KR101949187B1 - 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터 - Google Patents

일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터 Download PDF

Info

Publication number
KR101949187B1
KR101949187B1 KR1020157001561A KR20157001561A KR101949187B1 KR 101949187 B1 KR101949187 B1 KR 101949187B1 KR 1020157001561 A KR1020157001561 A KR 1020157001561A KR 20157001561 A KR20157001561 A KR 20157001561A KR 101949187 B1 KR101949187 B1 KR 101949187B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
filter
feed
deep
filtration
purification
Prior art date
Application number
KR1020157001561A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150027229A (ko
Inventor
엔리펜 싱
콕션 쳉
Original Assignee
이엠디 밀리포어 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이엠디 밀리포어 코포레이션 filed Critical 이엠디 밀리포어 코포레이션
Publication of KR20150027229A publication Critical patent/KR20150027229A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101949187B1 publication Critical patent/KR101949187B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
    • B01D15/125—Pre-filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D29/00—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor
    • B01D29/01—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor with flat filtering elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D39/00—Filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D39/08—Filter cloth, i.e. woven, knitted or interlaced material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/001—Processes for the treatment of water whereby the filtration technique is of importance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/52—Treatment of water, waste water, or sewage by flocculation or precipitation of suspended impurities
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/10—Apparatus for enzymology or microbiology rotatably mounted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • C12M1/123—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means with flat plate filter elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2239/00—Aspects relating to filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D2239/02—Types of fibres, filaments or particles, self-supporting or supported materials
    • B01D2239/025—Types of fibres, filaments or particles, self-supporting or supported materials comprising nanofibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2239/00—Aspects relating to filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D2239/04—Additives and treatments of the filtering material
    • B01D2239/0414—Surface modifiers, e.g. comprising ion exchange groups
    • B01D2239/0428—Rendering the filter material hydrophobic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2239/00—Aspects relating to filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D2239/06—Filter cloth, e.g. knitted, woven non-woven; self-supported material
    • B01D2239/065—More than one layer present in the filtering material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/52—Treatment of water, waste water, or sewage by flocculation or precipitation of suspended impurities
    • C02F1/54—Treatment of water, waste water, or sewage by flocculation or precipitation of suspended impurities using organic material
    • C02F1/56—Macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/34—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from industrial activities not provided for in groups C02F2103/12 - C02F2103/32
    • C02F2103/343—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from industrial activities not provided for in groups C02F2103/12 - C02F2103/32 from the pharmaceutical industry, e.g. containing antibiotics

Abstract

일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도 일차 정화 심층 여과 장치를 이용하여 mAb, 포유류 세포 배양물, 또는 세균 세포 배양물과 같은 관심있는 표적 생체분자를 함유하는 화학적으로 처리된 응집된 공급물을 비롯한 공급물을 일차 정화하는 방법. 상기 일차 정화 심층 여과 장치는 다양한 기공 정도의 등급화된 다공성 층을 갖는 다공성 심층 필터를 함유한다. 상기 일차 정화 심층 여과 장치는 약 0.5 ㎛ 내지 200 ㎛의 입자 크기 분포를 갖는 응집된 세포 파쇄물 및 콜로이드성 미립자를 함유하는 화학적으로 처리된 응집된 공급물을 비롯한 유체 공급물을 약 10 리터/m2/hr 내지 약 100 리터/m2/hr 유량으로 여과한다. 이를 사용하고 제조하는 키트 및 방법도 또한 제공된다.

Description

일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터{IMPROVED DEPTH FILTERS FOR DISPOSABLE BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2011년 7월 8일 출원된 미국 가특허출원 번호 61/571,994호를 우선권 주장하며, 그 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 설명
발명의 분야
일반적으로, 본 발명은 공급물(feed)의 일차 정화(primary clarification)에 관한 것이다. 특정의 특수 실시양태에서, 본 발명은 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동(tangential flow) 정밀여과(microfiltration) 단계를 이용하지 않고도 일차 정화 심층 여과(depth filtration) 장치를 이용하는, 공급물, 공급물 스트림, 공급원료(feed stock), 세포 배양 브로쓰(broth) 등의 일차 정화 심층 여과 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 덩어리가 대형 응집물로 응집되어 있는, 화학적으로 처리된 공급물의 일차 정화 심층 여과 방법을 제공한다.
모노클로날 항체(monoclonal antibody: mAb)와 같은 단백질을 비롯한 약품 등급 생체분자 제조는 환자용의 고품질 제품을 제조하기 위하여 고안된 복수의 여과, 원심분리, 및 크로마토그래피 수법을 포함하는 복잡한 제조 방법이다. 세포 배양물 및 고-고형분 공급원료의 정화는 고 세포 밀도로 인하여 최신의 제조 뱃치 바이오리액터로부터 대량 부피의 수집물(<25,000 L) 및 후속 크로마토그래피 작업 이전에 일차 정화뿐만 아니라 이차 정화를 흔히 필요로 하는 힘든 작업일 수 있다. 이와 같이, 포유류 세포 및 mAb와 같은 세포 배양 수집물 및 고-고형분 공급원료의 제조 방법에 대한 수집 및 정화 계획은 과거 20여년에 걸쳐 실시된 다수의 진전과 평가의 결과물이다.
포유류 세포 배양물 및 mAb에 대한 수집 수법은 높은 수율(>95%)과 최소의 세포 파괴로 통상적으로 실시될 것으로 예상되고 있다. 생성물 분자 역가가 증가함에 따라서, 세포 덩어리는 더 커지고 또 더 많은 양의 생성물은 하류 정제 단계에 대한 도전을 초래한다. 더 높은 세포 밀도는 정화 및 멸균 여과 동안 어려움을 초래한다. 더 높은 생성물 농도는 일반적으로 불순물 하중 증가 및 대형 크로토그래피 설치의 필요성을 초래한다. 따라서, 효율 및 처리량(throughput)에서 이득 증대가 요청되고 있다.
증가하는 요구와 증대되는 치료성 mAb는 공업적 치료성 모노클로날 항체의 생산을 위한 생산, 품질, 가공 효율 및 비용 효과 증대를 향한 노력에 일조하고 있다. 지난 수십년간 생산 증가, 상류 세포 배양물 생산 역가에서 현저한 성장 및 불순물 및 오염물의 특징화에 있어서 공업적 진보를 목격하여 왔다.
mAb 및 포유류 세포 배양물 공급원료를 함유하는 것과 같은 고-고형분 공급물을 비롯한 공급물, 공급물 스트림, 공급원료, 세포 배양 브로쓰 등의 일차 정화는 다량의 바이오매스(biomass), 특히 전체 세포 및 기타 대형 세포 파쇄물을 제거한 다음 이차 정화를 거쳐 소형 콜로이드성 미립자 및 하류 필터 성능을 손상시키는 다른 입자를 제거한다. 원심분리는 전형적으로 mAb 및 포유류 세포 배양 브로쓰 및 공급원료의 생산 방법에서 일차 정화 단계이다.
mAb 제조자들은 공급원료의 생산 역가를 증가시키기 위하여 상당한 시간과 노력을 투여하였다. 그러나, 더 높은 역가가 세포 배양물 생산성을 증가시키는 한편, 다량의 바이오매스와 세포 파쇄물(cell debris) 함량을 갖는 공급원료를 또한 생산한다. 다량의 바이오매스 및 세포 파쇄물과 같은 것을 함유하는 공급물은 원심분리 후에 높은 탁도(turbidity)의 농축물 생성할 수 있다. 높은 탁도의 농축물은 흔히 원심분리의 하류에 사용된 이차 정화 심층 필터의 처리량 및 원심분리의 하류에 사용된 후속되는 멸균 필터를 감소시킨다. 감소된 처리량은 공정 비용에서부터 필터 막힘과 긴 공정 지연에 기인한 공정 과정에서 편차에 이르는 문제를 초래한다. 마지막으로, 원심분리를 이용한 일차 정화의 필요성은, 뱃치 및 치료성 분자종 사이에서 교차 오염의 우려를 감소시키기 위한 시도로 실시되는 처리 사이에 광대하고 타당한 세정 과정을 필요로 한다
이것은 비교적 단시간 내에 복수의 생성물 처리가 바람직한 파일럿 규모 또는 임상 규모의 생체치료적 생산에서 특히 문제가 된다. 상기 원심분리 세정 과정은 상이한 생체분자의 생성으로 전환하는 파일럿 플랜트의 능력을 늦추고 또 생산 처리 사이의 교차 오염의 우려를 현저히 증가시킨다. 또한, 원심분리는 일차 정화 단계에서 이들 공급 원료로부터 모든 미립자 및 세포 파쇄물을 효과적으로 제거할 수 없으므로, 원심분리 단계 이후지만 후속하는 크로마토그래피 단계 이전에 심층 여과를 이용하는 이차 정화 단계를 필요로 한다.
다르게는, 연속적인 여과 처리는 공급원료로부터 상이한 크기의 세포 및 세포 파쇄물을 제거하는데 유용한 것으로 밝혀졌지만, 전형적으로 부피 처리량은 필터 설치가 적정한 크기를 갖는 더 적은 부피(<1000L)에 대한 적용을 제한한다. 여과의 이용은 교차 오염의 우려를 현저히 감소시키고 또 여과 장치의 일회성 성질로 인하여 처리 사이에 세정 및 세정 확인을 필요로 하는 것을 제거한다. 불행히도, 낮은 처리량은 각 연속 단계가 필터 장치 및 장비의 유지 부피를 통하여 공급물 용액의 일부의 손실을 초래하기 때문에 여과 수율을 감소시킬 수 있는 다수의 필터 유닛을 필요로 한다.
정화 성능, 처리량 및 하류 여과 작업을 더욱 향상시키기 위하여, 세포 배양 수집물의 응집을 이용하여 왔다. 응집제(flocculants)는 용액으로부터 미세 입자를 응집 및 응고할 수 있는 물질류로서, 액상으로부터 이들의 침전과 용액 탁도 감소를 초래한다.
응집은 중합체 처리, 화학제 처리 (pH) 또는 계면활성제의 부가를 비롯한 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 응집제를 사용한 석출은 용액 중에 단백질 생성물을 남기면서 불순물을 선택적으로 제거하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 응집제는 mAb, 포유류 세포, 및 관심 공급원료의 다른 생체분자 세포 물질의 정화에 광범위하게 사용되지 않고 있다.
화학물질에 의한 세포 배양 수집물의 응집은 아세트산과 같은 산, 또는 키토산, 다당류, 폴리아민 또는 폴리아크릴아미드와 같은 중합체의 사용을 필요로 한다. 응집은 원심분리 정화 처리량 및 농축물 품질을 향상시키기 위한 다른 분리 기술로서 사용되어, 하류 여과 작업을 개선한다. 화학적 응집은 세포 파쇄물 및 세포 오염물(숙주 세포 단백질 및 DNA)을 응집하는데 매우 효과적이지만, 생성한 응집된 현탁액은 일반적으로 여과 이전에 원심분리를 사용하지 않고는 통상의 여과 방법에 의해서는 용이하게 분리할 수 없다.
응집제는 단백질 상의 전하와 중합체(예컨대 고분자전해질) 상의 전하 사이의 상호작용으로 인하여 세포, 세포 파쇄물 및 단백질을 석출시켜, 불용성 착체를 생성하고, 또 후속적으로 잔류하는 전하 상호작용에 의해 또는 착물 상의 소수성 패치를 통하여 불용성 착물을 브릿징하여 대형 클러스터(cluster)를 형성한다. 이들 대형 클러스터를 제거하기 위하여, 원심분리 단계 또는 접선유동 정밀여과는 정화의 제1 모드이며, 이어서 이차 정화 단계가 실시되며, 심층 여과는 크로마토그래피 단계에서 포획하기 전에 세포 배양 브로쓰의 정화에서 널리 사용된다. 원심분리는 무-입자 농축물을 전달할 수 없으므로, 심층 필터(이차 심층 여과) 및 멸균 필터가 더 하류에 설치될 필요가 있다.
접선유동 정밀여과(직교류(cross-flow) 정밀여과라고도 불림)는 포유류 세포 배양물로부터 mAb 및 치료적 생성물을 수집하고 정화하기 위하여 원심분리와 경쟁한다. 이 수법이 제공하는 한가지 이점은 최소의 부가적 여과를 필요로 하는 무-입자 수집물 스트림을 생성하는 것이다. 그러나, 세포 배양 수집물에 대해 사용된 접선유동 정밀여과 막은 흔히 막 막힘(즉, 막 플럭스에서 회복불가능한 감소) 문제를 겪고 또 전형적으로 엄격하고 복잡한 작업 조건에 이어 각 사용 후 막에 대한 철저한 세정 처리(원심분리의 경우에서와 마찬가지로)를 필요로 한다. 이러한 사안을 해결하기 위하여 더욱 친수성인 접선유동 정밀여과 막을 이용한 최적화된 막 화학의 이용은 일반적으로 중요한 막 막힘에 덜 취약하다.
전통적으로, 응집은 비-형태변형성 고체 입자를 응집하기 위해 일반적으로 이용된다. 예를 들어, 작은 입자 크기 때문에 여과하기 아주 어려운 서브미크론 크기의 점토 또는 이산화 티탄 입자의 희석 현탁액은 화학적으로 응집될 수 있고 또 용이하게 분리될 수 있는데, 이는 이들 서브미크론 입자 크기가 응집된 플럭의 형성에 의해 현저하게 증가하여, 더욱 신속하게 침강되고, 또 그에 의해 케이크 내의 대형 유동 채널로 인하여 더 신속하게 여과되기 때문이다.
그러나, 화학적 응집이 mAb 공급원료 또는 기타 생체분자/세포성 공급원료에 적용되면, 생성한 응집물은 독특하고 또 이들 생체분자 물질의 생물학적 특성으로 인하여 토류 물질 및 금속 산화물의 비-형태변형성 고체 입자와는 매우 다르다. 토류 물질 또는 금속 산화물과 같은 대부분의 고형 비-형태변형성 입자는 물보다 훨씬 더 높은 밀도를 갖는다. 따라서, 이들 소형 입자가 일단 응집되면, 이들의 입자 크기는 현저하게 증가하고, 또 생성한 플럭(floc)은 중력에 의해 신속하게 (즉, 몇 분 이내에) 침강한다. 대조적으로, 세포, mAb 및 기타 생체분자 종은 아미노산 및 물로 만들어지며, 또 물의 밀도와 아주 근접한 밀도를 갖는다. 따라서, 응집된 세포 및 기타 생체분자는 용이하게 침강하지 않고 또 흔히 침강하기까지 많은 시간이 걸린다.
다른 문제는 응집된 세포 덩어리의 밀도가 비교적 낮아서, 전형적으로 압축된 케이크를 형성하기 보다는 공급물 부피의 현저한 부분을 점하는 보송보송한 덩어리를 형성한다. 또한, 입자의 생물학적 기원으로 인하여, 상기 플럭은 약하고 또 압력하에서 파괴되기 쉬운 경향이 있다.
이러한 이유로 인하여, 고체 입자 시스템에 유용하면서도 가장 통상적인 고체-액체 분리 방법은 mAb 공급원료와 같은 응집된 세포 덩어리에서는 작동하지 않는다.
입자 보유는 소수성, 이온성 및 기타 상호작용을 통한 크기 배제 및 흡착을 포함하는 것으로 믿어진다. 막힘 메카니즘은 기공 차단, 케이크 형성 및/또는 기공 압축을 포함할 수 있다. 심층 필터는, 오염물 제거에 아주 효과적이고 또 일회용 포맷으로 입수하기 때문에 유리하므로, 원심분리를 이용할 때 조우되는 것과 같은 재사용가능한 하드웨어 설치에 관련된 타당성 및 오염 문제를 해결한다. 그러나, 심층 필터는 원심분리 이후에 흔히 사용되는 것과 같이 고 역가 mAb 공정인 고-고형분 공급물 스트림을 현재 취급할 수 없다. 정화되지 않은 세포 배양 상층액에 존재하는 높은 미립자 하중 및 높은 탁도는 심층 여과 단독에 의한 일차 정화에 대하여 도전을 부가한다.
그러나, 심층 필터는 현재 고-고형분 공급물 스트림의 일차 정화를 취급할 수 없고, 또 흔히 원심분리 또는 접선유동 정밀여과 후에 사용되어야 한다. 정화되지 않은 세포 배양 상층액에 존재하는 높은 미립자 하중 및 높은 탁도는 심층 여과 단독에 의한 일차 정화에 대하여 도전을 부가한다. 현재, 상기 제한된 처리량은 일차 정화를 위한 심층 필터의 대형 설치를 초래하며, 이는 상기 논의한 바와 같이 대형 유지 부피 및 축적 문제로 인하여 수율 손실을 초래한다.
또한, mAb 공급원료는 더 많은 바이오매스 함량의 존재로 인하여 청정화 및 여과하는 도전적 공급물 스트림이며 또 원심분리 후 고 탁도 농축물을 초래한다. 다량의 바이오매스를 제거할 필요성으로 인하여, 고탁도 농축물은 하류를 정화하기 위한 심층 필터의 수명을 단축한다. mAb의 정화를 개선의 필요성이 존재하므로, 더 많은 처리량을 초래한다.
대형 입자를 제거하기 위하여 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 정밀여과 단계에 이어 심층 여과 매질에 의존하는 이차 정화 단계의 이용에 의존하는 상기 일차 정화 공정을 감안하여, 일차 정화 원심분리 또는 정밀여과 단계에 이어 부가적인 이차 정화 단계를 이용하지 않는, 일회성이고 합리적으로 신뢰성이 있으며 과도하게 비용이 들지 않는 일차 정화 공정을 실시할 필요가 존재한다.
발명의 요약
공급물, 공급물 스트림, 공급원료, 세포 배양 브로쓰 등의 일차 정화 공정과 관련된 상기 필요성과 문제에 대응하여, 본 발명은, 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도, 일차 정화 심층 여과 장치를 이용하는 일차 정화 심층 여과 방법을 이용하는 것에 의한 문제를 극복한다.
본 발명은, 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도, 관심있는 표적 생체분자 및 복수의 세포 파쇄물 및 콜로이드성 미립자를 함유하는 공급물, 공급물 스트림, 공급원료, 세포 배양 브로쓰 등을 심층 여과에 의해 일차 정화하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 다공성 심층 필터 매질을 갖는 심층 여과 장치를 제공하는 단계;
b) 관심있는 표적 생체분자 및 복수의 세포 파쇄물 및 미립자를 함유하는 공급물 스트림을 제공하는 단계, 이때 상기 세포 파쇄물 및 미립자는 약 0.5 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 입자 크기 분포를 가짐;
c) 상기 심층 필터 매질이 약 0.5 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 입자 크기 분포를 갖는 세포 파쇄물 및 미립자를 약 10 리터/m2/hr 내지 약 100 리터/m2/hr의 유속으로 여과할 수 있도록 상기 다공성 심층 필터 매질을 상기 공급물 스트림과 접촉시키는 단계; 및
d) 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도 상기 세포 파쇄물 및 미립자로부터 관심있는 표적 생체분자를 분리하는 단계.
본 발명은 관심있는 표적 생체분자 또는 관심있는 생체치료제(biotherapeutics) 및 응집된 세포 파쇄물, 물질, 및 콜로이드성 미립자를 함유하는 응집된 공급물을, 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도, 일차 정화 심층 여과 장치를 이용하여 심층 여과에 의해 일차 정화하는 방법을 더 포함하는 것으로, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 다공성 심층 필터 매질을 함유하는 심층 여과 장치를 제공하는 단계;
b) 화학적 응집제를 제공하는 단계;
c) 관심있는 표적 생체분자 및 복수의 세포성 물질, 파쇄물 및 콜로이드성 미립자를 함유하는 공급물을 제공하는 단계;
d) 상기 화학적 응집제를 상기 공급물과 조합하는 단계;
e) 상기 공급물 중에 화학적으로 응집된 세포성 물질, 파쇄물 및 콜로이드성 미립자 및 경우에 따라 화학적으로 응집하는 관심있는 표적 생체분자를 형성하는 단계;
f) 상기 다공성 심층 필터 매질을 상기 화학적으로 응집된 세포성 물질, 파쇄물 및 콜로이드성 미립자를 함유하는 공급물과 접촉시키는 단계; 및
g) 원심분리 정화 단계 또는 접선유동 정밀여과 정화 단계를 이용하지 않고도 관심있는 응집된 생체분자 종 및 복수의 응집된 세포성 물질을 분리하는 단계.
본 발명은 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도 심층 여과 장치를 이용하는 공급물의 일차 정화에 관한 것이다. 상기 심층 여과 장치는 약 0.5 ㎛ 내지 200 ㎛의 입자 크기 분포를 갖는 입자를 함유하는 고-고형분 공급물을 약 10 리터/m2/hr 내지 약 100 리터/m2/hr의 유속으로 TMP가 20 psi에 도달할 때까지 여과할 수 있다. 본 발명에서 개시된 상기 일차 정화 심층 필터 매질은 다양한 기공 수준의 등급화된(graded) 다공성 층을 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 일차 정화 다공성 이방성 심층 필터 매질의 일개 바람직한 적용은 관심있는 생체분자 종 또는 관심있는 생체치료제, 및 복수의 응집된 세포 파쇄물 및 응집된 콜로이드성 미립자를 함유하는 화학적으로 처리된 응집된 고-고형분 공급물의 일차 정화이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 mAb, 포유류 세포 배양물, 식물 세포 배양물, 세균 세포 배양물, 곤충 세포 배양물, 및 기타 관심있는 생체분자 세포성 물질 및 배양물을 함유하는 응집된 공급물의 일차 정화에서, 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도, 케이크 여과의 의도하지 않은 효과 없이 아주 대형의 입자를 함유하는 고 부피의 공급원료의 심층 여과를 실시할 수 있는 섬유계 다공성 심층 필터 매질을 사용하는 것에 의해 관심있는 생체분자 종으로부터 응집된 세포성 덩어리 및 파쇄물을 효과적으로 분리하는 것에 의해, 다공성 필터 매질을 갖는 심층 여과 장치를 이용하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 약 10 마이크론(㎛) 또는 그보다 작은 입자 응집제의 사용에 의해 약 10 마이크론(㎛) 보다 더 큰 크기를 갖는 응집된 세포 파쇄물 및 콜로이드성 미립자 또는 그보다 작은 입자를 비롯한 응집된 세포성 바이오매스의 제거 및 일차 정화에 사용하기 위한 복수의 등급화된 층을 갖는 다공성 심층 필터 매질을 포함한 심층 여과 장치를 제공한다.
더욱 다른 실시양태에서, 본 발명은 0.5 ㎛ 내지 200 ㎛의 다양한 입자 크기를 갖는 세포 파쇄물 및 콜로이드성 미립자의 심층 여과를 가능하게 하는 일차 정화 심층 여과에 사용하기 위한 개방 등급화된 층(open graded layer)을 갖는 다공성 심층 필터 매질을 포함하는 심층 여과 장치를 제공함으로써, 케이크 여과의 의도하지 않은 효과 없이 정화되지 않은 공급물 스트림에 대한 처리량을 향상시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명은,
a) 케이크 여과의 의도하지 않은 효과 또는 필터의 기공 내부에서 플럭 브릿징(floc bridging)의 형성 없이 세포 파쇄물의 대형 플럭이 침투하게 하는 대형 기공을 갖고;
b) 깊이가 아주 깊어서 세포 덩어리가 퍼져서 내부 플럭 브릿징을 방지하게 하여, 플럭 파괴를 유발할 수 있는 압력 강하 농도를 피하도록 매질 내부, 매질에 대하여 외부 또는 내부에서 내부 케이크 여과를 초래할 수 있으며;
c) 이방성 심층 필터층을 가지며, 즉 공급원료에서 플럭 집단 크기와 매칭되는 기공 크기가 점진적으로 감소됨. 중합체 대신 산 응집으로부터 생성된 것과 같은 상당량의 미세한 플럭을 갖는 특정 공급원료의 경우, 심층 필터층은 미세 제거가 필요한 펠트(felt) 물질, DE 및 절단 섬유(chopped fiber)의 조합을 갖는 복합 매질을 포함한다;
d) 10㎛ 보다 큰 평균 입자 크기를 갖는 관심있는 생체분자 종, 전형적 응집제 및 화학적으로 처리된 공급물 스트림을 일차 정화하기 위한 것으로, 상기 심층 필터는 다량의 고체를 갖는 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있는 개방형 명목상(open nominal) 기공 크기 등급을 갖는 부직 섬유의 등급화된 층을 포함하며;
e) 다량의 고체를 갖는 중합체 응집제 처리된 공급물 스트림을 여과할 수 있는 개방형 명목상 기공 크기 등급을 갖는 부직 섬유 및 셀룰로오스/규조토의 복합 등급화된 층이며;
f) 더 큰 투과성에도 불구하고 중합체 응집제(예를 들어 스마트 중합체(SmP), 키토산 등) 처리된 공급물에 대한 양호한 체류 특성을 가지고;
g) 더 큰 투과성에도 불구하고 중합체 응집제(예를 들어 산 석출, 카프릴산 등) 처리된 공급물에 대한 양호한 체류 특성을 가지며;
h) 부직 섬유의 등급화된 층을 포함하는 심층 필터를 이용하는, 배양물을 함유하는 세포 및 세포 파쇄물의 일차 정화 방법에 사용되며; 또
i) 부직 섬유의 등급화된 층을 포함하는 심층 필터를 이용하는, 배양물을 함유하는 응집된 세포 및 세포 파쇄물의 일차 정화 방법에 사용되는, 심층 여과 매질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 부직 섬유의 등급화된 층을 포함하는 < 약 25 ㎛의 명목상 기공 크기를 갖는 심층 필터에 대한 심층 여과 매질 프리필터를 제공한다.
더욱 다른 실시양태에서, 본 발명은 부직 섬유의 적어도 3개의 등급화된 층을 포함하는 < 약 25 ㎛의 명목상 기공 크기를 갖는 심층 필터에 대한 심층 여과 매질 프리필터를 제공한다.
더욱 다른 실시양태에서, 본 발명은 > 약 3% 고형분을 갖는 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있는 > 약 25 ㎛의 명목상 기공 크기를 갖는 적어도 2개 등급화된 부직 섬유층을 포함하는 심층 필터를 포함하는 심층 여과 매질을 제공한다.
더욱 다른 실시양태에서, 본 발명은 > 약 3% 고형분을 갖는 중합체 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있는 > 약 25 ㎛의 명목상 기공 크기를 갖는 적어도 2개 등급화된 부직 섬유층을 포함하는 심층 필터를 포함하는 심층 여과 매질을 제공한다.
더욱 다른 실시양태에서, 본 발명은 < 20 NTU의 탁도 산출량을 초래하는 > 약 3% 고형분을 갖는 중합체 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있는 > 약 25 ㎛의 명목상 기공 크기를 갖는 적어도 2개 등급화된 부직 섬유층을 포함하는 심층 필터를 포함하는 심층 여과 매질을 제공한다.
심층 필터와 관련된 현재의 도전을 극복하기 위하여, 본 발명은 약 0.5 마이크론 내지 200 마이크론의 입자 크기 분포를 갖는 고 고형분 함유 유체 스트림을, TMP가 20 psi에 도달할 때까지 약 10 리터/m2/hr (10 LMH) 내지 100 리터/m2/hr (100 LMH)의 유량으로 여과할 수 있는 일차 정화 심층 필터 매질 및 이를 사용하는 방법의 개발에 관한 것이다. 상기 일차 정화 심층 필터는 중합체 및 화학적으로 처리된 응집된 공급물의 일차 정화에 적용하는 다양한 기공 등급을 갖는 등급화된 층을 포함한다.
본 발명은 일회용 일차 정화 공정용 심층 필터에 관한 것이다. 심층 여과용의 개방 등급화된 층의 사용은 대형 클러스터를 함유하는 공급물의 여과를 가능하게 하여 원심분리를 없앨 가능성이 있고, 또 약 0.5 마이크론 내지 약 200 마이크론의 다양한 입자 크기를 갖는 고 고형분의 여과를 가능하게 함으로써, 정화되지 않은 공급물 스트림에 대한 처리량을 개선한다.
본 발명의 부가적 특징과 이점은 이하의 상세한 설명과 특허청구범위에 개시된 바와 같다. 본 발명의 다수의 변형과 변이는 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 한 행해질 수 있다. 상술한 일반적 기재 및 이어지는 상세한 설명, 특허청구범위뿐만 아니라 첨부한 도면은 예시적으로 든 것이고 본 발명의 기술의 다양한 실시양태를 예시하기 위해 제공되는 것임을 이해해야 한다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예로 든 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의도하지 않는다.
본 명세서에 혼입되어 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부한 도면은 본 발명의 현재 고려되는 실시양태를 예시하며 또 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 및 1F는 본 발명에 따른 일차 정화 심층 필터의 예의 상이한 개략적 실시양태를 도시하며, 도 1A(8층), 도 1C(7층) 및 도 1E(8층)는 중합체 응집제(스마트 중합체) 처리된 공급물과 사용하기 위한 일차 정화 심층 필터를 도시하고, 또 도 1B, 1D 및 1F는 화학적으로 처리된 공급물(산 처리)과 사용하기 위한 적어도 8개 층을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 2는 본 명세서에 기재된 바와 같이 예시적 일차 정화 심층 필터 정제 공정을 개략 도시하는 것이다. 상기 나타낸 정제 공정은 다음 공정 단계가 실시되는 세포 배양물용 바이오리액터를 사용한다: 일차 정화 심층 여과; 단백질 A 결합 및 용출 크로마토그래피(포획); 바이러스 불활성화; 플로우 쓰루(flow through) 정제; 및 배합(formulation). 도시된 바와 같이, 상기 공정 단계 각각은 상기 공정 단계의 목적하는 결과를 달성하기 위하여 이용된 하나 이상의 장치를 이용한다. 도시한 바와 같이, 정화는 도 1A 내지 1F에 개시되고 도시된 바와 같은 등급화된 정화 심층 여과를 적용한다; 단백질 A 결합 및 용출 크로마토그래피는 연속식 멀티컬럼 크로마토그래피(CMC: continuous multicolumn chromatograph)를 이용하여 실시된다; 바이러스 불활성화는 2개의 인-라인(in-line) 정적 혼합기를 이용한다; 플로우 쓰루 정제는 활성탄(AC)에 이어 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피에 이어, 인-라인 정적 혼합기를 이용한 pH 변화 및 서지 탱크에 이어 플로우 쓰루 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 적용하며; 또 배합은 투석여과/농축 접선유동 여과 장치에 이어 멸균 여과를 적용한다. 하나 이상의 멸균 필터가 공정을 통하여 적용된다.
실시양태의 설명
이전 또는 이후에 본 발명에 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 각 개별 문헌, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 특별히 또 개별적으로 본 명세서에 포함된 것과 동일 정도로 전체적으로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
특별히 다르게 나타내지 않는 한, 이 명세서 및 첨부된 특허청구범위의 목적을 위하여, 성분의 양, 물질의 % 또는 비율, 반응 조건을 나타내는 모든 숫자, 및 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 다른 숫자값은 분명히 나타내든 나타내지 않든 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 용어 "약"은 일반적으로 인용된 값(즉, 동일한 기능 또는 결과를 갖는)과 동등한 것으로 간주되는 범위의 수를 지칭한다. 많은 경우에서, 용어 "약"은 가장 가깝고 유의한 수에 가까운 숫자를 포함할 수 있다.
따라서, 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 이하의 명세서 및 첨부한 특허청구범위에서 나타낸 숫자 변수는 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라 다양할 수 있는 근사값이다. 적어도 및 특허청구범위의 균등론의 적용을 제한하는 의도가 아니라면, 각 숫자 변수는 보고된 유의한 디지트의 숫자를 고려하고 또 통상의 어림 수법을 이용하여 적어도 이해된다.
본 발명의 광범위한 범위를 나타내는 숫자 범위 및 변수는 근사치이긴 하지만, 특정 실시예에 나타낸 숫자값은 가능한한 정밀한 것으로 보고된다. 그러나, 어떤 숫자 값이라도 고유하게 각 시험 측정에서 발견되는 표준 편차에 기인한 특정의 오차를 반드시 함유한다. 또한, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 그 범위의 모든 하부범위를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어 "1 내지 10" 범위는 최소 값 1 및 최대값 10 사이(및 포함한)의 임의의 모든 하부범위를 포함하며, 즉, 1과 동일하거나 1보다 큰 최소 값과 10과 동일하거나 10보다 작은 최대 값, 예컨대 5.5 내지 10을 갖는 임의의 모든 하부범위를 의미한다.
본 발명을 더욱 자세하게 설명하기 전에, 다수의 용어를 정의한다. 이들 용어의 사용은 본 발명의 범위를 한정하지 않고 본 발명의 설명을 용이하게 할 뿐이다.
다르게 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 이하의 용어는 본 발명에 설명된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 단수 형태 "하나", "하나의", "상기"는 다르게 분명히 나타내지 않는 한 복수도 포함하는 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "바이오리액터"는 생물학적 활성 환경을 지지하는 제조된 또는 유전자공학처리된 장치 또는 시스템을 지칭한다. 일부 예에서, 바이오리액터는 생물 또는 그러한 생물로부터 유도된 생화학적 활성 물질을 포함하는 세포 배양 공정이 실시되는 용기이다. 이러한 공정은 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 통상적으로 사용되는 바이오리액터는 전형적으로 리터에서부터 입방미터에 이르기까지의 크기에 걸친 원통형이며, 또 흔히 스테인레스강으로 제조된다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 바이오리액터는 강철 이외의 물질로 제조되며 또 일회용 또는 단일 용도이다. 바이오리액터의 전체 부피는 특정 공정에 따라서 100 ml 내지 10,000 리터까지의 임의 부피 범위일 수 있다. 본 발명에 기재된 공정 및 시스템에 따른 일부 실시양태에서, 상기 바이오리액터는 심층 필터와 같은 단위 작업에 연결된다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 바이오리액터는 세포배양뿐만 아니라 석출을 위해 사용되며, 석출제(precipitant)는 바이오리액터에 직접 부가되어, 하나 이상의 불순물을 석출시킨다.
용어 "세포 배양물"은 현탁액, 롤러 병, 플라스크 등에서 성장한 세포뿐만 아니라 비제한적으로, 세포, 세포 파쇄물, 세포 오염물, 콜로이드성 입자, 생체분자, HCP, 숙주 세포 단백질(HCP) 및 DNA, mAb, 응집제를 포함한, 현탁액 자체의 성분을 지칭한다. 교반되는 발효기에서 마이크로캐리어(microcarrier)에 부착되어 성장하는 응집성 세포를 포함한 바이오리액터와 같은 대규모 어프로치도 용어 "세포 배양물"에 포함된다. 또한, 특허청구된 발명의 방법에서 접촉 의존적 세포를 배양할 뿐만 아니라 현탁 배양 수법을 이용할 수도 있다.
예시적 마이크로캐리어는 예를 들어 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로오스 및 Butler, Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303 (1988)에 기재된 바와 같은 그외의 것을 포함한다. 예를 들어, Cytoline.RTM. 또는 Cytopore.RTM.와 같은 다공성 캐리어뿐만 아니라 DEAE-덱스트란(Cytodex 1.RTM.), 4급 아민 코팅된 덱스트란(Cytodex 2.RTM.)과 같은 덱스트란계 캐리어 또는 젤라틴 코팅된 덱스트란(Cytodex 3.RTM.)과 같은 젤라틴계 캐리어가 또한 사용될 수 있다. 단백질의 대규모 및 소규모 생산을 위한 세포 배양 과정은 본 발명에 포함된다. 비제한적으로 유동층(fluidized bed) 바이오리액터, 중공 섬유 바이오리액터, 롤러 병 배양물 또는 교반되는 탱크 바이오리액터 시스템을 포함하는 과정은 마이크로캐리어를 이용하거나 이용하지 않고 이용되고, 또 뱃치식, 유가뱃치(fed-batch), 또는 관류(perfusion) 모드로 동작된다.
용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 동물 세포, 예컨대 포유류 세포를 성장시키기 위해 사용되는 영양 용액을 지칭한다. 이러한 영양 용액은 일반적으로 세포 부착, 성장, 및 세포 환경의 유지에 필요한 다양한 인자를 포함한다. 예를 들어, 전형적인 영양 용액은 기본 배지 배합물, 세포 유형에 따라서 다양한 보조제, 및 경우에 따라 항생물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 영양 용액은 다음 카테고리의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다: 1) 보통 글루코오스와 같은 탄수화물 형태인 에너지 공급원; 2) 모든 필수 아미노산, 및 기본 세트의 20개 아미노산 플러스 시스테인; 3) 저농도로 필요한 비타민 및/또는 기타 유기 화합물; 4) 유리 지방산; 및 5) 미량 원소, 이때 미량 원소는 전형적으로 아주 낮은 농도, 보통 마이크로몰 범위로 필요한 무기 화합물 또는 천연 산출 요소로 정의된다. 상기 영양 용액은 다음 카테고리로부터 선택되는 하나 이상의 성분에 의해 경우에 따라 보충될 수 있다:
1) 호르몬 및 기타 성장 인자, 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 및 표피 성장 인자; 2) 염 및 완충액, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트; 3) 뉴클레오사이드 및 염기, 예를 들어, 아데노신 및 티민, 하이포크산틴; 및 4) 단백질 및 조직 가수분해물. 일반적으로, 임의의 적합한 세포 배양 배지가 사용될 수 있다. 상기 배지는 혈청, 예컨대 우태아 혈청, 송아지 혈청 등을 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 배지는 무-혈청, 무-동물(animal free), 또는 무-단백질일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "세포 배양 첨가제"는 세포 배양 또는 발효 공정을 용이하게 하거나 또는 개선하기 위하여 세포 배양 공정에 부가되는 분자(예컨대, 비-단백질 첨가제)를 지칭한다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 자극 감응성 중합체는 하나 이상의 세포 배양 첨가제에 결합하여 석출한다. 예시적 세포 배양 첨가제는 소포제, 항생물질, 염료 및 영양분을 포함한다.
본 발명에 상호교환적으로 사용되는 용어 "중국 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"은 중국 햄스터 난소("CHO") 세포 배양물로부터 유도된 숙주 세포 단백질("HCP")의 혼합물을 지칭한다. 상기 HCP 또는 CHOP는 일반적으로 세포 배양 배지 또는 분해물(예컨대, 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 수집된 세포 배양 유체(예컨대, CHO 세포에서 발현된 항체 또는 이뮤노어드헤신(immunoadhesin) 중에 불순물로서 존재한다. 일반적으로, 관심있는 단백질을 포함하는 혼합물에 존재하는 CHOP의 양은 관심있는 단백질에 대한 순도의 척도를 제공한다. 전형적으로, 단백질 혼합물 중의 CHOP의 양은 혼합물 중의 관심 단백질의 양에 대하여 ppm(parts per million)으로 표시된다. 숙주 세포가 다른 포유류 세포 유형, 대장균(E. coli), 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포이면, HCP는 숙주 세포의 분해물에서 발견되는 표적 단백질 이외의 단백질을 지칭하는 것으로 이해된다.
본 발명에 상호교환적으로 사용되는 용어 "오염물" "불순물" 및 "파쇄물"은 본 발명에 따른 자극 감응성 중합체를 사용하여 하나 이상의 외래 또는 바람직하지 않은 분자로부터 분리되는 관심 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, 항체)를 함유하는 샘플에 존재할 수 있는, DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP 또는 CHOP), 내독소, 바이러스, 지질 및 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 마크로분자를 포함한, 임의의 외래 또는 바람직하지 않은 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본발명에 기재된 자극 감응성 중합체는 관심 단백질 또는 폴리펩티드 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 샘플로부터 관심 단백질 또는 폴리펩티드와 결합하여 석출한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체는 하나 이상의 불순물에 결합하여 석출함으로써, 하나 이상의 불순물로부터 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 분리한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "서지 탱크(surge tank)"는 공정 단계들 사이 또는 공정 단계 내(예컨대 단일 공정 단계가 일개 단계 이상을 포함할 때)에서 사용되는 임의의 용기 또는 공구 또는 백을 지칭한다; 1개 단계로부터의 아웃풋(output)은 서지 탱크를 통하여 다음 단계로 흘러들어간다. 따라서, 서지 탱크는 한 단계로부터 전체 아웃풋 부피를 유지하거나 수집하기 위한 것이 아니라는 점에서 풀 탱크(pool tank)과 상이하다; 그러나 대신에 1개 단계에서부터 다음 단계로 아웃풋의 연속적 흐름을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 공정 또는 시스템 중의 2개 공정 단계 사이 또는 일개 공정 단계 내에서 사용되는 서지 탱크의 부피는 공정 단계의 전체 아웃풋 부피의 25% 이하이다. 다른 실시양태에서, 서지 탱크의 부피는 일개 공정 단계로부터 전체 아웃풋 부피의 10% 이하이다. 일부 다른 실시양태에서, 서지 탱크의 부피는 표적 분자가 정제되는 출발 물질을 구성하는 바이오리액터 중의 세포 배양액의 전체 부피의 35% 미만, 또는 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만이다.
용어 "정적 혼합기"는 2개의 유체 물질, 전형적으로 액체를 혼합하기 위한 장치를 지칭한다. 상기 장치는 일반적으로 원통형(튜브) 하우징에 함유된 혼합기 요소로 이루어진다. 전체 시스템 디자인은 2개의 유체 스트림을 정적 혼합기로 전달하는 방법을 포함한다. 상기 스트림이 혼합기를 통하여 이동함에 따라서, 비-이동성 요소는 연속적으로 상기 물질과 혼합된다. 완전한 혼합은 유체의 특성, 튜브의 내부 직경, 혼합 요소의 개수 및 이들의 디자인 등을 포함한 다수의 변수에 따라 달라진다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "심층 필터" (예컨대, 구배-밀도 심층 필터)는 필터 물질의 심층 내에서 여과를 달성한다. 이러한 필터의 보통 유형은 결합되어(또는 다르게는 고정된) 유동채널의 복잡하고 구불구불한 미로를 형성하는 임의의 섬유 매트릭스이다. 이들 필터에서 입자 분리는 일반적으로 상기 섬유 매트릭스에 의한 포획 또는 섬유 매트릭스에 대한 흡착으로부터 기인한다. 세포 배양 브로쓰 및 기타 공급원료를 바이오가공(bioprocessing)하기 위해 가장 흔히 사용되는 심층 필터 매질은 셀룰로오스 섬유, DE와 같은 필터 조제, 및 양으로 하전된 수지 결합제로 이루어진다. 절대 필터와 달리, 심층 필터 매질은 다공성 매질을 통하여 입자를 유지하여, 기공 크기보다 더 크고 또 더 작은 입자의 체류를 허용한다. 입자 체류는 크기 배제 및 소수성, 이온성 및 기타 상호작용을 통한 흡착 양쪽을 포함하는 것으로 생각된다. 막힘(fouling) 메카니즘은 기공 차단, 케이크 형성 및/또는 기공 압축을 포함할 수 있다. 심층 필터는 이들이 오염물을 제거하고 또 일회용 포맷으로 입수가능하여 확인 문제를 제거하기 때문에 유리하다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "친화성 크로마토그래피 매트릭스"는 친화성 크로마토그래피에 적합한 리간드를 운반하는 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 전형적으로 상기 리간드(예컨대, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체 또는 그의 단편)는 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유결합적으로 부착되며 또 상기 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉함에 따라서 용액 중의 표적 분자에 접근할 수 있다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 전형적으로 항원/항체 또는 효소/수용체 결합과 같은 로크/키(lock/key) 메카니즘을 기본으로 하여 높은 특이성으로 표적 분자와 결합한다. 친화성 매트릭스의 예는 단백질 A SEPHAROSE™ 또는 PROSEP®-A와 같은 단백질 A 리간드를 갖는 매트릭스이다. 본 발명에 기재된 공정 및 시스템에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 전체 정제 공정에서 크로마토그래피 단계를 결합 및 용출하는 단계로 이용될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "이온 교환" 및 "이온 교환 크로마토그래피"는 혼합물 중의 관심 용질 또는 분석물(예컨대, 정제될 표적 분자)이 고상 이온 교환 물질에 연결된(공유 부착에 의해서와 같이) 하전된 화합물과 상호작용하여 상기 관심 용질 또는 분석물이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물보다는 다소 하전된 화합물과 비특이적으로 상호작용하게 하는 크로마토그래피 공정을 지칭한다. 혼합물 중의 오염성 용질은 관심 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 용출되거나 또는 관심 용질에 대하여 수지에 결합하거나 또는 상기 수지로부터 배출된다.
특히 "이온 교환 크로마토그래피"는 양이온 교환, 이온 교환, 및 혼합 모드의 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자(예컨대, Fc 영역 함유 표적 단백질)과 반응한 다음 용출(예컨대, 양이온 교환 결합 및 크로마토그래피 또는 "CIEX" 용출)하거나 또는 불순물과 주로 반응하면서 상기 표적 분자는 컬럼을 유통한다(양이온 교환 플로우 쓰루 크로마토그래피 FT- CIEX). 음이온 교환크로마토그래피는 표적 분자(예컨대, Fc 영역 함유 표적 단백질)에 이어, 용출하거나 또는 표적 분자가 컬럼을 "플로우 쓰루"하는 동안 불순물과 주로 반응할 수 있어, 흔히 음성 크로마토그래피라 칭한다. 일부 실시양태에서 및 본 발명의 실시예에 예시된 바와 같이, 상기 음이온 교환크로마토그래피 단계는 플로우 쓰루 모드로 실시된다.
용어 "이온 교환 매트릭스"는 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환 매질) 또는 양으로 하전된(즉, 음이온 교환매질)인 매트릭스를 지칭한다. 전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 예컨대 공유결합에 의해 매트릭스에 부착하는 것에 의해 제공될 수 있다. 다르게는, 또는 상기 전하는 매트릭스의 고유 특성일 수 있다(예컨대 전체적으로 음전하를 갖는 실리카의 경우에서와 같이).
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "음이온 교환 매트릭스"는 양으로 하전된, 예컨대 그에 부착된 4급 아미노기와 같은 하나 이상의 양으로 하전된 리간드인 매트릭스를 지칭한다. 상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare)를 포함한다. 본 발명에 기재된 공정 및 시스템에 사용될 수 있는 다른 예시적 물질은 Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno® Q 및 Fractogel® EMD DEAE (EMD Millipore)이다.
용어 "양이온 교환 매트릭스"는 음으로 하전되고 또 매트릭스의 고체 상과 접촉된 수용액 중의 양이온과 교환하기 위한 자유 양이온을 갖는 매트릭스를 지칭한다. 고상에 부착되어 양이온 교환 매트릭스 또는 수지를 형성하는 음으로 하전된 리간드는 예를 들어, 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 매트릭스는 카르복시-메틸-셀룰로오스, 아가로오스(예컨대, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, GE Healthcare) 상에 고정된 술포프로필(SP) 및 아가로오스(예컨대 S-SEPHAROSE FAST FLOW™ GE Healthcare) 상에 고정된 술포닐을 포함한다. Fractogel® EMD SO3, Fractogel® EMD SE Highcap, Eshmuno® S 및 Fractogel® EMD COO(EMD Millipore 제조)가 바람직하다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물"은 본 발명의 방법을 이용하여 하나 이상의 외래 또는 바람직하지 않은 분자로부터 분리되는 표적 분자를 함유하는 샘플 중에 존재하는 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 내독소, 바이러스, 지질 및 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 마크로분자를 포함한, 임의의 외래 또는 바람직하지 않은 물질을 지칭한다. 부가적으로, 이러한 불순물은 본 발명의 방법 이전에 생길 수 있는 단계에서 사용되는 시약을 포함할 수 있다. 불순물은 성질상 가용성 또는 불용성일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "불용성 불순물"은 성분이 현탁된 입자 또는 고체인 표적 분자를 함유하는 샘플에 존재하는 바람직하지 않은 성분을 지칭한다. 예시적 불용성 불순물은 전체 세포, 세포 단편 및 세포 파쇄물을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "가용성 불순물"은 성분이 불용성 불순물이 아닌 표적 분자를 함유하는 샘플에 존재하는 바람직하지 않은 성분을 지칭한다. 예시적 가용성 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP), DNA, RNA, 바이러스, 내독소, 세포 배양 매질 성분, 지질 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "연속 공정"은 2개 이상의 공정 단계(또는 단위 작업)를 포함하여서 1개 공정 단계로부터의 아웃풋이 상기 방법에서 중단없이 다음 공정 단계로 바로 흘러가며, 또 2개 이상의 공정 단계는 이들 지속 시간의 적어도 일부 동안 동시에 실시될 수 있는, 표적 분자를 정제하는 방법을 지칭한다. 즉, 본 발명에 기재된 바와 같은 연속 공정의 경우, 다음 공정 단계가 개시되기 전에 한 공정 단계를 완료할 필요는 없지만, 샘플의 일부는 언제나 공정 단계를 통하여 이동하고 있다. 용어 "연속 공정"은 한 공정 단계 내의 단계들에도 적용되며, 이 경우, 복수의 단계를 포함하는 한 공정 단계를 실시하는 동안, 샘플은 공정 단계를 실시하는데 필요한 복수의 단계를 통하여 연속적으로 유동한다. 본 발명에 개시된 공정 단계의 일례는 연속적 방식으로, 예컨대, 플로우 쓰루 활성탄에 이어, 플로우 쓰루 AEX 매질에 이어, 플로우 쓰루 CEX 매질에 이어 플로우 쓰루 바이러스 여과를 실시되는 복수의 단계를 포함하는 플로우 쓰루 정제 단계이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 바와 같은 심층 필터는 정화를 위해 사용되며, 이어 상기 정화된 세포 배양물은 연속적으로 정제 공정 중의 다음 단계, 예컨대 결합 및 용출 크로마토그래피 단계(예컨대 단백질 A 친화성 크로마토그래피)로 연속적으로 흘러들어간다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "반-연속 공정"은 임의의 단일 공정 단계 중의 유체 물질의 인풋(input) 또는 아웃풋이 비연속적이거나 또는 간헐적인 표적 분자를 정제하기 위한 일반적으로 연속 공정을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 한 공정 단계에서 인풋(예컨대, 결합 및 용출 크로마토그래피 단계)은 연속적으로 로딩(loaded)될 수 있다; 그러나 상기 아웃풋은 간헐적으로 수집될 수 있고, 상기 정제 공정에서 다른 공정 단계는 연속적이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 공정 및 시스템은, 이들이 간헐적으로 동작되는 적어도 하나의 단위 작업을 포함하지만 상기 공정 또는 시스템 중의 다른 단위 작업은 연속적 방식으로 실시될 수 있는 점에서 본질상 "반-연속"이다.
용어 "연결된 공정"은 각각 서로 직접 유체 소통하는 2 이상의 공정 단계 (또는 단위 작업)를 포함하여서 상기 유체 물질이 공정 중에서 공정 단계를 통하여 연속적으로 흘러가서 상기 공정의 정상 작업 중에 2 이상의 공정 단계와 동시에 접촉하게 되는, 표적 분자를 정제하기 위한 공정을 지칭한다. 때때로, 상기 공정 중의 적어도 1개의 공정 단계는 폐쇄된 위치에 있는 밸브와 같은 배리어(barrier)에 의해 다른 공정 단계로부터 일시적으로 분리될 수 있음을 이해해야 한다. 개별 공정 단계의 이러한 일시적 분리는 예를 들어 상기 공정의 개시 또는 폐쇄 동안 또는 개별 단위 작업의 제거/교체 동안 필요할 수 있다. 용어 "연결된 공정"은 하나의 공정 단계 내의 단계들에도 적용될 수 있고, 예컨대 한 공정 단계가 공정 단계의 목적하는 결과를 달성하기 위하여 실시될 필요가 있는 몇 개의 단계를 필요로 할 때에도 적용될 수 있다. 이러한 일개 예는 플로우 쓰루 모드로 실시되어야 하는 몇 개 단계, 예컨대 활성탄; 음이온 교환크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 포함할 수 있는 본 발명에 기재된 바와 같은 플로우 쓰루 정제 공정 단계이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "유체 소통"은 2개 공정 단계 사이의 유체 물질의 흐름 또는 한 공정 단계의 단계들 사이의 유체 물질의 흐름을 지칭하며, 상기 공정 단계들은 적합한 수단(예컨대 연결 라인 또는 서지 탱크)에 의해 연결되어 있어서, 일개 공정 단계로부터의 유체가 다른 공정 단계로 흐를 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 2개의 단위 작업 사이의 연결 라인은 상기 연결 라인을 통한 유체의 흐름을 제어하기 위하여 하나 이상의 밸브에 의해 중지될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "정제하는", "정제", "분리", "분리하는", "단리하다", "단리하는" 또는 "단리"는 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플로부터 표적 분자를 정제하는 정도를 향상시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 샘플로부터 적어도 하나의 불순물을 제거(완전히 또는 부분적으로)하는 것에 의해 증가된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "석출하다", "석출하는" 또는 "석출"은 가용성 표적 분자로부터 더욱 용이하게 분리될 수 있도록 바람직하지 않은 불순물의 특성이 변형되는 정화에서 사용되는 공정을 지칭한다. 이것은 바람직하지 않은 불순물을 함유하는 대형 응집 입자 및/또는 불용성 복합체를 형성하는 것에 의해 전형적으로 달성된다. 이들 입자는 여과 또는 원심분리와 같은 가용성 표적 분자를 함유하는 액상으로부터 더욱 용이하게 분리될 수 있는 특성(예컨대 밀도 또는 크기)을 갖는다. 일부 경우에서, 상 변화가 실시되어 바람직하지 않은 불순물이 가용성 표적 분자로부터 더욱 용이하게 분리될 수 있다. 상 변화에 의한 석출은 중합체 또는 작은 분자와 같은 석출제의 부가에 의해 실시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 석출제는 자극 감응성 중합체이며, 이는 스마트 중합체라고도 불린다. 본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 상기 석출제는 응집제이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 응집은 그 성능이 사용된 응집제 농도에 따라 달라지는 석출을 실시하는 한가지 방법이다("투여량 의존적"). 전형적인 응집제는 반대로 하전된 불순물과 착화되는 폴리양이온(polycation)과 같은 고분자전해질이다.
본 발명에 기재된 일부 실시양태에서, 정화는 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 샘플에 석출제를 부가한 다음 심층 여과를 실시하는 것을 이용한다. 일부 경우에서, 용액 조건에서의 변화(온도, pH, 염도와 같은)를 이용하여 자극 감응성 중합체의 경우에서와 같이 석출을 개시할 수 있다. 하나 이상의 불순물뿐만 아니라 석출제를 함유하는 석출된 물질은 제거됨으로써 액상 중의 표적 분자를 회수하며, 상기 액체는 전형적으로 표적 분자를 더 정제하기 위하여 추가의 공정 단계에 처리된다.
석출은 정제될 표적 분자를 발현하는 세포 배양물을 함유하는 바이오리액터에서 직접적으로 실시될 수 있으며, 이때 석출제는 바이오리액터에 직접 부가된다. 다르게는, 상기 석출제는 분리 용기 내에서 표적 분자를 전형적으로 함유하는 세포 배양물에 부가될 수 있다.
당업자에게는 여과 또는 침강 또는 그의 조합과 같은 석출된 물질을 제거하는 다수의 방법이 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "침강"은 석출된 물질이 중력의 영향하에서 용기의 바닥으로 이동하는 가라앉는 공정을 지칭한다. 침강은 액상 또는 상층액의 따라내기 또는 여과에 의해 실시될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "스마트 중합체"(SmP) (자극 감응성 중합체 또는 지능적 중합체 또는 친화성 마크로리간드(AML)로도 공지됨)는 본 발명에 사용된 바와 같은 pH, 온도, 광, 이온 세기, 복사선, 전압, 외부 압력, 용매 조성, 또는 다른 자극과 같은 환경 조건에서 변화와 같은 외부 자극에 대하여 생물학적, 화학적 또는 물리적 감응성인 중합체 그룹을 의미한다. 스마트 중합체는 작은 물리적 또는 화학적 자극에 대한 큰 특성 변화에 감응하며, 또 이들 환경적 자극에 대한 감응에서 물리적 또는 화학적 특성을 가역적으로 변화시킬 수 있다(Roy and Gupta, 2003; Kopecek, 2007). 스마트 중합체는 많은 형태를 취할 수 있다; 이들은 수용액에 용해되거나, 흡착되거나 또는 수성-고체 계면 상에 그라프팅(grafted)되거나, 또는 가교되어 히드로겔을 형성한다[Hoffman J Controlled Release (1987) 6:297-305; Hoffman Intelligent Polymers. In: Park K, ed. Controlled drug delivery. Washington: ACS Publications, (1997) 485-98; Hoffman Intelligent Polymers in medicine and biotechnology. Artif Organs (1995) 19:458-467]. 전형적으로, 중합체의 중요한 감응이 자극되면, 용액 중의 스마트 중합체는 상 분리됨에 따라서 탁도의 갑작스런 개시를 나타낼 것이다; 표면 흡착되거나 그라프팅된 스마트 중합체는 파괴될 것이고, 상기 계면을 친수성에서 소수성으로 전환하며; 또 상기 스마트 중합체(히드로겔 형태로 가교됨)는 급격히 파괴되어 그 팽윤 용액 대부분을 방출할 것이다. 스마트 중합체는 생체 분자에 물리적으로 혼합되거나 또는 화학적으로 콘쥬게이트되어 생물학적 자극 뿐만 아니라 물리적 및 화학적 자극에 감응할 수 있는 대형 패밀리의 중합체-생체분자 시스템을 얻을 수 있다. 중합체-콘쥬게이트될 수 있는 생체분자는 단백질 및 올리고펩티드, 당 및 다당류, 단일 가닥 및 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 및 DNA 플라스미드, 단순 지질 및 인지질, 및 다양한 스펙트럼의 인지 리간드 및 합성 약물 분자를 포함한다. 다수의 구조적 변수가 관심 단백질을 특이적으로 석출하는 스마트 중합체 능력을 제어한다; 스마트 중합체는 리간드 커플링하기 위한 반응성 기를 함유하여야 하고; 불순물과 강하게 상호작용하지 않아야 하며; 리간드가 표적 단백질과의 상호작용에 대해 이용가능하게 해야 하며; 또 소형 석출물을 형성해야 한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 공급물을 함유하는 "고-고형분"은 약 >7% 고형분을 갖는 공급물을 의미하는 반면, 용어 "저 고형분"은 약 0.1% 내지 7% 고형분을 갖는 공급물을 의미한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "자극성" 또는 "자극"은 본 발명에 따른 자극 감응성 중합체에 의한 감응을 초래하는 환경에서 화학적 변화를 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명은 자극에 대해 감응성이고 또 자극이 중합체의 용해도 변화를 초래하는 신규 중합체를 제공한다. 본 발명에 기재된 하나 이상의 중합체에 대한 자극의 예는 감응성이며, 또 비제한적으로, 예컨대 온도 변화, 도전성 변화 및/또는 pH 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극은 샘플에 대한 착화제 또는 착물 형성성 염의 부가를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 자극은 샘플에 중합체를 부가한 후에 일반적으로 부가된다. 상기 자극은 중합체를 샘플에 부가하는 동안 또는 부가하기 전에 부가될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "중합체"는 2 이상의 단량체 단위의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 지칭한다. 이들 단량체 단위는 합성일 수 있거나 또는 천연 산출일 수 있다. 반복 단위에 의해 형성된 중합체는 직쇄 또는 분기형일 수 있다. 중합체의 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리알릴아민, 폴리비닐알코올, 폴리스티렌 및 공중합체(예컨대 폴리스티렌-코-폴리피리딘, 폴리아크릴산-코-메틸 메타크릴레이트, 플루로닉스, PF68 등)를 포함한다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 중합체는 고분자전해질 주쇄를 포함한다.
용어 "단백질 A" 및 "Prot A"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되며 또 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 생산된 단백질 A(예컨대, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 수법에 의해), 및 Fc 영역과 같은 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질을 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 단백질 A는 Repligen, GE 또는 Fermatech로부터 구입할 수 있다. 단백질 A는 일반적으로 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된다. 본 발명에 따른 방법 및 시스템에 사용된 단백질 A의 기능적 유도체, 단편 또는 변이체는 마우스 lgG2a 또는 인간 IgGI의 Fc 영역에 대하여 적어도 K=108M, 및 바람직하게는 K=109M의 결합 상수를 특징으로 할 수 있다. 결합 상수에 대한 이러한 값에 대한 상호작용 순응성을 본 발명에서는 "고 친화성 결합"이라 칭한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A의 이러한 기능적 유도체 또는 변이체는 천연 도메인 E, D, A, B, C 또는 IgG 결합 관능성을 보유한 유전자공학 처리된 그의 돌연변이체로부터 선택된 야생형 단백질 A의 기능적 IgG 결합 도메인의 적어도 일부를 포함한다.
또한, 단백질 A 유도체 또는 고체 지지체에 대하여 단일점 부착을 허용하도록 유전자공학처리된 변이체는 특허청구된 방법에서의 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용될 수 있다.
단일점 부착은 일반적으로 단백질 잔기가 단일 공유결합을 통하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지체 물질에 부착되는 것을 의미한다. 이러한 단일점 부착은 노출된 아미노산 위치, 즉 N- 또는 C-말단 또는 단백질 폴드(fold)의 외부 주변 상의 어느 곳에 가까운 루프(loop)에 위치한 적합하게 반응성 잔기의 사용에 의해 생길 수 있다. 적합한 반응성 기는 예컨대 설프히드릴 또는 아미노 관능이다.
일부 실시양태에서, 변이체의 단백질 A 유도체는 다수점 부착을 통하여 적합한 크로마토그래피 매트릭스에 부착된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "친화성 크로마토그래피 매트릭스"는 친화성 크로마토그래피에 대하여 적합한 리간드를 갖는 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 전형적으로 상기 리간드(예컨대, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체 또는 그의 단편)는 공유결합적으로 크로마토그래피 매트릭스 물질에 부착되며 또 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉함에 따라서 표적 분자에 접근할 수 있다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 일례는 단백질 A 매트릭스이다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 전형적으로 항원/항체 또는 효소/수용체 결합과 같은 로크/키 메카니즘을 기본으로 높은 특이성으로 표적 분자와 결합한다. 친화성 매트릭스의 예는 단백질 A SEPHAROSE™ 또는 PROSEP®-A와 같은 단백질 A 리간드를 갖는 매트릭스이다. 본 발명에 기재된 방법 및 시스템에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 전체 정제 공정 중에서 결합 및 용출 크로마토그래피 단계로 이용될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "자극 감응성 중합체"는 자극 부가 후에 물리적 및/또는 화학적 특성 변화를 나타내는 중합체이다. 전형적인 자극 감응은 중합체의 용해도 변화이다. 예를 들어, 상기 중합체 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 약 35℃ 미만의 온도에서 가용성이지만, 약 35℃ 온도의 물에서 불용성으로 된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "응집"은 하나 이상의 현탁된 불용성 또는 가용성 불순물을 제거하기 위하여, 본 발명에 기재된 중합체 또는 화학적으로 처리된(예컨대, 산 처리) 것과 같은 응집제를 용액에 부가하는 것을 지칭한다. 상기 중합체는 전형적인 고체-액체 분리 방법을 통하여 용액으로부터 제거될 수 있는 불용성 응집물의 자연적 형성을 허용하는 농도로 용액에 부가되어야 한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "조성물", "용액" 또는 "샘플"은 하나 이상의 바람직하지 않은 개체 또는 불순물과 함께 본 발명에 기재된 하나 이상의 자극 감응성 중합체 또는 화학적으로 처리된(예컨대, 산 처리) 것을 사용하여 표적 분자 또는 정제될 소망하는 생성물의 혼합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 공급원료 또는 표적 분자 또는 소망하는 생성물이 분비될 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 하나 이상의 불순물(예컨대, 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 세포 배양 첨가제, 세포 및 세포 파쇄물)과 함께 표적 분자(예컨대, 치료성 단백질 또는 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 세포 배양 배지로 분비될 관심 표적 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 하나 이상의 자극 감응성 중합체 또는 화학적으로 처리된 (예컨대, 산 처리) 것을 사용하여 정제될 표적 분자로부터의 샘플은 샘플을 자극 감응성 중합체와 접촉하기 전에 "부분적으로 정제"된다. 부분적 정제는 상기 샘플을 예컨대 하나 이상의 비-치환성 크로마토그래피 단계와 같은 하나 이상의 정제 단계에 처리시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 상기 표적 분자는 하나 이상의 불순물을 석출하는 것에 의해 또는 표적 분자를 석출시키는 것에 의해 하나 이상의 바람직하지 않은 개체 또는 불순물로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "석출하다" "석출하는" 또는 "석출"은 결합된(예컨대, 관심 생체분자와의 착물) 또는 미결합 중합체 또는 기타 가용성 종을 수용성 및/또는 가용성 상태로부터 비-수성 및/또는 불용성 상태로 변경하는 것을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "관심(있는) 생체분자"는 예를 들어 소망하는 생성물 또는 관심 폴리펩티드(예컨대, 항체)와 같은 소망하는 표적 분자일 수 있거나, 또는 소망하는 표적 분자를 함유하는 샘플로부터 제거될 필요가 있는 바람직하지 않은 개체일 수 있다. 이러한 바람직하지 않은 개체는 비제한적으로 예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 단백질 응집물, 세포 배양 첨가제, 바이러스, 내독소, 전체 세포 및 세포 파쇄물로부터 선택된 하나 이상의 불순물을 포함한다. 또한, 상기 관심 생체분자는 본 발명에 기재된 바와 같은 자극 감응성 중합체 또는 화학적으로 처리된(예컨대, 산 처리) 것에 의해 결합되어 석출될 수 있다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "표적 분자", "표적 생체분자", "소망하는 표적 분자" 및 "소망하는 표적 생체분자"는 일반적으로 관심 폴리펩티드 또는 관심 생성물을 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 바람직하지 않은 개체, 예컨대, 하나 이상의 불순물로부터 정제되거나 분리되는 것이 바람직한 관심 폴리펩티드 또는 관심 생성물을 지칭한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "관심 단백질", "표적 폴리펩티드", "관심 폴리펩티드" 및 "표적 단백질"은 일반적으로 본 발명에 따른 자극 감응성 중합체를 사용하여 정제될 항체를 비제한적으로 포함하는 치료성 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 일반적으로 약 10개 보다 많은 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체는 단백질 또는 폴리펩티드와 함께 샘플에 존재하는 하나 이상의 바람직하지 않은 개체로부터 단백질 또는 폴리펩티드를 분리하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 개체는 정제될 단백질 또는 폴리펩티드와 함께 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 불순물이다. 상술한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체는 자극을 샘플에 부가하면 관심 단백질 또는 폴리펩티와 특이적으로 결합하여 석출한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체는 자극의 부가시 예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 전체 세포, 세포 파쇄물 및 세포 배양 첨가제와 같은 관심 단백질 또는 폴리펩티드 이외의 개체와 결합하여 석출한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체를 사용하여 정제될 단백질 또는 폴리펩티드는 포유류 단백질, 예컨대, 치료성 단백질 또는 치료법에 사용될 수 있는 단백질이다. 예시적 단백질은 비제한적으로 예를 들어, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 루테인화 호르몬; 글루카곤; 응고 인자; 항-응고 인자; 심방성 나트륨 배설 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제(enkephalinase); RANTES(활성화시 정상적으로 T-세포 발현되고 분비되게 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민; 뮐러리안-억제성(Muellerian-inhibiting) 물질; 릴락신 A-사슬; 릴락신 B-사슬; 프로릴락신; 마우스 고나도트로핀-관련; 베타-락타마제와 같은 미생물 단백질; Dnase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자; 표피 성장 인자(EGF); 트랜스포밍 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-l 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1 -3)-IGF-l(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP); CD 단백질; 에리쓰로포이에틴; 골유도성 인자; 이뮤노톡신; 골 형태형성성 단백질 (BMP); 인터페론; 인터루킨(II), 예컨대, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕해 가속 인자; 바이러스성 항원, 예를 들어, AIDS 엔빌로프의 일부; 수송 단백질; 호밍(homing) 수용체; 어드레신(addressin); 조절 단백질; 인테그린; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 수록한 폴리펩티드의 단편 및/또는 변이체를 포함한다.
또한, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 스마트 중합체를 사용하여 정제된 단백질 또는 폴리펩티드는 항체, 그의 기능적 단편 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역을 함유하는 재조합 단백질이다.
용어 "면역글로불린", "Ig" 또는 "항체"(본 발명에서 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 기본적 4개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 디설피드 결합에 의해 안정화되며, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "단일-사슬 면역글로불린" 또는 "단일-사슬 항체"(본 발명에서 상호교환적으로 사용됨)는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진 2개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어, 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화되며, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-플리티드 시트 및/또는 사슬간 디설피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예컨대 3 내지 4개 펩티드 루프 포함)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구형 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 본 발명에서는 "불변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 서열 변화의 상대적 결여, 또는 "가변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 현저한 변형을 기본으로 하여 "불변" 또는 "가변"으로도 칭한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 당해 분야에서 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로도 칭한다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로 칭한다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인이라 칭한다.
면역글로불린 또는 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날(polyclonal)일 수 있고 또 단량체 또는 중합체 형태, 예를 들어, 오량체 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체로 존재할 수 있다. 면역글로불린 또는 항체는 리간드-특이적 결합 도메인을 포함하거나, 또는 포함하도록 변형되는 한 다수특이적 항체(예컨대, 이특이적 항체), 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 용어 "단편"은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬에 비하여 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 지칭한다. 단편은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 얻을 수 있다. 단편은 재조합 수단에 의해서도 얻을 수 있다. 재조합적으로 생성되면, 단편은 단독으로 발현되거나 또는 융합 단백질이라 불리는 더 큰 단백질의 일부로 발현된다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 면역글로불린 또는 항체는 관심 "항원"에 대하여 생성되는 것이다. 바람직하게는, 상기 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며 질병 또는 장애에 걸린 포유류에 항체를 투여하면 그 포유류에서 치료 효과를 초래할 수 있다. 비폴리펩티드 항원(종양-관련된 당지질 항원과 같은; 미국 특허번호 5,091,178호)에 대한 항체도 또한 고려한다. 항원이 폴리펩티드이면, 트랜스멤브레인(transmembrane) 분자(예컨대 수용체) 또는 성장인자와 같은 리간드일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻은 항체, 즉 미량으로 존재할 수 있는 천연산출 돌연변이를 제외하고는 집단을 포함하는 개별 항체가 동일한 것을 지칭한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대하여 고 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정인자(항원결정부:eptitope)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날)항체 제제와 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대한 것이다. 한정어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특징을 나타내며, 또 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 이해되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용할 모노클로날 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(참조, 예컨대, 미국 특허번호 4,816,567호). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기재된 수법을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도되거나 또는 특정 항체 클래스(class) 또는 서브클래스(subclass)에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동이고, 상기 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유도되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 "키메라" 항체 (면역글로불린)뿐만 아니라 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편을 포함한다(미국 특허번호 4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 발명에 정의된 바와 같은 고가변(hypervariable) 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비-인간 (예컨대, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수용체의 고가변 영역 잔기가 소망하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)으로부터의 고가변 영역 잔기에 의해 치환되어 있는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부의 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 개선하게 된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 고가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 고가변 루프에 상응하며 또 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 고가변 루프이다.
인간화된 항체는 경우에 따라 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 또한 포함할 것이다. 상세하게는, Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 ( 988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 감응성 중합체를 사용하여 분리되거나 또는 정제된 항체는 치료성 항체이다. 예시적 치료성 항체는 예를 들어, 트라츠주맙(HERCEPTIN™, Genentech, Inc., Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289; 미국 특허번호 5,725,856); 키메라 항-CD20 "C2B8"와 같은 항-CD20 항체, 미국 특허번호 5,736,137호; 항-lgE (Presta et al (1993) J. Immunol. 151 :2623-2632; WO 95/19181호); 항-CD18 (미국 특허번호 5,622,700호; WO 97/26912호); E25, E26 및 E27를 포함하는 항-IgE (미국 특허번호 5,714,338호; 미국 특허번호 5,091,313호; WO 93/04173호; 미국 특허번호 5,714,338호); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793호); cA2 (REMICADE™), CDP571 및 MAK-195를 포함한 항-TNF-알파 항체(미국 특허번호 5,672,347호; Lorenz et al (1996) J. Immunol. 156(4): 1646-1653; Dhainaut et al (1995) Crit. Care Med. 23(9):1461-1469); 항-조직 인자 (TF) (EP 0 420 937 B1호); cM-7412 항체와 같은 항-CD4 항체(Choy et al (1996) Arthritis Rheum 39(1): 52-56); Graziano et al (1995) J. Immunol. 155(10):4996-5002에 기재된 바와 같은 Fc 감마 Rl에 대한 M22 항체와 같은 항-Fc 수용체 항체; 항-Gpllb/llla 항체; MEDI-493 (SYNAGIS™)와 같은 항-RSV 항체; PROTOVIR™와 같은 항-CMV 항체; PRO542와 같은 항-HIV 항체; 항-Hep B 항체 OSTAVIR™와 같은 항-간염 항체; 항-CA 125 항체 OvaRex; 항-유전자형 GD3 항원결정부위 항체 BEC2; 항-알파 v 베타3 항체 VITAXIN™; ch-G250과 같은 항-인간 신장 세포 암종 항체; ING-1; 항-인간 17-1A 항체(3622W94); 및 스마트 ID10 및 항-HLA DR 항체 Oncolym (Lym-1)과 같은 항-인간 백혈구 항원(HLA) 항체를 포함한다.
용어 "단리하는", "정제하는" 및 "분리하는"은 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체를 사용하여 표적 분자(예컨대 관심 폴리펩티드 또는 관심 단백질)를 정제하는 내용과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 표적 분자의 순도의 정도는 본 발명에 기재된 바와 같은 자극 감응성 중합체를 사용하는 것에 의해 샘플로부터 하나 이상의 불순물을 제거(완전히 또는 부분적으로)하는 것에 의해 증가된다. 다른 실시양태에서, 샘플 중의 표적 분자의 순도의 정도는 샘플 중의 하나 이상의 불순물ㄹ로부터 표적 분자를 석출하는 것에 의해서 증가된다.
일부 실시양태에서, 정제 공정은 부가적으로 하나 이상의 "크로마토그래피 단계"를 적용한다. 전형적으로, 이들 단계는 본 발명에 따른 자극 감응성 중합체를 사용하여 하나 이상의 바람직하지 않은 개체로부터 표적 분자를 분리한 후 필요에 따라 실시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 자극 감응성 중합체를 사용하여 관심 폴리펩티드 또는 관심 단백질을 단리, 분리 또는 정제하는 "정제 단계"는 본 발명에서 관심 단백질을 포함하는 조성물 중에 100 ppm 미만의 HCP를 포함하는, 다르게는 90 ppm 미만, 80 ppm 미만, 70 ppm 미만, 60 ppm 미만, 50 ppm 미만, 40 ppm 미만, 30 ppm 미만, 20 ppm 미만, 0 ppm 미만, 5 ppm 미만, 또는 3 ppm 미만의 HCP를 포함하는 조성물 또는 샘플을 지칭하기 위해 이용되는 "균질" 또는 "순수한" 조성물 또는 샘플을 초래하는 전체 정제 공정의 일부일 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "일차 정화"는 응집제를 사용하여 약 10 마이크론(㎛)보다 큰 크기를 갖는 응집된 세포 파쇄물 및 콜로이드성 미립자 또는 그보다 작은 입자를 포함한 응집된 세포 바이오매스를 제거하는 것을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "정화하다", "정화", "정화 단계"는 일반적으로 생체분자의 정제에서 처음으로 사용된 하나 이상의 단계를 지칭한다. 상기 정화 단계는 일반적으로 이하의 단독 또는 그의 다양한 조합을 포함하는, 예컨대, 정화 심층 여과, 석출, 응집 및 침강의 하나 이상의 단계를 이용하여 세포 및/또는 세포 파쇄물을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 다양한 정제 계획에서 일반적으로 사용되는 통상의 정화 단계에 대하여 개선점을 제공한다. 정화 단계는 일반적으로 하나 이상의 바람직하지 않은 개체를 제거하는 것을 포함하며 또 소망하는 표적 분자의 포획을 포함하는 단계 이전에 전형적으로 실시된다. 정화의 다른 주요 요지는 나중에 정제 공정에서 멸균 필터의 막힘을 초래할 수 있는 샘플 중의 가용성 및 불용성 성분을 제거하여, 전체 정제 공정을 더욱 경제적으로 만드는 것이다. 또한, 정화 효율을 향상시키는 방법, 예컨대 석출이 이용될 수 있다. 불순물의 석출은 응집, pH 조절(산 석출), 온도 변동, 자극-감응성 중합체 또는 소분자로 인한 상 변화와 같은 다양한 방법 또는 이들 방법의 조합에 의해 실시될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "크로마토그래피"는 혼합물에 존재하는 다른 분자로부터 관심 분석물(예컨대 표적 분자)를 분리하는 임의 종류의 수법을 지칭한다. 통상, 관심 분석물은 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향하에 정지 매질를 통하여 이동하는 속도에서 차이로 인하여 다른 분자로부터 분리되거나, 또는 결합 및 용출 공정에서 분리된다.
