CN107635657A - 用于去除可浸出物和/或可提取物的活性炭 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纯化靶分子，如重组和/或生物治疗蛋白。可用活性炭去除由过程中所用可弃式设备产生的可浸出物和/或可提取物。

Description

用于去除可浸出物和/或可提取物的活性炭
本发明涉及纯化靶分子，如重组和/或生物治疗蛋白，例如，由细胞表达系统产生。可用活性炭去除由过程中所用可弃式设备产生的可浸出物和/或可提取物。
发明背景
有效和经济地大规模制备生物分子是生物技术和制药工业上越来越重要的考虑，例如，治疗蛋白，包括抗体、肽或激素。一般纯化过程很复杂，花费大，且包括很多不同步骤。
一般蛋白用细胞培养方法制备，例如，使用哺乳动物或细菌细胞系，经重组工程以制备关注蛋白。通常，在靶蛋白表达后，从一种或多种杂质(例如，宿主细胞蛋白、培养基组分和核酸)分离造成难以克服的挑战。如果治疗蛋白要用于人，且必须由管理机构例如美国食品药物管理局(FDA) 批准，则这种分离和纯化尤其重要。
现今用于纯化蛋白的常规方法通常至少包括以下步骤：(a)用于去除细胞和细胞碎片的澄清步骤，例如，使用差分离心和/或过滤；和(b)从澄清细胞培养进料中的不同杂质分离关注蛋白的一个或多个下游色谱步骤。
因此，制备和纯化生物分子是涉及数个类型纯化介质和数个类型设备的多步过程。
出于灵活、安全、减少的资本和操作费用的生产，在生物制药工业有一个新出现趋势是将一次使用和/或可弃式塑料材料。可弃式生物处理设备可在宽范围和规模使用，从溶液容器、输送管到各种装置。在制备过程期间，这些设备组件与产物直接接触。已发现，来自塑料材料的可浸出物和/或可提取物可最终存在于成品中(W. Ding, Chemie IngenieurTechnik 2013, 85, No 1-2, 186-196)。虽然可浸出物/可提取物的水平通常低于工业指导(Q3C)中所给的水平，但问题是，即使低水平可浸出物/可提取物也可能影响药品安全性，并影响性能，导致产品安全和质量问题。
因此，需要在生物过程中从靶生物分子去除可浸出物/可提取物，以保证药品安全性和质量，同时使用可弃式设备。
发明概述
已发现，可通过经活性炭装置过滤去除或减少在靶分子制备中由使用可弃式设备产生的可浸出物/可提取物的量。
因此，本发明涉及纯化靶分子的方法，其制备和/或纯化过程包括使用可弃式设备，其中用活性炭使靶分子与可浸出物和/或可提取物分离。一般通过使活性炭与包含靶分子和潜在可浸出物和/或可提取物的液体接触，进行纯化，其中可浸出物和/或可提取物在与活性炭接触时保持或结合到活性炭上，而包含靶分子的液体不结合，然后例如通过过滤从活性炭分离。
在一个实施方案中，靶分子为具有10000或更大分子量的蛋白。
在一个实施方案中，靶分子为糖蛋白。
在一个实施方案中，靶分子为抗体。
在一个优选的实施方案中，可浸出物和/或可提取物为一种或多种以下组分：乙醛、甲苯、2-己酮、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯、双酚A、苄醇、三甲基硅烷醇、甲醛、苯二甲酸双(2-乙基己基)酯、乙酸1-甲基乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2-辛酮、2-戊酮、3,3-二甲基-2-丁酮、3-乙氧基丙烷、3-己酮、3-甲氧基-1-丁醇、丁醛、环己酮、乙醇、甲酸、七乙二醇、己醛、甲基·异丁基酮、戊醛、叔丁醇、四氢呋喃、甲酸甲酯。
在一个优选的实施方案中，方法在3至9之间的pH进行。
在另一个优选的实施方案中，活性炭为通过有机聚合材料、优选聚苯乙烯热解得到的活性炭。
在一个优选的实施方案中，活性炭具有5和40µm之间的中值粒径。
在一个实施方案中，通过经一个或多个包含活性炭的滤器过滤使靶分子与可浸出物和/或可提取物分离。
在一个实施方案中，本发明的方法用于制备和/或纯化过程，包括一个或多个以下步骤：
- 在生物反应器中细胞培养
- 澄清
- 纯化
- 过滤
在另一个实施方案中，在本发明的方法中，在一个过程步骤后使靶分子与活性炭接触，在所述过程步骤中可弃式设备与高于25℃温度和/或可弃式设备的机械变形组合使用，和/或在所述过程步骤中靶分子在可弃式设备中的停留时间大于1小时。
本发明还涉及活性炭用于从液体去除可浸出物和/或可提取物的用途。
在一个优选的实施方案中，使液体与活性炭在过滤装置中接触，其中液体流动通过包含活性炭的过滤装置，以便可浸出物和/或可提取物结合到活性炭，而液体和液体中包含的靶分子不结合到活性炭。
附图
图1显示在所选择材料上毒性和较小毒性参比物质的吸附。
图2显示在不同材料上所选择参比物质的吸附。
图3显示在所选择活性炭材料上乙酸乙酯的吸附。
图4显示在一次使用组合件后和在用活性炭填充的玻璃柱上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用电喷射离子化(ESI+)方法的质谱结果。
图5显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用电喷射离子化(ESI+)方法的质谱结果。
图6显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用电喷射离子化(ESI-)方法的质谱结果。
图7显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用大气压化学离子化(APCI-)方法的质谱结果。
图8显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用大气压化学离子化(APCI-)方法的质谱结果。
图9显示在一次使用组合件后和在用活性炭填充的玻璃柱上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用电喷射离子化(ESI+)方法的质谱结果。
图10显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用电喷射离子化(ESI+)方法的质谱结果。
图11显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用电喷射离子化(ESI-)方法的质谱结果。
图12显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用大气压化学离子化(APCI-)方法的质谱结果。
图13显示在一次使用组合件后和在Millistak+®滤器上装载经处理水后对于可提取物/可浸出物检测使用大气压化学离子化(APCI-)方法的质谱结果。
关于附图的更多细节可见于实施例中。
定义
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不限于具体组合物或过程步骤，因此可以变化。应注意到，如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如对“一个配位体”的提述包括复数配位体，而对“一个抗体”的提述包括复数抗体等。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明涉及领域的技术人员普遍了解的相同含义。为本文描述的发明定义以下术语。
本文所用术语“靶分子”指应与样品中的一种或多种其它组分(例如，杂质)分开、分离或纯化的任何分子、物质或化合物。靶分子的实例为抗体、抗原结合片段(Fab)、恒定区片段(Fc)、蛋白、肽、重组蛋白、其它天然化合物、其它生物药物化合物、疫苗或生物药物化合物的聚集体。在一个优选的实施方案中，靶分子为生物分子，优选蛋白。在一个很优选的实施方案中，靶分子为抗体。在制备和/或纯化过程中，靶分子一般存在于液体中。液体可以为水、缓冲液、非水溶剂(如乙醇)或其任何混合物。除靶分子外，所述液体还可能包含一种或多种杂质。在制备和/或纯化期间，根据进行的过程步骤，液体的组成可以改变。在色谱步骤后，液体一般包含除先前以外的其它溶剂，因为在色谱步骤中使用洗脱剂。为了制备最后剂型，一般只在最后步骤纯化步骤后才可干燥靶分子。
术语“抗体”指具有特异结合到抗原的能力的蛋白。一般地，抗体具有由两个重链和两个轻链组成的基本四个多肽链结构，所述链例如通过链间二硫键稳定化。抗体可以为单克隆或多克隆抗体，并且可以单体或聚合形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。抗体也可包括多特异抗体(例如，双特异抗体)和抗体片段，只要它们保持或改变以包含配体特异结合域。术语“片段”指比完整或完全抗体或抗体链包含更少氨基酸残基的抗体或抗体链的局部或部分。可通过化学或酶促处理完整或完全的抗体或抗体链得到片段。片段也可通过重组方式得到。在重组制备时，可单独或作为称为融合蛋白的较大蛋白的部分来表达片段。示例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fc和/或Fv片段。示例性融合蛋白包括Fc融合蛋白。根据本发明，融合蛋白也被术语“抗体”所包括。
在一些实施方案中，抗体为包含Fc区的蛋白，例如，免疫球蛋白。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白为包括融合到另一个多肽或其片段的免疫球蛋白的Fc区的重组蛋白。示例性多肽包括，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素α-链；胰岛素β-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管假性血友病因子；抗凝血因子，例如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(激活调节正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如，人血清白蛋白；副中肾管抑制物质；松弛素α-链；松弛素β-链；前松弛素；鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒素T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)(例如，CTLA-4)；抑制素；激活蛋白；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，例如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如αFGF和βFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(l-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD 19、CD20、CD34和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-I至IL-IO；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，例如CDl Ia、CDl Ib、CDl Ic、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如HER2、HER3或HER4受体；和任何上列多肽的片段和/或变体。另外，本发明的抗体为任何特异结合到任何上列多肽的蛋白或多肽、其片段或变体。
如本文所用，且除非另外说明，术语“样品”指任何包含靶分子的组合物或混合物。样品可从生物或其它源得到。生物源包括真核和原核源，例如植物和动物细胞、组织和器官。优选的样品来自细胞培养液，例如哺乳动物细胞培养物，例如CHO、NS-0、SP2/0、BioWa；细菌细胞培养物，例如大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)；酵母细胞培养物；或丝状真菌。样品也可包括稀释剂、缓冲剂、清洁剂和污染物类、碎片及发现与靶分子混合的类似物质。样品可“经部分纯化”(即，已经过一个或多个纯化步骤，例如过滤步骤)，或者可直接从产生靶分子的宿主细胞或生物体得到(例如，样品可包含收获的细胞培养液)。
本文所用术语“杂质”或“污染物”指任何外来或可能排斥的分子，包括生物大分子，例如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白、核酸、内毒素、脂质、合成源的杂质和一种或多种可存在于样品的添加剂，所述样品包含要与一种或多种外来或可能排斥的分子分离的靶分子。另外，此类杂质可包括任何用于制备和/或纯化过程步骤的反应剂。可浸出物和/或可提取物也是杂质。
术语“纯化”、“分离”或“分开”，在本文中可互换使用，指通过从包含靶分子和一种或多种其它组分(例如，杂质)的组合物或样品分离提高靶分子的纯度。一般通过从组合物去除(完全或部分)至少一种杂质提高靶分子的纯度。
术语“色谱”指使关注的分析物(例如，靶分子)与混合物中存在的其它分子分离的任何种类的技术。通常，靶分子由于在移动相影响下混合物的单独分子迁移通过固定介质的速率的差异或在结合和洗脱过程方面的差异而与其它分子分离。色谱分离过程的实例为反相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
“缓冲液”为由其酸-碱共轭组分的作用阻止pH变化的溶液。可根据例如缓冲液所需pH利用的各种缓冲液描述于(Buffers. A Guide for the Preparation and Use ofBuffers in Biological Systems(缓冲液. 生物系统中的缓冲液制备和使用指南),Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)。缓冲剂的非限制实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲剂及这些的组合。
“可弃式设备”或“一次使用设备”是一种为有限次数使用而设计的产品，使用后再循环或作为固体废物处置，或优选为一次使用而设计的产品，例如，用于纯化来自生物反应器的一批原料。该术语通常意味着廉价和短期便利，而不是中至长期耐用性。该术语有时也用于可持续数星期或数月的产品(例如，可弃式滤器)，以区分持续无限期的类似产品(例如，可洗式滤器)。优选“一次使用设备”为只使用一次的设备，由此，由其使用的过程的持续时间限定使用持续时间，例如过滤过程、生物反应器过程等。
可弃式设备由塑料材料制成，例如聚酰胺、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚酯、聚乙烯基类(例如聚氯乙烯)、聚砜(例如聚醚砜)、聚四氟乙烯、乙酸纤维素、乙烯基乙酸乙酯或聚丙烯。可弃式设备可以为制备和纯化靶分子所需的任何设备，例如生物反应器、储集罐、缓冲罐、缓冲袋、任何类型的管、阀、柱、滤器、筒或连接件。
本文所用术语“生物反应器”指任何支持生物活性环境的制造或设计的装置或系统。在一些情况下，生物反应器为其中进行细胞培养过程的容器，涉及生物体或从这些生物体得到的生物化学活性物质。此过程可需氧或厌氧。常用生物反应器一般为圆筒形，大小从数升至数立方米，通常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器可包含由钢以外的材料制成的可弃式组成部分，且可弃。在一些实施方案中为其中保持生物活性环境的可弃式袋。根据具体过程，可设想生物反应器的总体积为100mL至10,000升或更大的任何体积。可弃式或一次使用生物反应器提供可再用生物反应器的替代，并用于在处置之前进行优选一个生物或生物技术过程。通过为各过程提供新的可弃式生物反应器，且优选在制备过程期间灭菌，可减少(交叉-)污染风险，同时不需要进行和证明先前使用的生物反应器完善清洁和灭菌。可弃式生物反应器经常设计成柔性容器，例如袋，或至少在其一些部分具有柔性的壁的容器。此类生物反应器的实例描述于US 2011/0003374 A1、US2011/0058447A1、DE 20 2007 005 868U1、US 2011/0058448A1、US2011/0207218A1、WO 2008/088379A2、US 2012/0003733 A1、WO2011/079180 A1、US2007/0253288A1、US 2009/0275121A1和US 2010/0028990A1。
本文所用术语“储集罐”指一般在过程步骤之间使用，且具有能够从过程步骤收集整个输出体积的任何容器、器皿、储器、罐或袋。储集器可用于保持或储存或操控来自过程步骤的整个输出体积的溶液条件。
在一些实施方案中，制备和纯化靶分子的过程和系统可在整个过程中使用一个或多个储集罐或缓冲罐。
本文所用术语“缓冲罐”指在多个过程步骤之间或在一个过程步骤内使用(例如，在单一过程步骤包括多于一个步骤时)的任何容器或器皿或袋，其中来自一个步骤的输出通过缓冲罐流到下一步骤上。因此，缓冲罐与储集罐的不同之处在于，它不是要保持或收集来自一个步骤的整个输出体积，而是能够使输出从一个步骤连续流到下一步骤。
本文所用术语“澄清”、“澄清作用”和“澄清步骤”指用于去除悬浮颗粒和或胶体的过程步骤，从而减小包含靶分子的溶液的浊度，在NTU(比浊浊度装置)中测定。可通过多种方式澄清，包括离心或过滤。离心可以分批或连续方式进行，而过滤可以正常流(例如，深层过滤)或切向流方式进行。在现今工业使用的方法中，一般首先离心，随后深层滤器，旨在去除可能未由离心去除的不溶杂质。另外，可使用提高澄清效率的方法，例如沉淀。可通过不同方式沉淀杂质，例如，通过絮凝、pH调节(酸沉淀)、温度变化、由于刺激反应聚合物或小分子造成的相变或任何这些方法的组合。在本文所述的一些实施方案中，澄清包括任何离心、过滤、深层过滤和沉淀中两种或更多种的组合。本文所用术语“深层滤器”或“深层过滤”指能够在整个过滤介质而不是只在滤器表面保留颗粒物质的滤器。在本文所述的一些实施方案中，在澄清过程步骤使用一个或多个深层滤器。
本文所用术语“可浸出物和/或可提取物”指可在制备和/或纯化过程期间和之后在靶分子制备或在包含靶分子的液体中发现的杂质，其中所述杂质从制备和纯化过程中所用的设备、尤其可弃式设备产生。
可提取物为在一定时间、温度和机械力条件下从与靶分子直接接触的任何材料迁移进入靶分子或在暴露于适当溶剂时包含靶分子的液体的化合物。可排出可提取物的材料包括弹性体、塑料或涂层组分。
可浸出物为由于正常过程条件或加速储存条件下与靶分子制剂或包含靶分子的液体直接接触而从任何靶分子接触材料(包括弹性体、塑料或涂层组分)迁移进入靶分子制剂并存在于包含靶分子的液体和最终靶分子产物(如果未去除)的化合物，通常是可提取物的子集。
一般地，可提取物试验用模型溶剂进行，而可浸出物研究使用实际靶分子或过程流体。
一般地，可提取物在过大或侵蚀性条件下得到，而可浸出物试验使用正常过程条件。
因此，一般地，可浸出物显示为可提取物的子集。在一些情况下，由于过程流体或靶分子与过程设备的相互作用，一些可浸出物化合物不是可提取物的部分。
关于可提取物和可浸出物的细节，可发现于BPSA Extractables and Leachables Subcommittee, BioProcess Int.2007, 5 (11), 36。
可浸出物和/或可提取物的实例为乙醛、甲苯、2-己酮、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯、双酚A、苄醇、三甲基硅烷醇、甲醛、苯二甲酸双(2-乙基己基)酯、乙酸1-甲基乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2-辛酮、2-戊酮、3,3-二甲基-2-丁酮、3-乙氧基丙烷、3-己酮、3-甲氧基-1-丁醇、丁醛、环己酮、乙醇、甲酸、七乙二醇、己醛、甲基·异丁基酮、戊醛、叔丁醇、四氢呋喃、甲酸甲酯。
目前发展水平的生物药物制备过程一般用基因修饰细胞表达生物反应器中所关注的靶，随后进行很多单元操作将其纯化。对于一些生物药物分子，例如单克隆抗体，正使用由离心、深层过滤、色谱纯化、病毒灭活、色谱精制、病毒过滤和超滤/渗滤步骤组成的平台过程，以得到大量药物物质。建立生物药物分子纯化过程去除潜在污染和有害物，例如细菌、病毒、宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA、靶分子支架或聚集体、纯化过程可浸出物和可提取物(Shukla, A.A., Gottschalk U, Trends in Biotechnology(生物技术趋势), 2013年3月, Vol. 31, No. 3, 147-154)。
发明详述
本发明的要点是发现，活性炭，尤其通过有机聚合材料热解得到的活性炭，可用于去除从使用可弃式设备产生的可浸出物和/或可提取物。从WO201404281和US 2014/046038知道，活性炭一般可用于在生物制药过程去除杂质。但一直未发现活性炭尤其适用于去除从使用可弃式设备产生的可浸出物和/或可提取物。
活性炭是具有广泛非特异吸附性质的材料，并在工业领域用作吸附剂或脱色剂，例如化学药品和食品生产、污物或废水处理、水过滤和小分子药物生产。
本文所用术语“活性炭”或“活化炭”可互换使用，指已经过增强孔结构的过程的含碳材料。活性炭为具有很高表面积的多孔固体。它们可从多种源得到，包括煤、木材、椰壳、坚果壳、泥煤和有机聚合物。活性炭可从这些材料用物理活化(包括在控制气氛下加热)或化学活化(用强酸、碱或氧化剂)生产。活化过程产生具有给予活性炭高去除杂质能力的高表面积的多孔结构。为了控制表面酸性，可修改活化过程。
已发现，根据本发明，从有机聚合物得到的活性炭尤其有效用于去除可浸出物和/或可提取物。有机聚合物为任何合成、化学限定有机聚合物，例如聚苯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚乙烯、聚酯、聚乙烯基类或聚丙烯。
优选活性炭包括球形活性炭颗粒或优选由其组成。那意味它们具有在所有三个空间维度基本相似的扩展。除了球形外，也可想象立方、平行六面体或圆柱形，其条件为在两个不同空间维度的扩展相差不大于3倍，优选小于2倍。
从有机聚合物得到的活性炭可通过球形有机材料热解得到，例如聚苯乙烯。然而，也可使葡萄糖溶液热解，如Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 4, 2009, 第1063至1073页中所述。生产球形活性炭进一步公开于US 20060148645和US 2008171648。
生产此类活性炭聚合物颗粒的示例性方式是使用聚合物球，具体地讲，离子交换剂球，其聚合物结构包含可分离官能团，具体地讲，磺酰基和/或羧基，作为离析物。使多孔聚合物球热解，任选使经热解聚合物球经过活化步骤。分离官能团优选以高达5%至15%残余物含量存在(指所用官能团的重量份额)。此第一热处理的温度适合在200℃至350℃经历10min至60min。气氛原则上是任意的。以下热解步骤在基本相当于第一热处理最后温度的温度开始，优选结束于600℃至800℃。加热速率适合在5K/min至0.5K/min范围内，可立即由其计算热解步骤持续时间。活化步骤不关键，以常规方式进行。
适合球形活性炭也可作为SARATECH (TM) 100562、SARATECH (TM) 100772和SARATECH (TM) 101373(Blücher GmbH, Erkrath, Germany)得到。
活性炭具有优选10至10 000m2/g的表面积，更优选100至5000m2/g，最优选1000至2000m2/g。
活性炭的平均粒径优选为至少2µm，更优选2至550µm，特别优选5至40µm。
颗粒表征在本领域已知，优选通过过筛制备，由I. C. Edmundson, Particle-size analysis(粒径分析), H. S. Bean, A. H. Beckett和J. E. Carles (eds)在Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2, Academic Press, London 1967, 95-174中描述。
产物级分的平均粒径可通过EDANA推荐的检验方法No. WSP 220.2-05“粒径分布”测定，其中“筛分级分”的质量比例以累积形式绘图，并在图形上确定平均粒径。在本文中，平均粒径为产生累积50%重量的粒度值。
具有一定粒径的活性炭的比例，例如5至40µm，优选为全部活性炭重量的至少90%重量，更优选至少95%重量，最优选至少98%重量。
可在靶分子制备和/或纯化过程中发现的可浸出物和/或可提取物的类型和量取决于数个方面，如过程中使用的设备和进行过程的条件，如温度、溶剂、pH。典型可浸出物和/或可提取物为乙醛、甲苯、2-己酮、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯、双酚A、苄醇、三甲基硅烷醇、甲醛、苯二甲酸双(2-乙基己基)酯、乙酸1-甲基乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2-辛酮、2-戊酮、3,3-二甲基-2-丁酮、3-乙氧基丙烷、3-己酮、3-甲氧基-1-丁醇、丁醛、环己酮、乙醇、甲酸、七乙二醇、己醛、甲基·异丁基酮、戊醛、叔丁醇、四氢呋喃、甲酸甲酯。尤其已确定甲苯、2-己酮、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯、双酚A、苄醇、三甲基硅烷醇、甲醛和苯二甲酸双(2-乙基己基)酯为重要的可浸出物和/或可提取物。已证明甲苯、2-己酮、丙酮、2-丁酮和乙酸乙酯为监测和参比过程品质和残余可浸出物和/或可提取物的量的适合参比化合物。
为了进行本发明的方法，在靶分子制备和/或纯化过程的任何阶段，使一般存在于液体的靶分子与活性炭接触。这当然应在其中已利用可弃式设备的过程步骤后进行。生物制药一般包括数个过程步骤，例如，在生物反应器中细胞培养、澄清、色谱、病毒清除、过滤等。这些步骤和制备用于这些步骤的介质和缓冲液分别可包括使用可弃式设备。在制备和/或纯化过程内，可利用可弃式设备一次或数次。在制备和/或纯化过程中，可使用活性炭一次或数次。它可作为附加过程步骤进行，或者可包括在现有过程步骤，例如，过滤步骤。
在一个实施方案中，在其中可弃式设备与一个或多个以下过程特征组合使用后，使一般存在于液体的靶分子与活性炭接触：
- 升高的温度，这表示在此过程步骤在产物溶液与可弃式设备接触期间，温度至少部分高于25℃。这是例如其中细胞一般在37℃培养的可弃式生物反应器的情况。
- 长暴露时间，这表示在此过程步骤产物溶液与可弃式设备接触大于1小时。这是例如在其中细胞一般培养数天的生物反应器的情况，或在例如色谱步骤的过程步骤的情况，其中色谱分离需要大于1小时，以便在可弃式罐中储存包含靶分子的溶液大于1小时。
- 机械变形，这表示可弃式设备机械变形，或用机械力处理，例如在使用软管泵时，或在将塑料袋压在一起以释放其中所含液体时。这种变形通常增加可浸出物和/或可提取物从塑料材料的释放。
在另一个实施方案中，使一般存在于液体的靶分子与活性炭在过程中接触两次或更多次。
可通过包含靶分子的液体与活性炭混合进行与活性炭的接触，随后从活性炭分离液体，例如，通过沉降、离心和/或优选过滤。活性炭和液体之间的接触时间一般在5和30分钟之间。
在一个优选的实施方案中，通过使包含靶分子的液体流动通过活性炭进行接触。对此，活性炭可填充在柱、筒、滤器或任何其它适合装置中。一般地，液体在装置中的停留时间在0.5和5min之间。本领域的技术人员能够改变流速，以达到适合停留时间与液体和活性炭的量。
包含靶分子的液体一般为从应在其后进行本发明的方法的过程步骤得到的液体。它可以为水、缓冲液、有机液体或其混合物。一般为水性缓冲液。液体一般包含靶分子和一种或多种杂质，如可浸出物和/或可提取物。
用活性炭去除可浸出物和/或可提取物可在宽范围提取条件进行，例如pH、电导率和离子强度。一般地，包含靶分子的溶液可直接施加到活性炭，而不改变溶液的pH、电导率和离子强度。在接触活性炭时，包含靶分子的液体的pH可例如在pH 3和9之间。然而，在溶液中存在有机溶剂可能影响活性炭的结合能力。
用活性炭提取可浸出物和/或可提取物基于吸附性尺寸排阻，这表示可浸出物和/或可提取物结合在活性炭的孔中，而靶分子太大，以致于不能进入孔，因此不结合在孔内。虽然可在非吸附级分中回收靶分子，但可浸出物和/或可提取物吸附到活性炭上，从而减少包含靶分子的液体中可浸出物和/或可提取物的量。
要用于本发明的方法的活性炭的量取决于可能存在的可浸出物和/或可提取物的量和/或来源。对于0,005g可浸出物和/或可提取物，一般至少1g活性炭适合。一般1g活性炭可用于0,0001至0,005g可浸出物和/或可提取物，优选用于0,0005至0,0015g可浸出物和/或可提取物。已发现，对于甲苯、丙酮、双酚，从包含靶分子的溶液去除所需的活性炭的量低于有效去除醛所需的量。优选至少1g活性炭或最优选约1g活性炭用于约0,001g例如甲苯、丙酮、双酚的可浸出物和/或可提取物和约0,0005g例如乙醛的可浸出物和/或可提取物。
已发现，从有机聚合物得到的活性炭尤其适用于去除可浸出物和/或可提取物。可用此类型材料最有效减少可浸出物和/或可提取物。
还发现，具有4和50µm之间相对小粒径的活性炭尤其适用于本发明的方法。
本发明的方法首次提供从靶分子去除可浸出物和/或可提取物的容易有效的方式。活性炭是在本领域已知的材料，该材料可容易包括在纯化过程，而没有将新污染物加到靶分子的风险。
本发明的方法适合从靶分子去除至少50%可浸出物和/或可提取物，优选至少75%，最优选至少90%。已发现，本发明的方法尤其适合从靶分子去除可浸出物和/或可提取物，例如酮、醇、芳烃(如甲苯)和苄醇。预期用适合装置规模去除90%以上指定的可浸出物和/或可提取物。
以上和以下引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容通过引用结合到本文中，尤其2014年11月6日提交的相应欧洲专利申请EP 14003737.5。
实施例
用活性炭材料静态结合可浸出物和/或可提取物
对于以下试验，将市售材料(例如，活性炭100772, Blücher GmbH, Erkrath, Germany(“BL772”)；活性炭100562, Blücher GmbH, Erkrath, Germany (“BL562”)；活性炭，购自Adsorba® 150C hemoperfusion cartridge, Gambro Dialysatoren GmbH, Hechingen,Germany (“Gambro”)；LiChrolut® EN(40-120µm), Merck KGaA, Darmstadt, Germany(“Lichrolut”)；Polyspher PST 10, Merck KGaA, Darmstadt, Germany(“DVB颗粒”))在真空烘箱中在40℃干燥24h，然后将1克经干燥材料称入玻璃烧瓶。然后将具有经溶解试验分子0,1g/L的15ml水加到玻璃烧瓶。然后玻璃烧瓶经摇动器15分钟。摇动后，使玻璃烧瓶在4000转/min离心15分钟。然后过滤溶液，并经过顶空GC-MS。所给值为来自3个测定的平均值(图1-2)。
在检出限下，活性炭材料(“BL 562”和“BL 772”)可吸附4种所选参比材料中的3种。
在检出限下，活性炭材料(“BL 562”和“BL 772”)可吸附3种所选参比材料中的2种，并降低乙醛量至约1/3。
另外，用乙酸乙酯增加水平(1g/L)评价排除检测误差的活性炭的吸附容量(图1)。试验安排与上述相同，但乙酸乙酯浓度增加到1g/L，并使用2种活性炭材料(“Bl 772”和“Gambro”)(图3)。
得到的结果证明，可成功地用“BL 772”从模型溶液吸附乙酸乙酯。
活性炭和Millistak+CR40滤器用于一次使用生物处理组合件(Mobius Virus Clearance Assembly病毒清除组合件)的应用
对于以下实施例，用纯水试验一次使用组合件：
将10L溶液袋的Mobius ® Disposable Assembly可弃式组合件(γ照射(min 25-40kGy; MS0010L30EP, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA))用Lynx ST连接件(STC21THN01, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)连接到管(Pharma 50, 7486040801PU-6, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)，随后以母鲁尔接头(female lure) (5621000821, EMD Millipore Corporation,Billerica, MA, USA)连接到10L溶液袋的Mobius ® Disposable Assembly可弃式组合件(γ照射(min 25-40kGy; MS0010L30EP, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA,USA))；
将组合件安装在Mobius ® Virus Clearance病毒清除单元(EMD MilliporeCorporation, Billerica, MA, USA)，并用单元的蠕动泵使10L纯水以1,5L/h流速流动通过。将经处理水在室温收集在Mobius ® Disposable Assembly可弃式组合件10L溶液袋。
然后使含10L水的袋连接到经平衡Superformance®玻璃柱(10*150mm, GötecLabortechnik, Bickenbach, Germany)，玻璃柱填充有活性炭(100772, Blücher GmbH,Erkrath)，并用蠕动泵在4ml/min操作。将流通水收集在单独的玻璃容器中，并经受使用电喷射离子化(ESI+)方法的FIA-MS(流动注射质谱，在200µl/min，Bruker Esquire 3000+,Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)。结果在图4中给出。
通过填充有活性炭的玻璃柱过滤一次使用组合件处理水使可提取物/可浸出物的水平降低(根据FIA-MS-ESI+方法)到<ppm范围，显示很尖锐的穿透特性。
另外，使含10L经处理水的袋连接到包含活性炭并用蠕动泵在4ml/min操作的uPODTM format CR40 23 cm²中的经平衡Millistak+®介质(EMD Millipore Corporation,Billerica, MA, USA)。将流通水收集在单独的玻璃容器中，并经受使用电喷射离子化(ESI+, ESI-)和大气压化学离子化(APCI-, APCI+)方法的FIA-MS(流动注射质谱，在200µl/min，Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)。结果在图5-图8中给出。
通过Millistak+® CR40滤器过滤一次使用组合件处理水使可提取物/可浸出物的水平降低(根据FIA-MS-ESI+;ESI-方法)到1/10强度。
通过Millistak+® CR40滤器过滤一次使用组合件处理水使可提取物/可浸出物的水平降低(根据FIA-MS-APCI-,APCI+方法)，相当于MilliQ水品质。
因此，在一次使用组合件使用后用Millistak+® CR4装置去除可提取物/可浸出物几乎完全去除可提取物/可浸出物。
活性炭和Clarisolve滤器用于一次使用生物处理组合件(Mobius ® Chromatography Assembly色谱组合件)的应用
对于以下实施例，用纯水试验一次使用组合件：
将20L溶液袋的Mobius ® Disposable Assembly可弃式组合件(γ照射(min 25-40kGy; TF20020LGE1, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA))用Lynx ST连接件(STC21THN01, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)连接到管(Pharma 50, 7486040801PU-6, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)，随后将具有带有SHC膜的Optical XL 600滤器(EMD Millipore Corporation, Billerica,MA, USA)的Smart Flexware® Assembly for Chromatography色谱组合件(EMDMillipore Corporation, Billerica, MA, USA)用母鲁尔接头(5621000821, EMDMillipore Corporation, Billerica, MA, USA)连接到20L溶液袋的Mobius ®Disposable Assembly可弃式组合件(γ照射(min 25-40kGy; TF20020LGE1, EMDMillipore Corporation, Billerica, MA, USA))；
将组合件安装在Mobius ® Chromatography色谱单元(EMD Millipore Corporation,Billerica, MA, USA)，并用单元的蠕动泵使20L纯水以2L/h流速流动通过。将经处理水在室温收集在Mobius ® Disposable Assembly可弃式组合件20L溶液袋。然后使含20L水的袋连接到经平衡Superformance®玻璃柱(10*150mm, Götec Labortechnik, Bickenbach,Germany)，玻璃柱填充有活性炭(100772, Blücher GmbH, Erkrath)，并用蠕动泵在4ml/min操作。将流通水收集在单独的玻璃容器中，并经受使用电喷射离子化(ESI+)方法的FIA-MS(流动注射质谱，在200µl/min，Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation,Billerica, MA, USA)。结果在图9中给出。
通过填充有活性炭的玻璃柱过滤一次使用组合件处理水使可提取物/可浸出物的水平降低(根据FIA-MS-ESI+方法)到<ppm范围，显示没有穿透特性。
然后，使含20L水的袋连接到包含活性炭并用蠕动泵在4ml/min操作的uPODTMformat CR40 23 cm²中的经平衡Millistak+®介质(EMD Millipore Corporation,Billerica, MA, USA)。将流通水收集在单独的玻璃容器中，并经受使用电喷射离子化(ESI+, ESI-)和大气压化学离子化(APCI-, APCI+)方法的FIA-MS(流动注射质谱，在200µl/min，Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)。结果在图10-图13中给出。
通过Millistak+® CR40滤器过滤一次使用组合件处理水使可提取物/可浸出物的水平降低(根据FIA-MS-ESI+;ESI-方法)到1/10强度。
通过Millistak+® CR40滤器过滤一次使用组合件处理水使可提取物/可浸出物的水平降低(根据FIA-MS-APCI-,APCI+方法)，相当于MilliQ水品质。
因此，在一次使用组合件使用后用Millistak+® CR4装置去除可提取物/可浸出物几乎完全去除可提取物/可浸出物。

Claims (13)

1.一种纯化靶分子的方法，其中通过使包含靶分子的液体与活性炭接触使靶分子与可浸出物和/或可提取物分离。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述靶分子为具有10000或更大分子量的蛋白。
3.权利要求1和2的方法，其特征在于所述靶分子为糖蛋白。
4.权利要求1至3中一项或多项的方法，其特征在于所述靶分子为抗体。
5.权利要求1至4中一项或多项的方法，其特征在于所述可浸出物和/或可提取物为一种或多种以下组分：乙醛、甲苯、2-己酮、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯、双酚A、苄醇、三甲基硅烷醇、甲醛、苯二甲酸双(2-乙基己基)酯、乙酸1-甲基乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2-辛酮、2-戊酮、3,3-二甲基-2-丁酮、3-乙氧基丙烷、3-己酮、3-甲氧基-1-丁醇、丁醛、环己酮、乙醇、甲酸、七乙二醇、己醛、甲基·异丁基酮、戊醛、叔丁醇、四氢呋喃、甲酸甲酯。
6.权利要求1至5中一项或多项的方法，其特征在于靶分子与活性炭的接触在3至9之间的pH进行。
7.权利要求1至6中一项或多项的方法，其特征在于所述活性炭为通过有机聚合材料热解得到的活性炭。
8.权利要求1至7中一项或多项的方法，其特征在于所述活性炭具有5和40µm之间的中值粒径。
9.权利要求1至8中一项或多项的方法，其特征在于通过经一个或多个包含活性炭的滤器过滤使靶分子与可浸出物和/或可提取物分离。
10. 权利要求1至9中一项或多项的方法，其特征在于所述方法用于制备和/或纯化过程，包括一个或多个以下步骤：
- 在生物反应器中细胞培养
- 澄清
- 色谱纯化
- 过滤。
11.权利要求1至10中一项或多项的方法，其特征在于在一个过程步骤后使所述靶分子与所述活性炭接触，在所述过程步骤中可弃式设备与高于25℃温度和/或可弃式设备的机械变形组合使用，和/或在所述过程步骤中靶分子在可弃式设备中的停留时间大于1小时。
12.活性炭用于从液体去除可浸出物和/或可提取物的用途。
13.权利要求12的用途，其特征在于所述液体与所述活性炭在过滤装置中接触。
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