SK66198A3 - Diagnostics for and mediators of inflammatory disorders - Google Patents

Description

Protilátka, kompozícia a súprava s jej obsahom a jej použitie a použitie antigénu protilátky

Oblasť techniky

Vynález popisuje protilátky alebo ich fragmenty, kompozíciu a súpravu s ich obsahom a ich použitie a použitie antigénu protilátky.

Doterajší stav techniky

Oxidačný stres býva príčinou mnohých ochorení. Produktom oxidačného stresu, ktorý sprostredkúva oxidáciou - indukované ochorenie je peroxidizovaný lipid. Tvorba lipidových peroxidov v biologických systémoch, je komplexný proces, ktorý môže byť navodený rôznymi spôsobmi, a to enzýmami (ako sú napríklad lipooxygenázy, cyklooxygenázy, peroxidázy a iné oxygenázy), ale aj neenzymatickou tvorbou vnútrobunkových, mimobunkových alebo membránovo viazaných reaktívnych foriem kyslíka. Oxidované lipidy bunkovej membrány spoločne s mimobunkovým prostredím môžu indukovať veľmi vážne zmeny v chovaní buniek. Zhubné účinky lipidových peroxidov a ich degradačných produktov sú dobre preskúmané v procese patogenézy aterosklerózy (Herttuala, et al. Journal of Clinical Investigation, 84: 1086-1095 (1989); Gonen, et al., Atherosclerosis, 65:265-272 (1987); a Jurgens, et al., Biochim. Biophys. Acta, 875:104-114 (1986)). Oxidácia je dnes považovaná za potenciálny rizikový faktor kardiovaskulárnych ochorení (Palinski, et. al., Arteriosclerosis, 10:325-335 (1990)).

Kedže oxidácia lipidov je spojená so zápalovými stavmi a kardiovaskulárnymi ochoreniami, je významným medicínskym cieľom disponovať spoľahlivým testom na kvantifikáciu a určenie stupňa oxidácie lipidov v organizme, predovšetkým však u človeka.

Kvantifikácia lipidových hydroperoxidov v organizme, môže byť založená na priamom meraní hydroperoxidu, alebo jeho degradačných resp. reakčných produktov. Polynenasýtené mastné kyseliny (PUFAs) obsahujú najmenej dve dvojité väzby, pričom 15-20% PUFAs má tri alebo viac dvojitých väzieb. Prirodzene

-2sa vyskytujúce nenasýtené mastné kyseliny nie sú nikdy konjugované; dvojité väzby sú oddelené najmenej jednou metylovou skupinou. Počas oxidácie PUFAs na lipidové hydroperoxidy, môže dochádzať ku konjugácii dvojitých väzieb, čo je jedným z primárnych poškodzujúcich procesov. Prvé produkty oxidácie PUFAs sú lipidové hydroperoxidy (LOOH) a ich volné radikáli (LOOH alebo LOO·), z ktorých väčšina je zmenená tak, že obsahujú konjugované dvojité väzby. Tieto produkty, alebo ich ďalšie reakčné alebo degradačné produkty sa používajú na testovanie úrovne oxidácie lipidov v biologickej vzorke.

Napríklad LOOH môžu byť redukované in vivo na alkohol, LOH, ktorý je inertný. LOH možno stanoviť akýmkoľvek testom na alkoholy, a v prípade, že LOH je konjugovaný, akýmkoľvek testom stanovujúcim konjugáciu dvojitých väzieb. Avšak vzhľadom k tomu, že v biologickej vzorke je prítomné veľké množstvo rôznych alkoholov ako aj konjugovaných molekúl s dvojitými väzbami, žiaden z týchto testov nie je dostatočne špecifický.

Okrem toho, LOOH môže podliehať oxidácii kovovým iónom in vivo, a to za vzniku radikálu na dvojitej väzbe, ktorý je veľmi reaktívny. Týmto dochádza často k rozkladu molekuly na mieste oxidácie za vzniku dvoch fragmentov s aldehydovou skupinou, alebo ak nedôjde k rozkladu molekuly, často vzniká ketón. Molekula môže byť rozložená na dve asymetrické časti, a ak LOOH má viac než dve dvojité väzby, môže tvoriť rôzne produkty. Ak LOOH má tri alebo viac dvojitých väzieb, jedným z rozkladných produktov je malondialdehyd (MDA). Prítomnosť malondialdehydu môže byť zistená kyselinou tiobarbiturátovou (TBA), ktorá reaguje s MDA za vzniku ľahko merateľnej a kvantifikovateľnej fluorescenčnej zlúčeniny. Látky, ktoré sú schopné reagovať s TBA označujeme ako TBARS. Test s TBA nie je vhodný na použitie ako diagnostický test na stanovenie úrovne oxidácie lipidov v organizme, pretože bolo zistené, že produkuje falošne pozitívne výsledky, a to po reakcii TBA s inými aldehydmi, cukrami a aminokyselinami. Je vhodný len na vedecké účely, na štúdium presne definovaných vzoriek. Ďalšou nevýhodou je skutočnosť, že meria iba množstvo tých lipidových peroxidov, ktoré obsahujú tri a viac dvojitých väzieb.

-3 Ďalším spôsobom na meranie LOOH vo vzorke je priama reakcia s jodidom draselným, pri ktorej vznikajú farebné komplexy (l₂)KI, ktoré je možné ľahko merať a kvantifikovať. V dokonalejšej verzii využíva tento test leukometylénovú modrú, ktorá reaguje s LOOH za vzniku farebného produktu. Tento test je komerčne dostupný a predáva ho firma Kamiya Biomedical. Podobne ako TBA , je aj tento test použiteľný iba na testovanie laboratórnych vzoriek a nemožno ho použiť na testovanie biologických tekutín alebo bunkových kultúr, ktoré môžu obsahovať množstvo krížovo reagujúcich substancií.

Aldehydy, vznikajúce pri oxidácii lipidov, reagujú s telovými tekutinami a tkanivami. Tieto aldehydy ľahko modifikujú proteínové tioly, lyzíny, histidíny a iné rezíduá (Jurgens, et al., Biochemical Journal 265: 605-608 (1990); Jessup, Biochemical Journäl 234: 245-248 (1986); Steinbrecher, et al., J. Lipid Res. 25: 1109-1116 (1984)). Takéto aldehydmi modifikované proteíny sú antigénne. Protilátky proti takýmto epitopom sú veľmi dobrým prostriedkom na detekciu a lokalizáciu aldehydmi modifikovaných proteínov v aterosklerotickej artérii (Boyd Am. J. Pathol. 135: 815-825 (1989); Haberland, et al., Science 241: 215-218 (1988); Jurgens, Atheroscler. Throm. 13:1689-1699 (1993)). Aldehydmi modifikované proteínové antigény u normálnych jedincov, ale aj u aterosklerotických pacientov však obyčajne nie je možné nájsť v plazme, ale iba v tkanive, a aj to len v malých množstvách.

Pretože lipidové hydroperoxidy sú in vivo veľmi nestále a rýchlo sa rozkladajú, a navyše vznikajúce aldehydy sú len jednou z mnohých metabolických ciest rozkladu LOOH, pričom na ich vznik je potrebný istý čas, reakčné produkty samotných LOOH so susednými látkami môžu byť prítomné vo vyšších množstvách ako aldehydy a môžu teda predstavovať zaujímavý diagnostický cieľ. Napríklad lipidové peroxidy veľmi ochotne reagujú s aminoskupinami proteínov, lipidmi a lipofilnými molekulami. Ich lokalizácia v blízkosti membránových proteínov a lipoproteínových apoproteínov môže naznačovať, že tieto modifikácie môžu byť pre naše účely relevantnejšie než aldehydmi indukované modifikácie v biologických systémoch. Je teda pravdepodobnejšie, že vznik LOOH na bunkovej membráne alebo lipoproteíne má za následok tvorbu proteínov modifikovaných priamo LOOH, a to prinajmenšom v počiatočných fázach procesu, ako tvorbu proteínov

-4modifikovaných metabolický vzdialenými degradačnými produktmi LOOH ako sú aldehydy. Freubis, Parthasarathy, a Steinberg publikovali v roku 1992 údaje, naznačujúce, že medzi lipidovými peroxy - radikálmi a volnými aminoskupinami polypeptidov alebo fosfatidyletanolamínom dochádza ku komplexnej reakcii, pri ktorej vznikajú fluorescenčné zlúčeniny neznámej štruktúry Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,: 10588-10592 (1992). Freubis et al. inkubovali linolové hydroperoxidy s polypeptidmi, alebo s nenasýteným fosfatidyletanolamínom samotným v neprítomnosti kovových iónov. Tvorba výsledného fluorescenčného produktu bola mnohokrát intenzívnejšia než v prípade inkubácie polypeptidov alebo fosfatidyletanolamínu s aldehydom 4-hydroxynonenalom (ktorý produkuje Schiffove bázy). Freubis et al. navrhli dva možné reakčné mechanizmy, oba iniciované interakciou voľných aminoskupiny s peroxy - radikálom. Podľa ich úvahy by mohli tieto teoretické reakčné mechanizmy produkovať päť, šesť alebo sedem členné cyklické štruktúry. V článku nie je navrhnutá možná aktivita týchto hypotetických štruktúr, ani sa o nich nepredpokladá, že by mohli byť prítomné v in vivo systéme.

Prihláška vynálezu PCT/US95/05880 podaná univerzitou Emory, popisuje, že polynenasýtené mastné kyseliny (PUFAs) a ich hydroperoxidy (ox-PUFAs) indukujú expresiu adhezívnej molekuly bunkového povrchu endoteliálnych buniek VCAM-1, ale nie expresiu vnútrobunkovej adhezívnej molekuly ICAM-1 alebo Eselektínu v endoteliálnych bunkách aorty, a to mechanizmom, ktorý nie je sprostredkovaný cytokínmi alebo inými necytokínovými signálmi. Presnejšie, bolo popísané, že kyselina linolová, kyselina arachidónová, linolové hydroperoxidy a arachidónové hydroperoxidy indukujú génovú expresiu povrchového VCAM-1 ale nie vnútrobunkového ICAM-1 alebo E-selektínu. Nasýtené mastné kyseliny (ako napr. kyselina stearová) a mononenasýtené mastné kyseliny (ako napr. kyselina olejová) neindukujú expresiu VCAM-1, ICAM-1 alebo E-selektínu. Taktiež bolo publikované, že indukciu VCAM-1 prostredníctvom PUFAs a hydroperoxidov ich mastných kyselín možno potlačiť ditiokarbamátmi včítane pyrolidínového ditiokarbamátu (PDTC), čo podporuje záver, že indukcia je sprostredkovaná oxidovanou signálnou molekulou, a že indukcii možno predísť blokovaním oxidácie danej molekuly, eliminovaním oxidácie, alebo keď je oxidačno-redukčnému signálu iným spôsobom zabránené reagovať s pôvodnou cieľovou molekulou.

- 5 Patentová prihláška PCT/US93/10496, taktiež podaná univerzitou Emory popisuje, že ditiokarboxyláty a predovšetkým ditiokarbamáty blokujú indukciu expresie VCAM-1, a sú teda použiteľné v liečbe kardiovaskulárnych chorôb, včítane aterosklerózy, postangioplastickej restenózy, koronárnych arteriálnych ochorení a angíny ako aj nekardiovaskulárnych zápalových ochorení, ktoré sú sprostredkované VCAM-1.

Podstata vynálezu

Podstatou predloženého vynálezu je protilátka viažuca sa na antigén vzniknutý reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom alebo jej fragment.

Predmetom predloženého vynálezu je aj kompozícia obsahujúca túto protilátku a prostriedky na detekciu detegovatelnej látky.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie protilátky na stanovenie peroxidácie lipidov v biologickej vzorke.

Vynález tiež poskytuje súpravu na stanovenie peroxidácie lipidov v biologickej vzorke, ktorá obsahuje protilátku, ktorá sa viaže na reakčný produkt lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom a protilátku, ktorá sa viaže na túto primárnu protilátku.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie protilátky na stanovenie oxidatívneho poškodenia v biologickej vzorke.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie protilátky na diagnostikovanie oxidatívnych ochorení.

Vynález tiež popisuje použitie protilátky na vyhodnotenie schopnosti látok znižovať úroveň lipidovej peroxidácie v biologickej vzorke.

Ďalším predmetom predloženého použitie antigénu protilátky na indukciu zápalového efektu v biologickej vzorke alebo organizme.

-6Vynález je založený na objave, že modifikácia proteínov a iných látok obsahujúcich primárne amíny lipidovými hydroperoxidmi, vyúsťuje v tvorbu antigénnych epitopov. V súčasnosti bolo objavené, že tieto protilátky sú prítomné aj v plazme zdravých jedincov, avšak v plazme pacientov trpiacich na oxidáciou indukované ochorenia môžu byť zvýšené nad normálne hladiny. Tento test na zistenie hladín lipidových peroxidov v biologickej vzorke pacientov je dokonalejší v porovnaní s tými, ktoré sú dnes k dispozícii v tom, že je zameraný na testovanie antigénu, ktorý je prítomný v plazme jedinca vo významných koncentráciách, a môže byť spoľahlivo vykonaný na vzorkách in vivo. Naproti tomu, antigénne proteíny, generované modifikáciou aldehydmi, neboli pomocou protilátok proti proteínom modifikovaným aldehydmi v plazme organizmu doposiaľ detegované. Výnimku tvoria špecifické prípady, ako je napríklad prechodná angína. Ďalej platí, že protilátky proti proteínom modifikovaným lipidovými hydroperoxidmi ako aj proti rovnako modifikovaným iným látkam obsahujúcim primárne amíny, nevykazujú krížovú reaktivitu s proteínmi modifikovanými aldehydmi.

