JP2013503877A - 改変されたプロテインa溶離による向上したタンパク質精製 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、その開示の全体を出典明示によりここに援用する2009年9月1日出願の米国仮特許出願第61/238867号、及び2009年10月20日出願の米国仮特許出願第61/253438号に対する優先権を主張するものである。
この発明の分野は、一般に、ポリペプチドをプロテインAに結合させ、pH勾配で溶離させることを含むCH2/CH3領域を含むポリペプチドを精製する方法に関する。
本発明は、ポリペプチドをプロテインAに結合させ、低pHで始まるpH勾配で溶離させることによって、CH2/CH3領域を含むポリペプチドを精製する方法を提供する。本発明者は、低pHでのpH勾配でプロテインAからCH2/CH3領域を含むポリペプチドを溶離させると、宿主細胞不純物, ウイルスフィルター汚染物質、ウイルス又はウイルス様粒子、塩基性ポリペプチド変異体、及び/又はポリペプチド凝集物を含む様々な不純物からのポリペプチドの良好な逐次分離をもたらし、また精製画分/プール中の高純度又は割合の所望されるポリペプチド単量体を達成することができるという特筆すべき発見をなした。よって、本発明は顕著な利点を有している。本発明者はまたこれらの方法が様々なプロテインAクロマトグラフィー樹脂及びクロマトグラフィー吸着剤を使用して達成することができえうことと、これらの方法を製造スケール及び商業的プロセスで使用することができ、カラムクロマトグラフィー以外の代替の下流の精製技術(例えばメンブラン吸着体)の利用を容易にしうることを発見した。
(a)ポリペプチドをプロテインAに結合させる工程と、(b)溶離バッファーを使用して5.0以下で始まるpH勾配でポリペプチドを溶離させる工程を含み、ここで溶離バッファーが低pHバッファー及び高pHバッファーを含み、pH勾配が溶離バッファー中の各pHバッファーの割合を調整することによって形成される方法が提供される。
ここでの対象のポリペプチドはCH2/CH3領域を含むものであり、よってプロテインAによる精製を受け入れられるものであることが理解される。ここで使用される場合、「CH2/CH3領域」なる用語は、プロテインAと相互作用する免疫グロブリン分子のFc領域中のアミノ酸残基を意味する。幾つかの実施態様では、CH2/CH3領域はインタクトなCH2領域にインタクトなCH3領域が続くものを含み、最も好ましくは、免疫グロブリンのFc領域を含む。CH2/CH3領域含有タンパク質の例は、CH2/CH3領域に融合した、又はこれとコンジュゲートした対象のタンパク質を含む抗体、イムノアドヘシン及び融合タンパク質を含む。
ここでの方法は、低pHで始まるpH勾配を使用してプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって一又は複数の不純物からCH2/CH3領域含有ポリペプチドを精製することを含む。一態様では、CH2/CH3領域を含むポリペプチドは、プロテインAにポリペプチドを結合させ、5.0以下で始まるpH勾配で溶離させることを含む方法によって精製することができる。
を提供する。
透析;タンパク質を捕捉するために抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィー;疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)(例えばHICでの分画);硫酸アンモニウム沈澱;ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール誘導体沈殿、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈澱;逆相HPLC;シリカでのクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE、ウイルス濾過、ゲル濾過、及び弱い分配クロマトグラフィーを含む。
ここに記載された方法を使用して精製されるポリペプチド又はタンパク質は、限定しないが、CH2/CH3領域に融合した又は該領域にコンジュゲートした抗体、イムノアドヘシン、又はポリペプチドを含む。このような分子を作製する技術を以下に検討する。
本発明の範囲内の抗体は、限定しないが、抗CD20抗体、例えば米国特許第5736137号のキメラ抗CD20「C2B8」(RITUXAN(登録商標));抗VEGF抗体、例えばヒト化及び/又は親和成熟抗VEGF抗体、例えばヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1アバスチン(登録商標)(Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992)、国際公開第96/30046号及び1998年10月15日公開の国際公開第98/45331号)及びV3LA;抗MUC16抗体;抗CD4抗体、例えばcM-7412抗体(Choy等 Arthritis Rheum. 