CN103649297A - 用于一次性生物技术方法的改良深层滤器 - Google Patents

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Abstract

一种初步澄清进料的方法，所述方法包括化学处理的絮凝的进料，包含所关注的靶生物分子如mAb、哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物，使用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清过滤步骤或初步澄清切向流微滤步骤。所述初步澄清深层过滤装置包含多孔深层滤器，具有不同孔评级的分级多孔层。所述初步澄清深层过滤装置以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤液体进料，包括化学处理的絮凝的进料，其包含絮凝的细胞碎片和胶体颗粒，具有约0.5pm-200pm的粒径分布。还提供使用和制备所述初步澄清深层过滤装置的试剂盒和方法。

Description

用于一次性生物技术方法的改良深层滤器
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年7月8日提交的美国临时专利申请第61/571,994号的权益，其全部内容援引加入本文。
技术领域
一般来说，本发明涉及进料的初步澄清。在某些具体实施方案中，本发明提供进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清深层过滤方法，其利用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。在其他实施方案中，本发明提供化学处理的进料的初步澄清深层过滤方法，其中细胞团已絮凝为较大的聚集体。
背景技术
制备包括蛋白如单克隆抗体(mAb)在内的药物级别的生物分子是一个复杂的制备过程，包括设计用来制备用于患者的高质量产品的多种过滤、离心和色谱技术。细胞培养收获物和高固体原料的澄清可以是艰巨的任务，这是由于来自现代化生产批量生物反应器的大体积收获物(≤25,000L)和高细胞密度通常在随后的色谱操作之前需要初步以及二次澄清。因此，细胞收获物和高固体原料如哺乳动物细胞和mAb的制备过程的收获和澄清是过去20年左右进行的许多演变和评价的产物。
现在通常期望哺乳动物细胞培养物和mAb的收获技术以高收率(>95%)和最小细胞破裂的方式操作。随着产物分子滴度增加，较高的细胞团和较大量的产物对下游纯化步骤提出挑战。较高的细胞密度在澄清和无菌过滤期间造成困难。较高的产物浓度一般导致增加的杂质负荷且需要较大的色谱安装。因此，提高效率和通量形式的改良大受欢迎。
渐增的治疗性mAb需求使得人们致力于增加工业治疗性单克隆抗体生产的产品生产、质量、加工效率和成本效益。过去十年见证了生产、上游细胞培养产物滴度的大幅增长以及表征杂质和污染物的技术进步。
进料、进料流、原料、细胞培养液等(包括高固体进料，例如包含mAb和哺乳动物细胞培养原料的高固体进料)的初步澄清去除大量生物质，特别是全细胞和其他较大的细胞碎片，然后二次澄清，去除较小的胶体颗粒以及损害下游滤器容量的其他颗粒。在mAb和哺乳动物细胞培养液和原料的生产过程中，离心通常是初步澄清步骤。
mAb生产商投入了大量时间和精力增加原料的产品滴度。然而，虽然较高滴度增加细胞培养生产率，但是其还产生具有较大量生物质和细胞碎片含量的原料。包含这样较大量生物质和细胞碎片的进料可以在离心后产生高浊度离心液(centrate)。高浊度离心液常减少离心下游使用的二次澄清深层滤器和随后的无菌滤器的产量。减少的产量引起一系列问题，从增加的加工成本到加工过程的偏差，这是由于滤器的堵塞和长期加工延迟。最后，使用离心初步澄清在运行之间需要广泛的经过验证的清洁程序以试图减少批次和治疗性分子物质之间交叉污染的风险。
在期望于相对短的时间内加工多种产物的试验或临床规模的生物治疗性生产中，这特别有问题。离心清洁程序减慢试验工厂转换至生产不同生物分子的能力，并且大大增加生产运行之间交叉污染的风险。此外，在初步澄清步骤中，离心不可以有效地从这些原料去除所有颗粒和细胞碎片，因此在离心步骤之后，随后的色谱步骤之前需要利用深层过滤的二次澄清步骤。
或者，已证实连续过滤运行可用于从原料去除不同大小的细胞和细胞碎片，但是通常体积通量限制应用于较小体积(<1000L)，其中滤器安装具有合理的大小。过滤的使用大大减少交叉污染的风险，并且在运行之间无需清洁和清洁验证，这是由于过滤装置的一次性性质。不幸的是，低通量要求大量的滤器单元，这可以减少过滤收率，因为每个连续步骤导致通过滤器装置和设备的滞留体积损失一部分的进料溶液。
为了进一步提高澄清性能、通量和下游过滤操作，已使用细胞培养收获物的絮凝。絮凝剂是这样的一类物质，其可以从溶液聚集和凝集细颗粒，导致它们从液相沉降且溶液浊度减少。
絮凝可以以各种方式完成，包括聚合物处理、化学处理(pH改变)或添加表面活性剂。使用絮凝剂沉淀可以用来选择性地去除杂质，同时将蛋白产物留在溶液中。但是，絮凝剂尚未广泛用于mAb、哺乳动物细胞和所关注的原料的其他生物分子细胞材料的澄清。
通过化学品絮凝细胞培养收获物需要使用酸如乙酸，或者聚合物如壳聚糖、多糖、多胺或聚丙烯酰胺。絮凝已用作可选分离技术以增加离心澄清通量和离心液质量，从而改善下游过滤操作。虽然化学絮凝在团聚细胞碎片和细胞污染物(宿主细胞蛋白和DNA)中非常有效，但是所得的絮凝悬浮液一般不易于在过滤之前不使用离心而通过普通过滤方法分离。
絮凝剂沉淀细胞、细胞碎片和蛋白，这是因为蛋白上的电荷与聚合物(例如聚电解质)上的电荷的相互作用，产生不溶性复合物，并且随后通过剩余电荷相互作用或通过复合物上的疏水斑块桥接不溶性复合物以形成较大的簇集。为了去除这些大簇集，离心步骤或切向流微滤是澄清的主要模式，然后进行二次澄清步骤，其中深层过滤广泛用于在捕获色谱步骤之前澄清细胞培养液。因为离心不可以递送不含颗粒的离心液，下游需要进一步安装深层滤器(二次深层过滤)和无菌滤器。
切向流微滤(也称为交叉流微滤)与离心竞争从哺乳动物细胞培养物收获和澄清mAb和治疗性产物。这种技术提供的一个优点是产生不含颗粒的收获液，需要极少的额外过滤。但是，用于细胞培养收获物的切向流微滤膜常受到膜污染问题(无法挽回的膜通量下降)的困扰，并且通常每次使用之后对膜需要按照完全清洁方案的严格复杂的操作条件(对离心也是如此)。为了解决这个问题，使用优化的膜化学，用一般对显著污染较不敏感的更亲水的切向流微滤膜。
传统上，絮凝一般用来团聚不可变形的固体颗粒。例如，因为它们的小粒径而非常难以过滤的超微粘土或二氧化钛颗粒的稀悬浮液可以化学絮凝并由此容易地分离，因为这些超微颗粒的大小通过更快沉降的团聚絮状物的形成而大大增加，从而因为滤饼内的大流量通道而更快过滤。
但是，当化学絮凝用于mAb原料或其他生物分子/细胞原料时，因为这些生物分子材料的生物学特征的性质，所得的团聚是独特的，并且完全不同于土材料和金属氧化物的不可变形的固体颗粒。大多数固体不可变形的颗粒如土材料或金属氧化物具有远高于水的密度。因此，一旦这些小颗粒絮凝，它们的粒径大大增加，并且所得的絮状物通过重力迅速沉降(即，以分钟计)。相比之下，细胞、mAb和其他生物分子物质由氨基酸和水组成，并且具有与水的密度非常接近的密度。因此，絮凝的细胞和其他生物分子不容易沉淀，并且通常在沉降发生之前经历数小时。
另一问题是相对低密度的絮凝细胞团，其通常形成蓬松的团，占据显著部分的进料体积但不形成压实的滤饼。而且，因为颗粒的生物来源，絮状物易碎，并且往往在压力下容易分解。
为了这个原因，大多数常规的固体-液体分离方法虽然可用于固体颗粒系统，但是不能絮凝细胞团如mAb原料。
据认为颗粒截留包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可以包括孔阻塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层滤器是有利的，因为它们非常有效地去除污染物并且是一次性形式，从而消除了与可重复使用的硬件设施相关的验证和污染问题，例如在使用离心时遇到的那些问题。但是，深层滤器目前不能操作高滴度mAb过程的典型的高固体进料流，因此常在离心后使用深层滤器。未澄清的细胞培养上清中存在的高颗粒负荷和高浊度为通过单独的深层过滤进行初步澄清增加了挑战。
但是，深层滤器目前不能操作高固体进料流的初步澄清，并且通常必须在离心或切向流微滤之后使用。未澄清的细胞培养上清中存在的高颗粒负荷和高浊度为通过单独的深层过滤进行初步澄清增加了挑战。目前，有限的通量导致深层滤器的大型设备用于初步澄清，导致收率损失，这是由于如上文所讨论的大滞留体积和放大问题。
此外，因为存在较高的生物质含量，mAb原料对于澄清和滤器是挑战性的进料流，并且在离心后导致高浊度的离心液。因为需要去除大量的生物质，高浊度的离心液缩短了澄清下游的深层滤器的寿命。需要改进mAb的澄清，从而导致较高的通量。
鉴于上述初步澄清过程，其依赖于使用初步澄清离心步骤或初步澄清微滤步骤，然后是依赖于深层过滤介质的二次澄清步骤以出去较大的颗粒，需要一次性的合理可靠且完成不会非常昂贵的初步澄清方法，其不使用初步澄清离心或微滤步骤然后额外的二次澄清步骤。
发明内容
根据上述需求以及与进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清过程相关的问题，本发明通过使用初步澄清深层过滤方法克服了挑战，所述方法利用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
本发明涵盖一种通过深层过滤初步澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和胶体颗粒的进料、进料流、原料、细胞培养液等但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤的方法，所述方法包括：
a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
b)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和颗粒的进料流，其中所述细胞碎片和颗粒具有约0.5pm-约200pm的粒径分布；
c)使所述多孔深层滤器介质与所述进料流接触，从而所述深层滤器介质能够以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤具有约0.5μm-约200pm的粒径分布的细胞碎片和颗粒；以及
d)分离所关注的靶生物分子与所述细胞碎片和颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
本发明还涵盖一种使用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清过滤步骤或初步澄清切向流微滤步骤，通过深层过滤初步澄清其中包含所关注的靶生物分子或所关注的生物治疗剂以及絮凝的细胞碎片、物质和胶体颗粒的絮凝的进料的方法，所述方法包括：
a)提供包含多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
b)提供化学絮凝剂；
c)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞物质、碎片和胶体颗粒的进料；
d)将所述化学絮凝剂与所述进料混合；
e)在所述进料中形成化学絮凝的细胞物质、碎片和胶体颗粒，并且任选地化学絮凝所关注的靶生物分子；
f)使所述多孔深层滤器介质与包含化学絮凝的细胞物质、碎片和胶体颗粒的进料接触；以及
g)分离絮凝的所关注的生物分子物质与多种絮凝的细胞物质但不使用离心澄清步骤或切向流微滤澄清步骤。
本发明涉及进料的初步澄清，其使用深层过滤装置但不使用初步澄清步骤或初步澄清切向流微滤步骤，所述深层过滤装置能够以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤包含具有约0.5μm-200pm的粒径分布的颗粒的高固体进料直至TMP达到20psi。本文所教导的初步澄清深层滤器包括不同空隙评级的分级多孔层。
本文提供的初步澄清多孔各向异性深层滤器介质的一个优选应用是初步澄清化学处理的絮凝的高固体进料，所述高固体进料包含所关注的生物分子物质或生物治疗剂以及多种絮凝的细胞碎片和絮凝的胶体颗粒。
在某些实施方案中，本发明提供一种在包含mAb、哺乳动物细胞培养物、植物细胞培养物、细菌培养物、昆虫细胞培养物以及所关注的其他生物分子材料和培养物的絮凝的进料的初步澄清中使用具有多孔滤器介质的深层过滤装置的方法，通过从所关注的生物分子物质有效分离絮凝的聚集的细胞团和碎片但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤，通过使用基于纤维的多孔深层滤器介质，其能够进行包含非常大颗粒的高体积原料的深层过滤而没有不期望的滤饼过滤效应。
在某些实施方案中，本发明提供一种深层过滤装置，其包括具有多个分级层的多孔深层滤器介质，用于初步澄清和去除聚集的细胞生物质，包括大小大于约10微米(pm)的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒或者较小的颗粒，其中使用絮凝剂。
在其他实施方案中，本发明提供一种深层过滤装置，其包括具有开放分级层的多孔深层滤器介质，用于初步澄清深层过滤，使得能够深层过滤具有0.5μm-200μm粒径的细胞碎片和胶体颗粒，从而提高未澄清的进料流的通量而没有不期望的滤饼过滤效应。
在某些实施方案中，本发明提供深层过滤介质：
a)具有细胞碎片的大絮状物穿透的大孔，没有不期望的滤饼过滤效应或在滤器的孔内形成絮状物桥接；
b)具有非常高的深度以分散细胞团，从而防止会导致介质中的内部滤饼过滤的内部絮状物桥接，在介质的外部或内部以避免压力的浓度降低，压力的浓度降低可以引起絮状物分解。
c)具有各向异性深层滤器层，即孔径逐步减少，其匹配原料中絮状物大小的群体。对于某些具有大量细小絮状物的原料，例如从酸性絮凝代替聚合物产生的原料，深层滤器层包括复合介质，其具有毛毡材料、DE和短纤维的组合，因为需要精细去除；
d)对于平均粒径大于10μm的所关注的生物分子物质的初步澄清，通常絮凝剂和化学处理的进料流的初步澄清，其中深层滤器包括具有开放标称孔径评级的非织造纤维的分级层，能够过滤具有大量固体的絮凝的进料流；
e)具有开放标称孔径评级的非织造纤维和纤维素/硅藻土(diamatoceousearth)的复合分级层，其能够过滤具有大量固体的聚合物絮凝剂处理的进料流；
f)虽然具有较大的通透性，但对聚合物絮凝剂(例如智能聚合物(SmP)、壳聚糖等)处理的进料具有良好的保持特性；
g)虽然具有较大的通透性，但是对聚合物絮凝剂(例如酸沉淀、辛酸等)处理的进料具有良好的保持特性；
h)在使用包含非织造纤维的分级层的深层滤器初步澄清包含细胞和细胞碎片的培养物的过程中使用；以及
i)在使用包含非织造纤维的分级层的深层滤器初步澄清包含絮凝的细胞和细胞碎片的培养物的过程中使用。
在某些实施方案中，本发明提供深层滤器的深层过滤介质前置滤器，其具有<约25pm的标称孔径，包含非织造纤维的分级层。
在其他实施方案中，本发明提供深层滤器的深层过滤介质前置滤器，其具有<25约pm的标称孔径，包含至少三层非织造纤维的分级层。
在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有>约25pm的标称孔径，能够过滤具有>约3%固体的絮凝的进料流。
在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有>约25μm的标称孔径，能够过滤具有>约3%固体的聚合物絮凝的进料流。
在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有>约25μm的标称孔径，能够过滤具有>约3%固体的聚合物絮凝的进料流，从而导致<20NTU的浊度输出。
为了克服目前与深层滤器相关的挑战，本发明涉及初步澄清深层滤器介质的开发以及使用初步澄清深层滤器介质的方法，所述初步澄清深层滤器介质可以以约10升/m2/hr(10LMH)-100升/m2/hr(100LMH)的流速过滤具有约0.5微米-200微米的粒径分布的包含高固体的液流直至TMP达到20psi。初步澄清深层滤器包括具有各种孔隙评级的分级层，应用于聚合物和化学处理的絮凝的进料的初步澄清。
本发明涉及用于一次性初步澄清方法的深层滤器。将开放分级层用于深层过滤使得能够过滤包含大簇集的进料，具有消除离心的潜力，并且使得能够过滤具有约0.5微米-约200微米的粒径的较高固体，从而提高这些未澄清的进料流的通量。
本发明的额外的特征和优势会在下文的详细描述和权利要求书中示出。本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。应当理解上文的一般描述和下文的详细描述、权利要求书以及附图仅为示例性和解释性的，并且旨在提供本发明教导的各种实施方案的解释。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图说明目前考虑的本发明的实施方案，并且与说明一起用来解释本发明的原理。
图1A、1B、1C、1D、1E和1F示出本发明的初步澄清深层滤器的实例的不同原理的实施方案，其中图1A(8层)、图1C(7层)和图1E(8层)示出用于聚合物絮凝剂(智能聚合物)处理的进料的初步澄清深层滤器，而图1B、1D和1F示出用于化学处理的进料(酸处理)的具有至少8层的初步澄清深层滤器；以及
图2是如本文所述的示例性初步澄清深层滤器纯化方法的示意图。所示的纯化方法使用生物反应器用于细胞培养，然后进行以下方法步骤：初步澄清深层过滤；蛋白A结合和洗脱色谱(捕获)；病毒灭活；流过(flow-through)纯化；以及配制。如图所示，每个方法步骤采用一种或多种装置，用来达到方法步骤的预期结果。如图所示，澄清采用如本文所教导和图1A-1F所示的分级澄清深层过滤；利用连续多柱色谱(CMC)进行蛋白A结合和洗脱色谱；病毒灭活采用两个连续(in-line)静态混合器；流过纯化采用活性炭(AC)，然后阴离子交换(AEX)色谱，然后利用连续静态混合器和缓冲罐进行pH改变，然后流过阳离子交换(CEX)色谱和病毒过滤；而配制采用渗滤/浓缩切向流过滤装置，然后无菌过滤。在整个过程中还采用一个或多个无菌滤器。
具体实施方式
无论上文或下文引用的所有出版物、专利和专利申请整体援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的出版物、专利或专利申请援引加入本文相同。
为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，无论是否明确指出，说明书和权利要求书中使用的表示成分的数量、物质的百分比或比例、反应条件的所有数目以及其他数值应理解为在所有情况下受到术语“约”修饰。术语“约”一般指认为等同于所列举的值(即，具有相同功能或结果)的一定范围的数目。在许多情况下，术语“约”可以包括最近的有效数字左右的数目。
因此，除非有相反的指示，以下说明书和所附权利要求书中所示的数值参数为近似值，其可以根据本发明追求获得的期望特性而变化。至少，并且不试图限制权利要求书的范围的等同物的原则的应用，每个数值参数应当至少根据报道的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来理解。
尽管示出本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但是具体实例中所示的数值尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地包含在它们各自的试验测量中发现的标准差所致的必需的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包括的所有亚范围。例如，“1-10”的范围包括最小值1和最大值10之间的任何和所有亚范围(并且包括最小值1和最大值10)，即具有等于或大于1的最小值以及等于或小于10的最大值的任何和所有亚范围，例如5.5-10。
在进一步详细描述本发明之前，会定义许多术语。使用这些术语并不限制本发明的范围，而仅用来方便本发明的描述。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所涉及的领域的技术人员通常理解的相同的含义。为了如本文所述的发明的目的定义以下术语。
如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。
如本文所用，术语“生物反应器”指支持生物活性环境的任何制造或涉及的装置或系统。在某些情况下，生物反应器是其中进行生物培养过程的容器，其包含生物体或来源于这类生物体的生物化学活性物质。这样的过程可以是需氧的或厌氧的。常用的生物反应器通常是圆柱形的，大小从升到立方米，并且常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器由除钢以外的材料制成，并且是一次性或单次使用的。考虑生物反应器的总体积可以是从100mL到高达10,000升或更多的任何体积，这取决于具体过程。在本文所述的方法和系统的一些实施方案中，将生物反应器连接至单元操作如深层滤器。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器用于细胞培养以及沉淀，其中可以将沉淀剂直接加入生物反应器，从而沉淀一种或多种杂质。
术语“细胞培养物”指悬浮液、滚瓶、烧瓶等中生长的细胞，以及悬浮液本身的组分，包括但不限于细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、HCP、宿主细胞蛋白(HCP)和DNA、mAb、絮凝剂。术语“细胞培养物”还涵盖大规模方法，例如生物反应器，包括在搅拌的发酵罐中粘附至微载体生长的粘附细胞。此外，在要求保护的发明的方法中可以不仅培养接触依赖性细胞，还使用悬浮培养技术。示例性微载体包括例如葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素以及如Butler,Spier&Griffiths,Animal cellBiotechnology3:283-303(1988)所述的其他微载体。还可以使用多孔载体如Cytoline.RTM.或Cytopore.RTM.，以及基于葡聚糖的载体如DEAE-葡聚糖(Cytodex1.RTM.)、季胺包被的葡聚糖(Cytodex2.RTM.)或基于明胶的载体如明胶包被的葡聚糖(Cytodex3.RTM.)。本发明涵盖蛋白的大规模和小规模制备的细胞培养方法。可以使用包括但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养或搅拌釜式生物反应器系统的方法，有或无微载体，并且可选地以分批、补料分批或灌注模式操作。
术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长动物细胞如哺乳动物细胞的营养液。这样的营养液一般包括细胞粘附、生长和维持细胞环境所必需的各种因子。例如，典型的营养液可以包括基础培养基制剂、取决于细胞类型的各种补充物以及任选存在的抗生素。在一些实施方案中，营养液可以包括来自一种或多种以下物质的至少一种组分：1)能源，通常为碳水化合物如葡萄糖形式；2)所有必需氨基酸，并且通常是20种氨基酸的基本集合加上胱氨酸；3)在低浓度时需要的维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；以及5)微量元素，其中微量元素定义为通常在非常低的浓度(通常在微摩尔范围中)时需要的无机化合物或天然存在的元素。营养液可以任选地补充了来自任何以下物质的一种或多种组分：1)激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如钙、镁和磷酸盐；3)核苷和碱基，例如腺苷和胸苷、次黄嘌呤；以及4)蛋白和组织水解物。一般来说，可以使用任何合适的细胞培养基。培养基可以包含血清，例如胎牛血清、小牛血清等。可选地，培养基可以是不含血清的，非动物的，或者不含蛋白的。
如本文所用，术语“细胞培养添加剂”指某种分子(例如，非蛋白添加剂)，将其加入细胞培养过程以促进或改善细胞培养或发酵过程。在本发明的一些实施方案中，如本文所述，刺激响应性聚合物结合并沉淀一种或多种细胞培养添加物。示例性细胞培养添加剂包括消泡剂、抗生素、染料和营养物。
在本文中可交换使用的术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”指来源于中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP一般作为杂质存在于细胞培养基或裂解物中(例如，收获的包含所关注的蛋白或多肽(例如，CHO细胞中表达的抗体或免疫粘附素)的细胞培养液)。一般来说，包含所关注的蛋白的混合物中存在的CHOP的量提供所关注的蛋白的纯度的度量。通常，蛋白混合物中CHOP的量以相对于混合物中所关注的蛋白的量的百万分比表示。应当理解当宿主细胞为另一哺乳动物细胞类型、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞时，HCP指在宿主细胞的裂解物中找到的除靶蛋白之外的蛋白。
在本文中可交换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”指任何外源或不期望物质，包括生物大分子如DNA、RNA、一种或多种宿主蛋白(HCP或CHOP)、内毒素、病毒、脂质以及一种或多种添加剂，其可以存在于包含所关注的蛋白或多肽(例如，抗体)的样品中，利用本发明的刺激响应性聚合物分离自一种或多种外源或不期望分子，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物从包含所关注的蛋白或以及一种或多种杂质的样品结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀一种或多种杂质，从而分离所关注的多肽或蛋白与一种或多种杂质。
如本文所用，术语“缓冲罐”指在方法步骤之间或方法步骤内(例如，当单一方法步骤包括一个以上的步骤时)使用的任何容器或器皿或袋；其中来自一个步骤的产出流过缓冲罐至下一步。因此，缓冲罐不同于混合物罐(pooltank)，其并不意图盛放或收集来自步骤的整个体积的产出；而是取而代之使得来自一个步骤的产出能够连续流至下一步。在一些实施方案中，在本文所述的方法或系统的两个方法步骤之间或方法步骤内使用的缓冲罐的体积不超过来自方法步骤的产出的整个体积的25%。在另一实施方案中，缓冲罐的体积不超过来自方法步骤的产出的整个体积的10%。在一些其他实施方案中，缓冲罐的体积少于生物反应器中细胞培养物的整个体积的35%、或者少于30%、或者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%，所述生物反应器中的细胞培养物构成纯化靶分子的起始原料。
术语“静态混合器”指用于混合两种流体物质，通常为液体的装置。该装置一般由圆柱形(管)外壳中所含的混合器元件组成。总系统设计并入将两个液流递送入静态混合器的方法。当流过混合器时，非移动元件连续混合物质。完全混合取决于多个变量，包括液体的特性、管的内径、混合器元件的数量和它们的设计等。
如本文所用，术语“深层滤器”(例如，梯度-密度深层滤器)在滤器材料的深度内完成过滤。这类滤器的一种常见类型是包含连接(或者固定)的随机基质以形成流动通道的复杂的曲折迷宫的滤器。这些滤器中的颗粒分离一般由纤维基质截留或吸附指纤维基质所致。细胞培养液和其他原料的生物加工最常用的深层滤器由纤维素纤维、助滤剂如DE和带正电荷的树脂粘合剂组成。不像绝对滤器，深层滤器介质在整个多孔介质截留颗粒，允许截留大于或小于孔径的颗粒。据认为颗粒截留包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可以包括孔阻塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层滤器是有利的，因为它们去除污染物，并且还是一次性形式，从而消除了验证问题。
如本文所用，术语“亲和色谱基质”指携带适合亲和色谱的配体的色谱基质。通常配体(例如，蛋白A或者其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且在溶液与色谱基质接触时对于靶分子是易于接近的。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥匙机制如抗原/抗体或酶/受体结合以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体如蛋白ASEPHAROSETM或
Figure BDA0000454410370000131
的基质。在本文所述的方法和系统中，亲和色谱步骤在整个纯化过程中可以用作结合和洗脱色谱步骤。
如本文所用，术语“离子交换”和“离子交换色谱”指这样的色谱过程，其中混合物中所关注的溶质或分析物(例如，纯化的靶分子)与连接(例如通过共价连接)至固相离子交换材料的带电荷的化合物相互作用，从而所关注的溶质或分析物非特异性地与带电荷的化合物相互作用，比与混合物中的溶质杂质或污染物相互作用多或少。混合物中的污染溶质比所关注的溶质更快或更慢从离子交换材料的柱洗脱，或者相对于所关注的溶质结合至树脂或从树脂排除。
“离子交换色谱”具体包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式离子交换色谱。例如，阳离子交换色谱可以结合靶分子(例如，包含Fc区的靶蛋白)，然后洗脱(例如，利用阳离子交换结合和洗脱色谱或"CIEX")，或者可以主要结合杂质，而靶分子“流过”柱(阳离子交换流过色谱FT-CIEX)。阴离子交换色谱可以结合靶分子(例如，包含Fc区的靶蛋白)，然后洗脱，或者可以主要结合杂质，而靶分子“流过”柱，也称为负色谱。在一些实施方案中，并且如本文所示的实施例所证实的，以流过模式进行阴离子交换色谱步骤。
术语“离子交换基质”指带负电荷(即，阳离子交换介质)或带正电荷(即，阴离子交换介质)的基质。电荷可以通过将一种或多种带电荷的配体例如通过共价键连接至基质来提供。可选地或额外地，电荷可以是基质的固有特性(例如，在二氧化硅的情况下，其具有总体负电荷)。
在本文中术语“阴离子交换基质”指带正电荷的基质，例如具有连接至它的一种或多种带正电荷的配体，如季氨基。可商购的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM(GEHealthcare)。可以用于本文所述的方法和系统的其他示例性材料是EMD TMAE、
Figure BDA0000454410370000142
EMD TMAE highcap、
Figure BDA0000454410370000143
Q和
Figure BDA0000454410370000144
EMD DEAE(EMD Millipore)。
术语“阳离子交换基质”指带负电荷的基质，并且其具有游离的阳离子用于与基质的固相接触的水溶液中的阳离子交换。带负电荷的配体连接至固相以形成阳离子交换基质，或者树脂可以是例如羧酸盐或磺酸盐。可商购的阳离子交换基质包括羧基-甲基-纤维素、固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如，SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM或SP-SEPHAROSE HIGHPERFORMANCETM，来自GE Healthcare)和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如来自GE Healthcare的S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)。优选
Figure BDA0000454410370000145
EMD SO3、
Figure BDA0000454410370000146
EMD SE Highcap、
Figure BDA0000454410370000147
S和
Figure BDA0000454410370000148
EMDCOO(EMD Millipore)。
如本文所用，术语“杂质”或“污染物”指任何外源或有害分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一种或多种宿主细胞蛋白，内毒素，脂质以及一种或多种添加剂，其可以存在于利用本发明的方法分离自一种或多种外源或有害分子的包含靶分子的样品中。此外，这类杂质可以包括用于在本发明的方法之前进行的步骤的任何试剂。杂质的性质可以是可溶性的或不溶性的。
如本文所用，术语“不溶性杂质”指包含靶分子的样品中存在的任何不期望的或有害的实体，其中所述实体为悬浮颗粒或固体。示例性不溶性杂质包括全细胞、细胞片段和细胞碎片。
如本文所用，术语“可溶性杂质”指包含靶分子的样品中存在的任何不期望的或有害的实体，其中所述实体不是不溶性杂质。示例性可溶性杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、RNA、病毒、内毒素、细胞培养基组分、脂质等。
如本文所用，术语“连续方法”指纯化靶分子的方法，其包括两个或更多个方法步骤(或单元操作)，从而来自一个方法步骤的产出直接流入方法中的下一方法步骤，没有中断，并且其中两个或更多个方法步骤可以在它们的持续时间的至少一部分同时进行。换句话说，在连续方法的情况下，如本文所述，不必在下一方法步骤开始之前完成方法步骤，但是一部分样品通常移动通过方法步骤。术语“连续方法”还用于方法步骤内的步骤，在这种情况下，在包括多个步骤的方法步骤进行期间，样品连续流过进行方法步骤所需的多个步骤。本文所述的这样的方法步骤的一个实例是流过纯化步骤，其包括以连续方式进行的多个步骤，例如流过活性炭，然后流过AEX介质、然后流过CEX介质，然后流过病毒过滤。
在一些实施方案中，如本文所述，深层滤器用于澄清，之后澄清的细胞培养物可以连续流指纯化过程中的下一步，例如结合和洗脱色谱步骤(例如，蛋白A亲和色谱)。
如本文所用，术语“半连续方法”指用于纯化靶分子的一般连续方法，其中任何单一方法步骤中流体材料的输入或输出是不连续的或间歇的。例如，在本发明的一些实施方案中，方法步骤(例如，结合和洗脱色谱步骤)中的输入可以连续装载；但是输出可以间歇地收集，其中纯化过程中的其他方法步骤是连续的。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法和系统的性质是“半连续的”，其中它们包括至少一个以间歇方式操作的单元操作，而方法或系统中的其他单元操作可以以连续方式操作。
术语“连接的方法”指用于纯化靶分子的方法，其中所述方法包括两个或更多个方法步骤(或单元操作)，互相直接流体连通，从而流体材料在过程中连续流过方法步骤，并且在方法的普通操作期间同时与两个或更多个方法步骤接触。应当理解有时，方法中的至少一个方法步骤可以通过屏障如处于关闭位置的阀暂时从其他方法步骤分离。这种单独方法步骤的暂时分离可以是必需的，例如在加工启动或关闭期间或者在去除/置换单独单元操作期间。术语“连接的方法”还用于方法步骤内的步骤，例如，当方法步骤需要进行几个步骤以达到方法步骤的预期结果时。一个这样的实例是如本文所述的流过纯化方法步骤，其可以包括以流过模式进行的几个步骤，例如活性炭；阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和病毒过滤。
如本文所用，术语“流体连通”指两个方法步骤之间流体材料的流动或者方法步骤的步骤之间流体材料的流动，其中方法步骤通过任何合适的方式(例如，连接线或缓冲罐)连接，从而使得流体能够从一个方法步骤流至另一方法步骤。在一些实施方案中，两个单元操作之间的连接线可以被一个或多个阀中断以控制流体流过连接线。
如本文所用，术语“纯化(purifying)”、“纯化(purification)”、“分开(separate)”、“分开(separating)”、“分开(separation)”、“分离(isolate)”、“分离(isolating)”或“分离(isolation)”指增加来自包含靶分子以及一种或多种杂质的样品的靶分子的纯度。通常，通过从样品去除(完全或部分)至少一种杂质来增加靶分子的纯度。
如本文所用，术语“沉淀(precipitate)”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation)”指用于澄清的方法，其中改变不期望的杂质的特性，从而它们可以更容易地从可溶性靶分子分离。这通常通过形成包含不期望的杂质的大团聚颗粒和/或不溶性复合物来完成。这些颗粒具有这样的特性(例如密度或大小)，从而它们可以更容易地例如通过过滤或离心从包含可溶性靶分子的液相分离。在某些情况下，引起相分离，从而可以更容易地从可溶性靶分子分离不期望的杂质。通过相改变沉淀可以通过添加沉淀剂如聚合物或小分子来进行。在具体实施方案中，沉淀剂为刺激响应性聚合物，也称为只能聚合物。在本文所述的一些实施方案中，沉淀剂或沉淀试剂为絮凝剂。如本文所用，絮凝是一种进行沉淀的方式，其中性能通常取决于所用的絮凝剂浓度(“剂量依赖性”)。典型的絮凝剂是与带相反电荷的杂质络合的聚电解质，例如聚阳离子。
在本文所述的一些实施方案中，澄清采用将沉淀剂加入包含靶分子以及一种或多种杂质的样品，然后深层过滤。在某些情况下，溶液条件(例如温度、pH、盐度)的改变可以用来开始沉淀，例如在刺激响应性聚合物的情况下。去除包含一种或多种杂质以及沉淀剂的沉淀的物质，从而回收液相中的靶分子，然后通常使液体进行进一步的方法步骤以进一步纯化靶分子。
沉淀可以在包含表达待纯化的靶分子的细胞培养物的生物反应器中直接进行，其中将沉淀剂直接加入生物反应器。或者，可以在单独的容器中将沉淀剂加入细胞培养物，所述细胞培养物通常包含靶分子。
本领域技术人员已知许多方法去除沉淀的物质，例如过滤或沉降或它们的任何组合。
如本文所用，术语“沉降”指沉淀过程，其中沉淀的物质在重力的影响下迁移至容器的底部。沉降之后可以倒出或过滤液相或上清。
如本文所用，术语“智能聚合物”(SmP)，(也称为刺激响应性聚合物或聪明聚合物(intelligent polymer)或亲和大配体(AML))表示一组聚合物，其对外部刺激如环境条件如pH、温度、光、离子强度、辐射、电压、外部压力、溶剂组成的改变或其他刺激生物、化学或物理响应。智能聚合物对小的物理或化学刺激应答，发生大的特性改变，并且可以对这些环境刺激应答，可逆地改变它们的物理或化学特性(Roy and Gupta,2003;Kopecek,2007)。智能聚合物可以采用许多形式；它们可以溶于水溶液，吸附或移植在液体-固体界面上，或者交联以形成水凝胶[Hoffman J Controlled Release(1987)6:297-305;Hoffman Intelligent polymers.In:Park K,ed.Controlled drugdelivery.Washington:ACS Publications,(1997)485-98;Hoffman Intelligentpolymers in medicine and biotechnology.Artif Organs(1995)19:458-467]。通常，当刺激聚合物的临界应答时，溶液中的智能聚合物会在其相分离时表现出浊度的突然发生；表面吸附或移植的智能聚合物会塌陷，将界面由亲水转化为疏水；并且智能聚合物(以水凝胶形式交联)会表现出大幅度塌陷并释放许多其溶胀的溶液。智能聚合物可以物理地与生物分子混合或化学缀合至生物分子以获得大家族的聚合物-生物分子系统，其可以对生物以及物理和化学刺激应答。可以聚合物缀合的生物分子包括蛋白和寡肽、糖和多糖、单链和双链寡核苷酸以及DNA质粒、简单的脂质和磷脂、以及光谱的识别配体和合成药物分子。许多结构参数控制智能聚合物特异性沉淀所关注的蛋白的能力；智能聚合物应当包含配体偶联的反应基团；不与杂质强烈地相互作用；使得配体可用于与靶蛋白相互作用；并且形成紧实的沉淀。
如本文所用，短语包含“高固体”的进料表示具有约>7%固体的进料，而短语包含“低固体”的进料会有约0.1%-7%固体。
在本文中可交换使用时，术语“刺激(stimulus)”或“刺激(stimuli)”是指环境中的物理或化学改变，其导致本发明的刺激响应性聚合物的应答。因此，本发明提供新的聚合物，其对刺激应答，并且所述刺激导致聚合物溶解性的改变。本文所述的一种或多种聚合物应答的刺激的实例包括但不限于温度的改变、电导率的改变和/或pH的改变。在一些实施方案中，刺激包括向样品添加络合剂或络合形成盐。在各种实施方案中，一般在向样品添加聚合物之后加入刺激。然而，也可以在向样品添加聚合物期间或之前加入刺激。
如本文所用，术语“聚合物”指通过两个或更多个单体单元的共价连接形成的分子。这些单体单元可以是合成的或者在自然中出现。重复单元形成的聚合物可以是线性的或支化的。聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚烯丙基胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯和共聚物(例如聚苯乙烯-共-聚吡啶、聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯、pluronic、PF68等)。在本发明的一些实施方案中，聚合物包含聚电解质骨架。
术语“蛋白A”和“Prot A”在本文中可交换使用，并且涵盖从其天然来源回收的蛋白A，合成制备的蛋白A(例如，通过肽合成或通过重组技术)，以及保留结合具有CH2/CH3区如Fc区的蛋白的能力的变体。蛋白A可以商购自Repligen,GE或Fermatech。蛋白A一般固定在色谱基质上。用于本发明的方法和系统的蛋白A的功能衍生物、片段或变体的特征在于对小鼠IgG2a或人IgGl的Fc区至少K=I08M的结合常数，并且优选K=I09M。在本发明的上下文中，具有这样的结合常数值的相互作用柔性称为“高亲和结合”。在一些实施方案中，这样的蛋白A的功能衍生物或变体包含至少部分野生型蛋白A的功能IgG结合结构域，选自具有保留的IgG结合功能性的天然结构域E、D、A、B、C或其工程化突变体。
而且，工程化以允许单点连接至固体支持物的蛋白A衍生物或变体也可以用于要求保护的方法的亲和色谱步骤。
单点连接一般表示蛋白部分通过单一共价键连接至蛋白A亲和色谱的色谱支持材料。这样的单点连接还可以通过使用合适的反应残基来进行，将所述反应残基放置在暴露的氨基酸位置，即在环中，接近N-端或C-端或者在蛋白折叠的外周上。合适的反应基团例如巯基或氨基官能。
在一些实施方案中，变体的蛋白A衍生物通过多点连接连接至合适的色谱基质。
如本文所用，术语“亲和色谱基质”指携带适合亲和色谱的配体的色谱基质。通常配体(例如，蛋白A或者其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且在溶液与色谱基质接触时对于靶分子是易于接近的。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥匙机制如抗原/抗体或酶/受体结合以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体如蛋白ASEPHAROSETM或
Figure BDA0000454410370000191
的基质。在本文所述的方法和系统中，亲和色谱步骤在整个纯化过程中可以用作结合和洗脱色谱步骤。
如本文所用，术语“刺激响应性聚合物”是在添加刺激后表现出物理和/或化学特性改变的聚合物。典型的刺激应答是聚合物溶解性的改变。例如，聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)在低于约35℃的温度下是水溶性的，但是在约35℃的温度下变得不溶于水。
如本文所用，术语“絮凝”指向溶液加入本文所述的絮凝剂如聚合物或化学处理(例如，酸处理)以去除一种或多种悬浮的不溶性或可溶性杂质。必须将聚合物以允许自发形成不溶性团聚物的浓度加入溶液，所述不溶性团聚物可以通过典型的固体-液体分离方法从溶液去除。
如本文所用，术语“组合物”、“溶液”或“样品”指利用本文所述的一种或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化的靶分子或期望产物与一种或多种不期望的实体或杂质的混合物。在一些实施方案中，样品包含原料或细胞培养基，靶分子或期望的产物分泌至其中。在一些实施方案中，样品包含靶分子(例如，治疗性蛋白或抗体)与一种或多种杂质(例如，宿主细胞蛋白、DNA、RNA、脂质、细胞培养添加剂、细胞和细胞碎片)。在一些实施方案中，样品包含分泌至细胞培养基的所关注的靶分子。
在一些实施方案中，利用本文所述的一种或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化靶分子的样品在使样品与刺激响应性聚合物接触之前是“部分纯化的”。部分纯化可以例如通过使样品进行一个或多个纯化步骤如一个或多个非亲和色谱步骤来完成。靶分子可以通过沉淀一种或多种杂质或者通过沉淀靶分子来从一种或多种不期望的实体或杂质分离。
如本文所用，术语“沉淀(precipitate)”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation)”指结合(例如，在与所关注的生物分子的络合物中)或未结合的聚合物或者其他可溶性物质从水性和/或可溶性状态改变为非水性和/或不溶性状态。
如本文所用，术语“所关注的生物分子”可以是期望的靶分子，例如期望的产物或所关注的多肽(例如，抗体)，或者其可以是需要从包含期望的靶分子的样品去除的不期望的实体。这类不期望的实体包括但不限于例如选自宿主细胞蛋白、DNA、RNA、蛋白聚集体、细胞培养添加剂、病毒、内毒素、全细胞和细胞碎片的一种或多种杂质。此外，所关注的生物分子还可以通过如本文所述的刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)结合并沉淀。
在本文中可交换使用的术语“靶分子”、“靶生物分子”、“期望的靶分子”和“期望的靶生物分子”一般指所关注的多肽或产物，期望从一种或多种不期望的实体纯化或分离，例如可以存在于包含所关注的多肽或产物的样品中的一种或多种杂质。
在本文中可交换使用的术语“所关注的蛋白”、“靶多肽”、“所关注的多肽”和“靶蛋白”一般指治疗性蛋白或多肽，包括但不限于利用本发明的刺激响应性聚合物纯化的抗体。
在本文中可交换使用的术语“多肽”或“蛋白”一般指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白。在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物用来从与蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种不期望的实体分离蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种实体是可以与纯化的蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种杂质。如上文所讨论的，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物在将刺激加入样品时特异性地结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，在加入刺激时，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀除所关注的蛋白或多肽以外的实体，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、全细胞、细胞碎片和细胞培养添加剂。
在一些实施方案中，利用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的蛋白或多肽为哺乳动物蛋白，例如治疗性蛋白或可以用于治疗的蛋白。示例性蛋白包括但不限于例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子；抗凝血因子；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；Dnase；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D蛋白；类风湿因子；神经营养因子，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子如NGF-β.；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素；白介素(Il)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如部分AIDS包膜；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及任何上文所列的多肽的片段和/或变体。
此外，在一些实施方案中，利用本发明的智能聚合物纯化的蛋白或多肽为抗体、其功能片段或变体。在一些实施方案中，所关注的蛋白是包含免疫球蛋白的Fc区的重新蛋白。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β-折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称为抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH结构域”。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们保留，或者修饰以包含配体特异性结合结构域。术语“片段”指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的一部分或部分抗体或抗体链。可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链来获得片段。还可以通过重组方式获得片段。当重组制备时，片段可以单独表达，或者作为称为融合蛋白的较大蛋白的部分来表达。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。示例性融合蛋白包括Fc融合蛋白。
一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。但是，还考虑针对非多肽抗原(例如肿瘤相关的糖脂抗原；参见US Pat.No.5,091,178)的抗体。当抗原为多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即该群包含的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，U.S.Pat.No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)和Marks etal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术。
单克隆抗体还可以包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(U.S.Pat.No.4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
“框架”或“FR”残基是那些除如本文所定义的高变区残基以外的可变结构域残基。
非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体的性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。
人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones et al.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
在一些实施方案中，利用本发明的刺激响应性聚合物分离或纯化的抗体为治疗性抗体。示例性治疗性抗体包括例如曲妥珠单抗(HERCEPTINTM,Genentech,Inc.,Carter et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289;U.S.Pat.No.5,725,856)；抗CD20抗体如嵌合的抗CD20“C2B8”U.S.Pat.No.5,736,137；抗IgE(Presta et al(1993)J.Immunol.151:2623-2632;WO95/19181)；抗CD18(U.S.Pat.No.5,622,700;WO97/26912)；抗IgE，包括E25、E26和E27(U.S.Pat.No.5,714,338;U.S.Pat.No.5,091,313;WO93/04173;U.S.Pat.No.5,714,338)；抗Apo-2受体抗体(WO98/51793)；抗TNF-α抗体，包括cA2(REMICADETM)、CDP571和MAK-195(U.S.Pat.No.5,672,347;Lorenz et al(1996)J.Immunol.156(4):1646-1653;Dhainaut et al(1995)Crit.Care Med.23(9):1461-1469)；抗组织因子(TF)(EP0420937B1)；抗CD4抗体如cM-7412抗体(Choy et al(1996)Arthritis Rheum39(1):52-56)；抗Fc受体抗体，例如Graziano et al(1995)J.Immunol.155(10):4996-5002中针对FcγRI的M22抗体；抗GpIIb/IIIa抗体；抗RSV抗体如MEDI-493(SYNAGISTM)；抗CMV抗体如PROTOVIRTM)；抗HIV抗体如PRO542；抗肝炎抗体如抗Hep B抗体OSTAVIRTM)；抗CA125抗体OvaRex；抗独特型GD3表位抗体BEC2；抗αvβ3抗体VITAXINTM；抗人肾细胞癌抗体如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；以及抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
在利用本文所述的刺激响应性聚合物从包含靶分子以及一种或多种杂质的组合物或样品纯化靶分子(例如，所关注的多肽或蛋白)的上下文中，术语“分离(isolating)”、“纯化”和“分离(separating)”在本文中可交换使用。在一些实施方案中，如本文所述，通过利用刺激响应性聚合物从样品去除(完全或部分)一种或多种杂质来增加样品中的靶分子的纯度。在另一实施方案中，通过从样品中的一种或多种杂质沉淀出靶分子来增加样品中的靶分子的纯度。
在一些实施方案中，纯化方法额外地采用一个或多个“色谱步骤”。通常，如果需要，这些步骤可以在利用本发明的刺激响应性聚合物从一种或多种不期望的实体分离靶分子之后进行。
在一些实施方案中，利用本文所述的刺激响应性聚合物分离(isolate)、分离(separate)或纯化所关注的多肽或蛋白的“纯化步骤”可以是导致“均质”或“纯”组合物或样品的总纯化方法的部分，该术语在本文中用来指在包含所关注的蛋白的组合物中包含少于100ppm HCP的组合物或样品，或者少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于10ppm、少于5ppm或少于3ppm的HCP。如本文所用，“初步澄清”包括使用絮凝剂去除聚集的细胞生物质，包括大小大于约10微米(pm)的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒或者较小的颗粒。
如本文所用，术语“澄清(clarify)”、“澄清(clarification)”、“澄清步骤”一般指在纯化生物分子中最初使用的一个或多个步骤。澄清步骤一般包括利用一个或多个步骤去除细胞和/或细胞碎片，所述一个或多个步骤包括任何以下单独步骤或它们的各种组合，例如澄清深层过滤、沉淀、絮凝和沉降。在一些实施方案中，本发明提供对各种纯化方案中常用的常规澄清步骤的改进。澄清步骤一般包括去除一种或多种不期望的实体，并且通常在包括捕获期望的靶分子的步骤之前进行。澄清的另一关键方面是去除样品中的可溶性和不溶性组分，所述组分后来可以导致纯化过程中无菌滤器的污染，从而使得总纯化过程更经济。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种方式进行，例如通过絮凝、pH调节(酸沉淀)、温度变化、由于刺激响应性聚合物或小分子的相改变或者这些方法的任何组合。
如本文所用，术语“色谱”指任何种类的技术，其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如，靶分子)。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止介质的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。
术语“色谱树脂”或“色谱介质”在本文中可交换使用，并且指任何种类的相(例如，固相)，其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如，靶分子)。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止固相的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。各种类型的色谱介质的实例包括例如阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整体柱(monolith)。
如本文所用，术语“捕获步骤”一般指用于用刺激响应性聚合物或色谱树脂结合靶分子的方法，其导致包含靶分子以及聚合物或树脂的沉淀物的固相。通常，随后利用洗脱步骤回收靶分子，所述洗脱步骤从固相去除靶分子，从而导致从一种或多种杂质分离靶分子。在各种实施方案中，捕获步骤可以利用色谱介质如树脂、膜或整体柱进行，或者利用聚合物如刺激响应性聚合物、聚电解质或结合靶分子的聚合物进行。
如本文所用，术语“盐”指通过酸和碱的相互作用形成的化合物。可以用于本文所述的方法中采用的各种缓冲液的各种盐包括但不限于乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、氯化物(例如氯化钠)、硫酸盐(例如硫酸钠)或钾盐。
如本文所用，术语“溶剂”一般指能够溶解或分散一种或多种其他物质以提供溶液的液体物质。溶剂包括水性和有机溶剂，其中可用的有机溶剂包括非极性溶剂、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、己二醇、丙二醇和2,2-硫二甘醇。
在本文中可交换使用的术语“百万分数”或“ppm”指利用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的期望的靶分子(例如，靶蛋白或抗体)的纯度的度量。因此，这个度量可以用来衡量纯化过程后存在的靶分子的量，或者衡量不期望的实体的量。在一些实施方案中，单位“ppm”在本文中用来指溶液中的杂质的量，例如，以毫克/毫升计的所关注的蛋白的以纳克/毫升计的HCP或CHOP(即，CHOP ppm=(CHOP ng/ml)/(所关注的蛋白mg/ml)。当蛋白干燥时(例如，通过冷冻干燥)，ppm指(CHOP ng)/(所关注的蛋白mg))。
在本文中可交换使用的术语多肽的“pi”或“等电点”指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pi可以计算自连接糖的多肽的氨基酸残基或唾液酸残基的净电荷，或者可以通过等电聚焦来确定。
如本文所用，术语“结合和洗脱模式”以及“结合和洗脱方法”指分离技术，其中样品中包含的至少一种靶分子(例如，包含Fc区的蛋白)结合至合适的树脂或介质(例如，亲和色谱介质或阳离子交换色谱介质)并且随后洗脱。
在本文中可交换使用的术语“流过方法”、“流过模式”和“流过操作”指分离技术，其中生物药物制剂中包含的至少一种靶分子(例如，包含Fc-区的蛋白或抗体)与一种或多种杂质预期流过材料，所述材料通常结合一种或多种杂质，其中靶分子通常不结合(即，流过)。
在本文中可交换使用的术语“方法步骤”或“单元操作”指在纯化过程中使用一种或多种方法或装置以实现某种结果。在本文所述的方法和系统中可以采用的方法步骤或单元操作的实例包括但不限于澄清、结合和洗脱色谱、病毒灭活、流过纯化以及配制。应当理解每个方法步骤或单元操作可以采用一个以上的步骤或方法或装置以实现该方法步骤或单元操作预期的结果。例如，在一些实施方案中，如本文所述，澄清步骤和/或流过纯化步骤可以采用一个以上的步骤或方法或装置以完成该方法步骤或单元操作。在一些实施方案中，用来进行方法步骤或单元操作的一种或多种装置是一次性使用的装置，并且可以去除和/或置换而不必置换方法中的任何其他装置或甚至不必终止方法运行。
如本文所用，术语“孔径”和“标称孔径”指保留60-98%比率的大部分颗粒的孔径。
如本文所用，术语“通量”表示通过滤器过滤的体积。
如本文所用，术语“系统”一般指整个纯化方法的物理形式，如本文所述，其包括两个或更多个方法步骤或单元操作。在一些实施方案中，系统封闭在无菌环境中。
在本发明中，使用开放分级层允许较大的颗粒穿透并捕获在捕获在滤器的深层内，而不是收集在表面上(参见实施例2A和2B)。
本发明的优点是较高的通量，并且保留大的固体(0.5微米-约200微米)，同时消除滤饼形成的问题。在初步澄清滤器中使用开放孔提供这些深层滤器，其固体停留的压力线性增加，而压力没有显著增加，因此导致高通量。滤器的结构尺寸联合层的优化(孔径和厚度)给出卓越的过滤特性，其可以保留大量固体。
在本发明中，使用开放分级层允许进料流中较大的絮凝颗粒穿入滤器的深层，并且捕获在滤器的孔内，而不是收集在表面上(参见实施例9(A-E)和11(A-J))。本文提供的初步澄清深层滤器这样排列：“开放的”顶层构成深层滤器的前置过滤区以捕获较大的絮凝颗粒，而底层构成抛光区，其捕获较小的残余的聚集的絮凝颗粒。具有这种类型的排列的初步澄清深层滤器的一个优点是较高的通量，并且保留较大的絮凝颗粒，同时还消除滤饼形成的问题。在本文所教导的初步澄清滤器中使用这类开放孔提供固体停留的压力的线性增加，而压力没有显著增加，因此导致更高、更期望的通量。
本发明的初步澄清深层滤器的实例在图1A、1B、1C、1D、1E和1F中示出。
图1C示出具有至少7层的初步澄清深层滤器，并且在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
图1A和1E示出具有至少8层的初步澄清深层滤器，并且各自在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
图1B、1D和1F示出具有至少8层的初步澄清深层滤器，并且各自在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用。
图1A所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。
图1B所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约5微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
图1C所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约8微米厚的非织造纤维如聚丙烯的单层(底部)，约0.2cm厚。
图1D所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
图1E所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。
图1F所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约35微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约15微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
本文提供的初步澄清深层滤器的结构尺寸联合初步澄清深层滤器的孔径和/或层厚度的优化导致非常有利的过滤特性，其还保留大量固体。因为深层滤器通过各种机制的组合实现滤过介质的深层，所以进料的柱体积(Vf)比介质的柱体积(Vm)示出不同滤器的有效性。
此外，各种进料具有不同量的固体，这导致深层滤器的高度可变的性能，因此(Vf)比(Vm)值给出滤器的实际“效率”的更好估计。
另一重要参数K用来描述滤器效率，同时对原料的固体含量归一化。参数K允许有效比较具有不同固体含量的进料的过滤。
如等式1所示，K参数实际上是3个可测量的参数柱通量(TP)、收集效率(η)和固体的初始浓度(Ci)的函数。
K＝[TP]×[η]×[Ci]×100
        (1)
如等式2所示，其中柱通量(TP)通过过滤的进料体积(Vf)除以介质体积(Vm)来给出，收集效率(η)通过捕获的固体体积(Vsc)除以进料中的固体体积(Vs)来给出，而固体的初始浓度通过进料中的固体体积(Vs)除以过滤的进料体积(Vf)来给出。
K = [ V f V m ] &times; [ V sc V s ] &times; [ V s V f ] &times; 100 - - - ( 2 )
以下实施例证实等式(1)和(2)以及K参数在确定和比较颗粒深层滤器在用于特定原料时的效率的可用性。
提供以下实施例以向本领域技术人员提供怎样制备本发明的组合物以及怎样实施本发明的方法的完整公开和描述，并且不是为了限制本发明的范围。已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，温度以摄氏度C计，化学反应在大气压或跨膜压下进行，如本文所示，术语“环境温度”指约25℃，而“环境压力”指大气压。
比较例
沉降常常因为很长的沉降时间(小时)而失败。丢弃大体积松散的细胞絮状物团引起低mAb收率，因为大部分的mAb被截留在细胞团中。(参见实施例5)
滤饼过滤失败，因为细胞团在压力下破裂。换句话说，细胞碎片在压力下从聚合物分裂，并且作为滤液中的高浊度流过(参见实施例6)。
深层过滤失败，因为絮状物，特别是来自聚合物系统的絮状物很大，在100微米的数量级。代替深层过滤所需的穿入介质，大的絮状物迅速堆在深层滤器介质的表面上，将深层滤器介质降低为低效的滤饼滤器。(参见实施例7)
已尝试动态过滤如切向过滤或振动滤器介质，少量成功，因为减少滤饼形成所需的剪应力将絮状物破碎回单独的颗粒，使絮凝的益处无效。(参见实施例8)
本发明会通过以下实施例进一步说明，这意图示例本发明。
实施例
实施例1未澄清的非表达细胞培养液(CCF)的制备
在代表性实验中，使来源于表达中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的细胞在10L生物反应器(New Brunswick Scientific,Edison,NJ)中生长至10x106个细胞/mL的密度，并且在80%成活力时收获。单克隆抗体(mAb)滴度确定为0.8g/L。利用ELISA测定(Cygnus Technologies,Southport,NC,#3G ELISA)发现宿主细胞蛋白(HCP)水平为200,000ng/mL。未澄清的细胞培养物的pH为pH6.9。
实施例2多价离子刺激敏感聚合物的制备
将10g聚烯丙基胺(PAA)(Nittobo Medical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan150kD;40%wt/wt)置于100mL圆底烧瓶中，并且在磁力搅拌下于室温下少量加入3.34g氢氧化钠(1.2Eq./单体)在25mL H2O中的溶液。然后加入苄基氯(2.30g,2.09mL)，在室温下搅拌几分钟，然后加热至60℃过夜保持17小时。然后将反应冷却至室温并去除溶剂，导致聚合物沉淀。将沉淀的聚合物用水洗涤并在1M的AcOH水溶液(40ml)中搅拌，直至达到完全溶解。然后将溶液用H2O稀释至400ml的终体积(1%聚合物溶液)，在搅拌下加入磷酸氢二钾(K2HPO4)(3.48g)，并且将溶液的pH调整至pH6.8以沉淀修饰的聚合物。通过玻璃漏斗过滤收集聚合物，并且最终在50℃-60℃下于真空炉中干燥过夜。然后将聚合物重新溶解于1M乙酸以产生10%wt聚合物浓溶液。
实施例3CHO-S进料的智能聚合物(SmP)处理
为了用SmP絮凝细胞培养物，将来自实施例1的细胞培养液的500ml样品加入1000ml培养瓶。在搅拌的同时，将来自实施例2的聚合物浓缩液的样品加至期望的聚合物剂量(wt%)，通常为0.2%。将溶液混合15分钟。
实施例4CHO-S进料的酸处理
为了添加酸降低pH来絮凝细胞培养物，将来自实施例1的细胞培养液的500ml样品加入1000ml培养瓶。在搅拌的同时，逐滴加入浓乙酸直至达到期望的pH。除非另有说明，靶pH为pH4.8-5.0。允许将溶液混合15分钟。
实施例5智能聚合物(SmP)处理的CHO-S进料的沉降研究
在不同沉降时间进行沉降实验以确定利用密度差异进行SmP处理的进料的固体液体分离的有效性。根据实施例3制备500ml细胞培养液。
使SmP处理的进料沉降约0.5-6小时，采集上清的样品并测量浊度和固体体积。利用HACH Model#2100P浊度计(turbiditimeter)测量浊度。表1示出对0.5-6小时时间的SmP处理的CHO-S进料的沉降研究。
观察到对于SmP处理的CHO-S进料，沉降时间>约180分钟以达到<约20NTU的平衡浊度，而对于SmP处理的CHO-DH44进料，沉降时间为约120分钟以达到<约20NTU的平衡浊度。
当使用最小聚合物剂量(0.05%)时，对于SmP处理的CHO-S进料，不完全絮凝甚至在12小时沉降时间之后导致增加的浊度(>约350NTU)。此外，对于SmP处理的CHO-S进料，3小时的沉降时间具有大体积的松散细胞体(约30%-40%)，而对于SmP处理的CHO-DH44进料为20%，这显然可以导致低mAb收率(约60%-80%)，因为大量mAb被截留在松散的团中。
表1：智能聚合物处理的CHO-S进料的沉降研究
Figure BDA0000454410370000321
实施例6智能聚合物(SmP)处理的DG44和CHO-S进料的滤饼过滤
将硅藻土(DE)介质用来确定滤饼过滤的有效性。首先，将DE装入布氏漏斗中至少约4cm的深度，之后我们通过应用真空使来自实施例3的SmP处理的进料通过它。通过硅藻土介质过滤期间，CHO-S细胞在20μm筛上形成滤饼的膜。观察到滤饼阻碍滤液的外向流动，导致通量<约10L/m2。此外，观察到细胞团在压力下从聚合物分裂，导致高浊滤液(约200NTU-300NTU)，其可以显著影响二次过滤操作。
实施例7利用可商购的初步澄清滤器(D0HC和F0HC)深层过滤智能聚合物(SmP)处理的CHO-S进料
用来自实施例3的智能聚合物(SmP)处理的CHO-S进料和来自实施例4的酸处理的进料进行过滤实验以确定可商购的
Figure BDA0000454410370000331
D0HC深层滤器的通量。根据使用说明将D0HC滤器用水冲洗。利用蠕动泵将进料以100L/m2/hr的流速应用至深层滤器。但是，深层滤器不能操作高固体进料流。据信深层过滤失败主要是因为聚集的细胞较大，并且代替深层过滤所需的穿入介质，较大的颗粒在深层滤器介质表面上积聚，将深层滤器介质还原为低效的滤饼滤器。D0HC对SmP处理的进料具有约20L/m2的通量，而F0HC对酸处理的进料具有约5L/m2的通量。来自较大的絮状物颗粒的滤饼形成主要是由于滤器的密封性，这显著减少滤器的通量。
实施例8智能聚合物(SmP)处理的进料的动态过滤
进行利用切向流
Figure BDA0000454410370000332
3(0.11m2)过滤装置(可获得自MilliporeCorporation,Billerica,MA USA)的动态过滤实验以确定SmP处理的进料的固体液体分离的有效性。过滤装置包含聚偏氟乙烯(PVDF)膜构成的微滤膜(0.45μm)。将SmP处理的细胞培养收获物以50L/m2/h装载直至TMP达到15psi。观察到
Figure BDA0000454410370000333
3装置的瞬间阻塞，导致通量<5L/m2。观察到低收率，这是由于快速阻塞和系统和装置滞留体积产生的材料损失。
实施例9A用于去除团聚和大生物分子颗粒的深层滤器
利用七(7)层非织造纤维(聚丙烯)组装深层过滤装置，所有层的总厚度为1.6cm。在深层过滤装置中从最开放的标称孔径200μm(2层)然后标称50pm(2层)、标称40pm(2层)至单一标称8μm层排列层(参见图1)。
七(7)层(针刺毡)非织造纤维(Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI)的独有特性在表3中示出(2层×200pm，2层×50pm，2层×40pm以及1层×8pm)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试深层过滤装置的水通透性，在4psi下得到0.45L/min的值。
表3：来自Rosedale Products,Inc.和Midwest Filtration Company的非织造毡材料的物理特性的表征
Figure BDA0000454410370000341
实施例9B用于去除团聚和大生物分子颗粒的深层滤器
实施例9B的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约200μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由七(7)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维组成(2层×200pm，2层×100pm，2层×50pm和1层×8pm)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自MilliporeCorporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到.55L/min的值。
实施例9C用于去除团聚和大生物分子颗粒的深层滤器
实施例9C的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约200μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由七(7)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维组成(3层×200pm，3层×100pm和1层×8pm)。将本文提供的分级深层滤器组装在23cm2的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自MilliporeCorporation,Billerica,MA USA)中，并且测试水通透性，在4psi下得到0.55L/min的值。
实施例9D用于去除团聚和大生物分子颗粒的深层滤器
实施例9D的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含0.5μm-100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由七(7)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维组成(2层×100μm，2层×50μm，2层×40μm和1层×8μm)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.5L/min的值。
实施例9E用于去除团聚和大生物分子颗粒的深层滤器
实施例9E的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤聚合物絮凝的包含约0.5μm-约200μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由七(7)层来自Midwest Filtration Company,Cincinnati,Ohio的非织造纤维组成(2层×
Figure BDA0000454410370000351
760PP，2层×100pm，2层×50pm和1层×530MM)。分级深层滤器进料由七(7)层来自Midwest FiltrationCompany,Cincinnati,Ohio的非织造纤维组成(2层×
Figure BDA0000454410370000353
760PP，2层×100pm，2层×50pm和1层×
Figure BDA0000454410370000354
530MM)。将本文提供的分级深层滤器组装在23cm2的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自MilliporeCorporation,Billerica,MA USA)中，并且测试水通透性，在4psi下得到0.65L/min的值。
实施例10深层滤器去除团聚和大生物分子颗粒的过滤性能
利用以下方法测试来自实施例9A-9E的滤器装置的过滤性能。用Milli-Q水冲洗之后，用未处理和SmP处理的未澄清的进料运行深层滤器，通过压力传感器监测的交叉每个滤器的TMP。将未澄清的细胞培养收获物用0.2wt%智能聚合物(SmP)剂量(wt%)处理并搅拌15分钟。首先将深层滤器用≥约50L的Milli-Q水以每平方米过滤面积600L/m2/h冲洗，以便湿润滤器介质并冲掉可提取物。将未处理和SmP处理的未澄清的收获物以100L/m2/h装载，直至交叉任一滤器的TMP达到20psig。
表4比较了两个滤器(X0HC和D0HC)与初步澄清深层滤器过滤实施例3所述的进料的滤器通量。(0.2%(w/v)智能聚合物(SmP)处理的进料)。X0HC和DOHC给出10L/m2和44L/m2的通量，而初步澄清深层滤器的通量为325L/m2。如表4所示，在所有情况下，滤液浊度<约5NTU。关于滤液的柱体积比介质的柱体积，X0HC和D0HC给出1.5Vf/Vm和6Vf/Vm的通量，而初步澄清深层滤器的通量为16.5CVf/CVm。实施例9A表现最好，具有16.5Vf/Vm(325L/m2)的柱通量，84%的K效率。从这个比较，显然由本权利要求书所述的层组成的实施例9A滤器能够在澄清未澄清的细胞收获物期间去除大量固体。
表4：对于0.2%(w/v)的SMP处理的进料的过滤通量，实施例9A所述的初步澄清(PC)深层滤器的比较
Figure BDA0000454410370000361
关于线性压差增长，本发明具有显著优势。在X0HC和D0HC的情况下，在开始时流体压力较小并恒定，但是突然呈指数增加，从而达到其极限。与观察到的压力反应一致的一种可能的解释是在滤器的表面上迅速形成滤饼层。在初步澄清深层滤器的情况下，压力增加接近线性，压力没有显著的急剧增加。这种结果与颗粒截留在滤器的深层，避免滤饼形成一致。还观察到滤器体积通量的大幅度增加，这再次与深层过滤代替商业X0HC和D0HC滤器中观察到的滤饼形成一致。
表5比较了关于进料的柱体积比介质的柱体积，实施例9B-9E所述的初步澄清深层滤器的滤器通量。
对于SmP处理的CHO-DG44进料，实施例9B所述的分级深层滤器给出32Vf/Vm(640L/m2)的体积通量，90%的K效率，而对于SmP处理的CHO-S进料，给出22Vf/Vm(430L/m2)的柱通量，90%的K效率。
在另一实施例9C中，对于SmP处理的CHO-DG44进料，分级深层滤器得到33Vf/Vm(660L/m2)的体积通量，94%的K效率，而对于SmP处理的CHO-S进料，得到22Vf/Vm(435L/m2)的柱通量，90%的K效率。
对于SmP处理的CHO-DG44进料，实施例9D所述的分级深层滤器得到29Vf/Vm(580L/m2)的体积通量，81%的K效率，而对于SmP处理的CHO-S进料，得到20Vf/Vm(390L/m2)的柱通量，81%的K效率。
在另一实施例9E中，对于SmP处理的CHO-S进料，本权利要求书所述的分级深层滤器得到Vf/Vm(650L/m2)的体积通量，92%的K效率。
从这个比较明显可见，由权利要求书所述的层组成的实施例9A-9E滤器能够在澄清未澄清的细胞收获物期间去除大量固体。
表5：对于0.2%(w/v)的SMP处理的进料的过滤通量，实施例9B-9E所述的初步澄清(PC)深层滤器的比较
Figure BDA0000454410370000371
实施例11A用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
化学处理的进料(例如，酸处理)具有将平均粒径从<约5μm增加至>约20μm的能力。此外，酸处理的进料给出广泛的粒径分布。响应对分离这种广泛颗粒的需求，开放分级非织造纤维层与较紧(CE和DE)的组合提供有效的深层过滤。利用八(8)层非织造纤维(聚丙烯)组装深层过滤装置，所有层的总厚度为2.0cm。在过滤装置50中排列层，具有开放标称孔径200μm(2层)，然后标称50μm(2层)，标称40μm(2层)，然后一层纤维素(CE25)，以及一层硅藻土(DE40)。六(6)层(针刺)非织造纤维(RosedaleProducts,Inc.,Ann Arbor,MI)的独有特性在表3中示出((2×200μm,2×50μm,and2×40μm)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.40L/min的值。
实施例11B用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器。
实施例11B的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有2cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由六(6)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维(2层×30pm，2层×25pm,2层×20pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)组成。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.15L/min的值。
实施例11C用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11B的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有2cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器进料包含六(6)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维(2层×25pm，2层×20pm,2层×10pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.15L/min的值。
实施例11D用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11D的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器进料包含四(4)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维和纤维素(CE25)/硅藻土(DE60)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.3L/min的值。
实施例11E用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11E的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有2cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由六(6)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维(2层×25pm，2层×20pm,2层×10pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)组成。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.2L/min的值。
实施例11F用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11F的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由四(4)层来自Rosedale Products,Inc.,Ann Arbor,MI的非织造纤维(2层×20μm，2层×10pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)组成。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.3L/min的值。
实施例11G用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11G的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有1.6cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由六(6)层来自Midwest Filtration Company,Cincinnati,Ohio的非织造纤维(2层×50pm，2层×25pm,2层×10pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)组成。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.35L/min的值。
实施例11H用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11H的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有2cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5μm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由六(6)层来自Midwest Filtration Company,Cincinnati,Ohio的非织造纤维(2×25pm,2×10pm,2×5pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)组成。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.4L/min的值。
实施例11I用于去除团聚和小生物分子颗粒的深层滤器
实施例11I的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有2cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.5pm-约100μm的颗粒的进料流。分级深层滤器包含六(6)层来自Midwest Filtration Company,Cincinnati,Ohio的非织造纤维(2×10pm,2×5pm,2×1pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)。在组装一堆层之后，将聚丙烯软管倒钩末端盖加至顶部和底部，并且将整个组件封装入单一的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)。测试装置的水通透性，在4psi下得到0.4L/min的值。
实施例12深层滤器去除团聚和小生物分子颗粒的过滤性能
利用以下方法测试来自实施例11A-11I的滤器装置的过滤性能。将未澄清的细胞培养收获物用1M冰醋酸处理以将pH调整至4.8，并且搅拌30分钟。用Milli-Q水冲洗之后，用未处理和酸处理的未澄清的进料运行深层滤器，通过压力传感器监测的交叉每个滤器的TMP。首先将深层滤器用≥约50L的Milli-Q水以每平方米过滤面积600L/m2/h冲洗，以便湿润滤器介质并冲掉可提取物。将未处理和酸沉淀的未澄清的收获物以100L/m2/h装载，直至交叉任一滤器的TMP达到20psig。
表6比较了两个滤器(X0HC和D0HC)与初步澄清深层滤器对酸处理的进料的滤器通量。X0HC和DOHC给出5L/m2和20L/m2的通量，而初步澄清深层滤器的通量为210L/m2。
表6：酸沉淀初步澄清(APPC)深层滤器对酸处理的进料(pH=4.8)的过滤通量的比较
Figure BDA0000454410370000412
表2在进料的柱体积比介质的柱体积方面比较两种
Figure BDA0000454410370000413
滤器(X0HC和D0HC)与酸沉淀的初步澄清深层滤器对酸处理的进料的滤器通量。X0HC和DOHC给出1.5Vf/Vm(K=6)和4Vf/Vm((K=16)的通量，而初步澄清深层滤器的通量为9Vf/CVm(K=36)。从这个比较，显然由本权利要求书所述的层组成的实施例9A滤器能够在澄清未澄清的细胞收获物期间去除大量固体。
表2：智能聚合物处理的CHO-DG44进料的沉降研究
表7比较了关于进料的柱体积比介质的柱体积，实施例11B-11I所述的初步澄清深层滤器的滤器通量。从这个比较，显然由本文提供的层组成的实施例11A-11I滤器能够在澄清未澄清的细胞收获物期间去除大量固体。
表7：酸沉淀初步澄清(APPC)深层滤器对酸处理的进料(pH=4.8)的过滤通量的比较。
Figure BDA0000454410370000422
实施例13用于去除0.1μm-200μm的团聚和小胶体颗粒的深层滤器
实施例13的分级深层滤器由分级非织造纤维组成，具有2cm的深度，并且能够过滤酸絮凝的包含约0.1μm-约200μm的颗粒的进料流。分级深层滤器由六(6)层来自Midwest Filtration Company,Cincinnati,Ohio的非织造纤维(2层×25pm，2层×10pm,2层×5pm)，然后可商购的纤维素(CE25)/硅藻土(DE40)以及IM75组成。将本文提供的分级深层滤器组装在23cm2的整体式Mini Cap过滤装置(可获得自Millipore Corporation,Billerica,MA USA)中，并且测试水通透性，在4psi下得到0.25L/min的值。然后，将酸沉淀的未澄清的收获物以100L/m2/h装载，直至交叉任一滤器的TMP达到20psig。与对照分级滤器比较过滤性能，所述对照分级滤器由六(6)层来自Midwest Filtration Company,Cincinnati,Ohio的非织造纤维(2层×25pm，2层×10pm，2层×5pm)，然后一层纤维素(CE25)以及一层硅藻土(DE40)组成。这个实施例所述的滤器得到11Vf/Vm(K=66)的通量，而对照分级深层滤器的通量为12Vf/CVm(K=72)。但是，本实施例所述的分级深层滤器得到NTU的浊度，相比之下，对照分级滤器为4NTU。从这个比较，显然由本文提供的层组成的实施例13滤器在澄清期间除了细胞和细胞碎片，能够去除较小的胶体颗粒，这可能导致去除方法中的二次澄清滤器。
对消费者的另一主要益处是提高的高固体原料澄清经济学。如前所述，在许多高固体原料的澄清过程应用中，离心和/或切向流微滤用作二次澄清上游的初步澄清步骤，所述二次澄清通常包括深层滤器。通过以本文所述的方式将深层滤器加入初步澄清过程，消除前面(上游澄清步骤)和后来(下游澄清步骤)使用离心步骤和/或切向流微滤。此外，预期在清洁、检测和置换离心和/或切向流微滤膜中会花费较少停产时间。
实施例14用于纯化靶分子的澄清深层过滤装置和系统
图5是并入纯化靶分子的系统的示例性澄清深层过滤装置纯化方法的示意图，其中所述系统包括两个或更多个在流体连通后互相连接的单元操作，以便以连续或半连续方式进行纯化靶分子的方法。每个单元操作可以采用一个或多个装置以达到该单元操作预期的目的。因此，在一些实施方案中，本文所述的系统包括几个装置，连接所述装置以使得纯化过程以连续或半连续方式运行。
不希望受到理论的束缚，考虑系统可以封闭在密闭的无菌环境中，以便以无菌方式进行整个纯化过程。
在各种实施方案中，这样的系统中的第一个装置是包含起始原料的生物反应器，例如表达待纯化的蛋白的培养细胞。生物反应器可以是任何类型的生物反应器，如分批或补料分批生物反应器，或者连续生物反应器如连续灌注发酵生物反应器。生物反应器可以由任何合适的材料制备，并且可以是任何大小。典型的材料为不锈钢或塑料。在具体实施方案中，生物反应器是一次性的生物反应器，例如柔性的可折叠袋，设计为一次性使用。
澄清可以直接在生物反应器中进行，或者可选地，生物反应器可以简单地用于培养细胞，而澄清在不同的容器中进行。在另一实施方案中，细胞培养物简单地流过如本文所教导的澄清深层过滤装置以去除一种或多种杂质。因此，在一些实施方案中，生物反应器与用于进行深层过滤的装置流体连通。
本文所教导的澄清深层过滤装置与利用结合和洗脱色谱进行捕获的装置(例如，连续多柱色谱装置)流体连通。在一些实施方案中，将用于结合和洗脱色谱的装置与用于进行流过纯化的单元操作流体连通连接，所述单元操作可以包括一个以上装置/步骤。在一些实施方案中，在用于结合和洗脱色谱的装置与用于流过纯化的装置之间包括连续静态混合器或缓冲罐。
在一些实施方案中，流过纯化方法包括一个以上装置，例如活性炭装置，然后AEX色谱装置，然后用于改变pH的连续静态混合器和/或缓冲罐，然后CEX色谱装置，然后病毒过滤装置。装置一般可以是任何合适的形式，例如柱或筒。
系统中最后的单元操作可以包括一个或多个装置用于实现配制，所述配制包括渗滤/浓缩和无菌过滤。
通常，每个装置包括至少一个入口和至少一个出口，从而使得来自一个装置的输出能够与系统中的连续装置的入口流体连通。
在现在工业使用的大部分方法和系统中，纯化方法所用的每个装置采用加工设备单元，也称为“滑道(skid)”，其通常包括必要的泵、阀、传感器和装置支持物。通常,至少一个滑道与每个装置相关。在本文所述的一些实施方案中，整个纯化过程中使用的滑道的数目减少。例如，在一些实施方案中，仅一个滑道用来进行整个流过纯化方法，其可以包括多个装置，例如活性炭装置，阴离子交换色谱装置，阳离子交换色谱装置和病毒过滤装置，连同溶液条件改变所需的任何设备。因此，在一些实施方案中，单一滑道可以用于流过纯化方法中的所有前述步骤。
在一些实施方案中，各种装置之间的流体连通是连续的；其中流体直接流过所有装置，没有中断。在其他实施方案中，在各种装置之间可以包括一个或多个阀、传感器、检测器、缓冲罐以及用于任何连续溶液改变的设备，从而暂时中断流体流过系统，如果需要，例如置换/去除特定单元操作。
在一些实施方案中，各种装置之间包括一个或多个缓冲罐。在一些实施方案中，不超过3个和不超过2个缓冲罐存在于整个系统中。
在一些实施方案中，系统还包括一个或多个传感器和/或探针用于控制和/或监测系统内的一个或多个过程参数，例如温度、压力、pH、电导率、溶解氧(DO)、溶解二氧化碳(DCO2)、混合速率、流速、产物参数。在某些情况下，传感器还可以是光学传感器。
在一些实施方案中，方法控制可以以不损害系统的无菌性的方式实现。
在一些实施方案中，传感器和/或探针可以连接至传感器电子模块，其输出可以发送至端子板(terminal board)和/或继电器盒。传感操作的结果可以输入至计算机实施的控制系统(例如，计算机)用于计算和控制各种参数(例如，温度和重量/体积测量、纯度)以及用于显示和用户界面。这样的控制系统还可以包括电子、机械和/或气动系统的组合以控制过程参数。应当理解控制系统可以进行其他功能，并且本发明并不限于具有任何特定功能或功能集。
上文所示的公开可以涵盖具有独立功用的多个不同发明。虽然这些发明中的每一个以其优选形式公开，并不认为如本文公开和说明的其具体实施方案具有限制意义，因为许多变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新的和非显而易见的组合和亚组合。以下权利要求特别指出认为新的和非显而易见的某些组合和亚组合。特征、功能、元件和/或特性的其他组合和亚组合中包含的发明可以在从这个或相关申请要求优先权的申请要求保护。无论涉及不同发明或相同发明，并且无论范围广于、窄于、等于或不同于原始权利要求，还认为这样的权利要求包括在本文所教导的发明的主题内。

Claims (46)

1.一种通过深层过滤但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤来澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料的方法，所述方法包括：
a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
b)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料；
c)使所述深层滤器介质与所述进料接触；以及
d)分离所述进料中的所关注的靶生物分子与所述细胞碎片和胶体颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
2.权利要求1的方法，其还包括将化学絮凝剂加入步骤(b)的进料中，从而形成包含多种絮凝的细胞碎片和胶体颗粒的化学絮凝的进料。
3.权利要求1的方法，其中所述多孔深层滤器介质是各向异性的，所述孔具有>约25μm的标称孔径评级，并且所述滤器絮凝的进料具有>约3%的固体从而导致<约20NTU的浊度输出。
4.权利要求1的方法，其中所述澄清方法为初步澄清方法，并且所述深层滤器包含至少2层非织造纤维的分级层。
5.权利要求4的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
6.权利要求1的方法，其中所述深层滤器包含至少3层非织造纤维的分级层。
7.权利要求6的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
8.权利要求1的方法，其中所述细胞碎片和所述胶体颗粒具有约0.5pm-约200pm的粒径分布，并且平均粒径大于约10pm。
9.权利要求2的方法，其中所述深层滤器介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的原料的开放标称孔径评级。
10.权利要求1的方法，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
11.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂为聚合物或酸。
12.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂为智能聚合物。
13.权利要求12的方法，其中所述智能聚合物为修饰的多胺。
14.权利要求11的方法，其中所述酸为乙酸。
15.权利要求4的方法，其中所述非织造纤维包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
16.权利要求2的方法，其中所述深层滤器提供>约100L/M2/hr的通量，并且去除具有约0.5pm-约200pm的粒径分布的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒。
17.权利要求1的方法，其中所述进料是位于生物反应器中的细胞培养物，并且直接从所述生物反应器装入所述深层过滤装置以用于初步澄清加工。
18.权利要求17的方法，其中将澄清的细胞培养流出液直接装入蛋白A结合和洗脱色谱柱以用于色谱加工。
19.一种通过深层过滤但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤来初步澄清包含所关注的生物分子物质以及多种细胞物质的絮凝的进料的方法，所述方法包括：
a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
b)提供化学絮凝剂；
c)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞物质和/或胶体颗粒的进料；
d)将所述化学絮凝剂加入所述进料中；
e)形成化学絮凝的进料，其包含絮凝的细胞物质和/或胶体颗粒；
f)使所述深层滤器介质与所述化学絮凝的进料接触；以及
g)分离所述进料中的所关注的靶生物分子与所述絮凝的细胞物质和/或絮凝的胶体颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤澄清步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述多孔深层滤器介质是各向异性的，所述孔具有>约25μm的标称孔径评级，并且所述絮凝的进料具有>约3%的固体从而导致<约20NTU的浊度输出。
21.权利要求19的方法，其中所述深层滤器包含至少2层非织造纤维的分级层。
22.权利要求21的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
23.权利要求19的方法，其中所述深层滤器包含至少3层非织造纤维的分级层。
24.权利要求23的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
25.权利要求19的方法，其中所述细胞物质和胶体颗粒具有约0.5μm-约200μm的粒径分布，并且平均粒径大于约10μm。
26.权利要求19的方法，其中所述深层滤器介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的进料的开放标称孔径评级。
27.权利要求19的方法，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
28.权利要求19的方法，其中所述化学絮凝剂为聚合物或酸。
29.权利要求19的方法，其中所述化学絮凝剂为智能聚合物。
30.权利要求29的方法，其中所述智能聚合物为修饰的多胺。
31.权利要求28的方法，其中所述酸为乙酸。
32.权利要求19的方法，其中所述深层滤器提供>约100L/M2的通量，并且去除絮凝的细胞碎片和絮凝的胶体颗粒。
33.权利要求19的方法，其中所述进料包括细胞培养物、转基因哺乳动物细胞培养物、细菌细胞培养物、非转基因哺乳动物细胞培养物、组织培养物、微生物发酵批次、植物提取物、生物燃料、海水培养物、淡水培养物、废水培养物、处理的污水、未处理的污水、奶培养物、血液培养物以及它们的组合。
34.权利要求19的方法，其中所述非织造纤维包括聚丙烯。
35.权利要求19的方法，其中所述进料是位于生物反应器中的细胞培养物，并且直接从所述生物反应器装入所述深层过滤装置以用于初步澄清加工。
36.权利要求35的方法，其中将澄清的细胞培养流出液直接装入蛋白A结合和洗脱色谱柱以用于色谱加工。
37.一种用于初步澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤的深层过滤装置，其包含多孔深层滤器介质，所述介质具有至少2层非织造纤维的分级层，所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度，并且所述孔具有>约25μm的标称孔径分级。
38.权利要求37的装置，其中所述介质是各向异性的。
39.权利要求37的装置，其中所述介质包含至少3层非织造纤维的分级层。
40.权利要求37的装置，其中所述介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的原料的开放标称孔径评级。
41.权利要求37的装置，其中所述非织造纤维包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
42.权利要求37的装置，其中所述细胞碎片和所述胶体颗粒具有约0.5μm-约200μm的粒径分布，并且平均粒径大于约10μm。
43.权利要求37的装置，其中所述介质提供>约100L/M2/hr的通量，并且去除具有约0.5pm-约200μm的粒径分布的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒。
44.权利要求37的装置，其中当将化学絮凝剂加入所述进料中时，滤器絮凝的进料具有>约3%的固体从而导致<约20NTU的浊度输出。
45.权利要求37的装置，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
46.一种从样品纯化靶蛋白的方法，所述方法包括：
(i)提供包含靶蛋白以及一种或多种杂质的样品；
(ii)将沉淀剂加入所述样品中，并且利用梯度密度深层滤器去除一种或多种杂质，从而获得澄清的样品；
(iii)使来自步骤(ii)的澄清的样品进行结合和洗脱色谱步骤，从而获得洗脱液；
(iv)利用一个或多个连续静态混合器或者一个或多个缓冲罐使来自步骤(iii)的洗脱液与一种或多种病毒灭活剂接触；
(v)使病毒灭活步骤的输出进行流过纯化过程，其包括使用选自活性炭、阴离子交换色谱介质、阳离子交换色谱介质和病毒过滤膜的两种或更多种基质；以及
(vi)以期望的浓度和缓冲条件配制来自步骤(v)的输出，
其中所述方法连续进行，从而至少两个或更多个方法步骤在它们的持续时间的至少一部分期间同时进行。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106317166A (zh) * 2015-07-02 2017-01-11 北京中原领先科技有限公司 高效过滤层析混合机制分离蛋白装置
CN107029478A (zh) * 2017-05-19 2017-08-11 太仓新亚逊生物科技有限公司 用于一次性生物技术方法的改良深层过滤器
CN110996712A (zh) * 2017-06-15 2020-04-10 波雷克斯科技公司 具有可区分的密度或纤维直径的一体多孔纤维介质
CN113286804A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 伊克诺斯科学公司 细胞培养物澄清的方法
CN113785045A (zh) * 2019-02-15 2021-12-10 贾斯特-埃沃泰克生物制品有限公司 生产生物治疗剂的设施和方法
CN114470969A (zh) * 2020-11-12 2022-05-13 四川远大蜀阳药业有限责任公司 一种深层过滤介质及其用途

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG194763A1 (en) 2011-07-08 2013-12-30 Emd Millipore Corp Improved depth filters for disposable biotechnological processes
SG11201407525VA (en) * 2012-06-06 2014-12-30 Emd Millipore Corp Low organic extractable depth filter media processed with solvent extraction method
ES2895173T3 (es) * 2012-06-29 2022-02-17 Emd Millipore Corp Métodos para inactivar virus durante un proceso de purificación de proteínas
EP2682168A1 (en) 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
US10711238B2 (en) 2012-10-02 2020-07-14 Repligen Corporation Method for proliferation of cells within a bioreactor using a disposable pumphead and filter assembly
EP3019262A1 (en) * 2013-07-12 2016-05-18 Merck Patent GmbH Removal of fragments from a sample containing a target protein using activated carbon
US20150344545A1 (en) * 2014-06-03 2015-12-03 Harry Leneau Method of Treating and Preventing Infectious Diseases Using Colostrum
EP3015542A1 (de) * 2015-05-07 2016-05-04 Bayer Technology Services GmbH Modulare anlage und verfahren zur kontinuierlichen, keimreduzierten produktion und/oder aufbereitung eines produktes
SI3334747T1 (sl) 2015-08-13 2024-02-29 Amgen Inc. Globinsko nabito filtriranje proteinov, ki vežejo antigen
KR101766115B1 (ko) 2016-02-05 2017-08-07 현대자동차주식회사 장수명 자동차용 흡기 필터 및 이의 제조방법
WO2018022965A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Phillips 66 Company Thermoresponsive polymers for aqueous applications
CN106565844B (zh) * 2016-11-08 2019-07-09 深圳万乐药业有限公司 深层过滤单克隆抗体细胞培养液的方法
US10388778B2 (en) * 2016-11-18 2019-08-20 Nexperia B.V. Low resistance and leakage device
CN107604739B (zh) * 2017-09-26 2019-06-07 江南大学 一种过滤用棉秆皮纤维与壳聚糖复合非织布的制备方法
KR20200115467A (ko) * 2018-01-31 2020-10-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료용 단클론 항체에 대한 새로운 산성 번역 후 변형으로서의 글루쿠로닐화
CN110241012B (zh) * 2018-03-09 2022-11-01 嘉和生物药业有限公司 一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法、生产模块及在生产中的应用
EA202092216A1 (ru) * 2018-03-26 2021-06-11 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Способ получения иммуногенной композиции
WO2019212921A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant aav production
US10792618B2 (en) 2018-06-19 2020-10-06 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Particle separation and/or purification of a fluid
US11028359B2 (en) * 2018-09-11 2021-06-08 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Separation devices, associated methods, and systems
JP2020104036A (ja) * 2018-12-26 2020-07-09 Jnc株式会社 細胞培養液用の濾材及び当該濾材を含んでなるデプスフィルター
EP3916001A4 (en) * 2019-01-23 2022-10-19 Daiichi Sankyo Company, Limited ONE-STEP PROCEDURE FOR PURIFICATION OF ANTIBODIES USING ACTIVATED CARBON MATERIAL
CN111635063B (zh) * 2019-03-01 2023-02-10 四川中科翰林环保科技有限公司 一种基于人工智能的养殖污水处理设备及方法
WO2022118114A1 (en) * 2020-12-04 2022-06-09 3M Innovative Properties Company A filtration unit and a method for biomaterial purification
WO2023041515A2 (en) * 2021-09-15 2023-03-23 Basf Se Method for preparing an aqueous (meth) acrylamide solution
CN114307651A (zh) * 2021-11-23 2022-04-12 中国辐射防护研究院 一种用来分离不同粒径吸附放射性核素胶体的装置及方法
EP4292696A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-20 Sartorius Stedim Biotech GmbH Filter system usable as cell culture clarification filter in protein purification

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040118765A1 (en) * 2002-12-19 2004-06-24 Yavorsky David P. Deep gradient-density filter device
US20040124146A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-01 Scimed Life Systems, Inc. Porous spun polymeric structures and method of making same
US20060107639A1 (en) * 2004-10-15 2006-05-25 Hamlin Thomas J Pleated multi-layer filter media and cartridge
WO2008106078A2 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Den-Mat Holdings Llc Improved dental veneer instrument
CN101426905A (zh) * 2006-04-20 2009-05-06 惠氏公司 从细胞培养物分离纯化的水泡性口炎病毒的纯化方法
US7531632B2 (en) * 2006-02-16 2009-05-12 Gtc Biotherapeutics, Inc. Clarification of transgenic milk using depth filtration
US20090232737A1 (en) * 2006-12-21 2009-09-17 Wilson Moya Purification of proteins

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR205025A1 (es) * 1974-04-19 1976-03-31 Johnson & Johnson Medios para filtrar sangre
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989012463A1 (en) 1988-06-21 1989-12-28 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
ES2189787T3 (es) * 1990-09-25 2003-07-16 Asahi Medical Co Metodo y sistema de filtracion para eliminacion de leucocitos.
US5190657A (en) * 1991-07-22 1993-03-02 Lydall, Inc. Blood filter and method of filtration
ATE233813T1 (de) 1991-08-14 2003-03-15 Genentech Inc Veränderte immunglobuline für spezifische fc- epsilon rezeptoren
CA2140933A1 (en) 1992-08-21 1994-02-22 Paula M. Jardieu Method for treating an lfa-1 mediated disorder
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ES2108566T3 (es) 1993-12-10 1997-12-16 Genentech Inc Procedimientos para diagnosticar alergias y para seleccionar agentes terapeuticos antialergicos.
EP0739214B1 (en) 1994-01-18 1998-03-18 Genentech, Inc. A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS
ATE222774T1 (de) 1996-01-23 2002-09-15 Genentech Inc Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag
EP1860187B1 (en) 1997-05-15 2011-07-13 Genentech, Inc. Apo-2 receptor
CA2338319A1 (en) * 1998-07-21 2000-02-03 Monsanto Company Clarification of protein precipitate suspensions using anionic polymeric flocculants
US20040118766A1 (en) 2000-02-03 2004-06-24 Pulek John L. Graded particle-size retention filter medium for cell-type filter unit
US6693173B2 (en) * 2000-12-26 2004-02-17 Alpha Therapeutic Corporation Method to remove citrate and aluminum from proteins
US7118675B2 (en) * 2002-02-04 2006-10-10 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
US20030201229A1 (en) * 2002-02-04 2003-10-30 Martin Siwak Process for prefiltration of a protein solution
US7390403B2 (en) 2004-03-19 2008-06-24 Millipore Corporation Prefilter system for biological systems
KR20080006591A (ko) * 2005-05-08 2008-01-16 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 필터 카트리지 및 그 구성 방법
AU2006292739A1 (en) 2005-09-15 2007-03-29 Wyeth Protein floculation using salts
US7673757B2 (en) * 2006-02-17 2010-03-09 Millipore Corporation Adsorbent filter media for removal of biological contaminants in process liquids
US8147583B2 (en) * 2007-06-08 2012-04-03 Gore Enterprise Holdings, Inc. Multiple layer filter media
JP5199758B2 (ja) * 2008-07-04 2013-05-15 ディバーシー株式会社 フロアーポリッシュ剥離汚水および洗浄汚水の処理方法
DE102008037678A1 (de) * 2008-08-14 2010-02-25 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid
SG10201702951RA (en) * 2008-10-20 2017-06-29 Abbvie Inc Viral inactivation during purification of antibodies
CN102256993A (zh) * 2008-12-16 2011-11-23 米利波尔公司 蛋白的纯化
US20100190963A1 (en) * 2008-12-16 2010-07-29 Millipore Corporation Stirred Tank Reactor And Method
JP5416222B2 (ja) * 2008-12-23 2014-02-12 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 官能化不織布物品
US8192635B2 (en) * 2009-04-20 2012-06-05 Dholakia Jayant M Method for reducing clogging of filters
JP2012531531A (ja) * 2009-06-23 2012-12-10 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 官能化不織布物品
CA2815342A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Medimmune, Llc Methods for processing inclusion bodies
CA2821330C (en) * 2010-12-14 2019-02-26 Smith Mountain Industries, Inc Candle wick and wick clip
SG194763A1 (en) 2011-07-08 2013-12-30 Emd Millipore Corp Improved depth filters for disposable biotechnological processes
SG11201407525VA (en) * 2012-06-06 2014-12-30 Emd Millipore Corp Low organic extractable depth filter media processed with solvent extraction method

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040118765A1 (en) * 2002-12-19 2004-06-24 Yavorsky David P. Deep gradient-density filter device
US20040124146A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-01 Scimed Life Systems, Inc. Porous spun polymeric structures and method of making same
US20060107639A1 (en) * 2004-10-15 2006-05-25 Hamlin Thomas J Pleated multi-layer filter media and cartridge
CN101039734A (zh) * 2004-10-15 2007-09-19 3M创新有限公司 褶式多层过滤介质及滤筒
US7531632B2 (en) * 2006-02-16 2009-05-12 Gtc Biotherapeutics, Inc. Clarification of transgenic milk using depth filtration
CN101426905A (zh) * 2006-04-20 2009-05-06 惠氏公司 从细胞培养物分离纯化的水泡性口炎病毒的纯化方法
US20090232737A1 (en) * 2006-12-21 2009-09-17 Wilson Moya Purification of proteins
WO2008106078A2 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Den-Mat Holdings Llc Improved dental veneer instrument

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTIN A. CHANDLER，ANDREW L. ZYDNEY: "Clarification of Yeast Cell Suspensions by Depth Filtration", 《BIOTECHNOLOGY PROGRESS》 *
MARTIN A. CHANDLER，ANDREW L. ZYDNEY: "Clarification of Yeast Cell Suspensions by Depth Filtration", 《BIOTECHNOLOGY PROGRESS》, vol. 21, no. 5, 7 October 2005 (2005-10-07) *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106317166A (zh) * 2015-07-02 2017-01-11 北京中原领先科技有限公司 高效过滤层析混合机制分离蛋白装置
CN107029478A (zh) * 2017-05-19 2017-08-11 太仓新亚逊生物科技有限公司 用于一次性生物技术方法的改良深层过滤器
CN110996712A (zh) * 2017-06-15 2020-04-10 波雷克斯科技公司 具有可区分的密度或纤维直径的一体多孔纤维介质
CN113286804A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 伊克诺斯科学公司 细胞培养物澄清的方法
CN113785045A (zh) * 2019-02-15 2021-12-10 贾斯特-埃沃泰克生物制品有限公司 生产生物治疗剂的设施和方法
CN114470969A (zh) * 2020-11-12 2022-05-13 四川远大蜀阳药业有限责任公司 一种深层过滤介质及其用途

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Publication number Publication date
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