JPH06503427A - 組織および生物学的流体中のスルフィドロイコトリエンの決定法およびアレルギーその他の炎症性疾患の診断への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織および生物学的流体中のスルフィドロイコトリエンの決定法およびアレルギ ーその他の炎症性疾患の診断への応用本発明は、組織および生物学的流体中のス ルフィドロイコトリエンの決定法およびアレルギーその他の炎症性疾患の診断へ の使用に関する。

種々の刺激剤との相互反応の結果としての種々のタイプの血液または組繊細胞に よる炎症性メディエータ−の放出は、リューマチ性疾患や腎臓疾患などの種々の 急性または慢性疾患に起こる炎症過穆の共通した特徴である。アレルギー反応に おいては、血液の好塩基球および／または組織の肥満細胞によるヒスタミンの放 出が重要な特徴であると長い間考えられてきた。感受性を示すアレルゲンとの相 互反応の後に、アレルギー患者から単離した血液の白血球の懸濁液の上澄み液中 のヒスタミンのインビトロでの決定が、アレルギーの研究において広く用いられ てきた手順である。しかしながら、そのような決定法は多（の操作を必要とし、 全血では行うことができず単離した細胞でしか行えないという事実、およびヒス タミンの決定には面倒で高価な蛍光測定アッセイまたはラジオイムノアッセイが 必要であるという事実は、現在までのところ、アレルギーの日常的な診断を血液 細胞アッセイに頼れなくしている。

現在インビトロで広く用いられている唯一の診断法は、種々のタイプのラジオイ ムノアッセイまたは免疫酵素アッセイ（たとえば、ＲＡＳＴアッセイ）によるア レルゲン−特異的ＩｇＥ抗体の血清学的決定である。しかしながら、そのような アッセイは抗体の存在を検出するのみであり、アレルギー反応の最も意味のある 病理生理学的特徴、すなわち原因となるアレルゲンとの相互反応の結果としての 反応性細胞による炎症性メディエータ−の産生については考慮していない。この 理由から、アレルギー性疾患その他の炎症性疾患の日常的診断のために実際的で 信頼性のある細胞アッセイが最も望ましい。本発明の目的は、この目的を達成す るのを可能にする一連の新規な細胞アッセイを提供することにある。

スルフィドロイコトリエン（ｓＬＴ）Ｌ、Ｔｅ３、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４は炎 症性メディエータ−であり、従前にはまとめてアナフィラキシ−の遅反応性物質 （ＳＲ３−Ａ）と呼ばれていた。これらは、組織の肥満細胞、血液の好塩基球、 マクロファージ、好酸球および腎臓のメサンギウム細胞などの多くの細胞タイプ で合成される。これらは、炎症やアレルギー反応などの病理的事象、とりわけＩ ｇＥにより媒介されたアレルギー反応において重要な役割を担っている（ンユラ イマー（Ｓ　ｃｈｌｅｉｍｅｒ）ら、Ｊ　、　Ａｌｌｅｒｇｙ　ｃｌｉｎ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　、　７４．４７３〜４８１．１９８４）、特にサイトカイ ：／ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦで前処理した場合に（ビンヨッフ（ Ｂ　１ｓｃｈｏｆｆ）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７２．１５７７．１９９ ０）、血液の好塩基球がアレルゲンに応答してＩｇＨに依存した仕方でｓＬＴを 産生ずるということは特に興味がもたれる（ミタ（Ｍｉｔａ）ら、Ｐ　ｒｏｓｔ ａｇｌａｎｄｉｎｓ、　８６９〜８８６．１９８６）。それゆえ、理論的には、 現在の知識に基づいて、原因と思われるアレルゲンとの応答による好塩基球のｓ ＬＴ産生の決定は、アレルギーの診断において興味をもちえる。しかしながら、 実際には、本質的に多くの技術的困難のためにこの目的は未だ達成されていない 。本発明によれば、種々の部分的に新規で独創的な特徴の組み合わせからなる方 法が提供され、それによって、アレルギーおよび他の炎症性疾患のための日常的 なインビトロ細胞診断アッセイを確立することができる。

それゆえ、本発明の主題は、１または幾つかのモノクローナル抗ｓＬＴ抗体と表 示用酵素に結合したｓＬＴとの相互反応に基いた単一の免疫酵素ＥＬＩＳＡアッ セイによりグループＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４のスルフィドロイコトリ エンｓＬＴを検出する方法であって、該方法は、ｓＬＴを含有していると思われ る生物学的試料を担体に結合したモノクローナル抗ｓＬＴ抗体と接触させ、試料 中に存在するｓＬＴは該抗体に結合し、ついでｓＬＴと表示用酵素との結合体を 該付加担体に加え、最後に該担体に結合した結合体の量を評価する（該量は担体 に結合したｓＬＴの量と逆の相関関係にある）ことを特徴とする。

本発明の他の主題は、炎症性疾患の診断のためのインビトロ診断試験のために上 記方法を応用することである。

本発明のさらに他の主題は、該方法を行うための試薬のキットであり、該キット は、モノクローナル抗ｓＬＴ抗体をコーティングしたウェルを有するマイクロタ イタープレート、およびロイコトリエンと表示用酵素との結合体からなる。

そのようなアッセイは、以下の工程からなる。

１、ブライミング剤（ｐｒｉＩｌｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ）で前処理することによ り、血液の白血球、とりわけ好塩基球の反応性能を最適に高めること比較的短い 時間ブレインキュベーションすること、たとえば血液の白血球を特定のグループ のサイトカイン、すなわちＩＬ−３（インターロイキン３）、ＩＬ−５（インタ ーロイキン５）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（ｌ［Ｉ粗球／ＪＩＬ球コｏ＝−刺激因子） またはＮＧＦ　（神経成長因子）とともにインキュベーション（５〜１０分）す ると、アレルゲン（感作したアレルギー患者の白血球の場合）や補体成分Ｃ５ａ およびＣ３ａ、種々の塩基性ペプチドまたは細菌由来の構造、たとえばホルミル −メチル−ペプチド（ｆ　ＭＬ　Ｐ）などの非特異的メディエータ−放出因子な どの適当な刺激剤で攻撃した場合に、これらの細胞がメディエータ−を産生じ放 出する能力を著しく高める効果のあることが本発明者のグループにより記載され ている。このような現象は「ブライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）　Ｊとして記載さ れている。

しかしながら、現在までに行われている実験はすべて、勾配遠心分離によって得 られる単離単核白血球において行われており、これは面倒であるし、該反応の結 果に影響を与えるかもしれない血漿因子の幾つがとともに単球や血小板などの幾 つかの関与する細胞性反応パートナ−をも除去する可能性がある手順である。

本発明者は、全白血球または希釈した全血を精製ヒト組換えサイトカインまたは 活性化リンパ球細胞の培養液の適当に調製した上澄み液で前処理することにより 同様の結果を遂に達成した。できるだけ少ない数の血球およびできるだけ少ない 容量の血液から高い感度およびｓＬＴの高い放出を得るために最適のブライミン グが必要であるので、実施例３に記載しであるような全希釈血液のブライミング を達成するための好ましい条件が、試験を最終的に行い日常的な診断に応用する ために最も重要である。

■、アレルギーの検出における特定のアレルゲンによる血液白血球に対するｓＬ Ｔの産生への刺激 上記適当な前処理および「ブライミング」の後、勾配遠心分離または当該技術分 野で公知の他の方法により単離したものか、または全希釈血液中の懸濁液として の血液白血球を、適当な培地中で特定のアレルゲン（花粉抽出物、家屋ダニ抽出 物など）の存在下に数分〜１時間置く。

実施例３に記載するような古典的な実験手順において、推定アレルギー患者の血 液白血球を液体の形状の種々の投与量のアレルゲンとともに処理する。

所要の期間インキュベートした後、細胞を遠心分離にかけ、上澄み液を回収し、 下記ｓＬＴＩｓＡアッセイにおいて産生されたｓＬＴの量を別々に分析する。し かしながら、この方法は、アレルゲン当たりの幾つかの投与量の使用や１回の遠 心分離工程を含む多数の操作が含まれているため、日常的な診断法としては不都 合である。

驚くべきことに、細胞の適当な刺激およびサイトカインでブライミングした血液 白血球によるｓＬＴの産生のために、固相に結合したものとしてアレルゲンをも 細胞に加えることができることがわかった。このことは、アレルゲン特異的なＩ ｇＥ抗体の血清学的ＲＡＳＴアッセイに使用するものと同様に、マイクロタイタ ープレートのプラスチックまたはニトロセルロース底にアレルゲンを吸着または 結合させるか、またはアレルゲンをカップリングしたセルロースディスクの形態 で行うことができる。グルタルアルデヒドやポリリンンを用いた固体表面の前処 理によって、ビオチン−アビジンカップリング系によってまたは共有カップリン グ試薬によって可能となるものなどの、単位表面積当たりの高アレルゲン濃度を 得るための適当な結合条件が好ましい。この方法では、細胞上澄み液中で測定す べきｓＬＴの最適の産生および放出を得るためにアレルゲンとの単一投与量のイ ンキュベーションが必要であるという素晴らしい実際的な利点が得られる。

他の環境下でのｓＬＴの産生の検出およびＩｇＥ特異的アレルギー以外の疾患の 診断のために同様の手順を用いることができる。たとえば、種々のタイプの免疫 不全症およびリューマチ性疾患のような炎症性疾患における血球の反応性能を評 価するために、成分成分Ｃ５ａまたはＣ３ａなどの多くの非特異的刺激剤並びに ｆＭＬＰなどの細菌構造で攻撃した場合の血液白血球のｓＬＴ産生能を用いるこ とができる（実施例５）。血液または組繊細胞（生物学的流体（たとえば、滑液 、尿）を含む）によるｓＬＴの自発的産生を用いて炎症性疾患の程度の評価を行 うことができる。その場合、まず抽出または吸着クロマトグラフィーカラム上に 通すことによってｓＬＴを濃縮する必要がある。

同様にして、この新規試験は、ＩｇＥ媒介アレルギーと同じメディエータ−を炎 症細胞が産生ずるがその誘発機構が異なるいわゆる偽アレルギー（ｐｓｅｕｄｏ −ａｌｌｅｒｇｉｅｓ）の診断にも用いることができる。古典的な例は、アスピ リンおよび他の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）に対する非耐性反応で ある。この場合、これら薬剤は、ＩｇＥ媒介による好塩基球活性化とは異なるあ る種の他の機構によって非耐性患者においてヒスタミンおよびｓＬＴの産生およ び放出を引き起こす。しかしながら、正確な機構については未だわかっていない 。すべての可能な反応性細胞を包含する全血は、インビボの状況を模倣した培地 を提供する。非耐性患者においては、アスピリンまたはＮ５ＡＩＤｓを全白血球 または全血液懸濁液に加えるとｓＬＴの産生がもたらされ、このことは本発明の 新規なアッセイによって検出することができる（実施例３、図８参照）。このよ うにして、この新規なアッセイは、偽アレルギーをインビトロで診断する可能性 を初めて提供するものである。

現在までのところ、偽アレルギーの疑いを確かめる唯一の可能性は当該薬または 剤をインビボ誘発試験のために患者に投与することであったが、これは患者にと って不都合で危険でさえある手順である。この新規なｓＬＴ試験はまた、診断目 的のため、インビトロで検出することが困難であるか不可能であった多くの他の アレルギーおよび偽アレルギー、たとえば食物および食物添加物、薬剤および他 の化学剤、空気の汚染物質などに対する非耐性反応などを開発する可能性をも提 供する。

ＩＩｌ、ｓＬＴの検出 この新規アッセイの鍵となる要素は、行うのが容易な単一の免疫酵素アッセイに おいてすべてのｓＬＴを定量的に評価するために開発した方法である。

現在までのところ、生物学的材料中のロイコトリエン（ＬＴ）濃度を決定するた めの好ましい分析法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびラジオ イムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）であった。ＨＰＬＣの利点は、各種ＬＴを一つのア ッセイで決定できることである。しかしながら、この利点よりも、検出がナノグ ラムの範囲に限られていることおよびＨＰＬＣに供する前にすべての試料を充分 に精製しなければならないという欠点の方が大きい。

このためにＨＰＬＣは日常的な診断法としては用いることができない。対照的に 、ＲＩＡは非常に高感度な分析法であり、試料（血清、血漿または細胞培養上澄 み液など）を精製することなく用いることができる。しかしながら、ＲＩＡは放 射能試薬を用いるという反対圧力の高まっている手順を含むという欠点がある（ 高い製造物コストを包含する）。さらに、最近まで、そのようなアッセイにはＬ Ｔに対して充分な親和性と親和力を有するポリクローナル抗体しか利用できなか った。とりわけ、ＬＴＣ４に対して高い特異性を有するごくわずかのポリクロー ナル抗体が記載されているにすぎない（リンドグレン（Ｌ　ｉｎｄｇｒｅｎ）ら 、（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１５２．８３〜８８．１９８３：ウィナルダ（Ｗｙｎ ａｌｄａ）ら、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、　５６．１８６２〜１８６５．１９８４ ）。

ＬＴＤ４　（活性化細胞によって産生される主要なｓＬＴである）、およびＬＴ Ｄ４およびＬＴＥ４　（ＬＴＤ４の主要な代謝産物である）（ラインケ（Ｒｅｉ ｎｋｅ）　ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１０８ １．２７４〜２７８．１９９１）に対して厳密に特異的なモノクロ・−ナル抗体 を利用できることによって決定的な進歩が可能となった。このようにして、活性 化細胞のすべての関連するｓＬＴ産物を単一のラジオイムノアッセイまたは免疫 酵素アッセイで評価することが可能となった。そのようなモノクローナル抗体を 用いて、ＥＬＩＳＡアッセイが最近記載されている（ラインケら、Ｂ　ｉｏｃｈ ｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　１０８１．２７４〜２７８．１９９１）。このアッセイにおいて、 ＬＴＥ４をラン血清アルブミンに結合させ、マイクロタイタープレートのウェル にコーティングしている。ビオチン化した抗ｓＬＴモノクローナル抗体をｓＬＴ を含有する分析試料と反応させ、ついでＬＴＥ４−ＢＳＡをコーティングしたマ イクロタイタープレート中でインキュベートし、アビジン結合ペルオキシダーゼ を用いて呈示する。この方法は、日常的なアッセイとしては幾つかの欠点を有す る。（ａ）その感度は最適（約１０１００ｐではなく、そのため一層多量の細胞 を必要とする：　（ｂ）試薬の調製が面倒であり、その安定性も最適には及ばな い；　（Ｃ）必要とされる高価な合成ＬＴＥ４の量が極めて大きい、（ｄ）生物 学的流体や組織液などの高タンパク質含量の試料を用いた場合には精度は満足の いくものではない。

以上のことから、本発明者らは、感度を高め、操作工程を減少させ、試薬の調製 および質を改善し、並びに生物学的流体中でのｓＬＴアッセイを行うことを可能 とすることを目指して、別のＥＬＩ　ＳＡ法を研究した。この変法（下記に示す ）も本発明の一部である。

添付の図面および図表並びに実施例で本発明を説明する。

図ＩＡおよび図ＩＢは、アレルギーおよび炎症性疾患の診断に使用するための、 それぞれ１工程および２工程の５ＬＴ−ＥＬＩＳＡ−試験の概略の図を示す。

図２は、図表中で、固相モノクローナル抗ｓＬＴ抗体によるＬＴＤ４／ＡＰ反応 混合物からのホスファターゼの捕捉を示す。

図３は、１組みの２つの図表中で、（ＬＴＤ）−ＡＰと抗ｓＬＴ抗体との異なる 組み合わせを用いた抑制ＥＬＩ　ＳＡによるＬＴＤ４検出を示す。

図４は、図表中で、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡによるｓＬＴ測定の相関関係を示す 。

図５は、図表中で、単離ヒト単核細胞（ＭＮＣ）のアレルゲン誘発ｓＬＴ生成お よびヒスタミン放出を示す。

図６は、１組みの２つの図表中で、希釈全血液中でのアレルゲン誘発によるｓＬ Ｔ生成のＥＬＩ　ＳＡ検出を示す。

図７は、１組みの２つの図表中で、１２人の個体における、単離単核細胞により または全血液中で生成したｓＬＴまたはヒスタミンの量の相関関係を示し、これ ら細胞は抗ＩｇＥ抗体で攻撃した。

図８は、１組みの３つの図表中で、５つのアレルゲン（６−草木（６−Ｇｒａｓ ｓｅｓ）　、シラカンバ、ダーマトファゴイデス・ブテロニシヌス、ヨモギ、オ オバコ）で試験した３８人の患者からの皮膚試験、ＲＡＳＴおよびｓＬＴ産生の 比較を示す。

図９は、図表中で、ｓＬＴアッセイにおけるアセチルサリチル酸（Ａ　Ｓ　Ａ） で攻撃したアスピリン感受性の患者のｓＬＴ産生を示す。

図１０は、一連の図表中で、２人のドナーのＩＬ−３でブライミングしたおよび 未処理の（ＨＡＣＭ単独）希釈全血液の２時間、４時間および６時間後のｓＬＴ 放出の比較を示す。

要約すると、モノクローナル抗ｓＬＴ抗体をいかなる修飾を施すことなく、マイ クロタイタープレートまたは池の固相にトロセルロース膜など）上に、グルタル アルデヒドやポリリノンなどのコーティング剤の助けをかりて、またはビオチン −アビジンカップリング系の助けをかりて直接的に、または抗マウスＩｇＧ抗体 の助けをかりて間接的にコーティングする。そのようなコーティングマイクロウ ェルとともに分析試料をインキュベートすると（図ＩＡおよびＩＢ）、細胞によ って産生されたｓＬＴが直接結合する。アッセイの呈示工程は、ＬＴＤ４−また はＬＴＥ４−アルカリホスファターゼ結合体を単に添加することで得られ、その 結合は、結合した試料のｓＬＴの量に正比例した相関関係で抑制される。そのよ うな簡便化したｓＬＴ抑制ＥＬＩＳＡアッセイでは、結合体の製造のために実質 的に少しの合成ロイコトリエンしか必要でなくなり、感度および試薬の安定性も 向上し、全血中の少数の好塩基球により産生されたｓＬＴを開側かつ有効に決定 することができる。

これらアッセイおよびその診断目的への応用の正確な記載は下記実施例に示す。

報告した技術的条件は一般的な性質のものであり、制限的なものではなく、追及 している目的、すなわち適当かつ正確な試薬およびアッセイ条件のために境界を 設定したものである。

実施例１ アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはコリンエステラー ゼなどの免疫酵素とのＬＴＤ４または他のｓＬＴ結合体の調製合成ＬＴＤ４をグ ルタルアルデヒド活性化アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（リン酸緩衝食塩水ｐ Ｈ７，４中に０．２％グルタルアルデヒドおよび１７５ｎＭ）と室温にて２時間 結合させた。ついで、この結合体を４℃で一夜透析するかまたはＦＰＬＣにより 精製した。透析またはＦＰＬＣ精製後、１％ＢＳＡ　（ｗ／ｖ）を加え、ＬＴＤ ４−ＡＰの調製物をアリコートにて貯蔵した。

カップリング反応に用いたＬＴＤ４の量を変化させると異なったＬＴＤ４／ＡＰ 比が得られ、抗ｓＬＴ抗体によって検出されるホスファターゼ活性の量も異なる （図２）。

図２の図表・ ＡＰ溶液をグルタルアルデヒドの存在下で増加量のＬＴＤ４と反応させた。

ホスファターゼの結合したＬＴＤ４を検出するため、反応混合物をＧａＭコーテ ィングマイクロウェル中、４℃で４時間、抗ｓＬＴモノクローナル抗体ＩＡ−Ｌ ＤＲＩ　（最終希釈はそれぞれ１／２５および１１５００）（１ｕｍ／ウェル） とともにインキュベートした（黒丸）。非特異的結合については、抗ｓＬＴ抗体 を用いずに同様にして決定した（白丸）。ＰＢＳで３回洗浄した後、ホスファタ ーゼ基質ｐＮＰＰを加え、３７℃で４時間後に４０５ｎｍにおける吸光度を測定 した。データは２回分の平均値である（変化の範囲はく１５％）。ＢＧは、ｐＮ ＰＰ単独での自然加水分解を示す。

ＬＴＤ４／ＡＰの結合体比が４＝１〜２０１であるのが感度という点でアッセイ を行うのに最適であるのが実験的にわかった。そのような結合体では、抗ｓＬＴ 抗体をコーティングしていないマイクロタイタープレートウェルへの非特異的な 結合が実際的には認められず、それゆえｓＬＴアッセイにおいて非常に低いバッ クグラウンドを示す。そのような結合体はまた、適当な貯蔵条件下では６力月以 上にもわたって安定であることもわかった。

実施例２ ＳＬＴ−ＡＰに基づ＜ｓＬＴ　ＥＬＩＳＡアッセイの手順および有効性上記のよ うに、マイクロタイタープレートウェルや当該技術分野で公知の他の固相容器に トロセルロース膜など）を、場合によってはグルタルアルデヒドやポリリシンま たはビオチン−アビジンカップリング系の助けをかりて抗ｓＬＴ抗体で直接コー ティングすることができる。しかしながら、好ましい方法は、抗マウスＩｇＧ抗 体と抗ｓＬＴ抗体との混合物でウェルをコーティングすることである。というの は、このことによって感度が著しく向上し、ウェル当たりに必要な抗ｓＬＴ抗体 の量が減少するからである。マイクロウェルを適当にコーティングした後、分析 試料および所定量のＬＴＤ４−ＡＰ結合体を加え、４℃にて３０分から４時間の 期間インキュベートする。

洗浄後、バラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（１ｍｇ／ｍｌ）を加 え、リン酸検出緩衝液（ンエタノールアミン９７ｍ１．ＭｇＣ１２６ＨｚＯ：１ ００ｍｇ；１０１００Ｏの８２０当たりアジ化ナトリウム領２ｇ：ｐ８９．８） 中、３７℃で１〜４時間インキュベートすることにより、結合したホスファター ゼを呈示させる。ついで、適当な濃度計で４０５ｎｍにおける溶液の吸光度を測 定する。

図３に示すように、ｓＬＴＩＳＡ試験の最適条件は、コーティングした抗ｓＬＴ 抗体の量および呈示に用いたＬＴＤ４−ＡＰ結合体の量を変えることによって見 いだすことができる。

図３の図表： 上のパネルは、一定量の（ＬＴＤ４）４−ＡＰ　（最終希釈１／２５）において 抗ｓＬＴモノクローナル抗体ＩＡ−ＬＤＲＩの濃度を変えた効果を示す。

下のパネルは、所定の希釈（１１５００）の抗ｓＬＴモノクローナル抗体ＩＡ− ＬＤＲＩにおいて異なる量の（ＬＴＤ４）４−ＡＰを用いて得られた抑制曲線を 示す。ＮＳＢは、（ＬＴＤ４）−ＡＰの非特異的な結合、すなわち抗ｓＬＴ抗体 の不在下での結合を示す。データは、２回分の平均値である（変化の範囲はく１ ５％）。

図３の条件下では、下限の検出限界はｆ３ｐｇ　ＬＴＤ４／１００μｍ試料であ り、標準ＬＴＤ４曲線の５０％抑制は約６５ｐｇＬＴＤ４で得られた。

これは、これまでに報告された関連する５ＬＴ−ＥＬＩ　ＳＡ　（ラインヶら、 Ｂ　ｉｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１０８１．２７４〜２７ ８．１９９１）に比べて１０倍以上感度が良く、アッセイに必要な高価な合成ｓ ＬＴ試薬の量も４０倍も少ないことを示している。そのような感度の増大の重要 な実際的帰結は、マルチプルアッセイ、たとえば幾つかの異なるアレルゲンに対 する患者の血球の反応の検出を遥かに少量の血液試料を用いて行うことができる ことである（たとえば、アッセイ当たり２５μｍ血液、実施例４参照）。感度の 低いアッセイでは、日常的な診断に必要な血液の量は容認できないものとなる。

このアッセイの絶対的な感度は、ＡＰへのＬＴＤ４の結合の条件を修飾すること によって、たとえばポリマー化ＡＰを用いることによりおよび／または最適の結 合体のフラクションをＦＰＬＣ精製によって選択することにより、なお増大させ ることができる。シグナル生成工程はまた、たとえばマイクロタイター発光造影 （ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇ）と組み合わせて発光生成（ｌｕ ｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）ホスファターゼ検出試薬（たとえば、ＡＭＰＰＤ）を用い ることニヨッテ（メリー（Ｍａｌｙ）　ら、Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　 １６８．４６２〜４６９．１９８８）、またはＮＡＤＰ／アルコールデヒドロゲ ナーゼージアフオラーゼｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット系による 酵素増幅を用いることによって（セルフ　（Ｓｅｌｆ）　、Ｊ、　Ｉ　ｍｍｕｎ ｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　７６．３８９〜３９３．１９８５）高めることができる 。本発明の目的は、ｓＬＴＩｓＡアッセイによるアレルギーの日常的な診断のた めの可能な限り簡便で低層な方法を提供することにある。しかしながら、実施例 ２．３および４に記載した条件は、現在までにわかった最も最適に近い解決を示 すものにすぎない。ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡによるＳＬＴ測定の相関関係を決定 するための試験において、イオノマイシン刺激したＭＮＣ上澄み液中のｓＬＴの 量をＥＬＩＳＡ（ｙ軸）およびＲＩＡ（ｘ軸）により測定した。図４に示すよう に、５ＬＴ−ＥＬＩＳＡアッセイの感度は利用できる最良のＲＩＡのものと同じ オーダーであり、得られる結果もＲＩＡで得られる結果と非常に良い相関をなし ており、また経費もわずかで済み、しかもＲＩＡにより引き起こされる不都合（ 環境に対する危険、試薬の短い貯蔵寿命）もない。

実施例３ アレルゲンに暴露した単離単核細胞または希釈全血により生成したｓＬＴの検出 のためのＥＬＩ　ＳＡによる２工程アツセイ２工程アツセイ（図ＩＡ）において 、好塩基球を含有する単核細胞懸濁液、白血球または希釈全血を第一の一連の容 器（試験管またはマイクロタイタープレートのウェル）中のアリコートに分配し 、ＩＬ３、ＩＬ５またはＧＭ−ＣＳＦなどの適当なサイトカインで前処理し、つ いで液相中かまたはある種の固相に結合させて提供したアレルゲンと反応させる 。インキュベーション後、容器を遠心分離にかけ、上澄み液を回収する。ついで 、これら上澄み液について第二の一連の容器（通常は、実施例２に記載のように 、抗ｓＬＴ抗体をコーティングし、５ＬＴ−ＥＬＩＳＡのために処理したマイク ロタイタープレートのウェル）中でｓＬＴの含量を分析した。

好塩基球を含有する末梢血単核細胞懸濁液（ＭＮＣ）を調製するため、ＩＱｍＭ 　ＥＤＴＡで抗凝血処理した血液を０２５容量の６％デキストランと混合し、赤 血球を室温で９０分間沈降させる。白血球を遠心分離（１５０ｇ、室温で２０分 間）により上澄み液からペレット化し、ＨＡ緩衝液（２０ミリモルＨｅｐｅｓ、 １２５ミリモルＮａＣｌ、５ミリモルＫＣＩ、０．５ミリモルグルコースおよび ０．０２５％ＢＳＡ）中に再懸濁する。ついで、フィコール−ハイバック（Ｆ　 １ｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配（比重１．０７７）遠心分離（６００ ｇ、室温で４０分間）により細胞をさらに分画する。ＭＮＣを境界面から回収し 、ＨＡ緩衝液中で３回（１５０ｇ、４℃で１０分間）洗浄し、最後に１０７また は５Ｘ１０’細胞／ｍｌの細胞密度にてＨＡＣＭ緩衝液（１ミリモルＣａＣ１， および１ミリモルＭｇＣｌ。を添加したＨＡ緩衝液）中に再懸濁する。別法とし 、て、デキストラン沈降した白血球を洗浄することなく直接用いることもでき、 ついで遠心分離およびＨＡＣＭ緩衝液中に再懸濁する。

白血球または単核細胞によりｓＬＴを産生させるため、平底マイクロタイタープ レート中で１００　ｔｌ］　／ウェルのＨＡＣＭ緩衝液中の細胞懸濁液を３７℃ で１０分間加熱する。ＩＬ３またはＧＭ−Ｃ５Ｆ　（５０μｍ、最終濃度１０ｎ ｇ／ｍｌ）またはＨＡＣＭ緩衝液を同時にか、または刺激剤（５０μｍ、アレル ゲン抽出物またはＣ５ａやｆＭＬＰなどの非特異的な刺激剤）を加える前に１０ 分間加える。刺激剤を添加してから３０〜４０分後にマイクロタイタープレート を氷上で冷却することによって反応を停止させる。遠心分離（６００ｇ、４℃で ５分間）した後、上澄み液（１００μｍ）をＥＬＩＳＡアッセイマイクロタイタ ープレートに移し、ｓＬＴについて実施例２に記載したようにしてアッセイする 。

図５の図表は、単離ヒト単核球細胞（Ｍ！’；Ｃ）によるアレルゲンにより誘発 されたｓＬＴ生成およびヒスタミン放出を示す。ダニアレルギーのドナー（Ａ、 　Ｕ、　）からのＭＮＣ（２，５Ｘ　１０’／ウエル）をマイクロタイターウェ ル中、増加量のダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄ　ｅｒｓａｔｏｐｈａｇｏ ｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）アレルゲン（ＤＦ）で刺激した。４０分後に上澄み液 を回収し、本明細書に詳記するように、ｓＬＴの生成およびヒスタミンの放出を それぞｔｔＥＬＩｓＡおよびＲＩＡにより決定した。自発的なヒスタミンの放出 は１゜２％であった。データは２回分の平均値である（変化の範囲は〉１５％） 。

図５に示すように、家産ダニダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍ ａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ　ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）に対してアレルギー 性の個体の単離ＭＮＣ（２５００００／マイクロウエル）は、増加量の関連アレ ルゲンに応答してｓＬＴを産生ずる。これらｓＬＴは５ＬＴ−ＥＬＩＳＡによっ て容易に検出することができ、これら放出にはヒスタミンの相関放出を伴ってい た。

ＭＮＣは約１％の好塩基球を含有し、ｓＬＴ測定のために全インキュベート（２ ５０μｌ）のうちの１００μｌＬか用いないので、この５ＬＴ−ＥＬＩＳＡは約 １０００個の好塩基球からのｓＬＴの生成を検出する。５ＬＴ−ＥＬＩＳＡに用 いるインキュベーション容量および上澄み液の容量を変えることにより、もっと 少数の単核細胞を用いてアッセイすることができる。

しかしながら、臨床用の日常的な応用のためには、単核細胞の単離を回避し試験 を全血において直接行うことができるならばｓＬＴアッセイの実用性は遥かに向 上させることができるであろう。驚くべきことに、５ＬＴ−ＥＬＩＳＡアッセイ に血液血漿タンパク質が含まれていても５ＬＴ−ＥＬＩＳＡアッセイにおけるｓ ＬＴ回収に著しい影響を及ぼさず、血漿濃度に依存して７０〜９０％の間である 。それゆえ、希釈した全血中でアレルゲンの刺激により産生されるｓＬＴの検出 は実行可能であると思われる。

このアッセイのため、静脈からの全血をヘパリン（最終濃度１２Ｕ／ｍｌ）とと もに適当な密閉容器中に導入する。ＨＡＣＭ緩衝液で１．４に希釈したヘパリン 処理血液（ウェル当たり１００μｍ）をマイクロタイタープレート中にピペット で入れ、その後は上記単離単核細胞について記載したのと全（同じ手順を行う。

アレルゲンのダーマトファゴイデス・ブテロニシヌスは、ダニアレルギーの個体 からの希釈全血でｓＬＴの放出を刺激する。対照的に、この個体がアレルギーで ない無関係のアレルゲン、フレラム・プラテンセ（Ｐ　ｈｌｅｕｍ　ｐｒａｔｅ ｎｓｅ）は、ＩＬ３でブレインキュベートした細胞においてさえもｓＬＴの有意 の放出を引き起こさない。ダニアレルゲンにより誘発されるｓＬＴ生成の特異性 は、ＩＬ３ｒブライミング」を行いまたは行わずにいずれのアレルゲンで攻撃し た場合でも、アレルギーでない個体はｓＬＴ生成を示さないという事実によって さらに示される。

この試験においては全血が２５μｍしか必要ではなく、これは同じ個体での複数 の日常的アッセイに極めて適している。

１組みの２つの図表において、図６は全血中でのアレルゲンによって誘発された ｓＬＴ生成のＥＬＩＳＡ検出を示している。ダニアレルギードナー（左のパネル ）および非アレルギードナー（右のパネル）からのヘパリン処理面ｆ＆（２５μ ＋／ウエル）を、ＩＬ−３（Ｌｏｎｇ／ｍｌ）を前以て添加して（黒の柱）また は前以て添加することなく（白の柱）、ダーマトファゴイデス・ファリネ（ＤＦ ）抽出物またはフレラム・プラテンセ（ＰＰ）抽出物で刺激した。３７℃で４０ 分後に上澄み液を回収し、本明細書に詳記するようにしてｓＬＴ含量をＥＬＩＳ Ａにより測定した。データは２回分の平均値であり、範囲はく１５％である。比 較を容易にするため、ｓＬＴは、試料中に存在する全ヒスタミン、血液の好塩基 球含量の測定値に関連して、すなわちヒスタミンの全量（ｎｇ）当たりのｐｇ　 ｓＬＴとして表しである。

図６に示す結果は、約１００〜３００個の好塩基球によるｓＬＴ産生を反映して おり、単離ＭＮＣを用いた実験で期待される範囲にある。図７に示すように、希 釈全血で得られる結果と単離ＭＮＣで得られる結果との間には優れた相関関係が 存在する。

図７は、１組みの２つの図表において、１２人の個体において単離単核細胞（Ｐ ＢＬ）によってまたは全血中で産生された５ＬＴ（上のパネル）またはヒスタミ ン（下のパネル）の量の間の相関関係を示す。細胞を抗ＩｇＥ抗体（１００μｇ ／ｍｌ）で攻撃した。

このことは、同じ上澄み液で平行して行ったヒスタミン放出での経験とは対照的 である。ヒスタミン放出の場合、相関関係は、明らかにある種の細胞および／ま たは血漿タンパク質がヒスタミン決定に干渉するために遥かに印象が薄かった。

この観察は、全血におけるアレルゲン誘発反応の検出のためのｓＬＴＩＳＡアッ セイの独特の位置を強調している。

図８は、１組みの３つの図表において、５つのアレルゲン（６−草木、シラカン バ、ダーマトファゴイデス・ブテロニシヌス、ヨモギ、オオバコ）で試験した３ ８人の患者からの皮膚試験、ＲＡＳＴおよびｓＬＴ産生の比較を示す。皮膚試験 と平行しておよびアレルゲン特異的なＩｇＨのための古典的な血清学的ＲＡＳＴ と平行して得られた結果は、ｓＬＴアッセイと皮膚試験、それゆえ患者の臨床状 態との間には、ＲＡＳＴアッセイと皮膚試験との間に比べて一層良好な相関関係 が存在することを示している。このことは、アレルギー過敏を検出するために細 胞アッセイを用いることの理論的利点が初めて実際に確認されたことを示してい る。ＩｇＥ抗体を血清学的に検出することのできない偽アレルギーを診断する可 能性もまた、アスピリン（Ａ　Ｓ　Ａ）の攻撃によるｓＬＴの放出を示す結果に より確認される（図９）。攻撃により細胞がｓＬＴを産生ずる能力は、モノクロ ーナル抗１ｇＥ抗体により常にチェックされる（Ｌｅ２７、陽性コントロール、 図９）。

ここに示す結果は液相中にあるアレルゲンを添加して得られたが、細胞との最初 のインキュベーションに用いるウェルの底のコーティングとしてまたはアレルゲ ンをコーティングしたセルロースディスクおよび／またはプラスチックビーズ、 マイクロプリシピテーツ（＋ａｉｃｒｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）などとして の固相上のアレルゲンを添加することにより同様の結果を得ることもできる（表 １）。

表１　種々の形態のアレルゲンでの攻撃によるｓＬＴの産生アレルゲン　添加シ タ全　Ｎｂｍｍ／ＱｘルｓＬＴ　（ｐｇ／１００Ｉ１１）アレルゲン　（ＭＮＣ ） 流体の形状の ダーマトファゴイデス・　１０ｎｇ　１０’　６５〜ｉ５ｏ　（ｎ＝５）ダーマ ト７７ゴイデス・　８μｇ　１０５　４０〜１２０　（ｎ＝３）ブテロニシヌス ウェル上に吸着した ダーマトファゴイデス−５μｇ　１０Ｓ　５５〜１３０　（ｎ＝３）プテロニン ヌス このことは意味のあることである。というのは、溶液中のアレルゲンの１組みの 装置を用いた場合に比べて一層経済的で実際的な仕方で複数のアレルゲンを用い た調製診断キットが可能となるからである。

実施例４ アレルゲンに暴露した単離単核細胞または希釈全血により産生されたｓＬＴの検 出のためのＥＬＩ　ＳＡによる１工程アッセイ実施例１ａおよび実施例３に記載 した２工程アツセイにおいては、単離ＭＮＣまたは全血球とブライミングリンホ カインとのブレインキュベーションとその後のアレルゲンまたは非特異的な刺激 剤とのインキュベーションは第一の一連の別々の容器中で行い、上澄み液を回収 するために遠心分離工程を必要とする。ついで、これら上澄み液を、５ＬＴ−Ｅ ＬＩＳＡを行うために調製した第二のマイクロタイタープレート中で分析する。

これから記載しようとする１工程アツセイでは、すべての操作は同じマイクロタ イター−プレート中で行い、遠心分離および回収工程を省くことができ、試験が 一層実際的で経済的なものとなる。

図１ｂに示すように、抗ｓＬＴ抗体で前以てコーティングした５ＬＴ−ＥＬＩＳ Ａに必要なマイクロタイタープレートを、目的とする刺激剤、たとえばアレルゲ ンまたはアレルゲン混合物でも同時に前以てコーティングした。

この方法において、必要な操作の数および順番は：（ａ）単離ＭＮＣまたは希釈 全血の添加（ｂ）ＩＬ３などのブライミングサイト力インの添加および長くした インキュベーション （Ｃ）遠心分離工程を行うことなしに洗浄（ｄ）ＬＴＤ４−ＡＰ結合体の添加 （ｅ）濃度計の読み取り 操作は著しく減少し、簡便化される。それらはまた、すべて同じ容器中で行う。

この結果、臨床診断に必要な結果の質に影響を与えることなく、材料、時間およ び操作の簡便性において著しい利点が得られる。

詳細な手順および使用した試薬の濃度は、実施例２および３に記載した指示に従 う。１工程法により得られる結果の一例を表２に示す。

表２１工程ｓＬＴアツセイからの結果 アレルゲン　使用した全　細胞数／眞ル　ｓ　ＬＴ　（ｐｇ／１００ａｌ）アレ ルゲン　（血液） （流体） １、ダーマトファゴイ デス・ブテロニシヌス アレルギー叡者　Ｌｏｎｇ　３ｘｌＯ’　３０〜１４０　（ｎ＝４）非アレルギ ー患者　Ｌｏｎｇ　３Ｘ１０’　Ｏ〜１０　（ｎ＝４）２、チモシー・ポレン −（Ｔｉｍｏｔｈｙ　ｐｏｌｌｅｎ） アレルギー患者　５ｎｇ　２ｘｌＯ５４５〜１８０　（ｎ＝５）非アレルギー患 者　５ｎｇ　２ｘｌＯ５０〜１０　（ｎ＝４）この１工程アツセイの一般的な使 用の唯一の制限は、ウェル中にコーティングしたアレルゲンと、使用した幾つか の試薬、とりわけ、過剰に存在しアレルゲンを中和するかもしれない血清抗体と の干渉によるものである。その場合、アレルゲンをコーティングしたディスクの 使用および／または血漿タンパク質を除去するための遠心分離工程が必要である かもしれない。

アッセイの最終形態がいかなるものであれ、ここに記載した形態の５ＬＴ−ＥＬ Ｉ　ＳＡアッセイは、経済的で有効なインビトロアレルギー診断に明らかに適し た細胞アレルギー診断アッセイの最も重要なタイプを表している。

実施例５ 炎症性疾患および免疫不全疾患における診断目的の５ＬＴ−ＥＬＩＳＡアッセイ の使用 実施例２．３および４に示した一般的手順を用い、ｓＬＴの自発的生成に従うか または種々の非特異的刺激剤（イオノマインン、補体成分Ｃ５ａまたはｍ１ＷＩ 関連ｆＭＬＰなど）で攻撃することにより、炎症性血球または組織および生物学 的流体細胞の反応性を評価することが可能である。適当な刺激剤を選択すること により、希釈全血を用いた場合にも細胞の亜集団の反応性を評価することもでき る。

図１０は、−組みの図表において、２人のドナーのＩＬ−３でブライミングした 希釈全血および未処理（ＨＡＣＭ単独）希釈全血中での２．４および６時間後の ｓＬＴ放出の比較を示す。細胞をｆＭＬＰまたは抗１ｇＥ抗体で特別に攻撃した 。

図１０は、種々のドナーのｆＭＬＰ刺激剤への反応性並びにＭＮＣをＩＬ３で前 処理することのプライミング効果を示す。炎症性疾患の活動の進展および段階並 びに免疫不全のある種の病態はそれぞれ細胞の高反応性または低反応性によって 反映されるので、５ＬＴ−ＥＬＩＳＡ試験はそのような疾患の診断およびモニタ ーにおいて有用な役割を果たすことが期待される。

カップリング中のＬＴＤ４／ＡＰモル比ＲＩＡにおけるｓ　Ｌ　Ｔ　（ｐｇｌｏ 、　１■１）、１　１　１０　１００　１１００ ０ＤＦ（ｎ／ｍｌ） ア、、げ−ドナー　Ｆｉｇ、　６　非ア′ルギードナー皮膚試験 ｓＬＴ　（ｐｇ　／　１００　ｕｌ　）Ｆｉｇ、　９ Ｆｉｇ、　１０ 国際調査報告　ｅｌｒＴ／ｒｏ　Ｑり／ｎ？２１ｇフロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＢＲ，ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ　、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ 、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、ＮＯ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．組織および生物学的流体中のグループＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４の スルフィドロイコトリエンｓＬＴを単一の免疫酸素ＥＬＩＳＡアッセイにより検 出する方法であって、１または幾つかの抗ｓＬＴ抗体と表示用酸素に結合したｓ ＬＴとの相互反応に基づき、ｓＬＴを含有していると思われる生物学的試料を担 体に結合したモノクローナル抗ｓＬＴ抗体と接触させ、該試料中に存在するｓＬ Ｔは該抗体に結合し、ついでｓＬＴと表示用酵素との結合体を該付加担体に加え 、最後に該担体に結合した該結合体の量を評価し、該量は担体に結合した生物学 的ｓＬＴと逆の相関関係にあることを特徴とする方法。
2. ２．生物学的試料が、希釈全血、白血球、単核細胞の懸濁液、細胞培養の上澄み 液または尿である請求項１に記載の方法。
3. ３．マイクロタイタープレート上で複数の試料について同時に行う請求項１〜３ のいずれか一つに記載の方法。
4. ４．ストリップ装置上で複数の試料について同時に行う請求項１〜３のいずれか 一つに記載の方法。
5. ５．マイクロタイタープレートおよびストリップ装置よりなる群から選ばれた担 体にモノクローナル抗ｓＬＴ抗体が直接または間接的に結合している請求項１に 記載の方法。
6. ６．抗体がグルタルアルデヒド、ポリリシンによってまたはビオチン−アビジン カップリング系によって直接、または抗マウスＩｇＧ抗体のたすけを借りて間接 的に結合している請求項５に記載の方法。
7. ７．非常に少量の生物学的試料を用いて試験を行うことができるように、プライ ミング剤としてサイトカイン、たとえばＩＬ３、ＩＬ５またはＧＭ−ＣＳＦを用 いて生物学的試料中の細胞をプライミングする請求項１〜６のいずれか一つに記 載の方法。
8. ８．プライミングした細胞をｓＬＴを放出させるためにアレルゲンと接触させる 請求項７に記載の方法。
9. ９．アレルゲンを液体の形態または担体に結合した形態にて加える請求項８に記 載の方法。
10. １０．ｓＬＴを放出するための細胞の活性化を含む全手順を、各試料について単 一の反応容器中で行う請求項９に記載の方法。
11. １１．ｓＬＴの放出のための細胞の活性化を別の反応容器中で行う請求項９のい ずれか一つに記載の方法。
12. １２．結合体において、合成ＬＴＤ４またはＬＴＥ４がアルカリホスファターゼ 、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはコリンエステラーゼに結合している請求項 １に記載の方法。
13. １３．各試験について５〜１０００μｌの生物学的試料を用いる請求項１に記載 の方法。
14. １４．炎症性疾患の診断のための診断インビトロ試験への請求項１〜１４のいず れか一つに記載の方法の応用。
15. １５．炎症性疾患がリューマチ性疾患、免疫不全、アレルギーまたは偽アレルギ ーである請求項１４に記載の応用。
16. １６．請求項１に記載の方法を行うための試薬のキットであって、モノクローナ ル抗ｓＬＴ抗体をコーティングしたウエルを有するマイクロタイタープレート、 およびロイコトリエンと表示用酸素との結合体からなることを特徴とするキット 。
17. １７．マイクロタイタープレートが部分的にモノクローナル抗ｓＬＴ抗体で、部 分的にアレルゲンでコーティングされている請求項１６に記載のキット。
18. １８．試料をプライミングするためのサイトカインをさらに含む請求項１７に記 載のキット。
19. １９．ＩＬ３、ＩＬ５、およびＧＭ−ＣＳＦよりなる群から選ばれたサイトカイ ンを含む請求項１８に記載のキット。