39(1):52-56 (1996))及びイバリツマブ(TNX355)抗体;抗MET抗体、例えば一アーム5D5抗C-Met抗体;抗HER2抗体トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標)(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)、米国特許第5725856号)及びヒト化2C4 (国際公開第01/00245号, Adams等)、米国特許第5721108B1号におけるような2H7抗体のキメラ又はヒト化変異体、又はトシツモマブ(BEXXAR(登録商標));抗IL−8抗体(St John等 Chest, 103:932(1993)、及び国際公開第95/23865号);抗前立腺幹細胞抗原(PSCA)抗体(国際公開第01/40309号);抗CD40抗体、例えばS2C6及びそのヒト化変異体(国際公開第00/75348号);抗CD1抗体(米国特許第5622700号、国際公開第98/23761号;Steppe等 Transplant Intl. 4:3-7(1991)、及びHourmant等 Transplantation 58:377-380(1994));抗CD18(1997年4月22日発行の米国特許第5622700号、又は1997年7月31日公開の国際公開第97/26912号);抗IgE抗体(例えばE25、E26及びE27;1998年2月3日発行の米国特許第5714338号又は1992年2月25日発行の米国特許第5091313号、1993年3月4日公開の国際公開第93/04173号又は1998年6月30日出願の国際出願PCT/US98/13410号、米国特許第5714338号、Presta等 J. Immunol. 151:2623-2632(1993)及び国際公開第95/19181号);抗Apo-2レセプター抗体(1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号);抗TNF-α抗体、例えばcA2(レミケード(登録商標))、CDP571及びMAK-195(1997年9月30日発行の米国特許第5672347号、Lorenz等 J. Immunol. 156(4):1646-1653(1996)、及びDhainaut等 Crit. Care Med. 23(9):1461-1469(1995)を参照);抗組織因子(TF)(1994年11月9日許可の欧州特許第0420937B1号);抗ヒトα4β7インテグリン(1998年2月19日公開の国際公開第98/06248号);抗上皮増殖因子レセプター(EGFR)抗体(例えば1996年12月19日公開の国際公開第96/40210号におけるようなキメラ化又はヒト化225抗体);抗CD3抗体、例えばOKT3(1985年5月7日発行の米国特許第4515893号);抗CD25又は抗Tac抗体、例えばCHI−621(SIMULECT(登録商標)及びZENAPAX(登録商標)(1997年12月2日発行の米国特許第5693762号を参照);抗CD52抗体、例えばCAMPATH-1H(Riechmann等 Nature 332:323-337(1988));抗Fcレセプター抗体、例えばGraziano等 J. Immunol. 155(10):4996-5002(1995)におけるようなFcγRIに対するM22抗体;抗癌胎児抗原(CEA)抗体、例えばhMN-14(Sharkey等 Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s(1995);乳房上皮細胞に対する抗体、例えばhuBrE-3、hu-Mc3及びCHL6(Ceriani等 Cancer Res. 55(23):5852s-5856s(1995);及びRichman等 Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s(1995));結腸癌細胞に結合する抗体、例えばC242(Litton等 Eur J. Immunol. 26(1):1-9(1996));抗CD38抗体、例えばAT13/5(Ellis等 J. Immunol. 155(2):925-937(1995));抗CD33抗体、例えばHu M195(Jurcic等 Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s(1995)及びCMA−676又はCDP771;抗CD22抗体、例えばLL2又はLymphoCide(Juweid等 Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s(1995));抗EpCAM抗体、例えば17−1A(PANOREX(登録商標));抗GpIIb/IIIa抗体、例えばアブシキシマブ又はc7E3 Fab(REOPRO(登録商標));抗RSV抗体、例えばMEDI-493(SYNAGIS(登録商標));抗CMV抗体、例えばPROTOVIR(登録商標);抗HIV抗体、例えばPRO542;抗肝炎抗体、例えば 抗Hep B抗体OSTAVIR(登録商標);抗CA125抗体、例えばOvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗αvβ3抗体、例えばVITAXIN(登録商標);抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばch-G250;ING-1;抗ヒト17-1A抗体(3622W94);抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体R24;抗ヒト扁平上皮癌(SF-25);及び抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体、例えばSmart ID10及び抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)を含む。
