KR101764449B1 - 변형된 단백질 ａ 용리를 통한 증진된 단백질 정제 - Google Patents

변형된 단백질 ａ 용리를 통한 증진된 단백질 정제 Download PDF

Info

Publication number
KR101764449B1
KR101764449B1 KR1020127008252A KR20127008252A KR101764449B1 KR 101764449 B1 KR101764449 B1 KR 101764449B1 KR 1020127008252 A KR1020127008252 A KR 1020127008252A KR 20127008252 A KR20127008252 A KR 20127008252A KR 101764449 B1 KR101764449 B1 KR 101764449B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
protein
delete delete
antibody
buffer
Prior art date
Application number
KR1020127008252A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120106719A (ko
Inventor
아릭 브라운
크리스토퍼 제이. 다우드
아샤 난디니 라다모한
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43649614&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101764449(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20120106719A publication Critical patent/KR20120106719A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101764449B1 publication Critical patent/KR101764449B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 저 pH에서 출발하는 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는, CH2/CH3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.

Description

변형된 단백질 Ａ 용리를 통한 증진된 단백질 정제{ENHANCED PROTEIN PURIFICATION THROUGH A MODIFIED PROTEIN A ELUTION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 9월 1일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/238,867호 및 2009년 10월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/253,438호를 우선권 주장하며, 이 출원들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 분야는 일반적으로 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이다.
생명공학 산업에 있어 대규모로 단백질을 경제적으로 정제시키는 것이 갈수록 중요한 문제가 되어가고 있다. 일반적으로, 단백질은 단백질에 대한 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 삽입에 의해 관심의 대상이 되는 단백질이 제조될 수 있도록 공학처리된 포유동물 또는 세균 세포주를 사용함으로써 세포 배양에 의해 제조된다. 사용되는 세포주는 살아있는 유기체이기 때문에, 상기 유기체는 당, 아미노산, 및 성장 인자를 함유하는 복합 성장 배지를 제공받으며, 보통은 동물 혈청 시료로부터 공급받게 된다. 세포에게 제공된 화합물의 혼합물로부터, 및 세포 그 스스로의 부산물로부터 원하는 단백질을 인간용 치료제로서 사용하기에 충분할 정도의 순도로 분리하는 것은 엄청난 도전 과제를 제기한다.
세포 부스러기로부터 단백질을 정제하는 방법은 먼저 단백질의 발현 부위에 따라 달라진다. 일부 단백질은 세포로부터 주변 성장 배지로 직접 분비되도록 유도될 수 있고; 다른 경우에는 세포내에서 제조된다. 후자의 단백질인 경우, 정제 공정의 제1 단계는 세포 용해를 포함하는데, 이는 기계적 전단, 삼투압 충격, 또는 효소 처리를 비롯한, 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 파괴를 통해 균질액 내로 세포의 전체 내용물이 방출되며, 추가로 작은 크기로 인해 제거하기가 어려운 세포하 단편이 생산된다. 이는 일반적으로는 분별 원심분리법에 의해, 또는 여과에 의해 제거된다. 비록 그 규모는 더 작기는 하지만, 세포의 자연 사멸로 인한 단백질의 직접적인 분비 및 단백질 제조 시행 과정에서 세포내 숙주 세포 단백질의 방출을 비롯한, 동일의 문제가 발생하게 된다.
일단 관심의 대상이 되는 단백질을 함유하는 정화된 용액을 수득한 후, 상이한 크로마토그래피 기법의 조합을 사용함으로써 세포에 의해 제조된 다른 단백질로부터의 상기 관심의 대상이 되는 단백질의 분리를 시도한다. 일부 단백질 (예를 들어, 인간용 치료제로서 사용하기 위한 단백질)에 대해서는 보통 정제하고자 하는 단백질과 고정화된 포획제 사이의 특이적인 상호작용을 이용하는 친화 크로마토그래피가 사용된다. 단백질 A는 단백질, 예를 들어, Fc 영역을 함유하는 항체의 친화 크로마토그래피에 유용한 흡착제이다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화도로 (인간 IgG에 대해 약 10-8 M으로) 결합하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래된 41 kD의 세포벽 단백질이다. 그러나, 단백질은 응집되거나, 미스폴딩되는 경향이 있기 때문에, 원하는 단백질 (즉, 단량체)은 자주 상기 친화 칼럼으로부터 다른 불순물들, 예를 들어, 단백질 응집체, 세포 그 자체의 부산물 (즉, 숙주 세포 불순물들), 또는 바이러스 필터 오염물과 함께 공-정제된다.
이들 불순물들 및 단백질 혼합물을 그의 전하, 소수성 정도, 또는 크기에 기반하여, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 크기 배제 크로마토그래피를 기반으로 하여 추가로 분리하기 위한 다른 기법들이 개발되었다. 포함되어 있는 특정의 단백질에 정제 방식을 정확하게 맞출 수 있도록 허용하는 수개의 상이한 크로마토그래피 수지 또는 흡착체가 이러한 기법들 각각에 대해 이용가능하다. 이들 각각의 분리 방법의 본질은 단백질이 긴 고체상 (예를 들어, 칼럼)을 따라 다른 속도로 하강 이동하도록 하여 상기 단백질이 고체상을 따라 더 아래로 통과함에 따라 물리적 분리가 증가하도록 하거나, 또는 분리 매질에 선택적으로 부착시킨 후, 상이한 용매에 의해 차별적으로 용리될 수 있도록 하는 것이다. 그러나, 이러한 방법들은 각각 추가의 완충제, 수지, 또는 흡착제, 및 추가 정제를 위한 다른 공급원을 필요로 하고, 이로써 결국에는 공정 시간이 장기화되고 더 많은 비용이 소비된다. 따라서, 보다 효율적이고, 보다 경제적인, 단백질 단량체 정제 방법이 필요하다.
단백질 A 칼럼을 사용하고, pH 구배 용리를 이용하여 응집체, 다량체, 및 변형된 단백질로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법은 미국 특허 출원 제12/008,160호에 기술되어 있다.
본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은, 각 개개의 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 것으로서 구체적이고 개별적으로 기재된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 간단한 요약
본 발명은 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 저 pH에서 출발하는 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 이러한 정제 방법은 숙주 세포 불순물들, 바이러스 필터 오염물, 바이러스 또는 바이러스-유사 입자, 염기성 폴리펩티드 변이체, 및 폴리펩티드 응집체를 비롯한, 각종 불순물들로부터 폴리펩티드 또는 비-응집체를 보다 잘 순차적으로 분리시킬 수 있으며, 정제된 분획/풀 중의 바람직한 폴리펩티드 단량체를 보다 고순도로 분리해 낼 수 있다는 이점을 제공한다. 이러한 방법은 각종 단백질 A 크로마토그래피 수지 및 크로마토그래피 흡착제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은 또한 제조업 규모로 상업적 공정에 사용될 수 있고, 칼럼 크로마토그래피 이외의 대체 하류 정제 기술 사용을 촉진시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계; 및 (b) 용리 완충제를 사용하여 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 폴리펩티드를 용리시키고, 여기서 용리 완충제는 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제를 포함하고, 여기서 pH 구배는 용리 완충제 중의 각각의 pH 완충제의 백분율을 조절함으로써 형성되는 것인 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4.2에서 출발한다. 다른 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4.3에서 출발한다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 4.6에서 출발한다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 3.0에서 또는 그 초과에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 3.7에서 종결된다.
일부 실시양태에서, 고 pH 완충제는 약 pH 5.0이고, 저 pH 완충제는 약 pH 2.7이다.
일부 실시양태에서, 저 pH 완충제의 백분율은 약 35%에서 출발한다. 일부 실시양태에서, 약 35%로 저 pH 완충제를 함유하는 용리 완충제는 약 16.25 mM 아세테이트 및 약 8.75 mM 포르메이트를 함유한다. 다른 실시양태에서, 저 pH 완충제의 백분율은 약 25%에서 출발한다. 일부 실시양태에서, 약 25%로 저 pH 완충제를 함유하는 용리 완충제는 약 18.75 mM 아세테이트 및 약 6.25 mM 포르메이트를 함유한다. 일부 실시양태에서, 저 pH 완충제의 백분율은 약 40%에서 출발한다. 일부 실시양태에서, 약 40%로 저 pH 완충제를 함유하는 용리 완충제는 약 15 mM 아세테이트 및 약 10 mM 포르메이트를 함유한다.
일부 실시양태에서, 약 14 g/L에서 출발하는 로딩 밀도로 폴리펩티드를 로딩한다. 일부 실시양태에서, 약 14 g/L 내지 약 45 g/L 범위의 로딩 밀도로 폴리펩티드를 로딩한다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 단백질 A 칼럼 크로마토그래피 수지 또는 단백질 A 크로마토그래피 흡착제이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 흡착제는 막 또는 모놀리스이다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 단백질 A 칼럼 크로마토그래피 수지이고, 여기서 폴리펩티드는 약 5 칼럼 부피/시간 내지 약 25 칼럼 부피/시간 범위의 용리 유량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 단백질 A 칼럼 크로마토그래피 수지이고, 여기서 폴리펩티드의 정제된 분획은 약 12 또는 그 미만의 단백질 A 칼럼 부피를 함유한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포 불순물은 폴리펩티드로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 불순물은 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP)이다.
일부 실시양태에서, 응집체는 폴리펩티드로부터 분리된 것이다. 다른 실시양태에서, 바이러스 필터 오염물은 폴리펩티드로부터 분리된 것이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자는 폴리펩티드로부터 분리된 것이다. 다른 실시양태에서, 염기성 폴리펩티드 변이체는 폴리펩티드로부터 분리된 것이다.
일부 실시양태에서, C H 2/C H 3 영역은 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 이뮤노어드헤신이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 약 98% 단량체의 순도를 가진다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 약 99% 단량체의 순도를 가진다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비는 비정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 75% 더 낮거나, 약 80% 더 낮거나, 약 85% 더 낮거나, 약 90% 더 낮거나, 약 95% 더 낮거나, 약 96% 더 낮거나, 약 97% 더 낮거나, 약 98% 더 낮거나, 또는 약 99% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비는, 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 3.6에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH로 용리시키는 단계를 포함하는 단계식 용리 방법에 의해 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 20% 더 낮다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 3.6에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH로 용리시키는 단계를 포함하는 단계식 용리 방법에 의해 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 60% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자 계수는 약 15,000개 미만의 입자/ml이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자 계수는 약 12,500개 미만의 입자/ml, 약 10,000개 미만의 입자/ml, 약 7500개 미만의 입자/ml, 약 5,000개 미만의 입자/ml, 약 2,500개 미만의 입자/ml, 약 1,500개 미만의 입자/ml, 약 1,000개 미만의 입자/ml, 약 750개 미만의 입자/ml, 약 500개 미만의 입자/ml, 약 250개 미만의 입자/ml, 약 100개 미만의 입자/ml, 또는 약 50개 미만의 입자/ml이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-유사 입자는 레트로바이러스-유사 입자이다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 4 LRV (바이러스의 로그 10 감소)이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 4 LRV 내지 약 8 LRV 범위이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 4 LRV 내지 약 7 LRV 범위이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 5 LRV, 약 6 LRV, 약 7 LRV, 또는 약 8 LRV이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-유사 입자는 레트로바이러스-유사 입자이다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드는 폴리펩티드 단량체이다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 변형된 또는 비-변형된 단백질 A 리간드이다.
일부 실시양태에서, 정제는 제조업 규모 공정이다.
본 발명의 측면들 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 정제 방법은 폴리펩티드가 바이러스 여과 단계 또는 이온 교환 크로마토그래피 단계를 거치게 하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 정제 단계 이후에 진행된다.
본 발명의 측면들 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 정제 방법은 응집체를 제거하기 위한 추가의 정제 단계는 포함하지 않는다.
본 발명의 측면들 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 정제 방법은 바이러스 필터 오염물을 제거하기 위한 추가의 정제 단계는 포함하지 않는다.
본 발명의 측면들 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 정제 방법은 염기성 폴리펩티드 변이체를 제거하기 위한 추가의 정제 단계는 포함하지 않는다. 본 발명의 측면들 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 정제 방법은 산성 폴리펩티드 변이체를 제거하기 위한 추가의 정제 단계는 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 생성물을 제공한다.
도 1은 pH 단계식-구배 크로마토그램을 나타낸다: x축은 단백질 A 실행의 출발로부터 mL로 표시된 것이고, y축은 흡광도 (mAU)이다. UV 280 트레이스에서 단계식-구배 용리의 특이한 모양 또한 제시되어 있다 - 큰 피크는 용리 출발시에 존재하고, 이어서 안정적인 높이로 감소하고, 보다 낮은 pH에서 점점 줄어든다.
도 2는 항-VEGF 항체 #1의 분획에 의한 SEC (크기 배제 크로마토그래피) 결과를 나타낸 것이다. X축은 SEC 칼럼 상의 체류 시간 (min)이고, Y축은 정규화된 UV 흡광도 (mAU)이다. 분획수가 증가함에 따라 (즉, 구배 용리가 진행되어감에 따라 pH 감소), 단량체 피크는 감소하면서 (체류 시간은 16분) HMWS (고분자량 종) 및 이량체 피크 (체류 시간은 각각 약 12.5분 및 13.5분)는 또한 증가하였다. 별개의 상대적인 피크 면적(%)을 비교하면서 모든 피크 (예를 들어, HMWS, 이량체, 및 단량체)의 통합에 의해 상기 곡선들로부터 얻은 결과를 정량화하였다 (예를 들어, 전체 면적을 100%로 설정하였을 때, 샘플의 SEC 통합 프로파일을 비율(%)로서 제공할 수 있는데, 예를 들면, "31% HMWS, 36% 이량체, 및 33% 단량체"와 같다).
도 3은 항-VEGF 항체 #1에 대한 SEC 통합 결과 그래프를 나타낸 것이다. 상기 그래프에서 용리시 처음 9개의 용리 분획의 경우, 단량체 수준이 높았는데, 4개의 분획은 100%였고, 이량체 및 HMWS 수준은 후반에 피크에 도달한 것으로 나타났다. 본 분석 결과, pH 단계식-구배를 통해 항-VEGF 항체 #1의 단량체로부터 응집체가 분리되었음이 입증되었다.
도 4a는 다중의 단백질 분자 (항-CD20 항체, 항-VEGF 항체 #2, 항-MUC16, 및 항-CD4 항체)에 대한 SEC 통합 프로파일을 나타낸 것이다. pH 단계식-구배를 통해 항-CD20 항체, 항-VEGF 항체 #2, 항-MUC16, 및 항-CD4 항체에서 응집체로부터 단량체가 성공적으로 분리되었다.
도 4b는 세균 (E. 콜라이(E. coli)) 숙주 세포 발효에 의해 생산된 비당화된 1-아암 항-Met 항체에 대한 SEC 통합 프로파일을 나타낸 것이다. pH 단계식-구배를 통해 비당화된 1-아암 항-Met 항체에서 응집체로부터 단량체가 성공적으로 분리되었다.
도 5는 항-CD20 항체 표준 단계식 용리 (대조군; pH 구배없이 3.6에서 또는 그 미만의 pH에서 단백질 용리)과 pH 단계식-구배 용리를 나란히 비교한 것을 나타낸 것이다. 좌측 패널의 항-CD20 항체 및 CHOP 용리 그래프는 분획당 CHOP 수준 (ppm: 백만분율; 이는 불순물들의 측량을 생성물의 양으로 표준화시키는 데 사용되는 단위)을 나타낸 것이다. 우측 패널의 항-CD20 항체 및 응집체 용리 그래프는 구배 용리 전체에서 분획당 SEC 피크 통합값을 나타낸 것이다. 좌측 및 우측 패널, 둘 모두에서 수직선은 pH 구배 용리 풀을 생성하는 함유된 분획의 모의 풀링을 나타낸 것이며, 특징은 슬라이드 하단 표에 제시하였다.
도 6은 항-VEGF 항체 #1에 대한 CHOP 분리를 나타낸 것이다. 분획당 CHOP 수준은 ppm 또는 ng/mL로 표시되어 있다.
도 7은 항-MUC16 항체에 대한 CHOP 분리를 나타낸 것이다. 분획당 CHOP 수준은 ppm 또는 ng/mL로 표시되어 있다.
도 8은 맙셀렉트(MABSELECT)™, 맙셀렉트 수레(MABSELECT SURE)™, 프로셉® Va(PROSEP® Va), 프로셉® 울트라 플러스(PROSEP® Ultra Plus), 및 포로스® 맙캡쳐™ A(POROS® MABCAPTURE™ A) 단백질 A 수지 크로마토그램 오버레이이다.
도 9는 응집체 분리율을 측정할 때, 출발 %B (출발 pH 및 용리 구배 기울기)가 가장 영향력이 큰 파라미터이며, 그 다음으로 로드 밀도, 체류 시간이라는 것을 나타내는 파레토 플롯(Pareto Plot)이다.
도 10은 출발 %B, 로드 밀도 및 출발 %B, 전체 용리 길이, 및 체류 시간 파라미터에 대한 상호작용 프로파일이다.
도 11은 pH 단계식-구배 용리를 위한 제조 실행에 대한 일례이다.
도 12는 2가지 크기의 양이온 교환 막 및 3가지 크기의 음이온 교환 막을 사용하여 수행된 하류 이온 교환 막 연구 결과를 나타낸다. 코인 및 나노 유닛, 둘 모두 막 층 개수에서 제조업임을 나타내는 반면, 아크로디스크(ACRODISC)® 유닛은 감소된 개수의 층을 가지지만, 이는 전형적인 벤치 규모로 사용되는 모델이다.
도 13은 4.1 L 칼럼 (파일럿 규모)과 28 mL 벤치 규모 칼럼 실행 사이의 SEC 통합 결과 비교를 나타낸 것이다.
도 14는 비레솔브® 프로(VIRESOLVE® Pro) 파라보바이러스 필터 상에서의 더 많은 질량을 처리할 수 있는 처리량을 촉진시키는 것에 의해 단백질 A pH 단계식-구배를 단백질 A 표준 단계식과 비교하는, 항-VEGF 항체 #1의 비레솔브® 프로 투과성 소멸 그래프이다. 단백질 A pH 단계식-구배를 사용함으로써 비레솔브® 프로 상에서의 질량 처리량은 약 6배 증가하였다.
도 15는, 로드 밀도 21 g/L에서의 전체 pH 구배에 대한 실제 AKTA 유니콘(AKTA UNICORN)™ 크로마토그래피 소프트웨어 트레이스를 보여주는 단백질 A 전체 pH 구배 용리 크로마토그램이다. 구배 출발시 초기의 값이 큰 UV 250 스파이크가 없는데, 이는 용리 출발시의 pH가 단백질 A 칼럼으로부터 생성물을 용리시키는 데 필요한 pH보다 높다는 것을 나타낸다.
도 16은 pH 5.0-2.7에서의 pH 구배 시도 (0-100%B) AKTA 크로마토그램으로서, 이는 항-VEGF 항체 #1이 pH 4.6-3.6 범위에서 이산 피크로서 용리된다는 것을 나타낸다.
도 17은 단백질 A pH 단계식-구배 용리 분획 전역에 걸친 이온 교환 변이체 분석 피크 통합으로서, 이는 단계식-구배 용리의 후반부에서 염기성 폴리펩티드 변이체가 분리되었음을 나타낸다.
도 18은 항-VEGF 항체 #1 생성물 용리에 대해 그래프로 작성된 분획당 QPCR (정량적 중합효소 연쇄 반응)로부터의 RVLP (레트로바이러스-유사 입자) 입자 계수이다. RVLP 대부분은 구배 후반에 용리되었는데, 여기서 생성물의 용리는 거의 일어나지 않았다.
도 19는 항-VEGF 항체 #1의 단백질 A pH 단계식-구배 용리에서 각 분획에 대한 LRV (바이러스의 로그 10 감소)이다.
도 20은 분획의 모의 풀에 대한 누적 LRV를 보여주는 것으로서, 이는 후반 분획이 제거되면 단백질 A 풀에서 더 높은 LRV를 얻을 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 저 pH에서 출발하는 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 저 pH에서의 pH 구배로 단백질 A로부터 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 용리시키면 숙주 세포 불순물들, 바이러스 필터 오염물, 바이러스 또는 바이러스-유사 입자, 염기성 폴리펩티드 변이체, 및/또는 폴리펩티드 응집체를 비롯한, 각종 불순물들로부터 폴리펩티드를 보다 잘 순차적으로 분리시킬 수 있으며, 또한 정제된 분획/풀 중의 바람직한 폴리펩티드 단량체를 보다 고순도 또는 고비율로 분리해 낼 수 있다는 놀라운 결과를 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명은 유의적인 이점을 가진다. 본 발명자들은 또한 이러한 방법은 각종 단백질 A 크로마토그래피 수지 및 크로마토그래피 흡착제를 사용함으로써 달성될 수 있고, 이러한 방법은 제조업 규모로 상업적 공정에 사용될 수 있으며, 칼럼 크로마토그래피 이외의 대체 하류 정제 기술 사용 (예를 들어, 막 흡착기)을 촉진시킬 수 있다는 것도 발견하게 되었다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (a) C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 (b) 용리 완충제를 사용하여 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 폴리펩티드를 용리시키고, 여기서 용리 완충제는 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제를 포함하고, 여기서 pH 구배는 용리 완충제 중의 각각의 pH 완충제의 백분율을 조절함으로써 형성되는 것인 단계를 포함하는, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 생성물을 제공한다.
