RU2554820C2 - Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину е - Google Patents
Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину е Download PDFInfo
- Publication number
- RU2554820C2 RU2554820C2 RU2013145847/15A RU2013145847A RU2554820C2 RU 2554820 C2 RU2554820 C2 RU 2554820C2 RU 2013145847/15 A RU2013145847/15 A RU 2013145847/15A RU 2013145847 A RU2013145847 A RU 2013145847A RU 2554820 C2 RU2554820 C2 RU 2554820C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- ige
- immunoglobulin
- cells
- percentage
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и представляет собой способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину Е, который заключается в связывании исследуемых антител с IgE человека в растворе с последующим инкубированием данного раствора с периферической кровью человека, индукцией дегрануляции клеток и последующим определением доли клеток с высоким уровнем экспрессии поверхностного маркера CD63 (CD63high) в популяции базофилов с фенотипом CD123+HLA-DR-. Изобретение позволяет существенно сократить сроки анализа и снизить его трудоемкость. 2 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к иммунологии, в частности к способам определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину Е человека, и может использоваться в биотехнологии, фармацевтике и медицине, например, при диагностике и лечении аллергических заболеваний, в частности бронхиальной астмы.
Бронхиальная астма - тяжелое хроническое заболевание дыхательных путей - наиболее распространенная патология среди аллергических и бронхолегочных заболеваний [Аллергические болезни: диагностика и лечение. Под редакцией Р. Паттерсона, Л.К. Греммера, П.А. Гринберга, Москва, Медицина, 2000]. В России, по разным источникам, бронхиальной астмой страдает от 2,2 до 5-7% населения, т.е. от 3 до 9,8 млн человек, значительная часть которых болеет в тяжелой форме, при которой малоэффективно лечение кортикостероидами.
Проявление бронхиальной астмы является аллергической реакцией, опосредуемой иммуноглобулином Е (IgE). Когда антиген, такой как пыльца, домашняя пыль или иной аллерген, попадает в организм, в крови появляются IgE, специфичные к такому антигену, которые связываются с рецепторами, расположенными на поверхности базофилов и тучных клеток. При дальнейшем контакте с антигеном данный антиген связывается с IgE с образованием комплекса антиген-IgE-рецептор, что приводит к немедленной активации рецептора и проведению в клетку сигнала, вызывающего дегрануляцию клеток, в ходе которой химические медиаторы (главным образом гистамин и лейкотриены) освобождаются из клеточных гранул и попадают в кровоток с последующим развитием аллергических симптомов.
Общепринятые подходы к лечению аллергии, в частности бронхиальной астмы, заключаются в системной терапии антагонистами химических медиаторов, такими как антигистамины и стероиды. Применение данных антагонистов направлено на десенсибилизацию пациентов и на уменьшение воспаления, однако оно обеспечивает только симптоматическую терапию, поскольку не направлено на вмешательство во взаимодействие IgE с клеточным рецептором, запускающее аллергическую реакцию. Кроме того, применение стероидов приводит к ингибированию общего иммунного ответа, что выражается в ряде нежелательных побочных эффектов.
В настоящее время разработан способ лечения, основанный на применении полипептидов, блокирующих связывание IgE с Fc-рецепторами на поверхности клеток, а также способных вытеснить IgE из комплекса с рецептором, если IgE с ним уже связан. Наиболее перспективным является применение для данной цели антител к IgE. Молекула IgE состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, сшитых вместе дисульфидными связями. Каждая цепь состоит из вариабельной и константной областей, первая из которых отвечает за связывание антигена, а вторая - за взаимодействие с рецепторами. При этом константная область тяжелой цепи IgE состоит из четырех участков, обозначаемых Ch1, Ch2, Ch3, Ch4. Высокоаффинное связывание IgE с рецептором FcεRI происходит в результате сложного взаимодействия участка Ch3 IgE с α-субъединицей рецептора. Для предотвращения такого связывания предложены антитела, в частности омализумаб [RU 2242515], TES-C21 [WO 2004070011], BSW17 [RU 2193413]. На основе гуманизированного антитела Е25 (омализумаб) выпускается препарат «Ксолар», который представляет собой IgG1kappa антитело, содержащее человеческую структурную основу с определяющими комплементарность участками мышиного антитела, связывающими IgE [health.mail.ru/drug/xolair/].
В настоящее время разрабатываются другие гуманизированные и человеческие моноклональные антитела, однако для выбора оптимальной технологии лечения, позволяющей осуществить быструю и надежную нейтрализацию биологической активности иммуноглобулинов Е человека антителами необходимо разработать методы, позволяющие сравнить их эффективность.
В настоящее время для определения биологической активности иммуноглобулинов Е человека предлагаются, как правило, способы, основанные на использовании клеточных линий животных, стабильно экспрессирующих рецептор FcεRI человека или его субъединицу альфа [Hakimi J, Seals С, Kondas JA, Pettine L, Danho W, Kochan J. The alpha subunit of the human IgE receptor (FcERI) is sufficient for high affinity IgE binding. J Biol Chem. 1990; 265(36): 22079-81]. Связывание IgE клетками таких линий с последующим взаимодействием связанного IgE с антителами к IgE, обладающими анафилогенной активностью, приводит к дегрануляции клеток, которая может быть зарегистрирована, в частности, по мобилизации клетками кальция [WO 2008099188]. Недостатком вышеуказанных способов является их громоздкость и длительность.
Также известны способы, основанные на использовании базофилов человека. При этом выделенные базофилы человека либо гепаринизированную кровь инкубируют с IgE, после чего индуцируют дегрануляцию клеток обработкой антителами к IgE, обладающими анафилогенной активностью. Далее клетки осаждают, в супернатанте и в клеточных лизатах, полученных путем многократного замораживания-оттаивания ацетилируют гистамин, количество которого определяют с помощью иммуноферментного анализа (RU 2242515). Нейтрализацию биологической активности иммуноглобулинов Е антителами определяют по концентрации антител, вызывающей 50% ингибирование биологической активности IgE в стандартных условиях эксперимента.
Так, в патенте WO 2008123999 клетки RBL-2H3(FcεRI) инкубируют с IgE человека и исследуемыми антителами в течение 48 часов, после чего отмывают от IGE-анти-IgE комплексов, оставляя на поверхности клеток только IgE, связанные с рецептором FcεRI. Эти IgE связывают поликлональными антителами, вызывая дегрануляцию клеток, уровень которой определяют по выходу гистамина, определяемого с помощью ИФА. Недостатком данного способа является его длительность и трудоемкость
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ определения нейтрализующей активности антител с использованием клеток базофильной клеточной линии крыс RBL-2H3, трансфецированных ДНК, экспрессирующей рецептор FcεRI человека(WO 2008099188). После выделения клона, стабильно экспрессирующего FcεRI, клетки культивируют в присутствии антибиотика, поддерживающего экспрессию рецептора. Для определения нейтрализующей активности антител 5×104 клеток высевают в ячейки планшета для культивирования клеток и подращивают при 37°C в среде, содержащей 5% CO2, с добавлением 400 мкг/мл антибиотика G418 в течение 18-24 часов, после чего клетки многократно промывают и к ним добавляют IgE человека вместе с разведениями исследуемых антител. О степени дегрануляции судят по мобилизации клетками кальция, кинетику которой (80 измерений с интервалом 1 сек и 40 измерений с интервалом 8 сек) регистрируют быстродействующим фотометром).
Недостатком данного способа является его длительность и трудоемкость.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание более быстрого и простого способа определения нейтрализующей активности антител к IgE.
Техническая задача состояла в исключении из процесса наиболее трудоемких стадий за счет использования поверхностного маркера CD63, который объединяет группу белков, являющихся компонентами лизосомальных мембран и переносимых на клеточную поверхность при активации базофилов и ряда других клеток.
Предлагаемое решение задачи основано на связывании с рецептором FcεRI базофилов свободного (ненейтрализованного) IgE. После отмывки клеток от IgE, исследуемых антител и комплексов антитела-IgE связывание избытка известных антител к IgE (поликлональные антитела козы к IgE человека) с комплексом IgE-FcεRI вызывает дегрануляцию базофилов и позволяет оценить нейтрализующую способность антител.
Технический результат достигается за счет того, что содержащий базофилы препарат - гепаринизированную кровь донора - инкубируют не менее чем с тремя смесями исследуемых антител с IgE человека, содержащих различные соотношения антител при 37±1°C, отмывают центифугированием, затем добавляют поликлональные антитела козы к иммуноглобулину Е человека и вновь инкубируют при 37±1°C в течение 30-40 мин. Реакцию прекращают введением этилендиаминотетраацетата (ЭДТА), добавляют меченные разными флуоресцентными метками антитела к CD63, CD 123 и HLA-DR, выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 30-35 минут, затем лизируют эритроциты, отмывают смесь центрифугированием и анализируют в проточном цитофлуориметре с последующим подсчетом процента активированных клеток с фенотипом CD63high из пула клеток с фенотипом CD123highHLA-DR-. В качестве положительного контроля используют формил-метионин-лейцин-фенилаланин, а в качестве отрицательного контроля - показатель клеток, инкубированных в отсутствие иммуноглобулина Е, а также показатель клеток, инкубированных с иммуноглобулином Е, предварительно связанным с избытком нейтрализующих антител к иммуноглобулину Е, и констатируют в случае обнаружения дозозависимого увеличения доли клеток CD63high в популяции клеток с фенотипом CD123+HLA-DR-, что исследуемые антитела относят к анафилогенным, а при обнаружении дозозависимого снижения доли клеток CD63high в исследуемой популяции считают, что исследуемые антитела относят к нейтрализующим с вычислением концентрации антител по формуле:
% нейтр = 100×(1-(%АБоп-%АБа-IgE)/(%АБК IgE-%АБа-IgE)),
где % нейтр - процент нейтрализации;
%АБоп - процент активированных базофилов в присутствии соответствующей концентрации исследуемых антител;
%ABa-IgE - процент активированных базофилов в образце контроля анти-IgE;
%АБК IgE - процент активированных базофилов в образце контроля IgE без исследуемого препарата.
Анализ осуществляют следующим образом.
Исследуемые антитела предварительно раститровывают и инкубируют в течение 1 часа с раствором IgE человека с постоянным перемешиванием на орбитальном шейкере при комнатной температуре (по 50 мкл каждого разведения антитела и 50 мкл раствора IgE человека с концентрацией 20 мкг/мл), после чего смесь добавляют к 100 мкл донорской гепаринизированной крови человека и инкубируют при 37°C в течение 1 часа. Клетки дважды отмывают низкоскоростным центрифугированием, добавляют поликлональные антитела козы к IgE человека (50 мкг/мл) в объеме 10 мкл и вновь инкубируют в течение 30 минут при 37°C. Реакцию останавливают добавлением 10 мкл раствора ЭДТА (20 мМ) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее к образцам добавляют 20 мкл смеси меченных разными флуоресцентными метками антител к CD63, CD 123 и HLA-DR (коммерческий набор BD FastImmune CD63 FITC/CD123 PE/Anti-HLA-DR PerCP). После инкубации при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут производят лизис эритроцитов внесением 2 мл лизирующего раствора (0/75% раствор хлорида аммония) с последующей трехкратной отмывкой центрифугированием. Далее образцы анализируют в проточном цитофлуориметре с последующим подсчетом процента активированных клеток с фенотипом CD63high из пула клеток с фенотипом CD123highHLA-DR-. В качестве положительного контроля используют формил-метионин-лейцин-фенилаланин (fMLP) (Sigma), в качестве отрицательного контроля определяют показатель клеток, инкубированных в отсутствие IgE, а также показатель клеток, инкубированных с IgE, предварительно связанным с избытком нейтрализующих антител к IgE.
Изобретение иллюстрируется следующими диаграммами.
На фиг.1 представлены результаты нейтрализации биологической активности иммуноглобулинов Е известными антителами против IgE человека «Ксолар». На фиг.2 представлена оценка нейтрализующей активности мышиных антител против IgE человека, данные проточной цитофлюориметрии, анализ CD123+HLA-DR- базофилов. Цифры на гистограммах указывают процент клеток, высокоэкспрессирующих CD63. А - контроль поликлональных анти-IgE антител; Б - положительный контроль (fMLP); В - контроль известных нейтрализующих антител («Ксолар», 5 мкг/мл); Г и Д - 5 мкг/мл и 1 мкг/мл антител клона 1С2; Е и Ж - 5 мкг/мл и 1 мкг/мл антител клона 3В5 соответственно.
Промышленная применимость изобретения поясняется следующими примерами.
Пример 1. Определяли нейтрализацию биологической активности иммуноглобулинов Е человека рекомбинантными гуманизированными антителами к IgE человека (коммерческий препарат «Ксолар»).
Выявление активированных базофилов проводили с помощью набора BD FastImmune CD63 по инструкции изготовителя. В качестве положительного контроля использовали формил-метионин-лейцин-фенилаланин (fMLP) (Sigma) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Учет результатов проводили с помощью проточного цитофлюориметра EPICS XL (Beckman Coulter) в трехцветном режиме. Базофилы при анализе выделяли как CD123+HLA-DR- клетки и далее определяли процент базофилов, высокоэкспрессирующих CD63 (CD63high).
Результаты анализа приведены на фиг. 1.
Из фиг. 1 видно, что антитела «Ксолар» дозозависимо снижают процент базофилов, активированных в результате инкубации с IgE человека и последующей обработкой поликлональными антителами к IgE. IC50 в эксперименте составил 0,515 мкг/мл.
Пример 2. Определяли нейтрализующую активность мышиных моноклональных антител клонов 1С2 и 3В5 против иммуноглобулинов Е человека.
Мышиные моноклональные антитела (клоны 1С2 и 3В5) против IgE человека были получены с помощью гибридомной технологии. Нейтрализующую активность антител изучали, как описано выше, используя в тесте конечные концентрации антител 5 мкг/мл и 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля нейтрализации использовали препарат «Ксолар» в концентрации 5 мкг/мл. Результаты проточной цитофлюориметрии показаны на фиг. 2. Из фиг. 2 видно, что при увеличении концентрации антител 1С2 наблюдается увеличение процента CD63high активированных базофилов, что указывает на то, что данный клон антител является анафилактогенным. При этом в присутствии антител клона 3В5 имеет место полное подавление активации базофилов, что указывает на нейтрализующие свойства антител данного клона.
Сопоставление заявляемого способа с аналогами показало, что при его использовании время анализа сокращается с 20-30 до 4 часов, при этом достигается существенное снижение трудозатрат.
Claims (1)
- Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину Е, включающий в себя взаимодействие базофилов с антителами и иммуноглобулином Е человека, отмывание клеток от излишков иммуноглобулина, анализ физико-химических параметров полученной смеси и определение значимого параметра, отличающийся тем, что предварительно готовят не менее трех смесей антител с иммуноглобулином Е человека, которые потом инкубируют с гепаринизированной кровью донора при 37±1°C, а после отмывки излишков иммуноглобулина добавляют поликлональные антитела козы к иммуноглобулину Е человека и вновь инкубируют при 37±1°C в течение 30-40 мин, после чего реакцию прекращают введением этилендиаминотетраацетата, добавляют меченные разными флуоресцентными метками антитела к CD63, CD123 и HLA-DR, выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 30-35 минут, затем лизируют эритроциты, отмывают смесь центрифугированием и анализируют в проточном цитофлуориметре с последующим подсчетом процента активированных клеток с фенотипом CD63high из пула клеток с фенотипом CD123highHLA-DR, используя в качестве положительного контроля формил-метионин-лейцин-фенилаланин, а в качестве отрицательного контроля - показатель клеток, инкубированных в отсутствие иммуноглобулина Е, а также показатель клеток, инкубированных с иммуноглобулином Е, предварительно связанным с избытком нейтрализующих антител к иммуноглобулину Е, и в случае, если в опытных образцах при увеличении дозы исследуемых антител не отмечается дозозависимых изменений процента активированных базофилов, соответствующие антитела признаются не нейтрализующими, в случае обнаружения дозозависимого увеличения доли клеток CD63high в популяции клеток с фенотипом CD123+HLA-DR- исследуемые антитела относят к анафилогенным, а при обнаружении дозозависимого снижения доли клеток CD63high в исследуемой популяции считают, что исследуемые антитела относят к нейтрализующим с вычислением концентрации антител по формуле:
% нейтр = 100×(1-(%АБоп-%АБа-IgE)/(%АБК IgE-%АБа-IgE)),
где % нейтр - процент нейтрализации; %АБоп - процент активированных базофилов в присутствии соответствующей концентрации исследуемых антител; %АБа-IgE - процент активированных базофилов в образце контроля анти-IgE; %АБК IgE - процент активированных базофилов в образце контроля IgE без исследуемого препарата.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013145847/15A RU2554820C2 (ru) | 2013-10-15 | 2013-10-15 | Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину е |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013145847/15A RU2554820C2 (ru) | 2013-10-15 | 2013-10-15 | Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину е |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013145847A RU2013145847A (ru) | 2015-04-20 |
RU2554820C2 true RU2554820C2 (ru) | 2015-06-27 |
Family
ID=53282769
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013145847/15A RU2554820C2 (ru) | 2013-10-15 | 2013-10-15 | Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину е |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2554820C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2609839C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Способ дифференциальной диагностики гиперчувствительности к яду пчелы (apis mellifera) |
-
2013
- 2013-10-15 RU RU2013145847/15A patent/RU2554820C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Sainte-Laudy J et al / Use of both CD63 up regulation and IgE down regulation for the flow cytometric analysis of allergen induced basophil activation. Definition of an activation index / Inflamm Res / 2007, Vol.56, No.7, pp 291-296. Niya Wanich et al / Allergen-Specific Basophil Activation Associated with Clinical Tolerance in Patients with Milk Allergy / J Allergy Clin Immunol / 2009, Vol.123, No.4, pp 789-794. Maria L. Sanz et al / In vitro Tests: Basophil Activation Tests / Pichler WJ (ed): Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, pp 391-402. Chang TW / Anti-IgE as a mast cell-stabilizing therapeutic agent / J Allergy Clin Immunol / 2006, Vol.117, No.6, pp 1203-1212 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2609839C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Способ дифференциальной диагностики гиперчувствительности к яду пчелы (apis mellifera) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013145847A (ru) | 2015-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Grönwall et al. | Autoreactivity to malondialdehyde-modifications in rheumatoid arthritis is linked to disease activity and synovial pathogenesis | |
Castells et al. | Drug hypersensitivity | |
JPH09506435A (ja) | アレルギー診断法および抗アレルギー性治療剤のスクリーニング法 | |
CN103502815A (zh) | 检测针对抗-TNFα药物的自身抗体的测定法 | |
US7960126B2 (en) | Immunoregulation in cancer, chronic inflammatory and autoimmune diseases | |
JP7331168B2 (ja) | 多発性骨髄腫におけるmタンパク質反応の臨床評価 | |
Bharadwaj et al. | Afucosylation of HLA-specific IgG1 as a potential predictor of antibody pathogenicity in kidney transplantation | |
Kosmoliaptsis et al. | Improved Luminex-based human leukocyte antigen-specific antibody screening using dithiothreitol-treated sera | |
Herrera et al. | Antivenomic characterization of two antivenoms against the venom of the taipan, Oxyuranus scutellatus, from Papua New Guinea and Australia | |
CA2983796A1 (en) | Compositions and methods for treating subjects with immune-mediated diseases | |
JP2021509012A (ja) | 抗αシヌクレイン抗体 | |
JP6564435B2 (ja) | アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体の投与 | |
RU2554820C2 (ru) | Способ определения нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину е | |
JPH06503427A (ja) | 組織および生物学的流体中のスルフィドロイコトリエンの決定法およびアレルギーその他の炎症性疾患の診断への応用 | |
Zhang et al. | Inhibition of allergic reactivity through targeting FcεRI-bound IgE with humanized low-affinity antibodies | |
Brown et al. | Reanalysis of the role of pronase treatment of B cells in the flow cytometric crossmatch assay: Fc receptor is not the primary target | |
JP2002533678A (ja) | 液体サンプル中の特異的IgE抗体の検出および/または定量方法 | |
Maccio‐Maretto et al. | Luminal bacteria coated with IgA and IgG during intestinal inflammation as a new and abundant stimulus for colonic macrophages | |
Kumagai et al. | Loxoprofen sodium induces the production of complement C5a in human serum | |
JP2019537017A (ja) | 未発症の『危険相』から関節リウマチ、AAV、又はシェーグレン症候群への遷移のバイオマーカーとしてのFab結合型糖鎖 | |
JP4422291B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
Zhang et al. | Research Progress on Quantification Methods of Drug Concentration of Monoclonal Antibodies | |
Asadi Karam et al. | Extraction and purification of anti-proteinase 3 (PR3) antibodies from egg yolk | |
Pakzad | Using a biosensor platform for the detection and characterization of autoantibodies in myasthenia gravis patients | |
JPH01223349A (ja) | 抗d血液型判定用試薬 |