ＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢ
Ｓ溶液 350μl とを加え37℃の温度で30分間インキュベ
ートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理
食塩水で洗浄する。次に、試験管内に 0.015％ 3,3',5,
5'−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液 250μl、及
び 0.0034％ 過酸化水素を含む 0.1M リン酸クエン酸緩
衝液 (pH4.5)を 250μlずつ各試験管内に加え、37℃の
温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤として
1N硫酸を500mlずつ加えて酵素反応を停止させてから、分
光光度計を用いて450nmの波長の吸光度を測定し、これ
を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１
に示されるような濃度依存性の良好な検量線が得られ
た。

【００３１】〔実施例２〕 酵素免疫測定方法による臨床検体中のヒトメダラシンの
測定 健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存し
た試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取して
0.01％のドデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを
含有する精製水２ml中に加えボルテックスミキサーを用
いて十分混合して検体溶液とし、その10μl を試験管に
添加する。次いで、これに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ (pH7.
4)40μl を加えて希釈した後、この試験管にマウス抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化した
ビーズ各１個及びＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモ
ノクローナル抗体（2E04）0.2 μg/mlの濃度で含有する
２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 350μl を添加して37℃の温
度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線を
作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及
び反応停止を行った後、分光光度計を用いて 450nmの波
長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を
求めた。この測定の再現性を検討する目的で測定操作を
検体稀釈処理から別個に５回行った結果、検体血液中の
ヒトメダラシン濃度は、第１表に示すように非常に良好
な再現性を示すことが確認された。

【００３２】

【表１】

【００３３】〔比較例１〕 酵素免疫測定方法による臨床検体中のヒトメダラシンの
測定 健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存し
た試料を室温に戻して融解させ、その10μl を採取して
ＰＢＳ (pH7.4)２ml中に加え均一に混合して検体溶液と
し、その10μl を試験管に添加し、これに２％ＢＳＡ含
有ＰＢＳ(pH7.4) 40μl を加えて希釈した。次に、この
試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
（3F03）を固定化したビーズ１個及びＨＲＰ標識マウス
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/ml
の濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 350μl を
添加して37℃の温度で30分間インキュベートした。次
に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作によ
り、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光
度計を用いて 450nmの波長の吸光度を測定し、検量線よ
りヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検
討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に５回行
った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度の測定値は
第２表に示すように再現性が良好とは云えないデータを
示した。

【００３４】

【表２】

【００３５】

【発明の効果】以上説明したような発明の構成をとるこ
とにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシン量を再現性
よく正確に測定することが可能となり、慢性炎症性疾
患、特に多発性硬化症の血液診断等への利用に寄与する
ところが大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１記載の酵素免疫測定方法を用いて
ヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗
原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシ
ン測定用の検量線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 樹由 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血液試料を、溶血剤を含有する水
   性液体で処理して該ヒト血液試料中の白血球を完全に破
   壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラ
   シンを定量することを特徴とするヒト血液試料中のヒト
   メダラシンの免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】 ヒト血液試料を、溶血剤を含有する水
   性液体で処理して該ヒト血液試料中の白血球を完全に破
   壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン
   抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗
   体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラ
   シンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を
   定量することにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシン
   を定量することを特徴とするヒトメダラシンの免疫学的
   測定方法。
3. 【請求項３】 前記溶血剤が、界面活性剤である請求
   項１または２に記載のヒト血液試料中のヒトメダラシン
   の免疫学的測定方法。