용어 "크로마토그래피 수지" 또는 "크로마토그래피 매질"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용되며 또 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 관심 분석물(예컨대 표적 분자)를 분리하는 임의 종류의 상(예컨대 고상)을 지칭한다. 보통, 관심 분석물은 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향하에서 정지 고상을 통하여 이동하는 속도 차의 결과로 다른 분자로부터 분리되거나, 또는 결합 및 용출 공정으로 분리된다. 크로마토그래피 매질의 다양한 유형의 예는 예를 들어, 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환수지, 음이온 교환막, 소수성 상호작용 수지 및 이온 교환 모노리식(monolithic)을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "포획 단계"는 일반적으로 표적 분자가 자극 감응성 중합체 또는 크로마토그래피 수지와 결합시키기 위하여 사용된 방법을 지칭하며, 표적 분자 및 중합체 또는 수지의 침전을 함유하는 고상을 초래한다. 전형적으로, 상기 표적 분자는 이후 고상으로부터 표적 분자를 제거하는 용출 단계를 이용하여 회수되어, 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자의 분리를 초래한다. 다양한 실시양태에서, 상기 포획 단계는 수지, 막 또는 모노리식과 같은 크로마토그래피 매질, 또는 자극 감응성 중합체, 고분자전해질 또는 표적 분자를 결합하는 중합체와 같은 중합체를 사용하여 실시될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "염"은 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 본 발명에 기재된 방법에 이용된 다양한 완충액에 사용될 수 있는 다양한 염은 비제한적으로 아세트산염(예컨대 아세트산 나트륨), 시트르산염(예컨대, 시트르산 나트륨), 염화물(예컨대, 염화 나트륨), 황산염(예컨대, 황산 나트륨) 또는 칼륨 염을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "용매"는 일반적으로 하나 이상의 다른 물질을 용해 또는 분산시켜 용액을 제공할 수 있는 액체 물질을 지칭한다. 용매는 수성 및 유기 용매를 포함하며, 유용한 유기 용매는 비-극성 용매, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 2,2-티오디글리콜을 포함한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "백만당 부" 또는 "ppm"은 본 발명에 기재된 바와 같은 자극 감응성 중합체를 사용하여 정제된 소망하는 표적 분자(예컨대 표적 단백질 또는 항체)의 순도의 정도를 지칭한다. 따라서, 상기 정도는 정제 공정 후에 존재하는 표적 분자의 양을 측정하거나 또는 바람직하지 않은 개체의 양을 측정하는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단위 "ppm"은 용액 중의 불순물의 양, 예컨대 나노그램/밀리리터의 관심 단백질 중의 HCP 또는 CHOP (밀리그램/밀리리터)(즉, CHOP ppm= (CHOP ng/ml)/(관심 단백질 mg/ml))을 지칭한다. 상기 단백질이 건조되면(예컨대, 동결건조에 의해), ppm은 (CHOP ng)/(관심 단백질 mg))을 지칭한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하를 균형을 맞추는 pH를 지칭하며, pI는 아미노산 잔기 또는 폴리펩티드의 부착된 탄수화물의 시알산 잔기의 네트 전하로부터 산출할 수 있거나, 또는 등전포커싱(isoelectric focusing)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "결합 및 용출 모드" 및 "결합 및 용출 공정"은 샘플에 함유된 적어도 하나의 표적 분자(예컨대, Fc 영역 함유 단백질)가 적합한 수지 또는 매질(예컨대 친화성 크로마토그래피 매질 또는 양이온 교환 크로마토그래피 매질)과 결합하고 이어 용출되는 분리 수법을 지칭한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "플로우 쓰루 공정", "플로우 쓰루 모드" 및 "플로우 쓰루 작업"은 하나 이상의 불순물과 함께 생물약학적 제제에 함유된 적어도 하나의 표적 분자(예컨대 Fc 영역 함유 단백질 또는 항체)가 하나 이상의 불순물과 통상 결합하는 물질을 통하여 통과하며 상기 표적 분자는 보통 결합하지 않는(즉, 플로우 쓰루하는) 분리 수법을 지칭한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "공정 단계" 또는 "단위 작업"은 정제 공정에서 특정 결과를 달성하기 위한 하나 이상의 방법 또는 장치의 이용을 지칭한다. 본 발명에 기재된 공정 및 시스템에 이용될 수 있는 공정 단계 및 단위 작업의 예는 비제한적으로 정화, 결합 및 용출 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 플로우 쓰루 정제 및 배합을 포함한다. 공정 단계 또는 단위 작업의 각각은 공정 단계 또는 단위 작업의 목적하는 결과를 달성하기 위한 하나 이상의 단계 또는 방법 또는 장치를 이용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명에 기재된 바와 같은 상기 정화 단계 및/또는 플로우 쓰루 정제 단계는 공정 단계 또는 단위 작업을 달성하기 위한 하나 이상의 단계 또는 방법 또는 장치를 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공정 단계 또는 단위 작업을 실시하기 위해 이용되는 하나 이상의 장치는 단일-사용 장치일 수 있고 또 공정 중에 다른 장치를 교체할 필요없이 또는 공정 실시를 중단할 필요없이 제거되거나 및/또는 교체될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "기공 크기" 및 "명목 기공 크기"는 등급화된 기공 크기의 60-98%에서 미립자의 대다수를 보유하는 기공 크기를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "처리량(throughput)"은 필터를 통하여 여과된 부피를 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "시스템"은 일반적으로 본 발명에 기재된 바와 같은 2 이상의 공정 단계 또는 단위 작업을 포함하는, 전체 정제 공정의 물리적 형태를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 멸균 환경에서 밀폐된다.
본 발명에서, 개방 등급화된 층의 이용은 표면 상에서 수집하기 보다는 더 큰 입자가 통과하여 필터의 심층 내에서 포획되게 한다(실시예 2A 및 2B 참조).
이점은 케이크 형성 문제를 제거하면서도 대형 고체(0.5 마이크론 내지 약 200 마이크론)를 많은 처리량 및 보유하는 것이다. 일차 정화 필터에서 개방 기공의 사용은 압력에서 선형적 증가와 압력에서 현저한 증가없이 고체 체류를 갖는 심층 필터를 제공하므로 높은 처리량을 초래한다. 층의 최적화(기공 크기 및 두께)와 조합된 필터의 구조적 치수는 다량의 고형분을 유지할 수 있는 예외적 여과 특성을 제공한다.
본 발명에서, 개방 등급화된 층의 사용은 공급물 스트림 중의 더 큰 응집 입자가 필터의 심층으로 침투되게 하여 표면 상에서 수집되기 보다는 필터의 기공 내에서 포획되게 하는 것이다(실시예 9 (A-E) 및 11 (A-J) 참조). 본 발명에서 제공된 상기 일차 정화 심층 필터는 상기 "개방" 상부 층이 더 큰 응집 입자를 포획하기 위한 심층 필터의 예비여과 대역(prefiltration zone)을 구성하고, 하부 층은 더 작은 잔류 응집 입자를 포획하는 연마 대역(polishing zone)을 구성하도록 배열된다. 이러한 유형의 정렬을 갖는 일차 정화 심층 필터의 1개 이점은 처리량이 더 많고 대형 응집 고체를 더 보유하는 한편, 케이크 형성 문제를 해결하는 것이다. 본 발명에 개시된 일차 정화 필터에서 이러한 개방 기공의 사용은 고체 보유에 의한 압력의 선형적 증가를 제공하나 압력의 현저한 증가를 제공하지 않으므로 더 많은, 더욱 바람직한 처리량을 초래한다.
본 발명에 따른 일차 정화 심층 필터의 예는 도 1A, 1B, 1C, 1D, 1E 및 1F에 도시되어 있다.
도 1C는 적어도 7층을 갖고 세포 배양 공급물이 중합체 응집제(예컨대, 스마트 중합체 또는 전통적인 응집제)에 의해 처리될 때 사용되는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 1A 및 1E는 적어도 8층을 갖고 세포 배양 공급물이 중합체 응집제(예컨대, 스마트 중합체 또는 전통적인 응집제)에 의해 처리될 때 사용되는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 1B, 1D, 및 1F는 적어도 8층을 갖고 세포 배양 공급물이 화학적으로 처리(예컨대 산 처리)될 때 사용되는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 1A에 도시된 상기 일차 정화 심층 필터는 중합체 응집제(예컨대, 스마트 중합체)에 의해 세포 배양 공급물이 처리될 때 사용되며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 100 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 (상부)층을 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 50 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개 층을 가지며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 25 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 추가 층을 갖고, 이어 셀룰로오스(CE25)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 단일층, 및 예를 들어 규조토(DE40)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 다른 단일층을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 1B에 도시된 상기 일차 정화 심층 필터는 중합체 응집제(예컨대, 스마트 중합체)에 의해 세포 배양 공급물이 화학적으로 처리(예컨대 산 처리)될 때 사용되며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 25 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 (상부)층을 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 10 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개 층을 더 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 5 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 추가 층을 가지며, 셀룰로오스(CE25)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 단일층, 및 예를 들어 규조토(DE40)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 다른 단일층을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다. 셀룰로오스 또는 규조토층은 최저(저부)층으로 선택될 수 있다.
도 1C에 도시된 상기 일차 정화 심층 필터는 중합체 응집제(예컨대, 스마트 중합체)에 의해 세포 배양 공급물이 처리될 때 사용되며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 100 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 (상부)층을 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 100 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개 층을 더 가지며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 100 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 추가 층을 갖고, 약 0.2 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 8 미크론 두께의 단일층(저부)을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 1D에 도시된 상기 일차 정화 심층 필터는 세포 배양 공급물이 화학적으로 처리(예컨대, 산 처리)될 때 사용되며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 50 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 (상부)층을 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 25 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개 층을 가지며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 10 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 추가 층을 가지며, 셀룰로오스(CE25)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 단일층, 및 예를 들어 규조토(DE40)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 다른 단일층을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다. 셀룰로오스 또는 규조토층은 최저(저부)층으로 선택될 수 있다.
도 1E에 도시된 상기 일차 정화 심층 필터는 세포 배양 공급물이 중합체 응집제(예컨대, 스마트 중합체)로 처리될 때 사용되며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 100 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 (상부)층을 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 50 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개 층을 가지며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 25 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 추가 층을 갖고, 셀룰로오스(CE25)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 단일층에 이어, 예를 들어 규조토(DE40)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 다른 단일층을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다.
도 1F에 도시된 상기 일차 정화 심층 필터는 세포 배양 공급물이 화학적으로 처리(예컨대, 산 처리)될 때 사용되며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 35 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 (상부)층을 갖고, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 15 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개 층을 가지며, 약 0.4 cm 두께의 폴리프로필렌과 같은 부직물의 약 10 마이크론의 명목상 기공 크기를 갖는 2개의 추가 층을 갖고, 셀룰로오스(CE25)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 단일층에 이어, 예를 들어 규조토(DE40)와 같은 물질의 약 0.35 cm 두께의 다른 단일층을 갖는 일차 정화 심층 필터를 도시한다. 셀룰로오스 또는 규조토층은 최저(저부)층으로 선택될 수 있다.
일차 정화 심층 필터의 기공 크기 및/또는 두께의 최적화와 함께 본 발명에 제공된 일차 정화 심층 필터의 구조적 치수는 다량의 고형분을 역시 함유하는 굉장히 유리한 여과 특성을 초래한다. 심층 필터는 다양한 메카니즘의 조합을 통하여 매질의 심층을 통하여 여과를 달성하기 때문에, 공급물의 컬럼 부피(Vf) 대 매질의 컬럼 부피(Vm)는 상이한 필터 효능을 나타낸다.
또한, 다양한 공급물은 심층 필터의 고도의 가변 성능을 초래하는 상이한 양의 고형분을 가지므로, (Vf) 대 (Vm) 값은 필터의 실제 "효율"의 더 우수한 예상치를 낸다.
다른 중요한 변수, K,는 공급원료의 고형분 함량에 대해 규준화하면서 필터 효율을 기재하기 위해 사용된다. 변수 K는 효과적으로 비교될 상이한 고형분 함량을 갖는 공급물의 여과를 허용한다.
K 변수는 방정식 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 측정가능한 변수인 부피 처리량(TP), 수집 효율(η), 및 고형분의 초기 농도(Ci)의 함수이다:
Figure 112015006237930-pat00001
식 중에서, 부피 처리량(TP)은 매질의 부피(Vn)에 의해 나눠진 여과된 공급물의 부피(Vf)로 구하며, 수집 효율(η)은 공급물 중의 고형분의 부피(Vs)로 나눠진 포획된 고형분의 부피(Vsc)로 구하며, 및 고형분의 초기 농도(Ci)는 방정식 2에 나타낸 바와 같이 여과된 공급물의 부피(Vf)로 나눠진 공급물 중의 고형분의 부피(Vs)로 구해진다.
Figure 112015006237930-pat00002
하기 실시예는 특정 공급원료와 함께 사용될 때 입자 심층 필터의 효율을 결정하고 비교함에 있어서 방정식(1) 및 (2) 그리고 K 변수의 유용성을 나타낼 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 조성물을 어떻게 제조하고 또 본 발명의 방법을 어떻게 실시하는가에 대한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 공급하기 위하여 제공되며 본 발명자들이 그의 발명으로 고려하는 범위를 제한하려는 것이 아니다. 사용된 숫자(예컨대 양, 온도 등)에 관한 정확성을 확실히 하기 위하여 노력을 기울렸으나, 일부 실험의 오차 및 편차를 헤아려야 한다. 특별히 다르게 나타내지 않는한, 온도는 섭씨이고, 화학반응은 대기압 또는 트랜스멤브레인 압력에서 실시되었다. 용어 "주위 온도"는 약 25℃를 지칭하고. 또 "주위 압력"은 대기 압력을 지칭한다.
비교예
침강은 긴 침강 시간(시간)으로 인하여 흔히 실패한다. 층을 이루지 않은 대형 부피의 세포 플록 덩어리의 처분은 세포 덩어리에 상당량의 mAb가 포획되어 있어 낮은 mAb 수율을 초래한다. (실시예 5 참조)
케이크 여과는 세포 덩어리가 압력하에서 파쇄되기 때문에 실패한다. 즉, 세포 파쇄물은 응력하에서 중합체로부터 떨어져서 여액 중에 높은 탁도로 흘러간다 (실시예 6 참조).
심층 여과는 플럭, 특히 중합체 시스템으로부터 얻은 플럭이 100 마이크론 크기로 매우 대형이기 때문에 실패한다. 심층 여과에 필요한 매질로 침투하는 대신, 대형 플럭이 곧 심층 필터 매질의 표면상에 쌓여서, 심층 필터 매질이 효과없는 케이크 필터로 되는 것을 줄인다. (실시예 7 참조).
접선 여과와 같은 동적 여과 또는 진동된 필터 매질은 케이크 형성을 감소시키는데 필요한 전단 응력이 플럭이 개별 입자로 돌아가는 것을 깨지게 하여 응집의 효율을 무효화하기 때문에 성공적이지 못하였다. (실시예 8 참조).
본 발명은 본 발명의 예로 든 하기 실시예에 의해 또한 명백해질 것이다.
실시예
실시예 1.
정화되지 않은 비-발현성 세포 배양물 유체(CCF)의 제조
대표적 실험으로, 발현성 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주로부터 유도된 세포를 10L 바이오리액터(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)에서 10x106 세포/mL 밀도로 성장시키고 또 80% 생존력으로 수집하였다. 모노클로날 항체(mAb) 역가는 0.8 g/L로 결정되었다. 숙주 세포 단백질(HCP)의 수준은 ELISA 에세이(Cygnus Technologies, Southport, NC, # 3G ELISA)를 이용하여 200,000 ng/mL로 밝혀졌다. 정화되지 않은 세포 배양물의 pH는 pH 6.9이었다.
실시예 2.
다가 이온 자극 민감성 중합체의 제조.
10 g의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan 150 kD; 40% wt/wt)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 투입하고 또 25 mL H2O에 3.34g의 수산화 나트륨(단량체당 1.2 당량)이 용해된 용액을 자기 교반기하의 실온에서 소량으로 부가하였다. 염화벤질(2.30 g, 2.09 mL)을 부가하고, 실온에서 수분간 교반한 다음 60℃에서 철야로 17시간 동안 가열하였다. 이어 반응을 실온으로 냉각하고 또 용매를 제거하여 중합체 석출을 초래하였다. 석출된 중합체를 물로 세척하고 또 완전한 용해가 달성될 때까지 1M 수성 AcOH 용액(40 ml)에서 교반하였다. 이 용액을 H2O에 의해 희석하여 최종 부피 400 ml(1% 중합체 용액)를 얻었다. 이염기성 인산 칼륨(K2HP04)(3.48g)을 교반하에 부가하고 또 이 용액의 pH를 pH 6.8로 조정하여 변형된 중합체를 석출시켰다. 이 중합체는 프릿팅된 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하여 마지막으로 진공 오븐 중, 50℃ 내지 60℃에서 철야로 건조시켰다. 이 중합체를 1M 아세트산에 용해시켜 10% wt 중합체 농축 용액을 생성하였다.
실시예 3.
CHO-S 공급물의 스마트 중합체(SmP) 처리.
세포 배양물을 SmP에 의해 응집시키기 위하여, 실시예 1로부터 얻은 세포 배양 브로쓰의 500 ml 샘플을 1000 ml 매질 병에 부가하였다. 교반하는 동안, 실시예 2로부터 얻은 중합체 농축물 샘플을 소망하는 중합체 투여량(wt%), 전형적으로 0.2%에 부가하였다. 이 용액을 15분간 혼합시켰다.
실시예 4.
CHO-S 공급물의 산 처리
세포 배양물을 pH를 감소시키기 위한 산의 부가에 의해 응집시키기 위하여, 실시예 1로부터 얻은 세포 배양 브로쓰의 500 ml 샘플을 1000 ml 매질 병에 부가하였다. 교반하면서, 농축된 아세트산을 소망하는 pH가 달성될 때까지 부가하였다. 표적 pH는 다르게 나타내지 않는 한 pH 4.8-5.0이었다. 이 용액을 15분간 혼합시켰다.
실시예 5.
스마트 중합체 (SmP) 처리된 CHO-S 공급물에 대한 침강 연구
SmP 처리된 공급물의 고액 분리를 실시하기 위하여 밀도 차이를 이용하는 효능을 결정하기 위하여 침강 실험을 상이한 침강 시간으로 실시하였다. 500 ml의 세포 배양 브로쓰를 실시예 3에 따라 제조하였다.
SmP 처리된 공급물을 약 0.5 내지 6시간 동안 침강처리시키고, 또 상층액의 샘플을 취하여 고형분의 탁도와 부피를 측정하였다. 탁도는 HACH 모델 #21 OOP 탁도계를 이용하여 측정하였다. 표 1은 0.5 내지 6시간의 다양한 시간 동안 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대한 침강 연구를 나타낸다.
침강 시간은 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대한 평형 탁도 < 약 20 NTU에 도달하기 위하여 > 약 180 분이었고, 또 SmP 처리된 CHO-DH44 공급물에 대한 평형 탁도 < 약 20 NTU에 도달하기 위하여 약 120분임이 관찰되었다.
가장 적은 중합체 투여량(0.05%)이 사용될 때, 불완전한 응집은 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대한 12시간의 침강 시간 이후에도 증가된 탁도(> 약 350 NTU)를 초래한다. 또한, 3시간의 침강 시간은 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대하여 층을 이루지 않은 세포 덩어리의 최대 부피(약 30% 내지 40%) 및 SmP 처리된 CHO-DH44 공급물에 대해 20%를 가지며, 이는 상당량의 mAb가 층을 이루지 않은 덩어리 내에 포획되어 있기 때문에 낮은 mAb 수율(약 60% 내지 80%)를 초래할 수 있었다.
표 1
스마트 중합체 처리된 CHO-S 공급물에 대한 침강 연구
Figure 112015006237930-pat00003
실시예 6.
스마트 중합체(SmP) 처리된 DG44 및 CHO-S 공급물에 대한 케이크 여과
케이크 여과의 효능을 결정하기 위하여 규조토(DE) 매질을 사용하였다. 먼저, DE를 부크너 깔때기 내에 적어도 약 4 cm 깊이로 팩킹한 다음 그를 통하여 진공을 인가하는 것에 의해 실시예 3으로부터의 SmP 처리된 공급물을 통과시켰다. 규조토 매질을 통하여 여과하는 동안, CHO-S 세포는 20㎛ 체 상에 필터 케이크의 필름을 형성하였다. 필터 케이크는 여액이 외부로 흐르는 것을 방해하여 처리량 < 약 10 L/m2의 처리량을 초래함이 관찰되었다. 또한, 세포 덩어리는 응력하에서 중합체로부터 부서져서 높은 탁도의 여액(약 200 NTU 내지 300 NTU)을 초래하며, 이는 이차 여과 작업에 현저한 영향을 줄 수 있다.
실시예 7.
상업적으로 입수가능한 일차 정화 필터(D0HC 및 F0HC)를 이용한 스마트 중합체(SmP) 처리된 CHO-S 공급물에 대한 심층 여과
여과 실험은 실시예 3으로부터의 스마트 중합체(SmP) 처리된 CHO-S 공급물 및 실시예 4로부터의 산 처리된 공급물을 사용하여 상업적으로 입수가능한 MilliStak® DOHC 심층 필터의 처리량을 결정하기 위하여 실시하였다. DOHC 필터는 사용자 지시에 따라서 물에 의해 세척하였다. 공급물은 연동 펌프를 이용하여 약 100 L/m2/hr 유량으로 심층 필터에 적용하였다. 그러나, 심층 필터는 고-고형분 공급물 스트림은 취급할 수 없었다. 상기 응집된 세포는 더 커서 심층 여과에 필요한 매질에 대해 침투하는 대신 대형 미립자가 심층 필터 매질 표면 상에 축적되어서 심층 필터 매질 표면이 무효한 케이크 필터로 되는 것을 감소시키기 때문에 주로 실패하는 것으로 믿어진다. DOHC는 SmP 처리된 공급물에 대하여 약 20 L/m2의 처리량을 가졌고 또 F0HC는 산 처리된 공급물에 대하여 약 5 L/m2의 처리량을 가졌다. 대형 플록 입자로부터의 필터 케이크 형성은 주로 필터의 긴밀도(tightness)에 기인하여 필터의 처리량을 현저히 감소시켰다.
실시예 8.
스마트 중합체 (SmP) 처리된 공급물에 대한 동적 여과
접선유동 Pellicon® 3(0.11 m2) 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)를 이용한 동적 여과 실험은 SmP 처리된 공급물의 고액 분리의 효율을 결정하기 위하여 실시하였다. 여과 장치는 폴리비닐 디플루오라이드(PVDF) 막으로 제작된 정밀 여과 막(0.45 ㎛)을 함유하였다. SmP 처리된 세포 배양 수집물은 TMP가 15 psi에 도달할 때까지 50 L/m2/h로 로딩하였다. Pellicon® 3 장치의 순간 막힘이 관찰되어, 처리량 < 5 L/m2의 처리량을 초래하였다. 급속한 막힘 및 시스템과 장치 보유 부피에 의해 생긴 물질 손실로 인하여 불량한 수율이 관찰되었다.
실시예 9A.
응집된 및 대형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
심층 여과 장치(10)는 전체 층 1.6 cm의 총 두께를 갖는 부직 섬유(폴리프로필렌)의 7개 (7) 층을 사용하여 조립하였다. 상기 층은 가장 개방된 명목상 기공 크기 200 ㎛(2개층)에 이어 명목상 50 ㎛(2개층), 명목상 40 ㎛(2개 층)에서부터 단일 명목상 8 ㎛ 층에 이르는 심층 여과 장치에 배열된다(도 1 참조).
부직 섬유(로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, Ann Arbor, Ml)의 7개 (7) 층(니들 펠트)의 개별 특성은 표 3에 나타낸다(2층 x 200 ㎛, 2층 x 50 ㎛, 2층 x 40 ㎛, 및 1층 x 8 ㎛). 상기 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘(barb) 단부 캡을 상부와 하부에 부가하며 또 전체 어셈블리는 단일의 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰드(overmolded)되었다. 이 심층 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.45 L/분의 값을 얻었다.
표 3
로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드 및 미드웨스트 필트레이션 컴패니로부터 입수한 부직 펠트 물질의 물리적 특성의 특징화
Figure 112015006237930-pat00004
실시예 9B
응집된 및 대형 생체분자 미립자의 제거를 위한 심층 필터
실시예 9B의 등급화된 심층 필터는 전체 층 1.6 cm의 깊이를 갖는 등급화된 부직 섬유로 이루어지며, 약 0.5 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 상기 등급화된 심층 필터는 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드(미국 미시건 앤아버 소재)로부터 입수가능한 부직 섬유의 7개 층으로 이루어진다(2층 x 200 ㎛, 2층 x 100 ㎛, 2층 x 50 ㎛, 및 1층 8㎛). 상기 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘(barb) 단부 캡을 상부와 하부에 부가하며 또 전체 어셈블리는 단일의 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰드(overmolded)되었다. 이 심층 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.55 L/분의 값을 얻었다.
실시예 9C.
응집된 및 대형 생체분자 미립자의 제거를 위한 심층 필터
실시예 9C의 등급화된 심층 필터는 전체 층 1.6 cm의 깊이를 갖는 등급화된 부직 섬유로 이루어지며, 약 0.5 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 상기 등급화된 심층 필터는 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드(미국 미시건 앤아버 소재)로부터 입수가능한 부직 섬유의 7개 층으로 이루어진다(3층 x 200 ㎛, 3층 x 100 ㎛ 및 1층 x 8㎛). 본 발명에서 제공된 등급화된 심층 필터는 23 cm2의 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 조립하며 또 이 심층 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.55 L/분의 값을 얻었다.
실시예 9D.
응집된 및 대형 생체분자 미립자의 제거를 위한 심층 필터
실시예 9D의 등급화된 심층 필터는 전체 층 1.6 cm의 깊이를 갖는 등급화된 부직 섬유로 이루어지며, 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 상기 등급화된 심층 필터는 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드(미국 미시건 앤아버 소재)로부터 입수가능한 부직 섬유의 7개 층으로 이루어진다(2층 x 100 ㎛, 2층 x 50 ㎛, 2층 x 40 ㎛ 및 1층 x 8 ㎛). 상기 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘(barb) 단부 캡을 상부와 하부에 부가하며 또 전체 어셈블리는 단일의 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰드(overmolded)되었다. 상기 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.5 L/분의 값을 얻었다.
실시예 9E.
응집된 및 대형 생체분자 미립자의 제거를 위한 심층 필터
실시예 9E의 등급화된 심층 필터는 전체 층 1.6 cm의 깊이를 갖는 등급화된 부직 섬유로 이루어지며, 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 중합체 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 상기 등급화된 심층 필터는 미드웨스트 필트레이션 컴패니(미국 오하이오 신씨내티 소재)로부터 입수가능한 부직 섬유의 7개 층으로 이루어진다(2층 x UniPro® 760 PP, 2층 x 100 ㎛, 2층 x 50 ㎛ 및 1층 x UniPro® 530 MM). 본 발명에서 제공된 상기 등급화된 심층 필터는 23 cm2의 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 조립하며 또 이 심층 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.65 L/분의 값을 얻었다.
실시예 10.
응집된 및 대형 생체분자 미립자의 심층 필터 제거의 여과 성능
실시예 9A-9E로부터의 필터 장치는 다음 방법을 이용하여 여과 성능에 대해 시험하였다. 심층 필터는 Milli-Q 물로 세척한 후 미처리 및 SmP 처리된 미정화된 공급물을 사용하여 압력변환기에 의해 모니터링되는 각 필터에 대해 TMP로 실시되었다. 정화되지 않은 세포 배양 수집물을 0.2 wt% 스마트 중합체(SmP) 투여량(wt%)으로 처리하고 15분간 교반하였다. 심층 필터는 필터 매질를 적셔서 추출가능한 물질을 세척하도록 미터제곱의 각 필터 면적 당 600 L/m2/h로 Milli-Q 물에 의해 ≥ 약 50 L에 의해 세척하였다. 미처리 및 SmP 처리된 정화되지 않은 수집물은 1개 필터에 대한 TMP가 20 psig에 도달할 때까지 100 L/m2/h로 로딩하였다.
표 4는 실시예 3에 기재된 공급물의 여과를 위한 일차 정화 심층 필터를 이용하여 2개의 Millistak® 필터(XOHC 및 DOHC)를 이용한 필터 처리량을 비교한다. (0.2 % (w/v) 스마트 중합체(SmP) 처리된 공급물). XOHC 및 DOHC는 10 L/m2 및 44 L/m2의 처리량을 나타낸 반면, 일차 정화 심층 필터의 처리량은 325 L/m2이었다. 모든 경우에서의 여액 탁도는 표 4에 나타낸 바와 같이 < 약 5 NTU이었다. 매질의 컬럼 부피로 나눈 여액의 컬럼 부피 측면에서, XOHC 및 DOHC는 1.5 Vf/Vm 및 6 Vf/Vm의 처리량을 나타낸 반면에, 일차 정화 심층 필터의 처리량은 16.5 CVf/CVm이었다. 실시예 9A는 84% 의 K 효율을 갖는 16.5 Vf/Vm (325 L/m2)의 부피 처리량에 의해 가장 잘 실시되었다. 이러한 비교로부터, 본 발명의 특허청구범위에 기재된 층을 포함하는 실시예 9A 필터는 정화되지 않은 세포 수집물의 정화 동안 다량의 고형분을 제거할 수 있다.
표 4:
0.2 % (w/v)의 SMP 처리된 공급물의 여과 처리량에 대한 실시예 9A에 기재된 일차 정화(PC) 심층 필터의 대조
Figure 112015006237930-pat00005
본 발명은 상이한 압력 성장 면에서 현저한 이점을 갖는다. X0HC 및 DOHC의 경우에서 유체 압력은 개시시에 더 적고 불변이지만 갑자기 기하급수적으로 증가하여 그의 한계에 도달한다. 관찰된 압력 감응과 일치하는 일개의 가능한 설명은 필터의 표면 상에서 케이크 층의 급속한 형성이다. 일차 정화 심층 필터의 경우, 압력 증가는 직선에 가깝고, 압력에서 유의한 급격한 증가는 없다. 이러한 결과는 케이크 형성을 피하면서 필터의 심층을 통하여 미립자가 포획되는 것과 일치한다. 필터 부피 처리량에서 다량 증가도 또한 관찰되는데, 이는 시판되는 X0HC 및 DOHC 필터에서 관찰되는 케이크 여과 대신 심층 여과와 일치한다.
표 5는 공급물의 컬럼 부피 대 매질의 컬럼 부피 측면에서 실시예 9B-9E에 기재된 일차 정화 필터의 필터 처리량을 비교한다.
실시예 9B에 기재된 등급화된 심층 필터는 SmP 처리된 CHO-DG44 공급물에 대하여 90%의 K 효율과 함께 32 Vf/Vm (640 L/m2)의 부피 처리량을 나타내었고, SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대하여 90%의 K 효율과 함께 22 Vf/Vm (430 L/m2)의 부피 처리량을 나타내었다.
다른 실시예 9C에서, 상기 등급화된 심층 필터는 SmP 처리된 CHO-DG44 공급물에 대하여 94%의 Kman 효율과 함께 33 Vf/Vm (660 L/m2)의 부피 처리량을 초래하였고 또 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대하여 90% K 효율과 함께 22 Vf/Vm (435 L/m2)의 부피 처리량을 초래하였다.
실시예 9D에 기재된 등급화된 심층 필터는 SmP 처리된 CHO-DG44 공급물에 대해 81%의 K 효율과 함께 29 Vf/Vm (435 L/m2)의 부피 처리량을 초래하였고 또 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대해 81%의 K 효율과 함께 20 Vf/Vm (390 L/m2)의 부피 처리량을 초래하였다.
다른 실시예 9E에서,본 발명의 특허청구범위에 기재된 등급화된 심층 필터는 SmP 처리된 CHO-S 공급물에 대하여 92%의 K 효율과 함께 33 Vf/Vm (650 L/m2)의 부피 처리량을 초래하였다.
상기 대조로부터, 특허청구범위에 기재된 층을 포함하는 실시예 9A-9E 필터는 정화되지 않은 세포 수집물의 정화 동안 대량의 고형분을 제거할 수 있음이 분명하다.
표 5:
0.2 % (w/v)에 의해 처리된 공급물의 여과 처리량에 대한 실시예 9B-9E에 기재된 일차 정화 (PC) 심층 필터의 대조
Figure 112015006237930-pat00006
실시예 11A.
응집된 및 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
화학적으로 처리된 공급물(예컨대, 산 처리)은 < 약 5 ㎛ 내지 > 약 20 ㎛의 평균 입자 크기를 증가시키는 능력을 갖는다. 또한, 상기 산 처리된 공급물은 넓은 입자 크기 분포를 제공한다. 상기 넓은 범위의 입자의 분리에 필요성에 응하여, 개방된 등급의 부직 층 및 더 긴밀한 층(CE 및 DE)의 조합은 효과적인 심층 여과를 제공한다. 심층 여과 장치는 전체 층 2.0 cm의 총 두께를 갖는 부직 섬유(폴리프로ㅍ리렌)의 8개(8) 층을 사용하여 조립하였다. 상기 층은 도 1의 여과 장치(50)에 개방 명목상 기공 크기 200 ㎛(2층)에 이어, 명목상 50 ㎛(2층), 명목상 40 ㎛(2층), 이어 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)로 배열된다. (니들 펀칭된) 부직 섬유(로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, 미시건 앤 아버 소재)의 6개 (6) 층의 개별 특성은 표 3에 나타낸다(2 x 200 ㎛, 2 x 50 ㎛, 및 2 x 40 ㎛). 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하로 부가하여 전체 어셈블리를 단일의 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 이 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.40 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11B.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터.
실시예 11B의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 2 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터는 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, 미시건 앤 아버 소재로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 30 ㎛, 2층 x 25 ㎛, 2층 x 20 ㎛)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.15 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11C.
응집된 및 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11C의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 2 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, 미시건 앤 아버 소재로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 25 ㎛, 2층 x 20 ㎛, 2층 x 10 ㎛)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.15 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11D.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11D의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 1.6 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, 미시건 앤 아버 소재로부터 얻은 4개 (4) 층의 부직 섬유(2 x 20 ㎛, 2 x 10 ㎛) 및 셀룰로오스(CE 25)/규조토(DE 60)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.3 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11E.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11E의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 2 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, 미시건 앤 아버 소재로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 25 ㎛, 2층 x 20 ㎛, 2층 x 10 ㎛m)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.2 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11F.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11F의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 1.6 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 로즈데일 프로덕츠 인코포레이티드, 미시건 앤 아버 소재로부터 얻은 4개 (4) 층의 부직 섬유(2층 x 20 ㎛, 2층 x 10 ㎛)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.3 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11G.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11G의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 1.6 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 미드웨스트 필트레이션 컴패니(오하이오 신씨내티 소재)로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유 (2층 x 50 ㎛, 2층 x 25 ㎛, 2층 x 10 ㎛)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.35 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11H.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11H의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 2 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 미드웨스트 필트레이션 컴패니(오하이오 신씨내티 소재)로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 25 ㎛, 2층 x 10 ㎛, 2층 x 5 ㎛)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.4 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 11l.
응집된 소형 생체분자 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 11l의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 2 cm이며, 또 약 0.5 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 미드웨스트 필트레이션 컴패니(오하이오 신씨내티 소재)로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 10 ㎛, 2층 x 5 ㎛, 2층 x 1 ㎛)에 이어, 1개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 1개 층의 규조토(DE40)를 포함한다. 층의 적층을 조립한 후, 폴리프로필렌 호스 미늘 단부 캡을 상하부로 부가하고 전체 어셈블리를 단일한 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)로 오버몰딩하였다. 상기 여과 장치를 물 투과능에 대해 시험하여 4 psi에서 0.4 L/분의 값을 초래하였다.
실시예 12.
응집된 소형 생체분자 미립자의 심층 필터 제거의 여과 성능
실시예 11A-11l로부터 얻은 필터 장치는 다음 방법을 이용하여 여과 성능에 대해 시험하였다. 정화되지 않은 세포 배양 수집물은 1M 빙초산으로 처리하여 pH를 4.8로 조정하였고 또 30분간 교반하였다. 심층 필터는 압력변환기에 의해 모니터링되는 각 필터에 대하여 TMP에 의해 Milli-Q 물을 사용하여 세척한 후 미처리 및 산 처리된 정화되지 않은 공급물을 사용하여 실시하였다. 상기 심층 필터는 먼저 필터 매질을 적셔서 추출가능한 물질을 세척하도록 미터제곱의 각 필터 면적 당 600 L/m2/h로 Milli-Q 물에 의해 ≥ 약 50 L에 의해 세척하였다. 미처리 및 산 석출된 정화되지 않은 수집물은 1개 필터에 대한 TMP가 20 psig에 도달할 때까지 100 L/m2/h로 로딩하였다.
표 6은 산 처리된 공급물에 대하여 일차 정화 심층 필터를 이용하여 2개의 Millistak® 필터(XOHC 및 DOHC)의 필터 처리량을 비교한다. X0HC 및 DOHC는 5 L/m2 및 20 L/m2 의 처리량을 제공하는 반면에, 일차 정화 심층 필터의 처리량은 210 L/m2이었다.
표 6:
산 처리된 공급물(pH = 4.8)의 여과 처리량을 위한 산 석출 일차 정화(APPC) 심층 필터의 비교
Figure 112015006237930-pat00007
표 2는 공급물의 컬럼 부피 대 매질의 컬럼 부피 면에서 산 처리된 공급물에 대하여 2개의 Millistak® 필터(X0HC 및 DOHC)의 필터 처리량과 산 석출된 일차 정화 심층 필터를 비교한다. X0HC 및 DOHC는 1.5 Vf/Vm (K = 6) 및 4 VfA/m ((K = 16)의 처리량을 나타낸 반면에, 일차 정화 심층 필터의 처리량은 9 Vf/CVm(K = 36)이었다. 이 비교로부터, 본 발명의 특허청구범위에 기재된 층으로 이루어진 실시예 9A 필터는 정화되지 않은 세포 수집물의 정화 동안 다량의 고형분을 제거할 수 있다.
표 2:
스마트 중합체 처리된 CHO-DG44 공급물에 대한 침강 연구.
Figure 112015006237930-pat00008
표 7은 공급물의 컬럼 부피 대 매질의 컬럼 부피 측면에서 실시예 1B-111에 기재된 일차 정화 심층 필터의 필터 처리량을 비교한다. 이 비교로부터, 실시예 11A-11l에서, 본 발명에 제공된 층으로 이루어진 필터는 정화되지 않은 세포 수집물을 정화하는 동안 다량의 고형분을 제거할 수 있다.
표 7:
산 처리된 공급물(pH= 4.8)에 대한 여과 처리량에 대한 산 석출 일차 정화(APPC) 심층 필터
Figure 112015006237930-pat00009
실시예 13.
0.1 ㎛ 내지 200 ㎛ 범위의 응집된 소형 콜로이드성 미립자를 제거하기 위한 심층 필터
실시예 13의 등급화된 심층 필터는 등급화된 부직 섬유를 포함하고, 깊이가 2 cm이며, 또 약 0.1 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 범위의 입자를 포함하는 산 응집된 공급물 스트림을 여과할 수 있다. 등급화된 심층 필터 공급물은 미드웨스트 필트레이션 컴패니(오하이오 신씨내티 소재)로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 25 ㎛, 2층 x 10 ㎛, 2층 x 5 ㎛)에 이어, 상업적으로 입수가능한 셀룰로오스(CE25)/규조토(DE 40), 및 IM751를 포함한다. 본 발명에 제공된 등급화된 심층 필터는 23 cm2 일체형 미니 캡 여과 장치(밀리포어 코포레이션으로부터 입수, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)에서 조립되어 물 투과능에 대해 시험하여, 4 psi에서 0.25 L/분의 값을 초래하였다. 이어, 산 석출된 정화되지 않은 수집물을 100 L/m2/h에서 어느 하나의 필터에서 TMP가 20 psig에 도달할 때까지 로딩하였다. 미드웨스트 필트레이션 컴패니 (오하이오 신씨내티 소재)로부터 얻은 6개 (6) 층의 부직 섬유(2층 x 25 ㎛, 2층 x 10 ㎛, 2층 x 5 ㎛)에 이어, 일개 층의 셀룰로오스(CE25), 및 일개 층의 규조토(DE40)를 포함하는 대조군 등급화된 필터에 대해 여과성능을 비교하였다. 이 실시예에 기재된 필터는 11 Vf/Vm (K = 66)의 처리량을 초래한 반면, 대조군 등급화된 심층 필터의 처리량은 12 Vf/CVm (K = 72)이었다. 그러나, 이 실시예에 기재된 등급화된 심층 필터는 1 NTU의 탁도를 초래한 반면에 대조군 등급화된 필터의 경우 4 NTU의 탁도를 초래하였다. 이 비교로부터, 본 발명에 제공된 바와 같은 층으로 이루어진 실시예 13 필터는 정화하는 동안 세포 및 세포 파쇄물 이외에 더 작은 콜로이드성 미립자를 제거할 수 있음이 분명하며, 이는 공정에서 이차 정화 리터의 제거를 초래할 수 있다.
고객에 있어서 다른 중요한 이점은 개선된 고-고형분 공급원료 정화 경제이다. 앞서 언급한 바와 같이, 다수의 고-고형분 공급원료에 대한 정화 공정 적용에서, 전형적으로 심층 필터를 포함하는 이차 정화 바로 위로 원심분리 및/또는 접선유동 정밀여과가 일차 정화 단계로 이용된다. 심층 필터를 본 명세서에 기재된 바와 같은 일차 정화 공정에 혼입하는 것에 의해, 원심분리 단계 및/또는 접선유동 정밀여과 단계의 이전(상부 정화 단계 및 후속 (하류 정화 단계)가 제거된다. 또한, 세정, 확인 및 원심분리 및/또는 접선유동 정밀여과 막을 치환하는데 더 적은 시간이 소요될 것으로 예상될 것이다.
실시예 14.
표적 분자를 정화하기 위한 정화 심층 여과 장치 및 시스템
도 5는 표적 분자를 정제하기 위한 시스템에 혼입된 예시적 정화 심층 여과 장치 정제 공정의 개략도로서, 상기 시스템은 연속식 또는 반연속 방식으로 표적 분자를 정제하기 위한 공정을 실시하기 위하여 서로 유체 소통되게 연결된 2 이상의 단위 작업을 포함한다. 각 단위 작업은 목적하는 단위 작업을 달성하기 위하여 하나 이상의 장치를 이용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 시스템은 연속식 또는 반연속식으로 정제 공정을 실시할 수 있도록 연결된 몇 개의 장치를 포함한다.
이론에 얽매이지 않고, 시스템은 밀폐 멸균 환경에 포함되어 정제 정제 공정을 멸균 방식으로 실시할 수 있는 것으로 생각된다.
다양한 실시양태에서, 그러한 시스템 내의 제1 장치는 출발 물질, 예컨대 정제될 단백질을 발현하는 배양 세포를 함유하는 바이오리액터이다. 상기 바이오리액터는 배치형 또는 유가 뱃치형 바이오리액터와 같은 바이오리액터 또는 연속식 융합 발효 바이오리액터와 같은 연속식 바이오리액터 유형일 수 있다. 상기 바이오리액터는 적합한 물질로 제조될 수 있고 또 임의 크기일 수 있다. 전형적인 물질은 스테인레스 또는 플라스틱이다. 특정 실시양태에서, 상기 바이오리액터는 예컨대 단일 용도로 고안된 유연하고 접을 수 있는 백 형태의 일회용 바이오리액터이다.
정화는 바이오리액터 내에서 직접적으로 실시되거나 또는 다르게는 상기 바이오리액터는 세포 배양에만 사용되고, 또 정화는 상이한 용기에서 실시된다. 다른 실시양태에서, 상기 세포 배양물은 하나 이상의 불순물을 제거하기 위하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 정화 심층 여과를 통하여 흘러간다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 바이오리액터는 심층 여과를 실시하기위한 장치와 유체 소통한다.
본 명세서에 개시된 정화 심층 여과 장치는 결합 및 용출 크로마토그래피 (예컨대, 연속식 멀티 컬럼 크로마토그래피 장치)를 이용하여 포획을 실시하기 위한 장치와 유체 소통한다. 일부 실시양태에서, 결합 및 용출 크로마토그래피를 위한 장치는 하나 이상의 장치/단계를 포함할 수 있는 플로우 쓰루 정제를 실시하기 위한 단위 작업과 유체 소통하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 인-라인 정적 혼합기 또는 서지 탱크는 결합 및 용출 크로마토그래피를 위한 장치와 플로우 쓰루 정제를 위해 사용되는 제1 장치 사이에 포함된다.
일부 실시양태에서, 상기 플로우 쓰루 정제 공정은 하나 이상의 장치, 예컨대, 활성탄장치에 이어, AEX 크로마토그래피 장치에 이어, 인-라인 정적 혼합기 및/또는 pH를 변경하기 위한 서지 탱크에 이어, CEX 크로마토그래피 장치에 이어, 바이러스 여과 장치를 포함한다. 상기 장치는 적합한 포맷, 예컨대 컬럼 또는 카트리지일 수 있다.
상기 시스템에서 마지막 단위 작업은 투석여과/농축 및 멸균 여과를 포함하는 배합을 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다.
전형적으로, 각 장치는 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구를 포함하므로, 시스템 내의 연속식 장치의 입구와 유체 소통하는 1개 장치로부터 아웃풋을 가능하게 한다.
오늘날 사용되는 대부분의 공정 및 시스템에서, 정제 공정에 사용된 각 장치는 전형적으로 필수 펌프, 밸브, 센서 및 장치 홀더를 포함하는 "스키드(skid)"라고도 불리는 공정 장치 단위를 적용한다. 전형적으로, 적어도 하나의 스키드는 각 장치와 연관되며, 정제 공정을 통하여 사용된 스키드의 수는 감소된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 오직 1개의 스키드는 복수의 장치, 예컨대, 활성탄장치, 음이온 교환크로마토그래피 장치, 양이온 교환 크로마토그래피 장치 및 바이러스 여과 장치와 더불어 용액 상태 변화에 필요한 임의 장치를 포함할 수 있는 전체 플로우 쓰루 정제 공정을 실시하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 플로우 쓰루 정제 공정에서 상술한 단계 전부에 대해 단일 스키드가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다양한 장치 사이의 유체 소통은 유체가 단속없이 장치 전부를 직접 유통하는 점에서 연속적이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 밸브, 센서, 검출기, 서지 탱크 및 인-라인 용액 변화를 위한 임의 장치가 다양한 장치 사이에 포함될 수 있으므로, 필요한 경우, 예를 들어 특정 단위 작업을 교체/제거하기 위해 시스템을 통하여 유체의 흐름을 일시적으로 단속할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 서지 탱크가 다양한 장치 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 3개 이하, 및 2개 이하의 서지 탱크가 전체 시스템 내에 존재한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 또한 시스템 내의 하나 이상의 공정 변수, 예를 들어, 온도, 압력, pH, 도전성, 용존 산소(DO), 용존 이산화탄소(DCO2), 혼합율, 유동 속도, 생성물 변수를 제어하고 및/또는 모니터링하기 위한 하나 이상의 센서 및/또는 프로브를 더 포함한다. 상기 센서는 일부 경우에서 광학 센서일 수 있다.
일부 실시양태에서, 공정 제어는 시스템의 멸균성을 상쇄하지 않는 방식으로 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 센서 및/또는 프로브는 센서 전자 모듈에 접속될 수 있고, 그의 아웃풋은 터미널 보드 및/또는 릴레이 박스에 송신될 수 있다. 감지 작업의 결과는 다양한 변수(예컨대 온도 및 중량/부피 측정, 순도)의 측정 및 제어를 위한 및 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 위한 컴퓨터 실시된 제어 시스템(예컨대 컴퓨터)으로 입력될 수 있다. 이러한 제어 시스템은 공정 변수를 제어하기 위한 전자, 기계적 및/또는 공압 시스템의 조합을 포함할 수 있다. 상기 제어 시스템은 다른 기능을 실시하기 위한 것임을 이해해야 하며 본 발명은 특정 기능 또는 기능 세트를 갖는 것에 한정되지 않는다.
상기 기재한 내용은 독립적 유용성을 갖고서 복수의 분명한 발명을 포함할 수 있다. 각 발명은 바람직한 형태로 기재되어 있지만, 그의 특수한 실시양태는 제한을 의미하지 않으며, 다수의 변형이 가능하다. 본 발명의 주제는 모든 신규하고 자명하지 않은 조합을 포함하고 본 명세서에 개시된 다양한 원소, 특징, 작용 및/또는 특성의 서브조합도 포함한다. 이하의 특허청구범위는 신규하고 자명하지 않은 것으로 간주된 특정의 조합 빛 서브 조합을 특별히 지적한 것이다. 특징, 기능, 원소 및/또는 특성의 다른 조합 및 서브조합에 예시된 발명은 본 출원 또는 관련 출원에서 우선권 주장하는 출원에서 청구되어 있다. 상이한 발명 또는 동일한 발명에 관련된 이러한 특허청구범위는 원래의 특허청구범위와 비교하여 더 넓거나, 더 좁거나, 동일하거나, 또는 상이하든 여기에 개시된 본 발명의 주제에 포함된다.

Claims (32)

  1. 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 단계를 이용하지 않고도, 관심있는 생체분자 종 및 복수의 세포 물질 및/또는 콜로이드성 미립자를 포함하는 바이오리액터로부터 응집된 공급물을 심층 여과에 의해 일차 정화하는 방법으로서,
    a) 다공성 심층 필터 매질을 갖는 심층 여과 장치를 제공하는 단계, 상기 다공성 심층 필터 매질은 제1 부직 섬유층, 제2 부직 섬유층, 제3 부직 섬유층, 제4 부직 섬유층, 제5 부직 섬유층, 제6 부직 섬유층을 갖고, 상기 제1 부직 섬유층 및 제2 부직 섬유층은 100 마이크론의 기공 크기를 갖고, 상기 제3 부직 섬유층 및 제4 부직 섬유층은 50 마이크론의 기공 크기를 갖고, 상기 제5 부직 섬유층 및 제6 부직 섬유층은 25 마이크론의 기공 크기를 갖고;
    여기서 상기 공급물이 화학적으로 응집되면, 상기 필터 매질은 적어도 36의 k 변수 값을 갖고 또 공급물이 자극 감응성 중합체에 의해 응집되면, 상기 필터 매질은 적어도 66의 k 변수 값을 가지며, 어떤 경우에서든, 상기 k 변수 값은 3개의 측정가능한 변수인 부피 처리량(TP), 수집 효율(η), 및 고형분의 초기 농도(Ci)에 의해 하기 방정식으로 결정됨:
    Figure 112018016949226-pat00016
    ;
    b) 화학적 응집제를 제공하는 단계;
    c) 관심있는 표적 생체분자 및 복수의 세포 파쇄물 및/또는 콜로이드성 미립자를 함유하는 세포 배양 공급물을 제공하는 단계,
    d) 상기 화학적 응집제를 상기 세포 배양 공급물에 부가하는 단계;
    e) 응집된 세포 파쇄물 및/또는 콜로이드성 미립자를 포함하는 화학적으로 응집된 공급물을 형성하는 단계;
    f) 상기 다공성 심층 필터 매질을 상기 화학적으로 응집된 공급물과 접촉시키는 단계; 및
    g) 일차 정화 원심분리 단계 또는 일차 정화 접선유동 정밀여과 정화 단계를 이용하지 않고도 상기 공급물 중의 응집된 세포 파쇄물 및/또는 콜로이드성 미립자로부터 관심있는 표적 생체분자를 분리하는 단계를 포함하는, 바이오리액터로부터 심층 여과에 의해 일차 정화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학적 응집제가 산 및 자극 감응성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 공급물이 산 응집된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다공성 심층 필터 매질이 이방성이고, 또 상기 화학적으로 응집된 공급물은 > 3부피% 고형분을 가져서 < 20 NTU의 탁도 아웃풋을 초래하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 심층 필터가 셀룰로오스를 함유하는 제7 부직 섬유층 및 규조토를 함유하는 제8 부직 섬유층을 더 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 부직 섬유층이 0.3 cm 내지 3 cm의 전체 두께를 갖는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포 파쇄물 및 상기 콜로이드성 미립자가 0.5 ㎛ 내지 200 ㎛의 입자 크기 분포 및 10 ㎛ 보다 큰 평균 입자 크기를 갖는 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 관심있는 표적 생체분자가 모노클로날 항체(mAb), 폴리클로날 항체, 및 생체치료제를 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 자극 감응성 중합체가 스마트 중합체인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 스마트 중합체가 변형된 폴리아민인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 상기 산이 아세트산인 방법.
  15. 제5항에 있어서, 상기 부직 섬유가 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 또는 나일론을 포함하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 심층 필터는 > 100 L/M2/hr의 처리량을 제공하고 또 0.5 ㎛ 내지 200 ㎛의 입자 크기 분포를 갖는 응집된 세포 파쇄물 및 콜로이드성 미립자를 제거하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 공급물이 바이오리액터 내에 위치한 세포 배양물이고 또 바이오리액터로부터 일차 정화 공정을 위한 심층 여과 장치로 직접 로딩되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 단계 (g)의 정화된 세포 배양물 유출물이 크로마토그래피 공정을 위한 단백질 A 결합 및 용출 크로마토그래피 컬럼에 직접 로딩되는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 공급물이 세포 배양물, 트랜스제닉(transgenic) 포유류 세포 배양물, 세균 세포 배양물, 비-트랜스제닉(non-transgenic) 포유류 세포 배양물, 조직 배양물, 미생물 발효 뱃치, 식물 추출물, 생물연료, 해수 배양물, 신선한 물 배양물, 폐수 배양물, 처리된 하수, 미처리 하수, 우유 배양물, 혈액 배양물, 또는 그의 조합물을 포함하는 방법.
  20. 제5항에 있어서, 상기 부직 섬유가 폴리프로필렌을 포함하는 방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제1항에 있어서, 상기 다공성 심층 필터는 공급물이 산으로 응집되면 적어도 9의 공급물의 컬럼 부피(Vf) 대 매질의 컬럼 부피(Vm) 값을 갖고 또 상기 공급물이 자극 감응성 중합체에 의해 응집되면 적어도 16.5의 공급물의 컬럼 부피(Vf) 대 매질의 컬럼 부피(Vm) 값을 갖는 것을 더 포함하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 산 응집된 공급물의 k 변수가 적어도 71이고 또 자극 감응성 중합체 응집된 공급물에 대한 k 변수가 적어도 81인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 필터는 공급물 중의 더 큰 응집된 입자가 필터의 심층으로 침투하게 하여 필터의 표면 상에서 수집되기 보다는 필터의 기공 내에서 포획되게 하는 개방 등급의 층을 갖는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 필터는 필터의 상부 및 하부에서 단부 캡을 갖고 또 상기 필터 및 단부 캡은 단일한 일체형 여과 장치로 오버몰드(overmold)되는 방법.
  32. 제1항에 있어서,
    h) 단계 (g)의 관심있는 분리된 표적 생체분자를 결합 및 용출 크로마토그래피 단계에 처리하여 용출물을 얻는 단계;
    i) 상기 단계 (h)의 용출물을 하나 이상의 인-라인 정적 혼합기 또는 하나 이상의 서지 탱크를 이용하여 하나 이상의 바이러스 불활성화제와 접촉시키는 단계;
    j) 상기 바이러스 불활성화 단계(i)의 물질을 활성탄, 음이온 교환 크로마토그래피 매질, 양이온 교환 크로마토그래피 매질 및 바이러스 여과 막으로부터 선택된 2 이상의 매트릭스의 사용을 포함하는 플로우 쓰루 정제 공정에 처리하는 단계; 및
    k) 상기 단계(j)의 물질을 소망하는 농도 및 완충제 조건에서 배합하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (h) 내지 (k)는 연속적으로 실시되는 방법.
KR1020157001561A 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터 KR101949187B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161571994P 2011-07-08 2011-07-08
US61/571,994 2011-07-08
PCT/US2012/044806 WO2013009491A2 (en) 2011-07-08 2012-06-29 Improved depth filters for disposable biotechnological processes

