KR102398719B1 - 침출물 및/또는 추출물 제거용 활성탄 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합체 및/또는 생체치료용 단백질과 같은 표적 분자의 정제에 관한 것이다. 활성탄은 방법에서 사용되는 일회용 기구로부터 생성되는 침출물 및/또는 추출물을 제거하는데 사용될 수 있다.

Description

침출물 및/또는 추출물 제거용 활성탄 {ACTIVATED CARBON FOR THE REMOVAL OF LEACHABLES AND/OR EXTRACTABLES}
본 발명은 예를 들어 세포 발현 시스템으로부터 생성되는 재조합체 및/또는 생체치료용 단백질과 같은 표적 분자의 정제에 관한 것이다. 활성탄은 방법에서 사용되는 일회용 기구로부터 생성되는 침출물 및/또는 추출물을 제거하는데 사용될 수 있다.
생체분자, 예를 들어, 항체, 펩티드 또는 호르몬을 포함하는 치료용 단백질의 효율적이고 경제적인 대규모 제조는 생명공학 및 제약 산업에 점점 더 중요한 고려사항이다. 일반적으로, 정제 방법은 매우 정교하고 고가이며 많은 여러 단계들을 포함한다.
전형적으로, 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여, 예를 들어 목적 단백질을 생산하도록 재조합으로 조작된 포유류 또는 박테리아 세포주를 사용하여 생산된다. 일반적으로, 표적 단백질의 발현 후, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 배지 성분 및 핵산과 같은 하나 이상의 불순물로부터의 표적 단백질의 분리는 엄청난 도전을 제기한다. 이러한 분리 및 정제는 치료용 단백질이 사람에 사용하기 위한 것인 경우 특히 중요하며 미국식품의약국 (FDA) 과 같은 규제 기관의 승인을 받아야 한다.
오늘날 단백질의 정제에 사용되는 통상적인 방법은 종종 적어도 하기 단계를 포함한다: (a) 예를 들어, 분별 원심분리 및/또는 여과를 사용하는 세포 및 세포 잔해 제거를 위한 정화 단계; 및 (b) 정화된 세포 배양 공급물 중의 각종 불순물로부터 목적 단백질을 분리하기 위한 하나 이상의 다운스트림 크로마토그래피 단계.
결과적으로, 생체분자의 제조 및 정제는 여러 유형의 정제 배지 및 또한 여러 유형의 기구를 포함하는 다단계 절차이다.
유연하고, 안전하며, 감소된 자본 및 운영 비용 제조를 위해 일회용(single use) 및/또는 일회용(disposable) 플라스틱 물질을 사용하는 바이오제약 산업에서의 신흥 트렌드가 존재한다. 일회용 바이오프로세싱 기구는 용액 용기, 이송 튜빙에서 각종 장치에 이르는 광범위한 범위 및 스케일에서 이용가능하다. 이러한 기구 성분은 제조 방법 동안 생성물과 직접 접촉한다. 플라스틱 물질으로부터의 침출물 및/또는 추출물이 최종 생성물에 들어갈 수 있다는 것이 밝혀졌다 (W. Ding, Chemie Ingenieur Technik 2013, 85, No 1-2, 186-196). 침출물/추출물의 수준이 보통 업계 지침 (Q3C) 에서 제시되는 수준보다 낮지만, 낮은 수준의 침출물/추출물도 잠재적으로 약물 제품 안전성에 영향을 미치고 성능에 양향을 미쳐 제품 안전성 및 품질 문제를 야기할 수 있다는 우려가 존재한다.
결과적으로, 일회용 기구를 사용하는 동안 약물 안전성 및 품질을 보장하기 위해 바이오공정에서 목적 생체분자로부터 침출물/추출물을 제거할 필요가 있다.
발명의 간단한 설명
일회용 기구의 사용으로부터 생성되는 표적 분자 제제 중 침출물/추출물의 양이 활성탄 장치를 통한 여과에 의해 제거되거나 감소될 수 있음이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 제조 및/또는 정제 방법이 일회용 기구의 사용을 수반하는 표적 분자의 정제 방법에 관한 것으로서, 이에 의해 표적 분자가 활성탄을 사용하여 침출물 및/또는 추출물로부터 분리된다. 전형적으로, 정제는 활성탄을 표적 분자 및 잠재적으로 침출물 및/또는 추출물을 포함하는 액체와 접촉시킴으로써 수행되며, 이에 의해 침출물 및/또는 추출물은 활성탄과 접촉시 유지되거나 활성탄 상에 결합되고, 표적 분자를 포함하는 액체는 결합되지 않으며 이후 예를 들어 여과에 의해 활성탄으로부터 분리된다.
한 구현예에서 표적 분자는 10000 이상의 분자량을 갖는 단백질이다.
한 구현예에서 표적 분자는 당단백질이다.
한 구현예에서 표적 분자는 항체이다.
바람직한 구현예에서 침출물 및/또는 추출물은 하기 성분 중 하나 이상이다: 아세트알데하이드, 톨루엔, 2-헥산온, 아세톤, 2-부탄온, 에틸 아세테이트, 비스페놀 A, 벤질 알콜, 트리메틸 실라놀, 포름알데하이드, 비스 (2-에틸헥실) 프탈레이트, 1-메틸에틸 에스테르 아세트산, 2,4-디-t-부틸 페놀, 2-옥타논, 2-펜타논, 3,3-디메틸-2-부탄온, 3-에톡시-프로판, 3-헥산온, 3-메톡시-1-부탄올, 부탄알, 시클로헥산온, 에탄올, 포름산, 헵타에틸렌 글리콜, 헥산알, 메틸 이소부틸 케톤, 펜탄알, t-부탄올, 테트라하이드로푸란, 메틸 포르메이트.
바람직한 구현예에서, 방법은 3 내지 9 의 pH 에서 수행된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 활성탄은 유기 중합체성 물질, 바람직하게는 폴리스티렌의 열분해에 의해 수득되는 활성탄이다.
바람직한 구현예에서, 활성탄은 5 내지 40 μm 의 중간 입자 크기를 갖는다.
한 구현예에서, 표적 분자는 활성탄을 포함하는 하나 이상의 필터를 통한 여과에 의해 침출물 및/또는 추출물로부터 분리된다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 제조 및/또는 정제 방법에서 사용된다:
- 바이오리액터에서의 세포 배양
- 정화
- 정제
- 여과
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에서, 표적 분자는 일회용 기구가 25℃ 초과의 온도 및/또는 일회용 기구의 기계적 변형과 조합으로 사용되고/거나 일회용 기구에서의 표적 분자의 체류 시간이 1 시간 초과인 방법 단계 후에 활성탄과 접촉된다.
본 발명은 또한 액체로부터 침출물 및/또는 추출물을 제거하기 위한 활성탄의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 액체는 여과 장치에서 활성탄과 접촉되며, 이에 의해 액체는 활성탄을 포함하는 여과 장치를 통해 유동하여 침출물 및/또는 추출물은 활성탄에 결합되는 반면 액체뿐 아니라 액체에 포함된 표적 분자는 활성탄에 결합되지 않는다.
도면 1 은 선택된 물질에 대한 독성 및 보다 낮은 독성인 레퍼런스의 흡착을 나타낸다.
도면 2 는 각종 물질에 대한 선택된 레퍼런스의 흡착을 나타낸다.
도면 3 은 선택된 활성탄 물질에 대한 에틸아세테이트의 흡착을 나타낸다.
도면 4 는 일회용 어셈블리 후 및 활성탄이 패킹된 유리 칼럼에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 5 는 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 6 은 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 전자분무 이온화 (ESI-) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 7 은 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 대기압 화학적 이온화 (APCI-) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 8 은 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 대기압 화학적 이온화 (APCI-) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 9 는 일회용 어셈블리 후 및 활성탄이 패킹된 유리 칼럼에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 10 은 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 11 은 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 12 는 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 대기압 화학적 이온화 (APCI-) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면 13 은 일회용 어셈블리 후 및 Millistak+® 필터에 처리된 물을 로딩한 후 추출물/침출물 검출에 대해 대기압 화학적 이온화 (APCI-) 방법을 사용한 질량 분석 결과를 나타낸다.
도면에 관한 더 상세한 내용은 실시예에서 찾을 수 있다.
정의
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이 특정 조성물 또는 방법 단계에 한정되지 않으며, 그 자체가 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "리간드" 로 언급하는 것은 복수의 리간드를 포함하고, "항체" 로 언급하는 것은 복수의 항체 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련되어 있는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 분자" 는 샘플의 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물로부터 단리, 분리 또는 정제되어야 하는 임의의 분자, 물질 또는 화합물을 지칭한다. 표적 분자의 예는 항체, 단편 항원 결합부 (Fab), 단편 불변부 (Fc), 단백질, 펩티드, 재조합 단백질, 기타 천연 화합물, 기타 바이오제약 화합물, 백신 또는 바이오제약 화합물의 군이다. 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 생체분자, 바람직하게는 단백질이다. 매우 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체이다. 제조 및/또는 정제 방법에서, 표적 분자는 전형적으로 액체 중에 존재한다. 액체는 물, 완충액, 비수성 용매, 예컨대 에탄올 또는 그 임의의 혼합물일 수 있다. 표적 분자 이외에, 상기 액체는 하나 이상의 불순물을 포함할 수 있다. 액체의 조성은 수행되는 방법 단계에 따라 제조 및/또는 정제 동안 변화될 수 있다. 크로마토그래피 단계 후에, 크로마토그래피 단계에 사용되는 용리액으로 인해, 액체는 전형적으로 이전과는 다른 용매를 포함한다. 전형적으로, 가장 마지막 정제 단계 후에만, 표적 분자가 최종 투여 형태의 제조를 위해 건조될 수 있다.
