JP3268494B2 - 全身性エリテマトーデス病態診断剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、全身性エリテマト
ーデス病態診断剤、さらに詳しくは、酵素抗体法（ＥＬ
ＩＳＡ法）により血清中および脳脊髄液中の抗神経細胞
抗体（抗Ｎ抗体）値を測定することにより、全身性エリ
テマトーデスの中枢神経系の病態を診断するための診断
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、
多臓器を侵す自己免疫疾患で、多種類の自己抗体の出現
が大きな特徴である。中枢神経（ＣＮＳ）の障害（ＣＮ
Ｓループス）は、ＳＬＥの合併症として比較的よくみら
れるものであり、脳器質症候群や非器質性精神病（神経
症、うつ病、分裂病など）等の精神機能の異常（ループ
ス精神病）がＳＬＥにおけるＣＮＳの障害の１つの特徴
である。その頻度は軽症のものも含めると全患者の２５
〜６０％に及ぶといわれている。しかしながら、ＳＬＥ
におけるＣＮＳ障害の機序についてはよく判っておら
ず、従来、本症の治療を困難にしていた大きな要因とし
て、その診断・疾患活動性の評価が困難であった点が挙
げられる。

【０００３】ヒト神経芽細胞腫株細胞に結合する自己抗
体（抗Ｎ抗体）は、ＳＬＥ患者の２３〜３２％の血清中
に認められるが、必ずしもＣＮＳ障害の存在とは平行し
ない。一方、脳脊髄液中の抗Ｎ抗体は、ループス精神病
に対する特異性が非常に高いことが報されているが（例
えばＢｌｕｅｓｔｅｉｎ ＨＧ，ｅｔ ａｌ ″Ｃｅｒ
ｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ： ａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉ
ａｔｒｉｃ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓ
ｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕ
ｓ．”Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ７０，Ｐ２４０−２４６，１９
８１等）、別の報告ではこの抗体とＳＬＥの精神神経病
変との関連が否定されており（例えばＫｅｌｌｙ Ｍ
Ｃ，ｅｔ ａｌ ″Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌ
ｕｉｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ａｎｄ ｎ
ｅｕｒｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｎｅｕ
ｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕ
ｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ａｎｄ ｒｅｌ
ａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．”Ｊ Ｒｈｅｕｍａ
ｔｏｌ １４，ｐ７４０−７４４，１９８７ 等）、脳
脊髄液中のこの抗体のＳＬＥにおける意義については報
告により賛否両論入り混じっていた。

【０００４】こうした中で、報告者による差異は、測定
法やループス精神病の診断基準や研究の進め方の差異、
あるいは測定系の感度や使用した神経芽細胞腫の株の差
異、あるいは神経芽細胞腫細胞株の固相化の方法の差異
に起因するものである可能性等が考えられるが、未だに
解決をみるに至っていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このように、抗Ｎ抗体
とループス精神病との関連については、報告によって不
一致がみられ、したがって、抗Ｎ抗体の診断上の有用性
は、未だ確立されていない。

【０００６】本発明は、脳脊髄液中の抗Ｎ抗体とループ
ス精神病との相関関係を確立するとともに、有効な全身
性エリテマトーデス病態診断剤を提供することを目的と
するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒト神経芽細
胞腫株細胞がポリスチレン製の素材に細胞膜の本来の機
能を損うことなく結合され、安定に固相化されている結
合物を使用することにより、全身性エリテマトーデスの
病態を診断することができたものである。ここで、「全
身性エリテマトーデス病態診断剤」とは、全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）の有無のみならず、その病態、特
にＣＮＳループス、中でもループス精神病に該当するか
どうかを診断することができる診断剤を意味する。ヒト
神経芽細胞腫株細胞をポリスチレン製の素材に細胞膜の
本来の機能を損うことなく結合させる態様としては、パ
ラホルムアルデヒド等を結合剤として使用するのが好ま
しい。パラホルムアルデヒド以外に、グルタールアルデ
ヒド・ホルムアルデヒド・キシレン等も結合剤として使
用可能であるが、パラホルムアルデヒドが最も好まし
い。結合させるヒト神経芽細胞腫株細胞の密度は、ポリ
スチレンの表面積３０ｍｍ ^２ 当たり（１〜１００）×１
０ ^４ 個が好ましく、また、使用する結合剤の濃度は、
０．１〜５０重量％が好ましい。ヒト神経芽細胞腫株細
胞としては、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ株、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ株等が
適宜に使用される。

【０００８】本発明では、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ株等のヒト神
経芽細胞腫株細胞がプラスチックプレートのポリスチレ
ン表面に安定性をもって結合され固定された結合物を抗
原として使用し、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により、被
験者より得た脳脊髄液中の抗Ｎ抗体価を測定することに
より、ループス精神病（脳器質症候群と非器質性精神病
の両者を含む）の病態診断を的確に行うことができるも
のである。

【０００９】従来の研究においては、ＳＬＥ患者の脳脊
髄液中の抗Ｎ抗体の測定に当たって、固定化していない
生の神経芽細胞腫株細胞を抗原として用いている。その
場合には、被検検体との反応により細胞が死に陥る可能
性があり、その結果、抗細胞質抗体や抗核抗体が細胞内
に侵入して非特異反応を引き起こし、測定結果に重大な
誤差を生じることになる。また、生きた細胞を抗原とし
て用いる場合は、操作が非常に繁雑となり、また、条件
によっては操作中に細胞の脱落を来たし、測定毎に数値
の異なる不安定な結果しか得られない可能性もある。

【００１０】従って、本発明者らは、こうした測定系に
生の細胞を用いてきたことが、抗Ｎ抗体とループス精神
病の相関についての異なった結論を生み出している可能
性が高いとの想定の下に、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ株等のヒト神
経芽細胞腫株細胞がプラスチックプレートのポリスチレ
ン表面に安定性をもって結合され固定されている結合物
を使用することによって、抗Ｎ抗体に特異性の高いＥＬ
ＩＳＡ法を開発したのである。

【００１１】この方法を用いて、ループス精神病と脳脊
髄液抗Ｎ抗体との関係について検討を行ったところ、脳
脊髄液中の抗Ｎ抗体は、脳器質症候群と非器質性精神病
を含むループス精神病において、ループス精神病以外の
ＳＬＥ患者と比較して、有意の上昇を認めることが確認
され、この両者の相関が裏付けられた。従って、抗Ｎ抗
体とループス精神病との相関についてのこれまでの報告
の不一致は、用いる測定系の感度あるいは用いる生細胞
抗原の安定性の差、あるいは細胞の付着状態の安定性の
差が起因していた可能性が高いと結論づけられる。

【００１２】事実、過去の報告を見る限り、測定系の感
度には見過ごせない差が存在する。例えば、脳脊髄液抗
Ｎ抗体とループス精神病の有意な相関を報告したＢｌｕ
ｅｓｔｅｉｎらは感度の高い酵素抗体法を用いているの
に対して、この両者に有意の相関がないと報告している
Ｋｅｌｌｙらは感度の低いｈｅｍｏ−ａｄｓｏｒｐｔｉ
ｏｎ法を用ている。

【００１３】また、過去の報告では、いずれも神経芽細
胞腫株細胞を生きた状態で使用している。ここで、ＳＬ
Ｅ患者由来の検体の中には、こうした神経芽細胞腫株細
胞に対して毒性に作用する物質が存在する場合があり、
これは、抗Ｎ抗体の測定を行う際、特に非特異反応を生
じる原因となる。すなわち、反応中に細胞死を来たすこ
とにより、細胞膜の透過性の選択性が失われ、被検検体
中に存在する細胞質成分や核成分と反応する抗体の結合
を可能にするためである。また、生きた細胞を用いた場
合、洗浄などの操作により、かなりの細胞がプレートよ
り剥脱していまい、重大な誤差を生じる原因となる。こ
れに対して、神経芽細胞腫株細胞をプラスチックプレー
トのポリスチレン表面に付着させた後に、パラホルムア
ルデヒド等により固定した場合、これらの細胞はポリス
チレン表面に強固に付着するとともに、細胞表面の抗原
性を損なうことなく細胞膜を固定し、細胞質や核成分と
反応する抗体の透過が阻止されるため、抗Ｎ抗体の測定
を行う上で優れており、本発明の病態診断剤に特に有効
である。

【００１４】なお、本発明では、ループス精神病患者に
限ることなく全般にＳＬＥ患者の血清中には抗Ｎ抗体の
異常な上昇が認められるところから、これを利用してＳ
ＬＥ自体の診断が可能であり、そして、ＳＬＥ患者の中
でもループス精神病患者の脳脊髄液中には抗Ｎ抗体の異
常な上昇が認められることを利用して、ループス精神病
という病態を診断することができるのである。すなわ
ち、ＳＬＥにおいて抗Ｎ抗体の産生が中枢神経内で起っ
た場合にループス精神病を発症する可能性が高いと考え
られる。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明に用いられるヒト神経芽細
胞腫株は、市販されているものを用いることができる。
また、その種類もＳＫ−Ｎ−ＭＣに限らず、ＳＫ−Ｎ−
ＳＨ等他の種類の付着性細胞を用いることができる。