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137031025A Division KR20140004231A (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150027229A KR20150027229A (ko) 2015-03-11
KR101949187B1 true KR101949187B1 (ko) 2019-04-22

Family

ID=47439052

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187027001A KR102038336B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
KR1020157001561A KR101949187B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
KR1020197031325A KR102157227B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
KR1020157023502A KR101902225B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
KR1020137031025A KR20140004231A (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187027001A KR102038336B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197031325A KR102157227B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
KR1020157023502A KR101902225B1 (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
KR1020137031025A KR20140004231A (ko) 2011-07-08 2012-06-29 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20130012689A1 (ko)
EP (2) EP3722304A1 (ko)
JP (2) JP6027104B2 (ko)
KR (5) KR102038336B1 (ko)
CN (1) CN103649297B (ko)
DK (1) DK2732021T3 (ko)
ES (1) ES2809211T3 (ko)
SG (1) SG194763A1 (ko)
WO (1) WO2013009491A2 (ko)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102038336B1 (ko) 2011-07-08 2019-10-31 이엠디 밀리포어 코포레이션 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
CA2883344A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Emd Millipore Corporation Low organic extractable depth filter media processed with solvent extraction method
EP2682168A1 (en) 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
JP6182210B2 (ja) * 2012-06-29 2017-08-16 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン タンパク質精製プロセス中のウイルスの不活性化方法
US10711238B2 (en) 2012-10-02 2020-07-14 Repligen Corporation Method for proliferation of cells within a bioreactor using a disposable pumphead and filter assembly
CN105324166B (zh) * 2013-07-12 2018-01-19 默克专利股份有限公司 利用活性炭从包含靶蛋白的样品去除片段
US20150344545A1 (en) * 2014-06-03 2015-12-03 Harry Leneau Method of Treating and Preventing Infectious Diseases Using Colostrum
EP3015542A1 (de) * 2015-05-07 2016-05-04 Bayer Technology Services GmbH Modulare anlage und verfahren zur kontinuierlichen, keimreduzierten produktion und/oder aufbereitung eines produktes
CN106317166A (zh) * 2015-07-02 2017-01-11 北京中原领先科技有限公司 高效过滤层析混合机制分离蛋白装置
WO2017027861A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
KR101766115B1 (ko) 2016-02-05 2017-08-07 현대자동차주식회사 장수명 자동차용 흡기 필터 및 이의 제조방법
WO2018022965A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Phillips 66 Company Thermoresponsive polymers for aqueous applications
CN106565844B (zh) * 2016-11-08 2019-07-09 深圳万乐药业有限公司 深层过滤单克隆抗体细胞培养液的方法
US10388778B2 (en) * 2016-11-18 2019-08-20 Nexperia B.V. Low resistance and leakage device
CN107029478A (zh) * 2017-05-19 2017-08-11 太仓新亚逊生物科技有限公司 用于一次性生物技术方法的改良深层过滤器
EP3638072A4 (en) * 2017-06-15 2021-04-07 Porex Technologies Corporation INTEGRATED POROUS FIBROUS MEDIUM SHOWING DISTINGUISHING FIBER DIAMETERS OR DENSITY
CN107604739B (zh) * 2017-09-26 2019-06-07 江南大学 一种过滤用棉秆皮纤维与壳聚糖复合非织布的制备方法
JP7301054B2 (ja) * 2018-01-31 2023-06-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化
CN110241012B (zh) * 2018-03-09 2022-11-01 嘉和生物药业有限公司 一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法、生产模块及在生产中的应用
MX2020010018A (es) * 2018-03-26 2020-10-14 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Metodo para producir una composicion inmunogenica.
CA3098565A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Claire G. ZHANG Scalable clarification process for recombinant aav production
US10792618B2 (en) 2018-06-19 2020-10-06 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Particle separation and/or purification of a fluid
US11028359B2 (en) * 2018-09-11 2021-06-08 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Separation devices, associated methods, and systems
EA202191385A1 (ru) * 2018-12-21 2021-11-15 Икнос Сайенсис С.А. Способы осветления культур клеток
JP2020104036A (ja) * 2018-12-26 2020-07-09 Jnc株式会社 細胞培養液用の濾材及び当該濾材を含んでなるデプスフィルター
US20220098235A1 (en) * 2019-01-23 2022-03-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Methods for purifying antibodies comprising of a process by using activated carbon materials
EP3924461A2 (en) * 2019-02-15 2021-12-22 Just-Evotec Biologics, Inc. Facilities and processes to produce biotherapeutics
CN111635063B (zh) * 2019-03-01 2023-02-10 四川中科翰林环保科技有限公司 一种基于人工智能的养殖污水处理设备及方法
CN114470969A (zh) * 2020-11-12 2022-05-13 四川远大蜀阳药业有限责任公司 一种深层过滤介质及其用途
CN116615434A (zh) * 2020-12-04 2023-08-18 3M创新有限公司 用于生物材料纯化的过滤单元和方法
WO2023041515A2 (en) * 2021-09-15 2023-03-23 Basf Se Method for preparing an aqueous (meth) acrylamide solution
CN114307651A (zh) * 2021-11-23 2022-04-12 中国辐射防护研究院 一种用来分离不同粒径吸附放射性核素胶体的装置及方法
EP4292696A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-20 Sartorius Stedim Biotech GmbH Filter system usable as cell culture clarification filter in protein purification

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030201229A1 (en) * 2002-02-04 2003-10-30 Martin Siwak Process for prefiltration of a protein solution
US20100264087A1 (en) * 2009-04-20 2010-10-21 Dholakia Jayant M Method for reducing clogging of filters
US20120148966A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 James Ramaker Candle Wick and Wick Clip

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR205025A1 (es) * 1974-04-19 1976-03-31 Johnson & Johnson Medios para filtrar sangre
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
DE68919361T2 (de) 1988-06-21 1995-05-24 Genentech Inc Therapeutische zusammensetzungen für die behandlung von myocard-infarkten.
ATE234621T1 (de) * 1990-09-25 2003-04-15 Asahi Medical Co Methode und filtersystem zur entfernung von leukozyten
US5190657A (en) * 1991-07-22 1993-03-02 Lydall, Inc. Blood filter and method of filtration
JP3457962B2 (ja) 1991-08-14 2003-10-20 ジェネンテク，インコーポレイテッド 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体
ATE161192T1 (de) 1992-08-21 1998-01-15 Genentech Inc Verfahren zur behandlung einer durch lfa-1 vermittelten störung
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ATE157455T1 (de) 1993-12-10 1997-09-15 Genentech Inc Methoden zur diagnose von allergie und prüfung anti-allergischer therapeutika
ATE164079T1 (de) 1994-01-18 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur behandlung von parasitären infektionen unter verwendung von ige-antagonisten
ATE222774T1 (de) 1996-01-23 2002-09-15 Genentech Inc Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag
DK0981618T4 (da) 1997-05-15 2011-11-21 Genentech Inc Anti-Apo-2-antistof
ATE277949T1 (de) * 1998-07-21 2004-10-15 Monsanto Technology Llc Klärung von protein-niederschlagsuspensionen durch verwendung von anionischen polymerischen flockungsmitteln
US20040118766A1 (en) 2000-02-03 2004-06-24 Pulek John L. Graded particle-size retention filter medium for cell-type filter unit
US6693173B2 (en) * 2000-12-26 2004-02-17 Alpha Therapeutic Corporation Method to remove citrate and aluminum from proteins
US7118675B2 (en) * 2002-02-04 2006-10-10 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
US7125434B2 (en) * 2002-12-19 2006-10-24 Millipore Corporation Deep gradient-density filter device
US7083697B2 (en) * 2002-12-30 2006-08-01 Boston Scientific Scimed, Inc. Porous spun polymeric structures and method of making same
US7390403B2 (en) 2004-03-19 2008-06-24 Millipore Corporation Prefilter system for biological systems
BRPI0518130A (pt) * 2004-10-15 2008-10-28 3M Innovative Properties Co módulos de filtro pregueado, método de produção de um meio de filtro de profundidade compósito, e, meio de filtro de profundidade compósito pregueado
EP1888200A1 (en) * 2005-05-08 2008-02-20 3M Innovative Properties Company Filter cartridge and method of construction thereof
AU2006292739A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-29 Wyeth Protein floculation using salts
US7531632B2 (en) * 2006-02-16 2009-05-12 Gtc Biotherapeutics, Inc. Clarification of transgenic milk using depth filtration
US7673757B2 (en) * 2006-02-17 2010-03-09 Millipore Corporation Adsorbent filter media for removal of biological contaminants in process liquids
EP2007883B1 (en) * 2006-04-20 2011-12-28 Wyeth LLC Purification processes for isolating purified vesicular stomatitis virus from cell culture
US8569464B2 (en) * 2006-12-21 2013-10-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
US20080206703A1 (en) * 2007-02-28 2008-08-28 Den-Mat Corporation Dental veneer instrument
US8147583B2 (en) * 2007-06-08 2012-04-03 Gore Enterprise Holdings, Inc. Multiple layer filter media
JP5199758B2 (ja) * 2008-07-04 2013-05-15 ディバーシー株式会社 フロアーポリッシュ剥離汚水および洗浄汚水の処理方法
DE102008037678A1 (de) * 2008-08-14 2010-02-25 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid
SG195577A1 (en) * 2008-10-20 2013-12-30 Abbott Lab Viral inactivation during purification of antibodies
SG171446A1 (en) * 2008-12-16 2011-07-28 Millipore Corp Stirred tank reactor and method
EP2358734A1 (en) * 2008-12-16 2011-08-24 Millipore Corporation Purification of proteins
BRPI0923565A2 (pt) * 2008-12-23 2016-01-26 3M Innovative Properties Co artigo não tecido funcionalizado
BRPI1011747A2 (pt) * 2009-06-23 2018-02-27 3M Innovative Properties Co artigo não tecido funcionalizado.
AU2011317021B2 (en) * 2010-10-20 2015-07-09 Medimmune, Llc Methods for processing inclusion bodies
KR102038336B1 (ko) 2011-07-08 2019-10-31 이엠디 밀리포어 코포레이션 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
CA2883344A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Emd Millipore Corporation Low organic extractable depth filter media processed with solvent extraction method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030201229A1 (en) * 2002-02-04 2003-10-30 Martin Siwak Process for prefiltration of a protein solution
US20100264087A1 (en) * 2009-04-20 2010-10-21 Dholakia Jayant M Method for reducing clogging of filters
US20120148966A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 James Ramaker Candle Wick and Wick Clip

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013009491A3 (en) 2013-05-02
EP2732021B1 (en) 2020-05-27
US20130012689A1 (en) 2013-01-10
CN103649297A (zh) 2014-03-19
EP2732021A4 (en) 2015-05-06
KR20190122903A (ko) 2019-10-30
JP2017036316A (ja) 2017-02-16
KR20180105755A (ko) 2018-09-28
EP2732021A2 (en) 2014-05-21
US10786754B2 (en) 2020-09-29
KR20150027229A (ko) 2015-03-11
KR20150104224A (ko) 2015-09-14
KR20140004231A (ko) 2014-01-10
CN103649297B (zh) 2017-03-01
KR102157227B1 (ko) 2020-09-17
KR102038336B1 (ko) 2019-10-31
US20200398187A1 (en) 2020-12-24
DK2732021T3 (da) 2020-07-27
SG194763A1 (en) 2013-12-30
WO2013009491A2 (en) 2013-01-17
JP2014523247A (ja) 2014-09-11
JP6027104B2 (ja) 2016-11-16
ES2809211T3 (es) 2021-03-03
KR101902225B1 (ko) 2018-09-28
US11504646B2 (en) 2022-11-22
EP3722304A1 (en) 2020-10-14
US20180345173A1 (en) 2018-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101949187B1 (ko) 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
JP6484169B2 (ja) 生体分子の精製
TWI574975B (zh) 用於減少蛋白質純化期間樣本中一或多種雜質含量之方法
KR20130105340A (ko) 생물약제학적 제제로부터 플로우 쓰루 모드로 단백질 응집물의 제거
SG171764A1 (en) Purification of proteins
US20200056144A1 (en) Cell culture clarification
US20220194981A1 (en) Improvement of affinity chromatography of immunoglobulins by using pre-capture flocculation
KR20150096772A (ko) 단백질 침전을 위한 공중합체
JP2012505863A (ja) 高密度細胞における清澄化方法
CA2893760C (en) Selective removal of a protein from a mixture of proteins using activated carbon by adjusting solution conditions
RU2794431C1 (ru) Улучшение аффинной хроматографии иммуноглобулинов путем применения флокуляции до захвата
WO2019149693A1 (en) Protein purification process and platform

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant