JP6564435B2 - アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体の投与 - Google Patents
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Description
における新しい治療法の開発が求められる。
ある。
よび8のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なり、加えて(または代替的に)、18A11がいくつかの、ほとんどのまたは実質的に全てのN末端アミノ酸のピログルタミン酸への変換;ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのN末端および/またはC末端アミノ酸の除去(翻訳後または組換え技術によってのいずれか)からなる群から選択された、1つ以上の修飾を含む。
を示す場合、改善は持続性であると考えられる。改善の程度は一般的に、医師によって決定され、医師はこの決定を徴候、症状、生検、またはその他の検査結果に基づいて作成してもよく、医師はまた所与の疾患に関して作成された生活の質アンケートなどの、対象に実施されるアンケートを使用してもよい。
Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)、およびHarlow
and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照のこと。酵素反応および精製法は、当該技術分野で一般に達成されるように、または本発明に記載するように、製造者の仕様書に従って実施される。本発明で記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる専門用語、ならびにそれらの検査法および技術は、当該技術分野でよく知られ一般的に用いられるものである。標準的な方法を化学合成、化学分析、医薬品、製剤、および送達、ならびに患者の治療に用いてもよい。
タ7の作用のあらゆるアッセイを用いてもよく、アッセイのいくつかは当該技術分野においてよく知られている。アルファ4ベータ7阻害剤により抑制され得るアルファ4ベータ7の作用の例として、リガンド結合(すなわち、MAdCAM−1への結合)、リガンド発現細胞への接着、腸などの特定の区画への輸送、サイトカイン、ケモカインおよび他の介在物の放出、炎症反応および組織障害の亢進または悪化などが挙げられる。アルファ4ベータ7阻害剤およびアルファ4ベータ7作動薬の種類の例として、これらに限定されないが、抗原結合タンパク質(例えば、アルファ4ベータ7抗原結合タンパク質)、抗体、抗体断片、および抗体誘導体などのアルファ4ベータ7結合ポリペプチドが挙げられる。さらなる例として、アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体およびその変異体が挙げられる。
and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, Ne
w York, N.Y. (1991));および、Thornton et at.
Nature 354:105 (1991)に、記載されている。
(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))(全ての目的のためにその全てが参照により組み込まれる)を参照のこと。各軽/重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが2つの結合部を有するような抗体結合部を形成する。
、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割当は、Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91−3242, 1991の定義に基づく。免疫グロブリン鎖におけるアミノ酸に対するその他の付番方式は、IMGT(登録商標)(the international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185−203; 2005)およびAHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657−670; 2001)を含む。
慮される)における18A11と、同一または同様の抗体(またはその断片)を、包含する。例えば、有用な18A11ポリペプチドは、本発明で開示される18A11ポリペプチド(例えば、表2aおよび2bに記載のようなもの)と85%、90%、92%、95%、98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、有用なポリペプチドは、18A11と85%から100%同一である。1つの実施形態において、18A11は単離され、配列番号5からCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域を有し、配列番号2からCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域を有する、アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗原結合タンパク質である。別の実施形態において、18A11は単離されたアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗原結合タンパク質であり、重鎖可変領域は配列番号5と少なくとも90%同一であり、軽鎖可変領域はCDR1、CDR2およびCDR3から配列番号2と少なくとも90%同一である。