용어 "항체" 는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 기본 4-폴리펩티드 사슬 구조를 가지며, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 디술파이드 결합에 의해 안정화된다. 항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있고, 단량체성 또는 중합체성 형태로 존재할 수 있는데, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재하고/하거나 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. 항체는 유지된다면 항체 단편들 및 다특이적 항체 (예, 이중특이적 항체) 를 또한 포함할 수 있거나, 또는 개질되어 리간드-특이적 결합 도메인을 포함한다. 용어 "단편" 은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부를 지칭한다. 단편은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 방식에 의해 수득될 수 있다. 재조합으로 생산되는 경우, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질로 불리는 거대 단백질의 부분으로서 발현될 수 있다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라, 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 포함 단백질, 예를 들어 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, Fc 영역 포함 단백질은 또 다른 폴리펩티드 또는 그 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드는, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나아제 또는 인간뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화시 조절 정상적 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안(Muellerian)-저해 물질; 렐락신 α-사슬; 렐락신 β-사슬; 프로렐락신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA) (예, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β.; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및 βFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 골전도성 인자; 항체독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-I 내지 IL-IO; 초산화물 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부식 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 항체는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 그 단편 또는 변이체이며, 이는 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같고 달리 언급되지 않는 한, 용어 "샘플" 은 표적 분자를 포함하는 임의의 조성물 또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은 생물학적 또는 기타 공급원 유래일 수 있다. 생물학적 공급원은 진핵 및 원핵 공급원, 예컨대 식물 및 동물 세포, 조직 및 기관을 포함한다. 바람직한 샘플은 세포 배양 유체, 예컨대 포유류 세포 배양물, 예를 들어 CHO, NS-0, SP2/0, BioWa, 박테리아 세포 배양물, 예를 들어 대장균, B. 서브틸리스(subtilis), 효모 세포 배양물, 또는 사상균류이다. 샘플은 또한 표적 분자와 함께 혼합되어 발견되는 희석제, 완충액, 세제, 및 오염 종, 잔해 등을 포함할 수 있다. 샘플은 "부분 정제" 될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 정제 단계, 예컨대 여과 단계에 적용됨), 표적 분자를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다 (예를 들어, 샘플은 하베스트된 세포 배양 유체를 포함할 수 있음).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물" 은 생물학적 매크로분자, 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 핵산, 내독소, 지질, 합성 기원의 불순물, 및 외래 또는 부적당한 분자 중 하나 이상으로부터 분리된 표적 분자를 포함하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제를 포함하여, 임의의 외래 또는 부적당한 분자를 지칭한다. 추가로, 이러한 불순물은 제조 및/또는 정제 방법의 단계에 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다. 침출물 및/또는 추출물은 또한 불순물이다.
본원에서 상호교환되어 사용되는 바와 같은 용어 "정제", "분리" 또는 "단리" 는 표적 분자 및 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 분리에 의해 표적 분자의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
용어 "크로마토그래피" 는 혼합물에 존재하는 기타 분자로부터 관심있는 분석물 (예, 표적 분자) 을 분리시키는 임의 종류의 기법을 지칭한다. 통상적으로, 표적 분자는 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 고정 배지를 통해 이동하는 속도, 또는 결합 및 용리 과정의 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 크로마토그래피 분리 방법을 위한 예는 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피이다.
"완충액" 은 그 산-염기 콘주게이트 성분의 작용에 의한 pH 의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 목적하는 pH 에 따라 사용될 수 있는 각종 완충액이 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)] 에 기재되어 있다. 완충액의 비제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충액, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
"일회용(disposable) 기구" 또는 "일회용(single-use) 기구" 는 제한된 수의 사용으로 설계된 제품 (사용 후 재활용되거나 고체 폐기물로서 폐기됨) 또는, 바람직하게는, 일회용으로 설계된 제품 (예를 들어 바이오리액터로부터 생성되는 원료 물질의 하나의 배치의 정제에 사용) 이다. 용어는 종종 중장기 내구성 보다는 저렴함 및 단기 편의성을 의미한다. 용어는 무기한으로 지속되는 유사 제품 (예를 들어 세척가능 필터) 과 구별하기 위해 수 주 또는 개월 동안 지속될 수 있는 제품 (예를 들어 일회용 필터) 에 사용되기도 한다. 바람직하게는, "일회용 기구" 는 오직 1 회 사용되는 기구이며, 사용 지속 기간은 그것이 사용되는 방법, 예를 들어 여과 방법, 바이오리액터 방법 등의 지속 기간으로 정의된다.
일회용 기구는 플라스틱 물질, 예컨대 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리메틸펜텐, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리비닐, 예컨대 폴리비닐클로라이드, 폴리술폰, 예컨대 폴리에테르술폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 셀룰로스아세테이트, 에틸비닐아세테이트 또는 폴리프로필렌으로 제조된다. 일회용 기구는 표적 분자의 제조 및 정제에 필요한 임의의 기구, 예를 들어 바이오리액터, 풀 탱크, 서지 탱크, 서지 백, 임의 유형의 튜빙, 밸브, 칼럼, 필터, 카트리지 또는 커넥터일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "바이오리액터" 는 생물학적 활성 환경을 지지하는 제조된 또는 조작된 장치 또는 시스템을 지칭한다. 일부 예에서, 바이오리액터는 유기체 또는 이러한 유기체로부터 유도된 생화학적 활성 물질을 포함하는 세포 배양 공정이 실시되는 용기이다. 이러한 공정은 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 통상적으로 사용되는 바이오리액터는 전형적으로 크기가 리터에서부터 입방미터에 이르는 원통형이며, 흔히 스테인레스강으로 제조된다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 바이오리액터는 스틸 이외의 물질로 제조된 일회용 성분을 포함할 수 있으며 일회용이다. 일부 구현예에서, 이는 생물학적 활성 환경이 유지되는 일회용 백이다. 바이오리액터의 전체 부피는 특정 방법에 따라 100 mL 내지 10,000 리터 이하 또는 그 초과 범위의 임의의 부피일 수 있다. 일회용 또는 일회용 바이오리액터는 재사용 가능한 바이오리액터에 대한 대안을 제공하며, 폐기되기 전에 바람직하게는 1 회의 생물학적 또는 생명공학적 방법을 수행하는 데 사용된다. 각각의 방법에 대해 새로운 일회용 바이오리액터, 및 바람직하게는 제조 방법 동안 멸균되는 일회용 바이오리액터를 제공함으로써, (교차-) 오염의 위험을 줄이는 동시에, 이전에 사용한 바이오리액터의 완벽한 세척 및 멸균을 수행하고 기록해야 할 필요성을 제거한다. 일회용 바이오리액터는 종종 가요성 용기, 예를 들어 백, 또는 적어도 그 단면이 가요성인 벽을 갖는 용기로 설계된다. 이러한 바이오리액터의 예는 US 2011/0003374 A1, US2011/0058447A1, DE 20 2007 005 868U1, US 2011/0058448A1, US2011/0207218A1, WO 2008/088379A2, US 2012/0003733 A1, WO2011/079180 A1, US2007/0253288A1, US 2009/0275121 A1 및 US 2010/0028990A1 에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "풀 탱크" 는 임의의 용기, 통, 저장소, 탱크 또는 백을 지칭하며, 이는 일반적으로 방법 단계들 사이에서 사용되며 방법 단계로부터 산출물의 전체 부피를 수집할 수 있는 크기/부피를 갖는다. 풀 탱크는 방법 단계로부터 산출물의 전체 부피의 용액 상태를 유지하거나 또는 저장하거나 또는 조작하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 분자의 제조 및 정제를 위한 방법 및 시스템은 방법 동안 하나 이상의 풀 탱크 또는 서지 탱크를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "서지 탱크" 는 방법 단계 사이에 또는 방법 단계 내에 (예를 들어, 단일 방법 단계가 하나 초과의 단계를 포함할 때) 사용되는 임의의 용기 또는 통 또는 백을 지칭한다; 여기서 하나의 단계로부터의 산출물이 서지 탱크를 통해 다음 단계로 유동한다. 따라서, 서지 탱크는 단계로부터의 산출물의 전체 부피를 유지하거나 또는 수집하기 위한 것이 아니라는 점에서 풀 탱크와 상이하다; 그러나 대신 하나의 단계로부터 산출물이 다음으로 연속적으로 유동할 수 있게 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정화하다," "정화," 및 "정화 단계" 는 현탁된 입자 및 또는 콜로이드를 제거하여, NTU (비탁분석 탁도 단위) 에서 측정된 바와 같이, 표적 분자 함유 용액의 탁도를 감소시키기 위한 방법 단계를 지칭한다. 정화는 원심분리 또는 여과를 포함하는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 원심분리는 배치 또는 연속 모드로 수행될 수 있는 반면, 여과는 정상 흐름 (예를 들어, 심층 여과) 또는 접선 흐름 모드로 수행될 수 있을 것이다. 오늘날 업계에서 사용되는 공정에서, 원심분리는 전형적으로 원심분리에 의해 제거되지 않을 수 있는 불용성 불순물을 제거하기 위해 의도되는 심층 필터가 후속된다. 게다가, 정화 효율의 향상 방법은 예를 들어 침전이 사용될 수 있다. 불순물의 침전은 응집, pH 조정 (산 침전), 온도 이동, 자극-반응성 중합체 또는 소형 분자로 인한 상 변화, 또는 이들 방법의 임의의 조합과 같은 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 정화에는 원심분리, 여과, 심층 여과 및 침전 중 2 가지 이상의 임의의 조합이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "심층 필터" 또는 "심층 여과" 는 단지 필터 표면 상 보다는, 필터 매질을 통해 입자 물질을 보유할 수 있는 필터를 말한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 하나 이상의 심층 필터가 정화 방법 단계에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "침출물 및/또는 추출물" 은 제조 및/또는 정제 방법 동안 및 그 후에 표적 분자 제제 또는 표적 분자를 포함하는 액체에서 발견될 수 있는 불순물을 의미하며, 상기 불순물은 제조 및 정제 방법에서 사용되는 기구, 특히 일회용 기구에서 기인한다. 추출물은 특정 조건의 시간, 온도 및 기계력 하에 적절한 용매에 노출되었을 때 표적 분자와 직접 접촉하는 임의의 물질에서 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 액체로 이동하는 화학적 화합물이다. 추출물을 방출할 수 있는 물질은 엘라스토머, 플라스틱 또는 코팅 성분을 포함한다.
침출물은 통상적인 방법 조건 또는 가속된 저장 조건 하에 표적 분자 제제 또는 표적 분자를 포함하는 액체와의 직접 접촉의 결과로서, 임의의 표적 분자-접촉 물질 (엘라스토머, 플라스틱 또는 코팅 성분 포함) 로부터 표적 분자 제제로 이동하는 화학적 화합물로서, 전형적으로 추출물의 부분집합이며, 표적 분자를 포함하는 액체에서 발견되며, 제거되지 않으면 최종 표적 분자 생성물에서도 발견된다.
전형적으로, 추출물 시험은 모델 용매를 사용하여 수행되는 반면, 침출물 연구는 실제 표적 분자 또는 방법 유체를 사용한다.
전형적으로, 추출물은 과장된 또는 공격적인 조건 하에 수득되지만, 침출물 시험 통상적인 방법 조건을 사용한다.
결과적으로, 전형적으로, 침출물은 추출물의 부분집합으로 표시된다. 일부 경우에, 방법 유체 또는 표적 분자와 방법 기구의 상호 작용으로 인해, 일부 침출물 화합물은 추출물의 일부가 아니다.
추출물 및 침출물에 관한 세부 사항은 [BPSA Extractables and Leachables, BioProcess Int. 2007, 5 (11), 36] 에서 찾을 수 있다.