달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 기술내 포함되어 있는, 종래의 분자 생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기법을 사용할 것이다. 그러한 기법은 하기 문헌, ([Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; [Oligonucleotide Synthesis Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)])에 전체적으로 설명되어 있다.
정의
본원에서 관심의 대상이 되는 폴리펩티드는 C H 2/C H 3 영역을 포함하며, 따라서, 단백질 A에 의한 정제에 따라 잘 처리될 수 있는 폴리펩티드인 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바, "C H 2/C H 3 영역"이라는 용어는 단백질 A와 상호작용하는, 면역글로불린 분자의 Fc 영역 중의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, C H 2/C H 3 영역은 무손상 C H 2 다음에 이어 무손상 C H 3 영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. C H 2/C H 3 영역을 함유하는 단백질의 예로는 C H 2/C H 3 영역에 융합되거나, C H 2/C H 3 영역과 접합된 관심의 대상이 되는 단백질을 포함하는 항체, 이뮤노어드헤신 및 융합 단백질을 포함한다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 간섭에 의해: 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드 또한 상기 정의 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "정제된 폴리펩티드" 또는 "정제된 단백질"이라는 용어는 본원에 기술된 pH 구배 방법을 사용하여 단백질 A 친화 크로마토그래피로부터 용리된 생성물이다. 정제된 폴리펩티드/단백질은 바람직하게는 대개 폴리펩티드 단량체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "비정제된 폴리펩티드," "비정제된 단백질," 또는 "단백질 로드"라는 용어는 단백질 A 친화 크로마토그래피 정제 단계 이전의 로딩 물질 또는 출발 물질 중의 폴리펩티드 또는 단백질이다.
본원에서 사용되는 바, "불순물" 또는 "불순물들"이라는 용어는 원하는 폴리펩티드 단량체 생성물과 상이한 물질이다. 불순물들은 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 산성 또는 염기성 폴리펩티드 변이체), 폴리펩티드 단편, 원하는 폴리펩티드 단량체의 응집체 또는 유도체, 또 다른 폴리펩티드, 지질, 핵산, 내독소, 숙주 세포 불순물들, 또는 바이러스 필터 오염물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "단량체(들)"라는 용어는 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드의 단일 단위를 지칭한다. 예를 들어, 항체인 경우, 단량체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성되며; 1-아암 항체인 경우, 단량체는 1개의 중쇄와 1개의 경쇄로 구성된다.
본원에서 사용되는 바, "염기성 폴리펩티드 변이체" 또는 "염기성 변이체"라는 용어는 (예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정된 바) 관심의 대상이 되는 폴리펩티드보다 염기성 성질이 보다 더 큰 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 변이체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "산성 폴리펩티드 변이체" 또는 "산성 변이체"라는 용어는 (예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정된 바) 관심의 대상이 되는 폴리펩티드보다 산성 성질이 보다 더 큰 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 변이체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "응집체(들)"라는 용어는 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편으로 이루어진 임의의 다량체를 지칭한다. 예를 들어, 응집체는 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 사량체보다 큰 다량체 등일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "숙주 세포 불순물들"이라는 용어는 숙주 세포주, 세포 배양액, 또는 세포 배양물에 의해 도입된 임의의 단백질성 오염 물질 또는 부산물을 지칭한다. 그 예로 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP), E. 콜라이(E. coli.), 단백질, 효모 단백질, 심미안 COS 단백질, 또는 골수종 세포 단백질 (예를 들어, NS0 단백질 (BALB/c 마우스로부터 유래된 마우스 형질세포종 세포))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "바이러스 필터 오염물"이라는 용어는 유체력학적 직경이 파라보바이러스 필터의 공극 분포와 유사하거나 그보다 큰, 임의의 큰 분자량 입자 또는 고분자량 종 (HMWS)을 지칭한다. 바이러스 필터 오염물은 숙주 세포 불순물들 (예를 들어, CHOP)의 가용성 고분자량 폴리펩티드 응집체, 및 가용성 및/또는 불용성 응집체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"숙주 세포"는 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 폴리뉴클레오티드 삽입체의 도입을 위한 벡터(들)에 대한 수령체일 수 있거나, 수령체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 그 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적인 돌연변이에 의해 반드시 (형태 또는 게놈 DNA 보체에 있어서) 원래의 모체 세포와 완전히 동일할 필요는 없을 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, "고체상"은 단백질 A가 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 지칭한다.
"완충제"는 산-염기 접합체의 작용에 의해 pH 변화에 대해 내성을 띠는 완충처리된 용액을 지칭한다. 예를 들어, 완충제의 원하는 pH에 따라 사용될 수 있는 각종 완충제가 문헌 [Buffers . A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기술되어 있다.
본원에서 "평형 완충제"는 관심의 대상이 되는 단백질을 로딩하기 위한 (고정화된 단백질 A를 포함하는) 고체상을 제조하는 데 사용되는 것이다.
본원에서 "세척 완충제"는 관심의 대상이 되는 단백질의 로딩 후, 용리 이전에 (고정화된 단백질 A를 포함하는) 고체상을 통해 통과시키는 완충제를 지칭한다.
"항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이는 구체적으로는, 본원에서 정의된 바와 같이 C H 2/C H 3 영역을 보유하거나, 포함하도록 변형된 경우인 한, 모노클로날 항체 (전장의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 전장의 항체의 일부, 일반적으로 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일-쇄 항체 분자; 디아바디; 선형 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하다. 본원에서 사용되는 바, 항체 단편은 C H 2/C H 3 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하는 것으로서, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들을 소량으로 존재할 수 있는, 천연적으로 발생된 가능한 돌연변이를 제외하면 동일한 것들이다. 모노클로날 항체는 고도로 특이하며, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 추가로, 전형적으로는 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 것인 상이한 항체들을 포함하는 종래의 (폴리클로날) 항체 시료와는 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. "모노클로날"이라는 수식어는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 수득되었다는 항체의 특징을 나타내는 것이며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 먼저 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 기술된 바와 같이 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 ([Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol. 222:581-597 (1991)])에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
구체적으로 본원에서 모노클로날 항체는, 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄가 특정 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 동종성인 반면, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 동종성인 것인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 그의 항체 단편도 포함한다 (문헌 (미국 특허 번호 제4,816,567호; 및 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)])).
본원에서 사용되는 바, "초가변 영역"이라는 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]), 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)]). "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대개의 경우, 인간화 항체는 수령체의 초가변 영역 잔기가, 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가진 비-인간 종 (공여체 항체), 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된 것인 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형 항체의 성능을 추가로 개선시키기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 가변 도메인을 실질적으로는 모두, 또는 적어도 1개, 및 전형적으로는 2개를 포함하며, 여기서 초가변 루프 모두 또는 실질적으로 그 모두는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역 모두 또는 실질적으로 그 모두는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로, 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가로 상세한 설명을 위해서는 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op . Struct . Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, "이뮤노어드헤신"이라는 용어는, 이종성 "어드헤신" 단백질 (예를 들어, 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"과 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 작용이 조합된 항체-유사 분자를 지칭하는 것이다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체 (즉, "이종성"인 것)의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 원하는 결합 특이성을 가진 어드헤신 아미노산 서열 (항원 조합 부위)과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄로부터 유래된 것이 바람직한데, 그 이유는 상기 영역을 포함하는 이뮤노어드헤신이 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있기 때문이다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62: 1-13 (1983)]).
본원에서 사용되는 바, "리간드 결합 도메인"이라는 용어는 임의의 천연 세포-표면 수용체, 또는 적어도 상응하는 천연 수용체의 질적 리간드 결합을 보유하는, 그의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭한다. 구체적인 실시양태에서, 수용체는 면역글로불린 대가족 유전자군의 구성원과 동종성인 세포외 도메인을 가진 세포-표면 폴리펩티드로부터의 것이다. 면역글로불린 대가족 유전자군의 구성원은 아니지만, 그럼에도 불구하고 구체적으로 상기 정의에 포함되는 다른 수용체는 시토카인에 대한 수용체, 특히, 티로신 키나제 활성을 가진 수용체 (수용체 티로신 키나제), 헤마토포이에틴 및 신경 성장 인자 수용체 대가족군의 구성원, 및 세포 부착 분자, 예를 들어, (E-, L- 및 P-) 셀렉틴을 포함한다.
"수용체 결합 도메인"이라는 용어는 세포 부착 분자를 비롯한 수용체에 대한 임의의 천연 리간드, 또는 적어도 상응하는 천연 리간드의 질적 수용체 결합능을 보유하는, 상기 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭하는 데 사용된다. 특히 상기 정의는 구체적으로 상기 정의된 수용체에 대한 리간드로부터의 결합 서열을 포함한다.
"항체-이뮤노어드헤신 키메라"는 (본원에서 정의된) 항체의 결합 도메인 적어도 하나와 (본 출원에서 정의된) 적어도 하나의 이뮤노어드헤신이 조합된 분자를 포함한다. 예시적인 항체-이뮤노어드헤신 키메라는 문헌 ([Berg et al., PNAS ( USA ) 88:4723-4727 (1991)] 및 [Chamow et al., J. Immunol. 153:4268 (1994)])에 기술된 이중특이적 CD4-IgG 키메라이다.
본원에서 사용되는 경우, 달리 명확하게 명시되지 않는 한, "하나(a, an)" 등의 용어는 하나 이상인 것을 의미한다.
"약"과 관련하여, 본원에서 값 또는 파라미터는 그 자체의 값 또는 파라미터에 관한 실시양태를 포함한다 (및 기술한다). 예를 들어, "약 X"와 관련하여 언급한 경우 "X"를 언급하는 것을 포함한다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다.
본원에서 실시양태가 "포함하는"이라는 언어를 통해 기술되는 경우에는 언제든지, "~으로 구성된" 및/또는 "본질적으로 ~으로 구성된"이라는 용어를 통해 다른 방식으로 기술된 유사 실시양태 또한 제공한다는 것을 이해하여야 한다.
폴리펩티드의 정제
본원의 방법은 저 pH에서 출발하는 pH 구배를 사용함으로써 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 하나 이상의 불순물들로부터 C H 2/C H 3 영역을 함유하는 폴리펩티드를 정제하는 것을 포함한다. 한 측면에서, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 용리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 정제될 수 있다.
또 다른 측면에서, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드는 또한 (a) 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 (b) 용리 완충제를 사용하여 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 용리시키고, 여기서 용리 완충제는 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제를 포함하고, 여기서 pH 구배는 용리 완충제 중의 각각의 pH 완충제의 백분율을 조절함으로써 형성되는 것인 단계를 포함하는 방법에 의해 정제될 수도 있다.
단백질 A는 변형된 또는 비-변형된 단백질 A 리간드일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단백질 A 리간드"는 천연 단백질 A, 합성적으로 (예를 들어, 펩티드 합성법 또는 재조합 기법에 의해) 제조된 단백질 A, 및 C H 2/C H 3 영역을 가진 단백질에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 변형된 단백질 A 리간드는 단시간 동안 고 pH 용액 중에서 안정적일 수 있도록 화학적으로 공학처리된 것일 수 있다 (예를 들어, 맙셀렉트 수레™ (GE 헬쓰케어(GE Healthcare: 미국 뉴저지주 피스카타웨이)), 포로스® 맙캡쳐™ A (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 캘리포니아주 포스터 시티)). 본원에서 사용되는 바, "비-변형된 단백질 A 리간드"라는 용어는 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A와 유사한 단백질 A 리간드를 포함한다. 비-변형된 단백질 A 리간드, 예를 들어, 맙셀렉트™, 프로셉™ Va, 프로셉™ 울트라 플러스는 GE 헬쓰케어 (미국 뉴저지주 피스카타웨이) 또는 밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌러리카))로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
단백질 A는 고체상 위에 고정화될 수 있다. 고체상은 정제 칼럼, 불연속 상 또는 이산 입자, 막, 또는 필터일 수 있다. 고체상을 형성하는 물질의 예로는 다당류 (예를 들어, 아가로스 및 셀룰로스) 및 다른 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 실리카 (예를 들어, 공극 조절형 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자, 및 상기의 것 중 임의의 것의 유도체를 포함한다.
C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 데 고체상 위에 고정화된 단백질 A가 사용된다. 일부 실시양태에서, 고체상은 단백질 A의 고정화를 위한, 유리 비드-기반 수지, 실리카-기반 수지, 또는 아가로스-기반 수지를 포함하는 단백질 A 칼럼 수지이다. 예를 들어, 고체상은 공극 조절형 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 때때로, 칼럼은 칼럼에의 비특이적인 부착을 막기 위한 시도로 시약, 예를 들어, 글리세롤로 코팅되어 있다. 글리세롤로 코팅되어 있으며, 단백질 A 공극 조절형 유리 칼럼의 일례가 프로셉™ A 칼럼이다. 다른 실시양태에서, 고체상은 단백질 A의 고정화를 위한, 단백질 A 크로마토그래피 흡착제이다. 단백질 A 크로마토그래피 흡착제는 막 (예를 들어, 사토리우스(Sartorius: 독일 궤팅겐), 사토바인드(SARTOBIND)™ 단백질 A 막) 또는 모놀리스 (예를 들어, BIA 세퍼레이션(BIA Separations: 오스트리아 빌라흐), CIM® 단백질 A HLD 모놀리스)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단백질 A 크로마토그래피용의 고체상을 평형 완충제로 평형화시킨 후, 이어서, 각종 불순물들 (예를 들어, 수거된 세포 배양액)을 포함하는 비정제된 폴리펩티드를 평형화된 고체상 위에 로딩할 수 있다. 폴리펩티드를 로딩 완충제로 로딩할 수 있다. 편리하게는, 고체상의 평형화를 위한 평형 완충제는 로딩 완충제와 동일한 것일 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 폴리펩티드가 고체상을 통해 흘러 이동해 감에 따라, 폴리펩티드 및 각종 불순물들은 고정화된 단백질 A에 흡착된다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 제외한, 일부 불순물들, 예를 들어, 숙주 세포 불순물들을 제거하는 데 세척 완충제가 사용될 수 있다.
평형 완충제는 바람직하게는 등장성이며, 통상적으로는 그의 pH 범위는 약 6 내지 약 8이다. 예를 들어, 평형 완충제는 25 mM 트릿(Tris), 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, 및 pH 7.1을 가질 수 있다.
"로딩 완충제"는 단백질 A가 고정화된 고체상 위에 C H 2/C H 3 영역을 함유하는 단백질 및 오염 물질의 혼합물을 로딩하는 데 사용되는 완충제를 의미한다. 종종, 평형 완충제와 로딩 완충제는 동일한 것이다.
세척 완충제는 세포주 불순물 또는 다른 각종 불순물들을 용리시키는 역할을 할 수 있다. 세척 완충제의 전도도 및/또는 pH는 임의의 상당량의 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 제외한, 불순물들이 단백질 A 크로마토그래피로부터 용리될 수 있도록 하는 것이다.
단백질 A에 결합된 폴리펩티드는 단일 용리 완충제 또는 용리 완충제의 조합의 사용을 통해 pH 구배로 용리될 수 있다.
고정화된 단백질 A로부터 C H 2/C H 3 영역을 함유하는 폴리펩티드를 용리시키는 데 "용리 완충제"가 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 용리 완충제는 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제를 함유하며, 이를 통해 용리 완충제 중의 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제의 백분율을 조절함으로써 pH 구배를 형성한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH 범위는 약 3 내지 약 5이다. 본원에서 사용되는 바, pH 값은 폴리펩티드를 포함하지 않은 상태에서 측정된다. pH가 상기 범위내 포함되도록 조절하는 pH 완충제의 예로는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 포름산, 및 암모늄 완충제 뿐만 아니라, 이들의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중 바람직한 완충제는 아세테이트, 및 포름산 완충제이다.
일부 실시양태에서, pH 구배는 약 5.0에서 출발한다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 5.0 미만에서 출발한다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 5.0 내지 약 4.0 범위에서 출발한다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 4.9, 약 4.8, 약 4.7, 약 4.6, 약 4.5, 약 4.4, 약 4.3, 약 4.2, 약 4.1, 또는 약 4.0에서 출발한다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 4.98, 약 4.96, 약 4.94, 약 4.92, 약 4.90, 약 4.88, 약 4.86, 약 4.84, 약 4.82, 약 4.80, 약 4.78, 약 4.76, 약 4.74, 약 4.72, 약 4.70, 약 4.68, 약 4.66, 약 4.64, 약 4.62, 약 4.60, 약 4.58, 약 4.56, 약 4.54, 약 4.52, 약 4.50, 약 4.48, 약 4.46, 약 4.44, 약 4.42, 약 4.40, 약 4.38, 약 4.36, 약 4.34, 약 4.32, 약 4.30, 약 4.28, 약 4.24, 약 4.22, 약 4.20, 약 4.18, 약 4.16, 약 4.14, 약 4.12, 약 4.10, 약 4.08, 약 4.06, 약 4.04, 또는 약 4.02에서 출발한다.
일부 실시양태에서, pH 구배는 약 3.0에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 3.0 초과에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 3.0 내지 약 4.0에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 또는 약 3.9에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 3.12, 약 3.14, 약 3.16, 약 3.18, 약 3.20, 약 3.22, 약 3.24, 약 3.26, 약 3.28, 약 3.30, 약 3.32, 약 3.34, 약 3.36, 약 3.38, 약 3.40, 약 3.42, 약 3.44, 약 3.46, 약 3.48, 약 3.50, 약 3.52, 약 3.54, 약 3.56, 약 3.58, 약 3.60, 약 3.61, 약 3.62, 약 3.63, 약 3.64, 약 3.65, 약 3.66, 약 3.67, 약 3.68, 약 3.69, 약 3.70, 약 3.71, 약 3.72, 약 3.73, 약 3.74, 약 3.75, 약 3.76, 약 3.77, 약 3.78, 약 3.79, 약 3.80, 약 3.82, 약 3.84, 약 3.86, 약 3.88, 약 3.9, 약 3.92, 약 3.94, 약 3.96, 또는 약 3.98에서 종결된다.
일부 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4.2에서 출발하고, 약 pH 3.7에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4.24에서 출발하고, 약 pH 3.69에서 종결된다. 예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체, 항-MUC16 항체, 항-CD4 항체, 및 1-아암 항-Met 항체는 약 pH 4.24에서 출발하고, 약 pH 3.69에서 종결되는 pH 구배를 사용하여 정제될 수 있다.
다른 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4.3에서 출발하고, 약 pH 3.7에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배 (즉, pH 단계식-구배)는 약 pH 4.34에서 출발하고, 약 pH 3.69에서 종결된다. 예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체, 항-MUC16 항체, 항-CD4 항체, 및 1-아암 항-Met 항체는 약 pH 4.34에서 출발하고, 약 pH 3.69에서 종결되는 pH 구배를 사용하여 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, pH 구배는 약 pH 4.6에서 출발하고, 약 pH 3.7에서 종결된다. 일부 실시양태에서, pH 구배 (즉, pH 전체-구배)는 약 pH 4.58에서 출발하고, 약 pH 3.69에서 종결된다. 예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체, 항-MUC16 항체, 항-CD4 항체, 및 1-아암 항-Met 항체는 약 pH 4.58에서 출발하고, 약 pH 3.69에서 종결되는 pH 구배를 사용하여 정제될 수 있다.
용리 완충제는 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제를 함유하며, pH 구배는 용리 완충제 중의 각각의 pH 완충제의 백분율을 조절함으로써 형성된다. 일부 실시양태에서, 고 pH 완충제는 약 pH 5.0이고, 저 pH 완충제는 약 pH 2.7이다. 예를 들어, 고 pH 완충제는 25 mM 아세테이트 및 pH 5.0일 수 있고, 저 pH 완충제는 25 mM 포름산 및 pH 2.7일 수 있다.
저 pH 완충제의 출발 비율을 조절하면 정제된 폴리펩티드의 순도는 최적화 및 최대화될 수 있으며, 또한, 응집체, 세포주 불순물들, 염기성 폴리펩티드 변이체, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 및 바이러스 필터 오염물을 비롯한, 불순물들을 폴리펩티드 단량체로부터 순차적으로 분리시킬 수 있다. 용리 완충제 중 저 pH 완충제의 백분율은 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 또는 약 45%에서 출발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제 중 저 pH 완충제의 백분율은 약 25%에서 출발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 pH 완충제를 약 25%로 함유하는 용리 완충제는 약 19 mM 아세테이트, 약 6 mM 포르메이트, 및 약 1,140 완충제 전도도 (pH 4.5-4.6)를 포함한다. 예를 들어, 저 pH 완충제를 약 25%로 함유하는 용리 완충제는 18.75 mM 아세테이트, 6.25 mM 포르메이트, 1,141 uS/cm 완충제 전도도 (pH 4.58)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제 중 저 pH 완충제의 백분율은 약 35%에서 출발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 pH 완충제를 약 35%로 함유하는 용리 완충제는 약 16 mM 아세테이트, 약 9 mM 포르메이트, 및 약 1,040 완충제 전도도 (pH 4.3-4.4)를 포함한다. 예를 들어, 저 pH 완충제를 약 35%로 함유하는 용리 완충제는 16.25 mM 아세테이트, 8.75 mM 포르메이트, 1,039 uS/cm 완충제 전도도 (pH 4.34)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제 중 저 pH 완충제의 백분율은 약 40%에서 출발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 pH 완충제를 약 40%로 함유하는 용리 완충제는 약 15 mM 아세테이트, 약 10 mM 포르메이트, 및 약 974 완충제 전도도 (pH 4.2-4.3)를 포함한다. 예를 들어, 저 pH 완충제를 약 40%로 함유하는 용리 완충제는 15 mM 아세테이트, 10 mM 포르메이트, 974 uS/cm 완충제 전도도 (pH 4.24)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제 중 저 pH 완충제의 백분율은 약 60%에서 종결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 pH 완충제를 약 60%로 함유하는 용리 완충제는 약 10 mM 아세테이트, 약 15 mM 포르메이트, 및 약 763 완충제 전도도 (pH 3.6-3.7)를 포함한다. 예를 들어, pH 구배 종결점의 저 pH 완충제는 10 mM 아세테이트, 15mM 포르메이트, 763 uS/cm 완충제 전도도 (pH 3.69)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제의 완충제 전도도 범위는 약 1,200 uS/cm 내지 약 500 uS/cm이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 완충제 전도도 범위는 약 1,150 uS/cm 내지 약 700 uS/cm이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 완충제 전도도는 약 1,145 uS/cm, 약 1,141 uS/cm, 약 1,130 uS/cm, 약 1,120 uS/cm, 약 1,110 uS/cm, 약 1,000 uS/cm, 약 1,039 uS/cm, 약 1,000 uS/cm, 약 974 uS/cm, 약 900 uS/cm, 약 800 uS/cm, 약 763 uS/cm, 또는 약 700 uS/cm이다.
일부 실시양태에서, 용리 완충제의 조성은 약 9-20 mM 아세테이트 및 5-15 mM 포르메이트이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 조성은 약 10-19 mM 아세테이트 및 6-16 mM 포르메이트이다.
또한, 폴리펩티드의 로딩 밀도를 조절하면 정제되는 폴리펩티드의 순도는 최적화 및 최대화될 수 있으며, 응집체, 세포주 불순물들, 염기성 폴리펩티드 변이체, 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, 및 바이러스 필터 오염물을 비롯한, 불순물들을 폴리펩티드 단량체로부터 분리시킬 수 있다.
"로드 밀도" 또는 "로딩 밀도"라는 용어는 크로마토그래피 수지 리터당 정제되는 폴리펩티드 (g)의 밀도, 또는 막/필터 부피 리터당 (L) 정제되는 폴리펩티드의 밀도이다. 로딩 밀도는 g/L로 측정된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 14 g/L에서 또는 그 초과의 밀도에서 출발하는 로딩 밀도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 14 g/L 내지 약 45 g/L 범위, 약 14 g/L 내지 약 70 g/L 범위의 로딩 밀도로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 15 g/L, 약 17 g/L, 약 19 g/L, 약 21 g/L, 약 23 g/L, 약 25 g/L, 약 26 g/L, 약 27 g/L, 약 28 g/L, 약 29 g/L, 약 31 g/L, 약 33 g/L, 약 35 g/L, 약 37 g/L, 약 39 g/L, 약 41 g/L, 약 43 g/L, 약 45 g/L, 약 50 g/L, 약 55 g/L, 약 60 g/L, 약 65g/L, 또는 약 70 g/L의 로딩 밀도로 로딩된다.
또한, 폴리펩티드 용리 체류 시간 (또는 용리 유량)을 조절하면 폴리펩티드의 순도는 최적화 및 최대화될 수 있으며, 불순물들을 폴리펩티드 단량체로부터 순차적으로 분리시킬 수 있다. 로딩 밀도가 증가되었을 때에는 응집체를 효율적으로 분획화시킬 수 있는 pH 구배의 능력에 있어 폴리펩티드 용리 체류 시간이 더 큰 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 5 칼럼 부피/시간 내지 약 35 칼럼 부피/시간 범위의 용리 유량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 5 칼럼 부피/시간 내지 약 25 칼럼 부피/시간 범위의 용리 유량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 5 칼럼 부피/시간, 약 7.5 칼럼 부피/시간, 약 10 칼럼 부피/시간, 약 12.5 칼럼 부피/시간, 약 15 칼럼 부피/시간, 약 17.5 칼럼 부피/시간, 약 20 칼럼 부피/시간, 약 22.5 칼럼 부피/시간, 약 25 칼럼 부피/시간, 약 27.5 칼럼 부피/시간, 약 30 칼럼 부피/시간, 약 32.5 칼럼 부피/시간, 또는 약 35 칼럼 부피/시간의 용리 유량을 갖는다.
본원에 기술된 방법을 사용하여 정제된 폴리펩티드는 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 75%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 80%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 85%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 90%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 95%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 96%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 97%, 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 98%, 또는 비정제된 폴리펩티드의 적어도 약 99% 중 임의의 수율을 가진다.
수율은 본원에 기술된 단백질 A 친화 크로마토그래피 정제 이전의 비정제된 폴리펩티드와의 비교로 나타낸, 정제된 폴리펩티드의 수집된 총량이며, 이는 보통 비정제된 폴리펩티드에 대한 상대적인 비율로서 표시된다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비는 비정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 75% 더 낮거나, 약 80% 더 낮거나, 약 85% 더 낮거나, 약 90% 더 낮거나, 약 95% 더 낮거나, 약 96% 더 낮거나, 약 97% 더 낮거나, 약 98% 더 낮거나, 또는 약 99% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비는 본 발명의 것 이외의 pH 정제 단계(들)를 사용하여 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 20% 더 낮거나, 약 30% 더 낮거나, 약 40% 더 낮거나, 약 50% 더 낮거나, 약 60% 더 낮거나, 또는 약 70% 더 낮다. 예를 들어, 종래 또는 전형적인 단계식 단백질 A 용리 방법에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키고, pH 구배없이 pH 3.6에서 또는 그 미만에서 폴리펩티드를 용리시킴으로써 정제된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비는, 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 3.6에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH로 용리시키는 단계를 포함하는 단계식 용리 방법에 의해 정제된 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 20% 더 낮거나, 약 30% 더 낮거나, 약 40% 더 낮거나, 약 50% 더 낮거나, 약 60% 더 낮거나, 또는 약 70% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 바이러스 필터 오염물의 비는 비정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 75% 더 낮거나, 적어도 약 80% 더 낮거나, 약 85% 더 낮거나, 약 90% 더 낮거나, 약 95% 더 낮거나, 약 96% 더 낮거나, 약 97% 더 낮거나, 약 98% 더 낮거나, 또는 약 99% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 바이러스 필터 오염물의 비는 본 발명의 것 이외의 pH 정제 단계(들)를 사용하여 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 20% 더 낮거나, 약 30% 더 낮거나, 약 40% 더 낮거나, 약 50% 더 낮거나, 약 60% 더 낮거나, 또는 약 70% 더 낮다. 예를 들어, 종래 또는 전형적인 단계식 단백질 A 용리 방법에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키고, pH 구배없이 pH 3.6에서 또는 그 미만에서 폴리펩티드를 용리시킴으로써 정제된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드에 대한 바이러스 필터 오염물의 비는, 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 3.6에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH로 용리시키는 단계를 포함하는 단계식 용리 방법에 의해 정제된 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 약 20% 더 낮거나, 약 30% 더 낮거나, 약 40% 더 낮거나, 약 50% 더 낮거나, 약 60% 더 낮거나, 또는 약 70% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자 계수는 약 15,000개의 입자/ml 미만이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자 계수는 약 12,500개의 입자/ml 미만, 약 10,000개의 입자/ml 미만, 약 7500개의 입자/ml 미만, 약 5,000개의 입자/ml 미만, 약 2,500개의 입자/ml 미만, 약 1,500개의 입자/ml 미만, 약 1,000개의 입자/ml 미만, 약 750 입자/ml 미만, 약 500개의 입자/ml 미만, 약 250 입자/ml 미만, 약 100개의 입자/ml 미만, 약 50 입자/ml 미만이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-유사 입자는 레트로바이러스-유사 입자이다.
본원에서 사용되는 바, "바이러스 입자"라는 용어는 단백질 보호 외피 (캡시드)로 둘러싸여 있는 핵산 코어로 구성된 비리온이다. "바이러스-유사 입자"는 형태학적, 생화학적 또는 다른 특성들은 유사하게 닮은, 비-감염성 바이러스이다. 이는 바이러스 생명 주기에 필요한 성분들 중 적어도 하나에 결함이 있다. 바이러스-유사 입자의 예로는 복제가 불가능한 레트로바이러스-유사 입자가 있다. 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자는 내인성 또는 외인성 (우발)인 것일 수 있다. 내인성 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자는 세포 및 세포 배양액에 존재하는 숙주 세포주에 의해 생산되고, 이는 숙주 세포 불순물들로서 간주될 수 있다. 외인성 또는 우발 바이러스 또는 바이러스-유사 입자는 숙주 세포주로부터 유래된 것이 아니다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 4 LRV (바이러스의 로그 10 감소)이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 4 LRV 내지 약 8 LRV 범위이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 4 LRV 내지 약 7 LRV 범위이다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드의 바이러스 또는 바이러스-유사 입자 바이러스 제거율은 약 5 LRV, 약 6 LRV, 약 7 LRV, 또는 약 8 LRV이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-유사 입자는 레트로바이러스-유사 입자이다.
본원에서 사용되는 바, LRV는 비정제된 폴리펩티드 및 정제된 폴리펩티드에서의 로그 10 (총 바이러스)의 차이를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드는 폴리펩티드 단량체이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 정제된 분획은 약 20 이하의 단백질 A 칼럼 부피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 정제된 분획은 약 15 이하의 단백질 A 칼럼 부피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 정제된 분획은 약 12 또는 그 미만의 단백질 A 칼럼 부피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 정제된 분획은 약 11, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5.5, 또는 약 5.0 이하의 단백질 A 칼럼 부피를 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 원하는 폴리펩티드 단량체 생성물로부터 본원에 기술된 불순물들 중 적어도 2가지를 제거한다. 예를 들어, 본 방법은 응집체 및 숙주 세포주 불순물 둘 모두, 응집체 및 바이러스 필터 오염물 둘 모두, 응집체 및 바이러스 입자 둘 모두, 응집체 및 바이러스-유사 입자 둘 모두, 응집체 및 염기성 폴리펩티드 변이체 둘 모두, 또는 숙주 세포주 불순물 및 바이러스 입자 등을 제거한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 원하는 폴리펩티드 단량체 생성물로부터 본원에 기술된 불순물들 중 적어도 3가지를 제거한다. 예를 들어, 본 방법은 응집체, 숙주 세포 불순물들, 및 바이러스 필터 오염물, 또는 응집체, 숙주 세포 불순물들, 및 바이러스 입자, 및 염기성 폴리펩티드 변이체 등을 제거한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 원하는 폴리펩티드 단량체 생성물로부터 본원에 기술된 불순물들 중 적어도 4가지를 제거한다. 예를 들어, 본 방법은 응집체, 숙주 세포 불순물들, 바이러스 필터 오염물, 및 바이러스 입자, 또는 응집체, 숙주 세포 불순물들, 바이러스 필터 오염물, 및 바이러스-유사 입자를 제거한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 본원에 기술된 방법은 원하는 폴리펩티드 단량체 생성물로부터 본원에 기술된 불순물들 중 적어도 5가지를 제거한다. 예를 들어, 본 방법은 응집체, 숙주 세포 불순물들, 바이러스 필터 오염물, 바이러스 입자, 및 바이러스-유사 입자 등을 제거한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 원하는 폴리펩티드 단량체 생성물로부터 불순물들 모두를 제거한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 응집체를 제거하는 추가의 정제 단계를 포함하지 않으며, 정제된 폴리펩티드는 적어도 약 98% 또는 약 99% 단량체의 순도를 가진다. 보통 별개의 이온 교환 크로마토그래피 단계에서 수행되는 응집체 제거는, 상기 기술된 pH 구배를 사용한 단백질 A 크로마토그래피 이후에는 필요하지 않다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 바이러스 필터 오염물을 제거하는 추가의 정제 단계를 포함하지 않으며, 정제된 폴리펩티드는 적어도 약 98% 또는 약 99% 단량체의 순도를 가진다.
일부 실시양태에서, 정제 방법은 염기성 또는 산성 폴리펩티드 변이체를 제거하는 추가의 정제 단계를 포함하지 않는다.
본원에 기술된 방법을 사용하여 정제된 폴리펩티드를 단백질 A 크로마토그래피 단계 이전, 그동안, 또는 그 이후에 추가 정제 단계를 통해 정제할 수 있다. 예시되는 추가의 정제 단계로는 히드록실아파타이트 크로마토그래피; 투석; 단백질을 포획하는 항체를 사용하는 친화 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) (예를 들어, HIC 상에서의 분획화); 황산암모늄 침전; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE, 바이러스 여과, 겔 여과, 및 약한 분배성 크로마토그래피를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 바이러스 여과 단계를 통해 추가로 정제할 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 pH 구배를 사용한 단백질 A 크로마토그래피 단계 이후의 바이러스 여과 단계에서 파라보바이러스 필터가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 이온 교환 크로마토그래피 단계를 통해 추가로 정제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 본원에 기술된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피 단계 이후에 연속하여 진행된다. 예를 들어, pH 구배없이 표준 단백질 A 크로마토그래피를 수행한 후, 표준 양이온 및 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피 단계를 수행하는 방법에 의해 유사한 순도와 수율을 가진 정제된 폴리펩티드를 제조할 수 있도록 하기 위해 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 막이 본원에 기술된 단백질 A 크로마토그래피 방법 이후에 표준 양이온 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 대신하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 제조업 규모 또는 상업적 공정이다. 본원에서 사용되는 바, 제조업 규모 또는 상업적 공정이란 단백질/폴리펩티드를 대규모로 정제하는 것, 예를 들어, 정제 공정 1회당 약 1 kL 내지 약 25 kL 발효 규모의 단백질/폴리펩티드 생성물을 정제하는 규모를 지칭하는 것이다.
폴리펩티드
본원에 기술된 방법을 사용하여 정제하고자 하는 폴리펩티드 또는 단백질로는 C H 2/C H 3 영역에 융합되거나, C H 2/C H 3 영역과 접합된 항체, 이뮤노어드헤신, 또는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 분자를 생선하는 기법은 하기에서 논의된다.
항체