の使用、エアロゾル形態による拮抗剤の吸入、および同類のものが挙げられる。その他の代替案として、点眼剤;丸剤、シロップ剤、トローチまたはチューイングガムを含む経口剤;ならびにローション剤、ゲル剤、噴霧剤、および軟膏剤などの局所製剤、が挙げられる。
り示され得る。1つの実施形態において、2から4週間の間隔をおいた少なくとも2度の改善を対象が示す場合、改善は持続性であると考えられる。別の実施形態において、2から4ヶ月の間隔をおいた少なくとも2度の改善を対象が示す場合、改善は持続性であると考えられ;さらなる実施形態において、6から12ヶ月の間隔をおいた少なくとも2度の改善を対象が示す場合、改善は持続性であると考えられる。改善の程度は一般的に、医師によって決定され、医師はこの決定を徴候、症状、生検、またはその他の検査結果に基づいて作成してもよく、医師はまた所与の疾患に対して作成された生活の質アンケートなどの対象に実施されるアンケートを使用してもよい。
ある。18A11のその他の用量の投与、およびさらなる投与間隔での投与もまた、企図される。
Sandimmune(登録商標))などの免疫抑制剤が挙げられる。そのような薬剤の併用もまた、進歩性のあるアルファ4ベータ7阻害剤と一緒に使用されることが企図される。そのような薬剤は、経口または別の経路によって、例えば座剤または浣腸を介して、当該技術分野において既知であり処方情報に記載されている用量および間隔で投与されてもよい。
本実施例は、18A11のPK/PD特性の試験に用いた種々のアッセイについて述べる。
本実施例は、対象由来の血清における18A11の量の測定に用いたアッセイについて述べる。簡単に述べると、捕捉抗体(例えば、マウス抗18A11 1.30.1mAb)は、Multi−Array(登録商標)96ウェルHighBindマイクロプレートウェル(Meso Scale Discovery)に受動的に吸着される。マイクロプレートウェルは過剰な捕捉抗体を除去した後に、Blocker(商標)BLOTTO/ツイーン緩衝剤でブロックされる。既知の含量の18A11を100%の正常ヒト血清プールにスパイクすることにより調製した標準および品質管理試料は、Blocker(商標)BLOTTO/ツイーン緩衝剤中で50倍に希釈する前処理後に、検査される試料およびマトリックスブランクとしてマイクロプレートウェルに入れられる。試料中のあらゆる18A11は、固定化捕捉抗体により捕捉される。非結合物質はマイクロプレートウェルの洗浄により除去される。洗浄後に、SULFO−TAG(商標)結合検出抗体(例えば、抗18A11 1.2.1mAb)をマイクロプレートウェルに加えて、捕捉された18A11と結合させる。非結合SULFO−TAG(商標)結合捕捉抗体を、マイクロプレートウェルの洗浄で除去する。
本実施例は、対象由来の血清において18A11を結合する抗体の存在を検出するために用いたアッセイについて述べる。このアッセイにおいて18A11との結合抗体の検出は、電気化学発光(ECL)MSD(Meso Scale Discovery)技術基盤を利用し、抗体結合の多価特性に基づく。試験戦略は、スクリーニングアッセイおよび特異性アッセイからなる段階的な2つのアッセイアプローチを含む。スクリーニングアッセイにおけるアッセイカットポイントより大きな信号雑音比(S/N)を有する試料は、特異性アッセイにおいて試験前に過剰な18A11で試料をインキュベートすることにより、さらに検査される。
れた洗浄済ストレプトアビジン被覆標準結合MSDプレートに移動し、外気温でインキュベートしてビオチン化18A11を捕捉させ、ストレプトアビジン表面上に複合体を形成した。プレートウェルを洗浄し、トリプロピルアミンを含有するMSDリードバッファの溶液を加える。プレートはMSD Sector Imager 6000プレート読み取り装置で読み取られる。装置内において、ルテニウムは電圧が印加された場合に誘発される電気化学発光反応に関与する。プレートのウェル上に捕捉されるルテニル化18A11を含有する複合体は、試料中の抗18A11抗体の濃度に比例する電気化学発光信号をもたらす。
本実施例は、対象由来の血清において18A11を中和する抗体の存在を検出するために用いたアッセイについて述べる。抗18A11中和抗体(NAb)試験戦略は、スクリーニングアッセイおよび特異性アッセイからなる段階的な2つのアッセイアプローチを含む。スクリーニングアッセイの目的は、試験血清試料中における18A11活性に対するあらゆる抑制を検出することである。特異性アッセイは試料を過剰な18A11でインキュベートすることにより実施され、その後解析を行い、スクリーニングアッセイにおいて観察された18A11活性の抑制が、中和抗18A11抗体の存在に対して特異的であったことを確認する。スクリーニングおよび特異性アッセイの統合成績を用いて、抗18A11中和抗体に対して試料が陽性または陰性であるかどうかを決定する。