ここでの抗体は対象の抗原に対して産生される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原;米国特許第5091178号参照)に対して産生された抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子(例えばレセプター)又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。例示的な抗原は、以下のセクション(3)に記述されるタンパク質を含む。本発明に包含される抗体に対する例示的な分子標的は、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22及びCD34のようなCDタンパク質;EGFR、HER2、HER3あるいはHER4レセプターのようなErbBレセプターファミリーのメンバー;細胞接着分子、例えばLFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及びαv/β3インテグリンで、そのα又はβ何れかのサブユニットを含むもの(例えば抗CD11a、抗CD18あるいは抗CD11b抗体);VEGFのような増殖因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、あるいはここで言及された他の抗原の任意のものを含む。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による結合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はRとR1が異なったアルキル基であるR1N=C=NRにより結合させることが有用でありうる。
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作製することができる。
ヒト化抗体には非ヒトである供給源由来の一又は複数のアミノ酸残基がそこに導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかのCDR残基と場合によっては幾らかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。単鎖Fv断片(scFv)をまた単離することができる。国際公開第93/16185号を参照のこと。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような分子は通常は二つの抗原を結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、BsAbs)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ECD))を免疫グロブリン重鎖のFc領域及びヒンジと組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端的に融合させるが、N末端融合もまた可能である。
(a)ACL−ACL;
(b)ACH−(ACH、ACL−ACH、ACL−VHCH、又はVLCL−ACH);
(c)ACL−ACH−(ACL−ACH、ACL−VHCH、VLCL−ACH又はVLCL−VHCH)
(d)ACL−VHCH−(ACH、又はACL−VHCH、又はVLCL−ACH);
(e)VLCL−ACH−(ACL−VHCH、又はVLCL−ACH);及び
(f)(A−Y)n−(VLCL−VHCH)2
ここで、各Aは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
精製されるポリペプチドは、CH2/CH3領域に融合し又は該領域にコンジュゲートしたものである。このような融合ポリペプチドは、タンパク質の血清半減期を増加させ、及び/又はプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を容易にするために生産されうる。このようにしてコンジュゲートされうる生物学的に重要なタンパク質の例は、レニン;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク;α-1-アンチトリプシン;インシュリンA-鎖;インシュリンB-鎖;プロインシュリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;VIIIC因子、IX因子、組織因子、及びvon Willebrands因子等の凝固因子;プロテインC等の抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺界面活性剤;ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤(t−PA)等のプラスミノーゲン活性化剤;ボンベシン;トロンビン;造血性成長因子;腫瘍壊死因子-α及び-β;エンケファリナーゼ;RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted);ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP-1-α);ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン;ミューラー阻害物質;リラキシンA-鎖;リラキシンB-鎖;プロレラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質;DNアーゼ;IgE;CTLA-4のような細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモン又は増殖因子のレセプター;プロテインA又はD;リウマチ因子;脳誘導神経向性因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5又は-6(NT-3、NT-4、NT-5、又はNT-6)、又はNGF-β等の神経増殖因子等の神経成長因子;血小板誘導成長因子(PDGF);aFGF及びbFGF等の線維芽細胞増殖因子;上皮増殖因子(EGF);TGF-α及びTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、又はTGF-β5を含むTGF-βのようなトランスフォーミング増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II);des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インシュリン様増殖因子結合タンパク質;CD3、CD4、CD8、CD19及びCD20等のCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えば、M−CSF、GM−SCF、及びG−CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL-1からIL-10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス性抗原、例えばAIDSエンベロープの一部等;輸送タンパク質;ホーミングレセプター;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及びVCAM;腫瘍関連抗原、例えばEGFR、HER2、HER3又はHER4レセプター;及び上に列挙したポリペプチドの何れかの断片を含む。
ここに記載される方法を使用して精製されるポリペプチドは、一般に組換え技術を使用して産生される。ポリペプチドはまたペプチド合成(又は他の合成手段)によって製造されうるか又は天然源から単離されうる。
本発明は薬学的製剤のような組成物をまた含む。場合によっては異種性分子とコンジュゲートされた本発明の方法によって精製されたポリペプチドを含有する薬学的製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、所望の純度を有するポリペプチドを任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 21版(2005))と混合することにより調製することができる。
CH2/CH3領域を含む6つの異なったタンパク質である抗VEGF抗体#1、抗CD20抗体、抗VEGF抗体#2、抗MUC16抗体、抗CD4抗体、及びアーム抗Met抗体を、プロテインAクロマトグラフィーカラムでのpH段階勾配溶離法を使用して精製した。該方法は表1に概略を示す。
表1に列挙したタンパク質負荷及びバッファー組成/pHパラメーターを使用してUnicorn法ファイルを作成した。このファイルはGE Healthcare AKTA(GE Healthcare)エクスプローラーFPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)システムによって実行した。FPLCはプラスチック配管及びポンプからなるベンチスケールの機器で、製造精製プロセスをシミュレートした。FPLCは、流量が維持され、移送されるポンプの各々の流れの割合が変化させられる2台のポンプ(ポンプA及びポンプB)システムを使用してプログラムされた変化割合で2つのバッファーを混合することにより「pH勾配」相を作り出した。Unicornプログラムで指定されたものは、設定体積(カラム体積数)に対する他のものに対する「%B」であった。
分析的分子ふるい(サイズ排除)クロマトグラフィー(SEC)アッセイをAgilent1200シリーズHPLC(Agilent Technologies, USA, part G1329A)で実施し、集めた試料に対する高分子量種(HMWS)、二量体、単量体、及び断片の相対レベルを決定した。14.24mLのTSK G3000SWXL,7.8mmD×300mmH(Tosoh Bioscience, Tokyo, Japan, part 08541)カラムを使用した。各試料をリン酸カリウム/塩化カリウムHPLC流通バッファーを使用しておよそ0.5g/L抗体に希釈するか、又は試料注入を変更してアッセイカラムに充填される質量を標準化した。全ての試料はAgilent HPLC1.5mLのグラスバイアルで調製した。実験は0.5mL/分の流量で30分であった。試料注入は、およそ25ngの抗体が試料当たりに充填されるように調整した。試料の各バックグラウンドバッファーを含んでいるブランクを、各試料セットで実験した。UV280nm吸光度曲線を、ChemStation(Agilent Technologies)を使用してマニュアルで、又はCHROMELEON(登録商標)(DIONEX, Sunnyvale, CA)ソフトウェアを使用して自動的に解析して、別個にピークを積分し、試料に対する種のパーセント値を得た。このアッセイから得られたパーセント値に画分の濃度(mg/mL)を乗じて、試料中の各サイズ変異体種の実際の濃度を得ることができる(例えばSECの結果:4%HMWS、3%二量体、92%単量体、1%断片;試料濃度:2g/L;試料体積:10mL;1.84g/L単量体、試料中全体で18.4mg単量体)。
選択された実験からの試料をアッセイ群に供し、標準的で確証された酵素結合吸着免疫検定(ELISA)を実施してCHOPのレベルを定量した。アフィニティ精製したヤギ抗CHOP抗体をマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。CHOP、標準、及びコントロールを含む試料の希釈物をウェルにおいてインキュベートし、ついで西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギ抗CHOP抗体と共にインキュベートした。西洋わさびペルオキシダーゼ酵素活性をo−フェニレンジアミン二塩酸塩で検出した。CHOPはマイクロタイタープレートリーダーで492nmでの吸光度を読み取ることによって定量した。コンピュータカーブフィッティングプログラムを使用して標準曲線を生成し、試料濃度を自動的に計算した。ELISAのアッセイ範囲は典型的には5ng/mlから320ng/mlであった。結果をプールの比較のためにppmに標準化した。
段階勾配の溶離形状を図1に示す。全ての生成物はpH減少の終わりまでに溶離された。
大部分のタンパク質はより迅速にカラムから溶離されたが、十分なタンパク質がカラムに残り、勾配中に溶離された。低pHでは、所望の生成物(およそpH4.6から3.7の溶離範囲で、僅かな分子間変動)と望まれない凝集物(およそpH3.9から3.5の溶離範囲)との間の分離が生じた。
実施例1に記載されたpH段階勾配溶離タンパク質の方法を使用して、mg/mLでの画分当たりの抗CD20抗体レベル(図1Aの抗VEGF抗体#1クロマトグラムで見られる段階勾配溶離相のオンラインAKTA/Unicorn UV280読みで追跡されたベンチトップオフラインのUV280吸光度から)及びppmでの画分当たりのCHOPレベルを測定した。図5の左パネルに見られるように(抗CD20抗体及びCHOP溶離)、pH段階勾配溶離の低pHでの後の画分はCHOPの量と比較して非常に少ない抗CD20抗体しか含んでいなかった。抗CD20抗体段階勾配pH溶離と同時になされたコントロール実験からのデータは図5の表の上の列に示している。コントロール実験は、タンパク質溶離相においてはpH段階勾配が使用されず、タンパク質がpH3.6以下で溶離されたことを除いて、表1に記載されたものと同じ条件を使用してなされた。下の列はpH段階勾配を使用した抗CD20抗体収率における小さいが、許容できない減少を示している。(注意:凝集物除去のためにこの収率ロスは予想される;収率はカラムに添加された生成物の全量中に凝集物を含むHCCFタイター値を使用して計算する)。約5%少ない凝集物及び半分のCHOPレベルがコントロールプールとの比較で観察された。該結果は、pH段階勾配溶離を使用すると純度が増加するという予期せぬ効果を証明している。
実施例1に記載されたpH段階勾配溶離プロテインAクロマトグラフィーの方法を使用して、抗VEGF抗体#1のウイルス粒子クリアランスを測定した。
全ての相及びバッファーは実施例1において使用したものと同じであった。定量的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを使用してレトロウイルス様粒子数について画分を試験した。
RVLP内因性ウイルス粒子アッセイはリアルタイム定量的PCRアッセイである。ウイルスRNAを、Qiagen EZ1(Qiagen, Valencia, CA)を使用して試料から抽出した。試料サイズは0.4mL(未希釈、及び1:10希釈のHCCF、未希釈プロテインAプール)であった。抽出効率は既知のCHOレトロウイルス力価を持つ参照の標準HCCF試料を含めることによって確認した。ゲノムDNAは、上昇した温度で30分間、抽出溶離物を0.2単位/mLのデオキシリボヌクレアーゼIで処理することによってデオキシリボヌクレアーゼ消化によって除去した。ついで、デオキシリボヌクレアーゼを70℃で15分間、熱失活させた。レトロウイルスDNAが無いことを、逆転写酵素なしに試料をアッセイすることによって確認した。
実施例1に記載されたpH段階勾配溶離プロテインAクロマトグラフィーの方法を使用して、抗VEGF抗体#1の塩基性ポリペプチド変異体(又は塩基性変異体)クリアランスを測定した。を測定した。
全ての相及びバッファーは実施例1において使用したものと同じであった。画分をイオン交換変異体アッセイに供した。
分析的イオン交換クロマトグラフィー(IEC)アッセイをAgilent1200シリーズHPLC(Agilent Technologies, USA, part G1329A)で実施し、使用して、集めた抗VEGF抗体#1試料に対して酸性及び塩基性荷電変異体に対する主ピークの相対レベルを決定した。Dionex ProPac WCX−10,4.6×250mm(Dionex製品番号054993)カラムを、高い温度条件下でACES[N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸]及びNaClの勾配で使用した。試料調製物は、カルボキシペプチダーゼ(CpB)での20分加熱した消化の前にIEC移動相中にバッファー交換試料を含めた。およそ50ugの抗VEGF抗体#1を試料当たりカラム中に注入した。UV280nmトレースを得て、ChemStation(Agilent Technologies)ソフトウェアを使用して積分した。酸性、塩基性、及び主ピーク種の各カテゴリーに対する積分パーセントを、勾配にわたるイオン交換変異体組成物の傾向について分析した。図17は、20のプロテインAのpH段階溶離画分にわたるイオン交換変異体アッセイピークの積分の結果を示している。画分中に存在する塩基性変異体の割合は、プロテインApH段階勾配溶離のテール部分において劇的に増加する。勾配溶離のこのテール部分は、実施例1及び2に記載されたように、増加したCHOP及び凝集物分離が観察されたのと同じ部分である。
上述のpH段階勾配溶離法に対して、MABSELECT SURE(商標)及びMABSELECT(商標)樹脂を試験した。これらの二つのプロテインA樹脂は、名前が類似しているが、異なったアフィニティリガンドが結合している。MABSELECT(商標)は天然プロテインAリガンドを有しており、これは抗体のFc部分に結合している。MABSELECT SURE(商標)は、短い時間の間、高pHの溶液で安定であるように化学的に改変されたプロテインAの修飾形態を有している。オーバーレイされたAKTA溶離プロファイルは、溶離トレースが二つのプロテインA樹脂に対して極めて類似していることを示している。図8のMabSelectに対するSEC積分プロファイルから分かるように、匹敵する凝集物分離がこの樹脂を使用して達成された。凝集物分離に成功裏に試験された他の樹脂は、PROSEP(登録商標)Va、PROSEP(登録商標)ウルトラ・プラス、及びPOROS(登録商標)MABCAPTURE(商標)Aであった。従って、様々なアフィニティ樹脂(例えばMABSELECT(商標)、MABSELECT SUERE(商標)、PROSEP(登録商標)Va、PROSEP(登録商標)ウルトラ・プラス、及びPOROS(登録商標)MABCAPTURE(商標))を、不純物を分画するためにpH段階勾配溶離法において使用することができる。
殆どのクロマトグラフィープロセスで重要である様々なパラメータを、表2に示された範囲内で35回実施の統計的に設計された研究を使用して抗VEGF抗体#1について探求した。「溶離開始%B」パラメーターは、(溶離曲線の形状の決定において大きな役割を果たす。開始%Bが高くなるほど、開始溶離pHが低くなり、より多くのタンパク質が最初の画分でカラムから溶離される)溶離相の開始pH、並びに全体の勾配の傾斜に影響を及ぼす。主要な効果並びに相互作用を解明するために設計された画分要因研究で同時に変化させた。全ての実験は溶離中に分画され、凝集物及び濃度が全ての画分についてアッセイされた。内挿計算を使用して、正確に85%収率(段階収率標的の下限)を生じるプールについてモックプール単量体レベルを決定し、これらの値を使用して、単量体を凝集物から効率的に分離する点における実験パラメーターの各セットの有効性を比較した。
(複数カラムの充填を必要とする)カラム床高以外の全てのパラメーター変化をUnicornソフトウェアを使用して調べた。CV画分を全ての溶離に対して取り、(上述の)HPLC SECを使用してアッセイし、タンパク質濃度について測定した(NanoDrop UV分光光度計で測定したUV280吸光度)。比較の結果を最もよく標準化するために、様々な画分セットからのデータを編集し、計算を使用して、全体収率及び各実験からのプールのSECプロファイルを内挿した。
DOE結果のパレートプロットは、「開始%B」が凝集物分離の決定において最も影響するパラメーターであり、次に負荷密度(低い方が良い)と滞留時間(滞留時間は床高の制御パラメーター(cm/CV)を流速(cm/hr)で割ってhr/CVで計算した)が続くことを示している。従って、開始%Bが低くなると、溶離開始pHが高くなり、凝集物分離がより効率的になる;負荷密度が低いと凝集物分離がより効率的になる;及び滞留時間が長いと、凝集物分離がより効率的になる。図9を参照。更に、この研究からの相互作用プロファイルは、低密度のパラメーターと開始%Bの間に相関があり、また滞留時間と負荷密度の間に相互作用があったことを示している。増加した負荷密度では、開始%Bは、実験がより低い負荷密度でなされた場合よりも85%収率モックプールの単量体レベルについてより大きな効果を有していた。更に、増加した負荷密度では、滞留時間が、より効率的に凝集物を分画する勾配の能力において更に大きな役割を果たしていた。pH段階勾配法での高生成物スループットを達成するために溶離においては低い速度が使用されなければならない。図10を参照のこと。図11は、この実験からのプールは10CVs以下(例えば5.4CV又は6CV)であったが、85%よりも大きい収率で1%未満の凝集物を移送したことを示している。
下流のカラムクロマトグラフィーが精製プロセスから除去され、又はメンブランで置換されうるかどうかを決定するために、抗VEGF抗体#1(1%未満の凝集物及び高収率のプール)についてプロテインA pH段階勾配のベンチスケールサイクリングを下流の荷電メンブランに充填した。MUSTANG(登録商標)S(Pall corporation)及びMUSTANG(登録商標)Q(Pall corporation)メンブランはそれぞれカチオン交換メンブラン及びアニオン交換メンブランをそれぞれ表す。典型的な下流カラムプロセスと比較して同じ全体純度と収率を達成するメンブランの能力によって成功を測定した。
S及び/又はQメンブランに対するCHOP及び凝集物クリアランスのための最適な負荷条件の決定に使用されるパラメーターを、表3A及び3B中のプロテインA標準工程プールを使用してS及び/又はQメンブランに対するCHOPクリアランスに対する最適負荷条件についての先の研究から取り上げた。これらの先の研究では、プロテインA標準工程プールが使用された場合(pH勾配なしで3.6以下のpHでタンパク質を溶離するコントロール群)有望な結果が示された;しかしながら、このプロセスは、所望されるよりは僅かに高いCHOPレベルを有しており、プロセスからの凝集物を排除しなかった。これらの先の研究では、メンブランは5kg/Lメンブランまで充填され、最適な負荷条件が不純物除去に対して見出された。これらの同じ条件をプロテインA段階勾配溶離プールに使用して、CHOP及び凝集物のような標的とされている主な不純物でのこれらのメンブランに対する異なったプロテインAプールの性能を比較した。
プロテインA工程プールをカチオンからアニオン交換膜精製シリーズに対して負荷として使用した場合、得られた最も低いCHOPレベルは5kg/Lメンブランまで負荷されたメンブランに対して15−20ppmであった。メンブランは凝集物を排除しなかったので、この不純物のレベルは最終プールでは許容できないほど高かった。これに対して、プロテインSpH段階勾配溶離プールがこれらの同じメンブランに充填された場合、CHOPレベルは0−15ppmであり、凝集物レベルは最終プールでは尚も低く、全体のプロセスに対する利益を示している。
A. VIRESOLVE(登録商標)Pro透過率減衰比較
プロテインApH段階勾配を、パルボウイルスフィルター(VIRESOLVE(登録商標) Pro, Millipore, Inc.)での大きな質量スループットの容易化に関して、プロテインA標準工程(コントロール群、pH勾配なしでpH3.6以下でタンパク質を溶離する)と比較した。一般的なHCCFフィードを使用して、VIRESOLVE(登録商標)Proパルボウイルスフィルターに流す前に標準的なフロースルーモードでQSFF(Qセファロース・ファースト・フロー(アニオン交換カラム;GE Healthcare)にプロテインApH勾配及びプロテインA標準工程コントロールの双方を流した。幾つかのVIRESOLVE(登録商標)Pro実験条件を試験した:1)インラインのSHC滅菌前置フィルターを伴うプロテインA標準工程溶離プール、2)インラインの前置フィルターとしてカチオン交換(CEX)膜吸着体を伴うプロテインA標準工程溶離、3)SHC前置フィルター(未荷電の0.2ミクロンの滅菌グレードフィルター)を伴うプロテインApH段階勾配プール、及び4)インライン前置フィルターとしてCEX膜吸着体を伴うプロテインApH段階勾配プール。幾つかのプールは繰り返して実験した。VIRESOLVE(登録商標)Proは、スプレッドシートにデータを記録するための圧力センサー、蠕動ポンプ、バランスのセットを利用する濾過構成で実施した。