【００１６】プレートに神経芽細胞腫細胞を付着させる
場合には、ポリスチレン表面積３０ｍｍ^２あたり、好ま
しくは（１〜１００）×１０^４個、より好ましくは（３
〜１０）×１０^４個を付着させることが好ましい。溶媒
としてはＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓ
ｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）に非必須アミノ酸を添加
したものにウシ胎児血清を添加したもの等が挙げられ
る。ウシ胎児血清は、２．０〜２０．０％、特に８．０
〜１２．０％の濃度で添加するのが好ましい。付着させ
るまでの培養時間は、１６〜９６時間、特に３６〜７２
時間が好ましい。培養は３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で
行うことが好ましい。

【００１７】一方、付着した神経芽細胞腫株細胞の固定
・固相化は、パラホルムアルデヒドを０．０５〜０．２
５Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの
を用いることによって行うことができる。

【００１８】本発明において神経芽細胞腫株細胞を固定
・固相化するに当たって、ＰＢＳ中に溶解したパラホル
ムアルデヒドを使用するのが好ましいが、パラホルムア
ルデヒドの代わりにホルムアルデヒド・グルタールアル
デヒド・キシレン等を用いることも可能である。これら
は、０．１〜５０重量％、好ましくは０．５〜１０重量
％、さらに好ましくは０．５〜４重量％の濃度で使用す
る。また、固定・固相化の条件としては、好ましくは２
０〜４０℃、より好ましくは３７℃近辺の温度で、好ま
しくは１〜２０分間、より好ましくは３〜７分間行うの
が好ましい。また、固定・固相化の終了後、Ｔｗｅｅｎ
２０を０．０３〜０．０７％、特に約０．０５％の濃
度で添加したＰＢＳ溶液を用いて１〜３回洗浄すること
が好ましい。

【００１９】また、本発明の神経芽細胞腫株細胞を固定
および固相化したポリスチレン結合物は、サランラップ
等により密封した状態で、好ましくは、１０℃以下、よ
り好ましくは４〜６℃の温度で非凍結保存することによ
り、６ヶ月以上経時しても、本発明で適用されるべきＥ
ＬＩＳＡによる測定系に用いた場合に同じ安定した測定
結果を得ることができる。

【００２０】本発明では、従来公知の酵素抗体法（ＥＬ
ＩＳＡ）を用いて、すなわち、神経芽細胞腫株細胞を抗
原としてポリスチレンの固相（通常はプラスチック製の
プレート）に細胞膜を固定した状態（細胞膜の本来の機
能、特に膜の選択透過性を損うことなく）で結合させて
おき、被験者の血清あるいは脳脊髄液を反応させた後、
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧを反応させ、その
後、ｏ−フェニレンジアミン、Ｈ_２Ｏ_２を含む基質液で
発色させ、波長４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ４９２）を測
定して、プレート中のウェルの酵素活性を測定すること
により、血清あるいは脳脊髄液中の抗Ｎ抗体値を測定す
ることができる。また、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧの代わりに、アルカリホスファクターゼ標識抗ヒト
ＩｇＧ，ビオチン標識抗ヒトＩｇＧ等を使用しても、基
質液と検出波長を適宜調節することにより、同様に測定
することができる。

【００２１】本発明によれば、神経芽細胞腫株細胞をポ
リスチレン表面に非可逆的に結合させて固定した結合物
を使用することによって、脳脊髄液中の抗Ｎ抗体と全身
性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のループス精神病との相
関関係が明確になり、したがって、この結合物が有効な
全身性エリテマトーデス病態診断剤として機能すること
が確認された。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例により例証するが、本
発明はこれに限定されるものではない。

【００２３】１）患者 実施例では、８７例のＳＬＥ患者の検体を用いた。これ
らの患者はすべてアメリカリウマチ協会の１９８２年の
ＳＬＥの分類のための改訂基準を満たしていた。表１に
示す通り、８７例のＳＬＥ患者のうち、２７例は中枢神
経症状を欠いており、３４例はループス精神病（指南力
・認知・記憶・その他の知的機能の障害を主徴とする脳
器質症候群１４例、神経症・繰病・うつ状態・分裂病な
どの非器質精神病２０例）の症状を示し、２６例は精神
病以外の中枢神経症状を示した（非精神病ＣＮＳ）。な
お、ループス精神病及び非精神病ＣＮＳの診断は、ＣＳ
ＦＩｇ Ｉｎｄｅｘ（髄液Ｉｇ×血清アルブミン／血清
Ｉｇ×髄液アルブミン）と髄液（脳脊髄液）インターロ
イキン−６（ＩＬ−６）活性のいずれかあるいは両者の
上昇により確認されている（広畑俊成“ＣＮＳループ
ス”内科７５ ｐ５０２−５０８，１９９５参照）。ま
た、これ以外にも非ＳＬＥ神経疾患患者２０例を用い
た。

【００２４】

【表１】

【００２５】２）検体 ８７例のＳＬＥ患者より、その活動期に血清を採取し
た。さらに、４１例の患者については、血清採取日に同
時に腰椎穿刺によりＣＳＦ（脳脊髄液）を採取した。ま
た２０例の非ＳＬＥ神経疾患患者からも血清・脳脊髄液
を採取した。これらの検体は抗Ｎ抗体測定までの間−２
０℃で保存した。抗Ｎ抗体の測定は診断・臨床症状につ
いて予備知識を持っていない者により行われた。

【００２６】３）血清抗一本鎖ＤＮＡ抗体、抗二本鎖Ｄ
ＮＡ抗体、抗核抗体の測定 ８７例のＳＬＥ患者より無作為に選んだ１２例について
は、その血清中の抗一本鎖ＤＮＡ抗体価・抗二本鎖ＤＮ
Ａ抗体価を市販のキットにより測定した（ＭＥＳＡＣＵ
Ｐ ＤＮＡ−ＩＩテスト；ＭＢＬ社、名古屋市）。さら
に、抗核抗体をＨＥｐ−２細胞を用いた蛍光抗体法（Ｆ
ＬＵＯＲＯ ＨＥＰ ＡＮＡテスト；ＭＢＬ社、名古屋
市）を用いて測定した。

【００２７】４）ヒト神経芽細胞腫株細胞のプレートへ
の固相化と固定 ＥａｇｌｅのＭＥＭに非必須アミノ酸、ストレプトマイ
シン（１００μｇ／ｍｌ）・ペニシリンＧ（１００Ｕ／
ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ）及び１０
％ウシ胎児血清を添加した培養液中に、神経芽細胞腫株
ＳＫ−Ｎ−ＭＣを２．５×１０^５／ｍｌの割合で浮遊さ
せる。この浮遊液をポリスチレン製９６穴の平底のマイ
クロプレート（Ｎｏ．３５９６；コースター社）の各ウ
ェルに０．２ｍｌずつ添加し、５％ＣＯ_２、３７℃の環
境下に４８時間置くことにより、ＳＫ−Ｎ−ＭＣをプレ
ートの表面に５．０×１０^４／３０ｍｍ^２の密度で付着
させる。この上清を吸い出した後、各ウェルを０．１５
ＭのＰＢＳで１回洗浄する、その後、各ウェルに１％パ
ラホルムアルデヒド−ＰＢＳ液を０．１ｍｌずつ添加
し、３７℃で５分間置く。その後、パラホルムアルデヒ
ド−ＰＢＳ液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含
む０．１５ＭのＰＢＳ液で各ウェルを３回洗浄する。

【００２８】５）抗Ｎ抗体の測定 ヒト神経芽細胞腫株細胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣを固定・固相化
した９６穴マイクロプレート（ポリスチレン製）の各ウ
ェルに、予め１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
ＰＢＳで２００倍に希釈しておいた被検血清あるいは３
倍に希釈しておいた被検脳脊髄液を入れ３７℃で１時間
反応させた後、ウェルに結合した抗Ｎ抗体をペルオキシ
ダーゼ標識Ｆ（ａｂ′）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カペル
社、ペンシルバニア州コクランビル）に反応させて検出
した。１００ｍｌの０．０５Ｍクエン酸リン酸バッファ
ー中（ｐＨ４．８）にｏ−フェニレンジアミン４０ｍｇ
と３０％Ｈ_２Ｏ_２１０μｌを含む基質液を各ウェルに加
え、３７℃で３０分反応させた後、５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_２を
加えて反応を停止させ、２波長マイクロプレートリーダ
ー（ＭＴＰ−１２０、コロナ電機、茨城県）にてＯＤ４
９２を測定した。抗Ｎ抗体を多量に含む患者より得た血
清を用いて標準曲線を作成し、ＯＤ４９２の値より抗Ｎ
抗体をユニット標示で定量化した。すなわち、ＥＬＩＳ
Ａプレートにて最大吸光度の１／２の吸光度を示すのに
必要な抗Ｎ抗体を１Ｕ／ｍｌと便宜的に設定した。

【００２９】６）フローサイトメトリーによる抗Ｎ抗体
の特異性の検討 抗Ｎ抗体を含むＳＬＥ患者血清より抗Ｎ抗体を精製し、
その特異性をフローサイトメトリーで検討した。１％パ
ラホルムアルデヒド−ＰＢＳで処理したヒト神経芽細胞
腫株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（１６×１０^６個）に０．２ｍｌの
患者血清を加え、４℃で２４時間反応させ、抗Ｎ抗体を
細胞表面に結合させた。抗Ｎ抗体を結合させた後、細胞
をＰＢＳおよび生理食塩水で洗浄し、０．１７Ｍグリシ
ン塩酸バッファー（ｐＨ２．８）で抗Ｎ抗体を溶出し
た。溶出した抗Ｎ抗体は透析膜に入れ、ＰＢＳで透析し
た。ヒト神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびヒト前骨
髄性白血病細胞株ＨＬ−６０を１％パラホルムアルデヒ
ド−ＰＢＳで処理した後、精製抗Ｎ抗体あるいは対照ヒ
トＩｇＧと、２％ヤギ血清を含むＰＢＳ液中で４℃で３
０分反応させた。その後にＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ′）_２
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カペル社）と４℃で３０分間反応さ
せ、ＥＰＩＣＳ ＸＬフローサイトメーター（コールタ
ー社）を用いて染色パターンを解析した。

【００３０】結果は図１Ａに示すように、精製された抗
Ｎ抗体はパラホルムアルデヒドで処理されたＳＫ−Ｎ−
ＭＣ細胞に結合したが（実線で示す）、健常人由来対照
ＩｇＧは結合しなかった（点線で示す）。一方、抗Ｎ抗
体と対照ＩｇＧのいずれもＨＬ−６０細胞とは結合しな
かった。

【００３１】次に、プレートに付着した神経芽細胞腫株
細胞を１％パラホルムアルデヒドによりポリスチレン製
のマイクロプレートに固相化した後にＥＬＩＳＡを行っ
た場合と、そのまま無処理でＥＬＩＳＡを行った場合の
比較を行った。図１Ｂに示すとおり、１％パラホルムア
ルデヒドで固定しなかった場合（Ｌｉｖｅ ＳＫ−Ｎ−
ＭＣ）は、抗Ｎ抗体との結合は顕著に低下した。これ
は、主としてＥＬＩＳＡ操作中に神経芽細胞腫株細胞Ｓ
Ｋ−Ｎ−ＭＣがプレートから脱落することに起因するも
のである。従って、神経芽細胞腫株細胞がパラホルムア
ルデヒドで固定・固相化されている本発明の診断剤を使
用するＥＬＩＳＡ法により、抗Ｎ抗体の特異的かつ安定
した測定系が得られることが確認された。

【００３２】７）統計的解析 各群における血清および脳脊髄液抗Ｎ抗体価の差異は、
Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストを用いて検定し
た。治療による血清および脳脊髄液抗Ｎ抗体価の変動に
ついては、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ ｒａｎｋ
ｔｅｓｔにより解析した。

【００３３】８）抗Ｎ抗体測定ＥＬＩＳＡ法の特異性 抗Ｎ抗体のＥＬＩＳＡ法の特異性を検討するために、１
２例のＳＬＥ患者の血清について、その抗核抗体価・抗
一本鎖ＤＮＡ抗体価・抗二本鎖ＤＮＡ抗体価の値と抗Ｎ
抗体価を比較した。結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】ＳＬＥ患者血清中の抗Ｎ抗体価は、抗一本
鎖ＤＮＡ抗体価・抗二本鎖ＤＮＡ抗体価および抗核抗体
価のいずれとも有意の相関を示さなかった。すなわち、
抗Ｎ抗体価１００Ｕ／ｍｌ以下を示す患者血清の中で
も、抗ＤＮＡ抗体が高値を示したり（Ｎｏ．３及びＮ
ｏ．１１）、抗核抗体が高値を示したりするものが見ら
れた（Ｎｏ．８、及びＮｏ．１１及びＮｏ．１２）。一
方、抗Ｎ抗体価２５０Ｕ／ｍｌ以上の高値を示す患者血
清の中でも、抗ＤＮＡ抗体が低値を示したり（Ｎｏ．
１、Ｎｏ．９及びＮｏ．１０）、抗核抗体が低値を示し
たりするものが見られた（Ｎｏ．１）。従って、ＳＫ−
Ｎ−ＭＣ細胞がパラホルムアルデヒドで固定されること
により、細胞質成分や核成分に対する抗体の非特異反応
を抑制していることが判る。

【００３６】９）抗Ｎ抗体測定ＥＬＩＳＡ法に用いる神
経芽細胞腫株細胞固相化プレートの安定性 神経芽細胞腫株細胞を１％パラホルムアルデヒドにより
ポリスチレン製のマイクロプレートに固相化し、その後
ＰＢＳにＴｗｅｅｎ２０を０．０５％の濃度で添加した
溶液で３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミンを含む
０．１５ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１回さらに洗浄
し、ウェルの中の液体成分を吸い出した状態で、サラン
ラップにより密封して４℃の温度で非凍結保存した。こ
のプレートを用いて、高濃度の抗Ｎ抗体を含む患者血清
の反応性の変化の有無を検討した。

【００３７】図２に示すように１ヶ月間保存したプレー
ト（黒四角のグラフ）においても、６ヶ月間保存したプ
レート（白丸のグラフ）においても、保存前のプレート
（×印のグラフ）と同様に、８００倍希釈から１２，８
００倍希釈の間で、安定した用量反応曲線を得ることが
できた。従って、本発明の神経芽細胞腫株細胞を固相化
したプレートは、サランラップ等で密封した状態で４℃
の温度で非凍結保存することにより、少なくとも６ヶ月
間は安定した測定結果を得ることができることが実証さ
れた。

【００３８】１０）ＥＬＩＳＡによる抗Ｎ抗体の定量 ８７例のＳＬＥ患者血清中および４１例のＳＬＥ患者脳
脊髄液中の抗Ｎ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。

【００３９】図３Ａに示すように、血清抗Ｎ抗体は、非
ＳＬＥ神経疾患患者（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、非Ｃ
ＮＳのＳＬＥ患者（ＮＯｎ−ＣＮＳ ＳＬＥ）あるいは
ループス精神病（ｌｕｐｕｓ ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ ）
の患者あるいは非精神病ＣＮＳを示すＳＬＥ患者（Ｎｏ
ｎｐｓｙｃｈｏｔｉｃ ＣＮＳ ｌｕｐｕｓ）のいずれ
においても有意に上昇していた。しかし、ＳＬＥ患者の
３群の中では有意な差を認めなかった。

【００４０】図３Ｂに示すように、髄液抗Ｎ抗体は、ル
ープス精神病（ｌｕｐｕｓ ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ ）の
患者において、非ＳＬＥ神経疾患患者（Ｎｏｎ−ＳＬＥ
ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）あるいは非
精神病ＣＮＳを示すＳＬＥ患者（Ｎｏｎｐｓｙｃｈｏｔ
ｉｃ ＣＮＳ ｌｕｐｕｓ）に比し有意に上昇してい
た。ループス精神病の患者の中には、１０例の脳器質症
候群を示す患者と１７例の非器質精神病を示す患者が存
在する。しかし、髄液あるいは血清中抗Ｎ抗体は非器質
性精神症状（ｎｏｎ−ｏｒｇａｎｉｃ ｐｓｙｃｈｏｓ
ｉｓ）と脳器質症候群（ｏｒｇａｎｉｃ ｂｒａｉｎ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の間では有意差がなかった（図３
Ｃ）。統計学的解析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテ
ストを用いて行った。

【００４１】これらの結果は、本発明の診断剤を使用し
てＥＬＩＳＡ法により検出される血清抗Ｎ抗体価は、Ｓ
ＬＥ患者全般において上昇を示しており、ＣＮＳループ
スに特異的ではないが、ＳＬＥの診断においては有用で
ある可能性を示している。一方、同様に検出される脳脊
髄液中の抗Ｎ抗体価、すなわち神経細胞に対する自己抗
体の値は、ループス精神病患者において特異的に上昇し
ており、ループス精神病と有意に相関するという知見を
裏付けるものであって、ループス精神病というＳＬＥの
病態の診断の可能性を示している。さらに脳器質症候群
と非器質精神病は抗Ｎ抗体の関与する共通の病態を有し
ていることが示唆された。

【００４２】１１）治療による血清および脳脊髄液中抗
Ｎ抗体の変化 ８例のループス精神病を示す患者において、中枢神経症
状の治療による改善と血清および脳脊髄液抗Ｎ抗体価の
推移とを経時的に検討した（主として治療後１〜３ヶ月
の間）

【００４３】図４に示すように、治療により血清および
脳脊髄液中の抗Ｎ抗体価は有意に低下した（統計処理は
Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ
により行った）。図５は、治療によって改善したループ
ス精神病を示すＳＬＥの１症例の臨床経過を示す。中枢
神経症状の改善と平行して血清抗リボソームＰ抗体価、
髄液抗Ｎ抗体価ともに低下している。矢印はステロイド
パルス療法を示す（メチルプレドニゾロン１ｇ／日を３
日間連続）。血清抗リボソームＰ抗体は、患者の一過性
の症状増悪時には変動を示さなかったが、髄液抗Ｎ抗体
は、症状の増悪を的確に反映し上昇し、その後の症状の
軽快とともに低下している。従って、血清抗リボソーム
Ｐ抗体価に比し、脳脊髄液中の抗Ｎ抗体価は、中枢神経
病変の活動性の指標として、より有効であることが判
る。

【００４４】１２）まとめ 本発明においては、ヒト神経芽細胞腫株細胞を固定し、
プラスチックプレートに固相化した診断剤を使用するこ
とにより、抗Ｎ抗体の測定法を確立した。特に、細胞質
成分や核成分と反応する抗体による結合を阻止すること
により抗Ｎ抗体のＥＬＩＳＡの特異性に対して配慮を行
った。本測定法では、非特異的反応が生じにくく、抗Ｎ
抗体の測定を行う上で優れており、血清中の抗Ｎ抗体で
はなく、脳脊髄液中の抗Ｎ抗体がループス精神病の病状
をよく反映することが明らかとなり、本発明の病態診断
剤としての有効性が裏付けられた。

【００４５】Ｔｅｈらが指摘したように（Ｔｅｈ Ｌ−
Ｓ，Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ＤＡ ″Ａｎｔｉｒｉｂｏｓｏ
ｍａｌ ＰｒｏｔｅｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ
Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｅｍａｔｏｓ
ｕｓ″ａ ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ Ｒｈｅｕｍ ３７ ｐ３０７−３１５，１９９
４）、ループス精神病と診断する方法と基準が従来技術
ではまちまちであるという点は、ＳＬＥにおける多彩な
精神神経症状の評価の困難性を反映しているかもしれな
い。しかし、精神神経症状を示すＳＬＥ患者ではＣＳＦ
Ｉｇ Ｉｎｄｅｘや脳脊髄液ＩＬ−６の上昇で裏付け
られる中枢神経内での免疫異常を有することを考えてお
く必要がある。本発明では、ループス精神病及び非精神
病ＣＮＳを示すＳＬＥ患者はＣＳＦ Ｉｇ Ｉｎｄｅｘ
の上昇や脳脊髄液ＩＬ−６の上昇を示したことから、こ
れら患者の中枢神経症状は、活動性のＳＬＥに起因する
ことを確認している。従って、脳脊髄液中の抗Ｎ抗体と
ループス精神病の因果関係が確実と考えられる。

【００４６】また、上述の通り、ＳＬＥでは、高次脳機
能の異常に伴って多彩な症状がみられ、これら高次脳機
能の異常に伴う症状は、指南力・認知・記憶・その他の
知的機能の障害を特徴とする「脳器質症候群」と、神経
症・躁病・うつ状態・分裂病などの症状を主徴とする
「非器質性精神病」の２つに大別される傾向にあるが、
これまでの報告は、脳器質症候群と抗Ｎ抗体との相関に
ついては全く言及されていない。本発明の結果は、脳器
質症候群と非器質性精神病の間では脳脊髄液中抗Ｎ抗体
の値に有意差のないことをはっきりと証明した。従っ
て、抗Ｎ抗体は精神障害の特定の症状特異性を決定する
ものではないことが判る。

【００４７】血清抗リボソームＰ抗体もループス精神病
と非常に強い相関を示すことが明らかにされている。し
かしながら、抗リボソームＰ抗体は、ループス精神病患
者の脳脊髄液中には全く検出されない。従って、抗Ｎ抗
体とは異なり、血清中に存在する抗リボソームＰ抗体が
ループス精神病の病態形成上重要な役割を果たしてお
り、一方、脳脊髄液中では抗Ｎ抗体がループス精神病の
発症に中心的意義を担っていることが考えられる。

【００４８】本発明においては、患者の精神神経症状の
活動性が高いときに脳脊髄液抗Ｎ抗体価の上昇を認め、
治療により症状が軽快すると、脳脊髄液抗Ｎ抗体価は低
下した。さらに一人の患者で経時的に観察したところ、
治療によって症状が改善するのと平行してやはり脳脊髄
液抗Ｎ抗体価は低下した。これまでの報告で、血清中の
抗リボソームＰ抗体も、精神症状を示す患者の中枢神経
病変の活動性のモニターを行う上で有用であることが示
されている。しかし、患者の精神神経症状が増悪した
時、血清抗リボソームＰ抗体価の上昇が見られない時で
も、脳脊髄液抗Ｎ抗体価は上昇を示した。これらの結果
は、血清中の抗リボソームＰ抗体価そのものは中枢神経
病変の程度を知るための有益なマーカーではなく、むし
ろ共通な病態生理を持つＳＬＥの神経障害を起こす基盤
を示す１つの独特の指標と考えるべきであろう。むし
ろ、抗Ｎ抗体が中枢神経内で産生されて直接神経細胞と
結合することが中枢神経病変の発症の直接のきっかけと
なることが考えられる。

【００４９】従って、血清中ではなく、脳脊髄液中の抗
Ｎ抗体がループス精神病の発症に重要な役割を果たして
いる可能性が高い。しかし、現在のところその機序が全
く判っておらず、また、髄液中の抗Ｎ抗体がループス精
神病の病態形成に関与するという実際の直接的証拠もな
い。

【００５０】しかし、これまでに中枢神経内でのＩＬ−
６産生がループス精神病の病態形成に関与することが指
摘されている。一方、中枢神経内では、グリア細胞だけ
でなく、神経細胞もＩＬ−６を産生することができると
いう。従って、抗Ｎ抗体が神経細胞と結合することによ
り、神経細胞によるＩＬ−６の産生を促進したり、また
機能を障害する可能性が十分考えられる。この点に関し
ては、今後更に検討を加えてゆく必要があろう。

【００５１】まとめると、本発明の結果より、パラホル
ムアルデヒド等で固定・固相化することにより特異性の
高い抗Ｎ抗体測定のためのＥＬＩＳＡを樹立することが
できることが確認できた。さらに、我々は脳脊髄液中の
抗Ｎ抗体とループス精神病（脳器質症候群と非器質性精
神病の両者を含む）の相関を確認することができた。今
後の検討を要するが、血清中ではなく、脳脊髄液中の抗
Ｎ抗体がびまん性の中枢神経障害の発症に関与すること
を示唆するものである。なお、ループス精神病の発症に
関与する他の因子や精神神経症状の特異性を決定する要
因についても今後検討する必要がある。最後に抗Ｎ抗体
が中枢神経内で産生される機序についての検討も、ルー
プス精神病の発症機序の全貌解明のために重要である。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ヒト神経芽細胞腫株細胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣの
抗Ｎ抗体に対する結合の特異性を示す図。

【図１Ｂ】 ヒト神経芽細胞腫株細胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣを
ポリスチレン性のプレートにパラホルムアルデヒドによ
り固定・固相化した結合物の抗Ｎ抗体との反応性の安定
性を固定・固相化されていない場合と比較して示す図。
精製抗Ｎ抗体（Ａｎｔｉ−Ｎ）の種々の濃度において、
プレート（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ付着）との反応性に及ぼすパ
ラホルムアルデヒド固定の効果を示す。

【図２】 ヒト神経芽細胞腫株細胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣを
ポリスチレン性のプレートにパラホルムアルデヒドによ
り固定・固相化した結合物の抗Ｎ抗体との反応性の経時
安定性を示す図。

【図３】 固定・固相化されたヒト神経芽細胞腫株細
胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣを使用して測定したＳＬＥ患者の血清
中（図３Ａ、図３Ｃ）および脳脊髄液中（図３Ｂ、図３
Ｃ）の抗Ｎ抗体価を示す図。グラフはＢｏｘプロットを
用いて表示してある（Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈ Ｉ
Ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．１、アルベルックソフトウエ
ア社）。箱の上端、中間及び下端の線は、それぞれ７５
パーセンタイル、５０パーセンタイル及び２５パーセン
タイルを示し、箱を貫く縦線の上端及び下端がそれぞれ
９０パーセンタイル及び１０パーセンタイルを示す。丸
印は外れた場合を示す。

【図４】 ループス精神病８例における治療後の血清
中および脳脊髄液中抗Ｎ抗体値の変化を示す図。

【図５】 非器質性精神病（ループス精神病）を示す
ＳＬＥ患者の臨床経過を示す図。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト神経芽細胞腫株細胞をポリスチレン
   製の素材に細胞膜の本来の機能を損うことなく結合さ
   れ、安定に固相化されている結合物を含有することを特
   徴とする全身性エリテマトーデス病態診断剤。
2. 【請求項２】 ヒト神経芽細胞腫株細胞をポリスチレン
   製の素材にパラホルムアルデヒドにより結合され、安定
   に固相化されている結合物を含有することを特徴とする
   請求項１記載の全身性エリテマトーデス病態診断剤。
3. 【請求項３】 ヒト神経芽細胞腫株細胞がポリスチレン
   の表面積３０ｍｍ^２当たり（１〜１００）×１０^４個の
   密度で０．１〜５０重量％パラホルムアルデヒドにより
   非可逆的に結合され、固相化されている結合物を含有す
   ることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の全身性
   エリテマトーデス病態診断剤。