本実施例は、ヒト対象において受容体占有を評価するための、およびCD4 T細胞サブセットを列挙するための、6色6管のフローサイトメトリーアッセイIPRO(免疫表現型検査および受容体占有)アッセイについて述べる。アルファ4ベータ7受容体の遊離および全体レベルの両方が、下記の表3に示す管の型式を用いて、別々の管の中で測定される。アルファ4ベータ7の遊離および全体レベルの両方を同定する能力は、2つの試薬、アルファ4ベータ7との結合に関して18A11と競合する抗体(下記の表3において「競合a4b7」と称される)、およびアルファ4ベータ7のβ7サブユニットと結合するが、18A11と競合しない抗体(下記の表3において「非競合b7」と称される)を用いて達成され、それぞれがフィコエリスリンと結合する。試薬は、解析からαEβ7(非競合b7抗体を結合するであろう)を発現する細胞を排除するために用いられる、抗CD103(αE)もまた含む。約500マイクログラム/mlの18A11 ex vivoでの薬剤スパイク状態の追加は、完全飽和対照として働く。高品質な専用フローサイトメトリー試薬として、1:1の抗体と蛍光体の複合物、抗体カクテルならびに凍結乾燥した薬剤およびプラセボ緩衝剤(下記の表3における、溶解緩衝剤)が挙げられる。
PE:フィコエリスリン
PerCP:ペリジニンクロロフィルタンパク質
AlexaFluor(登録商標)647:約647nmの最大励起を有する合成蛍光色素
APC−H7:ラン藻類)−シアニン直列型蛍光色素において、付属の光合成色素が発見されたアロフィコシアニン
V450:青紫色レーザーにより励起されるクマリン色素
本実施例は、健常対象(HS)および軽度から中等度の潰瘍性大腸炎(UC;ClinicalTrials.gov、識別子:NCT01164904)に罹患した対象における18A11の安全性、耐用性、薬物動態(PK)および薬物動力(PD)を評価する、第1相、無作為抽出、二重盲検、プラセボ対照、漸増単回投与試験について述べる。次の用量を評価する:
本実施例は、健常対象および軽度から中等度の潰瘍性大腸炎(UC;ClinicalTrials.gov、識別子:NCT01290042)に罹患した対象(HS)における18A11の安全性、耐用性、薬物動態学および薬物動力を評価する、第1相、無作為抽出、二重盲検、プラセボ対照、漸増複数回投与試験について述べる。予備PKデータは、コホート1、2、3および8(7、21、70、および210mgの18A11の皮下投与)について、それぞれ予定した時点の141、141、197、および85日まで
に、3回投与後の健常対象について利用可能であった。PK特性を図2に示し、PKパラメータを表5に示す。
本実施例は、前述の試験に関する薬力学的分析について述べる。単回投与試験について、暫定的な18A11のα4β7受容体占有データが健常対象:コホート1から4に対して85日まで(0.7、2.1、7、および21mgの皮下投与)、コホート5および6に対して127日まで(70および210mgの皮下投与)、コホート7および8に対して197日まで(70および210mgの静脈内投与)、ならびにコホート9に対して225日まで(420mgの静脈内投与)、に利用可能であった。
本実施例は、患者における臨床観察について述べ、潰瘍性大腸炎(UC)対象における2つの18A11の第1相、無作為抽出、二重盲検、プラセボ対照試験において得られたさらなる結果を要約する。潰瘍性大腸炎(UC)に罹患した対象(患者)を、210mgを単回(試験20090107)または21mgを月々3回(20101261)の皮下投与(SC)用量の18A11で治療した/治療する(NIH臨床試験ウェブサイト、URL「clinicaltrials.gov;」、それぞれ試験20090107および20101261に対して試験識別子NCT01164904(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01164904)およびNCT01290042(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01290042))。
et al J Dig Dis 9: 140; 2008に記載の通りに、高感度
C反応性タンパク質(hs−CRP)法を用いておおむね決定された)および糞便カルプロテクチン(FC;Vieira et al BMC Research Notes
2:221; 2009に記載の通りにおおむね決定される)バイオマーカー、ならびに部分的メイヨースコアを測定した。直腸S状結腸鏡検査の総メイヨースコアを、スクリーニング中、ならびに6、12、および28週間(210mgのみ)の来診中に評価した。この解析の目的について、「寛解」を、1ポイント超の個々のサブスコアを有さない、2未満または2と同等のメイヨースコアとして規定する。「応答」を、3超または3と同等および30%超または30%と同等のベースラインからのメイヨースコアの減少と、少なくとも1ポイントの直腸出血スコアまたは0または1の絶対リーディングにおける減少として規定する。「粘膜治癒」を、0または1の直腸S状結腸鏡検査スコアとして規定する。それぞれ210mgおよび21mgのコホートについて、結果を図5Aおよび5Bに示す。
本実施例は、健常日本人対象(HJS;試験識別子20110259)における18A11の安全性、耐用性、薬物動態(PK)および薬物動力(PD)を評価する、無作為抽出、二重盲検、プラセボ対照、単回漸増投与試験について述べる。健常白色人種対象(HCS)のコホートを、日本人の対応対象と体重に従い±20%で対に対応し、比較対象として含んだ。各健常日本人対象コホートは、少なくとも4人の第1世代日本人対象(すなわち、日本で生まれた4人の祖父母、実父母および対象)からなり、残りの健常日本人対象は第1世代、第2世代(日本で生まれた4人の祖父母および実父母)または第3世代(日本で生まれた4人の祖父母)のいずれかとなる。以下の用量を評価した:
3、43、および14日にコホート1、2、3、および4に対して利用可能であった(それぞれ21、70、70、および210mgの18A11の皮下投与またはプラセボ)。PKおよび抗18A11結合抗体試料を、それぞれ10ng/mLの定量化下限値(LLOQ)および20ng/mL高信頼検出下限値(LLRD)で、有効な電気化学発光(ECL)イムノアッセイ法を用いて定量した。名目時間を、この予備的解析に関するPKパラメータの計算のために用いて、結果を表6に示した。血液を収集し、α4β7受容体占有およびCD4+T細胞数を、有効な全血6色フローサイトメトリーアッセイを用いて評価した。
は、日本人、白色人種、および非日本人対象の間で差異はない。中等度から重度のクローン病または潰瘍性大腸炎に罹患した日本人対象は、修飾されない18A11の進行中の第2相試験において実行された投与計画で、適宜検査され得る(www.clinicaltrials.gov.に記載される、試験識別子:NCT01696396およびNCT01694485、現在進行中の第2相試験はAmgen Inc.による提供である)。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
[態様1]
状態に罹患した対象を治療する方法であって、状態は消化管にアルファ4ベータ7を発現する細胞の不適当な輸送と関連し:
(a)7から21日間毎に5から14mg;
(b)14から56日間毎に15から54mg;
(c)43から126日間毎に55から149mg;
(d)112から147日間毎に150から299mg;および
(e)126から224日間毎に300から1000mg
からなる群から選択される量および間隔でアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
[態様2]
前記量および間隔が:
(a)11から17日間毎に5から10mg;
(b)30から50日間毎に15から30mg;
(c)75から95日間毎に55から85mg;
(d)120から132日間毎に160から260mg;および
(e)165から185日間毎に300から700mg
からなる群から選択される、態様1に記載の方法。
[態様3]
前記量および間隔が:
(a)2週間毎に7mg;
(b)6週間毎に21mg;
(c)12週間毎に70mg;
(d)18週間毎に210mg;および
(e)6ヶ月毎に420mg
からなる群から選択される、態様1に記載の方法。
[態様4]
状態に罹患した対象を治療する方法であって、状態は消化管にアルファ4ベータ7を発現する細胞の不適当な輸送と関連し、少なくとも約75%の受容体占有の達成および/または維持に十分な量および間隔で、その量のアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
[態様5]
達成された前記受容体占有が少なくとも約80%である、態様4に記載の方法。
[態様6]
達成された前記受容体占有が少なくとも約85%である、態様4に記載の方法。
[態様7]
達成された前記受容体占有が少なくとも約90%である、態様4に記載の方法。
[態様8]
達成された前記受容体占有が少なくとも約95%である、態様4に記載の方法。
[態様9]
達成された前記受容体占有が少なくとも約99%である、態様4に記載の方法。
[態様10]
状態に罹患した対象を治療する方法であって、状態は消化管にアルファ4ベータ7を発現する細胞の不適当な輸送と関連し、血清の体積あたり10ng/mlから1000ng/mlの間のヘテロ二量体特異抗体の量を達成および/または維持するために十分な量および間隔で、その量のアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
[態様11]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が少なくとも10ng/mlである、態様10に記載の方法。
[態様12]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が:少なくとも25ng/ml;少なくとも50ng/ml;少なくとも60ng/ml;少なくとも70ng/ml;少なくとも75ng/ml;および少なくとも80ng/mlからなる群から選択される、態様10に記載の方法。
[態様13]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が85ng/mlから100ng/mlの間である、態様10に記載の方法。
[態様14]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が70ng/mlから150ng/mlの間である、態様10に記載の方法。
[態様15]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が50ng/mlから250ng/mlの間である、態様10に記載の方法。
[態様16]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が40ng/mlから500ng/mlの間である、態様10に記載の方法。
[態様17]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が25ng/mlから750ng/mlの間である、態様10に記載の方法。
[態様18]
血清の体積あたりのヘテロ二量体特異抗体の前記量が10ng/mlから1,000ng/mlの間である、態様10に記載の方法。
[態様19]
前記アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体が18A11である、態様1から18のいずれか1項に記載の方法。
[態様20]
18A11が単離され、アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗原結合タンパク質が配列番号5からCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号2からCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域を有する、態様19に記載の方法。
[態様21]
18A11が単離され、アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗原結合タンパク質が、前記重鎖可変領域が配列番号5と少なくとも90%同一であり、前記軽鎖可変領域がCDR1、CDR2およびCDR3から配列番号2と少なくとも90%同一である、態様20に記載の方法。
[態様22]
18A11が軽鎖定常領域(配列番号7)および重鎖定常領域(配列番号8)をさらに含む、態様20または21に記載の方法。
[態様23]
18A11が18A11可変領域における1から10個のアミノ酸の置換、挿入または欠失により配列番号2および5のアミノ酸配列とアミノ酸配列の点で異なる、態様22に記載の方法。
[態様24]
18A11が18A11定常領域の18A11における1から10個のアミノ酸の置換、挿入または欠失により配列番号7および8のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる、態様22または23に記載の方法。
[態様25]
前記18A11がいくつかの、ほとんどのまたは実質的に全てのN末端アミノ酸のピログルタミン酸への変換;ならびに1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのN末端および/またはC末端アミノ酸の除去(翻訳後または組換え技術によってのいずれか)からなる群から選択される、1つ以上の修飾を含む、態様20から24のいずれか1項に記載の方法。
[態様26]
アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体で治療されているヒト対象におけるアルファ4ベータ7受容体占有を評価する方法であって:
a)前記対象に対して6本1組の試薬管を用意し、前記管には1から6の番号を付けられており、各管がアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体(管2;「スパイク」(spiked)と称する)またはプラセボ対照(管1、3、4、5および6)を含み、そしてアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体で治療された対象から全血試料を得、
b)前記全血試料の一部を前記6本の管それぞれの中に入れて試料混合物を形成し、前記得られた試料混合物をインキュベートし;
c)1:1の割合の抗体カクテルとフィコエリスリン試薬を、前記試料混合物に加え、実質的に示したようなスキームにおいて、抗体カクテル/試料混合物を形成し:
−管1に、抗CD8+CD103;FITC、抗アルファ4ベータ7競合抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CCR7:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管2に、抗CD8+CD103:FITC、抗アルファ4ベータ7競合抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CCR7:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管3に、抗CD+CD103:FITC、非競合抗β7抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CCR7:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管4に、抗CD7+CD103:FITC、非競合抗β7抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管5に、抗CLA:FITC、非競合抗β7抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CD4:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管6に、抗CD19:FITC、抗CD4:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CD16+CD56:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD8 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
d)前記抗体カクテル/試料混合物をインキュベートし、
e)前記抗体カクテル/試料混合物を処理してあらゆる赤血球を溶解して残りの細胞の混合物を形成し;
f)残りの細胞の前記混合物を洗浄し、蛍光活性化セルソーターを用いてそれらを解析して、前記残りの細胞に存在する、前記アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体により占有されたアルファ4ベータ7受容体の割合を決定することを含む、方法。
[態様27]
前記試料混合物が室温で約30分間インキュベートされ、前記抗体カクテル/試料が室温で約20分間インキュベートされる、態様26に記載の方法。
[態様28]
各管に加えられる、前記全血試料の一部が100マイクロリットルであり、前記抗体カクテルの体積が20マイクロリットルであり、前記抗体:フィコレリスリン試薬の体積が60マイクロリットルである、態様26または27に記載の方法。
[態様29]
各集団に対して集められた前記CD4ナイーブT細胞のイベントの数を前記リンパ球イベントによって除算し、その後マイクロリットルあたりのリンパ球の血液学的結果によって乗算し、ナイーブCD4 T細胞をCCR7+CD45RA+CD3+CD8−CD103−CD45+リンパ球として規定する、態様26から28のいずれか1項に記載の方法。
[態様30]
スパイクおよび非スパイク状態に対する蛍光強度中央値が蛍光ビーズ検量線を用いて細胞あたりの結合分子(MBPC)に変換され、受容体占有を算出するために利用される、態様26から29のいずれか1項に記載の方法。
[態様31]
前記対象が使用可能な2つの投与前試料があり、目標飽和度は以下の式:
Claims (6)
- アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体で治療されているヒト対象におけるアルファ4ベータ7受容体占有を評価する方法であって:
a)前記対象に対して6本1組の試薬管を用意し、前記管には1から6の番号を付けられており、各管がアルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体(管2;「スパイク」(spiked)と称する)またはプラセボ対照(管1、3、4、5および6)を含み;
b)アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体で治療された対象から得られた全血試料の一部を、前記6本の管それぞれの中に入れて試料混合物を形成し、前記得られた試料混合物をインキュベートし;
c)1:1の割合の抗体カクテルとフィコエリスリン試薬を、前記試料混合物に加え、実質的に示したようなスキームにおいて、抗体カクテル/試料混合物を形成し:
−管1に、抗CD8+CD103;FITC、抗アルファ4ベータ7競合抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CCR7:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管2に、抗CD8+CD103:FITC、抗アルファ4ベータ7競合抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CCR7:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管3に、抗CD+CD103:FITC、非競合抗β7抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CCR7:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管4に、抗CD7+CD103:FITC、非競合抗β7抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管5に、抗CLA:FITC、非競合抗β7抗体:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CD4:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD45 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
−管6に、抗CD19:FITC、抗CD4:フィコエリスリン、抗CD45:PerCP、抗CD16+CD56:AlexaFluor(登録商標)647、抗CD8 RA:APC−H7、および抗CD3:V450を加え;
d)前記抗体カクテル/試料混合物をインキュベートし、
e)前記抗体カクテル/試料混合物を処理してあらゆる赤血球を溶解して残りの細胞の混合物を形成し;
f)残りの細胞の前記混合物を洗浄し、蛍光活性化セルソーターを用いてそれらを解析して、前記残りの細胞に存在する、前記アルファ4ベータ7ヘテロ二量体特異抗体により占有されたアルファ4ベータ7受容体の割合を決定することを含む、方法。 - 前記試料混合物が室温で約30分間インキュベートされ、前記抗体カクテル/試料が室温で約20分間インキュベートされる、請求項1に記載の方法。
- 各管に加えられる、前記全血試料の一部が100マイクロリットルであり、前記抗体カクテルの体積が20マイクロリットルであり、前記抗体:フィコレリスリン試薬の体積が60マイクロリットルである、請求項1または2に記載の方法。
- 各集団に対して集められた前記CD4ナイーブT細胞のイベントの数を前記リンパ球イベントによって除算し、その後マイクロリットルあたりのリンパ球の血液学的結果によって乗算し、ナイーブCD4 T細胞をCCR7+CD45RA+CD3+CD8−CD103−CD45+リンパ球として規定する、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- スパイクおよび非スパイク状態に対する蛍光強度中央値が蛍光ビーズ検量線を用いて細胞あたりの結合分子(MBPC)に変換され、受容体占有を算出するために利用される、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
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