VIRESOLVE(登録商標)Pro実験シークエンス中に異なった点で試料を採取し、CHOP及びSECについてアッセイした。インラインでSHCを伴うプロテインA標準工程シーケンスはかなり低いCHOPレベルであったが、凝集物を尚も含んでいた。凝集物レベルは、異なったプロセス工程を通じたプロテインApH段階勾配実験において低いままであり、凝集物1%未満のエンドプールが生じた。この結果は、標準的な工程のプールによって送達されるプールに対して顕著な改善であった。更に、pH段階勾配SHC−VIRESOLVE(登録商標)Proプールに対するCHOPレベルは、カチオン交換メンブランを用いた標準的な工程の実験におけるレベルに匹敵していた。レベルはSHCでの標準的な工程からのものよりも僅かに低かった。表4A及び4Bを参照のこと。これらの結果は、pH段階勾配法が標準的な工程のプールと比較して高い質量スループットを生じたばかりでなく、また匹敵するかより良好な純度を作り出したことを示している。
プロテインA完全勾配溶離をまた試験した。全ての相及びバッファーは、pH段階勾配で使用された35−60%Bが勾配の開始時に25−60%まで減少させられ、これがより高いpH開始勾配(約pH4.6で開始し、約pH3.7で終了する)を生じたことを除いて、実施例1に記載されたpH段階勾配法で使用されたものと同じであった。25%Bは、pH4.58、18.75mMのアセテート及び6.25mMのホルマートのバッファー組成、及び1141uS/cmのバッファー導電率の溶離バッファーに対応する。60%Bは、pH3.69、10mMアセテート及び15mMのホルマートのバッファー組成、及び763uS/cmのバッファー導電率の溶離バッファーに対応する。表5を参照のこと。
Claims (71)
- CH2/CH3領域を含むポリペプチドを精製する方法において、ポリペプチドをプロテインAに結合させ、5.0以下で始まるpH勾配で溶離させることを含む方法。
- pH勾配が約pH4.2で始まる請求項1に記載の方法。
- pH勾配が約pH4.3で始まる請求項1に記載の方法。
- pH勾配が約pH4.6で始まる請求項1に記載の方法。
- pH勾配が3.0以上で終了する請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- pH勾配が約3.7で終了する請求項5に記載の方法。
- 宿主細胞不純物がポリペプチドから分離される請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞不純物がチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)である請求項7に記載の方法。
- 凝集物がポリペプチドから分離される請求項1に記載の方法。
- ウイルスフィルター汚染物質がポリペプチドから分離される請求項1に記載の方法。
- ウイルス粒子又はウイルス様粒子がポリペプチドから分離される請求項1に記載の方法。
- 塩基性ポリペプチド変異体がポリペプチドから分離される請求項1に記載の方法。
- CH2/CH3領域が免疫グロブリンのFc領域を含む請求項1に記載の方法。
- ポリペプチドが抗体である請求項1に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である請求項14に記載の方法。
- ポリペプチドがイムノアドヘシンである請求項1に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドが少なくとも約98%の単量体の純度を有している請求項1に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドが少なくとも約99%の単量体の純度を有している請求項1に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドに対する宿主細胞不純物の比が段階溶離法によって精製されたポリペプチドにおける比よりも少なくとも約20%低く、段階溶離法がポリペプチドをプロテインAに結合させ、3.6以下で始まるpHで溶離させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドに対する宿主細胞不純物の比が段階溶離法によって精製されたポリペプチドにおける比よりも少なくとも約60%低く、段階溶離法がポリペプチドをプロテインAに結合させ、3.6以下で始まるpHで溶離させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドがポリペプチド単量体である請求項19又は20に記載の方法。
- プロテインAが修飾又は非修飾プロテインAリガンドである請求項1に記載の方法。
- 精製が製造スケールプロセスである請求項1に記載の方法。
- プロテインAがプロテインAカラムクロマトグラフィー樹脂又はプロテインAクロマトグラフィー吸着剤である請求項1に記載の方法。
- プロテインAクロマトグラフィー吸着剤がメンブラン又はモノリスである請求項24に記載の方法。
- プロテインAがプロテインAカラムクロマトグラフィー樹脂であり、ポリペプチドの精製された画分が約12以下のプロテインAカラム体積を含む請求項24に記載の方法。
