BR112012004697B1 - método para purificar um polipeptídeo compreendendo uma região ch2/ch3 - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PURIFICAR UM POLIPEPTÍDEO COMPREENDENDO UMA REGIÃO CH2/CH3. A presente invenção refere-se a métodos para a purificação de um polipeptídeo que compreende uma região CH2/CH3, compreendendo a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um gradiente de pH que começa em um pH baixo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido de Patente Provisória No. 61/238.867, depositado em 01 de setembro de 2009, e para o Pedido de Patente Provisória No. 61/253.438 depositado em 20 de outubro de 2009, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se de uma forma geral aos métodos para a purificação de um polipeptídeo que compreende uma região CH2/CH3, compreendendo a ligação do polipeptídeo à proteína A e eluição com um gradiente de pH.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A purificação econômica em grande escala de proteínas é cada vez mais um problema importante para a indústria de biotecnologia. Geralmente, as proteínas são produzidas pela cultura de células, utilizando as linhagens celulares de mamífero ou bacterianas modificadas para produzir a proteína de interesse mediante a inserção de um plasmídeo recombinante contendo o gene para esta proteína. Visto que as linhagens celulares utilizadas são organismos vivos, elas devem ser alimentadas com um meio de crescimento complexo, contendo açúcares, aminoácidos, e fatores de crescimento, geralmente fornecidos a partir de preparações de soro animal. A separação da proteína desejada a partir da mistura de compostos alimentados nas células e dos subprodutos das próprias células em uma pureza suficiente para uso como um produto terapêutico humano representa um desafio formidável.

[0004] Os procedimentos para a purificação de proteínas de detritos de células inicialmente dependem do sítio de expressão da proteína. Algumas proteínas podem ser motivadas a serem secretadas diretamente da célula para dentro do meio de crescimento circundante; outras são produzidas intracelularmente. Para estas proteínas, a primeira etapa de um processo de purificação envolve a lise da célula, que pode ser feita por uma variedade de métodos, incluindo cisalhamento mecânico, choque osmótico, ou tratamentos enzimáticos. Tal quebra libera todo o conteúdo da célula no homogenato e, além disso, produz fragmentos subcelulares que são difíceis de remover devido ao seu pequeno tamanho. Estes são geralmente removidos pela centrifugação diferencial ou pela filtração. O mesmo problema surge, embora em menor escala, com as proteínas diretamente secretadas devido à morte natural das células e liberação de proteínas intracelulares das células hospedeiras no decurso do ciclo de produção de proteína.

[0005] Uma vez que uma solução clarificada contendo a proteína de interesse foi obtida, a sua separação das outras proteínas produzidas pela célula é geralmente tentada usando uma combinação de diferentes técnicas de cromatografia. A cromatografia de afinidade, que explora uma interação específica entre a proteína a ser purificada e um agente de captura imobilizada, é normalmente usada para algumas proteínas (por exemplo, as proteínas para uso como um produto terapêutico humano). A Proteína A é um adsorvente útil para a cromatografia de afinidade das proteínas, tais como anticorpos, os quais contêm uma região Fc. A Proteína A é uma proteína de parede celular 41 kD de Staphylococcus aureas que se liga com uma alta afinidade (cerca de 10-8 M para IgG humana) à região Fc de anticorpos No entanto, uma vez que as proteínas tendem a se agregar ou tornar- se inflexível, a proteína desejada (isto é, monômero) é freqüentemente co-purificada com outras impurezas provenientes destas colunas de afinidade, tais como agregados de proteína, subprodutos das próprias células (isto é, as impurezas de células hospedeiras), ou incrustações do filtro de vírus.

[0006] Outras técnicas têm sido desenvolvidas para separar ainda mais estas impurezas e misturas de proteínas com base na sua carga, grau de hidrofobicidade, ou tamanho, tal como a cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, ou cromatografia de exclusão de tamanho. Vários resinas de cromatografia diferentes ou sorventes são disponíveis para cada uma destas técnicas, permitindo a adaptação precisa do esquema de purificação com a proteína particular envolvida. A essência de cada um destes métodos de separação é que as proteínas podem ser motivadas para mover em diferentes taxas ao longo de uma fase sólida comprida (por exemplo, coluna), que alcança uma separação física que aumenta quando elas passam mais abaixo da fase sólida, ou se aderem seletivamente ao meio de separação, sendo então diferencialmente eluídas por diferentes solventes. No entanto, cada um destes métodos requer tampões, resinas ou sorventes adicionais, e outros recursos para outra purificação, e estes por sua vez resultam em maior tempo de processamento e custo mais elevado. Assim, métodos mais eficientes e econômicos para a purificação de monômeros de proteína são necessários.

[0007] Os métodos de purificação de polipeptídeos a partir de agregados, multímeros, e proteínas modificadas utilizando uma coluna de proteína A e eluição com um sistema de eluição de gradiente de pH foram descritos no Pedido de Patente U.S. No. 12/008.160.

[0008] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados são por meio desta aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos na medida em que como se cada publicação individual, patente e pedido de patente fossem específica e individualmente indicados para serem assim incorporados por referência.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção fornece métodos para a purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3 mediante a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um gradiente de pH que começa com um pH baixo. Estes métodos de purificação fornecem as vantagens de se alcançar uma melhor separação seqüencial de polipeptídeos ou não agregados de várias impurezas, incluindo as impurezas da célula hospedeira, incrustações de filtro de vírus, vírus ou partículas semelhantes a vírus, variantes de polipeptídeo básicas, e agregados de polipeptídeo, e também uma maior pureza dos monômeros de polipeptídeo desejáveis na fração purificada/conjunto. Estes métodos podem ser alcançados usando várias resinas de cromatografia de proteínas A e sorventes de cromatografia. Estes métodos também podem ser usados em escala de fabricação e processo comercial, e pode facilitar a utilização de tecnologias de purificação à jusante alternativas diferentes da cromatografia de coluna.

[00010] Em um aspecto, a invenção fornece um método para a purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3, compreendendo a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um gradiente de pH que começa em 5,0 ou abaixo.

[00011] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3, compreendendo as etapas de: (a) ligação do polipeptídeo à Proteína A; e (b) eluição do polipeptídeo com um gradiente de pH que começa em 5,0 ou abaixo usando um tampão de eluição, em que o tampão de eluição contém um tampão de pH elevado e um tampão de pH baixo e em que o gradiente de pH é formado através do ajuste de uma porcentagem de cada tampão de pH no tampão de eluição.

[00012] Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor do pH 4,2. Em outras formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor do pH 4,3. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor de 4,6. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina em ou acima de 3,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina ao redor de 3,7.

[00013] Em algumas formas de realização, o tampão de pH elevado está ao redor do pH 5,0 e em que o tampão de pH baixo está ao redor do pH 2,7.

[00014] Em algumas formas de realização, a percentagem de tampão de pH baixo começa em cerca de 35 %. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 35 % compreende cerca de 16,25 mM de acetato e cerca de 8,75 mM de formiato. Em outras formas de realização, a porcentagem de tampão de pH baixo começa em cerca de 25 %. Em algumas formas de realização, tanto o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo quanto ao redor de 25 % compreende cerca de 18,75 mM de acetato e cerca de 6,25 mM de formiato. Em algumas formas de realização, a porcentagem de tampão de pH baixo começa em cerca de 40 %. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 40 % compreende cerca de 15 mM de acetato e cerca de 10 mM de formiato.

[00015] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é carregado com uma densidade de carga que começa ao redor de cerca de 14 g/L. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é carregado com uma densidade de carga que varia de cerca de 14 g/L a cerca de 45 g/L.

[00016] Em algumas formas de realização, a Proteína A é um resina de cromatografia de coluna de Proteína A ou um sorvente de cromatografia de Proteína A. Em algumas formas de realização, o sorvente de cromatografia de Proteína A é uma membrana ou um monólito.

[00017] Em algumas formas de realização, a proteína A é uma resina de cromatografia de coluna de Proteína A e em que o polipeptídeo possui uma taxa de fluxo de eluição variando de cerca de 5 volumes de coluna/hora a cerca de 25 volumes de coluna/hora.

[00018] Em algumas formas de realização, a proteína A é um resina de cromatografia de coluna de Proteína A e em que uma fração purificada do polipeptídeo contém cerca de ou menos do que cerca de 12 volumes de coluna de Proteína A.

[00019] Em algumas formas de realização, uma impureza célula hospedeira é separada do polipeptídeo. Em algumas formas de realização, a impureza da célula hospedeira é a Proteína Ovário de Hamster Chinês (CHOP).

[00020] Em algumas formas de realização, um agregado é separado do polipeptídeo. Em outras formas de realização, uma incrustação de filtro de vírus é separada do polipeptídeo.

[00021] Em algumas formas de realização, uma partícula de vírus ou uma partícula semelhante a vírus é separada do polipeptídeo. Em outras formas de realização, uma variante de polipeptídeo básica é separada do polipeptídeo.

[00022] Em algumas formas de realização, a região CH2/CH3 compreende uma região Fc de uma imunoglobulina.

[00023] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é um anticorpo. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo multi- específico, ou um fragmento de anticorpo.

[00024] Em outras formas de realização, o polipeptídeo é um imunoaderente.

[00025] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo possui uma pureza de pelo menos cerca de 98 % de monômero. Em outras formas de realização, o polipeptídeo possui uma pureza de pelo menos cerca de 99 % de monômero.

[00026] Em algumas formas de realização, a relação de uma impureza de célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 75 % mais baixa, cerca de 80 % mais baixa, cerca de 85 % mais baixa, cerca de 90 % mais baixa, cerca de 95% mais baixa, cerca de 96 % mais baixa, cerca de 97 % mais baixa, cerca de 98% mais baixa, ou cerca de 99 % mais baixa do que a relação no polipeptídeo não purificado.

[00027] Em algumas formas de realização, um relação de uma impureza de célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 20 % mais baixa do que a relação em um polipeptídeo purificado por um método de eluição por etapas, em que o método de eluição por etapas compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um pH que começa em 3,6 ou abaixo. Em algumas formas de realização, uma relação de uma impureza de célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 60 % mais baixa do que a relação em um polipeptídeo purificado por um método de eluição por etapas, em que o método de eluição por etapas compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um pH que começa em 3,6 ou abaixo.

[00028] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui partículas de vírus ou partículas semelhantes a vírus que contam menos do que cerca de 15000 partículas/ml. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui partículas de vírus ou partículas semelhante a vírus que contam menos do que cerca de 12500 partículas/ml, menos do que cerca de 10000 partículas/ml, menos do que cerca de 7500 partículas/ml, menos do que cerca de 5000 partículas/ml, menos do que cerca de 2500 partículas/ml, menos do que cerca de 1500 partículas/ml, menos do que cerca de 1000 partículas/ml, menos do que cerca de 750 partículas/ml, menos do que cerca de 500 partículas/ml, menos do que cerca de 250 partículas/ml, menos do que cerca de 100 partículas/ml, ou menos do que cerca de 50 partículas/ml. Em algumas formas de realização, a partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a retrovírus.

[00029] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus de pelo menos cerca de 4 LRV (redução log 10 de vírus). Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus variando de cerca de 4 LRV a cerca de 8 LRV. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus variando de cerca de 4 LRV a cerca de 7 LRV. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus ao redor de 5 LRV, ao redor de 6 LRV, ao redor de 7 LRV, ou ao redor de 8 LRV. Em algumas formas de realização, a partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a retrovírus.

[00030] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado é um monômero de polipeptídeo.

[00031] Em algumas formas de realização, a proteína A é um ligante de Proteína A modificada ou não modificada.

[00032] Em algumas formas de realização, a purificação é um processo em escala de produção.

[00033] Em algumas formas de realização de qualquer um dos aspectos da invenção, o método de purificação ainda compreende submeter o polipeptídeo a uma etapa de filtração de vírus ou uma etapa de cromatografia de troca iônica. Em algumas formas de realização, a etapa de cromatografia de troca iônica é executada após a etapa de purificação.

[00034] Em algumas formas de realização de qualquer um dos aspectos da invenção, o método de purificação não compreende uma etapa de purificação adicional para remover um agregado.

[00035] Em algumas formas de realização de qualquer um dos aspectos da invenção, o método de purificação não compreende uma etapa de purificação adicional para remover uma incrustação de filtro de vírus.

[00036] Em algumas formas de realização de qualquer um dos aspectos da invenção, o método de purificação não compreende uma etapa de purificação adicional para remover uma variante de polipeptídeo de base. Em algumas formas de realização de qualquer um dos aspectos da invenção, o método de purificação não compreende uma etapa de purificação adicional para remover uma variante de polipeptídeo acídico.

[00037] Em outro aspecto, a invenção fornece um produto de polipeptídeo purificado pelos métodos aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00038] A Figura 1 mostra o cromatograma de gradiente da etapa de pH: eixo x está em ml do início da operação de Proteína A, e o eixo y é a absorvência (mAU). A forma distintiva da eluição de gradiente por etapas no traço de 280 UV também é mostrada - grande pico está no início da eluição e é depois diminuído para uma altura estável e afina nos pHs inferiores.

[00039] A Figura 2 mostra os resultados da SEC (cromatografia de exclusão de tamanho) pela fração de anticorpo anti-VEGF #1. O eixo X é o tempo de retenção na coluna da SEC (min), o eixo Y é a absorvência de UV normalizada (mAU). Visto que o número de fração aumentou (isto é, pH diminui à medida que a eluição gradiente progride), a HMWS (Espécie de Peso Molecular Elevado) e os picos diméricos (tempos de retenção ao redor de 12,5 minutos e 13,5 minutos respectivamente) também aumentaram enquanto que o pico monomérico diminui (tempo de retenção de 16 minutos). Os resultados destas curvas foram quantificados pela integração de todos os picos (por exemplo, HMWS, dímero, e monômero), comparando as áreas separadas dos picos relativos como percentagens (por exemplo, a área total foi ajustada para 100 %, um perfil integração de SEC da amostra pode fornecer percentuais, tais como "31% HMWS, 36 % dímero e 33 % monômero").

[00040] A Figura 3 mostra o gráfico de resultado da integração de SEC para o anticorpo anti-VEGF #1. Este gráfico mostra que os níveis de monômero foram elevados para as primeiras nove frações de eluição com quatro frações a 100 %, e os níveis de dímero e HMWS chegara ao ponto máximo mais tarde na eluição. Estes resultados de ensaio demonstram que o grandiente da etapa de pH separa os agregados do monômero de anticorpo anti-VEGF #1.

[00041] A Figura 4A mostra o perfil de integração de SEC para as múltiplas moléculas de proteína (anticorpo anti-CD20, anticorpo anti- VEGF #2, anticorpo anti-MUC16 e anti-CD4). O gradiente da etapa de pH separaou com sucesso os monômeros dos agregados no anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-VEGF #2, anticorpo anti-MUC16 e anti-CD4.

[00042] A Figura 4B mostra o perfil de integração de SEC para um anticorpo anti-Met aglicosilado de uma ramificação produzido por uma fermentação de célula hospedeira (E. coli) bacteriana. O gradiente da etapa de pH separou com sucesso os monômeros agregados no anticorpo anti-Met aglicosilado de uma ramificação.

[00043] A Figura 5 mostra uma comparação lado-a-lado entre uma eluição por etapas padrão do anticorpo anti-CD20 (controle; proteínas de eluição em pH igual ou inferior a 3,6 sem o gradiente de pH) e eluição gradiente da etapa de pH. O gráfico de eluição de anticorpo anti-CD20 e CHOP no painel esquerdo mostra os níveis de CHOP por fração em ppm (partes por milhão; unidade utilizada para padronizar a medição de impurezas em quantidade de produto). O gráfico de eluição de anticorpo anti-CD20 e agregado do painel direito mostra os valores de integração máxima da SEC por fração através da eluição gradiente. As linhas verticais nos painéis tanto da esquerda quanto da direita representam o agrupamento de simulação das frações contidas que devem gerar um conjunto de eluição gradiente do pH com as características mostradas na tabela na parte inferior da lâmina.

[00044] A Figura 6 mostra a separação de CHOP para um anticorpo anti-VEGF #1. Os níveis de CHOP por fração são expressos em ppm ou ng/ml.

[00045] A Figura 7 mostra a separação de CHOP para um anticorpo anti-MUC16. Os níveis de CHOP por fracção são expressos em ppm ou ng/ml.

[00046] A Figura 8 é uma camada de cromatograma da resina de Proteína A MABSELECT™, MABSELECT SURE™, PROSEP® Va, PROSEP® Ultra Plus, and POROS® MABCAPTURE™.

[00047] A Figura 9 é um Pareto Plot que mostra que a % B de partida (o pH de partida e a inclinação do gradiente de eluição) é o parâmetro mais influente na determinação da eficiência de separação de agregados, seguido pela densidade de carga e tempo de permanência.

[00048] A Figura 10 é um perfil de interação para os parâmetros da % B de partida, da densidade de carga e % B de partida, comprimento de eluição total, e tempo de permanência.

[00049] A Figura 11 é uma operação de fabrico exemplar para a eluição gradiente da etapa de pH.

[00050] A Figura 12 mostra os resultados do estudo de membrana de troca iônica a jusante usando dois tamanhos de membrana de troca catiônica e três tamanhos de membrana de troca aniônica. As unidades de cunha e nano são ambas representativas da fabricação no número de camadas de membrana, enquanto que as unidades ACRODISC® possuem um número reduzido de camadas, mas são os modelos de escala de bancada típicos utilizados.

[00051] A Figura 13 mostra a comparação de resultado da integração de SEC entre uma coluna de 4,1 L (escala piloto) e um operação de coluna em escala de bancada de 28 ml.

[00052] A Figura 14 é um gráfico de declínio de permeabilidade VIRESOLVE® Pro do anticorpo anti-VEGF #1 comparando o gradiente da etapa de pH da Proteína A versus a etapa padrão de Proteína A em termos de facilitar uma maior produção em massa sobre o filtro de parvovírus VIRESOLVE® Pro. Houve um aumento de cerca de seis vezes na produção em massa sobre o VIRESOLVE® Pro utilizando o gradiente da etapa de pH da proteína A.

[00053] A Figura 15 é um cromatograma de eluição gradiente de pH total da Proteína A que mostra os tração de software de cromatografia AKTA UNICORN™ real para o gradiente de pH completo em uma densidade de carga de 21 g/L. A ponta UV 250 elevada inicial no início do gradiente está ausente, indicando que o pH no início da eluição é maior do que o que é necessário para eluir os produtos da coluna de Proteína A.

[00054] A Figura 16 é um cromatograma AKTA de prova de gradiente de pH de 5,0 a 2,7 (0 a 100 % B), que indica que um anticorpo anti-VEGF #1 elui como um pico discreto na faixa de pH de 4,6 a 3,6.

[00055] A Figura 17 é uma integração do pico ensaio da variante de troca iônica através das frações de eluição gradiente da etapa de pH da Proteína A, que indica a separação da variante de polipeptídeo básico na parte final da eluição gradiente da etapa.

[00056] A Figura 18 é a contagem de partícula RVLP (Partícula como Retrovírus) da análise QPCR (Reação da Cadeia de Polimerase Quantitativa) por fração representada por meio de um gráfico contra a eluição do produto de anticorpo anti-VEGF #1. A maioria das RVLPs eluídas recentemente no gradiente onde pouca eluição do produto ocorreu.

[00057] A Figura 19 é LRV (redução log 10 de vírus) para cada fração na eluição gradiente da etapa do pH da Proteína A de anticorpo anti-VEGF #1.

[00058] A Figura 20 mostra as LRVs cumulativas para grupos simulados da fração, mostrando que as maiores LRVs podem ser alcançadas no conjunto de Proteína A se as frações posteriores forem omitidas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00059] A presente invenção fornece métodos para purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3 mediante a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um gradiente de pH que começa com um pH baixo. Os inventores fizeram a descoberta surpreendente de que os polipeptídeos de eluição compreendendo uma região CH2/CH3 da Proteína A com um gradiente de pH em um pH baixo podem fornecer uma melhor separação seqüencial de polipeptídeos a partir de várias impurezas, incluindo as impurezas da célula hospedeira, incrustações de filtro de vírus, vírus ou partículas semelhantes a vírus, variantes de polipeptídeo básico, e/ou agregados de polipeptídeo, e também alcançar uma maior pureza ou porcentagem dos monômeros de polipeptídeo desejáveis na fração purificada/conjunto. Assim, a invenção possui vantagens significativas. Os inventores também descobriram que estes métodos podem ser alcançados usando várias resinas de cromatografia de Proteína A e sorventes de cromatografia e que estes métodos podem ser usados em escala de fabricação e processo comercial, e podem facilitar a utilização de tecnologias de purificação a jusante alternativas diferentes da cromatografia de coluna (por exemplo, adsorventes de membrana).

[00060] Conseqüentemente, em um aspecto da invenção, é fornecido um método para a purificação de um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3, que compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um gradiente de pH que começa em 5,0 ou abaixo.

[00061] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para a purificação de um polipeptídeo que compreende uma região CH2/CH3, compreendendo as etapas de: (a) ligação do polipeptídeo à Proteína A, e (b) eluindo do polipeptídeo com um gradiente de pH que começa em 5,0 ou abaixo usando um tampão de eluição, em que o tampão de eluição contém um tampão de pH elevado e um tampão de pH baixo e em que o gradiente de pH é formado através do ajuste de uma porcentagem de cada tampão de pH no tampão de eluição.

[00062] Em mais outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo purificado pelos métodos aqui descritos.

[00063] A prática da presente invenção empregará, a não ser que de outra maneira indicada, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo as técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Definições

[00064] Entende-se que o polipeptídeo de interesse aqui é aquele que compreende uma região CH2/CH3 e, portanto, é passível de purificação pela Proteína A. O termo "região CH2/CH3" quando aqui utilizado refere-se àqueles resíduos de aminoácido na região Fc de uma molécula de imunoglobulina que interagem com a Proteína A. Em algumas formas de realização, a região CH2/CH3 compreende uma região CH2 intacta seguida por uma região CH3 intacta, e mais preferivelmente compreende uma região Fc de uma imunoglobulina. Exemplos de proteínas contendo a região CH2/CH3 incluem anticorpos, imunoadesinas e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de interesse fundida ou conjugada com uma região CH2/CH3.

[00065] Os termos "polipeptídeo"e "proteína" são aqui utilizados de modo trocável para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender os aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, a formação de ligação de dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente de rotulagem. Também incluídos dentro da definição estão, por exemplo, os polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, os aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica.

[00066] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo purificado" ou "proteína purificada"é um produto eluído a partir da cromatografia de afinidade da Proteína A utilizando os métodos de gradiente de pH como aqui descritos. Os polipeptídeos purificados/proteínas preferivelmente contêm principalmente monômeros de polipeptídeo.

[00067] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo não purificado", "proteína não purificada", ou "carga de proteína" é um polipeptídeo ou proteína no material de carga ou material de partida antes da etapa de purificação por cromatografia de afinidade da Proteína A.

[00068] Como aqui usado, o termo "impureza" ou "impurezas"é um material que é diferente do produto de monômero de polipeptídeo desejado. As impurezas incluem, mas não são limitadas a estas, uma variante de polipeptídeo (por exemplo, variante de polipeptídeo acídica ou básica), fragmento de polipeptídeo, agregado ou derivado do monômero de polipeptídeo desejado, outro polipeptídeo, lipídeo, ácido nucléico, endotoxina, impureza da célula hospedeira, ou incrustação do filtro de vírus.

[00069] Como aqui utilizado, o termo "monômero"refere-se a uma única unidade de um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3. Por exemplo, no caso de um anticorpo, um monômero consiste de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; no caso de um anticorpo não ramificado, um monômero consiste de uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[00070] Como aqui utilizado, o termo "variante de polipeptídeo básico"ou "variante básica"refere-se a uma variante de um polipeptídeo de interesse que é mais básico (por exemplo, como determinado pela cromatografia de troca catiônica) do que o polipeptídeo de interesse.

[00071] Como aqui utilizado, o termo "variante de polipeptídeo acídico"ou "variante acídica"refere-se a uma variante de um polipeptídeo de interesse que é mais acídico (por exemplo, como determinado pela cromatografia de troca catiônica) do que o polipeptídeo de interesse.

[00072] Como aqui utilizado, o termo "agregado" refere-se a quaisquer multímeros de um polipeptídeo ou um fragmento polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3. Por exemplo, um agregado pode ser um dímero, trímero, tetrâmero, ou um multímero maior do que um tetrâmero, etc.

[00073] Como aqui utilizado, o termo "impureza da célula hospedeira" refere-se a qualquer contaminante proteináceo ou subproduto introduzido pela linhagem celular hospedeira, fluido cultivado de células, ou cultura de células. Os exemplos incluem, mas não são limitados a estes, Proteína do Ovário de Hamster Chinês (CHOP), Proteína de E. coli, proteína de levedura, proteína de COS símio, ou proteína de células de mieloma (por exemplo, a proteína NS0 (células do plastocitoma de camundongo derivadas de um camundongo BALB/c)).

[00074] Como aqui utilizado, o termo "incrustação de filtro de vírus"refere-se a qualquer partícula de grande peso molecular ou espécies de peso molecular elevado (HMWS) com um diâmetro hidrodinâmico semelhante ou maior do que a distribuição de tamanho de poro do filtro de parvovírus. As incrustações de filtro de vírus incluem, mas não são limitadas a estes, agregados solúveis de polipeptídeo de peso molecular elevado e agregados solúveis e/ou insolúveis de impurezas de célula hospedeira (por exemplo, CHOP).

[00075] A "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura de células que pode ser ou foi um recebedor para o vetor para a incorporação de inserções de polinucletídeo para produzir polipeptídeos. As células hospedeiras incluem a descendência de uma única célula hospedeira, e a descendência pode não ser necessariamente de forma completa idêntica (em morfologia ou no complemento de DNA genômico) para a célula fonte original devido a mutação natural, acidental, ou deliberada.

[00076] A "fase sólida", como aqui utilizada, refere-se a uma matriz não aquosa a qual a Proteína A pode se aderir.

[00077] Um "tampão" é uma solução tamponada que resiste às mudanças no pH pela ação de seus componentes conjugados de ácido-base. Vários tampões que podem ser empregados dependendo, por exemplo, do pH desejado do tampão, são descritos em A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

[00078] O "tampão de equilíbrio"aqui é aquele utilizado para preparar a fase sólida (com a Proteína A imobilizada) para carregar a proteína de interesse.

[00079] O "tampão de lavagem"é aqui utilizado para se referir ao tampão que é passado sobre a fase sólida (com a Proteína A imobilizada) seguinte ao carregamento e antes da eluição da proteína de interesse.

[00080] O termo "anticorpo"é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monoclonais (incluindo os anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, contanto que eles retenham, ou sejam modificados para compreender, uma região CH2/CH3 como aqui definido.

[00081] Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte de um anticorpo de comprimento total, em geral a sua região de ligação ao antígeno ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab’, F(ab’)2, e os fragmentos Fv; moléculas de anticorpo de cadeia única; diacorpos; anticorpos lineares; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Como aqui utilizado, o fragmento de anticorpo compreende uma região CH2/CH3.

[00082] O termo "anticorpo monoclonal" como aqui utilizado refere- se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto com relação às possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações convencionais de anticorpo (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohleret al, Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, a Patente US no 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais"também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.

[00083] Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente os anticorpos "quiméricos"(imunoglobulinas) em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o resto da cadeia é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que apresentem a atividade biológica desejada (Patente US no 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

[00084] O termo "região hipervariável"quando aqui utilizado refere- se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 - 35 (1H), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "circuito hipervariável"(isto é, resíduos 26-32 (L1), 5052 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Os resíduos de "estrutura" ou "FR"são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável como aqui definidos.

[00085] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) são anticorpos quiméricos que contêm a seqüência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que os resíduos da região hipervariável do recebedor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejada especificidade, afinidade e capacidade. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são observados no anticorpo recebedor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os circuitos hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[00086] Como aqui utilizado, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam o "domínio de ligação"de uma proteína "adesina"heteróloga (por exemplo, um recebedor, ligante, ou enzima) com as funções efetoras de um domínio constante de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da seqüência de aminoácido de adesina com a especificidade de ligação desejada que é de outra maneira o reconhecimento do antígeno e sítio de ligação (sítio de combinação do antígeno) de um anticorpo (isto é, é "heterólogo") e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. A seqüência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina é de preferência derivada das cadeias pesadas y1, Y2, ou Y4 visto que as imunoadesinas compreendendo estas regiões podem ser purificados pela cromatografia de Proteína A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)).

[00087] O termo "domínio de ligação ao ligante" como aqui utilizado refere-se a qualquer recebedor da superfície celular nativo ou qualquer região ou seu derivado que retém pelo menos uma ligação de ligante qualitativo de um recebedor nativo correspondente. Em uma forma de realização específica, o recebedor é de um polipeptídeo da superfície celular tendo um domínio extracelular que é homólogo a um membro da supergenefamíla de imunoglobulina. Outros recebedores, que não são membros da supergenefamília de imunoglobulina, mas são, todavia, especificamente cobertos por esta definição, são recebedores para as citocinas, e em particular recebedores com atividade de tirosina cinase (tirosina cinases receptoras), membros das superfamílias de hematopoietina e do receptor do fator de crescimento, e moléculas de aderência celular, por exemplo, (E-, L- e P-) selectinas.

[00088] O termo "domínio de ligação ao receptor"é usado para designar qualquer ligante nativo para um receptor, incluindo as moléculas de aderência celular, ou a qualquer região ou derivado de tal ligante nativo que retém pelo menos uma capacidade de ligação ao receptor qualitativa de um ligante nativo correspondente. Esta definição, entre outros, especificamente inclui as seqüências de ligação de ligantes para os receptores acima mencionados.

[00089] Uma "quimera de imunoadesina de anticorpo" compreende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo (como aqui definido) com pelo menos uma imunoadesina (como definido neste pedido). As quimeras de imunoadesina de anticorpos exemplares são as quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas em Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) e Chamow et al., J. Immunol. 153:4268 (1994).

[00090] Para uso aqui, a não ser que expressamente indicado de outra maneira, o uso dos termos "um", "uma", e assim por diante se refere a um ou mais.

[00091] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) as formas de realização que são direcionadas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição que se refere a "cerca de X" inclui a descrição de "X". As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa.

[00092] Entende-se que onde quer que as formas de realização forem aqui descritas com a linguagem "compreendendo", as formas de realização análogas diferentes descritas em termos de "consistindo de" e/ou "consistindo essencialmente de"também são fornecidas.

Purificação de Polipeptídeos

[00093] O processo aqui envolve a purificação de uma polipeptídeo contendo a região CH2/CH3 de uma ou mais impurezas pela cromatografia de afinidade de Proteína A utilizando um gradiente de pH que começa de um pH baixo. Em um aspecto, o polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3 pode ser purificado por um método que compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um gradiente de pH que começa em 5,0 ou abaixo.

[00094] Em outro aspecto, o polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3 também pode ser purificado por um método que compreende as etapas de: (a) ligação do polipeptídeo à Proteína A; e (b) eluição do polipeptídeo com um gradiente de pH que começa em 5,0 ou abaixo usando um tampão de eluição, em que o tampão de eluição contém um tampão de pH elevado e um tampão de pH baixo e em que o gradiente de pH é formado através do ajuste de uma porcentagem de cada tampão de pH no tampão de eluição.

[00095] A Proteína A pode ser um ligante de Proteína A modificada ou não modificada. Como aqui utilizado, "ligante de Proteína A" abrange a Proteína A nativa, a Proteína A produzida sinteticamente (por exemplo, pela síntese peptídica ou por técnicas recombinantes), e suas variantes que retêm a capacidade de se ligar às proteínas que possuem uma região CH2/CH3. Um ligante de Proteína A modificada pode ser quimicamente planejado para ser estável em soluções de pH elevado durante pequenas quantidades de tempo (por exemplo, MABSELECT SURE™ (GE Healthcare (Piscataway, NJ)), POROS® M AB CAPTURE™ A (Applied Biosystems (Foster City, CA)). O termo "ligante de Proteína A não modificada", como aqui utilizado, abrange o ligante de Proteína A que é semelhante à Proteína A recuperada de uma fonte nativa. O ligante de Proteína A não modificada, por exemplo, MABSELECT™, PROSEP™ Va, PROSEP™ Ultra Plus, pode ser adquirido comercialmente da GE Healthcare (Piscataway, NJ) ou Millipore (Billerica, MA).

[00096] A proteína A pode ser imobilizada em uma fase sólida. A fase sólida pode ser uma coluna de purificação, uma fase descontínua ou partículas discretas, uma membrana, ou filtro. Exemplos de materiais para a formação da fase sólida incluem polissacarídeos (tais como agarose e celulose) e outras matrizes mecanicamente estáveis tais como sílica (por exemplo, vidro poroso controlado), poli(estirenodivinol)benzeno, poliacrilamida, partículas de cerâmica, e derivados de qualquer um dos acima.

[00097] A Proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificar os polipeptídeos contendo a região CH2/CH3. Em algumas formas de realização, a fase sólida é uma resina de coluna de Proteína A que compreende uma resina baseada e glóbulos de Proteína A, resina com base em sílica ou resina com base em agarose para imobilizar a Proteína A. Por exemplo, a fase sólida é uma coluna de vidro poroso controlado ou uma coluna de ácido silícico. Às vezes, a coluna foi revestida com um reagente, tal como glicerol, em uma tentativa de prevenir a aderência não específica na coluna. A coluna PROSEP™ A é um exemplo de uma coluna de vidro poroso controlado de Proteína A que é revestida com glicerol. Em outras formas de realização, a fase sólida é um sorvente de cromatografia de Proteína A para imobilizar a Proteína A. Os sorventes de cromatografia de Proteína A incluem, mas não são limitados a estes, as membranas (por exemplo, Sartorius (Goettingen, Germany), membrana de Proteína A SARTOBIND™) ou os monólitos (por exemplo, BIA Separations (Villach, Austria), monólitos HLD de Proteína A CIM®).

[00098] A fase sólida para a cromatografia de Proteína A pode ser equilibrada com um tampão de equilíbrio, e os polipeptídeos não purificados compreendendo várias impurezas (por exemplo, fluido de cultura celular colhida) podem então ser carregados para a fase sólida equilibrada. O polipeptídeo pode ser carregado com um tampão de carga. Convenientemente, o tampão de equilíbrio para equilibrar a fase sólida pode ser o mesmo como o tampão de carga, mas isso não é necessário. Quando os polipeptídeos circulam através da fase sólida, os polipeptídeos e várias impurezas são adsorvidos na proteína A imobilizada. Os tampões de lavagem podem ser usados para remover algumas impurezas, tais como as impurezas de célula hospedeiras, mas não os polipeptídeos de interesse.

[00099] O tampão de equilíbrio é de preferência isotónico e comumente possui um pH na faixa de cerca de 6 a cerca de 8. Por exemplo, um tampão de equilíbrio pode ter 25 mM Tris, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, e pH 7,1.

[000100] O "tampão de carga" refere-se a um tampão que é usado para carregar a mistura da proteína contendo a região CH2/CH3 e contaminantes na fase sólida em que a proteína é imobilizada. Muitas vezes, os tampões de equilíbrio e de carga são os mesmos.

[000101] O tampão de lavagem pode servir para eluir a impureza da linhagem celular ou outras várias impurezas. A condutividade e/ou pH do tampão de lavagem é tal que as impurezas são eluídas a partir da cromatografia de Proteína A, mas não qualquer quantidade significativa do polipeptídeo de interesse.

[000102] O polipeptídeo ligado à Proteína A pode ser eluído com um gradiente de pH usando um tampão de eluição único ou uma combinação de tampões de eluição.

[000103] O "tampão de eluição" é usado para eluir o polipeptídeo contendo a região CH2/CH3 da Proteína A imobilizada. Como aqui utilizado, o tampão de eluição contém um tampão de pH elevado e um tampão de pH baixo e assim forma um gradiente de pH mediante o ajuste de uma porcentagem do tampão de pH elevado e do tampão de pH baixo no tampão de eluição. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição possui um pH na faixa de cerca de 3 a cerca de 5. Os valores de pH como aqui usados são medidos sem a presença de polipeptídeos. Exemplos de tampões de pH que controlam o pH dentro desta faixa incluem, mas não são limitados a estes, os tampões de fosfato, acetato, citrato, ácido fórmico e amônio, assim como as suas combinações. Os tais tampões preferidos são tampões de acetato e ácido fórmico.

[000104] Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor de 5,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa abaixo de 5,0. Em alguns concretização, o gradiente de pH começa variando de cerca de 5,0 a cerca de 4,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa em cerca de 4,9, cerca de 4,8, cerca de 4,7, cerca de 4,6, cerca de 4,5, cerca de 4,4, cerca de 4,3, cerca de 4,2, cerca de 4,1, ou cerca de 4,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa em cerca de 4,98, cerca de 4,96, cerca de 4,94, cerca de 4,92, cerca de 4,90, cerca de 4,88, cerca de 4,86, cerca de 4,84, cerca de 4,82, cerca de 4,80, cerca de 4,78, cerca de 4,76, cerca de 4,74, cerca de 4,72 , cerca de 4,70, cerca de 4,68, cerca de 4,66, cerca de 4,64, cerca de 4,62, cerca de 4,60, cerca de 4,58, cerca de 4,56, cerca de 4,54, cerca de 4,52, cerca de 4,50, cerca de 4,48, cerca de 4,46, cerca de 4,44, cerca de 4,42, cerca de 4,40, cerca de 4,38, cerca de 4,36, cerca de 4,34, cerca de 4,32, cerca de 4,30, cerca de 4,28, cerca de 4,24, cerca de 4,22, cerca de 4,20, cerca de 4,18, cerca de 4,16, cerca de 4,14, cerca de 4,12, cerca de 4,10, cerca de 4,08, cerca de 4,06, cerca de 4,04, ou cerca de 4,02.

[000105] Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina ao redor de 3,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina acima de 3,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina variando de cerca de 3,0 a cerca de 4,0. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina em cerca de 3,1, cerca de 3,2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, ou cerca de 3,9. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH termina em cerca de 3,12, cerca de 3,14, cerca de 3,16, cerca de 3,18, cerca de 3,20, cerca de 3,22, cerca de 3,24, cerca de 3,26, cerca de 3,28, cerca de 3,30, cerca de 3,32, cerca de 3,34, cerca de 3,36, cerca de 3,38, cerca de 3,40, cerca de 3,42, cerca de 3,44, cerca de 3,46, cerca de 3,48, cerca de 3,50, cerca de 3,52, cerca de 3,54, cerca de 3,56, cerca de 3,58, cerca de 3,60, cerca de 3,61, cerca de 3,62, cerca de 3,63, cerca de 3,64, cerca de 3,65, cerca de 3,66, cerca de 3,67, cerca de 3,68, cerca de 3,69, cerca de 3,70, cerca de 3,71, cerca de 3,72, cerca de 3,73, cerca de 3,74, cerca de 3,75, cerca de 3,76, cerca de 3,77, cerca de 3,78, cerca de 3,79, cerca de 3,80, cerca de 3,82, cerca de 3,84, cerca de 3,86, cerca de 3,88, cerca de 3,9, cerca de 3,92, cerca de 3,94, cerca de 3,96, ou cerca de 3,98.

[000106] Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor do pH 4,2 e termina ao redor do pH 3,7. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor do 4,24 e termina ao redor do pH 3,69. Por exemplo, os anticorpos anti-VEGF, anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-MUC16, anticorpos anti-CD4, e anticorpos anti-Met de uma ramificação podem ser purificados usando o gradiente de pH que começa ao redor do pH 4,24 e termina ao redor do pH 3,69.

[000107] Em outras formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor do pH 4,3 e termina ao redor do pH 3,7. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH (isto é, gradiente da etapa de pH) começa ao redor do pH 4,34 e termina ao redor do pH 3,69. Por exemplo, os anticorpos anti-VEGF, anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-MUC16, anticorpos anti-CD4, e anticorpos anti-Met de uma ramificação podem ser purificados utilizando o gradiente de pH que começa em cerca de pH 4,34 e termina em cerca de pH 3,69.

[000108] Em algumas formas de realização, o gradiente de pH começa ao redor do pH 4,6 e termina ao redor do pH 3,7. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH (isto é, gradiente de pH total) começa ao redor do pH 4,58 e termina ao redor do pH 3,69. Por exemplo, os anticorpos anti-VEGF, anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-MUC16, anticorpos anti-CD4, e anticorpos anti-Met de uma ramificação podem ser purificados utilizando o gradiente de pH que começa ao redor do pH 4,58 e termina ao redor do pH 3,69.

[000109] O tampão de eluição contém um tampão de pH elevado e um tampão de pH baixo e o gradiente de pH é formado através do ajuste de uma porcentagem de cada tampão de pH no tampão de eluição. Em algumas formas de realização, o tampão de pH elevado está ao redor de 5,0 e o tampão de pH baixo está ao redor de 2,7. Por exemplo, o tampão de pH elevado pode ser 25 mM acetato de e pH 5,0 e o tampão de pH baixo pode ser 25 mM ácido fórmico e pH 2,7.

[000110] O ajuste da porcentagem de partida do tampão de pH baixo pode otimizar e maximizar a pureza do polipeptídeo purificado, e também a separação seqüencial das impurezas, incluindo agregados, impurezas linhagem celular, variante de polipeptídeo básico, partículas de vírus, partículas semelhantes a vírus, e incrustações de filtro de vírus, dos monômeros de polipeptídeo. A porcentagem de tampão de pH baixo no tampão de eluição pode começar em cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, cerca de 40 %, ou cerca de 45 %.

[000111] Em algumas formas de realização, a porcentagem de tampão de pH baixo no tampão de eluição pode começar ao redor de 25 %. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 25 % compreende cerca de 19 mM acetato, cerca de 6 mM formiato, e condutividade de tampão ao redor de 1140 em pH 4,5 a 4,6. Por exemplo, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 25 % compreende 18,75 mM acetato, 6,25 mM formiato, condutividade de tampão de 1141 uS/cm, em pH 4,58.

[000112] Em algumas formas de realização, a porcentagem de tampão de pH baixo no tampão de eluição pode começar ao redor de 35 %. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 35 % compreende cerca de 16 mM acetato, cerca de 9 mM formiato, e condutividade de tampão ao redor de 1040 em pH 4,3 a 4,4. Por exemplo, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 35 % compreende 16,25 mM acetato, 8,75 mM formiato, condutividade de tampão de 1039 uS/cm, em pH 4,34.

[000113] Em algumas formas de realização, a porcentagem de tampão de pH baixo no tampão de eluição pode começar ao redor de 40 %. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 40 % compreende cerca de 15 mM acetato, cerca de 10 mM formiato, e condutividade tampão em cerca de 974 em pH 4,2 a 4,3. Por exemplo, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 40 % compreende 15 mM acetato, 10 mM formiato, condutividade de tampão de 974 uS/cm, em pH 4,24.

[000114] Em algumas formas de realização, a porcentagem de tampão de pH baixo no tampão de eluição pode terminar ao redor de 60 %. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo ao redor de 60 % compreende cerca de 10 mM acetato, cerca de 15 mM formiato, e condutividade tampão em cerca de 763 em pH 3,6 a 3,7. Por exemplo, o tampão de pH baixo no final do gradiente de pH pode ser 10 mM acetato, 15 mM formiato, condutividade de tampão de 763 uS/cm, em pH 3,69.

[000115] Em algumas formas de realização, o tampão de eluição possui uma condutividade de tampão variando de cerca de 1200 uS/cm a cerca de 500 uS/cm. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição possui uma condutividade de tampão variando de cerca de 1150 uS/cm a cerca de 700 uS/cm. Em algumas formas de realização, o tampão de eluição possui uma condutividade de tampão de cerca de 1145 uS/cm, cerca de 1141 uS/cm, cerca de 1130 uS/cm, cerca de 1120 uS/cm, cerca de 1110 uS/cm, cerca de 1000 uS/cm, cerca de 1039 uS/cm, cerca de 1000 uS/cm, cerca de 974 uS/cm, cerca de 900 uS/cm, cerca de 800 uS/cm, cerca de 763 uS/cm, ou cerca de 700 uS/cm.

[000116] Em algumas formas de realização, a composição do tampão de eluição é de cerca de 9 a 20 mM acetato e 5 a 15 mM formiato. Em algumas formas de realização, a composição da eluição é de cerca de 10 a 19 mM acetato e 6 a 16 mM formiato.

[000117] O ajuste da densidade de carga do polipeptídeo também pode otimizar e maximizar a pureza do polipeptídeo purificado e a separação das impurezas, incluindo agregados, impurezas da linhagem celular, variante de polipeptídeo básico, partículas de vírus, partículas semelhantes a vírus, e incrustações de filtro de vírus, dos monômeros de polipeptídeo.

[000118] O termo "densidade de carga" ou "densidade de carregamento"é a densidade do polipeptídeo purificado (g) por litro de resina de cromatografia ou a densidade do polipeptídeo purificado por litro de membrana/volume do filtro (L). A densidade de carga é medida em g/L.

[000119] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é carregado com uma densidade de carga que começa em 14 g/L ou acima. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é carregado com uma densidade de carga variando de cerca de 14 g/L a cerca de 45 g/L ou de cerca de 14 g/L a cerca de 70 g/L. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é carregado com uma densidade de carga em cerca de 15 g/L, cerca de 17 g/L, cerca de 19 g/L, cerca de 21 g/L, cerca de 23 g/L, cerca de 25 g/L, cerca de 26 g/L, cerca de 27 g/L, cerca de 28 g/L, cerca de 29 g/L, cerca de 31 g/L, cerca de 33 g/L, cerca de 35 g/L, cerca de 37 g/L, cerca de 39 g/L, cerca de 41 g/L, cerca de 43 g/L, cerca de 45 g/L, cerca de 50 g/L, cerca de 55 g/L, cerca de 60 g/L, cerca de 65g/L, ou cerca de 70 g/L.

[000120] O ajuste do tempo de permanência de eluição polipeptídeo (ou a taxa de fluxo de eluição) também pode otimizar e maximizar a pureza de polipeptídeo e a separação seqüência de impurezas dos monômeros de polipeptídeo. Na densidade de carga aumentada, o tempo de permanência de eluição de polipeptídeo desempenha um papel muito maior na capacidade do gradiente de pH para fracionar os agregados de forma eficiente. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo possui uma taxa de fluxo de eluição variando de cerca de 5 volumes de coluna/hora a cerca de 35 volumes de coluna/hora. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo possui uma taxa de fluxo de eluição variando de cerca de 5 volumes de coluna/hora a cerca de 25 volumes de coluna/hora. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo possui uma taxa de fluxo de eluição de cerca de 5 volumes de coluna/hora, cerca de 7,5 volumes de coluna/hora, cerca de 10 volumes de coluna/hora, cerca de 12,5 volumes de coluna/hora, cerca de 15 volumes de coluna/hora, cerca de 17,5 volumes de coluna/hora, cerca de 20 volumes de coluna/hora, cerca de 22,5 volumes de coluna/hora, cerca de 25 volumes de coluna/hora, cerca de 27,5 volumes de coluna/hora, cerca de 30 volumes de coluna/hora, cerca de 32,5 volumes de coluna/hora, ou cerca de 35 volumes de coluna/hora.

[000121] Os polipeptídeos purificados que utilizam os métodos aqui descritos possuem um rendimento de pelo menos cerca de qualquer um de 75 % de polipeptídeo não purificado, 80 % de polipeptídeo não purificado, 85 % de polipeptídeo não purificado, 90 % de polipeptídeo não purificado, 95 % de polipeptídeo não purificado, 96 % de polipeptídeo não purificado, 97 % de de polipeptídeo não purificado, 98 % de de polipeptídeo não purificado, ou 99 % de de polipeptídeo não purificado.

[000122] O rendimento é a quantidade total de polipeptídeo purificado coletado em comparação com o polipeptídeo não purificado antes da purificação de cromatografia de afinidade da Proteína A como aqui descrita, geralmente expressa como uma porcentagem do polipeptídeo não purificado.

[000123] Em algumas formas de realização, a relação de uma impureza de célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 75 % mais baixa, cerca de 80 % mais baixa, cerca de 85 % mais baixa, cerca de 90 % mais baixa, cerca de 95 % mais baixa, cerca de 96 % mais baixa, cerca de 97 % mais baixa, cerca de 98 % mais baixa, ou cerca de 99 % mais baixa do que a relação no polipeptídeo não purificado.

[000124] Em algumas formas de realização, a relação de uma impureza de célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 20 % mais baixa, cerca de 30 % mais baixa, cerca de 40 % mais baixa, cerca de 50 % mais baixa, cerca de 60 % mais baixa, ou cerca de 70 % mais baixa do que a relação no polipeptídeo purificado utilizando uma etapa de purificação de pH diferente daquela da presente invenção. Por exemplo, em um método de eluição da Proteína A por etapas convencional ou típica, o polipeptídeo é purificado mediante a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição do polipeptídeo em pH 3,6 ou abaixo sem o gradiente de pH. Conseqüentemente, em algumas formas de realização, a relação de uma impureza de célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 20 % mais baixa, cerca de 30 % mais baixa, cerca de 40 % mais baixa, cerca de 50 % mais baixa, cerca de 60 % mais baixa, ou cerca de 70 % mais baixa do que a relação em um polipeptídeo purificado por um método de eluição por etapas, em que o método de eluição por etapas compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um pH que começa em 3,6 ou abaixo.

[000125] Em algumas formas de realização, a relação de uma incrustação de filtro de vírus para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 75 % mais baixa, pelo menos cerca de 80 % mais baixa, cerca de 85 % mais baixa, cerca de 90 % mais baixa, cerca de 95 % mais baixa, cerca de 96 % mais baixa, cerca de 97 % mais baixa, cerca de 98 % mais baixa, ou cerca de 99 % mais baixa do que a relação no polipeptídeo não purificado.

[000126] Em algumas formas de realização, a relação de uma incrustação de filtro de vírus para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 20 % mais baixa, cerca de 30 % mais baixa, cerca de 40 % mais baixa, cerca de 50 % mais baixa, cerca de 60 % mais baixa, ou cerca de 70 % mais baixa do que a relação no purificado polipeptídeo utilizando uma etapa de purificação de pH diferente da presente invenção. Por exemplo, em um método de eluição da proteína A por etapas convencional ou típico, o polipeptídeo é purificado mediante a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição do polipeptídeo em pH 3,6 ou abaixo sem o gradiente de pH. Conseqüentemente, em algumas formas de realização, a relação de uma incrustação de filtro de vírus para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 20 % mais baixa, cerca de 30 % mais baixa, cerca de 40 % mais baixa, cerca de 50 % mais baixa, cerca de 60 % mais baixa, ou cerca de 70 % mais baixa do que a relação em um polipeptídeo purificado por um método de eluição por etapas, em que o método de eluição por etapas compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um pH que começa em 3,6 ou abaixo.

[000127] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui partícula de vírus ou partícula semelhante a vírus que conta menos do que cerca de 15000 partículas/ml. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui partícula de vírus ou partícula semelhante a vírus que conta menos do que cerca de 12500 partículas/ml, menos do que cerca de 10000 partículas/ml, menos do que cerca de 7500 partículas/ml, menos do que cerca de 5000 partículas/ml, menos do que cerca de 2500 partículas/ml, menos do que cerca de 1500 partículas/ml, menos do que cerca de 1000 partículas/ml, menos do que cerca de 750 partículas/ml, menos do que cerca de 500 partículas/ml, menos do que cerca de 250 partículas/ml, menos do que cerca de 100 partículas/ml, ou menos do que cerca de 50 partículas/ml. Em algumas formas de realização, a partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a retrovírus.

[000128] Como aqui usado, o termo "partícula de vírus"termo é um vírion consistindo de núcleo de ácido nucléico circundado por uma camada protetora de proteína (capsídeo). As "partículas semelhantes a vírus" são vírus não infecciosos que se parecem com as propriedades morfológicas, bioquímicas ou outras similares. Elas são defeituosas em pelo menos um dos componentes necessários para o ciclo de vida do vírus. Um exemplo de partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a retrovírus que não pode se replicar. A partícula de vírus ou partícula semelhante a vírus pode ser endógena ou exógena (casual). Uma partícula de vírus ou partícula semelhante a vírus endógena é produzida por uma linhagem celular hospedeira, presentes nas células e fluido de cultura celular, e pode ser considerada como uma impureza da célula hospedeira. Uma partícula de vírus ou semelhante a vírus exógena ou casual não é derivada de uma linhagem celular do hospedeiro.

[000129] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus de pelo menos cerca de 4 LRV (redução log 10 de vírus). Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus variando de cerca de 4 LRV a cerca de 8 LRV. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus variando de cerca de 4 LRV a cerca de 7 LRV. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado possui depuração viral de um vírus ou uma partícula semelhante a vírus ao redor de 5 LRV, ao redor de 6 LRV, ao redor de 7 LRV, ou ao redor de 8 LRV. Em algumas formas de realização, a partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a retrovírus.

[000130] Como aqui utilizado, a LRV é a diferença de log 10 (vírus total) no polipeptídeo não purificado e no polipeptídeo purificado.

[000131] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo purificado é um monômero de polipeptídeo.

[000132] Em algumas formas de realização, uma fração purificada do polipeptídeo contém ao redor ou menos do que cerca de 20 volumes de coluna de Proteína A. Em algumas formas de realização, uma fração purificada do polipeptídeo contém ao redor ou menos do que cerca de 15 volumes de coluna de Proteína A. Em algumas formas de realização, uma fração purificada do polipeptídeo contém ao redor ou menos do que cerca de 12 volumes de coluna de Proteína A. Em algumas formas de realização, uma fração purificada do polipeptídeo contém ao redor ou menos do que cerca de 11, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5,5, ou cerca de 5,0 volumes de coluna de Proteína A.

[000133] Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos removem pelo menos duas das impurezas aqui descritas do produto de monômero de polipeptídeo desejado. Por exemplo, os métodos removem tanto um agregado quanto uma impureza da linhagem celular de hospedeiro, tanto um agregado quanto uma incrustação de filtro de vírus, tanto um agregado quanto uma partícula de vírus, tanto um agregado quanto uma partícula semelhante a vírus, tanto um agregado quanto uma variante de polipeptídeo básico, ou uma impureza da linhagem celular de hospedeiro e uma partícula de vírus, etc. Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos removem pelo menos três das impurezas aqui descritas do produto de monômero de polipeptídeo desejado. Por exemplo, os métodos removem um agregado, uma impureza de célula hospedeira, e uma incrustação de filtro de vírus, ou um agregado, uma impureza de célula hospedeira, e uma partícula de vírus, e uma variante de polipeptídeo básico, etc. Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos removem pelo menos quatro das impurezas aqui descritas do produto de monômero de polipeptídeo desejado. Por exemplo, os métodos removem um agregado, uma impureza de célula hospedeira, uma incrustação de filtro de vírus, e uma partícula de vírus, ou um agregado, uma impureza de célula hospedeira, uma incrustação de filtro de vírus, e uma partícula semelhante a vírus. Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos removem pelo menos cinco das impurezas aqui descritas do produto de monômero de polipeptídeo desejado. Por exemplo, os métodos removem um agregado, uma impureza de célula hospedeira, uma incrustação de filtro de vírus, uma partícula de vírus, e uma partícula semelhante a vírus, etc. Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos removem todas as impurezas do produto de polipeptídeo desejado.

[000134] Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos não compreendem uma etapa de purificação adicional para remover um agregado, e os polipeptídeos purificados possuem uma pureza de pelo menos cerca de 98 % ou cerca de 99 % de monômero. A depuração do agregado normalmente executada em uma etapa de cromatografia de troca iônica separada não é requerida seguinte a cromatografia de proteína A usando o gradiente de pH como descrito acima.

[000135] Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos não compreendem uma etapa de purificação adicional para remover uma incrustação de filtro de vírus, e os polipeptídeos purificados possuem uma pureza de pelo menos cerca de 98 % ou cerca de 99 % de monômero.

[000136] Em algumas formas de realização, o método de purificação não compreende uma etapa de purificação adicional para remover uma variante polipeptídeo básico ou acídico.

[000137] O polipeptídeo purificado usando os métodos aqui descritos pode ser submetido às etapas de purificação adicionais antes, durante ou após a etapa de cromatografia de Proteína A. Outras etapas de purificação exemplares incluem, mas não são limitados a estas, cromatografia de hidroxilapatita; diálise; cromatografia de afinidade usando um anticorpo para capturar a proteína; cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) (por exemplo, fracionamento em uma HIC); precipitação com sulfato de amônio; precipitação de polietileno glicol ou derivado de polietileno glicol, cromatografia de troca aniônica ou catiônica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica; cromatofocagem; cromatografia SDS-PAGE, de filtração de vírus, de filtração em gel, e de divisão fraca.

[000138] Em algumas formas de realização, os polipeptídeos são ainda submetidos a uma etapa de filtração de vírus. Por exemplo, um filtro de parvovírus pode ser utilizado na etapa de filtração de vírus após a etapa de cromatografia de Proteína A utilizando um gradiente de pH como aqui descrito.

[000139] Em algumas formas de realização, os polipeptídeos são ainda submetidos a uma etapa de cromatografia de troca iônica. Em algumas formas de realização, a etapa de cromatografia de troca iônica compreende uma etapa de cromatografia de troca catiônica. Em algumas formas de realização, a etapa de cromatografia de troca iônica compreende uma etapa de cromatografia de troca aniônica. Em algumas formas de realização, a etapa de cromatografia de troca iônica compreende uma etapa de cromatografia de troca catiônica e uma etapa de cromatografia de troca aniônica.

[000140] Em algumas formas de realização, a etapa de cromatografia de troca iônica funciona continuamente após a etapa de cromatografia de Proteína A como aqui descrito. Por exemplo, as membranas de cromatografia de troca catiônica e aniônica podem ser usadas em vez das colunas de cromatografia de troca catiônica e/ou aniônica padrão seguindo o método de cromatografia de Proteína A aqui descritos para alcançar polipeptídeos purificados de pureza comparável e rendimento produzido pelo método de cromatografia de Proteína A padrão sem o gradiente de pH seguido pelas etapas de cromatografia de coluna de troca catiônica e aniônica padrão.

[000141] Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos são processos e escala de fabricação ou comerciais. Como aqui utilizado, os processos em escala de fabricação ou comerciais se referem a uma purificação em grande escala de proteína/polipeptídeo, por exemplo, em produto de proteína/polipeptídeo em escala de fermentação de cerca de 1 kL a cerca de 25 kL por processo de purificação.

Polipeptídeos

[000142] O polipeptídeo ou proteína a ser purificada utilizando os métodos aqui descritos inclui, mas não está limitado a estes, anticorpo, imunoadesina, ou um polipeptídeo fundido ou conjugado com uma região CH2/CH3. Técnicas para a geração de tais moléculas são debatidas abaixo.

Anticorpos

[000143] Os anticorpos dentro do escopo da presente invenção incluem, mas não são limitados a estes: anticorpos anti-CD20 tais como anti-CD20 quimérico "C2B8" como na Patente US no 5.736.137 (RITUXAN ); anticorpos anti-VEGF, incluindo os anticorpos anti-VEGF maduros humanizados e/ou de afinidade tais como o anticorpo anti- VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTIN® (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicação Internacional No. WO 96/30046, e WO 98/45331, publicado em 15 de Oct. de 1998) e V3LA; anticorpo anti- MUC16; anticorpos anti-CD4 tais como o anticorpo cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum. 39(l):52-56 (1996)) e o anticorpo Ibalizumab (TNX355); anticorpos anti-MET tais como o anticorpo 5D5 anti-C-Met de uma ramificação; anticorpos anti-HER2 Trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:42854289 (1992), Patente US no 5.725.856) e 2C4 humanizado (WO 01/00245, Adams et al.), uma variante quimérica ou humanizada do anticorpo 2H7 como na Patente US no 5.721.108 B1, ou Tositumomab (BEXXAR®); anticorpos anti-IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993), e Publicação Internacional No. WO 95/23865); anticorpos do antígeno da célula tronco anti-próstata (PSCA) (WO 01/40309); anticorpos anti- CD40, incluindo S2C6 e suas variantes humanizadas (WO 00/75348); anticorpos anti-CDl (Patente US no 5.622.700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), e Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-CD18 (Patente US no 5.622.700, publicada em 22 de abril de 1997, ou como na WO 97/26912, publicada em 31 de Jul. de 1997); anticorpos anti-IgE (incluindo E25, E26 e E27; Patente US no 5,714,338, publicada em 03 de Fev. de 1998 ou Patente US no 5.091.313, publicada em 25 de Fev. de 1992, WO 93/04173 publicada em 04 de Mar. de 1993, ou Pedido Internacional No. PCT/US98/13410 depositado em 30 de Jun. de 1998, Patente US no 5.714.338, Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), e Publicação Internacional No. WO 95/19181); anticorpos do receptor anti-Apo-2 (WO 98/51793 publicada em 18 de Nov. de 1998); anticorpos anti-TNF-, incluindo cA2 (REMICADE®), CDP571 e MAK- 195 (Ver, a Patente US no 5.672.347 publicada em 30 de Set. de 1997, Lorenz et al. J. Immunol. 156(4): 1646-1653(1996), e Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23(9): 1461-1469 (1995)); anticorpos do fator anti- tecido (TF) (Patente Européia No. 0 420 937 B l concedida em 09 de Nov. de 1994); anticorpos da integrina anti-humano a4B7 (WO 98/06248 publicada em 19 de Fev. de 1998); anticorpos do fato de crescimento anti-epidérmico (EGFR) (por exemplo, anticorpo 225 quimerizado ou humanizado como na WO 96/40210 publicada em 19 de Dez. de 1996); anticorpos anti-CD3 tais como OKT3 (Patente US no 4.515.893 publicada em 07 de Mai de 1985); anticorpos anti-CD25 ou anti-Tac tais como CHI-621 (SIMULECT® e ZENAPAX® (Ver a Patente US no 5.693.762 publicada em 02 de dez de 1997); anticorpos anti- CD52 tais como CAMPATH-IH (Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)); anticorpos do receptor anti-Fc tais como o anticorpo M22 direcionado contra Fey RI como em Graziano et al. J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); anticorpos do antígeno anti- carcinoembriônico (CEA) tais como hMN-1 4 (Sharkey et al. Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995); anticorpos direcionados contra as células epiteliais da mama incluindo huBrE-3, hu-Mc 3 e CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); e Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); anticorpos que se ligam às células do carcinoma do cólon tais como C242 (Litton et al. Eur J Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); anticorpos anti-CD38, por exemplo, AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); anticorpos anti-CD33 tais como Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995) e CMA-676 ou CDP771; anticorpos anti- CD22 tais como LL2 ou LymphoCide (Juweid et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)); anticorpos anti-EpCAM tais como 17-1A (PANOREX®); anticorpos anti-GpIIb/IIIa tais como abciximab ou c7E3 Fab (REOPRO); anticorpos anti-RSV tais como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticorpos anti-CMV tais como PROTOVIR®; anticorpos anti-HIV tais como PR0542; anticorpos anti-hepatite tais como o anticorpo anti-Hep B OSTAVIR®; anticorpos anti-CA 125, tais como OvaRex; anticorpo do epítopo anti-idiotípico GD3 BEC2; anticorpos anti-avB3, incluindo VITAXIN; anticorpo do carcinoma da célula renal anti-humana tal como ch-G250; ING-1; anticorpo anti-humano 17-1 A (3622W94); anticorpo do tumor colorretal anti-humano (A33); anticorpo do melanoma anti-humano R24 direcionado contra GD3 gangliosídeo; carcinoma de células escamosas anti-humano (SF-25); e anticorpos do antígeno de leucócito anti-humano (HLA) tais comos Smart ID 10 e o anticorpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1).

[000144] Com exceção dos anticorpos especificamente identificados acima, o praticante versado pode gerar anticorpos direcionados contra um antígeno de interesse, por exemplo, utilizando as técnicas descritas abaixo.

(i) Seleção e Preparação de Antígeno

[000145] O anticorpo aqui contido é direcionado contra um antígeno de interesse. De preferência, o antígeno é um polipeptídeo biologicamente importante e a administração do anticorpo em um mamífero que sofre de uma doença ou distúrbio pode resultar em um benefício terapêutico neste mamífero. No entanto, os anticorpos direcionados contra os antígenos não polipeptídeo (tais como os antígenos associados aos tumores glicolipídicos; ver a Patente US no 5.091.178) são também contemplados. Aonde o antígeno for um polipeptídeo, pode ser uma molécula da transmembrana (por exemplo, recebedor) ou ligante tal como um fator de crescimento. Os antígenos exemplares incluem aquelas proteínas descritas na seção (3) abaixo. Os alvos moleculares exemplares para os anticorpos incluídos pela presente invenção incluem as proteínas CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 e CD34; membros da família de receptor ErbB tais como o receptor EGFR, HER2, HER3 ou HER4; moléculas de aderência celular tais como LFA-1, MAC1, p1 50,95, VLA-4, ICAM- 1, VCAM e integrina av/B3 incluindo as subunidades a ou β destes (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tais como VEGF; IgE; antígenos do grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3, receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, ou qualquer um dos outros antígenos aqui mencionados.

[000146] Os antígenos solúveis ou seus fragmentos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser usados como imunógenos para a geração de anticorpos. Para as moléculas da transmembrana, tais como receptores, seus fragmentos (por exemplo, o domínio extracelular de um receotor) podem ser usados como o imunógeno. Alternativamente, as células que expressam a molécula da transmembrana podem ser usadas como o imunógeno. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens celulares de câncer) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula da transmembrana.

[000147] Outros antígenos e suas formas úteis para a preparação de anticorpos serão evidentes para aqueles da técnica.

(ii) Anticorpos Policlonais

[000148] Os anticorpos policlonais são de preferência criados em animais por múltipla injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa, albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina da soja utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes.

[000149] Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados mediante a combinação, por exemplo, de 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês depois os animais são reforçados com 1/5 da {fração (1/10)} da quantidade original de antígeno ou conjugado em adjuvante completo de Freund pela injeção subcutânea em múltiplos locais. De sete a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é analisado quanto ao título de anticorpo. Os animais são reforçados até os platôs de titulação. De preferência, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser preparados em cultura de células recombinantes como fusões de proteína. Também, os agentes de agregação tais como alume são adequadamente utilizados para aumentar a resposta imune.

(iii) Anticorpos Monoclonais

[000150] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (Patente US no 4.816.567).

[000151] No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou macaco símio, é imunizado como mais acima descrito para extrair os linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são depois fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

[000152] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma de origem não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma de origem carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimento das células deficientes de HGPRT.

[000153] As células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção de alto nível estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre estas, as linhagens celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis da Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA. As linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo- humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[000154] O meio de cultura em que as células de hibridoma estão se desenvolvendo é avaliado com relação à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).

[000155] Após as células de hibridoma serem identificadas que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitativa e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59 - 103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores em ascite em um animal.

[000156] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, Proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. De preferência, o procedimento de cromatografia de afinidade de Proteína A usando um gradiente de pH aqui descrito é utilizado.

[000157] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e seqüenciado utilizando os procedimentos convencionais (por exemplo, mediante o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células do ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outra forma não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.

[000158] O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da seqüência de codificação para os domínios constantes de cadeia pesa e leve humanos em vez das seqüências homólogas de murino (Patente US no 4.816.567;. Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou por covalentemente se unir à seqüência de codificação de imunoglobulina total ou parcial da seqüência de codificação para um polipeptídeo não imunoglobulina.

[000159] Tipicamente tais polipeptídeos não imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, ou eles são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação do antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno diferente.

[000160] Os anticorpos monoclonais podem ser isolados de bibliotecas fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humanos, respectivamente, utilizando as bibliotecas fagos. As subseqüentes publicações descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) pelo rearranjo de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como a infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma para o isolamento de anticorpos monoclonais.

(iv) Anticorpos Humanizados e Humanos

[000161] Um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácido nele introduzidos a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são muitas vezes referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente executada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante a substituição das seqüências de CDRs ou CDR de roedor pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US no 4.816.567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[000162] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método de "melhor ajuste", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é submetida a triagem contra toda a biblioteca de seqüências de domínio variável humano conhecidas. A seqüência humana que é mais próxima daquela do roedor é então aceite como a FR humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)). Outro método utiliza uma estrutura particular derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

[000163] É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências de origem e vários produtos humanizados conceituais utilizam modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares daqueles versados na técnica. Os programas de computador são disponíveis os quais ilustram e apresentam prováveis estruturas tridimensionais conformacionais de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas apresentações permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidato de se ligar ao seu antígeno. Desta maneira, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do recebedor e as seqüências de importação de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o antígeno alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar ligação de antígeno.

[000164] Alternativamente, é agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após a imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a supressão homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e da linha germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da disposição genética de imunoglobulina da linha germinativa humana em tais camundongos mutantes da linha germinativa irá resultar na produção de anticorpos humanos após o desafio de antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Os anticorpos humanos também podem ser derivados das bibliotecas de apresentação fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).

(V) Fragmentos de Anticorpo

[000165] Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através da digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem ser agora produzidos diretamente pelas células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpos fagos acima debatidos. Alternativamente, os fragmentos Fab’-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura da célula hospedeira recombinante. Um fragmento Fv de cadeia única (scFv) também podem ser isolado. Ver a WO 93/16185. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o praticante versado.

(vi) Anticorpos Multiespecíficos

[000166] Os anticorpos multiespecíficos possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Embora tais moléculas normalmente se liguem apenas a dois antígenos (isto é, anticorpos biespecíficos, BsAbs), os anticorpos com especificidades adicionais tais como anticorpos triespecíficos são incluídos por esta expressão quando aqui utilizados.

[000167] Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Por causa da variedade aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é geralmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados na WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[000168] De acordo com outro método descrito na WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser preparada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As "cavidades"compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia lateral grande são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo mediante a substituição de grandes cadeias laterais de aminoácido com aquelas menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

[000169] Os anticorpos biespecíficos incluem os anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar as células do sistema imune para as células indesejadas (Patente US no 4.676.980), e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03.089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando qualquer método de reticulação conveniente. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são divulgados na Patente US no 4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.

[000170] As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritos na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando a ligação química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab’)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do arsenito de sódio do agente de complexo de ditiol para estabilizar os ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab’ gerados são depois convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab’-TNB é então reconvertido no Fab’-tiol mediante a redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab’-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[000171] O progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab’-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico totalmente humanizado F(ab’)2. Cada fragmento Fab’ foi separadamente secretado de E. coli e submetido ao acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar às células que superexpressam do receptor ErbB2 e das células T humanas normais, assim como ativar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama humano.

[000172] Várias técnicas para a produção e isolamento de fragmentos de anticorpo biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante também foram descritas. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados nas partes Fab’ de dois anticorpos diferentes pela fusão genética. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região da dobradiça para formar monômeros e depois oxidados novamente para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) tem proporcionado um mecanismo alternativo para a preparação de fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para a preparação de fragmentos de anticorpo biespecíficos através da utilização de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Alternativamente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares" como descrito em Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (VH -CH1- VH e VL) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[000173] Os anticorpos com mais do que duas valências são contemplados. Por exemplo, os anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al. J. Immunol 147: 60 (1991).

Imunoadesinas

[000174] O projeto de imunoadesina mais simples e mais constante combina o domínio de ligação da adesina (por exemplo, o domínio extracelular (ECD) de um receptor) com as regiões de dobradiça e Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Ordinariamente, quando se prepara as imunoadesinas da presente invenção, o ácido nucléico que codifica o domínio de ligação da adesina será fundido no C-terminal ao ácido nucléico que codifica o N-terminal de uma seqüência de domínio constante da imunoglobulina, no entanto, as fusões N-terminais também são possíveis.

[000175] Tipicamente, em tais fusões o polipeptídeo quimérico codificado irá reter pelo menos funcionalmente os domínios CH2 e CH3 de a dobradiça ativa da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões também são preparadas para o C-terminal da parte Fc de um domínio constante, ou imediatamente o N-terminal para a CH1 da cadeia pesada ou a região correspondente da cadeia leve. O local preciso em que a fusão é feita não é crítico; os locais particulares são bem conhecidos e podem ser selecionados de modo a otimizar a atividade biológica, secreção ou características de ligação da imunoadesina.

[000176] Em algumas formas de realização, a seqüência de adesina é fundida no N-terminal do domínio Fc da imunoglobulina G1 (Ig G1). É possível fundir a região constante de cadeia pesada inteira na seqüência de adesina. No entanto, de preferência, uma seqüência que começa na região de dobradiça exatamente a montante do sítio de clivagem da papaína que define IgG Fc quimicamente (isto é, o resíduo 216, tomando o primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada para ser 114), ou sítios análogos de outras imunoglobulinas são usados na fusão. Em algumas formas de realização, a seqüência de aminoácido de adesina é fundida com (a) a região da dobradiça e ou CH2 e CH3 ou (b) a CH1, dobradiça, domínios CH2 e CH3, de uma cadeia pesada de IgG.

[000177] Para imunoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas são montadas como multímeros, e particularmente como heterodímeros ou heterotetrâmeros. Geralmente, estas imunoglobulinas montadas terão estruturas unitárias conhecidas. Uma unidade estrutural de quatro cadeias básica é a forma em que is IgG, IgD e IgE existem. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de peso molecular mais elevado; o IgM geralmente existe como um pentâmero de quatro unidades básicas mantidas juntas por ligações de dissulfeto. A globulina IgA, e ocasionalmente a globulina IgG, podem também existir na forma multimérica no soro. No caso de multímero, cada uma das quatro unidades pode ser a mesma ou diferente.

[000178] Várias imunoadesinas montadas exemplares dentro do escopo deste documento são esquematicamente diagramadas abaixo: (a) ACL-ACL; (b) ACH-(ACH, ACL-ACH , ACL-VHCH, ou VLCL-ACH); (c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, ou VLCL- VHCH) (d) ACL-VHCH -(ACH, ou ACL-VHCH, ou VLCL-ACH); (e) VLCL- ACH -(ACL-VH Ch, ou VLCL-ACH); e (f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2, (g) que cada A representa as seqüências de aminoácidos de adesina idênticas ou diferentes; VL é um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH é um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH imunoglobulina; é um domínio constante de cadeia pesada de n é um número inteiro maior do que 1; Y designa o resíduo de um agente de reticulação covalente.

[000179] Em benefício da brevidade, as estruturas anteriores só mostram as características chaves; eles não indicam a união (J) ou outros domínios das imunoglobulinas, nem são ligações de dissulfeto mostradas. No entanto, onde tais domínios são requeridos para a atividade de ligação, eles devem ser construídos de modo a estarem presentes nas localizações normais que ocupam nas moléculas de imunoglobulina.

[000180] Alternativamente, as seqüências de adesina podem ser inseridas entre a cadeia pesada de imunoglobulina e as seqüências de cadeia leve, de tal modo que uma imunoglobulina compreendendo uma cadeia pesada quimérica é obtida. Nesta forma de realização, as seqüências de adesinas são fundidas na extremidade 3’ de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada ramo de uma imunoglobulina, entre a dobradiça e o domínio CH2, ou entre os domínios CH2 e CH3. Construções semelhantes foram relatadas por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28: 1027-1037 (1991).

[000181] Embora a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina não seja requerida nas imunoadesinas da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina pode estar presente covalentemente associada a um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada de adesina- imunoglobulina, ou diretamente fundida com a adesina. No primeiro caso, o DNA que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina é tipicamente co-expresso com o DNA que codifica a proteína de fusão de cadeia pesada de adesina-imunoglobulina. Após a secreção, a cadeia pesada híbrida e a cadeia leve serão covalentemente associadas para fornecer uma estrutura como imunoglobulina compreendendo dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina ligada por dissulfeto. Os métodos adequados para a preparação de tais estruturas são, por exemplo, divulgados na Patente US no 4.816.567, publicada em 28 de março de 1989.

[000182] As imunoadesinas são mais convenientemente construídas pela fusão da seqüência de cDNA que codifica a parte na estrutura em uma seqüência de cDNA de imunoglobulina. No entanto, a fusão de fragmentos de imunoglobulina genômicos também pode ser utilizada (ver, por exemplo, Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 (1990); e Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)). O último tipo de fusão requer a presença de seqüências reguladoras de Ig para a expressão. Os cDNAs que codificam as regiões constantes de cadeia pesada de IgG podem ser isolados com base nas seqüências publicadas a partir de bibliotecas de cDNA derivadas de linfócitos de baço ou do sangue periférico, mediante a hibridação ou mediante as técnicas de reação de cadeia da polimerase (PCR). Os cDNAs que codificam a "adesina" e as partes de imunoglobulina da imunoadesina são inseridos em tandem em um vetor de plasmídeo que direciona a expressão eficiente nas células hospedeiras seleccionadas. Outros Polipeptídeos Contendo a Região CH2/CH3

[000183] O polipeptídeo a ser purificado é aquele que é fundido, ou conjugado com, uma região CH2/CH3. Tais polipeptídeos de fusão podem ser produzidos de modo a aumentar a meia-vida no soro da proteína e/ou facilitar a purificação da proteína por cromatografia de afinidade de Proteína A. Exemplos de proteínas biologicamente importantes que podem ser conjugadas desta maneira incluem renina; um hormônio do crescimento, incluindo hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; fator de liberação do hormônio de crescimento; hormônio da paratiróide; hormônio estimulante da tiróide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia de insulina A; cadeia de insulina B; proinsulina; hormônio de estimulação do folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coagulação tais como o fator VIIIc, fator IX, fator tecidual e fator de von Willebrands; fatores d e anti-coagulação tais como a Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante de pulmão; um ativador do plasminogênio, tal como urocinase ou urina humana ou ativador do plasminogênio tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator alfa e beta de necrose tumoral; encefalinase; RANTES (regulada sobre a célula T de ativação normal expressa e segregada); proteína inflamatória de macrófago humano (MIP-1-alfa); uma albumina de soro tal como albumina de soro humana;

[000184] substância inibidora de Muellerian; cadeia de relaxina A; cadeia de relaxina B; prorrelaxina; peptídeo associado com gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado ao linfócitos T citotóxico (CTLA), tal como CTLA-4; inibina, ativina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; Proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico tal como o fator neurotrófico derivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento tal como NGF-β; fator do crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastos tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ou TGF-β5; fator-I e -II de crescimento semelhante a insulina e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), s proteínas de ligação do fator de crescimento semelhante a insulina; proteínas CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon tal como interferon-a, -β, e - Y; fatores estimuladores de colônias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutase; receptores da célula T; proteínas da membrana de superfície; fator de aceleração da deterioração; antígeno viral tal como, por exemplo, uma parte do envelope da AIDS; proteínas de transporte; receptores residentes; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado ao tumor tal como o receptor EGFR, HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer dos polipeptídeos acima listados.

Expressão de Polipeptídeos

[000185] O polipeptídeo a ser purificado utilizando o método aqui descrito é geralmente produzido usando técnicas recombinantes. O polipeptídeo pode também ser produzido pela síntese de peptídeos (ou outros meios sintéticos) ou isolado a partir de uma fonte nativa.

[000186] Para a produção recombinante do polipeptídeo, o ácido nucléico que codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para outra clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o polipeptídeo é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, onde o polipeptídeo for um anticorpo mediante o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes do vetor incluem geralmente, mas não são limitados a estes, um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de terminação da transcrição (por exemplo, como descrito na Patente US no 5.534.615, especificamente aqui incorporada por referência).

[000187] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vectores aqui são as células procariotas, de levedura, ou eucarióticas superiores. As procariotas adequadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram- negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgada na DD 266.710 publicada em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitativos.

[000188] Além das procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos ou leveduras filamentosos são hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para os vetores de codificação de polipeptídeo. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padeiro comum, é o mais comumente utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas são aqui comumente disponíveis e úteis, tais como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070);

[000189] Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e Aspergillus hosts tais como A. nidulans e A. niger.

[000190] As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem as células vegetais e de insetos. Numerosas cepas e variantes de baculovirus foram identificadas e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para a transfecção são publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser utilizados aqui como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.

[000191] No entanto, interesse tem sido maior em células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem, mas não são limitados a estes, células de rim de macaco CV1 transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células do carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e células de hepatoma humano (Hep G2).

[000192] As células hospedeiras são transformadas com a expressão acima descrita ou vetores de clonagem para a produção de polipeptídeo e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

[000193] As células hospedeiras utilizadas para produzir o polipeptídeo utilizado nos métodos desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como Ham’s F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. l02:255 (1980), Patentes US nos 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente US no Re. 30.985, pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o medicamento GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos nas concentrações apropriadas que devem ser conhecidas daqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e outros mais, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para o artífice comumente versado.

[000194] Quando se usa as técnicas recombinantes, o polipeptídeo pode ser produzido de modo intracelular, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado para dentro do meio. Se o polipeptídeo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, células hospedeiras ou células lisadas (por exemplo, resultantes da homogeneização), são removidas, por exemplo, pela centrifugação ou ultrafiltração. Onde o polipeptídeo for secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente em primeiro lugar concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon.

Composições Incluindo Formulações Farmacêuticas Compreendendo Polipeptídeos

[000195] A invenção também inclui composições, tais como formulações farmacêuticas. Uma formulação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo purificado pelos métodos da presente invenção, opcionalmente conjugado com uma molécula heteróloga, pode ser preparada pela mistura do polipeptídeo tendo o grau desejado de pureza com portadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences 21st edition (2005)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

[000196] O produto de polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3 purificada pelos métodos aqui descritos pode ter o grau desejado de pureza de pelo menos cerca de 98 % de monômero ou pelo menos cerca de 99 % monômero.

[000197] Os portadores, excipientes ou estabilizantes "farmaceuticamente aceitáveis" são não tóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; ressorcinol;

[000198] cicloexanol; 3-pentanol, e m-cresol); polipeptídeo de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn- proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[000199] Aqui a formulação também pode conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam negativamente entre si. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[000200] Os ingredientes ativos também podem ser capturados em microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de medicamento coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington’s Pharmaceutical Sciences 21st edition (2005).

[000201] A formulação a ser usada para administração in vivo deve ser estéril. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[000202] As preparações de liberação controlada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo a variante de polipeptídeo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil- metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente US no 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e Y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico- ácido glicólico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico.

[000203] O polipeptídeo purificado como aqui divulgado ou a composição compreendendo o polipeptídeo e um portador farmaceuticamente aceitável é então utilizado para vários usos de diagnóstico, terapêutico ou outros conhecidos para tais polipeptídeos e composições. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser usado para tratar um distúrbio em um mamífero mediante a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo ao mamífero.

[000204] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção.

EXEMPLOS

[000205] Entende-se que os exemplos e formas de realização aqui descritas são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações na sua compreensão serão sugeridas para as pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e campo de ação deste pedido. Exemplo 1: Cromatografia da Proteína A de Eluição Gradiente do pH

[000206] Seis diferentes proteínas contendo as regiões CH2/CH3, anticorpo anti-VEGF #1, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-VEGF #2, anticorpo anti-MUC16, anticorpo anti-CD4, e um anticorpo anti-Met ramificado foram purificadas utilizando um método de eluição gradiente da etapa de pH. O método é descrito na Tabela 1. Tabela 1

Procedimentos Experimentais

[000207] Um arquivo do método Unicorn foi construído usando os parâmetros de carga de proteína e composição de tampão / pH como listados na Tabela 1. Este arquivo foi executado por um sistema GE Healthcare AKTA (GE Healthcare) Explorer FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida). A FPLC foi um instrumento em escala de bancada produzido de tubos e bombas de plástico que simularam um processo de purificação de fabricação. A FPLC produziu uma fase de "gradiente do pH" mediante a mistura de dois tampões em uma proporção de alteração programada mediante o uso de um sistema de duas bombas (bomba A e bomba B) onde a taxa de fluxo foi mantida e o percentual do fluxo de cada uma das bombas entregue alterado. Foi designado no programa Unicorn um "%B" em outro através de um determinado volume (número de volumes de coluna).

[000208] Na fase de equilíbrio da coluna, a coluna foi retirada da solução de armazenamento como listado na Tabela 1 e preparada para carregar os materiais protéicos. Na fase de carregamento de proteína, o HCCF (fluido de cultura celular colhida) foi pré-filtrado usando um filtro de vácuo de tamanho de poro de 0,2 mícron e foi carregado na coluna de Proteína A (MABSELECT™, MABSELECT SURE™, POROS® MABCAPTURE™ A, PROSEP® Va, ou PROSEP® Ultra Plus). As proteínas foram carregadas em uma densidade na faixa de 14 a 37 g/L. A maioria das operações foi realizada em 21 g/L. Na fase de Lavagem 1, o tampão de Lavagem 1 foi usado para empurrar qualquer carga deixada nas linhas de Akta na coluna. Na fase de Lavagem 2, impurezas tais como CHOP (Proteína Ovário de Hamster Chinês) foram removida pelo tampão de Lavagem 2. Na fase de Lavagem 3, o tampão de Lavagem 3 foi usado para remover o tampão de Lavagem 2 e as impurezas associadas da coluna para a preparação da fase de eluição. Na fase de eluição gradiente da etapa do pH, um gradiente formado pela manipulação precisa de dois tampões de pH de diferentes pHs por um sistema de duas bombas foi utilizado para gradualmente mover de uma mistura de pH dos dois tampões para outra mistura, definida em porcentagens. O parâmetro de eluição de "35-60 %B" se correlaciona com uma faixa de gradiente de pH de cerca de 4,3 a 3,7. Mais especificamente, 35 %B corresponde ao pH do tampão de eluição de 4,34, composição de tampão de 16,25 mM acetato, 8,75 mM formiato, e condutividade de tampão de 1039 uS/cm. 60 %B corresponde a um pH de tampão de eluição de 3,69, composição de tampão de 10 mM acetato e 15 mm formiato, e condutividade de tampão de 763 uS/cm. Durante esta fase de eluição da maior parte das operações, as frações foram tomadas ao longo da eluição e avaliadas utilizando um ensaio de HPLC de exclusão de tamanho para determinar os comportamentos de eluição do monômero versus variante de tamanho (HMWS (Espécie de Peso Molecular Elevado), dímero, ou fragmento). Estas frações foram também submetidas a um ensaio de CHOP para a operação selecionada, e todas as frações foram medidas com relação a concentração de proteína utilizando um espectrofotômetro NanoDrop UV (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE). Na fase de regeneração, tampão regeneração foi usado para extrair por lavagem quaisquer impurezas firmemente ligadas ou produto de sobra para minimizar a transição entre as operações. Na fase de armazenamento, a coluna de Proteína A foi removida do tampão de regeneração e armazenada em uma solução que foi designada para manter a integridade da coluna ao longo do tempo em desuso.

[000209] Os comprimentos de fase e taxas de fluxo foram medidos em CVs e centímetros por hora, respectivamente. A taxa de fluxo foi dimensionada por centímetros por hora (dividir a taxa de fluxo em cm/h pela altura do leito da coluna em cm para atingir os volumes de coluna por hora, também uma unidade padrão), devido às preocupações de pressão.

[000210] Cromatogramas foram coletados e analisados pelo sistema de purificação AKTA (GE Healthcare) FPLC e seu pacote de software Unicorn associado. Após a operação de purificação da coluna A ter sido executada, os traços de absorvência de UV, pH e condutividade (assim como outros valores medidos ou instruções de programa/livro de registro) foram acessados e examinados.

a. Ensaio de Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC)

[000211] Um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho analítica (SEC) foi executado em uma Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies, USA, part G1329A) e usado para determinar os níveis relativos de espécies de peso molecular elevado (HMWS), dímero, monômero e fragmento para as amostras coletadas. Uma coluna de 14,24 ml TSK G3000SWXL, 7,8 mmD x 300 mmH (Tosoh Bioscience, Tokyo, Japan, part 08541) foi usada. Cada amostra foi diluída em aproximadamente 0,5 g/l de anticorpo utilizando o tampão de operação de HPLC de fosfato de potássio / cloreto de potássio ou injeções de amostra foram modificadas para padronizar a massa carregada na coluna de ensaio. Todas as amostras foram preparadas em frascos de vidro de 1,5 ml Agilent HPLC. As operações foram de 30 minutos com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. As injeções de amostra foram ajustadas de modo que aproximadamente 25 ng de anticorpo fossem carregados por amostra. Esboços contendo tampões de experiência das respectivas amostras foram operados com cada conjunto de amostras. As curvas de absorvência UV 280 nm foram analisadas manualmente usando ChemStation (Agilent Technologies) ou automaticamente usando software CHROMELEON® (DIONEX, Sunnyvale, CA) para integrar os picos separadamente para se obter os valores percentuais de espécies para as amostras. Os valores percentuais obtidos neste ensaio podem ser multiplicados pela concentração (mg/ml) da fração para obter um concentração real ou massa para cada espécie variante de tamanho na amostra (por exemplo, resultado SEC: 4 % HMWS, 3 % dímero, 92 % monômero, 1 % fragmento; concentração de amostra: 2 g/L; volume da amostra: 10 ml; 1,84 g/L de monômero, 18,4 mg de monômero total na amostra).

b. Ensaio CHOP

[000212] As amostras de operações selecionadas foram submetidas a um grupo de ensaio que executou um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) padrão e validado para quantificar os níveis de CHOP. Os anticorpos anti-CHOP de cabra purificados por afinidade foram imobilizados em reservatórios de placa de microtitulação. As diluições das amostras contendo CHOP, padrões e controles, foram incubadas nos reservatórios, seguido pela incubação com anticorpos anti-CHOP de cabra conjugados com peroxidase de rábano. A atividade enzimática de peroxidase de rábano foi detectada com dicloridreto de o-fenilenodiamina. O CHOP foi quantificado pela leitura da absorvência em 492 nm em uma leitora de placas de microtitulação. Um programa de computador de ajuste da curva foi utilizado para gerar a curva padrão e automaticamente calcular a concentração da amostra. A faixa de ensaio para o ELISA era tipicamente de 5 ng/ml a 320 ng/ml. Os resultados foram padronizados em ppm para comparações em conjunto.

Resultados

[000213] A forma de eluição de um gradiente de etapa é mostrada na Figura 1. Todas as proteínas foram eluídas até ao final do declínio de pH. Uma porção maior das proteínas foram eluídas da coluna mais rapidamente, mas bastante proteína permaneceu na coluna e foram eluídas durante o gradiente. No pH mais baixo, a separação entre o produto desejado (faixa de eluição ao redor do pH 4,6 a 3,7 com ligeira variação de molécula para molécula) e o agregado indesejável (faixa de eluição ao redor do pH 3,9 a 3,5) ocorreu.

[000214] Em todas as seis moléculas de proteína testadas (anticorpo anti-VEGF #1, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-VEGF #2, anticorpo anti-MUC16, anticorpo anti-CD4, e um anticorpo anti-Met de uma ramificação), alta porcentagens (~ 100 %) de monômero foram observadas nas frações gradientes iniciais e a parte final residual do gradiente continha níveis muito mais elevados de espécies agregadas (> 50 %). Estes resultados de SEC são mostrados nas Figuras 2-4B. Visto que esta série de moléculas testadas abrange as classes maiores de moléculas de proteína (por exemplo, anticorpos quiméricos, thioMabs (anticorpos monoclonais recombinante tendo uma mutação pontual mediante a substituição de um resíduo de aminoácido com cisteína), IgG4s, e fragmentos de anticorpo produzidos pela E. coli), este método de gradiente de etapa do pH sugere ampla aplicabilidade para todos os polipeptídeos/proteínas contendo a região CH2/CH3 (por exemplo, região Fc). Exemplo 2: Separação CHOP para o anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-VEGF #1, e anticorpo anti-MUC16 sobre uma coluna de cromatografia de Proteína A utilizando uma eluição por etapas padrão e uma eluição gradiente da etapa do pH

[000215] Utilizando o método de proteína de eluição gradiente da etapa do pH como descrito no Exemplo 1, os níveis de anticorpo anti- CD20 por fração em mg/ml (a partir da absorvência UV 280 fora de linha da parte superior da bancada, que rastreou com as leituras de AKTA/Unicorn UV 280 em linha para a fase de eluição gradiente da etapa como visto no cromatograma de anticorpo anti-VEGF #1 na Figura 1A) e os níveis CHOP por fração em ppm foram medidos. Como se vê no painel da esquerda da Figura 5 (anticorpo anti-CD20 e eluição CHOP), as frações posteriores em pH mais baixo da eluição gradiente da etapa do H continham muito pouco anticorpo anti-CD20 em comparação com a quantidade de CHOP. Os dados da operação de controle feita ao mesmo tempo como a eluição de pH gradiente da etapa de anticorpo anti-CD20 são mostrados na linha superior da tabela na Figura 5. A operação de controle foi utilizando as mesmas condições como descritas na Tabela 1, exceto que nenhum gradiente da etapa de pH foi utilizado durante a fase de eluição da proteína, e a proteína foi eluída no pH 3,6 ou abaixo. A linha da parte inferior mostra uma pequena, mas aceitável, diminuição no rendimento de anticorpo anti-CD20 utilizando o gradiente da etapa do pH, (observação: esta perda de rendimento devido à remoção de agregado é esperada; o rendimento é calculado usando o valor de titulação de HCCF que inclui agregados na quantidade total de produto carregado sobre a coluna). Cerca de 5 % menos agregados e metade dos níveis de CHOP foram observados em comparação com o conjunto de controlo. Os resultados estabelecem um benefício inesperado de pureza aumentada utilizando a eluição gradiente da etapa de pH.

[000216] As separações CHOP, tanto para o anticorpo anti-VEGF #1 quanto para o anticorpo anti-MUC16 também foram executadas usando o método de gradiente da etapa de pH descrito no Exemplo 1. Semelhante ao padrão observado no gráfico de CHOP de anticorpo anti-CD20, mais CHOP foi eluído no final do gradiente de pH na proporção para a eluição do anticorpo anti-VEGF, indicando que a eluição gradiente da etapa de pH separou as impurezas da célula hospedeira para esta molécula de proteína, assim como o anticorpo anti-CD20. Ver a Figura 6. Para a separação CHOP no anticorpo anti- MUC16, este anticorpo tinha níveis de CHOP muito mais elevados em comparação com o padrão de eluição observado no anticorpo anti- VEGF #l. Ver a Figura 7. Conseqüentemente, uma quantidade significativa de CHOP pode ser fraccionada a partir do anticorpo anti- MUC16 mediante o uso do método de gradiente da etapa de pH como descrito acima. Exemplo 3: A depuração de partículas de vírus usando a cromatografia de proteína A de eluição gradiente do pH

[000217] Utilizando o método de cromatografia de proteína A de eluição gradiente do pH como descrito no Exemplo 1, a depuração da partícula de vírus do anticorpo anti-VEGF #1 foi medida.

Cromatografia de proteína A de eluição do pH gradiente da etapa

[000218] Todas as fases e tampões foram os mesmos como aqueles utilizados no Exemplo 1. As frações foram testadas com relação às contagens de partícula semelhante a retrovírus utilizando um ensaio de reação da cadeia polimerase quantitativa.

a. Ensaio de Reação da Cadeia Polimerase Quantitativa de Partícula semelhante ao Retrovirus (RVLP QPCR)

[000219] O ensaio de partícula de vírus endógeno RVLP é um ensaio de PCR quantitativo em tempo real. O RNA viral foi extraído das amostras usando Qiagen EZ1 (Qiagen, Valencia, CA). Os tamanhos de amostra foram de 0,4 ml (não diluída e diluída 1:10 HCCF, conjunto de proteína A não diluída). A eficiência de extração foi confirmada através da inclusão de uma amostra de HCCF padrão de referência com um título de partícula de retrovírus de CHO conhecido. O DNA genômico foi removido pelas digestões ADNase mediante o tratamento do eluato de extração com 0,2 unidade/ml de DNase I a uma temperatura elevada durante 30 min. A DNase foi então inativada pelo calor a 70°C durante 15 min. A ausência de DNA retroviral foi confirmada mediante a análise das amostras sem transcriptase inversa.

[000220] Os ensaios de PCR quantitativos em tempo real para medir os genomas de retrovírus de CHO foram executados como descrito no De Wit et al. (Biologicals, 28(3): 137-48 (2000)), mas com a utilização de uma nova sonda na região próxima. Os reagentes e procedimentos também foram atualizados e melhorados. Os iniciadores e as seqüências de sonda foram designados para amplificar um fragmento na região pol altamente conservada do genoma de retrovírus tipo C de CHO. Cada partícula semelhante a retrovírus contém duas moléculas de RNA genômico. Sondas de oligonucleotídeos e iniciadores foram ordenados da Applied Biosystems (Foster City, CA) e Invitrogen (Carlsbad, CA). A depuração viral foi expressa como valor de redução log 10, ou LRV, que é a diferença de log 10 (vírus total) na carga de proteína (HCCF) e no conjunto do produto. O vírus total foi obtido a partir de títulos de vírus (partículas/ml ou nU/ml) nas amostras e volume de amostra (ml). A Figura 18 mostra a contagem de partícula semelhante a vírus endógeno para cada fração tomada da eluição gradiente da etapa de pH. Alguns vírus eluídos no início do gradiente no pico maior, mas uma porção maior do vírus eluiu no final do resíduo da eluição. Conseqüentemente, a separação destes RVLPs de produto pode beneficiar o gradiente da etapa de pH ou cromatografia de Proteína A de eluição gradiente total de eficiência global em termos de depuração viral. A Figura 19 mostra o LRV para cada fração em comparação com a carga de HCCF. O gráfico foi baseado em um cálculo usando os valores da Figura 18. Uma grande diminuição no LRV foi observada nas frações de eluição ricas em agregado posteriormente. O LRV foi elevado (efeito desejável) na eluição mediana, frações monoméricas de polipeptídeo mais elevadas. Exemplo 4: Depuração de variantes de polipeptídeo básico utilizando a cromatografia de proteína A de eluição gradiente de pH

[000221] Usando o método de cromatografia de proteína A de eluição gradiente da etapa de pH como descrito no Exemplo 1, a depuração de variantes de polipeptídeo básico (ou variantes básicas) de anticorpo anti-VEGF #1 foi medida.

Cromatografia de proteína A de eluição de pH gradiente da etapa

[000222] Todas as fases e tampões foram os mesmos como aqueles utilizados no Exemplo 1. As frações foram submetidas ao ensaio de variante de troca iônica.

a. Ensaio de Variante de Troca Iônica

[000223] Um ensaio de cromatografia de troca iônica analítica (IEC) foi executado em uma Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies, USA, part G1329A) e utilizado para determinar os níveis relativos de pico principal de variantes carregadas acídicas e básicas para amostras de anticorpo anti-VEGF #1 coletadas. Uma coluna Dionex ProPac WCX-10, 4,6 x 250 mm (Dionex product no. 054993) foi utilizada com um gradiente de ACES [ácido N-(2-acetamido)-2- aminoetanossulfônico] e NaCl sob condições de temperatura elevada. A preparação da amostra incluiu amostras de troca de tampão na fase móvel IEC antes de uma digestão aquecida de 20 minutos com Carboxipeptidase (CpB). Aproximadamente 50 ug de anticorpo anti- VEGF #1 foram injetados na coluna por amostra. Traços de UV 280 nm foram obtidos e integrados utilizando o software ChemStation (Agilent Technologies). As porcentagens de integração para cada categoria de espécies acídicas, básicas e de pico principal foram analisadas com relação às tendências de composição variante de troca iônica através do gradiente. A Figura 17 mostra o resultado da integração de pico de ensaio de variante de troca iônica através de 20 frações de eluição gradiente da etapa de pH da Proteína A. A porcentagem de variantes básicas presentes nas frações aumenta dramaticamente na parte residual da eluição gradiente da etapa de pH de Proteína A. Esta parte residual da eluição gradiente é a mesma parte onde o CHOP aumentado e a separação de agregação foram observadas, como descrito nos Exemplos 1 e 2. Exemplo 5: Eluição gradiente da etapa de pH usando múltiplas colunas de cromatografia de Proteína A

[000224] As resinas tanto MABSELECT SURE™ quanto MABSELECT™ foram testadas com relação ao método de eluição gradiente da etapa de pH como descrito acima. Estas duas resinas de Proteína A, embora semelhante no nome, possuem diferentes ligantes de afinidade incorporados. A MABSELECT™ carrega o ligante de Proteína A nativa, que se liga nas partes de Fc dos anticorpos. A MABSELECT SURE™ carrega uma forma modificada de Proteína A que foi quimicamente alterada para ser estável em soluções de pH elevado para quantidades curtas de tempo. Os perfis de eluição Akta encobertos mostram que os traços de eluição são extremamente semelhantes para as resinas de duas Proteínas A. Como pode ser visto pelo perfil de integração SEC para MabSelect na Figura 8, a separação de agregado comparável foi alcançada utilizando esta resina. Outras resinas testadas com sucesso para a separação de agregados foram PROSEP® Va, PROSEP® Ultra Plus, e POROS® MABCAPTURE™ A. Conseqüentemente, várias resinas de afinidade (por exemplo, MABSELECT™, MABSELECT SUERE™, PROSEP® Va, PROSEP® Ultra Plus, and POROS® MABCAPTURE™) podem ser usadas no método de eluição gradiente da etapa de pH para impurezas fracionadas. Exemplo 6: Projeto de experimentos (DOE) usando vários parâmetros para o método de eluição gradiente de pH

[000225] Vários parâmetros que são importantes na maioria dos processos de cromatografia foram explorados com relação ao anticorpo anti-VEGF #1 utilizando um estudo de operação 35 estatisticamente projetado dentro das faixas indicadas na Tabela 2. O parâmetro de "eluição inicial %B" afeta o pH de partida da fase de eluição (que desempenha um papel importante na determinação da forma da curva de eluição. Quanto mais elevado o %B de partida, tanto mais baixo o pH de eluição de partida, tanto mais a proteína eluída da coluna nas primeiras frações), assim como a inclinação do gradiente global. Os parâmetros foram variados simultaneamente em um estudo fatorial fracionado designado para elucidar os efeitos principais assim como as interações. Todas as operações foram fracionadas durante a eluição, e o agregado e a concentração foram avaliados para todas as frações. Um cálculo inserido foi utilizado para determinar os níveis de monômero de conjunto simulado que deve resultar em exatamente 85 % de rendimento (o limite mais baixa do alvo de rendimento da etapa) e estes valores foram usados para comparar a eficácia de cada série de parâmetros de operação na separação de monômero a partir de agregado de forma eficiente. Tabela 2 - Faixas de Parâmetro DOE

* Todas as eluições terminaram em 60%B (pH 3,7)

Procedimentos Experimentais

[000226] Todas mudanças de parâmetro com exceção da altura de leito da coluna (que requer o acondicionamento de várias colunas) foram examinadas utilizando o software Unicorn. As frações CV foram tomadas ao longo de todas as eluições, avaliadas usando o HPLC SEC (como descrito acima), e medidas com relação à concentração de proteína (absorvência de UV 280 como medida em um espectrofotômetro NanoDrop UV). A fim de melhor padronizar os resultados para comparação, os dados de várias séries de frações foram compilados e um cálculo foi utilizado para interpolar o rendimento global e o perfil SEC de um conjunto de cada uma das operações.

[000227] O pacote de software JMP® (SAS, Cary, NC) foi empregado para gerar um plano de operação de exploração do parâmetro fatorial fracionário. Uma das operações foi selecionada como a "operação de fabricação exemplar" da série devido ao seu elevado rendimento, nível de monômero elevado, e tamanho do conjunto baixo (Figura 11).

Resultados

[000228] O gráfico Pareto dos resultados DOE mostra que o "% B de partida" é o parâmetro mais influente na determinação da separação de agregado, seguido pela densidade de carga (mais baixa é melhor) e tempo de permanência (o tempo de permanência foi calculado pela divisão dos parâmetros controlados da altura de leito (cm/CV) pela taxa de fluxo (cm/h) para h/CV. Conseqüentemente, quanto mais baixo o % B de partida, tanto mais elevado o pH de partida de eluição, e tanto mais eficiente a separação de agregados; quando mais baixa a densidade da carga, tanto mais eficiente a separação de agregados; e quanto mais elevado o tempo de permanência, tanto mais eficiente a separação do agregado. Ver a Figura 9. Além disso, os perfis de interação deste estudo mostram que houve uma interação entre os parâmetros de densidade de carga e B% de partida, assim como uma interação entre o tempo de permanência e a densidade de carga. Nas densidades de carga aumentadas, o % B de partida teve um maior efeito sobre os níveis de monômero de conjuntos simulados com 85 % de rendimento do que se a operação fosse feita em densidades de carga mais baixas. Além disso, na densidade de carga aumentada, o tempo de permanência desempenhou um papel muito maior na capacidade do gradiente em fracionar os agregados de forma mais eficiente. Uma taxa mais baixa pode ser usada durante a eluição para se alcançar um rendimento elevado de produto com o método de gradiente da etapa de pH. Ver a Figura 10. A Figura 11 mostra que o conjunto desta operação foi mais baixa que 10 CVs (por exemplo, 5,4 CV ou 6 CV) enquanto libera menos do que 1 % de agregado com mais do que 85 % de rendimento.

[000229] Além dos efeitos principais (gráfico Pareto na Figura 9), interações (Figura 10), e operação de fabricação exemplar (Figura 11), observou-se que o comprimento de eluição global não teve nenhum efeito sobre a separação de agregados, mas pode ser manipulado para diminuir o tamanho do conjunto para resultar em um conjunto que possui alta pureza e rendimento elevado, mas em um menor volume (o que é preferível para a escala de fabricação). Da mesma forma, a utilização do gradiente da etapa de pH resultou em volumes menores de conjunto com pureza quase comparável àquela dada pelo gradiente completo (ver o Exemplo 8). O gradiente da etapa de pH também foi observado de ser robusto em várias mudanças de processo, incluindo menores mudanças na densidade de carga e taxa de fluxo, assim como não sendo completamente afetado pela altura do leito. Exemplo 7: Purificação de proteína usando a cromatografia de membrana de troca iônica seguindo a cromatografia de Proteína A de gradiente da etapa de pH

[000230] Para determinar se as cromatografias de coluna a jusante podem ser eliminadas do processo de purificação ou substituídas com membranas, o ciclo em escala de bancada do gradiente da etapa de pH de Proteína A sobre o anticorpo anti-VEGF #1 (com um conjunto de menos do que 1 % de agregado e um alto rendimento) foi carregado a jusante das membranas carregadas. As membranas MUSTANG® S (Pall Corporation) e MUSTANG® Q (Pall Corporation) representam uma membrana de troca catiônica e uma membrana de troca aniônica, respectivamente. O sucesso foi medido pela capacidade das membranas em alcançar as mesmas purezas e rendimentos globais em comparação com o processo típico de coluna a jusante.

Procedimentos Experimentais

[000231] Os parâmetros utilizados para a determinação de condicionamento de carga ideal para CHOP e a depuração de agregado sobre as membranas S e/ou Q foram tomados dos estudos anteriores sobre o condicionamento de carga ideal para a depuração CHOP sobre a membrana S e/ou Q utilizando um conjunto de etapa padrão da Proteína A nas Tabelas 3A e 3B. Nestes estudos anteriores, os resultados promissores foram mostrados quando um conjunto de etapa padrão da Proteína A foi utilizado (grupo de controlo, não utilizando nenhum gradiente de pH e eluição da proteína em pH 3,6 ou abaixo); no entanto, este processo tinha níveis CHOP ligeiramente mais elevados do que o desejável e não limpou quaisquer agregados do processo. Nestes estudos anteriores, as membranas foram carregadas em 5 kg/L de membrana e as condições de carga ideais foram observadas com relação a remoção de impurezas. Estas mesmas condições foram utilizadas para o conjunto de eluição gradiente da etapa de Proteína A para se comparar o desempenho dos conjuntos de Proteína A diferentes sobre estas membranas com as impurezas primárias orientadas como CHOP e agregado. Tabela 3A: Parâmetros anteriores para a determinação do condicionamento de carga ideal para a depuração CHOP sobre as membranas S ou Q

Tabela 3B: Parâmetros anteriores para determinar se a depuração impureza ortogonal pode ser alcançada através da operação de membranas S e Q em série.

[000232] Nos estudos iniciais, os conjuntos de eluição por etapas padrão de Proteína A foram condicionados a pHs e condutividades específicos e passaram através de unidades de membrana de troca catiônica (MUSTANG® S) e aniônica (MUSTANG Q) em escala de laboratório que foram conectadas ao sistema de purificação AKTA™ FPLC. As taxas de fluxo foram mantidas e traços de pressão foram examinados quanto a evidência de incrustação/deterioração da permeabilidade. As frações foram tomadas em várias densidades de carga e avaliadas quanto à CHOP (ELISA) e as concentrações de anticorpos (absorvência UV 280 no espectrofotômetro NanoDrop UV). Os resultados destes ensaios foram comparados em várias densidades de carga para encontrar as condições ideais de carga para a depuração de CHOP final. Nos estudos posteriores, o conjunto de eluição gradiente da etapa de pH da Proteína A foi condicionado como ideal observado nos estudos iniciais. A partir disso, o desempenho do conjunto de eluição gradiente da etapa foi comparado com aquele da eluição por etapas de proteína A padrão na capacidade das membranas a jusante na limpeza de CHOP e outras impurezas, enquanto mantém alto rendimento e baixos níveis de agregação. Dois tamanhos de membrana de troca catiónica e três tamanhos de membrana de troca aniônica também foram utilizados para testar a capacidade de reprodução e representação em escala dos resultados. Resultados

[000233] Quando o conjunto de etapas de Proteína A foi usado como a carga para uma série de purificação de membrana de troca catiônica para aniônica, os níveis de CHOP mais baixos obtidos foram de 15 a 20 ppm para membranas carregados com 5 kg/L de membrana. Visto que as membranas não limparam o agregado, os níveis desta impureza foram inaceitavelmente elevados nos conjuntos finais. Ao contrário, quando o conjunto de eluição de gradiente da etapa de pH da proteína A foi carregado nestas mesmas membranas, os níveis de CHOP foram de 0 a 15 ppm e os níveis de agregados foram ainda baixos nos conjuntos finais, mostrando um benefício para o processo global.

[000234] Além disso, os conjuntos finais de cada uma das três combinações de membranas de troca iônica testadas resultaram em conjuntos finais de alto rendimento e de alta pureza. Em todos os casos, os níveis de agregado permaneceram baixos através do ajuste de pH e processamento da membrana, e os níveis de CHOP também foram mais baixos do que aquele que foi observado nos estudos de controle anteriores, mostrando um benefício inesperado redução de CHOP para utilizar um conjunto de proteína A de agregado mais baixo como um alimento. Ver a Figura 12. Conseqüentemente, a utilização de membranas de cromatografia de troca iônica em lugar das colunas de cromatografia de troca iônica usuais elimina a necessidade de muitos tampões de cromatografia de coluna típicos e outros inconvenientes de consumo de hora/espaço de fabricação. Mais importante, visto que estas membranas carregadas foram utilizadas no modo de sobrecarga (isto é, a carga é passada através da membrana em uma densidade de carga elevada sem etapas de lavagem ou de eluição necessárias para gerar um conjunto altamente purificado), as membranas levam em conta um processo de purificação contínua a jusante da etapa de cromatografia de Proteína A gradiente do pH.

[000235] Os perfis de integração SEC entre a escala piloto (4,1 L) e a escala de bancada 28 mL também são mostrados de serem extremamente semelhantes, indicando que o gradiente da etapa de pH da Proteína A pode ser dimensionado com sucesso e que quaisquer resultados em pequena escala podem ser considerados indicativos de desempenho em maior escala. Ver a Figura 13. Estes resultados indicam um benefício inesperado de capacidade de reprodução e capacidade de representação em escala da cromatografia de Proteína A de eluição gradiente da etapa de pH. Exemplo 8: Operações de Filtro de Parvovirus com VIRESOLVE® Pro

A. Comparação da deterioração da permeabilidade com VIRESOLVE® Pro

[000236] O gradiente da etapa de pH de Proteína A foi comparado com a etapa padrão de Proteína A (grupo de controle, não usando nenhum gradiente de pH e eluição da proteína em pH 3,6 ou abaixo) em termos de facilitar um maior rendimento de massa sobre um filtro de parvovírus (VIRESOLVE® Pro, Millipore, Inc.). Um alimento de HCCF comum foi usado para executar tanto o gradiente da etapa de pH da Proteína A quanto o controle da etapa padrão da Proteína sobre o QSFF (fluxo Rápido de Q Sepharose (coluna de troca aniônica, GE Healthcare)) em um fluxo padrão através do modo antes da operação sobre o filtro de parvovírus VIRESOLVE® Pro. Várias condições de operação com VIRESOLVE® Pro foram testadas: 1) conjunto de eluição da etapa padrão de Proteína A com o pré-filtro estéril SHC em linha, 2) eluição da etapa padrão de Proteína A com um adsorvedor de membrana de troca catiônica (CEX) como um pré-filtro em linha, 3) o conjunto de gradiente da etapa de pH de Proteína A com o pré-filtro SHC (um filtro de grau estéril de 0,2 mícron não carregado), e 4) o conjunto de gradiente da etapa de pH de Proteína A com um adsorvente de membrana CEX como um pré-filtro em linha. Alguns conjuntos foram operados com repetição. O VIRESOLVE® Pro foi operado em uma configuração de filtração que utiliza uma série de bombas peristálticas, balanças, e sensores de pressão para informar os dados em uma planilha.

[000237] O conjunto de gradiente da etapa de pH com o filtro estéril SHC em linha executou de forma semelhante no conjunto de etapa com a membrana de troca catiônica, igualmente apresentando em torno de um aumento de seis vezes no possível rendimento de massa sobre o VIRESOLVE® Pro. Ver a Figura 14. Conseqüentemente, este resultado indica o benefício inesperado do gradiente da etapa de pH de proteína A na remoção de incrustações de filtro com VIRESOLVE® Pro sem o auxílio de um pré-filtro de membrana CEX. Adicionalmente, o desempenho de VIRESOLVE® Pro beneficiado pela combinação do adsorvedor de membrana CEX com o conjunto de gradiente da etapa de pH de Proteína A, resultando em uma melhora de 18 vezes aproximada inesperada no rendimento da massa potencial em comparação com a operação de conjunto de eluição por etapas padrão de Proteína com o SHC sobre o VIRESOLVE® Pro.

B. Experiências de CHOP e SEC com VIRESOLVE® Pro

[000238] As amostras foram tomadas em diferentes pontos durante as seqüências de operação com VIRESOLVE® Pro e analisadas para CHOP e SEC. A seqüência de etapa padrão de Proteína A com o SHC em linha teve níveis de CHOP bastante baixos, mas ainda continha agregados. Os níveis de agregado permaneceram baixo nas experiências de gradiente da etapa de pH de Proteína A através de diferentes etapas de processo e resultou em uma conjunto final com menos do que 1 % de agregado. Este resultado foi uma melhora significativa sobre o conjunto liberado pelo conjunto da etapa padrão. Além disso, os níveis de CHOP para os conjuntos SHC-VIRESOLVE® Pro de gradiente da etapa de pH foram comparáveis aos níveis na operação de etapa padrão com a membrana de troca catiônica. Os níveis foram ligeiramente mais baixos do que aqueles da etapa de padrão com o SHC. Ver as Tabelas 4A e 4B. Estes resultados mostram que não apenas o método de gradiente da etapa de pH produziu maior rendimento de massa em comparação com o conjunto da etapa padrão, mas também produziu pureza comparável ou melhor. Tabela 4ª

Tabela 4B

Exemplo 9: Eluição gradiente de pH total de Proteína A sobre a Proteína A

[000239] A eluição gradiente de pH total de Proteína A também foi testada. Todas as fases e tampões foram as mesmas como aquelas utilizadas no método de gradiente da etapa de pH como descrito no Exemplo 1, exceto que 35-60 %B como utilizado no gradiente da etapa de pH foi diminuído para 25-60 % no início do gradiente, o que resultou em um maior gradiente inicial do pH (partindo ao redor de pH 4,6 e terminando ao redor de pH 3,7). 25 %B corresponde ao pH do tampão de eluição de 4,58, composição tampão de 18,75 mM acetato e 6,25 mM formiato, e condutividade de tampão de 1141 uS/cm. 60 %B corresponde ao pH do tampão de eluição de 3,69, composição tampão de 10 mM acetato e 15 mM formiato, e condutividade de tampão de 763 uS/cm. Ver a Tabela 5. Tabela 5

[000240] A forma de eluição de um gradiente total é mostrada na Figura 15. Todos os produtos foram eluídos pelo fim do declínio do pH. O cromatograma para o gradiente de pH total é o mesmo em todas as fases como o gradiente da etapa de pH, exceto que a eluição do anticorpo começa em um pH mais elevado. A falta da ponta UV 280 elevada inicial no começo do gradiente resultou em frações de concentração mais baixas no início do gradiente, com mais proteína distribuída através do resto da fase de eluição. Isto levou em conta a maior separação das espécies que eluíram preferencialmente em pHs mais elevados do que o monômero. Assim, esta técnica pode ser igualmente eficaz na limpeza de impurezas que se separam do produto desejado com pHs inferiores (isto é, os agregados e as CHOPs separados utilizando o gradiente da etapa), com o único inconveniente como o volume de conjunto final em comparação com o gradiente da etapa de pH (concentrações de fração mais baixas no início do gradiente trasladam em uma necessidade de reunir mais frações em conjunto para alcançar um conjunto de simulação de um rendimento desejado). Os traços e integrações SEC para este gradiente total também demonstram a separação de agregados do monômero nos pHs mais baixos, sugerindo que os benefícios e a aplicabilidade do gradiente da etapa de pH podem ser estendidos a um gradiente total igualmente. Exemplo 10: Formação de agregados no Estudo de Proteína A

[000241] Para garantir que um agregado não fosse formado durante o pH baixo ou o final residual da eluição gradiente da etapa de pH e que a técnica de gradiente da etapa de pH da Proteína A de fato separou um monômero de um agregado, em vez de motivar a formação de um agregado, materiais purificados foram usados para mostrar que os níveis de agregado do alimento não foram aumentados pelo processamento sobre a Proteína A, com ou sem componentes HCCF. Ver a Tabela 6. Tabela 6

* ensaio de monômero SEC não utilizado em HCCF

Claims (18)

1. Método para purificar um polipeptídeo compreendendo uma região CH2/CH3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) ligar o polipeptídeo à Proteína A; e (b) eluir o polipeptídeo com um gradiente de pH começando em 5,0 ou menos usando um tampão de eluição, em que o tampão de eluição contém um tampão de pH elevado e um tampão de pH baixo e em que o gradiente de pH é formado através do ajuste de uma porcentagem de cada tampão de pH no tampão de eluição, em que o tampão de pH elevado apresenta pH 5,0 e o tampão de pH baixo apresenta pH 2,7, em que o gradiente de pH termina em 3,7, e em que um agregado, uma impureza de célula hospedeira, uma incrustação de filtro de vírus, uma partícula de vírus e uma partícula semelhante a vírus são removidas do polipeptídeo desejado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porcentagem de tampão de pH baixo começa em 35 %.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo em 35 % compreende 16,25 mM de acetato e 8,75 mM de formiato.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porcentagem de tampão de pH baixo começa em 25 %.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo em 25 % compreende 18,75 mM de acetato e 6,25 mM de formiato.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porcentagem de tampão de pH baixo começa em 40 %.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição contendo o tampão de pH baixo em 40 % compreende 15 mM de acetato e 10 mM de formiato.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH começa no pH 4,6.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a impureza de célula hospedeira é a Proteína de Ovário de Hamster Chinês (CHOP).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma variante de polipeptídeo básico é separada do polipeptídeo.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo multi-específico, ou um fragmento de anticorpo.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma imunoaderência.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo possui uma pureza de pelo menos 98 % de monômero.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que uma relação de uma impureza da célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 20 % mais baixa do que a relação em um polipeptídeo purificado por um método de eluição por etapas, em que o método de eluição por etapas compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um pH que começa em 3,6 ou abaixo.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que uma relação de uma impureza da célula hospedeira para o polipeptídeo purificado é de pelo menos cerca de 60 % mais baixa do que a relação em um polipeptídeo purificado por um método de eluição por etapas, em que o método de eluição por etapas compreende a ligação do polipeptídeo à Proteína A e eluição com um pH que começa em 3,6 ou abaixo.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo purificado é um monômero de polipeptídeo.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a purificação é um processo em escala de fabricação.

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