본 발명의 범주내 포함되는 항체로는 항-CD20 항체, 예를 들어, 키메라 항-CD20 "C2B8" (미국 특허 번호 제5,736,137호에 기술) (리툭산(RITUXAN)®); 인간화된 및/또는 친화도 성숙 항-VEGF 항체를 비롯한 항-VEGF 항체, 예를 들어, 인간화된 항-VEGF 항체 huA4.6.1 아바스틴(AVASTIN)® (문헌 ([Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)], 국제 공개 번호 WO 96/30046, 및 WO 98/45331 (1998년 10월 15일 공개)) 및 V3LA; 항-MUC16 항체; 항-CD4 항체, 예를 들어, cM-7412 항체 (문헌 [Choy et al., Arthritis Rheum. 39(1):52-56 (1996)]) 및 이발리주맙(Ibalizumab) (TNX355) 항체; 항-MET 항체, 예를 들어, 1-아암 5D5 항-C-Met 항체; 항-HER2 항체 트라스투주맙(Trastuzumab) (허셉틴(HERCEPTIN)®) (문헌 ([Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285-4289 (1992)], 미국 특허 번호 제5,725,856호))) 및 인간화된 2C4 (WO 01/00245 (아담스(Adams) 등)), 2H7 항체의 키메라 또는 인간화된 변이체 (미국 특허 번호 제5,721,108 B1호), 또는 토시투모맙(Tositumomab) (벡사르(BEXXAR)®); 항-IL-8 항체 (문헌 ([St John et al., Chest, 103:932 (1993)], 및 국제 공개 번호 WO 95/23865)); 항-전립샘 줄기 세포 항원 (PSCA) 항체 (WO01/40309); S2C6 및 그의 인간화된 변이체를 비롯한, 항-CD40 항체 (WO00/75348); 항-CD1 항체 (문헌 (미국 특허 번호 제5,622,700호, WO 98/23761, [Steppe et al., Transplant Intl . 4:3-7 (1991)], 및 [Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)])); 항-CD18 (미국 특허 번호 제5,622,700호 (1997년 4월 22일 등록), 또는 WO 97/26912 (1997년 7월 31일 공개); 항-IgE 항체 (E25, E26 및 E27 포함; 문헌 (미국 특허 번호 제5,714,338호 (1998년 2월 3일 등록) 또는 미국 특허 번호 제5,091,313호 (1992년 2월 25일 등록), WO 93/04173 (1993년 3월 4일 공개), 또는 국제 출원 번호 PCT/US98/13410 (1998년 6월 30일 출원), 미국 특허 번호 제5,714,338호, [Presta et al., J. Immunol . 151:2623-2632 (1993)], 및 국제 공개 번호 WO 95/19181))); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개)); cA2 (레미케이드(REMICADE)®), CDP571 및 MAK-195를 비롯한, 항-TNF-항체 (문헌 (미국 특허 번호 제5,672,347호 (1997년 9월 30일 등록), [Lorenz et al., J. Immunol. 156(4): 1646-1653(1996)], 및 [Dhainaut et al., Crit . Care Med . 23(9): 1461-1469 (1995)]) 참조); 항-조직 인자 (TF) 항체 (유럽 특허 번호 0 420 937 B1 (1994년 11월 9일 등록)); 항-인간 α4β7 인테그린 항체 (WO 98/06248 (1998년 2월 19일 공개)); 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 (예를 들어, 침팬지화된 또는 인간화된 225 항체 (WO 96/40210 (1996년 12월 19일 공개)); 항-CD3 항체, 예를 들어, OKT3 (미국 특허 번호 제4,515,893호 (1985년 5월 7일 등록)); 항-CD25 또는 항-Tac 항체, 예를 들어, CHI-621 (시물렉트(SIMULECT)® 및 제나팍스(ZENAPAX)® (미국 특허 번호 제5,693,762호 (1997년 12월 2일 등록)); 항-CD52 항체, 예를 들어, 캠파스(CAMPATH)-1H (문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)]); 항-Fc 수용체 항체, 예를 들어, Fcy RI에 대한 M22 항체 (문헌 [Graziano et al., J. Immunol . 155(10):4996-5002 (1995)]); 항-암배아 항원 (CEA) 항체, 예를 들어, hMN-1 4 (문헌 [Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s- 5945s (1995)]); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 비롯한, 유방 상피 세포에 대한 항체 (문헌 [Ceriani et al., Cancer Res . 55(23): 5852s-5856s (1995)]; 및 [Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)])); 결장암종 세포에 결합하는 항체, 예를 들어, C242 (문헌 [Litton et al., Eur J Immunol . 26(1): 1-9 (1996)]); 항-CD38 항체, 예를 들어, AT 13/5 (문헌 [Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)]); 항-CD33 항체, 예를 들어, Hu M195 (문헌 [Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)]) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체, 예를 들어, LL2 또는 림포시드(LymphoCide) (문헌 [Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)]); 항-EpCAM 항체, 예를 들어, 17-1A (파노렉스(PANOREX)®); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예를 들어, 압식시맙(abciximab) 또는 c7E3 Fab (리오프로(REOPRO)®); 항-RSV 항체, 예를 들어, MEDI-493 (시나지스(SYNAGIS)®); 항-CMV 항체, 예를 들어, 프로토비르(PROTOVIR)®; 항-HIV 항체, 예를 들어, PRO542; 항-간염 항체, 예를 들어, 항-Hep B 항체 오스타비르(OSTAVIR)®; 항-CA 125 항체, 예를 들어, 오바렉스(OvaRex); 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 비탁신(VITAXIN)®을 비롯한, 항-αvβ3 항체; 항-인간 신장 세포 암종 항체, 예를 들어, ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 대한 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포암종 (SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예를 들어, 스마트(Smart) ID10 및 항-HLA DR 항체 온콜림(Oncolym) (Lym-1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 구체적으로 확인된 항체 이외에도, 당업계의 숙련가는 예를 들어, 하기 기술하는 기법을 사용하여 관심의 대상이 되는 항원에 대한 항체를 생성할 수 있다.
(i) 항원 선별 및 제조
본원의 항체는 관심의 대상이 되는 항원에 대한 것이다. 바람직하게, 항원은 생물학상 중요한 폴리펩티드이며, 질환 또는 질병을 앓는 포유동물에게 항체를 투여하는 것이 상기 포유동물에게 치료학상 유익할 수 있을 것이다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원 (예를 들어, 종양-관련 당지질 항원; 미국 특허 번호 제5,091,178호 참조)에 대한 항체 또한 주시된다. 항원이 폴리펩티드일 경우, 막횡단 분자 (예를 들어, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어, 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원으로는 하기 섹션 (3)에 기술되어 있는 단백질을 포함한다. 본 발명에 포함되는 항체에 대한 예시적인 분자 표적으로는 CD 단백질, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 및 CD34; ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들어, EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어, LFA-1, Mac1, p1 50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 α 또는 β 서브유닛 포함 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어, VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mp1 수용체; CTLA-4; 단백질 C, 또는 본원에 언급된 다른 항원들 중 임의의 것을 포함한다.
임의로는 다른 분자에 접합된, 가용성 항원 또는 그의 단편이 항체 생성을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예를 들어, 수용체의 경우, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 별법으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래된 것일 수 있거나, 또는 재조합 기법에 의해 막횡단 분자를 발현하도록 형질전환된 세포일 수 있다.
항체를 제조하는 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 당업자에게 자명할 것이다.
(ii) 폴리클로날 항체
바람직하게는, 관련 항원 및 애주번트를 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사하면 폴리클로날 항체가 유도된다. 이작용성 또는 유도체화 제제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여 면역화시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 갑상샘 글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어, (각각 토끼 또는 마우스에 대해) 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체를 3 부피의 프로인트 완전 애주번트를 조합한 후, 다중 부위에 상기 용액을 진피내로 주사함으로써 동물을 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 경과 후, 항원 또는 접합체 원래 양의 1/5 내지 {분수 (1/10)}되는 양을 사용하여 다중 부위에 피하 주사하여 동물에게 추가 접종한다. 7 내지 14일 경과 후, 동물을 출혈시키고, 항체 역가에 대해 혈청을 분석한다. 역가가 최고값에 도달할 때까지 동물에게 추가 접종한다. 항원은 동일하지만, 다른 단백질에 접합되고/거나, 다른 가교제를 통해 접합된 것인 접합체를 사용하여 동물에게 추가 접종하는 것이 바람직하다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물 중에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 면역 반응을 증진시키는 데 응집제, 예를 들어, 알럼이 적합하게 사용된다.
(iii) 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 먼저 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 기술된 바와 같이 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호).
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터, 또는 긴꼬리 원숭이(macaque monkey)를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나, 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 제조한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).
바람직하게는 비융합된 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 물질을 하나 이상 함유하는 적합한 배양 배지 중에 그렇게 제조된 하이브리도마 세포를 시딩하고, 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 효소가 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로는, HGPRT-결핍 세포의 성장을 방해하는 히포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체를 생산하는 세포에 의해 항체의 안정적인 고수준의 생산을 지원하며, 배지, 예를 들어, HAT 배지에 감수성인 세포이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (이는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center: 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Culture Collection: 미국 메릴랜드주 로크빌)로부터 입수가능)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 것으로 기술된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)])).
그 중에서 하이브리도마 세포가 성장된 배양 배지를 항원에 대한 모노클로날 항체 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해, 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어, 방사면역측정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정한다.
원하는 특이성, 친화성, 및/또는 결합성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 방법에 의해 클론을 서브클로닝시키고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 상기 목적을 위해 적합한 배양 배지로는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 동물 중 복수 종양과 같이 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 면역글로불린 정제 방법, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다. 바람직하게는, 본원에 기술된 pH 구배를 사용한 단백질 A 친화 크로마토그래피 방법이 사용된다.
(예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브에 의한) 종래 방법을 사용함으로써 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 단리시키고 서열 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리시키고 나면, DNA를 발현 벡터 내로 배치시킬 수 있고, 이어서, 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예를 들어, E. 콜라이 세포, 심미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성한다.
DNA는 또한 예를 들어, 동종성인 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (문헌 (미국 특허 번호 제4,816,567호; 문헌 [Morrison, et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA , 81:6851 (1984)])), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 모두 또는 그 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인 대신으로 치환되거나, 또는 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인 대신으로 치환됨으로써 한 항원에 대해 특이성을 가진 하나의 항원-결합 부위, 및 상이한 항원에 대한 특이성을 가진 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체가 형성된다.
모노클로날 항체는 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기법을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 ([Clackson et al., Nature , 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991)])에는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체를 단리시키는 것이 기술되어 있다. 후속 공개문헌에는 쇄 셔플링 (문헌 [Marks et al., Bio / Technology, 10:779-783 (1992)])에 의해서 뿐만 아니라, 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하는 전략법으로서 조합형 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc . Acids . Res., 21:2265-2266 (1993)])에 의해 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체를 생산하는 것이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기법은 모노클로날 항체를 단리시키는 전통적 하이브리도마 기법에 대한 대안으로서, 실행가능한 방법이다.
(iv) 인간화 항체 및 인간 항체
인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그 안으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 명명되며, 이는 전형적으로는 "도입" 가변 도메인으로부터 수득된 것이다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter)와 그의 동료들의 방법에 따라 (문헌 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature , 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science , 239: 1534-1536 (1988)])) 인간 항체의 상응하는 서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 실질적으로는 무손상 인간 가변 도메인보다는 덜 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로는, 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 중의 유사 부위로부터의 것인 잔기에 의해 치환화된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는 데 사용하고자 하는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 둘 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는 데 있어 매우 중요하다. 소위 "최적-맞춤(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 FR로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol ., 151:2296 (1993)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 (문헌 ([Carter et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immnol ., 151:2623 (1993)])).
추가로, 항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모체 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하는 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정을 통해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 잠재적인 역할을 분석할 수 있고, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이런 방식으로, FR 잔기는 예를 들어, 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은 원하는 항체 특징이 달성되도록 수령체 및 도입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
별법으로, 현재는 면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제시킨다고 기재된 바 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno ., 7:33 (1993)]; 및 [Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)])을 참조한다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수도 있다 (문헌 ([Hoogenboom et al., J. Mol . Biol, 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol . Biol, 222:581-597 (1991)]; [Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)])).
(v) 항체 단편
항체 단편 제조를 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 분해에 의한 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 ([Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]) 참조). 그러나, 이러한 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜라이로부터 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리시킬 수 있다. 단일 쇄 Fv 단편 (scFv) 또한 단리시킬 수 있다. WO 93/16185를 참조한다. 항체 단편 제조를 위한 다른 기법은 당업자에게 자명할 것이다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 상기 분자는 보통 오직 2개의 항원에만 결합하지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 가진 항체, 예를 들어, 삼중특이적 항체는 본원에서 사용될 때, 상기와 같은 표현에 포함된다.
이중특이적 항체 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장의 이중특이적 항체의 전통적인 제조는 상이한 특이성을 가진 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현에 기초한다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (콰드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생산하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 가진다. 통상적으로 친화 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생산율이 낮다. 유사한 방법이 (WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
WO 96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율(%)을 최대화시킬 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C H 3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어, 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 교차 결합 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포로 표적화하고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089)하는 것과 관련하여 제안된 바 있다. 이종접합 항체는 임의의 통상적인 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 다수의 가교 기법과 함께 적절한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기법은 문헌에도 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질 분해에 의해 절단하여 F(ab')2 단편을 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고, 분자간 이황화 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나가 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, E. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp . Med ., 175: 217-225 (1992)]에는 완전 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 제조에 대해 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 E. 콜라이로부터 별개로 분비되고, 시험관내 지시된 화학적 커플링을 실시하여 이중특이적 항체를 형성한다. 이로써 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만이 아니라, 또한 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수도 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기법 또한 기술된 바 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조되었다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이량체의 제조에 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 동일 쇄의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 1개의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되고, 이에 의해 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편를 제조하는 또 다른 전략법도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다. 별법으로, 항체는 문헌 [Zapata et al., Protein Eng . 8(10):1057-1062 (1995)]에 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 간략하면, 이러한 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 병렬식 Fd 절편 (V H -C H 1-V H 및 V L )의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.
2가 초과의 항체가 주시된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 ([Tutt et al., J. Immunol . 147: 60 (1991)]).
이뮤노어드헤신
가장 간단하고, 가장 쉬운 이뮤노어드헤신 디자인은 어드헤신의 결합 도메인(들) (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인 (ECD))을 면역글로불린 중쇄의 힌지 및 Fc 영역과 조합하는 것이다. 보통, 본 발명의 이뮤노어드헤신을 제조할 경우에는, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산의 C-말단에 융합시키게 되는데, N-말단 융합체 또한 가능하다.
전형적으로, 상기 융합체에서 코딩된 키메라 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능상 활성인 힌지, C H 2 및 C H 3 도메인을 보유할 것이다. 또한, 불변 도메인의 Fc 부위의 C-말단에, 또는 중쇄의 C H 1의 N-말단 바로 옆, 또는 경쇄의 상응하는 영역에 융합될 수 있다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않으며; 특정 부위가 주지되어 있고, 이는 이뮤노어드헤신의 생물학적 활성, 분비, 또는 결합 특징을 최적화할 수 있도록 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 어드헤신 서열은 면역글로불린 G1 (Ig G1)의 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역이 어드헤신 서열에 융합될 수도 있다. 그러나, 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 정의하는 파파인 절단 부위 (즉, 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기를 114로 간주)의 상류쪽에 바로 위치하는, 힌지 영역에서 시작되는 서열, 또는 다른 면역글로불린의 유사 부위가 융합에 사용된다. 일부 실시양태에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및/또는 C H 2 및 C H 3 또는 (b) C H 1, 힌지, C H 2 및 C H 3 도메인에 융합된다.
이중특이적 이뮤노어드헤신의 경우, 이뮤노어드헤신은 다량체로서, 및 특히, 이종이량체, 또는 이종사량체로서 조립된다. 일반적으로, 이러한 조립된 면역글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본 4개의 쇄 구조 단위는 IgG, IgD, 및 IgE가 그러한 형태로 존재하는 것인 형태이다. 고분자량 면역글로불린에서는 4개의 쇄 단위가 반복되며; 일반적으로 IgM은 4개의 기본 단위가 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린 또한 혈청 중에서 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원의 범주 내에 포함되는 각종의 조립된 이뮤노어드헤신의 일례들은 하기와 같이 개략적으로 도시될 수 있다:
Figure 112012025602529-pct00001
여기서, 각각의 A는 동일하거나, 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내고;
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1 초과의 정수이고;
Y는 공유 가교 결합제의 잔기를 나타낸다.
간결하게 하기 위해, 상기 구조식은 단지 하기와 같은 중요한 특징만을 나타낸 것이다; 면역글로불린의 연결부 (J) 또는 다른 도메인을 제시되어 있지 않으며, 이황화 결합도 제시되어 있지 않다. 그러나, 그러한 도메인이 결합 활성을 위해 필요할 경우, 이는 그가 면역글로불린 분자 중에서 점유하고 있는 보통의 위치에 존재할 수 있도록 작제되어야 한다.
별법으로, 어드헤신 서열을 면역글로불린 중쇄와 경쇄 서열 사이에 삽입할 수 있고, 이로써, 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 수득할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 어드헤신 서열은 면역글로불린의 각 아암의 힌지와 CH2 도메인 사이, 또는 CH2와 CH3 도메인 사이의 면역글로불린 중쇄 3' 말단에 융합된다. 유사한 작제물이 문헌 [Hoogenboom, et al., Mol . Immunol . 28: 1027-1037 (1991)]에 보고되어 있다.
본 발명의 이뮤노어드헤신 중에 면역글로불린 경쇄가 존재할 필요는 없지만, 면역글로불린 경쇄는 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유적으로 결합되어 존재할 수 있거나, 또는 어드헤신에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 전형적으로 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 함께 공발현된다. 분비시, 하이브리드 중쇄 및 경쇄는 공유결합하여 2개의 이황화-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공하게 된다. 그러한 구조를 제조하는 데 적합하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호 (1989년 3월 28일 등록)에 개시되어 있다.
가장 편리하게는 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 프레임 내에서 면역글로불린 cDNA 서열에 융합시킴으로써 이뮤노어드헤신을 작제할 수 있다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편에의 융합 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 (1990)]; 및 [Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144 (1991)]) 참조). 후자와 같은 유형의 융합을 위해서는 발현을 위한 Ig 조절 서열이 존재하여야 한다. IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA는 비장 또는 말초 혈액 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 하이브리드화에 의해 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기법에 의해 공개된 서열에 기초하여 단리시킬 수 있다. 선택된 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터 내로 이뮤노어드헤신의 "어드헤신" 및 면역글로불린 부분을 코딩하는 cDNA를 병렬로 나란히 삽입할 수 있다.
다른 C H 2 / C H 3 영역을 함유하는 폴리펩티드
정제시키고자 하는 폴리펩티드는 C H 2/C H 3 영역에 융합되거나, C H 2/C H 3 영역과 접합된 폴리펩티드이다. 그러한 융합 폴리펩티드는 단백질의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 및/또는 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 단백질의 정제를 촉진시키기 위해 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 접합될 수 있는 생물학상 중요한 단백질의 예로는 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상샘 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1 -항트립신; 인슐린 A쇄; 인슐린 B쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어, VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예를 들어, 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예를 들어, 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직형 플라스미노겐 활성인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시 조절되고, 보통 T 세포에서 발현되고 분비된다); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예를 들어, 인간 혈청 알부민; 뮬러리안-억제 물질; 릴랙신 A쇄; 릴랙신 B쇄; 프로릴랙신; 마우스 생식샘자극 호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어, 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어, CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경 친화성 인자, 예를 들어, 골-유래 신경 친화성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 ner 성장 인자, 예를 들어, NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어, aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 애리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 소멸 가속 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, 예를 들어, AIDS 인벨럽의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들어, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어, EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거한 폴리펩티드 중 어느 것의 단편을 포함한다.
폴리펩티드 발현
본원에 기술된 방법을 사용하여 정제하고자 하는 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 기법을 사용함으로써 제조된다. 폴리펩티드는 또한 펩티드 합성 (또는 다른 합성 수단)에 의해 제조될 수 있거나, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다.
폴리펩티드의 재조합적 제조를 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입시킨다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 폴리펩티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함에 의한 항체이다). 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하기: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제5,534,615호에 기술된 바와 같으며, 상기 출원은 구체적으로 본원에 참고로 포함된다).
본원에서의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예를 들어, 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어, E. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스, 예를 들어, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710 (1989년 4월 12일 공개)에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어, P. 애루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니라, 예시적인 것이다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예를 들어, 섬유상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵용 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 흔하게 사용된다. 그러나, 하기 예시하는 수많은 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하고 유용하다: 예를 들어, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르크시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬반니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어, 쉬반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어, A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger).
당화된 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 애데스 애기프티(Aedes aegypti) (모기), 애데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질 감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서의 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 가장 큰 관심의 대상은 척추동물 세포이며, 배양물 (조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양물로 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포, FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
숙주 세포를 폴리펩티드 제조를 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는 데 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양한다.
본 발명의 방법에 사용되는 폴리펩티드의 제조에 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어, 햄(Ham's) F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM) (시그마)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth . Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal . Biochem . 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 번호 Re. 30,985)에 기재된 배지 중 임의의 것을 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의된다), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원을 보충할 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수 도 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업계의 통상의 숙련가에게 명백할 것이다.
재조합 기법을 사용할 경우, 폴리펩티드는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 제조될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 제조되는 경우, 제1 단계로서, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 미립자 부스러기, 숙주 세포 또는 용해된 세포 (예를 들어, 균질화로부터 생성된 것이다)를 제거한다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우에는 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 농축시킨다.
폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 비롯한 조성물
본 발명은 또한 조성물, 예를 들어, 제약 제제도 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 정제되고, 임의로, 이종성 분자와 접합된 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 원하는 순도의 폴리펩티드를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition (2005)])와 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 제조될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 정제된, C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드 생성물은 적어도 약 98% 단량체 또는 적어도 약 99% 단량체의 원하는 순도를 가질 수 있다.
"제약상 허용되는" 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로파일 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 당질 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만닛톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원의 제제는 치료되는 특정 징후에 필요한 것으로서, 바람직하게는 서로 유해한 작용을 하지 않는 상호 보완적인 활성을 지닌 것인 1 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 분자는 적합하게는 의도 목적에 대해 유효한 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합으로 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 21 st edition (2005)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지효성 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드 변이체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 지효성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
이어서, 본원에 개시된 바와 같이 정제된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 각종 진단제, 치료제, 또는 상기 폴리펩티드 및 조성물에 대해 알려진 다른 용도를 위해 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 포유동물에게 치료학상 유효량의 폴리펩티드를 투여함으로써 포유동물에서 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 제공되는 것이 아니라, 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그의 견지에서 각종 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 수 있고, 이는 본 출원의 정신 및 범위 내에 포함시키고자 함을 이해하여야 한다.
실시예 1: pH 구배 용리 단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 크로마토그래피 칼럼 상에서 pH 단계식-구배 용리 방법을 사용하여 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 6개의 상이한 단백질들, 항-VEGF 항체 #1, 항-CD20 항체, 항-VEGF 항체 #2, 항-MUC16 항체, 항-CD4 항체, 및 아암 항-Met 항체를 정제하였다. 방법은 하기 표 1에 개략적으로 설명되어 있다.
Figure 112012025602529-pct00002
실험 방법
표 1에 열거되어 있는 바와 같은 단백질 로드 및 완충제 조성/pH 파라미터를 사용하여 유니콘(Unicorn) 방법 파일을 작성하였다. 이 파일은 GE 헬쓰케어 AKTA (GE 헬쓰케어) 익스플로러 FPLC (고속 단백질 액체 크로마토그래피) 시스템(GE Healthcare AKTA (GE Healthcare) Explorer FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) system)에 의해 실행하였다. FPLC는 제조업 정제 공정을 모사한, 플라스틱 배관 및 펌프로 제작된 벤치-규모 장치였다. FPLC는, 유량은 유지되고, 각 펌프가 전달하는 유체의 비율(%)은 변경되는 2개의 펌프 (A 펌프 및 B 펌프) 시스템을 사용하여 프로그래밍된 교환 비율로 2개의 완충제를 혼합함으로써 "pH 구배" 단계를 형성하였다. 유니콘 프로그램에서 한 세트 부피 (칼럼 부피수) 상의 하나의 "%B"에서 또 다른 "%B"로 지정되었다.
칼럼 평형 단계에서, 표 1에 열거된 바와 같은 보관액으로부터 칼럼을 꺼내고, 로딩을 위한 단백질 물질을 제조하였다. 단백질 로딩 단계에서는, 공극 크기가 0.2 마이크로미터인 진공 필터를 사용하여 HCCF (수거된 세포 배양액)을 사전 여과시키고, 단백질 A 칼럼 (맙셀렉트™, 맙셀렉트 수레™, 포로스® 맙캡쳐™ A, 프로셉® Va, 또는 프로셉® 울트라 플러스) 상에 로딩하였다. 단백질을 14-37 g/L 범위의 밀도로 로딩하였다. 대부분 21 g/L으로 수행되었다. 세척 1 단계에서, 세척 1 완충제를 사용하여 칼럼 상의 AKTA 라인에 남아있는 임의의 로드를 푸시시켰다. 세척 2 단계에서, 세척 2 완충제에 의해 불순물들, 예를 들어, CHOP (차이니즈 햄스터 난소 단백질)를 제거하였다. 세척 3 단계에서, 세척 3 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 세척 2 완충제와 회합된 불순물들을 제거함으로써 용리 단계를 준비하였다. pH 단계식-구배 용리 단계에서, 2개의 펌프 시스템에 의해 pH가 상이한 두 pH 완충제를 정확하게 조작함으로써 형성된 구배를 사용하여 2개의 완충제 중 한 pH 믹스로부터 또 다른 믹스 (비율(%)로 설정)로 서서히 이동시켰다. "35-60% B"의 용리 파라미터는 약 4.3-3.7 범위의 pH 구배와 상관관계에 있다. 더욱 구체적으로, 35%B는 용리 완충제 (pH 4.34), 16.25 mM 아세테이트, 8.75 mM 포르메이트로 구성된 완충제 조성, 및 1,039 uS/cm의 완충제 전도도에 상응하는 것이다. 60%B는 용리 완충제 (pH 3.69), 10 mM 아세테이트 및 15 mM 포르메이트로 구성된 완충제 조성, 및 763 uS/cm 완충제 전도도에 상응하는 것이다. 대부분의 실행 중 상기와 같은 용리 단계 동안, 용리가 진행되는 동안 내내 분획을 채취하고, 크기 배제 HPLC 분석법을 사용하여 분석함으로써 단량체 대 크기 변이체 (HMWS (고분자량 종), 이량체, 또는 단편) 용리 양상에 대해 측정하였다. 상기 분획에 대해서 또한 선택된 실행에 대한 CHOP 분석법을 수행하고, 나노드롭(NanoDrop) UV 분광광도계 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fischer Scientific: 미국 델라웨어주 윌밍턴))를 사용하여 단백질 농도에 대해 모든 분획을 측정하였다. 재생 단계에서, 재생 완충제를 사용하여 밀착 결합된 임의의 불순물들 또는 잔재 생성물을 세척하여 제거함으로써 실행 단계 사이에 이월되는 물질을 최소화시켰다. 보관 단계에서, 단백질 A 칼럼을 재생 완충제로부터 제거하고, 비사용시 시간이 경과하여도 칼럼이 무손상 상태로 유지될 수 있도록 디자인된 용액 중에 보관하였다.
상 길이 및 유량을 각각 시간당 CV 및 시간당 ㎝로 측정하였다. 압력 문제를 감안하여 유량을 시간당 ㎝에 의해 크기 조정하였다 (유량 (cm/hr)을 칼럼의 상 높이 (㎝)로 나누어 시간당 칼럼 부피를 얻는다).
크로마토그램을 수집하고, AKTA (GE 헬쓰케어) FPLC 정제 시스템 및 그와 관련된 유니콘 소프트웨어 패키지에 의해 분석하였다. 칼럼 A 정제 실행을 수행한 후, UV 흡광도, pH, 및 전도도 (뿐만 아니라, 다른 측정치 또는 프로그램 설명/로그북)의 트레이스에 액세스하고 조사하였다.
a. 크기 배제 크로마토그래피 ( SEC ) 분석법
애질런트 1200 시리즈 HPLC (애질런트 테크놀로지즈: 미국, 파트 G1329A) 상에서 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석법을 실행하고, 이를 사용하여 수집된 샘플에 대한 고분자량 종 (HMWS), 이량체, 단량체, 및 단편의 상대적인 수준을 측정하였다. 14.24 mL TSK G3000SWXL, 7.8 mmD x 300 mmH (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience: 일본 도쿄), 파트 08541) 칼럼을 사용하였다. 각 샘플을 인산칼륨/염화칼륨 HPLC 전개 완충제를 사용하여 대략 0.5 g/L 항체로 희석시키거나, 샘플 주입량을 수정하여 분석 칼럼에 로딩되는 질량을 표준화시켰다. 모든 샘플을 애질런트 HPLC 1.5 mL 유리 바이알 중에서 제조하였다. 0.5 mL/min 유량으로 30분 동안 전개시켰다. 샘플 1개당 대략 25 ng의 항체가 로딩될 수 있도록 샘플 주입량을 조정하였다. 샘플의 각 배경 완충제를 함유하는 블랭크를 각 샘플 세트와 함께 전개시켰다. 켐스테이션 (애질런트 테크놀로지즈)을 사용하여 수동으로, 또는 크로밀리언(CHROMELEON)® (다이오넥스(DIONEX: 미국 캘리포니아주 서니베일)) 소프트웨어를 사용하여 자동으로 UV 280 nm 흡광도 곡선을 분석하여 피크를 통합하고, 샘플에 대한 종들의 값(%)을 따로따로 수득하였다. 상기 분석으로부터 수득한 값(%)에 분획 농도 (mg/mL)를 곱하여 샘플 중 각 크기의 변이체 종에 대한 실제 농도 또는 질량을 수득하였다 (예를 들어, SEC 결과: 4% HMWS, 3% 이량체, 92% 단량체, 1% 단편; 샘플 농도: 2 g/L; 샘플 부피: 10 mL; 1.84 g/L 단량체, 샘플내 총 단량체 18.4 mg).
b. CHOP 분석
입증된 표준 효소 면역흡착 분석법 (ELISA)을 수행하는 분석법으로 선택된 실행으로부터의 샘플에 대해 분석함으로써 CHOP 수준을 정량하였다. 친화-정제된 염소 항-CHOP 항체를 미세역가 플레이트 웰 상에 고정화시켰다. CHOP, 표준물, 및 대조군을 함유하는 샘플 희석액을 웰 중에서 인큐베이션시킨 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-CHOP 항체와 함께 인큐베이션시켰다. o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드를 사용하여 홀스래디쉬 퍼옥시다제 효소 활성을 검출하였다. 미세역가 플레이트 판독기에서 흡광도 (492 nm)를 판독하여 CHOP를 정량하였다. 컴퓨터 곡선-맞춤 프로그램을 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 샘플 농도를 자동으로 계산하였다. ELISA에 대한 분석 범위는 전형적으로 5 ng/ml 내지 320 ng/ml였다. 풀 비교를 위해 결과를 ppm으로 표준화시켰다.
결과
단계식-구배의 용리 모양은 도 1에 제시되어 있다. 모든 단백질은 pH 하락 종결시에 의해 용리되었다. 단백질 대부분이 보다 신속하게 칼럼으로부터 용리되었지만, 충분량의 단백질이 칼럼 상에 남아있었고, 이는 구배 동안 용리되었다. 더 낮은 pH에서, 원하는 생성물 (용리 범위 약 pH 4.6 내지 3.7, 약간의 분자 대 분자의 변동이 있었다)과 비바람직한 응집체 (용리 범위 약 pH 3.9 내지 3.5) 사이의 분리가 일어났다.
시험된 모든 단백질 분자 6개 (항-VEGF 항체 #1, 항-CD20 항체, 항-VEGF 항체 #2, 항-MUC16 항체, 항-CD4 항체, 및 1-아암 항-Met 항체)에서는 고비율 (~100%)의 단량체가 초기 구배 분획 중에서 관찰되었고, 구배 후단부는 응집된 종을 더욱더 높은 수준 (>50%)으로 함유하였다. 이러한 SEC 결과는 도 2-4B에 제시되어 있다. 상기 세트의 시험된 분자들은 좀 더 큰 부류의 단백질 분자들 (예를 들어, 키메라 항체, 티오Mab (하나의 아미노산 잔기가 시스테인으로 대체됨으로써 점 돌연변이를 가진 재조합 모노클로날 항체), IgG4, 및 E. 콜라이에 의해 생산된 항체 단편)을 포함하고 있는 바, 본 pH 단계식-구배 방법은 C H 2/C H 3 영역을 포함하는 모든 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역)에의 광범위한 적용가능성을 제안한다.
실시예 2: 표준 단계식 용리 및 pH 단계식- 구배 용리를 사용한, 단백질 A 크로마토그래피 칼럼 상에서의 항- CD20 항체, 항- VEGF 항체 #1, 및 항- MUC16 항체에 대한 CHOP 분리
실시예 1에 기술된 pH 단계식-구배 용리 단백질 방법을 사용하여, (도 1A의 항-VEGF 항체 #1 크로마토그램 상에서 관찰된 것과 같이, 단계식-구배 용리 단계에 대한 온라인 AKT A/유니콘 UV 280 판독값을 따라 추적하는 벤치 탑 오프라인 UV 280 흡광도로부터의) 분획당 항-CD20 항체 수준 (mg/mL) 및 분획당 CHOP 수준 (ppm)을 측정하였다. 도 5의 좌측 패널 (항-CD20 항체 및 CHOP 용리)에서 알 수 있는 바와 같이, pH 단계식-구배 용리 중 보다 낮은 pH에서의 후반 분획은 CHOP의 양에 비해 항-CD20 항체를 거의 함유하지 않았다. 항-CD20 항체 단계식-구배 pH 용리과 동시에 수행된 대조군 실행으로부터 얻은 데이터는 도 5의 표 맨 윗줄에 제시되어 있다. 대조군 실행에서는 표 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였고, 단, 예외적으로 단백질 용리 단계 동안 pH 단계식-구배는 사용하지 않았고, 단백질은 pH 3.6에서 또는 그 미만에서 용리시켰다. 맨 아랫줄에서는 pH 단계식-구배를 사용한 경우, 항-CD20 항체 수율이 소폭, 그러나, 허용될 정도로 감소되었다는 것이 제시되어 있다 (주석: 응집체 제거로 인한 상기와 같은 수율 손실이 예상된다; 수율은 칼럼 상에 로딩된 생성물 전체량 중의 응집체를 포함하는 HCCF 역가값을 사용하여 계산된다). 대조군 풀과 비교하여 약 5% 미만의 응집체 및 ½의 CHOP 수준이 관찰되었다. 본 결과를 통해 pH 단계식-구배 용리를 사용하면 순도를 증가시킬 수 있다는 예상밖의 이점이 있다는 것이 확립되었다.
실시예 1에 기술된 pH 단계식-구배 방법을 사용함으로써 항-VEGF 항체 #1 및 항-MUC16 항체에 대한 CHOP 분리 또한 수행하였다. 항-CD20 항체 CHOP 그래프에서 관찰된 패턴과 유사하게, 항-VEGF 항체 용리에 비례하여 pH 구배 종결시 더 많은 CHOP가 용리되었으며, 이는 pH 단계식-구배 용리가 항-CD20 항체 뿐만 아니라, 상기 단백질 분자에 대한 숙주 세포 불순물들도 분리시켰다는 것을 시사한다. 도 6을 참조한다. 항-MUC16 항체에서의 CHOP 분리시, 상기 항체는 항-VEGF 항체 #1에서 관찰된 용리 패턴과 비교하여 CHOP 수준은 더욱더 높았다. 도 7을 참조한다. 따라서, 상기 기술된 바와 같은 pH 단계식-구배 방법을 사용함으로써 상당량의 CHOP가 항-MUC16 항체로부터 분획화될 수 있다.
실시예 3: pH 구배 용리 단백질 A 크로마토그래피를 사용한 바이러스 입자 제거
실시예 1에 기술된 pH 단계식-구배 용리 단백질 A 크로마토그래피 방법을 사용하여 항-VEGF 항체 #1의 바이러스 입자 제거에 대해 측정하였다.
단계식- 구배 pH 용리 단백질 A 크로마토그래피
모든 단계 및 완충제는 실시예 1에서 사용된 것과 동일하였다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석법을 사용하여 분획의 레트로바이러스-유사 입자 계수에 대해 시험하였다.
a. 레트로바이러스-유사 입자 정량적 중합효소 연쇄 반응 ( RVLP QPCR ) 분석법
RVLP 내인성 바이러스 입자 분석법은 실시간 정량적 PCR 분석법이다. 퀴아젠(Qiagen) EZ1 (퀴아젠(Qiagen: 미국 캘리포니아주 발렌시아))을 사용하여 샘플로부터 바이러스 RNA를 추출하였다. 샘플 크기는 0.4 mL였다 (비희석된 HCCF 및 1:10으로 희석된 HCCF, 비희석된 단백질 A 풀). 공지의 CHO 레트로바이러스 입자 역가와 함께 참조 표준 HCCF 샘플을 포함함으로써 추출률을 확인하였다. 30 min 동안 승온하에서 0.2 유닛/mL의 DNase I로 추출 용리액을 처리함으로써 DNase 분해하여 게놈 DNA를 제거하였다. 이어서, 15 min 동안 70℃에서 DNase를 열처리하여 불활성화시켰다. 샘플을 분석하여 역전사 효소가 없음을 통해 레트로바이러스 DNA의 부재를 확인하였다.
문헌 [De Wit et al. (Biologicals, 28(3): 137-48 (2000)]에 기술된 바와 같이, 단, 주변 영역의 새로운 프로브를 사용하여 CHO 레트로바이러스 게놈을 측정하는 실시간 정량적 PCR 분석법을 수행하였다. 시약 및 방법 또한 최신형의 개선된 것이었다. CHO C형 레트로바이러스 게놈으로부터의 고도로 보존되는 pol 영역 중의 단편을 증폭시킬 수 있도록 프라이머 및 프로브 서열을 디자인하였다. 각 레트로바이러스-유사 입자는 2개의 게놈 RNA 분자를 함유하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티) 및 인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배즈)로부터 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머를 주문하였다. 바이러스 제거를 로그 10 감소값 또는 LRV로 표시하였는데, 이는 단백질 (HCCF) 로드 및 생성물 풀의 로그 10 (전체 바이러스)의 차이값이다. 샘플 및 샘플 부피 (mL) 중 바이러스 역가 (입자/ml 또는 nU/mL)로부터 전체 바이러스를 수득하였다. 도 18에는 pH 단계식-구배 용리로부터 얻은 각 분획에 대한 내인성 바이러스-유사 입자 계수가 제시되어 있다. 일부 바이러스는 큰 피크 중 구배 출발시에 용리되었지만, 대부분의 바이러스는 용리 후단부에 용리되었다. 따라서, 생성물로부터 이러한 RVLP를 분리하는 것은 바이러스 제거라는 면에서 pH 단계식-구배 또는 전체-구배 용리 단백질 A 크로마토그래피 전체 효율에 유익할 수 있다. 도 19에는 HCCF 로드와의 비교로 각 분획에 대한 LRV가 제시되어 있다. 본 그래프는 도 18로부터 얻은 값을 사용하여 계산된 값에 기반하여 작성되었다. 후반의 응집체가 풍부하게 존재한 용리 분획 중에서 LRV가 크게 감소한 것이 관찰되었다. 보다 높은 수준의 폴리펩티드 단량체 분획이 용리된 중간 부분의 LRV가 높게 나타났다 (바람직한 효과).
실시예 4: pH 구배 용리 단백질 A 크로마토그래피를 사용한 염기성 폴리펩티드 변이체 제거
실시예 1에 기술된 pH 단계식-구배 용리 단백질 A 크로마토그래피 방법을 사용하여 항-VEGF 항체 #1의 염기성 폴리펩티드 변이체 (또는 염기성 변이체) 제거에 대해 측정하였다.
단계식- 구배 pH 용리 단백질 A 크로마토그래피
모든 단계 및 완충제는 실시예 1에서 사용된 것과 동일하였다. 이온 교환 변이체 분석법으로 분획을 분석하였다.
a. 이온 교환 변이체 분석법
애질런트 1200 시리즈 HPLC (애질런트 테크놀로지즈: 미국, 파트 G1329A) 상에서 분석용 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 분석법을 실행하고, 이를 사용하여 수집된 항-VEGF 항체 #1 샘플에 대한 산성 및 염기성의 하전된 변이체에의 주요 피크의 상대적인 수준을 측정하였다. ACES [N-(2-아스트아미도)-2-아미노에탄술폰산] 및 NaCl 구배로 승온 조건하에서 다이오넥스 프로팩(ProPac) WCX-10, 4.6 x 250 mm (다이오넥스 제품 번호 054993) 칼럼을 사용하였다. 카르복시펩티다제 (CpB)를 사용하여 20분 동안 열 분해시키기 전에 샘플 시료는 IEC 이동상 내에 완충제 교환 샘플을 포함하였다. 대략 50 ug의 항-VEGF 항체 #1을 샘플당 칼럼에 주입하였다. UV 280 nm 트레이스를 수득하고, 켐스테이션 (애질런트 테크놀로지즈) 소프트웨어를 사용하여 통합하였다. 구배 전체의 이온 교환 변이체 조성 성향에 대한 산성, 염기성, 및 주요 피크 종의 각 카테고리에 대한 통합율(%)을 분석하였다. 도 17에는 20가지의 단백질 A pH 단계식-구배 용리 분획 전체의 이온 교환 변이체 분석 피크 통합에 대한 결과가 제시되어 있다. 분획 중 염기성 변이체의 존재율(%)은 단백질 A pH 단계식-구배 용리의 후반부에 현저하게 증가하였다. 상기의 구배 용리의 후반부는, 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, CHOP 및 응집 분리의 증가가 일어난 것으로 관찰된 부분과 동일부이다.
실시예 5: 다중 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 사용한 pH 단계식- 구배 용리
상기 기술된 pH 단계식-구배 용리 방법을 사용하여 맙셀렉트 수레™ 및 맙셀렉트™ 수지, 둘 모두를 시험하였다. 이들 두 단백질 A 수지는 명칭은 유사하지만, 이는 부착된 상이한 친화 리간드를 가지고 있다. 맙셀렉트™는 천연 단백질 A 리간드를 보유하는데, 이는 항체의 Fc 부위에 결합한다. 맙셀렉트 수레™는 단시간 동안 고 pH 용액 중에서 안정적일 수 있도록 화학적으로 변경된 것인, 변형된 형태의 단백질 A를 보유한다. 오버레이된 AKTA 용리 프로파일을 통해 용리 트레이스가 2개의 단백질 A 수지에 대해 매우 유사하다는 것이 나타났다. 도 8의 맙셀렉트에 대한 SEC 통합 프로파일에 의해서 알 수 있는 바와 같이, 상기 수지를 사용함으로써 유사한 응집체 분리가 이루어졌다. 응집체 분리에 대해 성공적으로 시험된 다른 수지는 프로셉® Va, 프로셉® 울트라 플러스, 및 포로스® 맙캡쳐™ A였다. 따라서, 불순물들을 분획화하는 pH 단계식-구배 용리 방법에 각종 친화 수지 (예를 들어, 맙셀렉트™, 맙셀렉트 수레™, 프로셉® Va, 프로셉® 울트라 플러스, 및 포로스® 맙캡쳐™)가 사용될 수 있다.
실시예 6: pH 구배 용리 방법을 위한, 다양한 파라미터를 사용한 실험 디자인 ( DOE )
35회 실행하여 통계학상 디자인된 연구를 사용하여 항-VEGF 항체 #1에 대해 하기 표 2에 제시되는 범위 내에서 대부분의 크로마토그래피 공정에서 중요한 다양한 파라미터를 연구하였다. "용리 출발 %B" 파라미터는 용리 단계의 출발 pH에 영향을 미칠 뿐만 아니라 (용리 단계의 출발 pH는 용리 곡선의 모양을 결정짓는데 중요한 역할을 한다. 출발 %B가 높을수록, 출발 용리 pH는 낮아지고, 처음 분획에서 칼럼으로부터 용리되는 단백질은 많아진다), 전체 구배 기울기에도 영향을 미친다. 동시에, 주요 효과 뿐만 아니라, 상호작용을 설명하기 위해 디자인된 부분 요인 연구에서 파라미터에 변화를 줄 수 있다. 용리 동안 모든 실행을 분획화하고, 응집체 및 농도를 모든 분획에 대해 분석하였다. 내삽 계산법을 사용하여, 수율이 정확하게 85% (단계식 수율 표적의 하한)인 풀에 대한 모의 풀 단량체 수준을 측정하고, 이 값을 사용하여 응집체로부터 단량체를 효율적으로 분리하는 데 있어서의 각 실행 파라미터 세트들의 효능을 비교하였다.
Figure 112012025602529-pct00003
실험 방법
유니콘 소프트웨어를 사용하여 (다중 칼럼 패킹을 필요로 하는) 칼럼 상 높이 이외의 모든 파라미터 변화를 조사하였다. 모든 용리 전체에 걸쳐 CV 분획을 취하고, (상기 기술된 바와 같이) HPLC SEC를 사용하여 분석하고, 단백질 농도 (나노드롭 UV 분광광도계 상에서 측정된 UV 280 흡광도)를 측정하였다. 비교를 위해 상기 결과를 최적으로 표준화시키기 위한 목적으로 다양한 분획 세트로부터 얻은 데이터를 컴파일링하고, 계산하여 각 실행으로부터 얻은 풀의 전체 수율 및 SEC 프로파일을 내삽하였다.
JMP® (SAS: 미국 노스캐롤라이나주 캐리) 소프트웨어 패키지를 사용하여 부분 요인 파라미터 연구 실행 계획을 작성하였다. 그의 수율이 높고, 단량체 수준이 높으며, 풀 크기가 낮기 때문에 세트로부터 실행 중 하나를 "제조 실행에 대한 일례"로서 선택하였다 (도 11).
결과
DOE 결과의 파레토 플롯은 응집체 분리율을 측정할 때, "출발 %B"가 가장 영향력이 큰 파라미터이며, 그 다음으로 로드 밀도 (낮을수록 우수하다)이고, 체류 시간 (체류 시간 (hr/CV)은 상 높이인 조절형 파라미터 (cm/CV)를 유량 (cm/hr)으로 나눔으로써 계산하였다)이라는 것을 나타낸다. 따라서, 출발 %B가 낮을수록, 용리 출발 pH는 높아지고, 응집체는 더욱 효율적으로 분리되고; 로드 밀도가 낮을수록, 응집체는 더욱 효율적으로 분리되며; 체류 시간이 길수록, 응집체는 더욱 효율적으로 분리된다. 도 9를 참조한다. 추가로, 상기 연구로부터의 상호작용 프로파일은 로드 밀도인 파라미터와 출발 %B 인 파라미터 사이에 상호작용이 존재할 뿐 만 아니라, 체류 시간과 로드 밀도 사이에 상호작용이 존재한다는 것을 나타낸다. 로드 밀도가 증가되었을 때에는 출발 %B는 85% 수율의 모의 풀의 단량체 수준에 대해, 보다 낮은 로드 밀도에서 실행이 이루어진 경우에서보다 더 큰 효과를 발휘하였다. 추가로, 로드 밀도가 증가되었을 때에는 응집체를 보다 효율적으로 분획화시킬 수 있는 구배 능력에 있어 체류 시간이 더 큰 역할을 하였다. pH 단계식-구배 방법을 사용하였을 때 높은 생성물 처리량을 얻기 위해서는 용리 동안 보다 낮은 속도가 사용되어야 한다. 도 10을 참조한다. 도 11은 상기 실행으로부터의 풀은 10 CV 아래이고 (예를 들어, 5.4 CV 또는 6 CV), 1% 미만으로 응집체를 전달하고 수율은 85% 초과라는 것을 나타낸다.
주요 효과 (도 9의 파레토 플롯), 상호작용 (도 10), 및 제조 실행에 대한 일례 (도 11) 이외에도, 전체 용리 길이가 응집체 분리에는 어떤 영향도 미치지 못하지만, 이는 풀 크기를 축소시키기 위해 조작될 수 있으며, 이로써 여전히 순도는 높고, 수율은 높지만, 부피는 더 적은 (이는 제조업 규모를 위해 바람직할 수 있다) 풀을 얻을 수 있다는 것을 관찰하게 되었다. 또한, pH 단계식-구배를 사용함으로써 순도는 전체 구배를 통해 얻은 순도와 거의 유사하며, 부피는 보다 적은 풀을 얻게 되었다 (실시예 8 참조). pH 단계식-구배는 또한 로드 밀도 및 유량의 작은 변화를 비롯한 수개의 공정 변화에서도 강력하며, 상 높이에 의해서는 완전하게 어떤 영향도 받지 않는다는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: pH 단계식- 구배 단백질 A 크로마토그래피 후에 이온 교환 막 크로마토그래피를 사용한 단백질 정제
하류 칼럼 크로마토그래피가 정제 공정으로부터 삭제될 수 있는지, 또는 막으로 치환될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항-VEGF 항체 #1 (1% 미만의 응집체 및 고수율의 풀)에 대한 단백질 A pH 단계식-구배의 벤치 규모의 사이클링을 하류의 하전된 막 상에 로딩하였다. 무스탕(MUSTANG)® S (폴 코포레이션(Pall corporation)) 및 무스탕® Q (폴 코포레이션) 막이 각각 양이온 교환 막 및 음이온 교환 막을 나타내었다. 전형적인 하류 칼럼 공정과 비교하여 동일의 전체 순도 및 수율을 달성할 수 있는 막의 능력에 의해 성공률을 측정하였다.
실험 방법
S 및/또는 Q 막 상에서의 CHOP 및 응집체 제거를 위한 최적의 로드 조건을 결정하는 데 사용된 파라미터는 하기 표 3A 및 3B의 단백질 A 표준 단계식 풀을 사용하여 수행된 S 및/또는 Q 막 상에서의 CHOP 제거를 위한 최적의 로드 조건에 관한 이전 연구로부터 채용하였다. 이러한 이전 연구에서, 단백질 A 표준 단계식 풀 (대조군: pH 구배없이 pH 3.6에서 또는 그 미만에서 단백질 용리)을 사용하였을 때 유망한 결과를 얻었지만; 이러한 공정에서의 CHOP 수준은 원하는 것보다 약간 더 높았고, 상기 공정으로부터는 어떤 응집체도 제거되지 못했다. 이러한 이전 연구에서, 막을 5 kg/L 막으로 로딩하고, 불순물 제거를 위한 최적의 로딩 조건을 발견하게 되었다. 단백질 A 단계식-구배 용리 풀에 대해서도 상기와 동일한 조건을 사용하여 CHOP 및 응집체로서 표적화되는 주된 불순물들을 사용하여 상기 막 상에서의 상이한 단백질 A 풀의 성능을 비교하였다.
Figure 112012025602529-pct00004
초기 연구에서, 단백질 A 표준 단계식 용리 풀을 특정 pH 및 전도도로 조절하고, AKTA™ FPLC 정제 시스템에 연결된 실험실 규모의 양이온 (무스탕® S) 및 음이온 (무스탕® Q) 교환 막 유닛을 통해 통과시켰다. 유량은 유지시키고, 오염/투과 소멸을 입증하기 위해 압력 트레이스를 조사하였다. 다양한 로드 밀도에서 분획을 채취하고, CHOP (ELISA) 및 항체 농도 (나노드롭 UV 분광광도계 상에서의 UV 280 흡광도)를 분석하였다. 다양한 로드 밀도에서 이러한 분석 결과들을 비교하여 종결시 CHOP 제거를 위한 최적의 로딩 조건을 찾아내었다. 후속 연구에서는, 초기 연구에서 찾은 최적의 조건으로 단백질 A pH 단계식-구배 용리 풀을 조절하였다. 이로부터, 고수율 및 낮은 응집체 수준을 유지하면서, CHOP 및 다른 불순물들을 제거할 수 있는 하류 막들의 능력에 있어서의 단계식-구배 용리 풀의 성능을 표준 단백질 A 단계식 용리의 성능과 비교하였다. 또한, 2가지 크기의 양이온 교환 막 및 3가지 크기의 음이온 교환 막을 사용하여 결과의 재현가능성 및 확장성에 대해 시험하였다.
결과
일련으로 양이온 교환 막 정제에서 음이온 교환 막 정제까지를 위한 로드로서 단백질 A 단계식 풀을 사용한 경우, 5 kg/L 막으로 로딩된 막에 대해 수득된 최저 CHOP 수준은 15-20 ppm이었다. 막이 응집체를 제거하지 않았기 때문에 상기 불순물의 수준은 최종 풀에서 받아들이기 어려울 정도로 높게 나타났다. 반대로, 단백질 A pH 단계식-구배 용리 풀을 상기와 동일한 막에 로딩한 경우, CHOP 수준은 0-15 ppm이고, 응집체 수준은 최종 풀에서 여전히 낮았는데, 이는 전반적인 공정에 유익하다는 것을 시사하는 것이다.
추가로, 시험된 이온 교환 막의 3가지 조합들 각각의 최종 풀은 고수율 및 고순도의 최종 풀을 얻었다. 모든 경우에서, 응집체 수준은 pH 조절 및 막 프로세싱을 통해 낮게 유지되었고, CHOP 수준 또한 이전 대조군 연구에서 관찰된 것보다 낮게 나타났는데, 예상밖의 CHOP 감소는 공급 물질로서 보다 소량의 응집체 단백질 A 풀을 사용하는 것에도 유익하다는 것을 나타낸다. 도 12를 참조한다. 따라서, 통상의 이온 교환 크로마토그래피 칼럼 대신 이온 교환 크로마토그래피 막을 사용하면 다수의 전형적인 칼럼 크로마토그래피 완충제가 필요없게 되고, 다른 시간/제조 공간을 소비하는 불편함도 없어지게 된다. 더욱 중요하게는, 이러한 하전된 막은 오버로드 모드로 사용되는 바 (즉, 로드는 높은 로딩 밀도로 막을 통과하며, 고도로 정제된 풀 생성을 위해 필요한 세척 또는 용리 단계는 없는 바), 막을 통해 pH 구배 단백질 A 크로마토그래피 단계 하류의 연속적인 정제 공정이 허용된다.
파일럿 규모 (4.1 L)와 28 mL 벤치 규모 사이의 SEC 통합 프로파일 또한 매우 유사한 것으로 나타났는데, 이는 단백질 A pH 단계식-구배의 규모를 성공적으로 조정할 수 있으며, 임의의 소규모 결과가 보다 큰 대규모 성능을 시사하는 것으로 간주될 수 있음을 나타낸다. 도 13을 참조한다. 이러한 결과는 pH 단계식-구배 용리 단백질 A 크로마토그래피의 재현가능성 및 확장성에 대한 예상밖의 이점을 시사한다.
실시예 8: 비레솔브 ® 프로 파라보바이러스 필터 실행
A. 비레솔브 ® 프로 투과성 소멸 비교
파라보바이러스 필터 (비레솔브 프로, 밀리포어 인크.(Millipore, Inc.)) 상에서의 더 많은 질량을 처리할 수 있는 처리량을 촉진시키는 것에 의해 단백질 A pH 단계식-구배를 단백질 A 표준 단계식 (대조군, pH 구배없이 pH 3.6에서 또는 그 미만에서 단백질 용리)과 비교하였다. 일반 HCCF 공급 물질을 사용하여 표준 유동식 모드로 QSFF (Q 세파로스 패스트 플로우 (음이온 교환 칼럼; GE 헬쓰케어)) 상에서 단백질 A pH 단계식-구배 및 단백질 A 표준 단계식 대조군, 둘 모두를 실행한 후, 비레솔브® 프로 파라보바이러스 필터 상에서 실행하였다. 수개의 비레솔브® 프로 실행 조건을 시험하였다: 1) 단백질 A 표준 단계식 용리 풀, SHC 멸균 프리필터 인라인 사용, 2) 단백질 A 표준 단계식 용리, 프리필터 인라인으로서 양이온 교환 (CEX) 막 흡착기 사용, 3) 단백질 A pH 단계식-구배 풀, SHC 프리필터 (비하전된 0.2 마이크로미터 멸균 등급의 필터) 사용, 및 4) 단백질 A pH 단계식-구배 풀, 프리필터 인라인으로서 CEX 막 흡착기 사용. 일부 풀은 반복 실행하였다. 데이터를 스프레드시트로 기록하기 위해 연동 펌프, 저울, 및 압력 센서로 이루어진 한 세트를 사용하는 여과 장치 상에서 비레솔브® 프로를 실행하였다.
SHC 멸균 프리필터 인라인을 사용한, pH 단계식-구배 풀을 양이온 교환 막을 사용한, 단계식 풀과 유사한 방식으로 수행하였는데, 이 둘 모두 비레솔브® 프로 상에서의 가능한 질량 처리량은 약 6배 증가한 것으로 나타났다. 도 14를 참조한다. 따라서, 이러한 결과는 CEX 막 프리필터의 도움없이도 비레솔브® 프로 필터 오염물을 제거함에 있어 단백질 A pH 단계식-구배가 예상밖으로 유익하다는 것을 시사한다. 추가로, CEX 막 흡착기와 단백질 A pH 단계식-구배 풀의 조합은 비레솔브® 프로 성능에 도움이 되며, 비레솔브® 프로 상에서 SHC를 사용한 단백질 A 표준 단계식 용리 풀 실행과 비교하였을 때, 잠재적인 질량 처리량은 예상밖으로 대략 18배 개선된 것으로 나타났다.
B. 비레솔브 ® 프로 CHOP 및 SEC 실 험
비레솔브® 프로 실행 순서 동안의 상이한 시점에 샘플을 채취하고, CHOP 및 SEC에 대해 분석하였다. SHC 인라인을 사용한 단백질 A 표준 단계식 순서에서는 CHOP 수준이 매우 낮았지만, 응집체는 여전히 함유하였다. 단백질 A pH 단계식-구배 실험에서 상이한 공정 단계 전체를 통해 응집체 수준은 낮게 유지되었고, 그 결과, 최종 풀의 응집체 수준은 1% 미만이었다. 이러한 결과는 표준 단계식 풀에 의해 전달된 풀보다 상당 수준 개선된 것이었다. 추가로, pH 단계식-구배 SHC-비레솔브® 프로 풀에 대한 CHOP 수준은 양이온 교환 막을 사용한 표준 단계식 실행에서의 수준과 유사하였다. 수준은 SHC를 사용한 표준 단계식의 것으로부터 얻은 수준보다 약간 낮았다. 하기 표 4A 및 4B를 참조한다. 본 결과를 통해 표준 단계식 풀과 비교하여 pH 단계식-구배 방법이 더 높은 질량 처리량을 보이는 결과를 초래할 뿐만 아니라, 유사하거나, 보다 우수한 순도를 가지게 하는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112012025602529-pct00005
실시예 9: 단백질 A 상에서의 단백질 A 전체 pH 구배 용리
단백질 A 전체 pH 구배 용리에 대해서도 또한 시험하였다. 모든 단계 및 완충제는 실시예 1의 pH 단계식-구배 방법에서 사용된 것과 동일하였고, 단, 예외적으로, pH 단계식-구배에서 사용된 35-60%B는 구배 출발시 25-60%로 감소시켰고, 이를 통해 더 높은 pH 출발 구배를 얻었다 (약 pH 4.6에서 출발하여 약 pH 3.7에서 종결). 25%B는 용리 완충제 (pH 4.58), 18.75 mM 아세테이트 및 6.25 mM 포르메이트로 구성된 완충제 조성, 및 1,141 uS/cm의 완충제 전도도에 상응하는 것이다. 60%B는 용리 완충제 (pH 3.69), 10 mM 아세테이트 및 15 mM 포르메이트로 구성된 완충제 조성, 및 763 uS/cm 완충제 전도도에 상응하는 것이다. 하기 표 5 참조한다.
Figure 112012025602529-pct00006
전체 구배의 용리 모양은 도 15에 제시되어 있다. 모든 생성물은 pH 하락 종결시에 의해 용리되었다. 전체 pH 구배에 대한 크로마토그램은 모든 단계에서 pH 단계식-구배와 동일하였는데, 단, 예외적으로 항체 용리는 더 높은 pH에서 시작되었다. 구배 출발시 초기의 값이 큰 UV 280 스파이크가 없기 때문에 구배 초반에 보다 저농도의 분획을 얻었고, 나머지 용리 단계 전체에 걸쳐 더 많은 단백질이 분포되었다. 이로써, 단량체보다 더 높은 pH에서 우선적으로 용리되는 종들이 더 많이 분리될 수 있었다. 따라서, 이러한 기법은 더 낮은 pH에서 원하는 생성물 (즉, 단계식-구배를 사용하여 분리된 응집체 및 CHOP)로부터 분리되는 불순물들을 제거하는 데 동등하게 효과적일 수 있으며, pH 단계식-구배와 비교하여 유일의 단점은 종결시의 풀 부피이다 (구배 출발시 보다 저농도의 분획이란 원하는 수율의 모의 풀을 달성하기 위해서는 함께 더 많은 분획을 풀링해야 한다는 것으로 해석될 수 있다). 이러한 전체 구배에 대한 SEC 트레이스 및 통합은 또한 더 낮은 pH에서 단량체로부터 응집체가 분리될 수 있다는 것을 입증하며, 이는 pH 단계식-구배의 이점과 적용가능성이 또한 전체 구배로까지 확대될 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 10: 단백질 A 연구에서 응집체 형성
응집체는 pH 단계식-구배 용리의 저 pH 동안 또는 후단부 동안에서는 형성되지 않으며, 단백질 A pH 단계식-구배 기법은 실제로는 응집체를 형성하기 보다는 응집체로부터 단량체를 분리시킨다는 것을 확인하기 위해, 정제된 물질을 사용한 결과, 공급물 중의 응집체 수준은 HCCF 성분을 포함하거나, 포함하지 않은 경우, 단백질 A 상에서의 프로세싱에 의해 증가하지 않은 것으로 나타났다. 하기 표 6을 참조한다.
Figure 112012025602529-pct00007

Claims (71)

  1. (a) C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및
    (b) 용리 완충제를 사용하여 5.0에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH 구배로 폴리펩티드를 용리시키고, 여기서 용리 완충제는 고 pH 완충제 및 저 pH 완충제를 함유하고, 여기서 pH 구배는 용리 완충제 중의 각각의 pH 완충제의 백분율을 조절함으로써 형성되는 것인 단계
    를 포함하고,
    여기서 고 pH 완충제가 pH 5.0의 것이고, 저 pH 완충제가 pH 2.7의 것이며, pH 구배가 pH 3.7에서 종결되고,
    응집체, 숙주 세포 불순물, 바이러스 필터 오염물, 바이러스 입자 및 바이러스-유사 입자가 목적하는 폴리펩티드로부터 제거되는 것인,
    C H 2/C H 3 영역을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 저 pH 완충제의 백분율이 35%에서 출발하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 35%로 저 pH 완충제를 함유하는 용리 완충제가 16.25 mM 아세테이트 및 8.75 mM 포르메이트를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 저 pH 완충제의 백분율이 25%에서 출발하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 25%로 저 pH 완충제를 함유하는 용리 완충제가 18.75 mM 아세테이트 및 6.25 mM 포르메이트를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 저 pH 완충제의 백분율이 40%에서 출발하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 40%로 저 pH 완충제를 함유하는 용리 완충제가 15 mM 아세테이트 및 10 mM 포르메이트를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 14 g/L에서 출발하는 로딩 밀도로 로딩되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단백질 A가 단백질 A 칼럼 크로마토그래피 수지 또는 단백질 A 크로마토그래피 흡착제인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 흡착제가 막 또는 모놀리스인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 단백질 A가 단백질 A 칼럼 크로마토그래피 수지이고, 폴리펩티드가 5 칼럼 부피/시간 내지 25 칼럼 부피/시간 범위의 용리 유량을 갖는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, pH 구배가 pH 4.2에서 출발하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, pH 구배가 pH 4.3에서 출발하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, pH 구배가 pH 4.6에서 출발하는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서, 숙주 세포 불순물이 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP)인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 염기성 폴리펩티드 변이체가 폴리펩티드로부터 분리되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, C H 2/C H 3 영역이 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 항체가 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체, 항-MUC16 항체, 항-CD4 항체, 또는 항-MET 항체인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 이뮤노어드헤신인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 적어도 98% 단량체의 순도를 갖는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 적어도 99% 단량체의 순도를 갖는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비가, 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 3.6에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH로 용리시키는 단계를 포함하는 단계식 용리 방법에 의해 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 20% 더 낮은 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 정제된 폴리펩티드에 대한 숙주 세포 불순물의 비가, 폴리펩티드를 단백질 A에 결합시키는 단계 및 3.6에서 또는 그 미만에서 출발하는 pH로 용리시키는 단계를 포함하는 단계식 용리 방법에 의해 정제된 폴리펩티드에서의 비보다 적어도 60% 더 낮은 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 정제된 폴리펩티드가 폴리펩티드 단량체인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 단백질 A가 변형된 또는 비-변형된 단백질 A 리간드인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 정제가 제조업 규모 공정인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 단백질 A가 단백질 A 칼럼 크로마토그래피 수지이고, 폴리펩티드의 정제된 분획이 12 또는 그 미만의 단백질 A 칼럼 부피를 함유하는 것인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 바이러스 여과 단계를 거치도록 하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 이온 교환 크로마토그래피 단계를 거치도록 하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피 단계가 단계 (b) 후에 연속하여 실행되는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 응집체를 제거하는 추가의 정제 단계를 포함하지 않는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 바이러스 필터 오염물을 제거하는 추가의 정제 단계를 포함하지 않는 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
KR1020127008252A 2009-09-01 2010-09-01 변형된 단백질 ａ 용리를 통한 증진된 단백질 정제 KR101764449B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23886709P 2009-09-01 2009-09-01
US61/238,867 2009-09-01
US25343809P 2009-10-20 2009-10-20
US61/253,438 2009-10-20
PCT/US2010/047448 WO2011028753A1 (en) 2009-09-01 2010-09-01 Enhanced protein purification through a modified protein a elution

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120106719A KR20120106719A (ko) 2012-09-26
KR101764449B1 true KR101764449B1 (ko) 2017-08-02

Family

ID=43649614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127008252A KR101764449B1 (ko) 2009-09-01 2010-09-01 변형된 단백질 ａ 용리를 통한 증진된 단백질 정제

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9428548B2 (ko)
EP (2) EP3736338A1 (ko)
JP (1) JP5787891B2 (ko)
KR (1) KR101764449B1 (ko)
CN (2) CN102686738A (ko)
BR (1) BR112012004697B8 (ko)
CA (1) CA2772653C (ko)
ES (1) ES2787234T3 (ko)
HR (1) HRP20200581T1 (ko)
MX (1) MX2012002565A (ko)
PL (1) PL2473617T3 (ko)
RU (1) RU2571929C2 (ko)
SI (1) SI2473617T1 (ko)
WO (1) WO2011028753A1 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090074040A (ko) 2006-09-13 2009-07-03 아보트 러보러터리즈 세포 배양의 개선
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
SG10201702951RA (en) 2008-10-20 2017-06-29 Abbvie Inc Viral inactivation during purification of antibodies
SG10201702922VA (en) 2008-10-20 2017-06-29 Abbvie Inc Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
KR20190018041A (ko) 2009-08-06 2019-02-20 제넨테크, 인크. 단백질 정제 시의 바이러스 제거의 개선방법
SG178483A1 (en) * 2009-09-10 2012-04-27 Lonza Biologics Plc Method and system for polypeptide purification
EP2794635B8 (en) * 2011-12-22 2018-11-14 H. Hoffnabb-La Roche Ag Ion exchange membrane chromatography
JP6420756B2 (ja) * 2012-03-28 2018-11-07 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
ES2895173T3 (es) 2012-06-29 2022-02-17 Emd Millipore Corp Métodos para inactivar virus durante un proceso de purificación de proteínas
US8921113B2 (en) 2012-12-21 2014-12-30 Dionex Corporation Buffer kit and method of generating a linear pH gradient
SG11201505901YA (en) * 2013-03-14 2015-08-28 Emd Millipore Corp Methods of increasing protein purity using protein a based chromatography
KR102251127B1 (ko) * 2013-07-12 2021-05-11 제넨테크, 인크. 이온 교환 크로마토그래피 입력 최적화의 설명
MX2016006167A (es) * 2013-11-15 2016-08-08 Genentech Inc Metodos para la inactivacion viral usando detergentes ecologico.
KR101921552B1 (ko) * 2014-03-10 2018-11-23 리히터 게데온 닐트. 사전 세정 단계를 이용하는 면역글로불린 정제
GB2539420B (en) * 2015-06-16 2021-01-13 Cytiva Sweden Ab Determination of chromatography conditions
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
US11022585B2 (en) 2019-06-09 2021-06-01 Dionex Corporation Methods and systems for optimizing buffer conditions with liquid chromatography

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008085988A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-17 Amgen Inc. Methods of purifying proteins

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4515893A (en) 1979-04-26 1985-05-07 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989012463A1 (en) 1988-06-21 1989-12-28 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
EP0479909B1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
EP0420397B1 (en) 1989-07-28 1995-11-29 Wako Pure Chemical Industries Ltd Fulgimide derivatives
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
CA2102511A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 Paul J. Higgins Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
ATE233813T1 (de) 1991-08-14 2003-03-15 Genentech Inc Veränderte immunglobuline für spezifische fc- epsilon rezeptoren
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
CA2140933A1 (en) 1992-08-21 1994-02-22 Paula M. Jardieu Method for treating an lfa-1 mediated disorder
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ES2108566T3 (es) 1993-12-10 1997-12-16 Genentech Inc Procedimientos para diagnosticar alergias y para seleccionar agentes terapeuticos antialergicos.
EP0739214B1 (en) 1994-01-18 1998-03-18 Genentech, Inc. A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS
CA2181787A1 (en) 1994-03-03 1995-09-08 Claire M. Doerschuk Anti-il-8 monoclonal antibodies for treatment of inflammatory disorders
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
ATE222774T1 (de) 1996-01-23 2002-09-15 Genentech Inc Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
AU731817C (en) 1996-11-27 2001-11-01 Genentech Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US20030109680A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-12 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
SI1325932T1 (ko) 1997-04-07 2005-08-31 Genentech Inc
EP1860187B1 (en) 1997-05-15 2011-07-13 Genentech, Inc. Apo-2 receptor
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
RU2145610C1 (ru) 1998-12-09 2000-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
EP2112167A3 (en) 1999-06-25 2010-12-22 Genentech, Inc. Humanized ANTI-ERBB2 antibodies and treatment with ANTI-ERBB2 antibodies
ES2309012T3 (es) 1999-10-29 2008-12-16 Genentech, Inc. Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca.
EP1578774B1 (en) * 2002-09-18 2013-11-06 Danisco US Inc. Purification of immunoglobulins
CN101120017A (zh) * 2004-08-30 2008-02-06 英国龙沙生物医药股份有限公司 用于纯化抗体的亲和力加离子交换层析
EP1693108A1 (en) * 2004-12-04 2006-08-23 MERCK PATENT GmbH Mixed-modal anion-exchange type separation material
CN101365722A (zh) * 2005-06-17 2009-02-11 艾兰制药国际有限公司 纯化抗Aβ抗体的方法
US20100267932A1 (en) 2006-08-28 2010-10-21 Alex Eon-Duval Process for the purification of fc-fusion proteins
EP2120915B1 (en) * 2007-01-22 2011-09-28 Genentech, Inc. Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies
RU2522002C2 (ru) * 2009-06-26 2014-07-10 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
US9813410B2 (en) 2014-06-26 2017-11-07 Rakuten, Inc. Information processing apparatus, information processing method, and information processing program

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008085988A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-17 Amgen Inc. Methods of purifying proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Immunological Methods, Vol 31, Pages 211-217(1979)*

Also Published As

Publication number Publication date
CN108409829A (zh) 2018-08-17
ES2787234T3 (es) 2020-10-15
RU2571929C2 (ru) 2015-12-27
EP2473617B1 (en) 2020-02-26
JP2013503877A (ja) 2013-02-04
EP3736338A1 (en) 2020-11-11
JP5787891B2 (ja) 2015-09-30
SI2473617T1 (sl) 2020-07-31
MX2012002565A (es) 2012-05-29
CA2772653A1 (en) 2011-03-10
RU2012112536A (ru) 2013-10-10
US20130041139A1 (en) 2013-02-14
US20220081466A1 (en) 2022-03-17
US9428548B2 (en) 2016-08-30
EP2473617A4 (en) 2014-04-09
PL2473617T3 (pl) 2020-06-29
BR112012004697B1 (pt) 2021-02-09
HRP20200581T1 (hr) 2020-07-10
KR20120106719A (ko) 2012-09-26
CN102686738A (zh) 2012-09-19
US20220324905A1 (en) 2022-10-13
CA2772653C (en) 2019-06-25
WO2011028753A1 (en) 2011-03-10
BR112012004697A2 (pt) 2015-09-08
BR112012004697B8 (pt) 2021-05-25
EP2473617A1 (en) 2012-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220081466A1 (en) Enhanced protein purification through a modified protein a elution
CA2531595C (en) Reducing protein a leaching during protein a affinity chromatography
KR101843915B1 (ko) 고유 단백질 대체 이온 교환 막 크로마토그래피를 이용한 오염물의 제거 방법
KR101036414B1 (ko) 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 정제 방법
DK1501369T3 (en) Non-affinity purification of proteins
KR20140015166A (ko) 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제
KR20210025692A (ko) 이온 교환 막 크로마토그래피
ES2578933T3 (es) Reducción de la lixiviación de la proteína A durante la cromatografía de afinidad con proteína A
AU2011253773A1 (en) Reducing protein a leaching during protein a affinity chromatography

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant