JPH09506435A - アレルギー診断法および抗アレルギー性治療剤のスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 患者におけるアレルギー性疾患の診断法を提供する。抗アレルギー性治療剤およびＩｇＥ拮抗剤のスクリーニング法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 アレルギー診断法および抗アレルギー性治療剤のスクリーニング法 発明の背景 本発明の分野 この発明はアレルギー性疾患診断の分野に関し、またアレルギー性疾患処置用 治療剤のスクリーニング法に関する。 背景および関連技術の記載 アレルギー性疾患の診断には主に皮膚反応、ＩｇＥ血清水準検定、およびヒス タミン放出検査の３種の技術が使用されてきた。皮膚反応は１８６５年に導入さ れて以来、アレルギーの第一次診断用手段を代表してきた。アトピーの古典的な 皮膚反応は皮膚に導入した抗原が予め形成されていた伝達物質の放出、血管透過 性の亢進、局所浮腫およびカユミを起こすＩ型膨疹および紅斑反応である。この ような皮膚反応は臨床的基礎の上に立つ特異的アレルギーの診断用に有用な確証 を提供できる。しかしながら、不適正に行なうと、皮膚反応は誤陽性または誤陰 性の結果を招来することがある。皮膚反応の主な限界は、非アレルギー性個体の 一部がアレルギー性の症候なしに皮膚反応に対して膨疹および紅斑反応を起こす 特異的ＩｇＥ抗体を持つために、陽性反応が必ずしもその病気がアレルギー的な 性格であることを意味しないことである。 皮膚反応で観察されるＩｇＥ媒介誤陽性現象は患者血清中のアレルゲン特異的 ＩｇＥを検定する試験管内法では観察されない（ＨｏｍｂｕｒｇｅｒとＫａｔｚ ｍａｎｎ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ａｌｌｅｒｇｙ（実験的免疫学方法論：ア レルギー用各種実験的検査の原理および解釈）」、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎなど編、 「Ａｌｌｅｒｇｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（アレルギ ー、原理および実際）」、Ｍｏｓｂｙ出版、４版、第１巻、２１章、５５４〜５ ７２頁（１９９３年）参照）。典型的には、アレルゲン特異的ＩｇＥ水準は患者 血清を抗原被覆吸着剤粒子とともにインキュベーションし、それに続いて標識抗 体で抗原に結合した特異的ＩｇＥを検出する放射性アレルゲン吸着法（ＲＡＳＴ ）により測定する（たとえば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．、１１５巻：１５７７〜１５８３頁（１９７５年）参照）。 全血清ＩｇＥ水準もアレルギーの診断に使用する。全ＩｇＥ水準はＨｏｍｂｕ ｒｇｅｒとＫａｔｚｍａｎｎ、前出、に記載のラジオイムノアッセイまたはイム ノメトリー検定法によって測定できる。ＩｇＥ水準はしばしばアレルギー性疾患 で上昇し、寄生体侵襲により著しく高める。アトピー性疾患の存在について小人 または成人を評価する時、正常な全ＩｇＥ水準はアトピーを排除しないのだが、 上昇したＩｇＥ水準は診断の助けになる。臨床的兆候の発現に重要な寄与をする 遺伝子的および環境的因子が存在するので、全ＩｇＥの測定のみではアレルギー 状態を予測しない。アレルギー診断における血清ＩｇＥ水準の価値には健康個体 でのＩｇＥ血清濃度範囲の広さという限界もある。健康成人におけるＩｇＥ濃度 の頻度分布は９５％限界が広く、低ＩｇＥ値の数が不相応なので顕著に歪曲され る。従って、正常ＩｇＥ水準の９５％限界算出に当って、多くの研究者は算術的 方法と比較して正常血清ＩｇＥ上限が非常に高く出る対数変換によってデータを 処理している。正常血清ＩｇＥの上限が高いことは臨床的アレルギーについての スクリーニングによる血清ＩｇＥ検査の診断的価値を低減する。 ヒスタミン放出検査は患者血清中の機能的でアレルゲン特異的なＩｇＥの検出 方法を提供する。典型的には、ヒスタミン放出検査は患者で起きるようなアレル ゲン特異的反応を模倣する（たとえば、ｕｎｄｅｒ ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅなど 、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８２巻：２７０〜２８１ 頁（１９８８年）参照）。患者の血液と様々なアレルゲンとを混合することによ ってこの反応を試験管内で発生させ、その後、後続する各アレルギー反応の間に 放出されるヒスタミン量を測定する。試験管内ヒスタミン放出検定法では本来全 血からの白血球分離および／または遊離ヒスタミンの様々な抽出法が必要であっ た。後に、白血球ヒスタミン放出検査法が改良され、自動化されて、血球分離と ヒスタミン抽出とが回避された（たとえば、Ｓｉｒａｇａｎｉａｎなど、Ｊ．Ａ ｌｌ ｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５７巻：５２５〜５４０頁（１９７６ 年）参照）。現在では、商業的に購入できる白血球ヒスタミン放出検査のキット によれば、２.５ｍＬの全血で１００回までの異なる測定が可能である。しかし ながら、血液標本は検定の前２４時間以上保存できない。これに加え、この検査 では、アレルゲン抽出物の毒性や他の因子によって起きる非特異的ヒスタミン放 出に起因する誤陽性の結果が出る。また、品質管理研究からヒスタミンの測定に はかなりの研究室間変動があるという報告がある（ＧｌｅｉｃｈとＨｕｌｌ、Ｊ ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６６巻：２９５〜２９８頁（ １９８０年））。 アレルギー症候、陽性皮膚反応および明瞭に検出可能なＩｇＥ抗体を持つ患者 の中の少数では、患者好塩基球とアレルゲンとからの試験管内ヒスタミン放出が 観察できない。もし陽性対照が入手できないと、この現象はヒスタミン放出検査 結果を解釈不能にし、アレルギー性疾患診断でのこの検査の有用性を限定する。 ＬｅｖｙとＯｓｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９９巻：１０６２〜１０６７頁 （１９６７年）は、非アレルギー性個体の僅かに２０％から３０％までの白血球 だけが試験管内でアレルゲン特異的ＩｇＥでの受動感作とそれに続くアレルゲン チャレンジによるヒスタミン放出を示すことを報告した。Ｉｓｈｉｚａｋａなど 、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１巻：５００〜５１１頁（１９７３年）は白血球 を酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）とともにインキュベーションすると、抗ブタクサ血清で の白血球の受動感作およびブタクサ抗原によるチャレンジによって誘導されるヒ スタミン放出を強化することを証明することによって、この検査の有用性を拡大 した。Ｐｒａｈｌなど、Ａｌｌｅｒｇｙ、４３巻：４４２〜４４８頁（１９８８ 年）は非アレルギー性個体から分離したＩｇＥ欠落白血球で非放出性アレルギー 性患者血清での受動感作と、それに続くアレルゲンの誘導によるヒスタミン放出 を報告した。しかしながら、Ｐｒａｈｌなどの方法は非アレルギー性提供者全血 からの対照白血球分離と、それに続く提供者血球に結合したＩｇＥの移動と、が 必要である。これに加えて、Ｌｅｖｙなど、Ｉｓｈｉｚａｋａなど、およびＰｒ ａｈｌなどの操作は前記他種ヒスタミン放出検査法の有用性を限定するヒスタミ ン検 定変動と同じ変動の対象である。 従って、本発明の目的の一つは便利で再現性があり、広範に適用できるアレル ギー性疾患診断用試験管内検査法を提供することである。 アレルギー性疾患処置用治療剤の生物活性検定用試験管内操作法を提供するこ とがもう一つの目的である。 ＩｇＥ拮抗剤スクリーニング用試験管内操作法を提供することが別の目的の一 つである。 これらおよび他の目的は当業者には自明になるものと思われる。 発明の要約 従って、本発明は患者におけるアレルギー性疾患診断用試験管内検査法を提供 するものであって、ここに、ＩｇＥ拮抗剤の存在下および不在下の双方でアレル ゲン特異的ＩｇＥを非アレルギー性提供者からのＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞と相互作 用（で感作）させることにより患者血清内のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する 。 本発明の一側面は放出混合物中での薬理学的伝達物質の放出と遮断放出混合物 中での薬理学的伝達物質の放出とを比較することを含む患者におけるアレルギー 性疾患の診断法であって、ここに、放出混合物は患者からの血清標本およびナイ ーブ提供者からの組織標本を含み、およびここに、遮断放出混合物は患者からの 血清標本、ナイーブ提供者からの組織標本、およびＩｇＥ拮抗剤を含み、および ここに、放出混合物と遮断放出混合物との双方を目的アレルゲンと混合するもの である。 本発明はもう一つのアレルギー診断用試験管内検査法をも提供するものであっ て、ここに、アレルゲン特異的ＩｇＥを、患者ＩｇＥおよびアレルゲンとの接触 に際してその宿主細胞の薬理学的伝達物質放出をさせることができるＦｃ_εＲＩ α−サブユニットの表面発現を展示するように遺伝子工学的に処理した好塩基球 または肥満細胞宿主と、ＩｇＥ拮抗剤の存在下および不在下の両方で、相互作用 させることにより患者血清内のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する。このアレル ゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用はアレルゲンを添加することおよびヒス タミンまたはその他の薬理学的伝達物質の即時放出を測定することによって検定 する。この検定中で使用するには、Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと 競合するものであるＩｇＥ拮抗剤およびＩｇＥへの結合についてＦｃ_εＲＩ受容 体と競合するＩｇＥ拮抗剤を含む、いかなるＩｇＥ拮抗剤も適当である。ＩｇＥ 拮抗剤のこの新規な使用は薬理学的伝達物質１種またはそれ以上の非特異的放出 に起因する誤陽性結果を削減する。 本発明の一側面は患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、 （ａ）反応混合物中での薬理学的伝達物質の放出と遮断した反応混合物中での 薬理学的伝達物質の放出とを比較すること、ここに、 （１）反応混合物および遮断した反応混合物は患者血清ＩｇＥおよびアレルゲ ンによる誘導に際して薬理学的伝達物質の宿主細胞による放出を媒介できるＦｃ_ε ＲＩ α−サブユニットの表面発現を展示するように遺伝子工学的に処理した いずれかの肥満細胞宿主および患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンによる誘導に際 して薬理学的伝達物質の宿主による放出を媒介できるＦｃ_εＲＩ α−サブユニ ットの表面発現を展示するよう遺伝子工学的に処理したいずれかの好塩基球から 構成される群から選択した共通親細胞の子孫である細胞を含み、 （２）反応混合物および遮断した反応混合物各々はさらにその患者からの単一 血清標本の一部であって、血清標本中での目的アレルゲン特異的ＩｇＥの存在ま たは不在が未知であるものを含み、 （３）遮断した反応混合物はさらにＩｇＥ拮抗剤を含み、および （４）反応混合物と遮断反応混合物とを両方ともアレルゲンと混合すること、 および （ｂ）段階（ａ）での比較に基づいてアレルゲン特異的ＩｇＥの血清標本内で の存在または不在を決定すること を含む診断法である。 本発明は抗アレルギー性治療剤としての薬剤の生物活性用およびＩｇＥ拮抗剤 としての薬剤の生物活性用の試験管内検査法も提供するものであって、その薬剤 の存在下または不在下に、アレルゲン特異的ＩｇＥをＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞と接 触することによってその薬剤がアレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との 間 の相互作用を遮断する性能を検定する。このアレルゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲ Ｉ相互作用はアレルゲンの添加とヒスタミンその他の薬理学的伝達物質の即時的 放出の測定とによって検定する。 本発明の一側面は薬剤がＩｇＥ誘導免疫細胞感作を遮断する生物活性検定の方 法であって、放出混合物中での薬理学的伝達物質の放出と遮断された放出混合物 中での薬理学的伝達物質の放出との比較からなり、ここにその放出混合物はナイ ーブ提供者からの組織標本および血清標本を含み、またここに、その遮断された 放出混合物はナイーブ提供者からの組織標本、血清標本およびその薬剤を含み、 およびここに、その放出混合物および遮断された放出混合物を目的アレルゲンと 混合するものである。 本発明の別の側面は免疫細胞脱顆粒反応を阻止する性能について薬剤をスクリ ーニングする方法である。この方法では、その薬剤で処置した患者免疫細胞また は試験管内でその薬剤とともにプレインキュベーションした提供者免疫細胞を、 まずＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下にアレルゲン特異的ＩｇＥと混合し、そ の混合物をそのアレルゲンでチャレンジする。ヒスタミン放出を減少するＩｇＥ 拮抗剤の性能はその薬剤が免疫細胞脱顆粒反応を阻止する性能を示す。 図面の簡単な説明 図１はｒｈｕＭＡｂＥ２５のヒスタミン放出始動不能性を示すグラフ描写であ る。ナイーブ提供者１２名からの血液標本を１０％ＲＳＨＰで前感作し、ＨＢＳ Ｓ／１％ＢＳＡ、ブタクサ０.１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬのＭＡＥ１、また は１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５で３７℃で３０分間チャレンジした。様 々な反応混合物の上清液に放出されたヒスタミン（ｎＭ）を次の通りに示した： ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ混合物は白色正方形で表示し、ブタクサ混合物は黒色正方 形で表示し、ＭＡＥ１混合物は白色三角形で表示し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５混合物 は黒色円形で表示した。 図２はブタクサ特異的ヒト血漿のスクリーニングを示すグラフ描写である。ナ イーブ提供者１名からの全血を１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在（陰影 柱）下または不在（黒色柱）下にブタクサにアレルギー性であることが知られた 提供者から採取した相異なるヒト血漿（Ａ〜Ｇ）７個で個別に前感作した後に、 ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ 単独で前感作した混合物は白色柱で表示した。各柱は測定２回の平均値を表示す る。血漿Ｂ（ロット４２−３６５０５４）を次の検定での好塩基球感作のために 選択した。各誤差線は測定値２個の範囲を表示する。 図３は１０％ＲＳＨＰでの前感作が全血のブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼ す効果を示すグラフ描写である。ヘパリン化血液標本をＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ （白色柱）か、または１０％ＲＳＨＰ、ロット４２−３６５０５４（陰影柱）か とともに３７℃で２時間プレインキュベーションした後に、０、１、１０および １００ｎｇ／ｍＬのブタクサアレルゲンでチャレンジした。誘導ヒスタミン放出 を定量し、様々な反応上清液中濃度（ｎＭ）の値として表現する。各柱は測定２ 回の範囲を表示する（白色円形）。 図４は様々なナイーブ提供者血液のヒスタミン放出性能を示すグラフ描写であ る。ナイーブ提供者血液をｒｈｕＭＡｂＥ２５の生物活性検定で使用するために 適当なヒスタミン放出性能についてスクリーニングした。提供者血液を１０μｇ ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在（陰影柱）下または不在（黒色柱）下に１０ ％ＲＳＨＰとともに２時間３７℃でインキュベーションして感作した後に、ブタ クサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡチャ レンジに反応してのヒスタミン放出を白色柱で表示する。誘導ヒスタミン放出を 細胞中全ヒスタミンに対する百分率として表示する。各柱は測定２回の平均値を 表示する。 図５はヒスタミン放出機序を示すグラフ描写である。０.５μｇ／ｍＬのｒｈ ｕＭＡｂＥ２５(白色正方形)、１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５(白色三角形) 、またはｒｈｕＭＡｂＥ２５なし（白色円形）の存在下に１０％ＲＳＨＰで前感 作したナイーブ提供者血液をブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジ し、所定時間インキュベーションした。１０％ＲＳＨＰで前感作し、ＨＢＳＳ／ １％ＢＳＡでチャレンジしたナイーブ提供者血液を（白色円形）陰性対照に用い た。誘導したヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中の濃度（ｎＭ） として表現した。誤差線は測定値２個の範囲を表示する。 図６はインキュベーション培地内におけるＣａ⁺²およびＭｇ²⁺欠落に起因する ヒスタミン放出減少を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者のヘパリン化全血 をハンク緩衝液（白色円形）またはＣａ⁺²およびＭｇ²⁺が欠落したハンク緩衝液 （ＨＢＳＳ^--）（黒色円形）で希釈し、様々な濃度のｒｈｕＭＡｂＥ２５と共に ２時間インキュベーションした後、３７℃で３０分間ブタクサアレルゲン（０. １μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。各点は測定２回の平均値を表示する。 図７はインキュベーション培地のＣａ⁺²およびＭｇ2⁺濃度がヒスタミン放出に 及ぼす効果を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者全血を様々な濃度のＣａＣ ｌ₂・２Ｈ₂Ｏ(白色円形)、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ(黒色円形)、またはＣａＣｌ₂・２Ｈ₂ ＯプラスＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（白色正方形）を含有するＨＢＳＳ^--で希釈して１ ０％ＲＳＨＰによって２時間感作した後に、３７℃で３０分間ブタクサアレルゲ ン（０.１μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。上清液中ヒスタミン放出を定量し、 細胞中全ヒスタミンの百分率として表現した。各点は測定２回の平均値を表示す る。 図８はブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼすｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度の効果を 示すグラフ描写である。ナイーブ提供者血液を様々な濃度のｒｈｕＭＡｂＥ２５ の存在下に１０％ＲＳＨＰとともに３７℃で２時間インキュベーションして感作 した後に、３７℃で３０分間ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジ した。誘導したヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中での濃度（ｎＭ） として表現する。各点は測定２回の平均値を表示する。 図９はチリダニに対してアレルギー性の個体からの血漿が起こすナイーブ提供 者好塩基球のヒスタミン放出に及ぼすｒｈｕＭＡｂＥ２５の効果を示すグラフ描 写である。ナイーブ提供者１名からのヘパリン化全血をハンクス緩衝液で１：７ に希釈し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在（１μｇ／ｍＬ）下または不在下にチリダ ニにアレルギー性である個体から採取した血漿（ＡからＧまで）７個とともに２ 時間プレインキュベーションし、３７℃で３０分間緩衝液（ＨＢＳＳ／１％ＢＳ Ａ）およびチリダニアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。誘導し たヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中での濃度（ｎＭ）として表現す る。ｒｈｕＭＡｂＥ２５不在下でのヒスタミン放出は白色柱で表示し、１μｇ／ ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５存在下でのヒスタミン放出は陰影柱で表示する。各柱 は測定２回の平均値を表示する（円形）。 図１０はヒトＩｇＥのＲＢＬ４８細胞への結合に対するｒｈｕＭＡｂＥ２５に よる阻止を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで 接種し、５％ＣＯ₂培養器中一夜３７℃で培養した後にアルコールで固定した。 固定した細胞を次の培地の一つの中で１時間３７℃でインキュベーションした： （１）１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ−グルタミンおよび活性ゲネティシン（ｓＩ ＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ＃１１８１１−０３１）５００μｇ／ｍＬ添加Ｉ ｓｃｏｖｅ修正ダルベッコ培地、（２）ｓＩＭＤＭ／１０％ＲＨＳＰ、または（ ３）ｓＩＭＤＭ／１０％ＲＨＳＰ／１０μｇ／ｍＬｒｈｕＭＡｂＥ２５。インキ ュベーション後に、細胞をＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で６回洗浄し、次 にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ（１／１０ ０００倍希釈）と３７℃で３０分間反応させ、続いてｏ−フェニレンジアミン二 塩酸塩（ＯＰＤ）基質と常温で３０分間インキュベーションした。各柱は測定２ 回の平均値を表示する。 図１１はＲＢＬ４８細胞中でのブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼす温度およ びＣａ⁺²濃度の効果を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞 ／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞を１０％ （ｖ／ｖ）ＲＳＨＰを含むｓＩＭＤＭ中、３７℃で２時間プレインキュベーショ ンし、次に室温で５０％Ｄ₂Ｏ(白色円形)、３７℃で５０％Ｄ₂Ｏ(黒色円形)、３ ７℃でＳＩＭＤＭ(黒色正方形)、または３７℃で５０％Ｄ₂Ｏ／２.５ｍＭ−ＥＤ ＴＡ（白色正方形）中のブタクサアレルゲン０μｇ／ｍＬ、０.００１μｇ／ｍ Ｌ、０.０１μｇ／ｍＬ、０.１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍ Ｌでチャレンジした。各点は測定２回の平均値を表示する。 図１２は５０％Ｄ₂Ｏ存在下、ＲＢＬ４８細胞によるブタクサ誘導ヒスタミン 放出の時間的経過を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞をｓＩＭＤ ＭまたはｓＩＭＤＭ／１０μｇ／ｍＬｒｈｕＭＡｂＥ２５とともに１０％（ｖ／ ｖ）ＲＳＨＰの存在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤ Ｍで３回洗浄後、細胞を下記混合物の一つでチャレンジした：（１）ヒスタミン 放出緩衝液（ＨＲＢ）（５０％Ｄ₂Ｏ、０.８％ＮａＣｌ、１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂ 、ｓＩＭＤＭ）(白色円形)、（２）ＨＲＢおよびブタクサアレルゲン０.１μｇ ／ｍＬ(黒色円形)、（３）ＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ、およ び０.５μｇ／ｍＬのrｈｕＭＡｂＥ２５(黒色正方形)、または（４）ＨＲＢ、ブ タクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ、および１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５ （白色正方形）。各点は測定２回の平均値を表示する。 図１３はＲＢＬ４８細胞中のブタクサ誘導ヒスタミン放出に対するｒｈｕＭＡ ｂＥ２５による阻害を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞 ／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞を０.０７ ８、０.１５６、０.３１３、０.６２５、１.２５、２.５、５、および１０μｇ ／ｍＬ濃度でのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰ存在下に ３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗浄後、細胞を ＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ、５０％Ｄ₂Ｏにより３７℃で３０ 分間チャレンジした。各点は測定２回の平均値を表示する。 図１４はヒト好塩基球ヒスタミン検定（ＨＢＨＡ）結果とラット肥満細胞ヒス タミン検定（ＲＭＣＨＡ）結果との間の相関関係を示すグラフ描写である。１５ 標本のｒｈｕＭＡｂＥ２５を各々２用量でＨＢＨＡおよびＲＭＣＨＡの双方でブ タクサ誘導ヒスタミン放出阻止性能について検査した。各標本のｒｈｕＭＡｂＥ ２５濃度は各検定法のｒｈｕＭＡｂＥ２５標準曲線から決定した。回収したｒｈ ｕＭＡｂＥ２５濃度（希釈係数に対して補正後）をプロットした。ＳｔａｔＶｉ ｅｗ４.０プログラムを使用して９５％信頼区間による単純回帰分析を行った。 図１５はアレルゲンパネルに対するアレルギー性個体からのヒト血漿標本のＲ ＭＣＨＡスクリーニングを示すグラフ４個を開示する。ＲＢＬ４８細胞を４００ ００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞 を異なるアレルギー性提供者４名から分離した血漿標本（Ｐ₁、Ｐ₂、Ｐ₃、Ｐ₄） で個別に感作し、ＨＲＢ(Ａ)、ＨＲＢおよび標準化したダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａ ｅ）アレルゲン０.１μｇ／ｍＬ(Ｂ)、ＨＲＢおよびハウスダスト混合アレルゲ ン０.１μｇ／ｍＬ(Ｃ)、ＨＲＢおよびブタクサ抗原Ｅ−ＢおよびＥ−Ｃ０.１μ ｇ／ｍＬ(Ｄ)、ＨＲＢおよび標準化したネコ毛皮アレルゲン０.１μｇ／ｍＬ(Ｅ )、またはＨＲＢおよびアルテルナリア属真菌（Ａlｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｉ ｕｓ）のアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ（Ｆ）でチャレンジした。アレルゲン誘導 ヒスタミン放出は１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５存在（黒色柱）下または不 在（白色柱）下に感作した標本に対する細胞中全ヒスタミンの百分率として決定 した。各柱は測定２回の平均値を表示する。 図１６はＨＢＨＡ検定で測定したブタクサアレルゲンおよびブタクサアレルゲ ン／３３％Ｄ₂Ｏにより誘導されたヒスタミン放出量の比較を示すグラフ描写で ある。提供者血液を１０％ＲＳＨＰとともに３７℃で２時間インキュベーション し、次に３３％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下に３７℃で３０分間ブタクサアレル ゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。異なるナイーブ提供者全部で２７名を 用いた。各点は測定２回の平均値を表示する。 図１７はＲＢＬ４８細胞のブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼすＤ₂Ｏの効果 を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、 ５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞をｓＩＭＤＭまたはｓＩＭＤ Ｍ／１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰ存 在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗浄後、 細胞を次の混合物中、様々な濃度（０％、３０％、５０％、７０％、１００％） のＤ₂Ｏで個別にチャレンジした：（１）ＨＲＢ(黒柱)、（２）ＨＲＢおよびブ タクサアレルゲン(白色柱)、および（３）ＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μ ｇ／ｍＬ、および１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５（陰影柱）。各点は測定 ２回の平均値を表示する。 好適な態様の詳細な記載 Ａ．定義 用語「ＩｇＥ拮抗剤」はここではＩｇＥと免疫細胞上の高親和性受容体Ｆｃ_ε ＲＩまたはアレルゲン剌激に反応して薬理学的伝達物質単数または複数を放出し ないよう遺伝子工学的に処理した細胞との間の相互作用を分裂または阻害できる 化合物を意味する。好ましくは、このＩｇＥ拮抗剤は免疫細胞または遺伝子工学 的に処理した細胞の特定薬理学的伝達物質単数または複数の誘導不能性によって も特徴付けられる。ＩｇＥ拮抗剤は、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ およびＩｇＥのような、いかなる免疫グロブリン型の抗ＩｇＥ抗体およびその断 片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体およびその断片、抗Ｆｃ_εＲＩ抗体およびその断片 、ＩｇＥ変異体およびその断片、ＩｇＥ結合性ペプチド、Ｆｃ_εＲＩ受容体結合 性ペプチド、およびＩｇＥに結合することができるかまたはＦｃ_εＲＩ受容体へ のＩｇＥの結合についてＩｇＥと競合することができる非蛋白質性低分子を含む 。 「抗ＩｇＥ抗体」はここでは結合したＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体と相互作用す る性能を削減または除去するようにＩｇＥに結合することができる抗体のいずれ かとして定義する。 「抗ＩｇＥ抗体断片」はここでは結合したＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体と相互作 用する性能を削減または除去するようにＩｇＥに結合することのできる抗ＩｇＥ 抗体分子のいずれかの部分として定義する。 「可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体」はここではＦｃ_εＲＩα鎖の細胞外ドメイン（エ キソドメイン）にＩｇＥ結合部位を含み、ここに、結合ＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容 体と相互作用する能力を削減または除去するようにその分子がＩｇＥに結合する ことができる分子のいずれかとして定義する。 用語「ＩｇＥ変異体」はここでは、ＩｇＥ分子が免疫細胞を感作する性能を削 減するか除去し、ここに、変化したＩｇＥ分子がＦｃ_εＲＩ受容体への結合につ いてＩｇＥと競合することができる、単数または複数のアミノ酸置換および／ま たは単数または複数のアミノ酸欠失のような変化を持つＩｇＥ分子のいずれかと して定義する。 用語「ＩｇＥ変異体断片」と「ＩｇＥ変異体の断片」とはここではＦｃ_εＲＩ 受容体への結合についてＩｇＥと競合することのできるＩｇＥ変異体の断片のい ずれかとして定義する。 用語「ＩｇＥ−結合性ペプチド」はここでは可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体および抗 ＩｇＥ抗体およびその断片を含む、ＩｇＥへの結合についてＦｃ_εＲＩ受容体と 競合することのできるペプチドのいずれかとして定義する。 用語「Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド」はここではＩｇＥ変異体およびその 他の抗体およびその断片を含み、Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競 合することのできるペプチドのいずれかとして定義する。 用語「アレルゲン」はここでは、たとえば花粉、ブタクサ、チリダニ、および 牛乳抗原のような、ある抗原に対する患者の第２回または後続する接触に際して 患者にＩ型過敏反応を発生することのできる抗原のいずれかを示す。 用語「薬理学的伝達物質」はここでは、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞により放出され 、たとえばヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジンおよび血小板活性 化因子のように炎症反応を媒介することのできる化合物のいずれかを意味する。 用語「Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞」はここではＦｃ_εＲＩ高親和性受容体を発現す る細胞であって、ＩｇＥ誘導感作および目的抗原との接触に際して薬理学的伝達 物質単数または複数を放出することのできる、たとえば肥満細胞および好塩基球 のような細胞を示すことを意図している。 用語「遺伝子工学的に処理した」はここでは外因性または追加的内因性ＤＮＡ の導入によって天然の状態から変えられている細胞とこのような変化された細胞 の子孫とを示す。遺伝子工学的に処理した肥満細胞の例には、宿主細胞に異種で あるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現する肥満細胞、宿主細胞と 同族であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現する肥満細胞、およ び宿主細胞によるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする内因性ＤＮＡの発現を強化する外 因性ＤＮＡを含む肥満細胞などを包含する。遺伝子工学的に処理した好塩基球の 例には、宿主細胞に異種であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現 する好塩基球、宿主細胞と同族であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡ を発現する好塩基球、宿主細胞によるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする内因性ＤＮＡ の発現を強化する外因性ＤＮＡを含む好塩基球などを包含する。 用語「患者血清」および「患者から採取した血清標本」はここではＩｇＥを含 有し、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を欠落する患者血液の画分のいずれかであるとして 定義する。 用語「血清標本」および「目的アレルゲンに特異的なＩｇＥを含有する血清」 はここでは感作したＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を目的アレルゲンによるチャレンジに よって、薬理学的伝達物質単数または複数の放出を誘導するようにＦｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞を感作することができるＩｇＥ含有処理物のいずれかを示す。 用語「提供者」、「ナイーブ提供者」、「健常提供者」、および「非アレルギ ー性提供者」はここでは互換的に使用され、目的アレルゲンに対してアレルギー を持たない個体を示すことを意図している。 用語「ナイーブ提供者からの組織標本」と「提供者組織」とはここではナイー ブ提供者から採取した、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を含有する肺臓組織、全血、およ び血液分画を包含する組織のいずれかとして定義する。 用語「ナイーブ提供者からの血液標本」と「提供者血液」とはここではナイー ブ提供者から採取し、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を含有する、全血を包含する血液分 画として定義する。 用語「放出混合物」、「感作混合物」、「感作免疫細胞」、および「感作提供 者血液」はここでは患者血清またはその他の血清標本および提供者組織との混合 物を示し、ここでは、患者の血清または血清標本中に存在するアレルゲン特異的 なＩｇＥのいずれかを提供者組織に存在するＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞と相互作用さ せる。 用語「遮断放出混合物」および「遮断した感作混合物」はここでは患者血清ま たはその他の血清標本、提供者組織、およびＩｇＥ拮抗剤であるか、またはＩｇ Ｅ拮抗剤候補であるか、または抗アレルギー性治療剤候補である薬剤との混合物 を示す。ＩｇＥ拮抗剤の場合には、その薬剤を好ましくは患者血清または血清標 本内に存在するアレルゲン特異的ＩｇＥのいずれかと提供者組織の中に存在する Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞との間の相互作用を減少させるに十分な濃度で存在させる 。ＩｇＥ拮抗剤候補または抗アレルギー性治療剤候補の場合には、薬剤は好まし く はＩｇＥとＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞との相互作用を分裂または遮断する該薬剤の性 能を検定するに十分な濃度で存在させる。 用語「ＩｇＥ誘導免疫細胞感作を遮断する薬剤の生物活性」はここではＩｇＥ のＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞への相互作用を分裂または遮断するその薬剤の性能とし て定義する。この定義にはＦｃ_εＲＩ⁺とＩｇＥへの結合について競合すること によってＩｇＥ／免疫細胞相互作用を遮断または分裂する生物活性およびＦｃ_ε ＲＩへの結合についてＩｇＥと競合することによってＩｇＥ／免疫細胞相互作用 を遮断または分裂する生物活性を包含する。 用語「抗アレルギー性治療剤候補」はここではアレルギー性疾患の処置での使 用について評価すべき薬剤のいずれかとして定義する。 用語「ＩｇＥ拮抗剤候補」はここではＩｇＥ拮抗剤としての使用について評価 すべき薬剤のいずれかとして定義する。 用語「Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞とのＩｇＥの相互作用」、「ＩｇＥ誘導免疫細胞 感作」、「Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞感作」、「免疫細胞感作」、および「Ｆｃ_εＲ Ｉ受容体とのＩｇＥの相互作用」は、ここではアレルゲン特異的ＩｇＥの免疫細 胞Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合であって、これに後続するアレルゲンのＦｃ_εＲＩ 受容体結合性ＩｇＥへの結合が免疫細胞による薬理学的伝達物質単数または複数 の放出を誘導するようなものとして定義する。Ｂ．一般的方法 Ｉ．ナイーブＦｃ_εＲＩ⁺細胞によるアレルゲン特異的ＩｇＥの検出 一側面では、本発明はアレルギー性疾患の診断法を提供する。一般的に、この 方法はＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を使用するアレルギー性患者血清内アレルゲン特異 的ＩｇＥの検出を含む。さらに特定的には、アレルギー性患者血清中のアレルゲ ン特異的ＩｇＥをＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に好塩基球および／または 肥満細胞上での開放されたＦｃ_εＲＩ受容体とそのアレルゲン特異的ＩｇＥとを 、相互作用（感作）させることによって検出する。このアレルゲン特異的ＩｇＥ ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用をアレルゲン添加およびヒスタミンまたはその他の薬理学 的伝達物質の即時放出の測定によって検定する。ＩｇＥ拮抗剤はＩｇＥ／Ｆｃ_ε Ｒ Ｉ相互作用を遮断するので、ＩｇＥ拮抗剤を含有する反応混合物中でのヒスタミ ンの低濃度は患者血清中におけるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を指摘する。ヒ スタミンは下記論議の多くでアレルゲンが誘導し、ＩｇＥが媒介する免疫細胞の 炎症反応関連化合物の放出を示すために使用できる薬理学的伝達物質の例として 役立つけれども、本発明はここに定義し、論議し、請求する方法において、ロイ コトリエン、プロスタグランジンおよび血小板活性化因子を包含するかかる薬理 学的伝達物質いずれかの使用をも包含することが認識されるであろう。 ａ．ナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の調製 一態様において、本方法は患者血清をナイーブ提供者から採取したＦｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞と接触することを包含する。ＩｇＥ感作およびアレルゲンチャレンジ に反応して薬理学的伝達物質単数または複数を放出することのできるＦｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞を包含する、ナイーブ提供者から採取した組織標本のいずれも患者血 清中におけるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出するために使用できる。例え ば、好塩基球を含む組織標本を使用できる。個体の約１５％は試験管内でヒスタ ミンを放出しない好塩基球を持っているので、提供者候補を本方法での使用に適 する好塩基球のヒスタミン放出性能についてスクリーニングすべきである。好ま しくは、アレルゲン特異的ＩｇＥで前感作した提供者好塩基球はアレルゲンチャ レンジに際して細胞中全ヒスタミンの７％またはそれ以上、さらに好ましくは１ ０％またはそれ以上を放出する。いずれのアレルゲンおよび対応するＩｇＥによ るヒスタミン放出についても、下記実施例に記載するブタクサ誘導ヒスタミン放 出に関する提供者スクリーニング法に従えば、提供者をスクリーニングできる。 許容可能な放出性を持つ潜在的な提供者の群は、提供者細胞を酸化重水素（Ｄ₂ Ｏ）存在下に提供者細胞をインキュベーションすることによって増加する。実施 例に示すように、インキュベーション培地中のＤ₂Ｏの存在はアレルゲン誘導性 ヒスタミン放出を増大する。インキュベーション培地における最終濃度約１０％ から５０％、好ましくは約２０％から４０％、最も好ましくは約３３％でＤ₂Ｏ を効果的に使用できる。 好適な態様では、ナイーブ提供者からの全血標本を使用する。全血使用は好塩 基球の検定前処理を有益に減じ、細胞分離操作に起因する細胞機能の破壊を回避 する。全血標本は検定で使用する前に抗凝固処理し、緩衝塩溶液で希釈できる。 インキュベーション培地内Ｃａ²⁺の存在はヒスタミン放出に実質的な影響を及ぼ す（ＭａｃＧｌａｓｈａｎとＢｏｔａｎａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻： ９８０〜９９１頁（１９９３年））ので、希釈緩衝液はＣａ²⁺を含有するものが 好適である。その他に、希釈緩衝液は下記実施例に記載するように、ヒスタミン 放出を増加するためにＭｇ²⁺も含有できる。約１：２から１：１０、より好まし くは約１：５から１：７までの比率での１.３ｍＭ−Ｃａ²⁺および０.９ｍＭ−Ｍ ｇ²⁺を含有するハンク平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ）による血液標本の希釈はヒスタ ミン放出について良い環境を提供する。 その他に、ナイーブ提供者からの分離白血球も使用できる。白血球はＧｉｌｌ ｅｓｐｉｅなど、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５１巻：２９４１〜２９４７ 頁（１９７２年）の方法に従って分離し、調製できる。 もう一つの態様では、提供者細胞にある開放Ｆｃ^εＲＩ受容体数を好塩基球の 細胞表面からＩｇＥを除去することによって増加できる。この技術は検定用に適 当な受容体数を持つ潜在的提供者集団を増加する。Ｐｒａｈｌなど、前出、が記 載のように血液を洗浄し、血球を４℃で約５分間燐酸緩衝液（ｐＨ３.６）中に 懸濁することにより、またはＰｒｕｚａｎｓｋｙなどがＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １３巻：１９４９〜１９５４頁（１９８３年）に記載のような乳酸洗浄により好 塩基球細胞表面から結合したＩｇＥを除去できる。 さらに別の態様では、肥満細胞からなる提供者組織標本を使用できる。肥満細 胞を含む組織標本はナイーブ提供者の肺臓組織から入手できる。肺臓組織はＭａ ｒｏｎｅなど、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９３巻：２４６〜２５ ２頁（１９８９年）に記載のように細胞懸濁液として採取調製できる。 ｂ．患者血清の調製 ＩｇＥを含有し、および／またはＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を欠落する患者血液画 分はいずれも本発明によるアレルギー診断での使用に適当である。容易に得られ るので患者血清標本は分析用に便利な画分である。 ｃ．患者血清によるナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の感作 患者血清をＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下にナイーブ提供者組織標本に添 加するとそれぞれ遮断感作混合物または感作混合物を得る。提供者組織が血液標 本である時は、混合物中の患者血清と提供者血液との望ましい比率は提供者血液 の画分および使用すべき血液の希釈率および検査すべき患者血清の希釈率に従っ て変化する。提供者全血をＨＢＳＳ／１％ＢＳＡで１：７に希釈し、非希釈患者 血清と混合する場合は、提供者血液と患者血清との適当な比率は約２：１から２ ０：１、好ましくは約４：１から１５：１、さらに好ましくは約９：１である。 患者血清／ナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の混合物少なくとも２個を並 行して比較する。一方の混合物では患者血清ＩｇＥがナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞に結合するのをＩｇＥ拮抗剤を使用して遮断する。第二の混合物では 患者血清をナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞とＩｇＥ拮抗剤の不在下に接触 する。好適な態様では、ＩｇＥに結合するＩｇＥ拮抗剤を患者血清／提供者組織 混合物中で患者血清中アレルゲン特異的ＩｇＥを力価検定するための濃度範囲で 使用する。ＩｇＥ拮抗剤濃度範囲の効果の分析は患者のアレルギー症状の重篤度 評価に強力な手段が得られる。要すれば、アレルゲン特異的ＩｇＥを含有するこ とが判明している血清標本もＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に本発明に従っ て検査してそれぞれ陰性および陽性対照を提供する。 遮断感作混合物のＩｇＥ拮抗剤の望ましい濃度は使用するＩｇＥ拮抗剤の型に 従って変化する。ＩｇＥへの結合についてＦｃ_εＲＩ受容体と競合するＩｇＥ拮 抗剤の場合には、ＩｇＥ拮抗剤の好適な濃度はＩｇＥ拮抗剤およびＦｃ_εＲＩ受 容体のＩｇＥへの相対的親和性に依存する。ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用 の完全な遮断を所望する時は、遮断感作混合物中に存在するＩｇＥの飽和に十分 な濃度のＩｇＥ拮抗剤を使用するのが好ましい。Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合につ いてＩｇＥと競合するＩｇＥ拮抗剤の場合には、ＩｇＥ拮抗剤の好適な濃度はＩ ｇＥとＩｇＥ拮抗剤とのＦｃ_εＲＩ受容体への相対的親和性に依存する。ＩｇＥ ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用の完全な遮断を所望する時は、遮断感作混合物中に 存在するＦｃ_εＲＩ受容体の飽和に十分なＩｇＥ拮抗剤濃度を使用するのが好ま しい。 抗ＩｇＥモノクローナル抗体をＩｇＥ拮抗剤として使用する時およびナイーブ 提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の源泉として血液を使用する時は、患者血清／提供 者血液混合物中にある抗体の有用な濃度範囲は好ましくは約０.００１から１０ μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約０.００５から５μｇ／ｍＬ、より好ましくは 約０.０１から２μｇ／ｍＬである。 ＩｇＥ拮抗剤は、患者血清を提供者組織混合物に添加する前か、または同時か に提供者組織と混合できる。あるいは、患者血清をＩｇＥ拮抗剤とを前混合し、 次に提供者組織と混合できる。 提供者組織／患者血清混合物はＩｇＥのＦｃ_εＲＩ受容体への結合に適当な条 件下にインキュベーションする。提供者血液／患者血清混合物の場合には、好適 な条件は下記実施例に記載するように、加湿５％ＣＯ₂培養器での３７℃で約２ 時間のインキュベーションから構成される。 ｄ．感作Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞のアレルゲンチャレンジ インキュベーションに続いて、感作混合物と遮断感作混合物との適量を目的ア レルゲンでチャレンジする。好ましくは、感作混合物および遮断感作混合物の適 量、約５０から２００μＬ、さらに好ましくは１００から１５０μＬの大きさ、 をアレルゲンチャレンジのために使用する。感作混合物および遮断感作混合物の 適量をマイクロタイタープレートのウェルに入れて、好都合なアレルゲンとの反 応および分析ができる。各ウェルにアレルゲン充分量を添加し、反応混合物をヒ スタミン放出に適当な緩衝液で希釈できる。必要なアレルゲン量はＩｇＥ結合性 Ｆｃ_εＲＩ受容体の濃度とＩｇＥのアレルゲン特異的結合への親和性とに依存す る。反応混合物中で過剰のアレルゲンを使用できるが、アレルゲンの高濃度はヒ スタミン放出の非特異的誘導を起こしうる。アレルゲン濃度約０.０１μｇ／ｍ Ｌから１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０.０５μｇ／ｍＬから１５μｇ／ ｍＬ、さらにより好ましくは約０.１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬは本発明で殆 どのアレルゲンと感作免疫細胞との反応に適当である。 アレルゲン反応混合物のインキュベーション条件はヒスタミン放出が誘導され るよう選択する。好適な態様では、反応混合物を温度低くとも３２℃で約２０か ら３０分間、さらに好ましくは低くとも３７±１℃でインキュベーションする。 ｅ．ヒスタミン放出の検定 アレルゲン反応混合物中のヒスタミン放出は反応容器温度を鋭く低下させる、 たとえばマイクロタイタープレートを氷上に置くようないずれの好都合な方法で もよいが、ことにより停止できる。各標本について細胞中全ヒスタミンは細胞を 破壊し、細胞破砕物からヒスタミンを分離し、分離したヒスタミンを定量するこ とによって測定できる。細胞は、たとえば超音波処理、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌ ｉｎ圧縮または浸透圧および凍結解凍のような、いかなる好都合な方法によって も破壊でき、ヒスタミンを細胞破砕物から、たとえば濾過または遠心分離によっ て、容易に分離する。ヒスタミン濃度はＮｏｌｔｅなど、Ａｌｌｅｒｇｙ、４２ 巻：３６６〜３７３頁（１９８７年）に記載の分光光学的螢光測定法、Ｐｅｙｒ ｅｔなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、９０巻：３９〜４５頁（１９ ８６年）に記載のラジオイムノアッセイ、および、たとえばヒスタミンをヒスタ ミン複合酵素と固体担体に固定した抗体への結合について競合させ、それに続い て発色団基質を持つ結合酵素の検出によって結合競合イムノアッセイを行うよう な、酵素イムノアッセイを包含する多数の方法で測定できる。下記実施例に記載 するように本発明ではＡＭＡＣ社、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥから購入できるヒ スタミンのイムノアッセイキットを使用してヒスタミン水準を測定できる。 本発明のさらなる態様では、ガラス繊維存在下にヒスタミン放出反応を行い、 続いてガラス繊維に結合したヒスタミンを検出することによりヒスタミン濃度を 測定できる。マイクロタイタープレートはＮｏｌｔｅなどが記載したようにして ガラスミクロ繊維を層積できる。血球がミクロ繊維に捕捉されるのを回避するた め、Ｎｏｌｔｅなどの方法に従ってＰｉｐｅｓ−ＡＭＣをウェルに添加できる。 次に、提供者血液および患者血清をＩｇＥ拮抗剤存在下または不在下にウェルに 添加し、続いて前記方法におけるようにアレルゲンと反応する。妨害物質はプレ ートを洗浄することによってミクロ繊維に結合したヒスタミンから分離できる。 ヒスタミンを、たとえばＮｏｌｔｅなどが記載したＨＣｌＯ₄／ｏ−フェニレン ジアミン混合物のような適当な溶媒の添加によりミクロ繊維から放出し、ヒスタ ミン含有量は前記方法のいずれかによっても測定できる。 最後に、ＩｇＥ拮抗剤に起因するヒスタミン放出の阻害百分率を算出する。Ｉ ｇＥ拮抗剤の特定濃度に起因する阻害百分率はＩｇＥ拮抗剤不在下のヒスタミン 放出量からＩｇＥ拮抗剤存在下のヒスタミン放出量を減算し、この差をＩｇＥ拮 抗剤不在下のヒスタミン放出量で除算することによって算出できる。ヒスタミン 放出を減少するＩｇＥ拮抗剤の性能は、患者血清内にアレルゲン特異的ＩｇＥの 存在を示すので、その特定のアレルゲンに対するアレルギー反応が認定される。 ヒスタミン放出を減少するために必要なＩｇＥ拮抗剤の量は、アレルギー症状の 臨床的な強度および重篤度の指標である。 ＩＩ．ナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞による患者血清中のアレルゲン特異的Ｉ ｇＥ検出用キット 本発明の検査システムをキットの形で供給でき、その内容はナイーブ提供者の Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を含むバイアル、ＩｇＥ拮抗剤を含むバイアルおよび目的 アルレゲンを含むバイアル単数または複数を包含する。ナイーブ提供者Ｆｃ_εＲ Ｉ⁺免疫細胞は全血、血液画分、洗浄白血球懸濁液、またはナイーブ提供者に由 来する肥満細胞懸濁液の形で提供でき、冷蔵庫中に貯蔵するのが便利である。前 記のＩａに記載したように感作放出混合物中の薬理学的伝達物質の放出を促進す るに適当な緩衝塩溶液を含むバイアルをキットに包含することもできる。 所望ならば、目的アルレルゲンに特異的なＩｇＥを含むバイアル１個またはそ れ以上を陽性対照として提供できる。陽性対照アレルゲン特異的ＩｇＥは被検患 者と同じ動物種に由来する。陽性対照アレルゲン特異的ＩｇＥは患者血清中のア レルゲン特異的ＩｇＥの力価測定に有用な標準曲線の構築を促進するために所定 濃度で提供できる。 態様の一つでは、このキットには提供者のナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞が放 出する薬理学的伝達物質の分析に使用する薬剤を含むバイアルを包含する。 別の態様では、このキットには包装ラベルまたは前記Ｉに記載した方法のいず れかによるキットの使用に関する指示を提供する包装挿入物を包含する。 ＩＩＩ．遺伝子工学的に処理した細胞による患者血清中のアレルゲン特異的Ｉ ｇＥの検出 本発明はさらに患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥと遺伝子工学的に処理し た細胞の感作およびアレルゲンとの接触に際して、薬理学的伝達物質単数または 複数の宿主細胞による放出を媒介できるＦｃ_εＲＩα鎖の表面発現を示すように 遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球に患者血清を接触することによ る患者血清標本のアレルゲン特異的ＩｇＥの検出法を包含する。このシステムに おいては、遺伝子工学的に処理した肥満細胞宿主または好塩基球宿主が発現する Ｆｃ_εＲＩα鎖は患者血清中ＩｇＥのいずれとも結合することができる。これに 加え、このＦｃ_εＲＩα鎖は宿主細胞の薬理学的伝達物質放出効果器の機能の中 で作用することができる。このＦｃ_εＲＩα鎖は患者ＩｇＥ結合Ｆｃ_εＲＩα鎖 のアレルゲン誘導交差結合が伝達物質放出を始動するように機能的ＩｇＥ受容体 複合体として、また十分な数で宿主細胞の表面に発現される。アレルギー性患者 血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥは、ＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に、ア レルゲン特異的ＩｇＥを遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球宿主上 のＦｃ_εＲＩ受容体α鎖と相互作用させることによって検出する。アレルゲン特 異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖相互作用はアレルゲンを添加し、即時放出ヒスタミ ンまたは他の薬理学的伝達物質を測定することで検定する。ＩｇＥ拮抗剤はＩｇ Ｅ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用を遮断するので、ＩｇＥ拮抗剤含有反応混合物中のヒス タミン低濃度は患者血清中におけるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を指摘する。 ａ．遺伝子工学的に処理した細胞の構築 本発明の方法は遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球宿主のいずれ かについて実施できる。典型的には、本方法では所与の動物種由来のＦｃ_εＲＩ α鎖は同じ動物種に由来するＩｇＥと反応するであろうから、患者の動物種にと って本来のＦｃ_εＲＩα鎖を発現するように遺伝子工学的に処理した肥満細胞ま たは好塩基球宿主を使用する。しかしながら、本発明は種間システムの使用も包 含し、そこでは、遺伝子工学的に処理した宿主細胞が発現するＦｃ_εＲＩα鎖が 患者のものとは異なる動物種に由来するけれども、患者血清中に存在するアレル ゲ ン特異的ＩｇＥと反応することができ、感作宿主細胞のアレルゲン誘導に際して 薬理学的伝達物質単数または複数の放出を起こす。 本発明はＦｃ_εＲＩα鎖を特定度合の同族性または異種性の発現宿主細胞とと もに使用することに限定されていないことは認識されるものと思われる。本発明 を実施するのに必要なアレルゲン刺激に際して、薬理学的伝達物質のＩｇＥ媒介 放出を起こすことが宿主細胞／Ｆｃ_εＲＩα鎖システムの性能である。本発明で 使用するために適当な遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球は動物の 適当な組織から肥満細胞または好塩基球を分離し、その肥満細胞または好塩基球 を組織培養中でクローニングし、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡを分離 または合成し、Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターにクロ ーニングし、肥満細胞または好塩基球細胞宿主を組換え発現ベクターで形質転換 し、細胞表面に組換えＦｃ_εＲＩα鎖を発現し、患者ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖複 合体のアレルゲンへの交差結合に反応して薬理学的伝達物質単数または複数を放 出する肥満細胞または好塩基球形質転換体を検出し、採取することによって構築 できる。 １．肥満細胞および好塩基球の分離 本発明は、たとえば齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、および 霊長類その他のようないかなる動物種から採取した肥満細胞ででも実施できる。 肥満細胞宿主候補は種々の型の動物組織から入手できる。肥満細胞は動物から採 取した骨髄、腹膜腔液、脾臓、胎児肝臓、リンパ節、または肺臓組織から分離で きる。肥満細胞を次に組織標本から抽出し、たとえば、Ｎａｂｅｌなど、Ｎａｔ ｕｒｅ、２９１巻：３３２〜３３４頁（１９８１年）またはＧａｌｌｉなど、Ｊ ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９５巻：４３５頁（１９８２年）の方法など当分野で 公知の有力な方法のいずれかによりクローニングする。 クローニングした肥満細胞の培養のために適当な培地は公知である。商業的に 購入できる培地にはダルベッコの修正イーグル培地(ＤＭＥＭ)、Ｉｓｃｏｖｅの 修正ダルベッコの培地（ＩＭＤＭ）およびその他の公知のものを含む。これら製 品は、たとえば加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）など、血清を添加するか血 清とともに使用するのが有益であり、他のエネルギー源または栄養および／また は感染を予防するために抗生物質または抗ウイルス剤を包含できる。 好ましくは、クローニングした肥満細胞を生長／刺激因子の存在下に維持する が、この因子にはＣｏｎＡで刺激した脾臓細胞から、Ｎａｇｅｌなど、前出、に 記載のクローニングしたＬｙｌ⁺２^-インデューサーＴリンパ球から、またはＮａ ｇｅｌなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１２巻：３３３頁（１９８１年）に記載のＷＥ ＨＩ−３細胞から、採取した上清液などを包含する数種が既に公知である。 好適な態様では、肥満細胞系候補はＣａｎｔｏｒなどへの米国特許４５５９３ １０号に記載のようにして入手する。 他の好適な態様では、不死細胞系、たとえば目的肥満細胞種の新生物同族体な ど、を、たとえばラット肥満細胞系ＲＢＬ ２Ｈ３のような、肥満細胞宿主とし て使用し、前記培養基中で生育させる。 本発明は、たとえば齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、および 霊長類その他のようないかなる動物種から採取した好塩基球ででも実施できる。 好塩基球宿主候補は動物血液から採取できる。白血球は前記Ｉａに記載したナイ ーブ提供者白血球を分離するために使用した操作のいずれかに従って全血から分 離できる。好塩基球は、たとえば白血球調製物をフルオロクローム標識抗Ｆｃ_ε ＲＩ抗体またはフルオロクローム標識ＩｇＥと反応させ、続いて螢光を発する細 胞をフロー活性化細胞選別機で検出し、区分するような、当分野の公知操作によ り残余白血球集団から分離できる。あるいは、好塩基球はＭｕｌなど、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４９巻：２０７〜２１４頁（１９９２年）の方法に 従って目的動物種から分離できる。分離した好塩基球を次に、たとえば、Ｉｓｈ ｉｚａｋａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：５３２〜５４０頁（１９８ ５年）に記載のような、確立された方法に従って懸濁細胞培養で生長させる。 ２．Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡの調製 目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡは当分野で公知の種々の方法のいずれ かで調製できる。もしＤＮＡ配列が公知であれば、そのＤＮＡは、たとえばトリ エステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法のよ うにＥｎｇｅｌｓなど、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２ ８巻：７１６〜７３４頁（１９８９年）に記載の方法に従って、化学的に合成で きる。Ｓｈｉｍｉｚｕなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８５巻：１９０７〜１９１１頁（１９８８年）はヒトＦｃ_εＲＩα鎖をコードす るｃＤＮＡとラットＦｃ_εＲＩα鎖をコードするｃＤＮＡとを開示している。天 然配列ＤＮＡに加えて、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードする非天然起源ＤＮＡもこ こでの使用に適当である。一つの態様では、発現宿主細胞に好適なコドンを使用 してＦｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡを設計する。 その他に、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡはＦｃ_εＲＩα鎖ｍＲＮＡ を含むと信じられる組織、一般的には意図する患者と同じ動物種から採取した肥 満細胞または好塩基球、から得たいずれのｃＤＮＡライブラリーからもクローニ ングできる。Ｆｃ_εＲＩα鎖の遺伝子はゲノムＤＮＡライブラリーからも取得で きる。ライブラリーを目的遺伝子またはそれがコードする蛋白質を認定するよう に設計したプローブでスクリーニングする。ヒトおよびラットのＦｃ_εＲＩα鎖 の完全ｃＤＮＡはＳｈｉｍｉｚｕなどに記載がある。他の動物種のＦｃ_εＲＩα 鎖をコードする核酸はＳｈｉｍｉｚｕなどの１９０９頁の図２のＦｃ_εＲＩα鎖 遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド配列を持つプローブを使用して目的種のゲ ノムＤＮＡ、肥満細胞ｃＤＮＡまたは好塩基球ｃＤＮＡのライブラリーをストリ ンジェンシーの低いスクリーニングをすることで容易に取得できる。これらプロ ーブは通常約１００またはそれ以上の塩基を含み、ラットまたはヒトのＦｃ_εＲ Ｉα鎖ｃＤＮＡ全体を構成できる。ハイブリッド化スクリーニングで検出した陽 性クローンを次にヒトおよびラットＦｃ_εＲＩα鎖に対する相同性を分析する。 一般に、所与動物種からのＦｃ_εＲＩα鎖候補はラットまたはヒトのＦｃ_εＲＩ α鎖との間に約３０％またはそれ以上のアミノ酸相同性を示し、Ｓｈｉｍｉｚｕ などがラットまたはヒトについて記載したようにＦｃ_εＲＩα鎖は免疫グロブリ ン様構造を持つであろう。 目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードする全長遺伝子のハイブリド化を確認する検定を 行う。Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡ候補を単純に発現ベクターに挿入し、 正常ならば意図する患者の目的ＩｇＥとは結合しない宿主細胞に形質転換する。 そこで、意図する患者のＩｇＥに結合する性能を獲得した形質転換体は目的とす るＦｃ_εＲＩα鎖遺伝子を持つ。例えば、Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡ候 補をｐＳＶＬベクターにサブクローニングして形質転換したＣＯＳ−７細胞によ り発現し、形質転換体をトリニトロフェニル化赤血球および意図する患者の動物 種から誘導した抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）モノクローナルＩｇＥと反応させ 、続いてＭｉｌｌｅｒなどが、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：３３４〜３３６頁（ １９８９年）に一般的に記載したようにロゼット形成を検出する。 Ｓｈｉｍｉｚｕなどはラット全長Ｆｃ_εＲＩα鎖ｃＤＮＡを成功裏に使用して ヒトＦｃ_εＲＩα鎖ｃＤＮＡクローンをヒト肥満細胞ｃＤＮＡライブラリーから 検出し、分離しているので、ラットまたはヒトのｃＤＮＡを使用すれば他の動物 種のＦｃ_εＲＩα鎖をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをライブラリーを 求めるスクリーニングに高い成功率をもって使用できることが認識されよう。 もう一つの態様は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する、たとえばＳａｍｂｒ ｏｏｋなど、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室指針）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ社（１９８９年）の１４章に記載のあるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）（米国特許４６８３１９５号、Ｅｒｌｉｃｈ編、「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ（ＰＣＲ技術）」、１９８９年）の方策である。この方法は目的とする Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードする核酸にハイブリッド化すると期待されるオリゴヌク レオチドのプライマーの使用が必要とするが、これらはＳｈｉｍｉｚｕなどが開 示したラットまたはヒトのＦｃ_εＲＩα鎖をコードするｃＤＮＡから容易に選択 される。 もう一つの態様では、Ｆｃ_εＲＩα鎖蛋白質を目的動物種の肥満細胞または好 塩基球から分離し、α鎖蛋白質を部分的にまたは完全にアミノ酸配列決定し、ア ミノ酸配列の情報を使用して縮重ＤＮＡプローブを設計し、プローブの集合を合 成してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの目的Ｆｃ_εＲＩα鎖遺伝子に ついてのスクリーニングに使用する。この一般的操作はラットＦｃ_εＲＩα鎖を コードするｃＤＮＡのクローニングに関してＳｈｉｍｉｚｕが記載している。 ３．遺伝子工学的に処理した細胞の作成 Ｆｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡを得た後、これを選択した肥満細胞または好塩基球細胞 宿主内でＦｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡを発現することのできるベクターに挿入する。ベ クター構築物はＦｃ_εＲＩα鎖をコードする領域の上流（センス一本鎖上のコー ド領域の５’方向）に肥満細胞または好塩基球細胞宿主にとって内因的なＲＮＡ ポリメラーゼによりＦｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡの転写を開始することができるプロモ ーター配列を含まねばならない。要すれば、プロモーター配列はＦｃ_εＲＩα鎖 ＤＮＡの転写を強力に推進するものである。発現ベクターは転写を促進するため のエンハンサーおよび／または転写終止配列を持つ。好ましくは、宿主細胞をマ ーカー遺伝子を含む発現ベクターで形質転換するか、または発現ベクターとマー カー遺伝子を含むベクターとで共形質転換して、形質転換体の検出または選択を 促進する。好適な態様では、Ｇｉｌｆｉｌｌａｎなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １４９巻：２４４５〜２４５１頁（１９９２年）に記載のＶＩＳ発現ベクターを 使用する。 適当な発現ベクターの構築後、肥満細胞または好塩基球細胞宿主を、たとえば 燐酸カルシウム法またはＤＥＡＥデキストラン沈殿法、電気穿孔法、ウイルス形 質導入法、または微粒子衝突法のような当分野での公知方法いずれかによって、 ベクターＤＮＡで形質転換し、形質転換体を選択培地中で生長させて検出し、選 別する。 形質転換体肥満細胞または好塩基球を次に、たとえば前記Ｍｉｌｌｅｒなどの 方法または下記実施例２に記載した方法を使用して、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖の表面 発現について検査する。目的Ｆｃ_εＲＩα鎖を発現する肥満細胞候補または好塩 基球宿主候補はアレルゲン誘導ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖複合体の交差結合に際し て、たとえばヒスタミンのような、薬理学的伝達物質放出能について検定する。 この検定は遺伝子工学的に処理した肥満細胞候補または好塩基球候補を前記ＩＩ Ｉ（ａ）（１）に記載した培地中で生長させること、培養した肥満細胞または好 塩基球を下記実施例２に記載する意図する患者の動物種から由来する公知のアレ ルゲン特異的ＩｇＥを含む血清と接触すること、感作した肥満細胞または好塩基 球を下記実施例２に記載するアレルゲンと接触すること、および前記Ｉ（ｅ）に 記載した方法いずれかにより混合物中のヒスタミン放出を測定することによって 行う。 好ましくは、意図する患者のアレルゲン特異的ＩｇＥで前感作してある遺伝子 工学的に処理した肥満細胞または好塩基球はアレルゲンのチャレンジに際して、 細胞中全ヒスタミンの７％より大きい、さらに好ましくは１０％より大きい放出 をする。許容できる放出能のある遺伝子工学的に処理した肥満細胞および遺伝子 工学的に処理した好塩基球の潜在的な集合は遺伝子工学的に処理した細胞を酸化 重水素（Ｄ₂Ｏ）の存在下にインキュベーションをすることによって増加する。 下記実施例２に示すように、培地中のＤ₂Ｏの存在はアレルゲン誘導ヒスタミン 放出を強化する。Ｄ₂Ｏはインキュベーション培地中の最終濃度約１０％から１ ００％、好ましくは約３０％から７０％、さらに好ましくは約５０％から７０％ で効果的に使用できる。 好適な態様の一つでは、Ｇｉｌｆｉｌｌａｎなどが記載したラット肥満細胞系 ＲＢＬ４８を本発明の方法で使用する。 ｂ．遺伝子工学的に処理した細胞の検定用調製 遺伝子工学的に処理した肥満細胞は、たとえばＣａｎｔｏｒなどに付与された 米国特許４５５９３１０号に記載の肥満細胞クローニングに使用された組織培養 法のような、肥満細胞培養に適当なことが公知の好都合な方法のいずれかによっ て、本発明の方法で使用するために培養できる。遺伝子工学的に処理した細胞が 全面生長した後、これらをトリプシン化し、培養培地中に懸濁し、細胞密度約０ .２×１０⁶から０.６×１０⁶細胞／ｍＬ、好ましくは約０.４×１０⁶細胞／ｍＬ に希釈する。次に、細胞をマイクロタイタープレートのウェル中に約２００００ から６００００細胞／ウェル、好ましくは約４００００細胞／ウェルで接種し、 約１日間培養する。 好適な態様の一つでは、培養上清液を、たとえば吸引により、除去し、ウェル に残留する接着細胞を培養培地で１回またはそれ以上洗浄して遺伝子工学的に処 理した細胞が自然に放出したいかなるヒスタミンの存在をも削減する。細胞洗浄 に続き、培養ウェルに適量の新鮮な培地または、より好ましくは遺伝子工学的に 処理した細胞による薬理学的伝達物質の放出を強化するように設計した塩緩衝液 を添加する。インキュベーション培地中のＣａ²⁺の存在がヒスタミン放出に実質 的効果を及ぼす（ＭａｃＧｌａｓｈａｎとＢｏｔａｎａ、前出）ので、緩衝液が Ｃａ²⁺を含有するのが好適である。その他に、緩衝液は後記実施例１および実施 例２に記載するように、ヒスタミン放出を増加するためにＭｇ²⁺を含有できる。 態様の一つでは、緩衝液は希釈したＨＢＳＳであって、最終Ｃａ²⁺濃度約０.１ ３ｍＭから０.６５ｍＭ、好ましくは約０.１８ｍＭから０.２６ｍＭ、および最 終Ｍｇ²⁺濃度約０.０９ｍＭから０.４５ｍＭ、および好ましくは約０.１３ｍＭ から０.１８ｍＭを提供する。 遺伝子工学的に処理した好塩基球は、たとえばＩｓｈｉｚａｋａなど、前出、 の方法のような、好塩基球懸濁細胞培養に適当なことが公知の好都合な方法のい ずれかによって、本発明の方法で使用するために培養できる。好ましくは、好塩 基球懸濁液培養物を約３００００から９００００細胞／ｍＬ、好ましくは約５０ ０００から７００００細胞／ｍＬの濃度まで希釈する。懸濁培養物の希釈は新鮮 な培養培地または、より好ましくは前記のようにヒスタミン放出を強化するよう に設計した塩緩衝液で実施できる。 好適な態様では、自然に放出したヒスタミンを、遺伝子工学的に処理した好塩 基球を培養培地から、たとえば遠心分離または濾過などにより、分離し、細胞を 新鮮な培養培地で１回またはそれ以上洗浄することによって、削減する。洗浄し た細胞を次に新鮮な培養培地中に再懸濁するか、または、より好ましくは、前記 のような細胞による薬理学的伝達物質の放出を促進するのに適当な緩衝液塩溶液 中に再懸濁する。この細胞懸濁液を前記所期細胞濃度になるよう調整する。 これに加え、遺伝子工学的に処理した細胞のヒスタミン放出性能は懸濁緩衝液 または培養上清液中に適当な濃度のＤ₂Ｏ（前記ＩＩＩ（ａ）（３））を添加す ることにより増強できる。好適な態様では、遺伝子工学的に処理した肥満細胞を 下記実施例２に記載のように培養する。 ｃ．検定用患者血清の調製 ＩｇＥが含まれ、および／または、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞が欠落する患者血液 のいかなる画分も本方法に従うアレルギー診断での使用に適当である。容易に採 取できるので、患者血清標本は便利な分析用画分である。 ｄ．遺伝子工学的に処理した細胞の感作 患者血清を遺伝子工学的に処理した細胞標本に、ＩｇＥ拮抗剤の存在下または 不在下に添加して、それぞれ遮断した反応混合物または反応混合物を形成する。 ＩｇＥ拮抗剤は混合物に患者血清を添加する前または同時に遺伝子工学的に処理 した細胞標本と混合できる。あるいは、患者血清はＩｇＥ拮抗剤と予め混合し、 次に遺伝子的に処理した細胞標本と混合できる。接着細胞培養物を使用する態様 では、反応混合物および遮断反応混合物は患者血清をＩｇＥ拮抗剤の存在下また は不在下に培養上清液と混合することによって形成できる。懸濁細胞培養を使用 する態様では、反応混合物および遮断反応混合物はＩｇＥ拮抗剤存在下または不 在下に患者血清を細胞懸濁液と混合することによって形成できる。 好適な態様ではヘパリンを反応混合物中に約１から１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは 約２から６Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは約３Ｕ／ｍＬの濃度で存在させる。反応 混合物中のヘパリン成分は、患者血清をヘパリン緩衝液にいれたものとして入手 するか調製するのが有利である。あるいは、ヘパリン成分は反応混合物に使用す る細胞培養培地または細胞懸濁緩衝液中に包含できる。 患者血清／遺伝子工学的に処理した細胞少なくとも２種を並行して比較する。 一方の混合物ではＩｇＥ拮抗剤を使用して患者血清ＩｇＥが遺伝子工学的に処理 した細胞に結合するのを遮断する。第二の混合物ではＩｇＥ拮抗剤不在下に患者 血清を遺伝子工学的に処理した細胞と接触させる。態様の一つでは、ＩｇＥに結 合するＩｇＥ拮抗剤は患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥを力価検定をするた めに、患者血清／遺伝子工学的に処理した細胞の混合物中で一定の濃度範囲で使 用する。ＩｇＥ拮抗剤濃度範囲の効果の分析は患者のアレルギー症状の重篤度を 評価する強力な手段を提供する。要すれば、アレルゲン特異的ＩｇＥを含有する ことが判明している血清標本も本方法に従ってＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在 下に検査して、各々陰性および陽性対照を提供する。 反応混合物中で使用する患者血清およびＩｇＥ拮抗剤の濃度はＦｃ_εＲＩα鎖 の発現水準および使用する特定の遺伝子工学的に処理した細胞の細胞濃度、宿主 細胞が発現するＦｃ_εＲＩα鎖に対する患者ＩｇＥの親和性、および患者ＩｇＥ および／または宿主細胞が発現するＦｃ_εＲＩα鎖に対するＩｇＥ拮抗剤の親和 性に依存する。好ましくは、ＩｇＥ拮抗剤は遮断反応混合物中に含有する遺伝子 工学的に処理した細胞と患者ＩｇＥとの間の相互作用を減少するに十分な濃度で 存在する。ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖相互作用の完全な遮断が所望される時には、 遮断反応混合物中に存在するＩｇＥおよび／またはＦｃ_εＲＩα鎖を飽和するに 十分なＩｇＥ拮抗剤濃度で使用するのが望ましい。抗ＩｇＥモノクローナル抗体 をＩｇＥ拮抗剤として使用し、遺伝子工学的に処理した細胞の単層を患者血清と 最終希釈率約１：１００から約１：２まで、好ましくは約１：１０で接触する時 には、患者血清／遺伝子工学的に処理した細胞混合物中の抗ＩｇＥモノクローナ ル抗体濃度の有用な範囲は約０.５から１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１から １０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約２から５μｇ／ｍＬである。反応混合物中 の遺伝子工学的に処理した細胞濃度、患者血清希釈率、およびＩｇＥ拮抗剤濃度 についての至適パラメーターは本方法のいずれの態様についても常用的実験によ って容易に決定できることが認識されると思われる。 反応混合物および遮断反応混合物はＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体に結合するのに 適する条件下にインキュベーションする。好適な条件は下記実施例２に記載する ように加湿５％ＣＯ₂培養器中、約３７℃でのインキュベーション約２時間であ る。 ｅ．感作した遺伝子工学的に処理した細胞のアレルゲンチャレンジ インキュベーションに続き、反応混合物および遮断反応混合物を目的アレルゲ ンでチャレンジする。もし遺伝子工学的に処理した細胞の接着培養物を使用する なら、前記ＩＩＩ（ｂ）に記載のように、要すれば培養上清液を、たとえば吸引 により、除去し、Ｄ₂Ｏ（アレルゲンチャレンジに際してヒスタミン放出を最大 にするため）含有または不含の塩緩衝溶液に置換する。アレルゲンチャレンジは 反応容積約５０から２００μＬ、好ましくは約１００から１５０μＬ、中で実行 するのが有利である。そこで、感作細胞の接着細胞培養の場合は、培養上清液を 約５０から２００μＬ、好ましくは約１００から１５０μＬの前記塩緩衝液と置 換するのが望ましい。遺伝子工学的に処理した細胞の懸濁液の場合には、約５０ から２００μＬ、好ましくは約１００から１５０μＬ量の感作細胞懸濁液を使用 してアレルゲンチャレンジ用反応容積を提供するのが望ましい。 約０.０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０.０５μｇ／ ｍＬから１５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約０.１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍ Ｌのアレルゲン濃度が本検定における殆どのアルレルゲンと感作した遺伝子工学 的に処理した細胞との反応には適当である。 このアレルゲン反応混合物用インキュベーション条件はヒスタミン放出を誘導 させるように選択する。好適な態様の下では、反応混合物を、低くとも３２℃、 さらに好ましくは低くとも３７℃±１℃の温度で、約２０から３０分間インキュ ベーションする。 ｆ．ヒスタミン放出の検定 アレルゲン反応混合物中のヒスタミン放出は、たとえばマイクロタイタープレ ートを氷上に置くような、好都合な方法いずれによっても反応容器内温度を鋭く 低下することにより停止できる。アレルゲン誘導ヒスタミン放出測定のために、 反応混合物上清液を濾過または遠心分離によって細胞から分離し、上清液中のヒ スタミンを前記Ｉ（ｅ）記載のヒスタミン検出検定法のいずれかにより測定でき る。細胞中全ヒスタミン測定のためには反応液中の遺伝子工学的に処理した細胞 を、たとえば超音波処理、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ圧搾、トリトンＸ−１０ ０のような界面活性剤での処理、または浸透圧および凍結解凍など、便利な方法 いずれかによって破壊し、濾過または遠心分離により細胞破砕物からヒスタミン を分離し、ヒスタミンを前記の通りに定量する。 最後に、ＩｇＥ拮抗剤に起因するヒスタミン放出阻止百分率を算出する。アレ ルゲンが誘導するヒスタミン放出はアレルゲン誘導ヒスタミン値を細胞中全ヒス タミン値で除算して細胞中全ヒスタミンの百分率として表現でき、遮断反応混合 物および非遮断反応混合物のおのおのについて遮断百分率および非遮断百分率を 得る。特定濃度のＩｇＥ拮抗剤で起きる阻止百分率は非遮断百分率から遮断百分 率を減算し、この差を非遮断百分率で除算することにより決定できる。あるいは 阻止百分率はＩｇＥ拮抗剤存在下のヒスタミン放出量をＩｇＥ拮抗剤不在下のヒ スタミン放出量から減算し、この差をＩｇＥ拮抗剤不在下のヒスタミン放出量で 除算して算出できる。そのＩｇＥ拮抗剤がヒスタミン放出を削減する性能は患者 血清中でのアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を示し、それ故特定アレルゲンに対す るアレルギー反応を認定する。ヒスタミン放出削減に必要なＩｇＥ拮抗剤の量は アレルギー症状の強度と重篤度の指標である。 ＩＶ．遺伝子工学的に処理した細胞による患者血清中アレルゲン特異的ＩｇＥ 検出用キット 本発明の検査システムはキットの形で供給でき、その内容は遺伝子工学的に処 理した肥満細胞または遺伝子工学的に処理した好塩基球を含むバイアル、ＩｇＥ 拮抗剤を含むバイアル、および目的アレルゲンを含むバイアル１種またはそれ以 上から構成される。遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球は凍結型で 好都合に供給できるが、この場合は使用前に適当な公知解凍操作による再生化が 必要である。このキットには細胞培養中に遺伝子工学的に処理した肥満細胞また は好塩基球の増殖を支えることができる必須栄養素、エネルギー源、増殖因子な どを含む培地をいれたバイアルおよび／または前記ＩＩＩ（ｂ）に記載したよう に反応混合物中で薬理学的伝達物質の放出を促進するのに適切な緩衝塩溶液を含 むバイアルも包含することができる。 要すれば、目的アレルゲンに特異的なＩｇＥを含むバイアル１種またはそれ以 上を陽性対照として提供する。アレルゲン特異的ＩｇＥ陽性対照は、検査すべき 患者と同じ動物種から由来する。アレルゲン特異的ＩｇＥ陽性対照は所定濃度で 提供され、アレルゲン特異的ＩｇＥを力価測定するために有用な標準曲線の構築 を促進する。 態様の一つでは、このキットには遺伝子工学的に処理した細胞により放出され る薬理学的伝達物質の分析に使用する試薬を含むバイアルも包含する。 他の態様では、このキットには包装ラベルまたは前記ＩＩＩに記載した方法い ずれかでのキットの使用に関する指示を提供する包装挿入物も包含する。 Ｖ．ＩｇＥ拮抗剤のスクリーニング 本発明はＩｇＥ誘導免疫細胞の感化を遮断する薬剤の生物活性検定法も提供す る。本法はアレルギー疾患処置用治療剤のスクリーニングに使用できる。本法は 前記アレルギー診断法またはその他のいずれの目的において使用するためのＩｇ Ｅ拮抗活性をもつ薬剤のスクリーニングにも使用できる。一般に、本法は前記ア レルギー疾患診断法におけるＩｇＥ拮抗剤の代わりに被検薬剤を使用することに 関連する。アレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞とをその薬剤の存在 または不在下に接触することによってアレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容 体との間の相互作用を遮断する性能についてある薬剤を検定する。アレルゲン特 異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩの相互作用はアレルゲンを添加し、即時的なヒスタミン またはその他の薬理学的伝達物質の放出を測定することによって検定する。その 薬剤含有混合物中のヒスタミン濃度の低さはその薬剤のＩｇＥ拮抗作用を示す。 目的アレルゲンに特異的なＩｇＥを含み、およびＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を欠落 した血清標本はいずれもＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の活性検定にお ける使用に適当である。適当な血清標本は前記のようにアレルギー性患者から入 手できる。この態様では、ある薬剤は特定の患者からのアレルゲン特異的ＩｇＥ を遮断する性能について検定でき、その特定患者における種々の薬剤の治療効果 を評価するために強力な手段を提供する。たとえば下記実施例で使用するブタク サ特異的ヒト血漿（ＲＳＨＰ）のような商業的に調製した血漿製品も本発明での 使用に好適である。 ＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の活性検定において使用するのに適当 なナイーブ提供者血液またはその他のナイーブ提供者組織標本の画分は前記アレ ルギー性疾患診断法について記載したようにして取得し、調製できる。 血清標本をその薬剤の存在下または不在下にナイーブ提供者組織標本に添加し てそれぞれ遮断感化混合物または感化混合物を形成する。提供者組織として全血 または血液画分を使用する時は、血清および提供者血液を前記アレルギー性疾患 診断法について記載した割合で混合できる。 血清／ナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の混合物少なくとも２種を並行し て比較する。一方の混合物では、血清ＩｇＥのナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫 細胞への結合を遮断するためにその薬剤を使用する。第二の混合物では、その薬 剤の不在下に血清をナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞に接触させて陽性対照 を提供する。好適な態様では、一連の血清／提供者組織混合物を所定濃度範囲で アレルギー性疾患の処置におけるその薬剤の効果を評価するために使用し、また はその薬剤のＩｇＥ拮抗剤としての活性を測定するために使用する。被検薬剤が モノクローナル抗体である時および使用する提供者組織が全血または血液画分で ある時、血清／血液提供者混合物中の抗体濃度の有用な範囲は好ましくは約０. ００１から１０μｇ／ｍＬ、より好ましくはくは約０.０１から５μｇ／ｍＬ、 さらにより好ましくは約０.０１から２μｇ／ｍＬである。 薬剤は、提供者組織混合物に血清を添加する前または同時に提供者組織と混合 できる。あるいは、その血清を薬剤とあらかじめ混合し、次に提供者組織混合物 に添加できる。 提供者組織／血清混合物はアレルギー性疾患診断法について前記した条件下に インキュベーションする。 インキュベーションに続いて、感化混合物および遮断感化混合物の適量を目的 アレルゲンでチャレンジする。アレルゲン反応混合物の適当な量、アレルゲン量 およびインキュベーション条件はアレルギー性疾患診断法について前記した。 アレルゲン反応混合物中に放出されたヒスタミンは前記アレルギー性疾患診断 法について記載した技術いずれかにより測定できる。最後に、その薬剤に起因す るヒスタミン放出の阻止百分率を算出する。特定濃度の薬剤に起因する阻止百分 率はその薬剤濃度の存在下に放出されたヒスタミン量をその薬剤不在下に放出さ れたヒスタミン量から減算し、その差をその薬剤不在下に放出されたヒスタミン 量で除算して決定する。その薬剤がヒスタミン放出を減少する性能はアレルギー 性疾患の処置でのその薬剤の効果および／またはＩｇＥ拮抗剤としてのその薬剤 の活性の指標である。ヒスタミン放出を減少するのに必要なその薬剤の量は抗ア レルギー性治療剤および／またはＩｇＥ拮抗剤としてのその薬剤の強さの指標で ある。 これに加えて、本発明は免疫細胞脱顆粒反応を阻止する性能についての薬剤の スクリーニング法を提供する。この方法では薬剤で処置した患者からの免疫細胞 または試験管内でその薬剤とともにプレインキュベーションした提供者免疫細胞 を、まずＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下にアレルゲン特異的ＩｇＥと混合し て、次にその混合物をアレルゲンでチャレンジする。ヒスタミン放出を減少する ＩｇＥ拮抗剤の性能は免疫細胞脱顆粒反応を阻止するその薬剤の性能の指標であ ろう。この方法は肥満細胞および好塩基球の両方における脱顆粒反応を阻止する その薬剤の性能を検査するために使用できる。 本発明の使用に適当なＩｇＥ拮抗剤には抗ＩｇＥ抗体およびその断片、可溶性 Ｆｃ_εＲＩ受容体、ＩｇＥ変異体およびその断片、Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプ チド、ＩｇＥ結合性ペプチド、およびＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞がアレルゲン刺激に 応答して薬理学的伝達物質単数または複数を放出しないように、ＩｇＥとＦｃ_ε ＲＩ受容体との間の相互作用を分裂または遮断することのできる非蛋白質性低分 子を包含する。ある化合物をＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の前記生物 活性検定法に従ってＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。 拮抗剤候補は免疫細胞ヒスタミン放出誘導不能性についてスクリーニングでき る。このような作用はアレルギー性疾患を診断する本発明の方法におけるＩｇＥ 拮抗剤の効果を損なう筈である。その上に、ヒスタミン放出を始動する薬剤の性 能は患者でのアレルギーを刺激または悪化するものと思われ、それ故、抗アレル ギー性治療剤のためには望ましくない特性である。ある薬剤のヒスタミン放出誘 導作用は感化免疫細胞をアレルギー性疾患診断法について前記したアレルゲンの 代わりにその薬剤と混合することによって検査できる。アレルゲンまたは緩衝液 のみと混合した感化免疫細胞はおのおの陽性対照および陰性対照として役立つ。 好適な態様では、下記実施例に記載したようにヒスタミン放出の誘導について、 その薬剤を検査する。もしその薬剤がヒスタミン放出を誘導しなければ、すなわ ち、陰性対照の水準よりも実質的に高くなければ、その薬剤は本発明での使用が 許容できる。 ＶＩ．ＩｇＥ拮抗剤の作成 好適な態様の一つでは、抗ＩｇＥ抗体をＩｇＥ拮抗剤として使用する。この抗 ＩｇＥ抗体は、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのよう な、ＩｇＥに対して産生されるそのような抗体のポリクローナルおよびモノクロ ーナル型を含むいずれの型の免疫グロブリンであることもできる。 ＩｇＥに対するポリクローナル抗体は一般に動物へのＩｇＥおよびアジュバン トの多回皮下（ｓｃ）または腹腔（ｉｐ）注射により産生される。ＩｇＥまたは ＩｇＥのＦｃ領域からの標的アミノ酸配列を含む断片を、免疫すべき種において 免疫原である蛋白質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブ ミン、ウシ甲状腺グルブリンまたは大豆トリプシン阻止剤など、に双官能試薬ま たは誘導化剤、例えば、マレインイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエステ ル(システイン残基経由複合)、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド(リジン残基経由) 、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、 ここにＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である、など、を使用して複合すること は有用であろう。 動物は通常は、ＩｇＥ１ｍｇまたは１μｇと完全フロイントアジバントを結合 し、この溶液を多数部位に皮内注射することによって、細胞または免疫原複合体 または誘導物に対して免疫される。１ケ月後、不完全フロイントアジュバント中 で元の量の１／５から１／１０の複合体を動物の多数部位に皮下注射してブース ト（ｂｏｏｓｔ）する。７から１４日後、動物から採血し、血清を抗ＩｇＥ力価 検定する。力価がプラトーになるまで動物をブーストする。好ましくは、動物を 同じＩｇＥの複合体であるが、異なる蛋白質への複合体および／または異なる交 差結合剤によるものでブーストする。複合体は組換え細胞培養物中に蛋白質融合 体として製造できる。また、たとえば明礬のような、凝集剤を使用して免疫反応 を強化する。 モノクローナル抗体は免疫した動物から脾臓細胞を採取し、その細胞を、たと えば骨髄腫細胞との融合またはエプスタイン−バール（ＥＢ）ウイルス形質転換 と所期抗体を発現するクローンのスクリーニングとによるなど、通常の様式で不 死化して調製する。最初にＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがＥｕｒ．Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１頁（１９７６年）に、また、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎ ｇなどが「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ）」、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ中、５６３〜６８１頁（１９８１年）に記載したハイブ リドーマ技術は特異的抗原多数に対するモノクローナル抗体を高水準で分泌する ハイブリッド細胞系の調製に広範に応用されてきた。 ハイブリッド細胞系は試験管内で細胞培養培地内に維持できる。抗体を生産す る細胞系はヒポキサンチン−アミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培地内の連続細 胞系からなる組成物中で選択し、および／または維持できる。実際、一旦ハイブ リドーマ細胞系が樹立されると、種々の栄養的に適当な培地上に維持できる。そ の上、ハイブリッド細胞系は、液体窒素下の凍結および貯蔵を含む、常法多数の いずれかで貯蔵し、保存できる。凍結した細胞系は再生し、モノクローナル抗体 の合成および分泌の再開を伴って無限に培養できる。 分泌した抗体は、たとえば沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロ マトグラフィーのような、常法によって組織培養上清液から回収する。ここに記 載する抗体もハイブリドーマ細胞培養物から、これまで血漿集積から免疫グロブ リン精製用に使用されてきたＩｇＧまたはＩｇＭの精製用の常法、たとえばエタ ノールまたはポリエチレングリコール沈降操作など、によって回収する。精製し た抗体は無菌濾過する。 日常的にはマウスのモノクローナル抗体を使用するが、本発明はこれに限定さ れるものではない、事実、ヒト抗体も使用できる。このような抗体は、例えば、 ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅなど、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（モノクローナル抗体およ び癌治療）」、Ａｌａｎ Ｒ．、Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年））により、入 手できる。事実、本発明に従えば、動物の抗原結合性可変ドメインをヒト定常ド メインを結合することによるキメラ抗体生産用に開発された技術（Ｃａｂｉｌｌ ｙなど、米国特許４８１６５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁(１９８４年)、Ｂｏｕｌｉａｎｎ ｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６４３〜６４６頁(１９８４年)、Ｎｅｕｂｅ ｒｇｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６０４頁(１９８４年)、Ｎｅｕｂｅｒ ｇｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：２６８〜２７０頁(１９８５年)、Ｔａｋ ｅｄａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：４５２頁(１９８５年)、欧州特許１８４ １８７、欧州特許１７１４９６、欧州特許１７３４９４、ＰＣＴ ＷＯ８６／０ １５３３、Ｓｈａｗなど、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．、８０巻：１５５ ３〜１５５９頁(１９８８年)、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻： １２０２〜１２０７頁(１９８５年)、Ｏｉなど、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 ４巻：２１４頁（１９８６年））を利用でき、そのような抗体はこの発明の範囲 内である。用語「キメラ」抗体は、ここでは少なくとも抗体分子の抗原結合部位 を含み、少なくとももう一つの他の蛋白質の一部に結合している（典型的には免 疫グロブリン定常ドメイン）ポリペプチドを記載するために使用する。 態様の一つでは、このようなキメラ抗体は齧歯類（またはその他の非ヒト種） 配列約三分の一を含み、そこで、ヒトで著明な抗グロブリン反応を起こすことが できる。例えば、ネズミ抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３の場合には、得られる抗グ ロブリン反応は多くが可変領域に対するもので、定常領域に対するものではない （Ｊａｆｆｅｒｓなど、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４１巻：５７２〜５ ７８頁（１９８６年））。 ヒト化抗体は、人におけるいずれかの抗グロブリン免疫反応を軽減または除去 するために使用する。実際に、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であって、そこ では、抗原結合部位の形成に直接関与している可変ドメイン中の超可変領域であ る相補性決定領域（ＣＤＲｓ）からのアミノ酸残基、およびおそらく可変ドメイ ン内のいくらか保存がなされている配列の領域であるフレームワーク領域（ＦＲ ｓ）からのアミノ酸、が齧歯類抗体中の類似部位からの残基で置換されている。 ヒト化抗体の構築はＲｉｅｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３ 〜３２７頁(１９８８年)、Ｑｕｅｅｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：１００２９〜１００３３頁(１９８９年)、Ｃｏなど、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：２８６９〜２８７３ 頁(１９９１年)、Ｇｏｒｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁(１９９１年)、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙなど 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９巻：２４７１〜２４７６頁(１９ ９１年)、Ｂｒｏｗｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８８巻：２６６３〜２６６７頁(１９９１年)、Ｊｕｎｇｈａｎｓなど、Ｃａｎｅ ｒ Ｒｅｓ．、５０巻：１４９５〜１５０２頁(１９９０年)、Ｆｅｎｄｌｙなど 、Ｃａｎｅｒ Ｒｅｓ．、５０巻：１５５０〜１５５８頁(１９９０年)、および ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６６９２およびＷＯ９２／２２６５３に記載されている 。 場合によっては、齧歯類抗体からのＣＤＲをヒトのフレームワーク領域にある ヒトＣＤＲに置換することは高い抗原結合親和性の移動に十分（Ｊｏｎｅｓなど 、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁(１９８６年)、Ｖｅｒｈｏｅｙｅ ｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））で あるが、一方では他の場合にはさらに１個（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎなど、前出）ま たは数個（Ｑｕｅｅｎなど、前出）のＦＲ残基を追加的に置換することが必要で ある。Ｃｏなど、前出、も参照。 本発明はトランスジェニック動物の生産でのヒト抗体の使用も包含する。この システムでは、目的抗体をコードするＤＮＡを分離し、動物宿主の生殖系に安定 的に導入する。この抗体はその動物により生産され、その動物の血液または他の 体液から収穫する。あるいは、所期抗体を発現する細胞系を動物宿主から分離し て、試験管内で抗体を生産するために使用し、その抗体を標準法により細胞培養 物から収穫する。 本発明の方法での使用に殊に好適なものは、下記実施例に記載するヒト化抗Ｉ ｇＥ抗体Ｅ２５（ｒｈｕＭＡｂＥ２５）である。ｒｈｕＭＡｂＥ２５の構築はＰ ｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２５２３〜２６３２頁（１ ９９３年）に開示されている。 抗ＩｇＥ抗体断片も本発明の方法で使用できる。免疫細胞または遺伝子工学的 に処理した細胞とのＩｇＥ相互作用を遮断または分裂することができる抗ＩｇＥ 抗体の断片はいずれもここでの使用に適当である。この抗体断片は免疫細胞また は遺伝子工学的に処理した細胞中でのヒスタミン放出を始動することができない ことが好ましい。 適当な抗ＩｇＥ抗体断片は組合せ可変ドメインライブラリーを所期抗体断片を 発現することのできるＤＮＡについてスクリーニングして入手できる。抗体分子 の抗原結合領域の組換えＤＮＡ版（Ｆ（ａｂ）断片と呼ばれる）を作成するため のこれら技術は、モノクローナル抗体の作成を回避するが、この発明の実施の範 囲内に包含する。そこで抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を免疫した動物か ら得た免疫システム細胞から抽出し、これらを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）中に転写 し、そのｃＤＮＡを細菌発現系内にクローニングする。この発明の実施に適当な このような技術の一例はスクリプス／ストラタジェンの研究者が開発し、所有す るバクテリオファージラムダベクター系に導入するものである。このベクター系 は発現したＦ（ａｂ）蛋白質の細胞質縁辺空隙（細菌の細胞膜と細胞壁との間） への移動を起こすか、分泌させるリーダー配列を含む。抗原に結合する機能的な Ｆ（ａｂ）断片を無数に迅速に発生させて、スクリーニングできる。このような ＩｇＥ結合分子（ＩｇＥ蛋白質について特異的なＦ（ａｂ）断片）もここに特定 的に定義し、討論し、請求する用語「抗体」の中に包含する。 本発明の別の態様では、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体をＩｇＥ拮抗剤として使用で きる。ここで使用するために適当な可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体はＦｃ_εＲＩα鎖の 細胞外ドメイン（エキソドメイン）にＩｇＥ結合部位を含む分子を包含する。こ のＦｃ_εＲＩのα鎖は、Ｂｌａｎｋなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻 ：２６３９〜２６４６頁（１９９１年）またはＱｕなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． 、１６７巻：１１９５頁の方法に従って、エキソドメインを可溶性蛋白質として 組換え発現システム中に分泌するように遺伝子的に修飾できる。前記したＩｇＥ が誘導する免疫細胞の感化遮断薬剤の生物活性検定法に従えば、ＩｇＥ拮抗剤と しての活性について可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体候補をスクリーニングできる。ある い は、ＩｇＥと前記遺伝子工学的処理細胞によるアレルギー診断法での遺伝子工学 的に処理した細胞との間の相互作用をその可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体候補がブロッ クするように使用することによって、ＩｇＥ拮抗剤としての活性について可溶性 Ｆｃ_εＲＩ受容体候補をスクリーニングできる。 本発明は抗ＩｇＥ抗体および可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体に加えて、ＩｇＥ結合性 ペプチドの使用も包含する。ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との間の相互作用を分裂 または遮断することのできるＩｇＥ結合性ペプチドはいずれもここでの使用に適 当である。ＩｇＥ結合性ペプチド候補はＩｇＥ誘導免疫細胞の感化を遮断する薬 剤の生物活性を検定する前記方法に従って、ＩｇＥ拮抗剤としての活性について スクリーニングできる。その他にＩｇＥ結合性ペプチド候補は、前記遺伝子工学 的に処理した細胞によるアレルギー診断法のいずれかによって、ＩｇＥと遺伝子 工学的に処理した細胞との間の相互作用を遮断するためにそのＩｇＥ結合性ペプ チド候補を使用すれば、ＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングでき る。 このＩｇＥ結合性ペプチドは免疫細胞または遺伝子工学的に処理した細胞中で ヒスタミン放出を誘導できないものが好ましい。ＩｇＥ結合性ペプチド候補は前 記アレルギー性疾患診断法のいずれかにおいて、感化免疫細胞（または感化した 遺伝子工学的に処理した細胞）と、アレルゲンの代わりにそのペプチドとを混合 すれば、検査できる。アレルゲンまたは単なる緩衝液と混合した感化細胞はそれ ぞれ陽性および陰性対照として役立つ。もしＩｇＥ結合性ペプチド候補がヒスタ ミン放出を誘導しなければ、すなわち陰性対照の水準よりも実質的に高くなけれ ば、そのペプチドは本発明の方法での使用について許容される。 たとえば、前記した抗ＩｇＥ抗体、その断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、その 他の前記ＩｇＥ結合性ペプチドのようなＩｇＥに結合することによってＩｇＥ／ Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用を妨害するＩｇＥ拮抗剤に加えて、本発明はＦｃ_εＲ Ｉ受容体への結合についてＩｇＥと競合して、利用可能なＦｃ_εＲＩ受容体を減 少させることによってＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用を分裂するＩｇＥ拮抗 剤の使用を包含する。 ＩｇＥ変異体は本発明の方法での使用に適当なＦｃ_εＲＩ受容体結合競合体の 一例である。ＩｇＥ変異体は、たとえば単数または複数のアミノ酸置換および／ または単数または複数のアミノ酸欠失のような変換を持ち、免疫細胞を感化する この変換ＩｇＥ分子の性能が低下または除去されるもの、およびこの変換ＩｇＥ 分子がＦｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合することができるもの、 であるＩｇＥの形態である。ＩｇＥ変異体候補は、前記のＩｇＥ誘導の免疫細胞 感化を遮断する薬剤の生物活性の検定法に従えば、ＩｇＥ拮抗剤としての活性に ついてスクリーニングできる。その他に、ＩｇＥ変異体候補は、前記遺伝子工学 的に処理した細胞によるアレルギー診断法のいずれかで遺伝子工学的に処理した 細胞とＩｇＥとの間の相互作用を遮断するためにそのＩｇＥ変異体候補を使用す ることによって、ＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。 ＩｇＥ変異体候補は免疫細胞感化活性または遺伝子工学的に処理した細胞感化 活性の不在について、アレルゲンチャレンジに際してのＩｇＥ変異体感化細胞の ヒスタミン放出とＩｇＥ感化細胞のヒスタミン放出とを比較すれば検査できる。 もし、ＩｇＥ変異体候補を含む混合物中のヒスタミン放出の水準がＩｇＥを含む 混合物中のヒスタミン放出の水準よりも実質的に低ければ、その変異体は本発明 の方法における使用に適当である。 ＩｇＥ変異体の断片も、ここでの使用に適する。Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合に ついてＩｇＥと競合することのできるＩｇＥ変異体の断片は本発明の方法で使用 できる。ＩｇＥ変異体断片候補は前記ＩｇＥ変異体候補についての方法に従えば 所期の活性について検査できる。 本発明はＩｇＥ変異体およびその断片に加えてＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチ ドの使用も包含する。ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との間の相互作用を分裂または 遮断することができるＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドは、いずれもここでの使 用に適当である。Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド候補はＩｇＥ拮抗剤としての 活性について、前記したＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の生物活性検定 法に従って、スクリーニングできる。その他に、Ｆｃ_εＲＩ結合性ペプチド候補 は前記した遺伝子工学的に処理した細胞によるアレルギー診断法のいずれかにお いて、ＩｇＥと遺伝子工学的に処理した細胞との間の相互作用を遮断するために Ｆｃ_εＲＩ結合性ペプチド候補を使用すればＩｇＥ拮抗剤としての活性について スクリーニングできる。 このＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドは免疫細胞または遺伝子工学的に処理し た細胞中でヒスタミン誘導できないのが好ましい。Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプ チド候補は免疫細胞感化活性（または遺伝子工学的に処理した細胞感化活性）の 欠落について、ＩｇＥ変異体の免疫細胞（または遺伝子工学的に処理した細胞） 感化活性の検査について前記したものと同じ方法によって、検査できる。 本発明の実施はペプチドＩｇＥ拮抗剤の使用に限定されていない。ＩｇＥ拮抗 剤として機能できるいかなる化合物も、非蛋白質性の低分子化合物も含めて、本 発明の方法における使用について好適である。そのような化合物はＩｇＥ拮抗剤 活性について、前記方法でＩｇＥ拮抗剤としてその化合物を使用することによっ て、検査できる。もしその化合物が感化された免疫細胞（または感化された遺伝 子工学的に処理した細胞）中で薬理学的伝達物質単数または複数の放出を始動で きなければ、またアレルゲン刺激に感応して薬理学的伝達物質単数または複数を 放出せずに、ＩｇＥと免疫細胞（または遺伝子工学的に処理した細胞）上の高親 和性受容体Ｆｃ_εＲＩとの間の相互作用を分裂または遮断することができれば、 その化合物にはここに定義し、記載し、請求するＩｇＥ拮抗剤の一つとしての資 格がある。 本発明のさらなる詳細は下記実施例に見出すことができ、本発明の範囲をさら に定義する。ここに引用する文献はその全体について参考のために明示的に引用 するものである。 実施例 実施例１ １．材料および方法 ａ．材料 通常のハイブリドマ技術により製造したモノクローナル抗体をＣａｒｔｅｒな ど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜４２ ８９頁（１９９２年）およびＰｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１巻 ：２６２３〜２６３２頁（１９９３年）によって記載のように、ヒト化し、分離 した。これらには好塩基球上のＩｇＥに結合してヒスタミン放出を始動する（Ｐ ｒｅｓｔａなど）ネズミ抗ヒトＩｇＥ ＭＡｂ(ＭＡＥ１)、ヒト化抗ヒトＩｇＥ ＭＡｂ(ｒｈｕＭＡｂＥ２５)、ヒト化抗ＨＥＲ２ ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ ２）およびヒト化抗ＣＤ１８ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８）を包含する。ヒト ＩｇＧＦｃ断片はＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ社、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ 、ＰＡから購入した。ブタクサ抗原Ｅ−ＢおよびＥ−Ｃ（ロット番号Ａ−６０１ −９０３Ａ−１８５）はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌ ｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手した。チリダニアレルゲン（Ｄ．ｆａｒ ｉｎａｅおよびＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ ５０／５０ｍｉｘ、ロット６ ６９１ＵＭ）はＭｉｌｅｓ社、Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ、ＣＴからである。ブタク サ特異的ヒト血漿（ＲＳＨＰ）およびチリダニ特異的ヒト血漿（ＤＭＳＨＰ）は Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬから 入手した。ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、ＩＸ）はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社、Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄからである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、第Ｖ 画分）はＳｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏから入手した。ＣａＣｌ₂２Ｈ₂ ＯおよびＭｇＣｌ₂６Ｈ₂ＯはＢａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｐｉｔｔｓｂｕ ｒｇｈ、ＮＪから入手した分析純級の試薬であった。 ｂ．血液提供者 検定用ヘパリン化全血は一群の非アレルギー性またはアレルギー性個体から入 手した。この群は女子１７名（非妊婦）と男子２６名とから構成され、年齢２２ から５１才の範囲で、平均３４±７才であった。ボランティアは全例が治療を受 けておらず、事前告知を承認した。 ｃ．ブタクサアレルゲン誘導ヒスタミン放出検定 あらかじめスクリーニングした提供者からの全血（５ｍＬ）をヘパリン管（Ｂ ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取し、４時間以内に検定に使用した。血 液をＨＢＳＳ／１％ＢＳＡで１：７に希釈した。希釈血液９部をＲＳＨＰ１部に 添加し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５標準（最終濃度０.０１から２μｇ／ｍＬ）の存在 下または不在下に加湿５％ＣＯ₂培養器中、３７℃で２時間インキュベーション した。インキュベーションの後、標本１００μＬを緩衝液（酵素免疫検定キット で提供されたＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ）５０μＬ、ブタクサアレルゲン（ＰＢＳ／ ０.０１％ＢＳＡ中、０.３μｇ／ｍＬ）またはＭＡＥ１（ＰＢＳ／０.０１％Ｂ ＳＡ中、３０μｇ／ｍＬ）を含む丸底９６ウェル非組織培養プレート（Ｃｏｓｔ ａｒ３７９７）に移し、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。プレ ートを氷上に移してインキュベーションを停止した。プレートを９００×ｇで５ 分間遠心分離し、上清液を収穫してヒスタミンを測定した。各血液標本について 、標本５０μＬを蒸留水９５０μＬと混合し、続いて凍結と解凍を１５分サイク ルで２回行うことにより、細胞中の全ヒスタミンを測定した。標本を９００×ｇ で５分間遠心分離し、上清液を集めた。上清液中のヒスタミン濃度を、製造元の 指示書に従ってヒスタミン酵素免疫検定キット（ＡＭＡＣ社、Ｗｅｓｔｂｒｏｏ ｋ、ＭＥ）により、測定した。略述すれば、ヒスタミンをアシル化し、マイクロ ウェル上に被覆した抗体への結合についてヒスタミンアセチルコリンエステラー ゼと競合させた。１８時間後、各ウェルを洗浄し、結合した酵素活性を発色団基 質（ジチオニトロ安息香酸アセチルコリンエステル）の添加により測定した。４ ０５ｎｍでの発色強度を使用して標本中のヒスタミン濃度をキットに添付された 標準で得た標準曲線によって計算した。算出したヒスタミン濃度を次に細胞中全 ヒスタミンに対する百分率に換算した。ブタクサによるヒスタミン放出を分母と してｒｈｕＭＡｂＥ２５によるブタクサ誘導ヒスタミン放出の阻止百分率を計算 した。様々なｒｈｕＭＡｂＥ２５製品の生物活性を標準希釈曲線から測定し、そ こでブタクサ誘導ヒスタミン放出の阻止百分率を最小自乗非線形４母数適合度プ ログラムを使用してｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度に対してプロットした。 ｄ．２価カチオンの研究 全血をＣａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まないハンクの平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ^--）に ＣａＣｌ₂２Ｈ₂Ｏ、ＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏ、またはＣａＣｌ₂２Ｈ₂ＯプラスＭｇＣｌ₂ ６Ｈ₂Ｏを最終濃度０、０.３２５、０.６２５、１.２５、２.５、５、および１ ０ｍＭで添加したもので１：７に希釈する以外は、前記段階ｃに記載したものと 同じ方法でヒスタミン放出検定を実行した。１０％ＲＳＨＰで２時間感化した後 、希釈血液をブタクサアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）で３７℃で３０分間チャ レンジした。上清液中のヒスタミン放出を測定し、細胞中全ヒスタミンに対する 百分率に換算した。 ｅ．酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）の研究 検定用血液提供者のスクリーニングにあたり、酸化重水素の効果を測定した。 非アレルギー性提供者１７名からのヘパリン化全血を１０％ＲＳＨＰで前記検定 の構成におけるように感化し、次にＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡか、または酸化重 水素（最終濃度３３.３％）かの中で調製したブタクサアレルゲンでチャレンジ した。３０分間インキュベーション後の上清液中のヒスタミン放出を定量し、細 胞中全ヒスタミンに対する百分率に換算した。 ｆ．チリダニアレルゲン誘導ヒスタミン放出検定 非アレルギー性提供者全血をハンクス緩衝液で１：７に希釈し、ｒｈｕＭＡｂ Ｅ２５（１μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下に、チリダニにアレルギー性個体 から採取した血漿（最終濃度１０％）７個とともに個々に２時間プレインキュベ ーションし、次に前記段階ｃに記載した操作に従ってチリダニアレルゲンでチャ レンジした。上清液中のヒスタミン濃度を定量した。２．結果 ａ．ｒｈｕＭＡｂＥ２５のヒスタミン放出始動不能性 最初の研究はｒｈｕＭＡｂＥ２５はＲＳＨＰ感化好塩基球に結合せず、抗原刺 激不在下にはヒスタミン放出を始動しないことを確認するために実行した。提供 者１２名からの全血標本を１０％ＲＳＨＰで前感化し、ブタクサアレルゲン０. １μｇ／ｍＬ、ＭＡＥ１（Ｐｒｅｓｔａなどが記載したように、好塩基球表面上 のＩｇＥに結合でき、ヒスタミン放出を始動できるネズミＭＡｂ）１０μｇ／ｍ Ｌ、１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５、またはＨＢＳＳ／１％ＢＳＡでチャ レンジした。インキュベーションの後、上清液中のヒスタミン濃度を定量した。 ブタクサアレルゲンとＭＡＥ１との両方はヒスタミン放出を起こした。しかしな がら、ｒｈｕＭＡｂＥ２５は背景水準以上にはヒスタミン放出を誘導しなかった （図１）。 ｂ．ＲＳＨＰによる好塩基球感化 好塩基球を最高度に感化するために、ブタクサに対してアレルギー性であるこ とが判明している個体から採取したヒト血漿標本７個をヒスタミン放出誘導性能 についてスクリーニングした。ＲＳＨＰロット番号４２−３６５０５４（全Ｉｇ Ｅ１.６４μｇ／ｍＬ）はブタクサアレルゲンでチャレンジ後、常に最高のヒス タミン放出を示した（図２）。そこで、ＲＳＨＰ（ロット４２−３６５０５４） をその後の検定全てで好塩基球を感化するために使用した。図３に示すように、 全血中の好塩基球のブタクサ特異的ＩｇＥを含む外因性ヒト血漿（ＲＳＨＰ）に よる前感化は、後続するブタクサアレルゲンによるチャレンジに際しての、ヒス タミン放出のための必要条件の一つであった。ＲＳＨＰ不在下には、背景水準の ヒスタミンが検出されたが、一方ＲＳＨＰ存在下には用量依存性のヒスタミン放 出が観察された。 ｃ．提供者スクリーニング 非アレルギー性ボランティアを検定で提供者として使用する前にプレスクリー ニングした。スクリーニング実験計画はｒｈｕＭＡｂＥ２５（１０μｇ／ｍＬ） の存在下および不在下に提供者全血を１０％ＲＳＨＰで２時間３７℃で前感化す ること、続いてブタクサアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）でチャレンジすること を包含していた。細胞中全ヒスタミンの１０％以上を放出した好塩基球を持つ提 供者を後の研究用に選択した。図４に示すように、ある提供者からの血球はブタ クサでのチャレンジに際してヒスタミンを放出せず、逆に、他の提供者からの血 球ではアレルゲンでのチャレンジなしにヒスタミンを放出することを見出した。 ボランティア４３名中、１２名が本検定のこの態様における日常的使用に適切な 「応答者」であった。 ｄ．ヒスタミン放出の機序 ＲＳＨＰ感化全血からのブタクサ誘導ヒスタミン放出は迅速で、インキュベー ション２０〜３０分後にはプラトーに達する（図５）。これらの結果に基づき３ ７℃で３０分間のインキュベーションを検定の至適条件として確定した。もし、 常温でインキュベーションすると、ヒスタミン放出は顕著に減少した。 ｅ．特異性 ＲＳＨＰ感化全血とｒｈｕＭＡｂＥ２５に対して相補性決定領域（ＣＤＲ）で は異なるが全相同性は約９５％を示す他のヒト化モノクローナル抗体とのプレイ ンキュベーションは次の表Ｉに示すようにブタクサアレルゲンにより起こされる ヒスタミン放出には阻止効果を及ぼさなかった。これに加えて、ヒトＩｇＧ Ｆ ｃ断片もブタクサ誘導ヒスタミン放出には阻止効果を示さなかった。 ｆ．変動 検定間変動を測定するため、提供者１２名からの血液を使用して全部で２３回 の検定を行った。これらの検定からの結果を次の表ＩＩに表示する。 ０.１、０.５および１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５によるブタクサ誘導ヒ スタミン放出阻止百分率の平均はそれぞれ２２．５％±７.８％、７８.３％±１ ３.３％、９３.９％±５.８％であった。０.５μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５ によるヒスタミン放出阻止百分率から算出した検定間変動（％ＣＶ）は１７％（ ｎ＝２３）であった。８週間の期間にわたる提供者内変動はさらに小さく、平均 ９.０５％（ｎ＝７）であった。 ｇ．２価カチオン ヒスタミン放出がインキュベーション培地中のＣａ²⁺によって影響されること はよく確立されている（ＬｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎとＯｓｌｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ ｅｄ．、１２０巻：５０７〜５３０頁(１９６４年)、ＨａｙｄｉｋとＭａ、Ｃ ｌｉｎ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇｙ、６巻：１４１〜１６２頁(１９８８年)、Ｍａ ｃＧｌａｓｈａｎとＢｏｔａｎａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻：９８０〜 ９９１頁（１９９３年））。従って、前記検定法でのＣａ²⁺およびＭｇ²⁺の効果 を測定した。全血をＣａ²⁺とＭｇ²⁺とが欠落したハンク平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ^-- ）で希釈した時、Ｃａ²⁺とＭｇ²⁺とを含有するハンク平衡塩緩衝液での希釈と 比べてヒスタミン放出能にかなりの減少があった（図６）。ＣａＣｌ₂２Ｈ₂Ｏお よびＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏを等濃度でＨＢＳＳ^--に添加すると、ヒスタミン放出が再 生した。ＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏのみを添加すると放出は部分的に再生したが、ＣａＣ ｌ₂２Ｈ₂Ｏの添加ではヒスタミン放出能は完全に再生された（図７）。 ｈ．遮断抗体とのプレインキュベーションによるヒスタミン放出の阻止 ブタクサ特異的血清を０.５または１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５ととも にプレインキュベーションすると、後続するブタクサチャレンジによる刺激での ヒスタミン放出をかなり阻止した（図５）。ｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度に対してブ タクサ誘導ヒスタミン放出阻止百分率をプロットするとｒｈｕＭＡｂＥ２５の阻 止効果は最も良く示される。典型的ｒｈｕＭＡｂＥ２５標準曲線を図８に示す。 ブタクサ誘導ヒスタミン放出の阻止は用量依存的であり、１μｇ／ｍＬ以上のｒ ｈｕＭＡｂＥ２５によりしばしば到達される。ｒｈｕＭＡｂＥ２５について至適 検定範囲は約０.１から約１μｇ／ｍＬまでで、平均ＩＣ₅₀は０.２５５±０.０ ７９μｇ／ｍＬ（ｎ＝１５）であった。この検定の構成を修正すれば、容易に他 種アレルゲンが起こすヒスタミン放出遮断に及ぼすｒｈｕＭＡｂＥ２５の効果を 決定できる。一例を図９に示す。非アレルギー性提供者の全血をｒｈｕＭＡｂＥ ２５（１μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下にチリダニにアレルギー性の個体か らの１０％血漿で２時間３７℃で個別に感化した。次に、血球をチリダニアレル ゲン（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加してさらに３０分間チャレンジした。上清液中 のヒスタミン放出を測定した。患者Ｂ、Ｃ、Ｆ、およびＧではチリダニ誘導ヒス タミン放出は１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５で阻止されることが観察された 。患者Ａ、ＤおよびＥではチリダニアレルゲンでのチャレンジ後のヒスタミン放 出には背景以上の顕著な上昇はなかった。もし１０％ではなく、５０％のチリダ ニ 特異的ヒト血漿を使用して好塩基球を感化したなら、チリダニ誘導ヒスタミン放 出を完全な遮断には高濃度のｒｈｕＭＡｂＥ２５が必要であった。そこで、この 検定の構成はあるアレルゲンに対して特異的なＩｇＥの存在ならびに抗ＩｇＥ抗 体がアレルゲンが起こす反応を遮断する性能の両方を証明するために有用である 。 ｉ．酸化重水素の研究 酸化重水素が白血球からのヒスタミン放出を強化するとの報告がある（Ｇｉｌ ｌｅｓｐｉｅとＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５ １巻：２９４１〜２９４７頁（１９７２年））。それ故、ブタクサ誘導ヒスタミ ン放出における酸化重水素の効果を決定した。Ｄ₂Ｏ単独ではヒスタミン放出を 始動しなかった。次の表ＩＩＩに示すように、インキュベーション媒体にＤ₂Ｏ を添加（最終濃度３３％）すると、ブタクサ誘導ヒスタミン放出を顕著に強化す る。無作為に選択した非アレルギー性提供者１７名の中で、提供者１５名（８８ ％）はこの検定の構成ではブタクサアレルゲンによるチャレンジに際して血球中 全ヒスタミンの２０％より大きいヒスタミン放出を示した。ヒスタミン放出の増 加は平均６.３倍ほどであった。 実施例２ １．材料および方法 ａ．材料 通常のハイブリドーマ技術により生産したモノクローナル抗体をＣａｒｔｅｒ など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９巻：４２８５〜４２８９ 頁（１９９２年）およびＰｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２６ ２３〜２６３２頁（１９９３年）に記載のようにヒト化して、分離した。これら にはヒト化抗ヒトＩｇＥ ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＥ２５）(Ｐｒｅｓｔａなどは「 変異体１２」として記載している)、ヒト化抗ＨＥＲ２ ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＨ ＥＲ２)、ヒト化抗ＣＤ１８ ＭＡｂ(ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８)、およびヒト化抗Ｉ ＣＡＭ ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＩＣＡＭ）を包含する。ヤギ抗ヒトＩｇＥ（ε） ＨＲＰ複合体はＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから購入した。組換えヒト神経生長因子 (ｒｈｕＮＧＦ)、腫瘍壊死因子(ｒｈｕＴＮＦ)、およびガンマ−インターフェロ ン（ｒｈｕＩＦＮ−ガンマ）はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒ ａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が生成し、クローニングし、配列決定をした。ブタクサ 抗原Ｅ−ＢおよびＥ−Ｃ（ロットＡ−６０１−９０３Ａ−１８５）はＮａｔｉｏ ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから 入手した。標準化ダニアレルゲン（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）（カタログ＃６７２０ ＵＰ、ロット＃Ｅ５３Ｌ３５３３）およびハウスダスト混合アレルゲン（カタロ グ＃４７０１ＥＤ、ロット＃Ｃ６３Ｊ８３０８）はＭｉｌｅｓ社、Ｅｌｋｈａｒ ｔ、ＩＮから購入した。標準化ネコ毛皮アレルゲン（ロット＃３Ｅ００２０２） およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓ（ロット＃３Ｊ１７２４２）アルレ ルゲンはＣｅｎｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ、ＮＹから入手した。ヒト血漿はＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬから入手した。ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ 、１Ｘ）およびグルタミンはＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、ＭＤ）から購入した。ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、第Ｖ画分)、ｏ−フェニレ ンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質およびトリトンＸ−１００はＳｉｇｍａ社、 Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した。ウシ胎児血清はＨｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏ ｇａｎ、ユタから購入した。酸化重水素（Ｄ₂Ｏ、純度９９.９９６％）はＡｌｄ ｒｉｃｈＣｈｅｍ．社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩから入手した。 ｂ．血液提供者 ヘパリン化全血を一群の健康な非アレルギー性またはアレルギー性個体から採 集し、ヒト好塩基球ヒスタミン検定（ＨＢＨＡ）のために使用する前にプレスク リーニングした。スクリーニングのプロトコールは提供者全血をｒｈｕＭＡｂＥ ２５（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下に１０％ＲＳＨＰによる３７℃で ２時間の前感化とそれに続くブタクサアルレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）による チャレンジを包含していた。血球中全ヒスタミンの１０％以上を放出した好塩基 球を持つ提供者をその後の研究用に選択した。これらボランティアは治療を受け ておらず、全例が事前告知を承認した。 ｃ．ヒト好塩基球ヒスタミン検定（ＨＢＨＡ） ヘパリン化全血をＨＢＳＳ／１％ＢＳＡで１／７に希釈し、１０％（ｖ／ｖ） アレルゲン感化ヒト血漿（たとえば、ブタクサ特異的ヒト血漿（ＲＳＨＰ））と 混合した。混合物をｒｈｕＭＡｂＥ２５（ＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡ中で製造） の存在下または不在下に加湿５％ＣＯ₂培養器中、３７℃で２時間インキュベー ションした。インキュベーション後、標本を緩衝液（ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡまた は５０％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂）またはアレルゲン（ ＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡまたは５０％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−Ｃ ａＣｌ₂中、０.３μｇ／ｍＬ）を含む９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７ ９７）に移動し、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを ４℃で５分間９００×ｇで遠心分離し、上清液を収穫し、ヒスタミン測定をした 。各血液標本について、全血５０μＬを蒸留水９５０μＬと混合し、続いて凍結 と解凍を１５分間サイクルで行うことによって、血球中全ヒスタミンを測定した 。上清液中のヒスタミン濃度をヒスタミン酵素免疫検定キット（ＡＭＡＣ社、Ｗ ｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）で測定した。 ｄ．細胞培養 ＲＢＬ４８ラット肥満細胞系はＧｉｌｆｉｌｌａｎなど、前出、によって記載 されたようにして入手した。ＲＢＬ４８細胞系はラット親肥満細胞系ＲＢＬ２Ｈ ３をヒト高親和性ＩｇＥ受容体Ｆｃ_εＲＩのα−サブユニットで形質転換して誘 導した（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎなど）。細胞を加湿５％ＣＯ₂孵卵器中、３７℃で Ｔ１７５組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ＃３０２８）に入れたｓＩＭＤＭ（１ ０％ウシ胎児血清、２ｍＭ−グルタミン、および活性ゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ＃１１８１１−０３１）５００μｇ／ｍＬ添加Ｉｓｃｏｖｅ修正ダルベッ コ培地）中で増殖させた。細胞をＰＢＳ４ｍＬ／０.０５％トリプシン／０.５３ ｍＭ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ＃１５４００−０１３）に３７℃で２分間 接触し、その後、遠心分離（４００×ｇ、１０分間）し、新鮮なｓＩＭＤＭ中に 再懸濁して収穫した。全面生長が達成された後、細胞を１：５比で至適に分離し た。 ｅ．ヒト血漿ＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡ検定 ウェル当り４００００細胞で接種したＲＢＬ４８細胞を加湿培養器中で、一夜 ３７℃／５％ＣＯ₂で培養した。プレート洗浄器でＰＢＳ／０.０５％トゥイーン ２０で３回洗浄後、細胞を常温でウェル当り無水アルコール２００μＬで２分間 固定し、続いて残留アルコール除去のため６回洗浄した。ｒｈｕＭＡｂＥ２５（ 最終濃度１０μｇ／ｍＬ）存在下または不在下に１０％ＲＳＨＰを含むｓＩＭＤ Ｍを細胞と３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細 胞をＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で６回洗浄した。捕捉したＩｇＥを次に ヤギ抗ヒトＩｇＥＨＲＰと３７℃で３０分間反応し、続いて常温で３０分間ＯＰ Ｄ基質とともにインキュベーションした。６Ｎ−Ｈ₂ＳＯ₄１００μＬ／ウェルの 添加によって反応を停止した。４９２ｎｍでの吸光度を測定した。 ｆ．ラット肥満細胞ヒスタミン検定（ＲＭＣＨＡ） ＲＢＬ４８細胞を全面生長まで増殖させ、次に前記ｄに記載したようにトリプ シン処理した。懸濁液中の細胞をヘマサイトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔ ｅｒ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）で計数し、密度 を０.４×１０⁶細胞／ｍＬに調整した。細胞を次に９６ウェルＵ字型プレート（ Ｌ ｉｎｂｒｏ＃７６−０４２−０５）中に１００μＬ／ウェル（ウェル当り４００ ００細胞）で接種し、加湿５％ＣＯ₂培養器中３７℃で２４時間培養した。ｓＩ ＭＤＭ２００μＬ／ウェルで１回洗浄後、細胞をヘパリンナトリウム（Ｂｅｃｔ ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＃３６７６７３）３Ｕ／ｍＬおよび１０％（ｖ／ｖ） アレルゲン特異的ＩｇＥ含有アレルゲン感化ヒト血漿を包含する新鮮ｓＩＭＤＭ １００μＬ／ウェルとともに、ｒｈｕＭＡｂＥ２５標準の存在（最終濃度範囲０ .０７８から１０μｇ／ｍＬ）または不在下に、３７℃で２時間プレインキュベ ーションした。インキュベーション後、ウェル中の培養培地を吸引して除去し、 接着細胞をｓＩＭＤＭで３回洗浄した。細胞を次にヒスタミン放出緩衝液（ＨＲ Ｂ）（５０％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂／ｓＩＭＤＭ）１ ００μＬ／ウェル、アレルゲン(ＨＲＢ中、０.１μｇ／ｍＬ)、または０.５％ト リトン溶液（全ヒスタミン放出用）とともに３７℃で３０分間インキュベーショ ンした。プレートを４℃で５分間、９００×ｇで遠心分離し、上清液を収穫し、 全ヒスタミン放出用にはＰＢＳで１０００倍に希釈し、アレルゲン誘導ヒスタミ ン放出用には８０倍に希釈した。上清液中のヒスタミン濃度は前記ｃにＨＢＨＡ 検定について記載したようにして測定した。 ｇ．ＲＭＣＨＡとＨＢＨＡとの相関性研究 ｒｈｕＭＡｂＥ２５標本１５個（−７０℃、２〜８℃、２５℃、および４０℃ で１から１８ケ月貯蔵）をＨＢＨＡおよびＲＭＣＨＡの両方でブタクサ誘導ヒス タミン放出阻止能について並行検査した。濃度２段階（ＲＭＣＨＡには０.６２ ５および１.２５μｇ／ｍＬ、ＨＢＨＡには０.２５および０.５μｇ／ｍＬ）の 各標本を前記ｃおよびｆに記載した検定に使用した。標本の蛋白質濃度はｒｈｕ ＭＡｂＥ２５標準曲線から決定した。標本の回収濃度（希釈率係数で補正後）を 算出した。 別の研究で、ダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト混合物、ブタクサ、ネ コ毛皮、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓを包含するアレルゲン５種 のパネル（５０％グリセリン中で調製）を使用してヒト血漿８種のパネル（Ｎｏ ｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬからの アレルギー性個体の血漿７種およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社、ＳｏｕｔｈＳ．Ｆ． 、ＣＡからの貯蔵血漿標本１種）をＲＭＣＨＡおよびＨＢＨＡの両方でスクリー ニングした。ＲＢＬ４８ラット肥満細胞およびナイーブ提供者血液好塩基球を最 初にｒｈｕＭＡｂＥ２５（１μｇ／ｍＬ、ＲＭＣＨＡにはｓＩＭＤＭ／ヘパリン ナトリウム３Ｕ／ｍＬで、およびＨＢＨＡにはＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡ中で調 製）の存在下または不在下に１０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿で２時間３７℃で感化し 、次に緩衝液（ＨＢＨＡ用には３３％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−Ｃ ａＣｌ₂、ＲＭＣＨＡには３３％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂ ／ｓＩＭＤＭ）または３３％Ｄ₂Ｏ含有緩衝液中アレルゲン（３３３.３ＡＵ／ ｍＬ＝３３.３３ＢＡＵ／ｍＬ＝１００ＰＮＵ／ｍＬ＝１μｇ／ｍＬと仮定して 最終濃度０.１μｇ／ｍＬ）の単回投与でチャレンジした。上清液中のヒスタミ ン濃度を前記のように測定した。 ｈ．データ分析 ヒスタミン濃度はヒスタミン標準曲線から「Ｒｅａｄ」コンピュータープログ ラムを使用して決定した。阻止百分率はＭｉｃｒｏＳｏｆｔ Ｅｘｅｌ ４.０プ ログラムにより算出した。グラフはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３.０プログラム を使用して描出した。統計はＳｔａｔＶｉｅｗ４.０プログラムで分析した。２．結果 ａ．ＩｇＥのＲＢＬ４８細胞への結合 ＩｇＥのＲＢＬ４８細胞への結合はアルコール固定ＲＢＬ４８単層を使用して ＲＳＨＰ中のヒトＩｇＥ（全ＩｇＥは１.６４μｇ／ｍＬで測定）がＲＢＬ４８ 細胞表面に発現したＦｃ_εＲＩ受容体のα−サブユニットに結合できるかどうか 決定するためにＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡによって評価した。図１０はＲＳＨＰに存 在するＩｇＥが実際にＲＢＬ４８細胞のＦｃ_εＲＩ受容体に結合することを証明 する。これに加え、遮断抗ＩｇＥモノクローナル抗体、ｒｈｕＭＡｂＥ２５、の 添加がこの結合を完全に破壊するので、この結合はＩｇＥに特異的である。 ｂ．ＲＭＣＨＡの特異性 ＲＭＣＨＡを行って(表ＩＶ)、ｒｈｕＭＡｂＥ２５が、たとえば抗ＨＥＲ２、 抗ＣＤ１８、および抗ＩＣＡＭのような、他の組換えヒトモノクローナル抗体お よび、たとえばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＮＧＦのような、組換えヒトサイト カインと同様に、単独でＲＢＬ４８細胞に適用した時には、肥満細胞に脱顆粒反 応を誘導しないことを証明した。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接 種し、５％ＣＯ₂培養器中、３７℃で一夜培養した。細胞をｓＩＭＤＭ／５０％ Ｄ₂Ｏ、ｒｈｕＭＡｂＥ２５(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２(１０μｇ ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＩＣＡＭ(１０ μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＩＦＮ−γ(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＴＮＦ(１０μｇ／ｍ Ｌ)、またはｒｈｕＮＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨ Ｐの存在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗 浄した後、細胞を５０％Ｄ₂Ｏの存在下にブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬで ３０分間３７℃でチャレンジした。これに加え、ＲＳＨＰ感化細胞を直接にｒｈ ｕＭＡｂＥ２５(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２(１０μｇ／ｍＬ)、ｒ ｈｕＭＡｂＣＤ１８(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＩＣＡＭ(１０μｇ／ｍＬ) 、ｒｈｕＩＮＦ−γ(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＴＮＦ(１０μｇ／ｍＬ)、または ｒｈｕＮＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）単独で３７℃で３０分間チャレンジした。下記 表ＩＶに示す値はそれぞれ測定３回の平均を代表する。 標本を前記抗体およびサイトカイン１０μｇ／ｍＬとともにプレインキュベー ションした時には、ヒスタミン放出は観察されなかった。その上、ブタクサ特異 的ヒト血漿を１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともにプレインキュベーシ ョンすると５０％Ｄ₂Ｏ存在下のブタクサ０.１μｇ／ｍＬ誘導ヒスタミン放出を 完全に破壊した。 ｃ．温度およびカルシウムの効果 ＲＭＣＨＡでは、ブタクサにより誘導されるヒスタミン放出はブタクサ濃度、 温度およびカルシウムイオンに依存性である（図１１）。ブタクサチャレンジ段 階を５０％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下に３７℃でインキュベーションした時に は、約０.１μｇ／ｍＬで極大放出に達する鐘型用量依存性ヒスタミン放出曲線 が観察された。ブタクサによって起きるヒスタミン放出は、もしも２.５ｍＭ− ＥＤＴＡの存在下または常温でインキュベーションすれば、減弱または破壊され た。 ｄ．ヒスタミン放出の時間的経過 図１２に示すデータは３７℃でのブタクサ誘導ヒスタミン放出は時間依存性で あって、インキュベーション３０分間で極大に達することを証明する。インキュ ベーション時間を４５分間または６０分間まで延長すると、上清液中のヒスタミ ン濃度は細胞中全ヒスタミンの３６％から１６％までに鋭く低下した。これに加 えて、ブタクサ特異的血漿を０.５または１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５と ともにプレインキュベーションすると、ブタクサアレルゲンによるヒスタミン放 出が阻止された。ｒｈｕＭＡｂＥ２５の生物学的活性を定量するための典型的な 標準曲線を図１３に示す。ｒｈｕＭＡｂＥ２５によるブタクサ誘導ヒスタミン放 出阻止はＩＣ₅₀平均１.１９±０.３１μｇ／ｍＬ（ｎ＝２５）である。 ｅ．ＲＭＣＨＡとＨＢＨＡとの相関 ｒｈｕＭＡｂＥ２５標本１５個の活性を評価すると、ＲＭＣＨＡとＨＢＨＡと の間には相関係数０.９３（ｎ＝５９、ｐ＜０.０００１）と、良い相関が証明さ れた（図１４）。 これに加えて、ｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在または不在下のヒト血漿８種おのお のからのＩｇＥで前感化したナイーブ提供者血液好塩基球およびＲＢＬ４８肥満 細胞の双方をチャレンジするためにアレルゲン５種のパネルを使用した。ＲＭＣ ＨＡ用の各血漿標本４種の代表的な棒グラフを図１５に示す。細胞を血漿標本１ （Ｐ１）で感化した時、ダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）およびブタクサアレルゲン が起こすヒスタミン放出のみが明確にベースライン（３３％Ｄ₂Ｏ／０.８％Ｎａ Ｃｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂／ｓＩＭＤＭ（ＨＲＢ））より高いヒスタミン放出 を起こした。しかしながら、ダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト、ブタク サ、ネコ毛皮、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓアレルゲンで誘導さ れた時には第二の血漿標本（Ｐ２）とのプレインキュベーションは明確なヒスタ ミン放出を起こした。同様に、第三の血漿標本（Ｐ３）はダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎ ａｅ)、ハウスダスト、ブタクサ、およびネコ毛皮で誘導した時は、明確なヒス タミン放出を起こした。これと対照的に、細胞を第四の血漿標本（Ｐ４）でプレ インキュベーションした時は、これらアレルゲン５種はどれも明確なヒスタミン 放出を刺激しなかった。これら全ての場合、このアレルゲン誘導ヒスタミン放出 は１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５で遮断できた。血漿標本全８種について行 った血液および細胞検定から得られたヒスタミン放出データを単純回帰統計学に よって分析した。下記表Ｖはハウスダストアレルゲン(ｒ＝０.８４、ｐ＝０.０ ０１３、Ｎ＝１１)、ブタクサアレルゲン(ｒ＝０.８６、ｐ＝０.０１３３、Ｎ＝ ７)、ネコ毛皮アレルゲン(ｒ＝０.６７、ｐ＝０.０１６５、Ｎ＝１２)、および 全アレルゲン（ｒ＝０.６９、ｐ＝０.０００１、Ｎ＝３７）での検定２種の相関 を示す。 ｆ．酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）の効果 もしあるなら、ＨＢＨＡシステムにおける３３％Ｄ₂Ｏの効果を研究するため に、３３％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下のブタクサ誘導ヒスタミン放出の比較研 究を行った。無作為に選択した健康な提供者計２７名を研究に採用した。提供者 のヘパリン化全血を１０％ＲＳＨＰで２時間３７℃で前感化した後、ブタクサア レルゲン０.１μｇ／ｍＬ（最終濃度）でさらに３０分間３３％Ｄ₂Ｏの存在下ま たは不在下にチャレンジした。上清液に放出されたヒスタミン濃度を細胞中全ヒ スタミンに対する百分率に換算した。回帰分析はブタクサ誘導ヒスタミン放出と ブタクサ／３３％Ｄ₂Ｏ誘導ヒスタミン放出との間に線形の相関（ｒ＝０.８０、 勾配＝１.０４、ｐ＝０.０００１）を示した（図１６）。データは３３％Ｄ₂Ｏ 存在下でのヒスタミン放出強化の特性はＤ₂Ｏ不在下のブタクサチャレンジに比 例し、同等であることを示す。 ＲＭＣＨＡに及ぼすＤ₂Ｏの効果も検討した。Ｄ₂ＯはＲＢＬ４８細胞中のヒス タミン放出を用量依存的な様式で強化し、５０％Ｄ₂Ｏで最大放出に至ることが 判明した（図１７）。しかしながら、Ｄ₂Ｏはそれ自体ではヒスタミン放出を刺 激せず、また、ＲＢＬ４８細胞によるヒスタミン放出を阻止するｒｈｕＭＡｂＥ ２５を妨害することもない。 これらの検定で使用する試薬のｐＨに及ぼすＤ₂Ｏの効果を研究して、Ｄ₂Ｏに 起因するヒスタミン放出強化がｐＨの変化によるものではないことを決定した。 ＨＢＨＡで使用した種々の試薬（ＨＢＳＳ、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ、ＨＢＳＳ＋ １％ＢＳＡ＋血液＋１０％ＲＳＨＰ、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ＋血液＋１０％ＲＳ ＨＰ＋３３％Ｄ₂Ｏ、血液、および１００％ＲＳＨＰ）およびＲＭＣＨＡで使用 した種々の試薬（ｓＩＭＤＭ、ｓＩＭＤＭ＋ヘパリンナトリウム３Ｕ／ｍＬ、お よびｓＩＭＤＭ＋３３％Ｄ₂Ｏ）（２ｍＬ）のｐＨを常温または３７℃で１時間 インキュベーション後に分析した。下記表ＶＩに示す各ｐＨ値は測定各３回の平 均値を示す。予期通り、試薬のｐＨは常温と比較して３７℃ではｐＨ７.２０± ０.０１から７.３４±０.０１へと僅かに酸性になった。３３％Ｄ₂Ｏは血液試薬 （３７℃で）の僅かなアルカリ性化を起こしたが、全血のｐＨ（ｐＨ７.３５± ０.０１）またはＲＭＣＨＡ試薬のｐＨには有意な変化を起こさなかった。 ３．討論 ヒトＦｃ_εＲＩ受容体のαサブユュニットを形質転換したラットの肥満細胞系 （ＲＢＬ４８）を使用してアレルゲン誘導ヒスタミン放出およびｒｈｕＭＡｂＥ ２５活性を定量する生物検定法を開発した。この検定ではこれら細胞表面に発現 したＦｃ_εＲＩ受容体に結合するアレルゲン特異的ＩｇＥを含むヒト血漿でＲＢ Ｌ４８細胞を感化した（図１０）。それに続くブタクサアレルゲンによるチャレ ンジはヒスタミン放出を起こし（図１１）、これは抗ＩｇＥモノクローナル抗体 （ｒｈｕＭＡｂＥ２５）により用量依存的様式で阻止された（図１３）。ｒｈｕ ＭＡｂＥ２５は、いずれのアレルゲン誘導ヒスタミン放出をも阻止できるので、 この検定の構成はアレルゲン全てに適用できる。この検定を修正してアレルゲン のパネルを使用すれば、ヒト血漿をスクリーニングしてＩｇＥ媒介アレルギー性 疾患の症状診断ができる（図１５）。 ＲＭＣＨＡ開発のために、ヒスタミン放出に及ぼすＤ₂Ｏの効果を注意深く研 究した。図１７に示すように、ＲＢＬ４８細胞を高濃度（１００％まで）Ｄ₂Ｏ でチャレンジしてもヒスタミン放出は観察されなかった。図１６のデータはブタ クサとブタクサ／３３％Ｄ₂Ｏとで誘導されるヒスタミン放出の間に統計学的に かなり有意な相関関係（ｒ＝０.８０、ｎ＝２７、ｐ＝０.０００１）が証明され て、Ｄ₂Ｏが血液の好塩基球中に比例的なヒスタミン放出を促進することが示さ れた。３３％Ｄ₂Ｏの存在はＨＢＨＡ試薬もＲＭＣＨＡ試薬もいずれも生理学的 ｐＨには顕著な効果を及ぼさないと思われる（表ＶＩ）。 ＲＭＣＨＡの構成はｒｈｕＭＡｂＥ２５またはその他のＩｇＥ拮抗剤が種々の アレルゲンが誘導するヒスタミン放出を阻止する効果を測定するために図１５に 示すように容易に修正しうる。ベースライン（ＨＲＢ）より高いヒスタミン放出 は血漿中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在の指標である。ここで得られたデータ は、アレルゲン２種がベースラインより有意に高いヒスタミン放出を剌激するの で、血漿標本１（Ｐ１）はダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、およびブタクサに特異的 なＩｇＥを含むことを指摘する。同様に、血漿標本２（Ｐ２）はダニ(Ｄ．ｆａ ｒｉｎａｅ)、ハウスダスト混合物、ブタクサ、ネコ毛皮、およびＡｌｔｅｒｎ ａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓに特異的なＩｇＥを含み、血漿標本３（Ｐ３）はダニ(Ｄ ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト混合物、ブタクサ、およびネコ毛皮に特異的 なＩｇＥを含み、血漿標本４（Ｐ４）はこれらアレルゲン５種のいずれにも特異 的なＩｇＥを含まないことを示す。同様なヒスタミン放出プロファイルはＨＢＨ Ａでの血液好塩基球をチャレンジするためにこれらアレルゲンを使用した時にも 得られた。ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体１５種の生物学的活性を評価する について(図１４)、および種々のアレルゲンにより誘導されるヒスタミン放出に ついて（表ＶＩ）ＲＭＣＨＡはＨＢＨＡと良く相関するので、これをＩｇＥ媒介 アレルギー診断に新しい手段として使用できる。 数々の研究がＩｇＥ水準はアレルギー性疾患に相関することを明確に立証して いるので(Ｂａｈｎａ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、６２巻：４７１〜４７５頁(１ ９８９年)、Ｍａｓｃｉａなど、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、６２巻：３１１〜３ １８頁（１９８９年）、Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉ ｒ．Ｄｉｓ．、１４５巻：Ｓ４４〜Ｓ４７頁（１９９２年）)、このＲＭＣＨＡ はＩｇＥ媒介経路を研究し、開発するため、ならびにＩｇＥのＦｃ_εＲＩへの結 合の遮断を指向する免疫治療法の効果推測を予想するため、に使用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャルデュー、ポーラ アメリカ合衆国カリフォルニア94708、バ ークレイ、ヒルデイル・アベニュー854番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、 （ａ）放出混合物中への薬理学的伝達物質放出を遮断放出混合物中への薬理学 的伝達物質放出と比較すること、ただしここに、放出混合物および遮断放出混合 物はおのおのナイーブ提供者からの単一組織標本の一部を含み、およびここに、 放出混合物および遮断放出混合物はおのおのさらに、血液標本中の目的アレルゲ ンに特異的なＩｇＥの存在または不在が未知な、患者からの単一血液標本の一部 を含み、およびここに、遮断放出混合物はさらにＩｇＥ拮抗剤を含み、およびこ こに、放出混合物および遮断放出混合物双方をアレルゲンと混合するものとする 、 （ｂ）段階（ａ）での比較に基づいて、その血清標本中にそのアレルゲンに特 異的なＩｇＥの存在または不在を決定すること を含む診断法。 ２．薬理学的伝達物質がヒスタミンである請求項１の方法。 ３．組織標本が血液標本である請求項１の方法。 ４．ＩｇＥ拮抗剤が抗ＩｇＥ抗体またはその断片である請求項１の方法。 ５．抗ＩｇＥ抗体がモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である請求項４の方法。 ６．モノクローナル抗ＩｇＥ抗体がｒｈｕＭＡｂＥ２５である請求項５の方法。 ７．ＩｇＥ拮抗剤がＩｇＥ変異体またはその断片である請求項１の方法。 ８．ＩｇＥ拮抗剤が可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体である請求項１の方法。 ９．ＩｇＥ拮抗剤がＩｇＥ結合性ペプチドまたはＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチ ドである請求項１の方法。 １０．遮断放出混合物中の組織標本を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に患者か らの血清標本と混合する請求項１の方法。 １１．遮断放出混合物中の血清標本を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に組織標 本と混合する請求項１の方法。 １２．好塩基球のＩｇＥ誘導感化を遮断する薬剤の生物活性検定法であって、 （ａ）放出混合物中への薬理学的伝達物質放出を遮断放出混合物中への薬理学 的伝達物質放出と比較すること、ただしここに、放出混合物および遮断放出混合 物はおのおのナイーブ提供者から得た単一全血標本の一部を含み、およびここに 、放出混合物および遮断放出混合物はおのおのさらにアレルゲンに特異的なＩｇ Ｅを含む単一血清標本の一部を含み、およびここに、遮断放出混合物はさらに薬 剤を含み、およびここに、放出混合物および遮断放出混合物双方をアレルゲンと 混合するものとする、 （ｂ）段階（ａ）での比較に基づいて、好塩基球のＩｇＥ誘導感化を遮断する 薬剤の生物活性を決定すること を含む薬剤の生物活性検定法。 １３．薬剤が抗アレルギー性治療剤候補である請求項１２の方法。 １４．抗アレルギー性治療剤候補が抗ＩｇＥ抗体またはその断片、ＩｇＥ変異体 またはその断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、ＩｇＥ結合性ペプチドおよびＦｃ_ε ＲＩ受容体結合性ペプチドから構成される群から選択される請求項１３の方法。 １５．薬剤がＩｇＥ拮抗剤候補である請求項１２の方法。 １６．ＩｇＥ拮抗剤候補が抗ＩｇＥ抗体またはその断片、ＩｇＥ変異体またはそ の断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、ＩｇＥ結合性ペプチドおよびＦｃ_εＲＩ受容 体結合性ペプチドから構成される群から選択される請求項１５の方法。 １７．遮断放出混合物中の全血標本を最初に薬剤と混合し、次に血清標本と混合 する請求項１２の方法。 １８．遮断放出混合物中の血清標本を最初に薬剤と混合し、次に全血標本と混合 する請求項１２の方法。 １９．患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、 （ａ）反応混合物中への薬理学的伝達物質放出を遮断反応混合物中への薬理学 的伝達物質放出と比較すること、ただしここに、 （１）反応混合物および遮断反応混合物は患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンに よる誘導に際して宿主細胞の薬理学的伝達物質放出を媒介することのできるＦｃ_ε ＲＩαサブユニットの表面発現を示すように遺伝子工学的に処理した肥満細胞 宿主のいずれか、および患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンによる誘導に際して宿 主細胞の薬理学的伝達物質放出を媒介することのできるＦｃ_εＲＩαサブユニッ トの表面発現を示すように遺伝子工学的に処理した好塩基球細胞宿主のいずれか から構成される群から選択した共通の親細胞の子孫である遺伝子工学的に処理し た細胞を含み、 （２）反応混合物および遮断反応混合物はおのおのさらに血清標本中の目的ア レルゲンに特異的なＩｇＥの存在または不在が未知な、患者からの単一血清標本 の一部を含み、 （３）遮断反応混合物はさらにＩｇＥ拮抗剤を含み、および （４）放出混合物および遮断放出混合物双方をアレルゲンとを混合するものと する、 （ｂ）段階（ａ）での比較に基づいて、その血清標本中にそのアレルゲンに特 異的なＩｇＥの存在または不在を決定すること を含む診断法。 ２０．遺伝子工学的に処理した細胞が遺伝子工学的に処理した肥満細胞である請 求項１９の方法。 ２１．遺伝子工学的に処理した肥満細胞が遺伝子工学的に処理した齧歯類肥満細 胞である請求項２０の方法。 ２２．遺伝子工学的に処理した齧歯類肥満細胞が遺伝子工学的に処理したラット 肥満細胞である請求項２１の方法。 ２３．遺伝子工学的に処理したラット肥満細胞がＲＢＬ４８細胞である請求項２ ２の方法。 ２４．Ｆｃ_εＲＩαサブユニットが患者の動物種から誘導される請求項１９の方 法。 ２５．患者がヒトである請求項１９の方法。 ２６．Ｆｃ_εＲＩαサブユニットをヒト起源から誘導する請求項１９の方法。 ２７．Ｆｃ_εＲＩαサブユニットが遺伝子工学的に処理した細胞に対して外因性 である請求項１９の方法。 ２８．ＩｇＥ拮抗剤が抗ＩｇＥ抗体またはその断片である請求項１９の方法。 ２９．抗ＩｇＥ抗体がモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である請求項２８の方法。 ３０．抗ＩｇＥ抗体がｒｈｕＭＡｂＥ２５である請求項２９の方法。 ３１．ＩｇＥ拮抗剤がＩｇＥ変異体またはその断片である請求項１９の方法。 ３２．ＩｇＥ拮抗剤が可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体である請求項１９の方法。 ３３．ＩｇＥ拮抗剤がIｇＥ結合性ペプチドまたはＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプ チドである請求項１９の方法。 ３４．遮断反応混合物中の遺伝子工学的に処理した細胞を最初にＩｇＥ拮抗剤と 混合し、次に患者からの血清標本と混合する請求項１９の方法。 ３５．遮断反応混合物中の血清標本を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に遺伝子 工学的に処理した細胞と混合する請求項１９の方法。 ３６．薬理学的伝達物質がヒスタミンである請求項１９の方法。