- ポリペプチドにウイルス濾過工程を施すことを更に含む請求項1に記載の方法。
- ポリペプチドにイオン交換クロマトグラフィー工程を施すことを更に含む請求項1に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー工程が請求項1のpH勾配精製工程後に連続的に実施される請求項28に記載の方法。
- 凝集物を除去するための更なる精製工程を含まない請求項1に記載の方法。
- ウイルスフィルター汚染物質を除去するための更なる精製工程を含まない請求項1に記載の方法。
- CH2/CH3領域を含むポリペプチドを精製する方法において、
(a)ポリペプチドをプロテインAに結合させる工程と、
(b)溶離バッファーを使用して5.0以下で始まるpH勾配でポリペプチドを溶離させる工程を含み、ここで溶離バッファーが低pHバッファー及び高pHバッファーを含み、pH勾配が溶離バッファー中の各pHバッファーの割合を調整することによって形成される方法。 - 高pHバッファーが約pH5.0であり、低pHバッファーが約pH2.7である請求項32に記載の方法。
- 低pHバッファーの割合が約35%で始まる請求項32に記載の方法。
- 約35%で低pHバッファーを含む溶離バッファーが約16.25mMのアセテートと約8.75mMのホルマートを含有する請求項34に記載の方法。
- 低pHバッファーの割合が約25%で始まる請求項32に記載の方法。
- 約25%で低pHバッファーを含む溶離バッファーが約18.75mMのアセテートと6.25mMのホルマートを含有する請求項36に記載の方法。
- 低pHバッファーの割合が約40%で始まる請求項32に記載の方法。
- 約40%で低pHバッファーを含む溶離バッファーが約15mMのアセテートと10mMのホルマートを含有する請求項38に記載の方法。
- ポリペプチドが約14g/Lで始まる充填密度で充填される請求項32に記載の方法。
- プロテインAがプロテインAカラムクロマトグラフィー樹脂又はプロテインAクロマトグラフィー吸着剤である請求項32に記載の方法。
- プロテインAクロマトグラフィー吸着剤がメンブラン又はモノリスである請求項41に記載の方法。
- プロテインAがプロテインAカラムクロマトグラフィー樹脂であり、ポリペプチドが約5カラム体積/hrから約25カラム体積/hrの範囲の溶離流量を有している請求項41に記載の方法。
- pH勾配が約pH4.2で始まる請求項32に記載の方法。
- pH勾配が約pH4.3で始まる請求項32に記載の方法。
- pH勾配が約pH4.6で始まる請求項32に記載の方法。
- pH勾配が3.0以上で終了する請求項32及び44から46の何れか一項に記載の方法。
- pH勾配が約3.7で終了する請求項47に記載の方法。
- 宿主細胞不純物がポリペプチドから分離される請求項32に記載の方法。
- 宿主細胞不純物がチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)である請求項49に記載の方法。
- 凝集物がポリペプチドから分離される請求項32に記載の方法。
- ウイルスフィルター汚染物質がポリペプチドから分離される請求項32に記載の方法。
- ウイルス粒子又はウイルス様粒子がポリペプチドから分離される請求項32に記載の方法。
- 塩基性ポリペプチド変異体がポリペプチドから分離される請求項32に記載の方法。
- CH2/CH3領域が免疫グロブリンのFc領域を含む請求項32に記載の方法。
- ポリペプチドが抗体である請求項32に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片である請求項56に記載の方法。
- ポリペプチドがイムノアドヘシンである請求項32に記載の方法。
- ポリペプチドが少なくとも約98%の単量体の純度を有している請求項32に記載の方法。
- ポリペプチドが少なくとも約99%の単量体の純度を有している請求項32に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドに対する宿主細胞不純物の比が段階溶離法によって精製されたポリペプチドにおける比よりも少なくとも約20%低く、段階溶離法がポリペプチドをプロテインAに結合させ、3.6以下で始まるpHで溶離させることを含む、請求項32に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドに対する宿主細胞不純物の比が段階溶離法によって精製されたポリペプチドにおける比よりも少なくとも約60%低く、段階溶離法がポリペプチドをプロテインAに結合させ、3.6以下で始まるpHで溶離させることを含む、請求項32に記載の方法。
- 精製されたポリペプチドがポリペプチド単量体である請求項61又は62に記載の方法。
- プロテインAが修飾又は非修飾プロテインAリガンドである請求項32に記載の方法。
- 精製が製造スケールプロセスである請求項32に記載の方法。
- プロテインAがプロテインAカラムクロマトグラフィー樹脂であり、ポリペプチドの精製された画分が約12以下のプロテインAカラム体積を含む請求項41に記載の方法。
- ポリペプチドにウイルス濾過工程を施すことを更に含む請求項32に記載の方法。
- ポリペプチドにイオン交換クロマトグラフィー工程を施すことを更に含む請求項32に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー工程が工程(b)後に連続的に実施される請求項68に記載の方法。
- 凝集物を除去するための更なる精製工程を含まない請求項32に記載の方法。
- ウイルスフィルター汚染物質を除去するための更なる精製工程を含まない請求項32に記載の方法。
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