Ako ilustráciu objavov na základe ktorých spočíva predložený vynález, bol urobený experiment, v ktorom bol pomocou lipidových peroxidov modifikovaný králičí sérový albumín, ktorý potom generoval tvorbu polyklonovej protilátky. Táto polyklonová protilátka rozpoznáva proteíny modifikované lipidovými peroxidmi, a súčasne nerozpoznáva nemodifikované proteíny. Využitím imunohistochémie bolo zistené, že táto protilátka rozpoznáva epitopy prítomné v ľudských aterosklerotických léziách, v aterosklerotických artériách cholesterolom kŕmených opíc, a v bunkách RAW - makrofágoch predinkubovaných s lipidovým peroxidom. Protilátka bola účinná vo Western-blot - analýze a môže byť použitá na detekciu prítomnosti modifikovaných epitopov aj v normálnej plazme.

-7Vynález zahŕňa použitie protilátky a súpravy na analýzu stavu peroxidácie lipidov v organizme, včítane vhodného množstva protilátky, ktorá môže byť imobilizovaná na pevnom podklade pričom najlepšie je, ak je naznačená detegovateľnou látkou. Protilátky môžu byť imobilizované na rôzne pevné substráty, a to známym spôsobom. Medzi vhodné pevné podporné substráty patria materiály, obsahujúce membránu alebo povrchovú úpravu podporenú alebo adherovanú na paličkách, guličkách, bankách alebo iných typoch pevnej podpory. Iné pevné substráty zahŕňajú platničky pre bunkové kultúry, ELISA platničky, skúmavky a polymérne membrány. Protilátky môžu byť naznačené detegovateľnými látkami ako sú napríklad fluorochróm, rádioaktívna značka, biotín, alebo iný enzým ako napr. chrenová peroxicláza, alkalická fosfatáza a 2galaktozidáza. Ak je detekčnou látkou enzým, prostriedok na detekciu môže byť dodaný spoločne so súpravou. Prednostným spôsobom na stanovenie detegovatelnej látky, je využitie enzýmu v úlohe detegovatelnej látky a enzýmového substrátu ktorý po reakcii s enzýmom mení farbu. Súprava môže obsahovať aj prostriedky na vyhodnotenie výsledku testu, napríklad farebný diagram, alebo numerickú referenčnú tabuľku.

Súprava môže byť zostavená vo forme kvantitatívnych alebo kvalitatívnych testov. Možno ju používať vo vedeckom laboratóriu, v medicínskom laboratóriu alebo v teréne.

Ďalej bolo objavené, že niektoré reakčné produkty lipidových hydroperoxidov a primárnych amínov sa vyznačujú nezávislou biologickou aktivitou ako mediátory bunkových odpovedí. Termín oxykĺn je tu používaný na označenie fluorescenčného proteínu alebo lipidu, ktorý je generovaný reakciou lipidového hydroperoxidu a primárneho amínu, a ktorý môže vyvolať v cieľovej bunke odpoveď. Oxykĺny môžu byť generované extracelulárne, môžu byť tvorené na bunkovej membráne, alebo aj intracelulárne za účelom sprostredkovania bunkovej odpovede. Rozsiahla skupina rôznorodých biologicky aktívnych molekúl, ktoré obsahujú primárne amíny môže byť konvertovaná na oxykĺny, ktoré majú biologickú aktivitu.

-8Príkladom oxykĺnu, ktorý sa však nemyslí v obmedzujúcom význame, je stabilný fluorescenčný produkt reakcie medzi linolovým hydroperoxidom (13HPODE) a vhodnou aminokyselinovou skupinou, ako je lyzín v albumíne alebo polylyzín, alebo látka o nízkej molekulovej hmotnosti ako napr. fosfatidyletanolamín. Tieto oxykĺny pôsobia ako silné zápalové signály, ktoré indukujú expresiu génu pre endoteliálny VCAM-1, a to mechanizmom, ktorý možno inhibovať selektívnymi antioxidantami. K ďalším bunkovým odpovediam ktoré môžu byť vyvolané oxykĺnmi patria okrem iných tieto: tvorba alebo aktivácia MCP-1, IL-1, TNF-α, ICAM, MCSF, a selektínu E.

Kým všetky primárne amíny reagujú s lipidovými hydroperoxidmi za vzniku antigénnych molekúl, ktoré môžu indukovať tvorbu protilátok, odrážajúcich oxidačný stav organizmu, nie všetky peptidy alebo primárne amíny vyskytujúce sa v biologickom systéme tvoria oxykĺny. Je to preto, že produkcia protilátok na jednej strane a bunková odpoveď na strane druhej môžu mať rôzne spúšťacie mechanizmy.

Ďalším výsledkom vynálezu je použitie protilátky na stanovenie oxidatívneho poškodenia v biologickej vzorke, ktorý zahŕňa nasledovné kroky: (i) izolácia antigénu tvoreného reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom; a potom (ii) identifikácia primárneho amínu. Povaha amínu v niektorých prípadoch môže poskytnúť informácie o lokalizácii oxidatívneho poškodenia.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je stĺpcový graf, detekcie králičieho sérového albumínu a králičieho sérového albumínu modifikovaného lipidovým hydroperoxidom, pomocou protilátky z príkladu č. 4, čo je vyjadrené ako množstvo proteínu v nanogramoch, oproti optickej denzite roztoku pri 450 nm.

Na obr. 2 je stĺpcový graf reprezentujúci schopnosť protilátky z príkladu č. 4 rozpoznať oxidovanú frakciu nízkodenzitných lipoproteínov (LDL) čo je vyjadrené v mikrogramoch oproti jednotkám optickej denzity.

-9Na obr. 3 je stĺpcový graf reprezentujúci dávkovo závislú indukciu VCAM-1 (A) a ICAM-1 (B) oxidovaným hovädzím sérovým albumínom, ktorá je vyjadrená ako percento maximálnej indukcie dosahovanej pomocou TNF-a.

Na obr. 4 je schematický diagram veľkoobjemovej syntézy 13-HpODE modifikovaného oxykĺnu, využívajúcej systém generovania lipidových peroxidov. Cieľový proteín bol dialyzovaný v membráne so schopnosťou prepustiť molekuly do 10 kDa, a systém generujúci 13-HpODE, bol vymieňaný každých 8-16 hodín.

Na obr. 5 je Western blot diagram, demonštrujúci skutočnosť, že sLO a kyselina linolová sú minimálne požiadavky na tvorbu oxsLO.

Na obr. 6 je Western blot diagram, demonštrujúci detekciu imunorektívnej vzorky, opracovanej s 13-HpODE po 96 hodinách vo veľkoobjemovej reakcii.

Na obr. 7 je priebeh indukcie ICAM-1 vplyvom sLO opracovaného s 13HpODE, ako percento indukcie vplyvom TNF v závislosti od času.

Na obr. 8 je chromatogram, ktorý naznačuje, že sLO modifikovaná s 13HpODE je viac hydrofóbna než neopracovaná sLO.

Na obr. 9 je graf indukcie ICAM-1 frakciami oxSLO (oxidovaná sójová lipooxygenáza) získanými chromatografiou gélovou filtráciou. Tento graf ukazuje, že frakcia č. 10 indukuje ICAM-1 najsilnejšie.

Na obr. 10 je graf závislosti absorbancie (pri 280nm) od frakcií oxSLO, získaných chromatografiou gélovou filtráciou, ktorý ukazuje, že biologicky aktívne frakcie 9 a 10 tvoria iba časť z celkového množstva proteínov identifikovaných chromatografiou gélovou filtráciou.

Na obr. 11 je stĺpcový graf reprezentujúci indukciu ICAM-1 sójovou lipooxygenázou, linolovou kyselinou a oxidovanou sójovou lipooxygenázou ako percento indukcie ICAM vplyvom TNF.

Na obr. 12 je stĺpcový graf reprezentujúci indukciu ICAM-1 (ako funkciu percenta indukcie vplyvom TNF). účinkom sójovej lipooxygenázy a oxidovanej

- 10sójovej lipooxygenázy syntetizovaných veľkoobjemovou metódou v ľudských endoteliálnych bunkách aorty (HAEC).

Na obr. 13 je stĺpcový graf reprezentujúci indukciu ICAM-1 (ako funkciu percenta indukcie vplyvom TNF) účinkom sójovej lipooxygenázy a oxidovanej sójovej lipooxygenázy, čo naznačuje, že oxSLO aktivuje expresiu povrchového ICAM dávkovo závislým spôsobom.

Na obr. 14 je stĺpcový graf reprezentujúci indukciu ICAM-1 (ako funkciu percenta indukcie vplyvom TNF) oxidovanou sójovou lippoxygenázou. Graf znázorňuje, že oxSLo indukuje vo väčšom rozsahu ICAM ako indukuje VCAM.

*

Na obr. 15 je výsledok Northern blot analýzy, ktorý indikuje, že oxSLO na rozdiel od SLO indukuje akumuláciu mRNA pre VCAM, ICAM, a MCP-1 v ľudských endoteliálnych bunkách aorty (HAEC).

Na obr. 16 je výsledok Northern blot analýzy, ktorý indikuje rýchlu akumuláciu mRNA pre VCAM, ICAM, a MCP-1 v ľudských endoteliálnych bunkách aorty.

Podrobný opis vynálezu

I. Spôsob stanovenia oxidačného stavu organizmu

A. Produkcia protilátky (i) Lipidový hydroperoxid

Lipid je vo vode nerozpustná, olejová alebo tuková organická substancia, ktorá je extrahovateľná z buniek a tkanív nepolárnymi rozpúšťadlami ako sú chloroform a éter. Najrozšírenejšia forma lipidu je triacylglycerol. Mastné kyseliny sú charakteristické stavebné kamene lipidov. Mastná kyselina je organická karboxylová kyselina s dlhým reťazcom, typicky obsahujúca od štyroch do dvadsiatich štyroch uhlíkových atómov. Mastné kyseliny sa v bunkách alebo v tkanivách obyčajne nevyskytujú volné, ale sú viazané vo väčšej molekule ako je

-11napríklad lipoproteín, albumín, triacylglycerol, vosk, fosfoglycerid (napr. fosfatidyletanolamín, fosfatidylcholín, fosfatidylserín, fosfatidylinozitol, alebo kardiolipín), sfingolipid (napr. sfingomyelín, cerebrozidy, alebo gangliozidy), alebo sterol a jeho ester mastnej kyseliny. Aj materiály obecne označované ako ceroidy a lipofuscíny obsahujú mastné kyseliny.

V tomto dokumente bude termín polynenasýtená mastná kyselina (PUFA) označovať mastnú kyselinu (obyčajne C₈ až C24), ktorá má aspoň dve alkénové väzby a ide predovšetkým, ale nie výlučne o kyselinu linolovú (Ci₈A), linoleovú (Ci₈A), arachidónovú (C₂₀A) a ekosatrienovú (C₂₀Ä).

Termín lipidový hydroperoxid, tak ako je používaný v tomto dokumente označuje:

1. (i) polynenasýtenú mastnú kyselinu; alebo (ii) molekulu ktorá obsahuje zvyšok polynenasýtenej mastnej kyseliny;

2. v ktorej najmenej jedna z alkenylových väzieb je konvertovaná na hydroperoxid.

Ako nelimitujúce príklady lipidových hydroperoxidov sú uvedené:

15-HPETE

'OOH

13-HPODE

'OOH

Lipidové hydroperoxidy sa môžu tvoriť in vivo enzymatický z polynenasýtených mastných kyselín, alebo lipidov obsahujúcich zvyšky PUFA, a to lipooxygenázou, cyklooxygenázou, peroxidázou, alebo iným oxygenázovým enzýmom ako aj neenzymatickým spôsobom, a to vďaka produkcii skupiny

- 12reaktívnych kyslíkových molekúl intracelulárne, extracelulárne, alebo na bunkovom povrchu. Lipidové peroxidy môžu byť produkované chemicky, oxidáciou polynenasýtených mastných kyselín, alebo lipidov obsahujúcich zvyšky PUFA, a to využitím štandardných chemických spôsobov.

Je zrejmé, že na tvorbu protilátky, ktorá reaguje s vybraným amínom je možné použiť širokú paletu lipidových hydroperoxidov. Táto reakcia nie je selektívna; v skutočnosti každý lipidový hydroperoxid bude reagovať s primárnym amínom antigénne.

(ii) Primárny amín

Každý primárny amín možno použiť v reakcii s lipidovým hydroperoxidom za účelom vytvorenia antigénneho materiálu. Bolo zistené, že čím je amín hydrofóbnejší a viac nukleofilný, tým viac uľahčuje reakciu. Napríklad, benzylamín reaguje s lipidovým hydroperoxidom rýchlejšie než etylamín. Z tohoto hľadiska nie je použitie malých amínov ako napr. Ci až C3 alkylamínov a amónia preferované. Z hľadiska aplikácie do organizmu, preferovaný amín je ten, ktorý má nízku toxicitu či už samotný, alebo po reakcii s lipidovým hydroperoxidom. Amín môže byť naviazaný na väčšiu molekulu, napríklad, haptén, ak je žiadúce zvýšiť antigénnu odpoveď

Preferované sú syntetické verzie prirodzene sa vyskytujúcich molekúl, ktoré obsahujú primárne amíny, teda peptidy a proteíny. Príklady zahrňujú peptidy a proteíny, ktoré obsahujú ako terminálnu aminoskupinu lyzínové rezíduum (napr. albumín a polylyzín) alebo histidínové rezíduum. Vhodné sú aj fosfatidyletanolamín, fosfatidylserín a hormóny končiace sa aminoskupinou.

Príkladom toho, že reakcia lipidového hydroperoxidu a proteínov prebieha v prirodzených in vivo podmienkach je skutočnosť, že komerčne dostupné proteíny ako napr. hovädzí sérový albumín obsahuje lipid-hydroperoxidový - amínový epitop. Z tohoto dôvodu je na prípravu antigénu dobré použiť syntetický peptid

- 13alebo proteín; zvlášť je to však nutné pri príprave protilátky za účelom kontroly kvality.

(iii) Reakcia lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom

Schopnosť lipidového hydroperoxidu reagovať s proteínom demonštrovali Fruebis Parthasarathy a Steinberg v Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, str. 10588-10592, november 1992, Medicínske vedy. V tomto článku bola popísaná príprava lipidového hydroperoxidu reakciou kyseliny linolovej alebo fosfolipidu kyseliny linolovej so sójovou lipooxygenázou a následnou inkubáciou hydroperoxidu s polypeptidmi v prostredí bez kovových iónov. Všeobecný prístup a experimentálne podmienky popísané v tomto článku môžu byť použité na prípravu širokej palety reakčných produktov z východiskových a k sebe inklinujúcich lipidových hydroperoxidov a amínov.

Chemickú reakciu medzi lipidovým hydroperoxidom a primárnym amínom možno uskutočniť v laboratóriu, alebo vo fabrike pri izbovej teplote, neutrálnom alebo takmer neutrálnom pH, simulujúc podmienky in vivo. Reakcia prebieha predovšetkým vo vodnom prostredí, ale aj v organických rozpúšťadlách, ak z reaktanty a produkty sú v organickom rozpúšťadle dostatočne rozpustné. LOOH môžu byť v organických rozpúšťadlách menej stabilné než vo vodných roztokoch. Reakčná teplota môže byť zvýšená podľa potreby až do bodu varu rozpúšťadla. Priebeh reakcie možno monitorovať fluorescenčnou spektrofotometriou. Excitačná vlnová dĺžka produktu je obyčajne medzi 330 až 360 a emisná medzi 420 a 450 nm. Reakcia je skončená, ak nedochádza k ďalšiemu zvýšeniu fluorescencie vzorky. V typickej reakcii je pomer lipidového hydroperoxidu a amínu približne 1,5:1, avšak, na iné účely, alebo pri optimalizácii požadovaného výťažku môžu byť použité iné pomery.

(iv) Produkcia a použitie protilátok í

Spôsob a súprava na stanovenie stavu lipidovej peroxidácie organizmu môže zahŕňať buď monoklonové alebo polyklonové protilátky alebo fragmenty protilátok.

Termín protilátka, ako ho používame v tomto dokumente zahŕňa monoklonové a polyklonové protilátky, ako aj fragmenty protilátok, ktoré sa viažu špecificky, ale reverzibilne na popísaný epitop. Výhodné je, ak je protilátka alebo fragment protilátky derivované z monoklonovej protilátky alebo jej fragmentu. Príprava monoklonových a polyklonových protilátok proti antigénu vytvorenému reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom môže byť uskutočnená využitím ktorejkoľvek známej metódy, napríklad tej, ktorá je popísaná v: Zola, H. (1988) Monoclonal Antibodies - A manual of techniques CRC Press a Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane; Cold Spring Harbor (1988), tieto zdroje sú zahrnuté v zozname literatúry.

V istom uskutočnení, predovšetkým na laboratórne použitie boli zvieratá imunizované antigénom, a to prednostne v zmesi s adjuvansom. Ďalšie imunizácie (booster) sú podľa potreby vykonávané s antigénom v PBS a v zmesi s adjuvansom v opakujúcich sa intervaloch. Zvieratám sa následne po imunizácii odoberá krv. Po odstránení zrazeniny a bunkovej drte je možné sérum testovať ELISA testom. Po začiatočnej imunizácii možno získať mesačné alebo iné periodické titre protilátky.

Druhou možnosťou je odobratie sleziny zvieratám imunizovaným s antigénom a (pokiaľ možno aj s) adjuvansom. Slezinové bunky sú potom izolované a fúzované s myelómovými bunkami s neobmedzeným rastovým potenciálom, za použitia polyetylénglykolu. Fúzované hybridómové bunky sú potom selektované a kultivované in vitro. Médiá z hybridómových bunkových kultúr sú testované na prítomnosť hybridómových protilátok s požadovanou špecificitou. Selekčná technika na identifikáciu vhodných monoklonových alebo polyklonových protilátok je významným prvkom v procese získavania požadovanej imunošpecificity. Popri

- 15 štandardných spôsoboch, môžu byť hybridómové bunky testované na prítomnosť protilátok špecifických voči danému antigénu, napr. ELISA testom.

Vo všeobecnosti platí, ak produkt vybraného lipidového hydroperoxidu a vybraného amínu obsahuje antigén s jedným epitopom, tento antigén vyvolá tvorbu monoklonovej alebo polyklonovej protilátky. Ak sa použije viac antigénov alebo jeden antigén s viacerými epitopmi, získa sa polyklonová protilátka. Napríklad, ak LOOH reaguje so sérovým albumínom, dôjde k tvorbe antigénu s mnohými epitopmi, pretože albumín má mnoho lyzínových zvyškov na rôznych miestach v molekule. Tento antigén vyvolá tvorbu polyklonových protilátok. Ak na opak, použijeme ako antigén reakčný produkt jednoduchého amínu s LOOH, tento antigén môže indukovať tvorbu monoklonových alebo polyklonových protilátok. Napríklad, ak vyberieme fosfatidyletanolamín, ktorý obsahuje nenasýtenú lipidovú časť, môže tento hrať úlohu tak lipidového ako aj amínového komponentu. Taká molekula môže indukovať tvorbu jednak monoklonových ale aj polyklonových protilátok.

Bolo pozorované, že proteíny z prirodzených zdrojov môžu obsahovať malé množstvo antigénu LOOH/amín. Preto za účelom kontroly kvality sa ako antigén na produkciu protilátok preferuje použitie produktu reakcie syntetického peptidu, alebo syntetickej molekuly, obsahujúcej amín s LOOH.

Variabilné ťažké (V_H) a variabilné ľahké (V_L) domény protilátok sa podieľajú na rozpoznaní antigénu, to je skutočnosť zistená na základe prvých experimentov s natrávením protilátok proteázami. Ďalšie potvrdenie prišlo na základe humanizácie hlodavčích protilátok. Variabilné domény hlodavčieho pôvodu môžu byť fúzované s konštantnými doménami ľudského pôvodu, tak že výsledná protilátka si zachováva antigénnu špecificitu hlodavčej rodičovskej protilátky (Morrison et al. (1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855). Na humanizáciu hlodavčích protilátok možno použiť aj metódu tzv. CDR grafting. Okrem toho aj rekombinantné monoklonové protilátky môžu byť primatizované napr. protilátky, ktorých variabilné oblasti sú odvodené od dvoch rôznych druhov primátov, najčastejšie pochádzajú variabilné oblasti protilátky z opice makak a konštantné oblasti sú ľudské. K výhodám takýchto protilátok patrí: vysoká homológia k

-16ľudskému imunoglobulínu, podržanie si ľudských výkonných funkcií, redukovaná imunogénnosť a dlhší sérový polčas existencie (Newman et al. (1992) Biotechnology 10, 1455).

Antigén špecifická oblasť môže byť exprimovaná ako časť bakteriofága, napríklad použitím techniky, ktorú popísal McCafferty et al. (1990) Náture 348: 552-554. Protilátkam podobné molekuly tohoto vynálezu môžu byť selektované z tzv. phage display knižníc metódou popísanou v článku Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12, 725-734, podľa ktorej sú antigény imobilizované a použité na výber fágov. Na väzbu fágov môžu byť použité aj vhodné bunky rastúce v jednej vrstve, a to buď fixované formaldehydom alebo glutaraldehydom alebo nefixované. Nezaujímavé fágy sú vymyté a naviazané fágy sú potom získané späť, a to narušením ich väzby na antigén. Tieto sú potom reamplifikované v baktériách. Za účelom obohatenia populácie fágov obsahujúcich molekuly, ktoré sú podobné protilátkam v tomto vynáleze, je táto selekcia a amplifikácia vykonaná niekoľkokrát.

Fragmenty protilátok, obsahujú Fab- podobné molekuly (Better et al. (1988) Science240, 1041); Fv molekuly (Skerra et al. (1988) Science 240, 1038); jednoreťazcové Fv (ScFv) molekuly kde partnerské domény V_H a V_L sú spojené flexibilným oligopeptidom (Bird et al. (1988) Science242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) a jednoduché protilátkové domény (dAbs) pozostávajúce z izolovaných variabilných oblastí (Ward et al. (1989) Náture 341, 544). Všeobecný prehľad techník, zaoberajúcich sa syntézou fragmentov protilátok, ktoré si podržia svoje špecifické väzbové miesta možno nájsť v článku Winter & Milstein (1991) Náture 349, 293-299.

Tento vynález zahŕňa nasledovné fragmenty protilátok, avšak neobmedzuje sa len na tieto: Fab, (Fab)₂, Fv, scFv a dAb. Protilátkam podobné molekuly môžu byť pripravené pomocou techník rekombinantnej DNA podľa WO84/03712.

Je výhodnejšie používať fragmenty protilátok než celé protilátky. Fragmenty protilátok Fab, Fv, ScFv a dAb, môžu byť exprimované a secernované z E. coli, a teda je možné, ľahko ich naprodukovať vo veľkých množstvách.

-17Celé protilátky a F(ab')2 fragmenty sú bivalentné. Tým sa myslí, že protilátky a F(ab')₂ fragmenty majú dve miesta reagujúce s antigénom. Naproti tomu fragmenty Fab, Fv, ScFv a dAb, sú monovalentné, a teda majú len jedno miesto na reakciu s antigénom.

Technológia protilátkového inžinierstva sa vyvíja veľmi rýchlo, ako je to aj popísané v článkoch Tan L.K. a Morrison, S.L. (1988) Adv. Drug Deliv. Rev. 2: 129-142, Williams, G. (1988) Tibtech 6: 36-42 a Neuberger, M.S. et al. (1988) 8th Intemational Biotechnology symposium Part 2, 792-799 (všetky tieto zdroje sú v zozname literatúry k tomuto dokumentu), a je vhodná na prípravu molekúl podobných protilátkam spomínaným v tomto vynáleze.

Protilátky môžu byť použité na najrôznejšie účely, podľa zámeru konkrétneho štúdia, a to na lokalizáciu, izoláciu a purifikáciu antigénu ku ktorému sa špecificky viažu. Zvlášť dobre môžu byť použité na zobrazenie, ako aj manipuláciu buniek nesúcich antigén. Na protilátku podľa tohoto vynálezu môže byť naviazaná rádioaktívna značka, rádioizotop, kardiovaskulárne, protizápalové, alebo iné liečivo, prekurzor a enzým konvertujúci tento prekurzor liečiva na aktívnu formu kardiovaskulárneho, protizápalového alebo iného požadovaného lieku, alebo iná látka sprostredkúvajúca bunkové procesy. Takéto konjugáty majú väzbovú časť, pozostávajúcu z protilátky podľa tohoto vynálezu, a funkčnú časť, pozostávajúcu z liečiva alebo enzýmu atď. Väzbová časť a funkčná časť môžu byť oddelené spojovacou oblasťou.

Väzbová a funkčná časť konjugátu (hoci aj peptidu alebo polypeptidu) môže byť spojená akýmkoľvek konvenčným spôsobom, používaným na spájanie polypeptidov, napríklad aj tak, ako je to všeobecne popísané v článku O'Sullivan et al. (1979) Anál. Biochem. 100, 100-108. Napríklad, jedna časť môže byť obohatená tiolovými skupinami a druhá časť sa nechá zreagovať s bifunkčným činidlom schopným reagovať s tými tiolovými skupinami, ako je napríklad N-hydroxysukcinimidester kyseliny jódoctovej (NHIA) alebo N-sukcinimidyl-3-(2-pyridilditio) propionát (SPDP). Amidové a tioéterové väzby tvorené napríklad mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimid esterom sú in vivo všeobecne viacej stále ako disulfidové väzby.

- 18Ďalšia možnosť je použitie spojovacej technológie ako je popísaná v EP 0 088 695, a to ak väzbová časť obsahuje cukry, čo je prípad protilátok alebo niektorých fragmentov protilátok, pričom funkčná časť býva pripojená práve cez túto cukornú oblasť.

Funkčnou časťou konjugátu môže byť enzým konvertujúci prekurzor liečiva na jeho aktívnu formu, pričom je možné využiť technológiu podobnú tej, ktorú popísal Bagshawe a jeho spolupracovníci (Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531; Bagshawe et al. (1988) Br. J. Cancer 58, 700; WO 88/07378).

Nie je nevyhnutné, aby bol v konjugáte prítomný celý enzým, samozrejme katalytická časť musí byť prítomná. Môžu byť použité aj.tzv. abzýmy, v ktorých je prítomná monoklonová protilátka, generovaná proti substancii zúčastňujúcej sa na katalytickej reakcii v intermediárnom reakčnom stave. Výsledná protilátka potom môže v danej reakcii slúžiť ako enzým.

Konjugát možno purifikovať na základe jeho veľkosti alebo afinitnou chromatografiou, a testovať na dvojakú biologickú aktivitu. Imunoreaktivita antigénu môže byť zmeraná pomocou ELISA testu s imobilizovaným antigénom a rádioimunotestom v živej bunke. Ako enzýmový test možno použiť β-glukozidázu a substrát, ktorý mení absorbanciu ak dôjde k hydrolýze glukózových zvyškov, ako napr. ONPG (o-nitrofenyl-p-D-glukopyranosid), uvoľňujúci 2-nitrofenol, ktorý je merateľný spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Stabilita konjugátu môže byť testovaná in vitro, najprv inkubáciou pri 37°C v sére a následne FPLC analýzou. Stabilita in vivo môže byť testovaná rovnakým spôsobom v myšiach, a to analýzou séra v rôznych časoch po injikovaní konjugátu. Okrem toho je možné pred konjugáciou protilátku rádioaktívne naznačiť s ¹²⁵l, a enzým s ¹³¹1 a stanoviť biodistribúciu konjugátu, volnej protilátky a volného enzýmu v myšiach.

Konjugát môže byť produkovaný aj ako fúzny produkt technológiou rekombinantnej DNA, pričom daná DNA obsahuje oblasti kódujúce dve časti konjugátu, a to buď v tesnej blízkosti alebo oddelené oblasťou kódujúcou spojovací peptid, ktorý nenaruší požadované vlastnosti konjugátu. Je možné, že dve funkčné

-19vlastnosti takejto substancie sa budú prelínať úplne, alebo čiastočne. DNA je potom exprimovaná vo vhodnom hostiteľovi, a to známymi spôsobmi.

Protilátky alebo ich konjugáty môžu byť podávané akýmkoľvek vhodným spôsobom, napríklad intravenózne alebo intraperitoneálne, v štandardných sterilných a nepyrogénnych zmesiach a nosičoch, ako je napríklad izotonický fyziologický roztok (v prípade vnútrožilovej aplikácie). Ak sa už konjugát naviazal na cieľové bunky a vymizol z cirkulácie (ak to je nevyhnutné), čo trvá asi jeden deň, podáme podľa potreby, prekurzor, obyčajne v jednej dávke infúzie, resp. cieľová oblasť je už zobrazená. Ak je to nutné, z dôvodu imunogenity niektorých antigénov, podávame pri dlhodobejšej aplikácii cyklosporín alebo iné imunosupresívum, avšak obyčajne to nie je potrebné.

Správne časovanie podávania konjugátu a prekurzora môže byť optimalizované klasickým spôsobom, pretože pomer prítomnosti konjugátu v poškodenom a normálnom tkanive (prinajmenšom v prípade intravenóznej aplikácie) je najvyšší po niekoľkých dňoch, zatiaľ čo absolútne množstvo konjugátu naviazané na cieľové tkanivo v tomto čase je v percentuálnom vyjadrení injikovanej dávky na gram, nižšie než v kratších časových intervaloch. Teda optimálny interval medzi podaním konjugátu a prekurzora bude kompromis medzi vrcholom tkanivovej koncentrácie proti látka/enzým a najlepším distribučným pomerom medzi poškodeným a normálnym tkanivom. Dávka konjugátu bude vybraná lekárom podľa všeobecne platných kritérií. Dávka akéhokoľvek konjugátu bude vybraná podľa normálnych kritérií, zvlášť s ohľadom na typ, podmienky a lokalizáciu cieľového tkaniva a hmotnosť pacienta. Dĺžka liečby bude závisieť z časti na rýchlosti a rozsahu akejkoľvek imunitnej reakcie proti konjugátu.

Ak je konjugát používaný na diagnostiku zápalu, funkčná časť konjugátu obyčajne obsahuje rádioaktívny atóm na scintigrafické štúdie, ktorým môže byť napr. technécium 99m (^99mTc), alebo jód 123 (¹²³l), alebo spinovú značku na zobrazenie nukleárnou magnetickou rezonanciou (nmr), (známou aj pod názvom zobrazenie magnetickou rezonanciou - mri), ktorou môže byť opäť jód -123, jód 131, indium -111, fluór -19, uhlík -13, dusík -15, kyslík -17, gadolínium, mangán alebo železo.

-20Ak sa konjugát má použiť na selektívnu deštrukciu tkaniva, funkčná časť obsahuje vysoko rádioaktívny atóm, ako je napríklad jód -131, rénium -186, rénium -188, ytrium -90, alebo olovo -212, ktorý emituje dostatok energie na zničenie susedných buniek. Rádioaktívne, alebo iné značky možno inkorporovať do konjugátu známymi spôsobmi. Napríklad, značka môže byť syntetizovaná použitím vhodných reaktantov, ktoré obsahujú napríklad fluór -19 namiesto vodíka. Také značky ako sú ^mTc, ¹²³l, ¹⁸⁶Rh, ¹⁸⁸Rh, a ¹¹¹ In, môžu byť pripojené cez cysteínové rezíduá peptidov. Ytrium -99 môže byť pripojené cez lyzínové rezíduá. Na inkorporáciu jódu -123 možno použiť metódu lodogen (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys Res. Commun. 80: 49-57). Ďalšie metódy sú podrobne popísané v monografii Monoclonal Antibodies in Immunoscintigr^phy (Chatal, CRC Press 1989).

B. Spôsob detekcie antigénu

Vynález zahŕňa spôsob na detekciu antigénov generovaných reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom. Tento test môže byť vykonaný na laboratórnej ale aj na biologickej vzorke. Termín biologická vzorka, tak ako ho používame v tomto dokumente, znamená vzorku tkaniva alebo tekutiny izolovanej z organizmu, obyčajne z človeka, ako je napríklad plazma, sérum, likvor, lymfatická tekutina, očná tekutina, tkanivo kože, peritoneálna tekutina, moč, žlč, vzorka z kardiovaskulárneho, dýchacieho, črevného, alebo genitálneho traktu, vzorka centrálneho nervového systému, vzorka maternice, placenty, sĺz, pupočnej šnúry, mlieka, endoteliálnych buniek, endometriálnych buniek, epiteliálnych buniek, vzorky tumorov, orgánov a taktiež vzorky z bunkových kultúr rastúcich in vitro, ktoré však nie sú obmedzené len na tzv. kondiciované médium, ktoré je obohatené o sekrečné produkty bunkového metabolizmu, pričom tento výpočet nie je myslený v limitujúcom význame, ale len ako príklad.

Podľa predloženého vynálezu oxidačný stav a predovšetkým stav lipidovej peroxidácie organizmu je vyhodnocovaný testovaním biologickej vzorky z organizmu na prítomnosť a hladinu buď: (I) antigénov, ktoré sa viažu na protilátku generovanú tak, ako je to popísané v časti I. A.; alebo (ii) protilátok, ktoré krížovo reagujú s protilátkami generovanými ako je popísané v časti I. A. Bolo zistené, že

-21 každý organizmus a dokonca aj zdraví jedinci majú v rôznom množstve vo svojich tkanivách a tekutinách prítomné aj (I) antigény aj (ii) protilátky. V skutočnosti komerčne dostupný hovädzí sérový albumín obsahuje (I) a teda bude vykazovať pozitívnu odpoveď pri testovaní s protilátkami generovanými podľa časti I. A. Teda striedma prítomnosť (I) a (ii) v organizme nie je sama osebe indikáciou chorobného oxidáciou indukovaného stavu. Namiesto toho úroveň (I) alebo (ii) v organizme by mala byť posudzovaná vo svetle populačných a individuálnych noriem. Teda diagnostika je celkom podobná tomu, ako je to v prípade cholesterolu, kde sa jeho hladina u daného jedinca porovnáva so štatistickými normami. Okrem toho, podobne ako v testoch na cholesterol, v niektorých prípadoch zmeny v individuálnych hladinách môžu poskytnúť významnejšie diagnostické informácie než individuálne hladiny samotné.

Pre cholesterolový test je typické, že ak sa v prvom teste sa zistí u pacienta riziko srdcového ochorenia, vykoná sa druhá sada testov, za účelom získať viac diagnostických informácií, včítane absolútnych hladín HDL, LDL a triacylglyceridov. Pri rovnakej hladine cholesterolu, poskytujú rôzne pomery každého z komponentov presné diagnostické a prognostické informácie. Predkladaný test je podobný tomuto opisu v tom, že ak hladina lipidovej hydroperxydácie indikuje, že u pacienta hrozí riziko, alebo už má zápalové ochorenie, včítane kardiovaskulárneho ochorenia, môže byť vhodné vykonať sériu testov druhej úrovne, jednak na potvrdenie diagnózy, ako aj na získanie väčšieho množstva informácií ohľadne daného ochorenia. Táto druhá úroveň testov môže vyhodnotiť prítomnosť a aj množstvo ďalších markerov, ochorenia, na ktoré padá podozrenie. K týmto ďalším markerom môže patriť okrem iných aj LDL, LDH, triacylglyceridy, L_(P)A (tvorený reakciou LDL s proteínom A), VCAM (rozpustný, cirkulujúce hladiny VCAM-1 sú zvýšené v sére pacientov so systémovými zápalovými ochoreniami), ICAM, Eselektín, MCSF, G-CSF, TNF-α, IL-1, a MCP-1. Indikačné markery ďalších špecifických ochorení sú známe a testy na tieto markery sú komerčne dostupné, alebo sú dostupné v medicínskom laboratóriu.

Alternatívne, protilátky špecifické pre cieľové proteíny a oxidované indikačné markery môžu byť použité na testovanie špecifických komponentov

-22vzorky modifikovanej lipidovým peroxidom, za účelom získania väčšieho množstva informácií ohľadne toho, ktoré primárne amíny sa podieľajú na oxidačnom procese. Toto poskytuje ďalšiu špecifickosť a citlivosť diagnostiky aterosklerózy a iných zápalových ochorení, a môže poskytnúť informáciu na zistenie, ktorý z lipidových peroxidov, ak tam také sú, môžu pôsobiť ako oxykĺn. Použitím štandardných, dve protilátky využívajúcich detekčných techník (napr. imunoprecipitácia a Western blot), môžu byť amíny modifikované lipidovým peroxidom, včítane LDĽ, HDL, triacylglyceridy, Ι__(Ρ)Α, VCAM, ICAM, E-selektín, MCSF, G-CSF, TNF-α, IL-1, a MCP-1, identifikované a kvantifikované v tkanivách alebo tekutinách. Tento komponent celkového stavu lipidovej peroxidácie, môže reprezentovať citlivý a špecifický marker vaskulárnych zápalových príhod sprostredkovaných lipidovým peroxidom, čo je charakteristické pre aterosklerózu. Podobne, modifikácia apo-B lipidovým peroxidom, môže byť detegovaná použitím protilátky proti apo-B ale aj protilátky proti LOOH/amínu.

Podľa predloženého vynálezu, akýkoľvek test, ktorý meria väzbu antigénu na protilátku môže byť použitý na vyhodnotenie hladiny antigénu alebo protilátky v biologickej vzorke jedinca. Je známe veľké množstvo takýchto testov, ktoré sa všeobecne používajú a sú dostupné komerčne.

Imunocytochémia a imunohistochémia sú techniky, ktoré využívajú protilátky na identifikáciu antigénov na povrchu buniek v roztokoch, alebo v na rezoch tkanivami. Imunocytochémia sa používa na kvantifikáciu individuálnych bunkových populácií podľa povrchových markerov. Imunohistochémia sa používa na lokalizáciu daných bunkových populácií alebo antigénov. Tieto techniky sa taktiež používajú na identifikáciu autoprotilátok, a to použitím tkanív alebo buniek, ktoré obsahujú predpokladaný autoantigén ako substrát. Protilátky sú obyčajne identifikované použitím protilátok konjuguvaných s enzýmom, ktoré sú generované proti pôvodným protilátkam a následným pridaním vhodného substrátu, ktorý sa ukladá ako depozit vo farebnej a nerozpustnej forme na bunke alebo tkanive.

Ďalší všeobecne používaný spôsob je rádioimunotest (RIA), v ktorom sú na detekciu antigénu alebo protilátky použité rádioaktívne označené reagencie.

Protilátka môže byť detegovaná použitím platničiek naznačených antigénom. Na

-23takéto platničky sa potom aplikuje protilátka a tá sa deteguje pridaním rádioaktívne označeného ligandu, špecifického pre túto protilátku. Množstvo ligandu viazaného na platničku je úmerné množstvu testovanej protilátky. Tento test môže byť aj obrátený na testovanie antigénu. Variáciami RIA sú kompetičná RIA, RIA s priamou väzbou, vychytávacia RIA, sendvičová RIA a imunorádiometrický test (IRMA).

Énzýmové imunoadsorpčné testy (ELISA) sú široko používanou skupinou techník na detekciu antigénu a protilátok. Princípy sú analogické ako v RIA s výnimkou, že enzým je kojugovaný s detekčným systémom a nie s rádioaktívnou molekulou. Typické enzýmy, ktoré sa tu používajú sú peroxidáza, alkalická fosfatáza, a 2-galaktozidáza. Tieto tvoria farebné reakčné produkty z bezfarebných substrátov. Denzita farby je úmerná množstvu reaktanta, ktorý skúmame. Tieto testy sú pohodlnejšie než RIA, avšak sú menej senzitívne.

Western bloting (imunobloting) je spôsob používaný na charakterizáciu neznámych antigénov. Komponenty biologickej vzorky sú separované gélovou elektroforézou. SDS gély separujú vzorky podľa molekulovej hmotnosti a IEF gély separujú vzorky podľa nábojových charakteristík. Separované proteíny sú prenesené na membrány (sú blotované) a imunocytochemicky identifikované. K menej často používaným, ale vhodným spôsobom patrí tzv. Farr - test (v ktorom sa rádioaktívne označané ligandy viažu a sú detegované špecifickou protilátku v roztoku, kde sú precipitované a kvantifikované), precipitačné reakcie (v ktorých protilátky a antigény reagujú za vzniku veľkých zrazenín, pričom vzniká nerozpustný imunokomplex; toto však funguje len ak antigén aj protilátka sú prítomné v dostatočnom množstve, sú blízko ekvivalencie a keď tam je dosť epitopov prístupných na tvorbu precipitátu); nefelometria (meria imunitné komplexy vzniknuté v roztoku resp. ich schopnosť rozptyľovať svetlo), imunodifúzia (deteguje antigény a protilátky v agarových géloch); protiprúdová elektroforéza (podobná imunodifúzii, avšak protilátky a antigén sa spoločne pohybujú v poli elektrického prúdu; je vhodná pri nízkych koncentráciách antigénu alebo protilátky); jednoduchá radiálna imunodifúzia (SRID) (kvantifikuje antigény tak, že ich necháva difundovať smerom od jamky do gélu obsahujúceho protilátku; technika môže byť aj obrátená tak, že neznáma protilátka sa nechá difundovať smerom k antigén obsahujúcej

-24jamke); raketová elektroforéza (je podobná na SRID, avšak testovaný antigén sa pohybuje v gély v elektrickom poli); a imunofluorescencia (je podobná na imunochémiu, avšak namiesto enzýmových konjugátov sa tu využíva fluorescencia). Protilátka, používaná na analýzu telovej tekutiny je obyčajne imobilizovaná na pevnom substráte. Protilátka môže byť imobilizovaná rôznym spôsobom, ako je to popísané v príručke Antibodies: A Laboratory Manuaľ, citovanej vyššie. K vhodným pevným substrátom patria tie, ktoré majú membránu alebo povrchovú vrstvu podporenú alebo adherovanú na paličkách, syntetickom skle, agarózových guličkách, pohárikoch, vaničkách alebo iných typoch pevnej podpory. Iný typ pevných substrátov predstavujú platničky na bunkové kultúry, ELISA platničky, skúmavky alebo polymérne membrány.

Spôsoby na značenie protilátok s detegovateľnými činidlami sú taktiež popísané v príručke Antibodies: A Laboratory Manuaľ, predtým citovanej. Množstvo antigénu v biologickej vzorke jedinca môže byť určené akýmkoľvek spôsobom asociovaným so zvoleným testom. Napríklad, zvolený imunotest môže byť vykonaný so známym zvyšujúcim sa množstvom antigénu tak, aby bolo možné vytvoriť štandardnú krivku alebo farebný graf, a potom môže byť množstvo testovaného antigénu určené porovnaním výsledku testu so štandardnou krivkou alebo grafom, ktorý koreluje množstvo komplexu antigén - protilátka so známym množstvom antigénu. Množstvo antigénu určené v biologickej vzorke jedinca môže byť použité na vyhodnotenie pacientovho stavu, a to rôznymi spôsobmi. Po prvé, hladina antigénu môže byť prirovnaná ku populačnej norme, založenej na štatistických údajoch. Po druhé, na hodnotu antigénu je možné nazerať vo svetle pacientovej vlastnej histórie ako na hladinu tohoto antigénu.

C. Súpravy

Tento vynález zahŕňa aj súpravu na diagnostiku stavu lipidovaj peroxidácie vo vzorke. Súprava v optimálnej výbave zahŕňa protilátku, ktorá reaguje s epitopom vytvoreným reakciou lipidového hydroperoxidu s amínom v biologickej vzorke.

Protilátky sú prítomné v súprave v takom množstve, aby došlo k účinnému vyviazaniu a detekcii v podstate všetkého antigénu vo vzorke. Optimálna súprava obsahuje dostatočné množstvo protilátky na vyviazanie všetkého antigénu vo vzorke do desiatich minút. Protilátka môže byť imobilizovaná na pevnom podklade a môže byť naznačená detekčnou látkou, tak ako je to popísané vyššie. Súprava môže obsahovať prostriedky na detekciu detegovatelnej látky. Ak je však protilátka značená fluorochrómom alebo rádioaktívnou značkou, obyčajne sa neposkytuje prostriedok na jej detekciu, pretože sa predpokladá, že užívateľ disponuje s vhodným spektrofotometrom, scintilačným počítačom alebo mikroskopom. Ak je detekčnou látkou enzým, môže byť spolu so súpravou poskytnutá aj detekčná látka a je to obyčajne substrát enzýmu, a to v dostatočnom množstve na detekciu komplexov antigén - protilátka. Jeden z preferovaných spôsobov na detekciu je použitie substrátu, ktorý je konvertovateľný enzýmom na farebný produkt. Všeobecným príkladom je použitie enzýmu chrenovej peroxidázy s 2,2'- azino-di[3-etyl-benzotyazolin sulfátu] (ABTS).

Súprava môže obsahovať lyzačné činidlo, ktoré lyžuje bunky prítomné vo vzorke telovej tekutiny. Vhodné lyzačné činidlá sú detergenty ako napr. Tween 80, Nonidet P40 a Triton X -100. Uprednostňuje sa, ak je lyzačné činidlo imobilizoavné na pevnom podklade spoločne s protilátkou.

Súprava môže obsahovať aj tlmivé roztoky na premývanie substrátu medzi jednotlivými krokmi. Tlmivým roztokom je obyčajne fyziologický roztok, ako napr. fosfátový tlmivý roztok, 0,9% roztok NaCI, citrátový tlmivý roztok alebo Tris.

Súprava môže obsahovať rôzne koncentrácie vopred pripraveného antigénu na tvorbu kalibračnej krivky. Súprava môže ďalej obsahovať vizuálnu alebo numerickú prezentáciu množstiev antigénu ako kalibračnú štandardu, vhodnú na referenčné účely. Napríklad, ak ide o test, kde výsledkom je farebný produkt, môže byť k súprave pripojený obrázok, kde je znázornené ako zvýšenie intenzity farby zodpovedá daným množstvám antigénu.

Okrem toho, súprava môže obsahovať antigén vzniknutý reakciou lípidového hydroperoxidu s primárnym amínom, za účelom vyhodnotenia hladiny protilátky v biologickej vzorke.

-26Súprava môže obsahovať v detekčnom systéme dve protilátky. Prvá protilátka, ktorá je prítomná v malých množstvách je špecifická pre antigén ktorý je predmetom testovania. Druhá protilátka je poskytnutá vo väčších množstvách a používa sa na detekciu prvej protilátky. Napríklad, králičiu protilátku možno použiť na detekciu antigénu LOOH/amín, a potom protikráličia IgG protilátka môže byť použitá na detekciu naviazanej králičej protilátky. Kozie protilátky a protilátky proti protilátkam sa taktiež všeobecne používajú.

Ako jeden príklad, ktorý nie je zamýšľaný v obmedzujúcom význame, je poskytnutá súprave na detekciu stavu lipidovej peroxidácie pacienta, ktorá obsahuje králičiu protilátku špecifickú proti antigén LOOH/amín, protikráličiu IgG protilátku v dostatočnom množstve na detekciu prvej protilátky, enzým konjugovaný s druhou protilátkou a substrát enzýmu, ktorý mení farbu akonáhle sa vystaví pôsobeniu enzýmu.

D. Použitie diagnostických súprav.

Diagnostický spôsob a súpravy popísané v tomto dokumente môžu byť použité na vyhodnotenie širokej palety medicínskych stavov, ktoré sú sprostredkované oxidáciu indukovanými dejmi a zvlášť lipidovými hydroperoxidmi. Napríklad prítomnosť zvýšených koncentrácií lipidových hydroperoxidov, alebo reakčných produktov lipidových hydroperoxidov s primárnym amínom môže byť využitá ako prvotný diagnostický znak kardiovaskulárneho ochorenia, včítane aterosklerózy, zápalového ochorenia, endometriózy, glomerulárnej nefritídy, preeklampsie, choroby centrálneho nervového systému sprostredkované lipidovou peroxidáciou, Alzheimerovej choroby, psoriázy, astmy, atopickej dermatitídy, tumorov, Kaposiho sarkómu, neurodegeneratívnych ochorení, Crohnovej choroby, reumatoidnej artritídy, a ischemickej reperfúzie. Biologická vzorka je odobratá podľa toho, o akú chorobu ide. Napríklad, vzorka tkaniva z postihnutej oblasti je optimálna, ak ide o tkanivovo špecifické ochorenie. Ak tento spôsob a súprava indikuje zvýšenie, alebo abnormálne hladiny lipidovej peroxidácie v organizme, môžu byť použité ďalšie testy na potvrdenie špecifického ochorenia.

II. Biologické aktivity oxykĺnov

A. Definícia oxykĺnov

Bolo zistené, že niektoré reakčné produkty lipidových hydroperoxidov a primárnych amínov majú nezávislú biologickú aktivitu ako mediátory bunkových odpovedí. Termínom oxykĺn, tak ako je používaný v tomto dokumente rozumieme fluorescenčný proteín alebo lipid, ktorý je generovaný reakciou lipidového hydroperoxidu a primárneho amínu, a ktorý vyvoláva v cieľovej bunke odpoveď. Oxykĺny môžu byť tvorené buď extraceluláme, alebo na bunkovej membráne a môžu sprostredkovávať bunkovú odpoveď. Oxykĺny môžu byť tvorené aj vo vnútri bunky.

Na oxykĺny s biologickou aktivitou môže byť konvertovaná široká paleta biologicky aktívnych molekúl, obsahujúcich primárne amíny. Príkladom oxykĺnu je stabilný fluorescenčný produkt reakcie medzi linolovým hydroperoxidom (13HPODE) a vhodnou aminokyselinovou skupinou, ako je napr. lyzín v albumíne alebo polylyzín, prípadne látky s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je fosfatidyletanolamín. Niektoré oxykĺny pôsobia ako silné zápalové signály, ktoré indukujú expresiu génu pre endoteliálny VCAM-1, mechanizmom, ktorý možno inhibovať selektívnymi antioxidantami. Ďalšie bunkové odpovede, ktoré môžu byť vyvolané oxykĺnmi sú tvorba alebo aktivácia MCP-1, IL-1, TNF-α, ICAM, MCSF a E-selektínu.

Oxykĺny môžu byť v organizme použité ako mediátory bunkových zápalových odpovedí, včítane kardiovaskulárnych odpovedí, pretože oxidácia lipidov je asociovaná so zápalovými a kardiovaskulárnymi chorobami. Špecifické chorobné stavy, ktoré sú vo svojej podstate zápalovej alebo kardiovaskulárnej povahy, zahŕňajú aterosklerózu, endometriózu, glomerulárnu nefritídu, preeklampsiu, choroby centrálneho nervového systému sprostredkované lipidovou peroxidáciou, Alzheimerovu chorobu, autoimunitné ochorenia, psoriázu, astmu, atopickú dermatitídu, rakovinu kože, neurodegeneratívne ochorenia, Crohnovu chorobu, reumatoidnú artritídu, ischemickú reperfúziu, osteoartritídu, dermatitídu, sklerózu multiplex, angioplastickú restenózu, choroby koronárnych artérií a angínu.

-28Kým všetky primárne amíny budú reagovať s lipidovými hydroperoxidmi za vzniku antigénnych molekúl, ktoré môžu byť použité na tvorbu protilátok, pomocou ktorých možno stanoviť úroveň oxidačného stavu organizmu, nie všetky peptidy, alebo biologicky relevantné primárne amíny sú schopné tvoriť oxykĺny. To preto, že na tvorbu protilátky stačí jeden epitop, avšak na sprostredkovanie biologickej odpovede, a teda väzbu na receptor, je kritický počet a poloha reakčných miest.

Jeden z mnohých príkladov je popísaný v Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, str. 10588 - 10592, November 1992, Medical Sciences, ktorý je v tomto dokumente uvedený v zozname literatúry. V konkrétnom prípade, epitopmi môžu

KC—CH

H/: íCHp.-HC^

R = alkyl

Protilátky v predloženom vynáleze môžu byť použité na blokovanie poškodzujúcej aktivity antigénu, predovšetkým fyzickou interferenciou s jeho schopnosťou sprostredkúvať biologickú odpoveď.

B. In vitro syntéza a charakteristika oxykĺnu.

Lipidová modifikácia sójovej lipooxygenázy (sLO) bola dosiahnutá inkubáciou lipidového hydroperoxidu s lipooxygenázou použitím metódy, ktorú popísali Freubís, Parthasarathy a Steinberg (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10588

- 10592). Pri tejto syntéze bolo dôležité udržať vysoký pomer lipidu k proteínu. V maloobjemovej reakcii (1 ml) bolo inkubovaných 250 μΙ kyseliny linolovej priamo s

-29sLO (50 jednotiek, 80 ng) pri izbovej teplote počas troch dní; bolo dôležité aby reakčná zmes bola prevzdušňovaná a toto bolo dosiahnuté prudkým miešaním. Všetky reakcie prebiehali v roztoku 10mM Tris, pH 8.0 a 15 mM chloridu sodného. Na tvorbu králičích polyklonových a myších monoklonových protilátok proti oxidačné modifikovanému oxykĺnu sójovej lipooxygenázy (oxSĽO) bola použitá neprečistená reakčná zmes.

Vo veľkoobjemovej reakcii nebolo možné zachovať vysoký pomer lipidu k proteínu, a to kvôli problému nedostatočnej miešateľnosti týchto substancií. Bol teda vyvinutý spôsob syntézy oxykĺnu modifikovaného s 13-HpODE, resp. modifikácie cieľového proteínu (pozri obr. 4). Cieľový proteín, v množstve 1-3 mg v objeme do 1.5 ml bol odizolovaný pomocou membrány priepustnej pre molekuly do 10kDa. Toto umožnilo plynulú regeneráciu 250 ml systému produkujúceho lipidový peroxid so súčasný zadržaním cieľového proteínu. V systéme na tvorbu peroxidov, boli na katalýzu tvorby kyseliny 13- hydroxyperoxy - [S-(E,Z)J - 9, 11 oktadekadiénovej, použité katalytické množstvá sójovej lipooxygenázy, 1260 jednotiek, a 800 μΙ kyseliny linolovej. Tento systém bol vymieňaný za čerstvú zmes sLO/kyselina linolová každých osem až šestnásť hodín počas najmenej 170 hodín. Reakcia prebiehala v roztoku 10mM Tris, pH8.0, a 15 mM chloridu sodného za stáleho miešania. Výhodou veľkoobjemovej metódy bolo, že ako cieľový proteín môže byť použitý akýkoľvek proteín väčší než 10 kDa alebo zmes proteínov. Medzi kritériá na tvorbu oxykĺnov vznikajúcich oxidáciou prostredníctvom 13- HpODE patrí indukcia ICAM-1 v endoteliálnych bunkách (test je detailne diskutovaný v ďalšom texte tohoto dokumentu) a imunoreaktivita s protilátkami proti oxykĺnom. Minimálne požiadavky na tvorbu oxykĺnov boli stanovené v nízko-objemovej reakcii. Pomocou Western blot analýzy s polyklonovou protilátkou bolo zistené, že minimálnymi požiadavkami v trojdňovej reakcii je prítomnosť sLO a kyseliny linolovej (viď obr. 5). Miešanie reakčnej zmesi zvyšovalo výťažok. Nebola pozorovaná žiadna krížová reakcia ak bola sLO inkubovaná iba v samotnom tlmivom roztoku. Časový priebeh tvorby oxykĺnu vo veľko-objemovej reakcii bol monitorovaný imunoreaktivitou a biologickou aktivitou (indukciou ICAM-1; pozri obr. 6 a 7). Prítomnosť imunoreaktivity bola pozorovaná ešte pred biologickou aktivitou. Počiatočný produkt bol testovaný pomocou Western blot-u, a bol to

-30vysokomolekulárny pás pohybujúci sa v oblasti asi 80 kDa. Reakčné produkty vznikajúce v neskôr tvorili rebrík s produktmi hlavne v oblasti približne 25 kDa. Časový priebeh reakcie pozorovaný prostredníctvom imunoreaktivity a biologickej aktivity bol závislý na koncentrácii lipidu; zvýšenie koncentrácie kyseliny linolovej malo za následok zvýšenie rýchlosti reakcie.

Oxykĺnové reakčné produkty boli testované analytickými postupmi, a to vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze (RP-HPLC) a gélovou filtráciou. Analýza HPLC za použitia kolóny C18 odhalila, že reakčné produkty boli hydrofóbnejšie ako východiskový materiál, čo je konzistentné s tým, že k lipooxygenáze bol pridávaný lipid (pozri obr. 8). Na čiastočné prečistenie oxykĺnov bola použitá preparatívna gélová filtrácia (pozri obr. 9 a 10). Biologickú aktivitu mali frakcie 9 a 10, hoci väčšina proteínu bola prítomná v iných frakciách.

Stabilita oxykĺnu bola stanovená na základe imunoreaktivity a biologickej aktivity. Analýzou Western blot bolo zistené, že oxykĺn je stabilný v mnohých kyslých aj zásaditých podmienkach ako aj v prítomnosti redukčných činidiel. Imunoreaktivita s polyklonovou aj monoklonovou protilátkou bola zachovaná aj po inkubácii vzorky v nasledovných podmienkach: 3.5 M MgCI₂ v 10mM fosfáte sodnom, pH 7.2; 5.0 M LiCI v 10mM fosfáte sodnom, pH 7.2; 100 mM trietylamín, pH 11.5; 100 mM glycín pH 2.5. Naopak, inkubácia s 3.5 MgCI₂ v 10 mM fosfáte sodnom pri pH 7.2, spôsobovala stratu biologickej aktivity, kým ostatné podmienky nemali žiadny účinok. Príčina straty aktivity nie je jasná, a môže byť dôsledkom zmeny v štruktúre proteínu, zmeny oxidačného stavu, alebo inej zmeny. Biologická aktivita bola zachovaná aj po teplotnej denaturácii, a to bez, alebo aj v prítomnosti ditiotreitolu. Pridanie EDTA, Trolox-u, a prebucol-u taktiež nemalo žiaden efekt na indukciu ICAM-1. Po kyslej hydrolýze proteínov došlo k strate biologickej aktivity.

Príklady uskutočnenia vynálezu

E. Príklady stanovenia oxidačného stavu organizmu

Králičí sérový albumín (RSA), sójová lipooxygenáza, kyselina linolová, kozia protikráličia IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou, oktylglukozid, tetrametoxypropán a p-nitrofenyl fosfát boli získané z firmy Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Nonenol bol zakúpený od Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl). Práškové mlieko bez obsahu tuku bolo zakúpené od Bio-Rad Chemical Company (Hercules, CA). Tween-20 a 96 jamkové platničky boli zakúpené od Fisher Chemical Company (Pittsburgh, PA). Bol získaný 20 aminokyselinový peptid o sekvencii YVTKSYNETKIKFDKYKAEKSHEDEL (kde K znamená lyzín) (SEQ I.D. No. 1).

Príklad 1 Príprava proteínu modifikovaného lipidovým peroxidom

Kyselina linolová bola konvertovaná na 13 - hydroperoxylinoleát opracovaním so sójovou lipooxygenázou (SLO) ako bolo popísané autormi Freubis, Parthasarathy a Steinberg (viď vyššie). Vzniknutý hydroperoxid kyseliny linolovej sa nechal ihneď reagovať s RSA, zbaveným imunoglobulínov a zmes bola inkubované pri 37°C dva dni. V typickej reakcii bolo 100 nmol kyseliny linolovej spracované 30 jednotkami SLO v 1 ml fosfátom tlmeného fyziologického roztoku (PBS) a reakcia bola sledovaná meraním zvýšenia absorbancie pri 234 nm. Reakcia je obyčajne ukončená do 30 minút. Lipidový hydroperoxid bol potom inkubovaný v prítomnosti 100 gg albumínu zbaveného lipidov, IgG a iných proteínov v prítomnosti 50μΜ EDTA 2 dni pri 37°C. Tvorba fluorescenčných produktov bola vyšpecifikovaná meraním fluorescencie pri excitačnej vlnovej dĺžke 330 nm a emisnej vlnovej dĺžke 430 nm. Produkt bol extrahovaný chloroformom a metanolom metódou, ktorú popísali Bligh a Dyer (Bligh, et al. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917 (1959)), čím sa odstránil nezreagovaný LOOH a potom premytý niekoľkokrát ľadovým acetónom. Finálny produkt, RSA modifikovaný vplyvom LOOH (LOOH/RSA), bol rozpustný vo vodných roztokoch a mal fluorescenčné charakteristiky podobné ako oxidované nízkodenzitné lipoproteíny (Ox-LDL). Tvorba LOOH ako aj modifikácia proteínu bola vykonaná v neprítomnosti kovov, aby sa zabránilo tvorbe aldehydov.

-32Príklad 2 Príprava oxidovaného LDL

LDL bol izolovaný z heparinizovanej plazmy normálnych ľudských darcov, použitím stolovej ultracentrifúgy Beckman TL -100 a rotora TLA -100.4 (Santaman, et al., J. Clin. Invest. 95: 2594-2600; 1995). Na prečistenie LDL od kontaminácie albumínom bol použitý jednoduchý gradient. Izolácia bola kompletná do troch hodín od získania plazmy. Izolovaný LDL bol 6 hodín dialyzovaný oproti PBS pri 4°C (pri 200 násobnom objeme). Čistota izolovaného LDL bola potvrdená prítomnosťou jedného pásu po elektroforéze v agarózovom géle a intaktným apolipoproteínom B po elektorforéze v polyakrylamidovom géle v prítomnosti dodecylsulfátu sodného. Izolovaný LDL (100gg/ml) bol inkubovaný v PBS s 5μΜ meďou v 50mm platničke pri 37°C. Po 24 hodinách inkubácie bol roztok prenesený do sklenenej skúmavky a delipidovaný extrakciou lipidov metódou popísanou autormi Bligh a Dyer. Delipidovaný LDL proteín bol rozpustený v oktylglukozide (100μΙ z roztoku 10mg/ml bolo pridané k proteínu spoločne s 5μΙ 1N NaOH), tak ako to popísal Parthasarathy et al. (Parthasarathy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 537-540; 1987).

Príklad 3 Príprava proteínov modifikovaných aldehydom

Bol pripravený roztok 1 mg proteínu, RSA zbaveného globulínov (alebo iného proteínu) v 100 μΙ PBS a celkový objem bol potom zvýšený na 1 ml s PBS. K proteínu bol pridaný nonenol alebo hexol (100μΙ z 25μΜ v etanole), obsah bol dobre zamiešaný a inkubovaný 24 hodín pri 37°C. Potom boli pridané štyri ml ľadového acetónu a skúmavka bola držaná v mrazničke jednu hodinu. Po centrifugácii pri 1500 rpm a 10 minútach pri 4°C bol supernatant odobratý. Tento krok bol opakovaný ešte trikrát a precipitát bol potom vysušený vo vákuu. Potom bol do skúmavky pridaný 1ml PBS, a po zamiešaní bol roztok použitý v ELISA teste.

-33 Proteíny modifikované malóndyaldehydom boli pripravené nasledovne. Bola pripravená jedna 10ΟμΙ vzorka tetrametoxypropánu a do skúmavky bolo pridané 0.5 ml 6N HCI. Skúmavka bola zahriata na 60°C počas 30 minút. Potom bolo upravené pH na 6.4 použitím 4N NaOH a celkový objem bol doplnený na 2.7 ml s PBS. Potom bolo 25μΙ takto pripraveného roztoku pridané k 2 mg RSA zbaveného globulínov a iných proteínov a zmes bola inkubované pri 37°C. Po 3 hodinách inkubácie bol roztok dialyzovaný oproti PBS a použitý v ELISA teste.

Príklad 4 Príprava protilátky.

Boli zadovážení traja králičí samčekovia vážiaci 3-4 kg od firmy Myrtle Rabbitry (Thompson Station, TN). Na primárnu imunizáciu bol v PBS (v koncentrácii 1.5mg/ml) rozpustený králičí sérový albumín modifikovaný lipidovým peroxidom, zmiešaný s Freundovým kompletným adjuvansom (Sigma, St. Louis, MO) a injikovaný subkutánne. Ďalšie imunizácie nasledovali s antigénom rozpusteným v PBS a zmiešaným s nekompletným Freundovým adjuvansom, a to v štvortýždňových intervaloch. Králikom bola odoberaná krv 10 až 14 dní po imunizáciách. Krv bola ponechaná v pokoji pri izbovej teplote 4 hodiny a pri 4°C cez noc. Po odobratí zrazeniny a bunkovej drti bola centrifugovaná 20 minút pri 3000 rpm, sérum bolo otestované ELISA testom a uskladnené pri -20°C. Titre protilátky boli sledované mesačne a po 6 mesiacoch od začiatku imunizácie bola zvieratám odobratá všetka krv. Titer protilátky proti LOOH/RSA vo zvieratách kontinuálne s časom stúpal a plató dosahoval okolo štrvrtého mesiaca.

Príklad 5 ELISA test na proteíny modifikované s LOOH

Použitím ELISA testu bolo zisťované, či LOOH/RSA protilátka rozpoznáva proteín modifikovaný LOOH a nemodifikovaný proteín. Ako kontrola bol použitý nemodifikovaný RSA zbavený IgG.

Jamky ELISA platničiek boli naplnené rôznymi riedeniami RSA, modifikovaným lipidovým peroxidom, a to do objemu 50 μ! a inkubované pri 37°C 3

-34hodiny. Platničky boli trikrát premyté s 0.05% Tween 20 v PBS a blokované 3 hodiny s 300 μ11% odstredeného mlieka v PBS, ktoré obsahovalo aj 0.05% Tween 20. Po blokovaní nešpecifických väzbových miest boli platničky trikrát premyté s 0.05% - ným Tween 20 v PBS a protilátkou proti LOOH/RSA, ktorá bola nariedená 1:250. Objem tejto protilátky bol päťdesiat μΙ na každú jamku a inkubácia prebiehala pri 37°C 3 hodiny alebo cez noc. Po trojnásobnom premytí s 0.05% Tween 20 v PBS, bola pridaná do každej jamky protikráličia protilátka IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou, a to v riedení 1 : 38000 a objeme 50μΙ na jamku. Inkubácia prebiehala pri 37°C a trvala 2 hodiny. Po šesťnásobnom premytí s 0.05% Tween 20 v PBS bolo do každej jamky pridaných 50μΙ p-nitofenylfosfátu a nasledovala inkubácia pri 37°C. Platničky boli kontrolované v 15 minútových intervaloch počas 2 hodín. Výsledná krivka bola skonštruovaná nanesením hodnoty OD (optická denzita) oproti koncentrácii LOOH/RSA.

Antigény (LOOH/RSA, RSA, Ox-LDL a iné modifikované proteíny) boli nanesené na 96 jamkovú platničku a ponechané cez noc pri izbovej teplote. Jamky boli blokované s 3%- ným BSA v PBS počas 2 hodín a premyté trikrát s PBS. Protilátka anti-LOOH/RSA bola nariedená 1:250 s PBS obsahujúcom 3% BSA a pridaná do každej jamky. Po dvoch hodinách inkubácie pri 37°C, boli jamky premyté s PBS trikrát. Kozia proti králičia IgG protilátka, konjugovaná s alkalickou fosfatázou bola zriedená 1 : 38000 a pridaná do jamiek. Po dvoch hodinách inkubácie pri 37°C boli jamky opäť premyté a bol pridaný p-nitrofenolfosfát. Intenzita farby bola určená platničkovým počítačom (Antosll).

Na obr. 1 je stĺpcový graf, na ktorom je znázornené rozpoznanie králičieho sérového albumínu a králičieho sérového albumínu modifikovaného lipidovým hydroperoxidom, vyjadrené v hodnotách nanogramov proteínu oproti optickej denzite pri vlnovej dĺžke 405 nm. Ako vidno na obrázku, protilátka v riedení 1 : 250 selektívne rozpoznáva modifikovaný proteín v závislosti na jeho koncentrácii. Už 10 ng RSA (menej než 2 nM modifikovaného RSA) bolo rozpoznané na signifikantne vyššej úrovni než v prípade kontrolného proteínu. Nemodifikovaný kontrolný proteín bol ťažko rozoznateľný protilátkou, aj pri použití vyšších koncentrácií. Kontroly bez prvej alebo druhej protilátky neboli rozpoznávané. Iné

-35 modifikované proteíny (hovädzí alebo ľudský sérový albumín, kataláza a cytochróm c, modifikované vplyvom LOOH) boli taktiež rozpoznávané protilátkou. Apoproteín B_1Oo (apo B), ktorý je komponentom LDL podlieha počas oxidácii LDL rozsiahlej modifikácii. Mnoho štúdií demonštruje, že modifikácie zahŕňajú vznik nového antigénneho epitopu vplyvom kovalentnej modifikácie lyzínových rezíduí aldehydmi.

Za účelom zistenia či Οχ-LDL taktiež obsahuje lyzíny modifikované intaktným LOOH bolo skúmané, či protilátka proti LOOH/RSA rozpoznáva LDL alebo Οχ-LDL. Na obrázku 2 je stĺpcový graf, ilustrujúci rozpoznanie ox-LDL protilátkou z príkladu 4, merané ako koncentrácia v mikrogramoch oproti jednotkám optickej denzity. Ako vidno na obrázku 2, Ox-LDL bol protilátkou rozpoznaný, a to v závislosti na jeho stúpajúcej koncentrácii. Protilátka bola schopná detegovať už 0.25 pg proteínu Ox-LDL (>0.5 nM apo B). Natívny LDL, pripravený v prítomnosti butylovaného hydroxytoluénu (BHT) nebol rozpoznávaný ani v množstve 2.5 pg. V separátnych experimentoch bolo zistené, že lipidový komponent Ox-LDL bol touto protilátkou tiež rozpoznávaný, čo naznačuje, že aminofosfolipidy Ox-LDL ako napr. fosfatidyletanolamín, môžu byť podobne modifikované.

Príklad 6 Imunohistochémia

Schopnosť protilátky rozpoznávať modifikované proteíny v tkanivách bola testovaná v dvoch experimentálnych usporiadaniach. V prvej štúdii boli použité bunky RAW, a tieto boli pred-inkubované s LOOH. V druhej štúdii boli použité aterosklerotické artérie z opíc kŕmených cholesterolom a tieto boli imunitné farbené s protilátkou.

RAW makrofágy boli inkubované so 100 pM 13-HPODE počas 1, 2 alebo 3 dní, ako je to popísané ďalej. Bunky v konfluentnom štádiu v 6 jamkových platničkách boli ovplyvňované s 13-HPODE počas 1, 2 alebo 3 dní v bezsérovom

DMEM (Dalbecco -ova modifikácia Eagle -ovho minimálneho esenciálneho média).

Na druhý a tretí deň bol k bunkám pridaný čerstvý 13-HPODE. Na konci prvého, druhého alebo tretieho dňa boli bunky fixované Bouin -ovým fixatívom počas 10

-36minút a bola vykonaná imunocytochémia použitím protilátok proti LOOH/RSA. Po fixácii boli bunky 3 krát premyté s PBS. Ku každej jamke bola potom pridaná protilátka proti LOOH/RSA bola nariedená 1 : 250 s PBS obsahujúcim 3 % BSA. V negatívnej kontrole bola prvá protilátka vynechaná. Po dvojhodinovej inkubácii pri izbovej teplote boli jamky premyté s PBS trikrát a bola pridaná kozia IgG protilátka proti králičej konjugovaná s alkalickou fosfatázou, v riedení 1 : 100. Po dvojhodinovej inkubácii pri izbovej teplote boli jamky opäť premyté a inkubované so substrátom fast red. Po zafarbení bola reakcia ukončená, a bunky boli fotografované použitím mikroskopu Nikon s pripojeným fotoaparátom.

Zmrazené kúsky tkaniva abdominálnej aorty zo skupiny opíc samčieho pohlavia boli vyhodnotené imunohistochemicky. Zvieratá boli kŕmené diétou s mierne zvýšeným obsahom tukov, ktorá obsahovala vysokoproteínovú stravu doplnenú s 8.2 % sušeného vaječného žĺtku a 10 % bravčového sadla, a to v priebehu piatich rokov. Finálna diéta potom obsahovala 37.5 % nasýteného tuku, 44.9 % mononenasýtených tukov, 17.5 % polynenasátených tukov s 0.25 % cholesterolu. Priemerná hodnota hladiny cholesterolu u týchto zvierat bola 306 mg/dl. Tieto hladiny cholesterolu sú dostatočné na to, aby u opíc vyvolali celý rad aterosklerotických lézií. Ľudské aorty, vykazujúce rôzne stupne vývoja aterosklerózy boli získané z orgánov darcov, v čase odberu tkaniva, a boli zbierané s povolením Výboru pre ľudské subjekty pri univerzite Emory. Ľudské a opičie aorty boli fixované v paraformaldehyde a pred rezaním na 5 pm rezy na kryostate boli zmrazené v kryoprotektívnom médiu O.C.T. Tkanivové rezy boli potom imunitné farbené použitím prvej protilátky v riedení 1 : 500 a následne kozej protikráličej biotinilovanej frakcie IgG (Fisher Scientific) v riedení 1 : 200. Vizualizácia bola vykonaná použitím systému Vector ABC-AP s chromogénom Vector Red (Vector Laboratories). Imunohistochemická analýza ukázala, že bunky inkubované s LOOH boli imunitné sfarbené a antigénne epitopy boli prítomné íntracelulárne. Kontrolne bunky a kontroly bez prvej protilátky nevykazovali žiadnu imunoreaktivitu. Artérie vykazovali intenzívnu imunoreaktivitu. Imunoreaktivita bola lokalizovaná v oblastiach bohatých na makrofágy penovitej bunkovej morfológie, čo bolo určené pomocou kontrastného farbenia makrofágov.

-37Príklad 7 Analýza Western blot

Analýza Western blot bola vykonaná po separácii proteínov v 7.5 % -nom akrylamidovom gély pri nanáške 2.5 pg proteínov. Preblotované vzorky boli detegované použitím zriedenej (1 : 250) primárnej protilátky proti LOOH/RSA. Ako druhá protilátka bola použitá s peroxidázou konjugovaná kozia protikráličia frakcia IgG. Výsledná reakcia bola vizualizovaná chemoluminiscenčne.

Použitím analýzy Western blot bolo potvrdené, že protilátka z príkladu 4 je schopná rozpoznávať Ox-LDL ale nie natívny LDL. Analýza Western blot ďalej ukázala, že táto protilátka rozpoznáva v ľudskej plazme najmenej tri rôzne proteíny. Vzorky plazmy boli pripravené v prítomnosti BHT a nie je pravdepodobné, že tieto epitopy boli generované in vitro. Povaha týchto proteínov nie je známa, i keď z ich mobility v gély možno dedukovať, že ide o produkty albumínu a apo B.

Príklad 8 Krížová reakcia protilátky z príkladu č. 7 s proteínmi modifikovanými aldehydom

Bolo popísaných množstvo protilátok proti proteínom modifikovaným aldehydom. Pretože inkubácia proteínu s LOOH je dlhodobá, je možné, že k tvorbe antigénnych epitopov môžu prispievať aj aldehydy. Za účelom zistenia, či protilátka proti LOOH/RSA rozpoznáva proteíny modifikované aldehydmi, bolo pripravených dvadsať aminokyselinových sekvencií YVTKSYNETKIKFDKYKEKSHEDEL (kde K znamená lyzín) (SEQ I.D. No.: 1) Tento peptid bol použitý z toho dôvodu, že komerčne dostupné plazmové proteíny ako napr. albumín môžu obsahovať podobné epitopy, a to buď vzniknuté už in vivo, alebo in vitro, v priebehu procesu purifikácie. V tabuľke 1 sú uvedené údaje z ELISA testu na MDA, hexanál, nonenál a syntetický peptid modifikovaný s LOOH. Protilátka nerozpoznala syntetický peptid, ani jeho aldehydmi modifikované deriváty vo významnejšom rozsahu. Naopak, syntetický peptid modifikovaný s LOOH bol touto protilátkou významne rozpoznaný.

-38Tabuľka 1: Rozpoznanie peptidu modifikovaného s LOOH, prostredmíctvom protilátky proti LOOH/RSA, a negatívna reakcia s peptidmi modifikovanými s aidehydmi.

pg PepCid	Natívny peptid	LOOH- Pepcid	MDA-Peptid	Nonenal- Pepcid.	Hexanal- Pepcid
0	57	51	53	51	55
0.25	46	190	50	56	64
1.25	38	327	57	60	84
2.5	42	358	62	46	103

Mikrotitračné platničky boli potiahnuté so vzrastajúcimi koncentráciami nemodifikovaného alebo modifikovaného peptidu. Po blokovaní jamiek s odtučneným práškovým mliekom, bolo do každej jamky pridané 1ΟΟμΙ protilátky proti LOOH/RSA v riedení 1 : 250. Po premytí bol do každej jamky pridaný konjugát pritikráličej frakcie IgG s alkalickou fosfatázou. Po pridaní substrátu pnitrofenylfosfátu, bola na mikroplatničkovom počítači meraná OD pri 405 nm. Hodnoty sú priemerom zo sady triplikátov čítania optických denzít jamiek z jedného z najmenej 2 separátnych experimentov.

Analýza “Western blot potvrdila, že žiaden zo syntetických proteinov modifikovaných aldehydmi nebol významne rozpoznávaný, kým peptidy modifikované s LOOH boli protilátkou rozpoznané.

Príklad 9 Charakteristika biologickej aktivity oxSLO: indukcia expresie ICAM v ľudských endoteliálnych bunkách aorty (HAEC) vplyvom oxSLO

V malo objemovej syntéze sLO konvertovala 250μΙ kyseliny linolovej na 13HpODE v priebehu prvej hodiny inkubácie pri izbovej teplote. Počas nasledujúcej

-39trojdňovej inkubácie, 13-HpODE dochádza pravdepodobne k oxidačnej modifikácii enzýmu a tvorbe epitopov na enzýme, ktoré môžu vyvolať biologickú aktivitu, ako napríklad expresiu ICAM na povrchu buniek HAEC, ako to ukazuje ELISA test, ktorého výsledky sú na obrázku 11. Bunky HAEC rastúce na mikrotitračných platničkách boli exponované spomenutej procedúre 16 hodín pred ELISA testom. Ak boli bunky inkubované s sLO alebo kyselinou linolovou samotnými, ani po 3 dňovej inkubácii nedochádzalo ku vzniku biologicky aktívnej substancie. Táto skutočnosť naznačuje, že na vznik biologicky aktívneho epitopu je esenciálna oxidatívna modifikácia sLO. V prípade veľko-objemovej reakcie jedine prítomnosť systému generujúceho 13-HpODE mala za následok vznik aktívnej sLO, ako je to znázornené na obrázku 12. Negatívnu kontrolu voči sLO predstavovala dlhodobá inkubácia enzýmu sLO samotného - len v tlmivom roztoku. Potvrdili sme, že oxSLO syntetizovaný rôznymi spôsobmi je funkčne a imunologický identický. Ďalej sme zistili, že tvorba biologicky aktívnej substancie je proteínovo špecifická. Reakcia králičieho sérového albumínu veľko-objemovým alebo malo-objemovým spôsobom oxykĺnovej reakcie produkuje imunoreaktívne látky, avšak tieto nemajú biologickú aktivitu.

Aktivácia expresie ICAM bunkového povrchu vplyvom oxSLO, bola dávkovo závislá, ako je to znázornené na obrázku 13. V štandardnom ELISA teste bolo zistené, že na dosiahnutie signifikantného signálu stačí 40ng/ml oxSLO. Rovnaké množstvo nemodifikovanej sLO nedokázalo aktivovať HAEC. Podobné výsledky boli pozorované aj v analýze Nothern blot, ako to znázorňuje obrázok 15.

Príkladl0 Expresia VCAM indukovaného s oxSLO, E-selektínu a MCP-1 v bunkách HAEC oxSLO indukuje nielen ICAM, ale aj dve ďalšie adhezívne látky (VCAM na obr. 15, E-selektín na obr. 16) a jednu chemokínovú látku (MCP-1 na obr. 15 a 16).

Na obrázku 14 je znázornená indukcia expresie VCAM na povrchu buniek HAEC, ktorá nie je tak silná ako indukcia ICAM. Údaje z ELISA testu sú podporené výsledkami Northern blot-u, ako je vidno na obrázku 15. Množstvo akumulácie

-40mRNA pre VCAM po 4 hodinách pôsobenia oxSLO bolo menšie než mRNA pre ICAM. Ďalej, hladiny mRNA pre MCP-1 a E-selektín boli rovnako vysoké pri indukcii s TNF, čo naznačuje, že MCP-1 a E-selektín by mohli byť kľúčovými komponentmi signálnej kaskády indukovanej vplyvom oxSLO. Ako je vidno na obrázku 16, indukcia týchto prozápalových génov je veľmi rýchla. V priebehu 2-6 hodín stimulácie dosahujú hladiny mRNA korešpodujúcich týmto génom ustálený stav.

Príklad 11 Expresia IL-1 β v makrofágoch účinkom oxSLO

Okrem toho, že oxSLO má výrazný účinok na endoteliálne bunky, ako je to zhrnuté v tabuľke 2, indukuje oxSLO aj akumuláciu mRNA pre ďalší cytokín, a to IL-1 β v makrofágovej bunkovej línii (RAW), ako je to znázornené na obr. 14. Bunky RAW boli ovplyvňované s oxSLO počas 4 hodín, a následne bola izolovaná a analyzovaná celková RNA. Bolo zistené, že vo vývoji aterosklerózy sú veľmi dôležité oba tieto bunkové typy. Naše údaje in vitro významne podporujú predstavu, že unikátna trieda proteínov modifikovaných lipidovým hydroperoxidom, lipidy alebo lipofilné molekuly, definované ako oxykĺny, môžu sprostredkovať prozápalový signál v oblastiach aterosklerotických lézií.

Tabuľka 2: Indukcia akumulácie mRNA pre VCAM-1, ICAM-1 a MCP-1 vplyvom oxSLO v bunkách HAEC

	VCAM-1 (ιϊα&ον, νγ&ε.,	ICAM-1 (ĽJjgoU.	MCP-1 (Cv&oV.VYŠE. ίδ&,Ο
TNr (100 ^e-óvu/ml)	62.06	71.92	101.65
sLO (0.8 ug/ml)	3.36	3.14	12.34
sLO (0.08 ug/ml)	0.12	-0.09	3.1
sLO (0.008 ug/ml)	-0.14	-0.51	1.12
modif.' sLO (1 ug/ml)	24.17	19.74	116.62
modif. sLO (0.2 ug/ml)	11.51	• 9.41	96.28
modif. sLO (0.04 ug/ml)	9.38	2.06	37.35

-41 Príklad 12: Biologická aktivita produktu oxidatívnej modifikácie králičieho sérového albumínu linolovým hydroperoxidom

Bolo skúmané, či oxidatívna modifikácia králičieho sérového albumínu RSA linolovým hydroperoxidom mení štruktúrne alebo biologické vlastnosti časti (peptidovej alebo nepeptidovej) tohoto materiálu, vo vzťahu k jeho biologickej funkcii ako vaskulárneho, endoteliálneho, bunkového zápalového signálu. Kultivované ľudské endoteliálne bunky aorty boli vystavené pôsobeniu oxidatívne modifikovaného RSA (oxRSA), ktorý bol pripravený podľa príkladu č.1. oxRSA bol použitý v koncentráciách od 1 do 100 nM. Bunky boli potom testované ELISA testom na intenzitu expresie indukovatelných adhezívnych molekúl VCAM-1, ICAM-1 alebo konštitutívne exprimovanej molekuly ICAM-2. Ako vidno na obrázku č. 3, kde je výsledok vyjadrený ako percento maximálnej expresie indukovanej TNF-α, οχ-RSA vykazoval dávkovo závislú indukciu VCAM-1 na úrovni 40% a ICAM-1 na úrovni 80% z maximálneho signálu dosiahnutého pomocou TNF-a. Približná hodnota EC₅o oxRSA potrebná na indukciu oboch VCAM-1 aj ICAM-1 bola 10 - 15 nM. Táto indukcia nebola prejavom lipopolysacharidovej kontaminácie, pretože polymixín B (1 Ομρ/ΠΊΙ) úplne inhiboval indukciu LPS a pritom nemal žiaden efekt na aktiváciu oxRSA. Ďalej, obsah LPS v preparátoch oxRSA bol podľa tzv. limulus testu pod hladinou detekčnej schopnosti tohoto testu. Úroveň expresie konštitutívne exprimovaného ICAM-2 nebola ovplyvnená. Tento výsledok naznačuje, že oxRSA pôsobí v nízkych nanomolámych koncentráciách a v závislosti od dávky ako silný zápalový faktor endoteliálnych buniek.

Príklad 13 Účinok produktu oxidatívnej modifikácie králičieho sérového albumínu linolovým hydroperoxidom na akumuláciu mRNA

Ďalej bolo skúmané či indukcia expresie VCAM-1 a ICAM-1 na bunkovom povrchu vplyvom oxRSA je aspoň čiastočne dôsledkom zmien v akumulácii mRNA.

Analýza Northern blot bola vykonaná z RNA izolovanej z buniek HAEC, vystavených 4 - hodinovému pôsobeniu buď TNF-a (100 jednotiek/ml) alebo oxRSA (25 nM). Podobne, ako bolo pozorované na úrovni proteínov, hladiny

-42mRNA pre VCAM boli indukované vplyvom ox-RSA na úroveň približne 30 - 40 % indukcie vplyvom TNFa. mRNA pre ICAM-1 bola taktiež indukovaná vplyvom oxRSA.

Príklad 14 Účinok produktu oxidatívnej modifikácie králičieho sérového albumínu linolovým hydroperoxidom na transkripčnú aktiváciu promótora VCAM-1 pomocou DNA - viažuceho komplexu podobného NF-kB.

Za účelom zistenia, či oxRSA pôsobil na jadrové regulačné deje asociované s génovou expresiou oxidačno-redukčne senzitívneho VCAM-1, boli endoteliálne bunky ľudskej aorty kultivované počas dvoch hodín v prostredí s alebo bez (kontrola) TNFa (100 jednotiek/ml) alebo 25nM oxykĺnu RSA-LOOH (oxRSA). Následne boli pripravené jadrové extrakty a vykonaný test posunu pohyblivosti DNA komplexov v elektrickom poli, a to s využitím tandemových väzbových miest podobných NF-kB z promótora ľudského génu pre VCAM-1, známych ako kLOkR, a označených s ³²P. Určenie sekvenčne špecifickej väzby komplexu NF-kB na DNA, bolo vykonané použitím vhodného studeného (nerádioaktívneho) kompetítora a tzv. superšift kontroly s využitím protilátok anti-p5O a anti-p65 (R&D Systems). Obe substancie, TNF aj oxRSA indukovali DNA - väzbovú aktivitu, podobne ako NF-kB. Táto skutočnosť naznačuje, že oxykĺny môžu hrať istú úlohu v procese aktivácie transkripcie sprostredkovávanej v tkanive ciev účinkom NF-kB.

Príklad 15 Titre autoprotilátok vo vzorkách plazmy od pacientov s endometriózou a kontrolných jedincov.

Oxidácia v brušnej dutine, ku ktorej dochádza u pacientov s endometriózou môže vyúsťovať v tvorbu autoprotilátok proti modifikovaným proteínom, a hladina týchto protilátok môže byť u pacientov trpiacich na endometriózu zvýšená. Za účelom zistenia, či tieto autoprotilátky sú prítomné u pacientov diagnostikovaných na endometriózu, boli im odobraté vzorky plazmy a vyhodnotené na prítomnosť

-43 protilátok, ktoré reagujú s tromi antigénmi: reakčným produktom lipidového hydroperoxidu s králičím sérovým albumínom, reakčným produktom lipidového hydroperoxidu s LDL ako aj MDA-LDL.

ELISA test: 10 gg Ox-LDL, MDA-LDL alebo lipidovým hydroperoxidom modifikovaný albumín (LOOH-RSA pozitívne antigény) a LDL, ľudský albumín a acetyl LDL (negatívne kontroly) boli napipetované v objeme 10ΟμΙ do 96 - jamkovej mikrotitračnej platničky. Po inkubácii cez noc pri 4°C, boli platničky blokované inkubáciou s 3% -ným práškovým mliekom počas 2 hodín. Ľudský IfF, ktorý zostal naviazaný na antigéne po premytiach platničky, bol detegovaný peroxidázovým konjugátom, alebo konjugátom proti - ľudskej frakcie IgG s alkalickou fosfatázou. Enzým viazaný v konjugáte IgG bol potom kvantifikovaný po farebnej reakcii so špecifickými substrátmi.

Výsledky sú uvedené v tabuľkách 3-5. Ako vidno, v porovnaní s kontrolou bolo u pacientov s endometriózou štatisticky zistené zvýšenie v hladinách reaktívnych protilátok.

Tabuľka 3 Antigén: LOOH/RSA (200μΙ vzorky plazmy). Výsledky sú vyjadrené v OD ekvivalentnej tvorbe p-nitrofenolu.

t-Test: dva súbory, nerovnomerné rozloženie

	Endometrioi<x	í/ontrolos
	0.493885	0.196313
Variancío>	0.117233	0.023264
	63	32
P(T<=t) one-tail	3.74E-08
P(T<=t)two-tail	7.47E-08

-44Tabuľka 4 Antigén: Ox-ĽDL (200μΙ vzorky plazmy).

t-Test: dva súbory, nerovnomerné rozloženie

	Endometrio	bpntrolov.
metiEv,	0.214741935	0.18009375
Varianď-x	0.005239014	0.006001378
?Ož‘Oťo(/A^/A	62	32
P(T<=t)one-tail	0.019975579
P(T<=t)two-tail	0.039951158

Tabuľka 5 Antigén: MDA-LDL (200μΙ vzorky plazmy).

t-Test: dva súbory, nerovnomerné rozloženie

	Endometrío'žZK^.	Kontrola
	0.213758065	0.165406
Varianci-A	0.00,5736645	0.003401
	62	32
P(T<=t)one-tail	0.000485039
P(T<=t)two-tail	0.000970078

Tento vynález je popísaný s referenciami ku jeho preferovaným uskutočneniam. Variácie a modifikácie vyššie popísaného spôsobu, súpravy a materiálov včítane protilátok, budú pre tých ktorí sa pohybujú v danej oblasti techniky zrejmé z predchádzajúceho detailného popisu vynálezu. Predpokladá sa, že všetky tieto zmeny a modifikácie sú pokryté rozsahom nasledujúcich nárokov.

PATENTOVÁ, ZNÁMKOVÁ A PRÁVNA ^A KANCELÁRIA

ŽOVICOVÁ.ŽOVIC

P.O.BOX č.23

840 00 BRATISLAVA 4

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protilátka, vyznačujúca sa tým, že sa viaže na antigén vzniknutý reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom.
2. 2. Fragment protilátky podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa viaže na antigén vzniknutý reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom.
3. 3. Protilátka podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že je imobilizovaná na pevnom nosiči.
4. 4. Protilátka podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že ako pevný nosič je zvolená membrána a povrchová vrstva, ktoré sú podporené alebo adherované na tyčinkách, guličkách, jamkách, alebo inom nosiči.
5. 5. Protilátka podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že ako pevný nosič je zvolená platňa na bunkové kultúry, ELISA - platňa, skúmavka a polymérová membrána.
6. 6. Protilátka podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že je naznačená detegovateľnou látkou.
7. 7. Protilátka podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že je naznačená detegovateľnou látkou, zvolenou zo skupiny látok pozostávajúcej z fluorochrómu, rádioaktívnej značky, biotínu, chrenovej peroxidázy, alkalickej fosfatázy, 2-galaktozidázy alebo iného enzýmu.
8. 8. Protilátka podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je konjugátom.
9. 9. Protilátka podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že antigénom je reakčný produkt hydroperoxidu kyseliny linolovej a primárneho amínu.
10. 10. Protilátka podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že primárnym amínom je aminokyselinová skupina lyzín v albumíne alebo polylyzín, alebo látka s nízkou molekulovou hmotnosťou ako je fosfatidyletanolamín.
11. 11. Protilátka podľa nároku 3 alebo 4, vyznačujúca sa tým, že je humanizovaná.
12. 12. Kompozícia vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku podľa nároku 6 a prostriedky na detekciu detegovatelnej látky.
13. 13. Kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že kombinované prostriedky na detekciu detegovatelnej látky využívajú enzým ako detegovatelnú látku a substrát enzýmu, ktorý po interakcii s enzýmom mení farbu.
14. 14. Použitie protilátky podľa nároku 1 až 13 na stanovenie peroxidácie lipidov v biologickej vzorke, pričom dochádza k interakcii biologickej vzorky s protilátkou, ktorá sa viaže na antigén vzniknutý reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym aminom.
15. 15. Použitie protilátky podľa nároku 1 až 13 na stanovenie úrovne lipidovej peroxidácie v biologickej vzorke, ktoré zahŕňa interakciu vzorky buď s: (I) antigénom, ktorý sa viaže na protilátku pripravenú proti antigénu vznikajúcemu v reakcii lipidového hydroperoxidu s primárnym aminom, alebo (II) s protilátkou, fragmentom protilátky, alebo konjugátom, ktoré krížovo reagujú s protilátkou, viažucou sa na antigén vznikajúci reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym aminom.
16. 16. Použitie podľa nároku 15, kde hladina (I) alebo (II) v konkrétnom organizme, je porovnávaná s populačnou normou.
17. 17. Použitie podľa nároku 15, kde lipidovým hydroperoxidom je 13-HPODE.
18. 18. Použitie podľa nároku 15, kde amín je zvolený zo skupiny látok pozostávajúcej z aminokyseliny, proteínu, peptidu alebo fosfatidyletanolamínu.
19. 19. Súprava na stanovenie peroxidácie lipidov v biologickej vzorke, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku (I) podľa nároku 1 až 13, ktorý sa viaže na reakčný produkt lipidového hydroperoxidu s primárnym aminom a protilátku (II), ktorá sa viaže na protilátku (I).
20. 20. Použitie protilátky podľa nároku 1 až 13 na stanovenie oxidatívneho poškodenia v biologickej vzorke, ktoré zahŕňa izoláciu antigénu vznikajúceho reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom a následnú identifikáciu primárneho amínu.
21. 21. Použitie podľa nároku 20, kde podmienky oxidácie sú zvolené tak, aby zodpovedali podmienkam, ktoré sú potrebné pre nasledujúcu skupinu ochorení ako sú kardiovaskulárne ochorenia, ateroskleróza, zápalové ochorenia, endometrióza, glomerulárna nefritída, preeklampsia, choroby centrálneho nervového systému sprostredkované lipidovou peroxidáciou, Alzheimerova choroba, psoriáza, astma, atopická dermatitída, pevné tumory, Kaposiho sarkóm, neurodegeneratívne ochorenia, Crohnova choroba - zápalová choroba čriev, reumatoidná artritída, a ischemická reperfúzia.
22. 22. Použitie protilátky podľa nároku 1 až 13 na diagnostikovanie oxidatívnych ochorení v biologickej vzorke, ktoré zahŕňa stanovenie hladiny produktu reakcie lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom.
23. 23. Použitie protilátky podľa nároku 1 až 13 na vyhodnotenie schopnosti látok znižovať úroveň lipidovej peroxidácie v biologickej vzorke, ktoré zahŕňa porovnanie hladiny reakčného produktu lipidového hydroperoxidu a primárneho amínu vo vzorke pred interakciou vzorky s danou látkou a po nej.
24. 24. Použitie antigénu vzniknutého reakciou lipidového hydroperoxidu s primárnym amínom podľa nároku 1 na indukciu zápalového efektu v biologickej vzorke alebo v organizme, pričom dochádza k interakcii vzorky alebo organizmu s fluorescenčným antigénom.
25. 25. Použitie podľa nároku 24, kde zápalový účinok je indukovaný prostredníctvom mediátora zvoleného zo skupiny pozostávajúcej z VCAM-1, MCP-1, IL-1, TNFa, ICAM, MCSF a E-selektínu.