침출물 및/또는 추출물의 예는 아세트알데하이드, 톨루엔, 2-헥산온, 아세톤, 2-부탄온, 에틸 아세테이트, 비스페놀 A, 벤질 알콜, 트리메틸 실라놀, 포름알데하이드, 비스 (2-에틸헥실) 프탈레이트, 1-메틸에틸 에스테르 아세트산, 2,4-디-t-부틸 페놀, 2-옥타논, 2-펜타논, 3,3-디메틸-2-부탄온, 3-에톡시-프로판, 3-헥산온, 3-메톡시-1-부탄올, 부탄알, 시클로헥산온, 에탄올, 포름산, 헵타에틸렌 글리콜, 헥산알, 메틸 이소부틸 케톤, 펜탄알, t-부탄올, 테트라하이드로푸란, 메틸 포르메이트이다.
최첨단 바이오제약 제조 방법은 전형적으로 유전자 조작 세포를 사용하여 바이오리액터에서 목적 타겟을 발현하고, 이를 정제하기 위한 수많은 단위 작업을 수행한다. 단일클론 항체와 같은 일부 바이오제약 분자의 경우, 원심분리, 심층 여과, 크로마토그래피 정제, 바이러스 비활성화, 크로마토그래피 폴리싱, 바이러스 여과 및 벌크 약물 물질을 수득하기 위한 한외여과/투석여과 (ultrafiltration/diafiltration) 단계로 이루어진 플랫폼 방법이 사용된다. 바이오제약 분자 정제 방법은 잠재적으로 오염되고 유해한 작용제, 예컨대 박테리아, 바이러스, 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA, 표적 분자 스캐폴드 또는 군, 정제 방법 침출물 및 추출물을 제거하기 위해 확립되었다 (Shukla, A.A., Gottschalk U, Trends in Biotechnology, March 2013, Vol. 31, No. 3, 147-154).
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 요지는 활성탄, 특히 유기 중합체성 물질의 열분해에 의해 수득되는 활성탄이 일회용 기구의 사용으로 인한 침출물 및/또는 추출물을 제거하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하는 것이다. WO201404281 및 US 2014/046038 로부터 일반적으로 활성탄이 바이오제약 제조 방법에서 불순물을 제거하기 위해 사용될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 그러나, 활성탄이 일회용 기구의 사용으로부터 생성되는 침출물 및/또는 추출물을 제거하는데 특히 적합하다는 것은 아직 발견되지 않았다.
활성탄은 광범위한 비특이적 흡착 특성을 갖는 물질이며, 화학약품 및 식품의 제조, 하수 또는 폐수 처리, 물 여과, 및 저분자 약물의 제조와 같은, 산업 분야에서의 흡착제 또는 탈색제로서 사용된다.
본원에서 상호교환되어 사용되는 바와 같은 용어 "활성 탄소" 또는 "활성탄" 은 그 기공 구조를 향상시키는 방법에 의해 처리된 탄소질 물질을 지칭한다. 활성탄은 매우 높은 표면적을 갖는 다공성 고체이다. 이들은 석탄, 목재, 코코넛 껍질, 견과껍질, 이탄 (peat) 및 또한 유기 중합체를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 활성탄은 강한 산, 염기, 또는 산화제를 사용하여 제어된 분위기 또는 화학적 활성화 하에서 가열을 수반하는 물리적 활성화를 사용하여 이들 물질로부터 제조될 수 있다. 활성화 과정은 불순물 제거를 위한 높은 능력을 활성탄에게 제공하는 높은 표면적을 갖는 다공성 구조를 제조한다. 활성화 과정은 표면의 산도를 제어하기 위해 변형될 수 있다.
유기 중합체로부터 수득된 활성탄이 본 발명에 따른 침출물 및/또는 추출물 제거에 특히 효과적임을 발견하였다. 유기 중합체는 예를 들어 폴리스티렌, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리메틸펜텐, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리비닐 또는 폴리프로필렌과 같은, 임의의 합성의, 화학적으로 정의된 유기 중합체이다.
바람직하게는, 활성탄은 구형 활성 탄소 입자를 포함하거나, 바람직하게는 이로 이루어진다. 이는 모든 3가지 공간 차원으로 본질적으로 유사한 확장을 가짐을 의미한다. 구형 이외에, 입방체, 평행육면체 또는 원통형을 생각할 수 있는데, 단, 2가지 상이한 공간 차원으로의 확장이 3 배 이상, 바람직하게는 2 배 미만으로 다르지 않다.
유기 중합체로부터 수득된 활성탄은 구형 유기 물질, 예를 들어 폴리스티렌의 열분해에 의해 제조될 수 있다. 그러나, [Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 4, 2009, pages 1063 to 1073] 에 기재된 바와 같이, 글루코스 용액을 열분해 하는 것도 가능하다. 구형 활성탄의 제조는 US 20060148645 및 US 2008171648 에 더 개시되어 있다.
이러한 활성 탄소 중합체 입자를 제조하는 예시적인 방법은 중합체 볼, 특히 이온 교환기 볼, 중합체 구조 (분리가능한 작용기, 특히 술포닐기 및/또는 카르복실기를 함유함) 를 추출물(educt)로서 사용하는 것이다. 다공성 중합체 볼은 열분해되고, 임의로 열분해된 중합체 볼은 활성화 단계에 적용된다. 작용기의 분리는 바람직하게는 5% 내지 15% 의 잔류 함량 (사용되는 작용기의 중량 분율 기준) 까지 일어난다. 이 제 1 열 처리의 온도는 적합하게는 10 분 내지 60 분 동안 200 ℃ 내지 350 ℃ 의 범위이다. 분위기는 원칙적으로 임의적이다. 다음의 열분해 단계는 본질적으로 제 1 열 처리의 최종 온도에 상응하는 온도에서 시작하며, 바람직하게는 600 ℃ 내지 800 ℃ 에서 끝난다. 가열 속도는 적합하게는 5 K/min 내지 0.5 K/min 의 범위이며, 이로부터 열분해 단계의 지속 기간을 즉시 계산할 수 있다. 활성화 단계는 중요하지 않으며 통상적인 방식으로 발생한다.
적합한 구형 활성탄은 또한 SARATECH (TM) 100562, SARATECH (TM) 100772 및 SARATECH (TM) 101373 (Blucher GmbH, Erkrath, Germany) 으로 입수가능하다.
활성탄은 바람직하게는 10 내지 10 000 ㎡/g, 더 바람직하게는 100 내지 5000 ㎡/g, 가장 바람직하게는 1000 내지 2000 ㎡/g 의 표면적을 갖는다.
활성탄의 평균 입자 크기는 바람직하게는 적어도 2 μm, 더 바람직하게는 2 내지 550 μm, 매우 특히 5 내지 40 μm 이다.
입자의 특성은 당업계에 공지되어 있으며 바람직하게는 체질(sieving)에 의해 제조된다. 이는 [I. C. Edmundson, Particle-size analysis, H. S. Bean, A. H. Beckett and J. E. Carles (eds) in: Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2, Academic Press, London 1967, 95-174] 에 의해 기재된다.
생성물 분획의 평균 입자 크기는 [EDANA recommended test method No. WSP 220.2-05 "Particle Size Distribution"] 에 의해 측정될 수 있는데, 여기서 스크린 분획의 질량 비율은 누적된 형태로 플롯(plot)되고 평균 입자 크기는 그래프 상에서 결정된다. 여기서 평균 입자 크기는 누적 50 중량% 를 생기게 하는 메쉬 크기의 값이다.
예를 들어 5 내지 40 μm 의, 특정 입자 크기 범위를 갖는 활성탄의 비율은 전체 활성탄 중 바람직하게는 적어도 90 중량%, 더 바람직하게는 적어도 95 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 98 중량% 이다.
표적 분자의 제조 및/또는 정제 방법에서 발견될 수 있는 침출물 및/또는 추출물의 유형 및 양은 여러 측면, 예컨대 방법에서 사용되는 기구뿐 아니라 방법이 수행되는 조건, 예컨대 온도, 용매, pH 에 따라 다르다. 전형적인 침출물 및/또는 추출물은 아세트알데하이드, 톨루엔, 2-헥산온, 아세톤, 2-부탄온, 에틸 아세테이트, 비스페놀 A, 벤질 알콜, 트리메틸 실라놀, 포름알데하이드, 비스 (2-에틸헥실) 프탈레이트, 1-메틸에틸 에스테르 아세트산, 2,4-디-t-부틸 페놀, 2-옥타논, 2-펜타논, 3,3-디메틸-2-부탄온, 3-에톡시-프로판, 3-헥산온, 3-메톡시-1-부탄올, 부탄알, 시클로헥산온, 에탄올, 포름산, 헵타에틸렌 글리콜, 헥산알, 메틸 이소부틸 케톤, 펜탄알, t-부탄올, 테트라하이드로푸란, 메틸 포르메이트. 특히 톨루엔, 2-헥산온, 아세톤, 2-부탄온, 에틸 아세테이트, 비스페놀 A, 벤질알콜, 트리메틸실라놀, 포름알데하이드 및 비스 (2-에틸헥실) 프탈레이트가 중요한 침출물 및/또는 추출물로 확인되었다. 톨루엔, 2-헥산온, 아세톤, 2-부탄온 및 에틸 아세테이트는 방법 품질 및 잔여 침출물 및/또는 추출물의 양을 모니터링하고 참조하기에 적합한 레퍼런스 화합물인 것으로 입증되었다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해, 표적 분자의 제조 및/또는 정제 방법의 임의의 단계에서, 전형적으로 액체 중에 존재하는 표적 분자가 활성탄과 접촉된다. 이는 물론 일회용 기구가 사용되는 방법 단계 후에 실시되어야 한다. 바이오제약 생산은 전형적으로 바이오리액터에서의 세포 배양, 정화, 크로마토그래피, 바이러스 제거, 여과 등의 여러 방법 단계를 포함한다. 각각의 이들 단계뿐 아니라 이들 단계에서 사용되는 배지 및 완충액의 제조는 일회용 기구의 사용을 수반할 수 있다. 일회용 기구는 제조 및/또는 정제 방법에서 1 회 또는 수 차례 사용될 수 있다. 활성탄의 사용은 제조 및/또는 정제 방법에서 1 회 또는 수 차례 수행될 수 있다. 이는 추가적인 방법 단계로서 수행될 수 있거나, 또는 기존 방법 단계, 예를 들어 여과 단계에 포함될 수 있다.
한 구현예에서, 전형적으로 액체 중에 존재하는 표적 분자는 일회용 기구가 하기 방법 특징 중 하나 이상과 조합으로 사용되는 방법 단계 후에 활성탄과 접촉된다:
- 승온 － 이는 생성물 용액과 일회용 기구가 접촉하는 이 방법 단계에서, 온도가 적어도 부분적으로 25℃ 초과임을 의미한다. 이는 예를 들어 세포가 전형적으로 37℃ 에서 배양되는 일회용 바이오리액터를 사용하는 경우이다.
- 긴 노출 시간 － 이는 이 방법 단계에서 생성물 용액과 일회용 기구의 접촉이 1 시간 초과임을 의미한다. 예를 들어, 세포가 전형적으로 수 일 동안 배양되는 일회용 바이오리액터의 경우 또는 크로마토그래피 분리가 1 시간 넘게 소요되어 표적 분자를 포함하는 용액이 1 시간 넘게 일회용 탱크에 저장되는 크로마토그래피 단계와 같은 방법 단계의 경우.
- 기계적 변형 － 이는 일회용 기구가 기계적으로 변형되거나 또는 기계력으로 처리됨을 의미한다 (예를 들어 호스 펌프를 사용하는 경우 또는 플라스틱 백이 함께 가압되어 그 안에 들어있는 액체가 방출되는 경우). 이러한 변형은 전형적으로 플라스틱 물질로부터 침출물 및/또는 추출물의 방출을 증가시킨다.
또 다른 구현예에서, 전형적으로 액체 중에 존재하는 표적 분자는 방법에서 2 회 이상 활성탄과 접촉된다.
활성탄과의 접촉은 표적 분자를 포함하는 액체를 활성탄과 혼합한 후, 예를 들어 침강, 원심분리 및/또는 바람직하게는 여과에 의해 활성탄으로부터 액체를 분리하는 것으로 수행될 수 있다. 활성탄과 액체의 접촉 시간은 전형적으로 5 내지 30 분 이다.
바람직한 구현예에서, 접촉은 활성탄을 통해 표적 분자를 포함하는 액체를 유동시킴으로써 수행된다. 이를 위해 활성탄은 칼럼, 카트리지, 필터 또는 임의의 다른 적합한 장치로 패킹될 수 있다. 전형적으로, 장치 내 액체의 체류 시간은 0.5 내지 5 분이다. 당업자는 액체 및 활성탄의 양뿐 아니라 적합한 체류 시간을 달성하기 위해 유속을 조정할 수 있다.
표적 분자를 포함하는 액체는 전형적으로 본 발명의 방법을 수행한 후에 방법 단계로부터 생성되는 액체이다. 이는 물, 완충액, 유기 액체 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다. 전형적으로 이는 수성 완충액이다. 액체는 전형적으로 표적 분자뿐 아니라 하나 이상의 불순물, 예컨대 침출물 및/또는 추출물을 포함한다.
활성탄에 의한 침출물 및/또는 추출물의 제거는 광범위한 추출 조건, 예컨대 전도도 및 이온 강도 하에 수행될 수 있다. 전형적으로 표적 분자를 포함하는 용액은 용액의 pH, 전도도 및 이온 강도를 변화시키지 않고 직접 활성탄에 적용될 수 있다. 표적 분자를 포함하는 액체의 pH 는 활성탄과 접촉할 때 예를 들어 pH 3 내지 9 일 수 있다. 그럼에도 불구하고 용액 중 유기 용매의 존재는 활성탄의 결합 능력에 영향을 미칠 수 있다.
활성탄에 의한 침출물 및/또는 추출물의 추출은 흡착 크기 배제를 기반으로 하며, 이는 침출물 및/또는 추출물이 활성탄의 기공에 결합되는 반면 표적 분자는 기공에 진입하기에 너무 크며 따라서 기공 내에 결합되지 않음을 의미한다. 따라서, 표적 분자는 비-흡착 분획에서 회수될 수 있으며, 침출물 및/또는 추출물은 활성탄 상에 흡착되어, 표적 분자를 포함하는 액체 중 침출물 및/또는 추출물의 양을 감소시킨다.
본 발명의 방법에 사용되는 활성탄의 양은 존재할 수 있는 침출물 및/또는 추출물의 양 및/또는 기원에 따라 다르다. 0.005 g 의 침출물 및/또는 추출물에 대해 전형적으로 적어도 1 g 의 활성탄이 적합하다. 전형적으로 1 g 의 활성탄이 0.0001 내지 0.005 g 의 침출물 및/또는 추출물, 바람직하게는 0.0005 내지 0.0015 g 의 침출물 및/또는 추출물에 대해 사용될 수 있다. 톨루엔, 아세톤, 비스페놀의 경우 표적 분자를 포함하는 용액으로부터 이들을 제거하는데 필요한 활성탄의 양은 알데하이드를 효과적으로 제거하는데 필요한 양보다 적다는 것을 발견하였다. 바람직하게는 적어도 1 g 의 활성탄 또는 더 바람직하게는 약 1 g 의 활성탄이 약 0.001g 의 침출물 및/또는 추출물, 예컨대 톨루엔, 아세톤, 비스페놀에 대해 사용되고, 약 0.0005g 의 침출물 및/또는 추출물, 예컨대 아세탈알데하이드에 대해 사용된다.
유기 중합체로부터 수득되는 활성탄이 침출물 및/또는 추출물의 제거에 특히 적합함을 발견하였다. 침출물 및/또는 추출물의 가장 효과적인 감소가 이러한 유형의 물질에 의해 달성될 수 있다.
4 내지 50 μm 의 비교적 작은 입자 크기를 갖는 활성탄이 본 발명의 방법에 특히 적합하다는 것을 추가로 발견하였다.
본 발명의 방법은 표적 분자로부터 침출물 및/또는 추출물을 제거하는 쉽고 효과적인 방법을 처음으로 제공한다. 활성탄은 표적 분자에 새로운 오염물을 첨가하는 위험을 감수하지 않고 정제 방법에 쉽게 포함될 수 있는 당업계에 공지된 물질이다.
본 발명의 방법은 표적 분자로부터 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 의 침출물 및/또는 추출물을 제거하는데 적합하다. 본 발명의 방법이 표적 분자로부터 침출물 및/또는 추출물, 예컨대 케톤, 알콜, 톨루엔 및 벤질알콜과 같은 방향족 탄화수소를 제거하는데 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 적절한 장치 스케일링(scaling)을 사용하여 90% 의 상기 명명한 침출물 및/또는 추출물을 제거할 것으로 예상된다.
상기 및 하기 인용된 모든 출원, 특허, 및 출판물, 특히 대웅 유럽 특허 출원 EP 14003737.5 (2014년 11월 6일 출원) 의 전체 개시는 본원에 참조로 인용된다.
실시예
활성탄 물질을 사용한 침출물 및/또는 추출물의 정적 결합
하기 실험을 위해 시판 물질 (예를 들어, Activated Carbon 100772, Bluher GmbH, Erkrath, Germany ("BL772"); Activated Carbon 100562, Blucher GmbH, Erkrath, Germany ("BL562"); Adsorba® 150C 혈액관류(hemoperfusion) 카트리지의 Activated Carbon, Gambro Dialysatoren GmbH, Hechingen, Germany ("Gambro"); LiChrolut® EN(40-120μm), Merck KGaA, Darmstadt, Germany ("Lichrolut"); Polyspher PST 10, Merck KGaA, Darmstadt, Germany ("DVB 입자")) 을 진공 오븐에서 40℃ 에서 24h 동안 건조시킨 다음 1 그램의 건조 물질을 유리 플라스크에 칭량했다. 그 다음, 시험 분자 0.1g/L 가 용해된 15 ml 의 물을 유리 플라스크에 넣었다. 이어서, 유리 플라스크를 15 분 동안 쉐이커에 적용하였다. 쉐이킹 후, 유리 플라스크를 4000 회전/분으로 15 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 용액을 여과하고 헤드스페이스 GC-MS 에 적용했다. 주어진 값은 3 회의 측정으로부터의 평균 값이다 (도면 1-2).
활성탄 물질 ("BL 562" 및 "BL 772") 은 검출 한계 하에 4 개의 선택된 레퍼런스 물질 중 3 개를 흡착할 수 있었다.
활성탄 물질 ("BL 562" 및 "BL 772") 은 검출 한계 하에 3 개의 선택된 레퍼런스 물질 중 2 개를 흡착할 수 있었고, 아세탈알데하이드의 양을 대략 3 배 감소시켰다.
또한, 검출 오류를 제외하고 활성탄의 흡착 능력을 평하가기 위해 에틸아세테이트 (1g/L) 의 증가된 수준을 사용하였다 (도면 1). 실험 설정은 상기 기재한 바와 동일하였으나, 에틸아세테이트의 농도를 1g/L 로 증가시켰고, 2 가지 활성탄 물질 ("Bl 772" 및 "Gambro") 을 사용하였다 (도면 3).
달성된 결과는 "BL 772" 가 모델 용액으로부터 에틸아세테이트를 흡착하는데 성공적으로 사용될 수 있음을 입증하였다.
일회용 바이오프로세싱 어셈블리 (Mobius Virus Clearance Assembly) 용 활성탄 및 Millistak+CR40 필터 적용
하기 실시예에 대해 일회용 어셈블리를 순수한 물을 사용하여 시험했다:
Mobius ® Disposable Assembly (감사 조사됨 (최소 25-40kGy; MS0010L30EP, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 의 10L 용액 백을 Lynx ST 커넥터 (STC21THN01, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 로 튜빙 (Pharma 50, 7486040801PU-6, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 에 연결하고, Mobius ® Disposable Assembly (감사 조사됨 (최소 25-40kGy; MS0010L30EP, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 의 10L 용액 백에 피메일 루어(female lure) (5621000821, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 연결했다;
어셈블리를 Mobius ® Virus Clearance unit (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 에 설치하고, 10L 의 순수한 물을 유닛의 연동 펌프를 사용하여 1.5L/시간 유속으로 유동시켰다. 처리된 물을 실온에서 Mobius ® Disposable Assembly 10L 용액 백에 수집하였다.
그 다음, 10L 물 함유 백을 활성탄 (100772, Blucher GmbH, Erkrath) 이 패킹된 평형 Superformance® 유리 칼럼 (10*150mm, Gotec Labortechnik, Bickenbach, Germany) 에 연결하고, 연동 펌프를 사용하여 4ml/min 에서 작동시켰다. 물을 통과하는 유동을 개별 유리 용기에 수집하고, 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용하여 FIA-MS (유동 주입 질량 분석법 200μl/min 에서 Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) 에 적용시켰다. 결과를 도면 4 에 나타냈다.
활성탄이 패킹된 유리 칼럼을 통한 일회용 어셈블리 처리된 물의 여과는 추출물/침출물의 수준 (FIA-MS-ESI+ 방법에 따름) 을 <ppm 범위로 감소시켰으며, 매우 급격한 급증(break through) 프로파일을 나타냈다.
또한, 10L 처리된 물을 함유하는 백을 활성탄을 함유하는 uPOD™ 포맷 CR40 23 ㎠ 의 평형 Millistak+® 미디어 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 에 연결하고, 연동 펌프를 사용하여 4ml/min 에서 작동시켰다. 물을 통과하는 유동을 개별 유리 용기에 수집하고, 전자분무 이온화 (ESI+, ESI-) 및 대기압 화학적 이온화 (APCI-, APCI+) 방법을 사용하여 FIA-MS (유동 주입 질량 분석법 200μl/min 에서 Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) 에 적용했다. 결과는 도면 5- 도면 8 에 나타냈다.
Millistak+® CR40 필터를 통한 일회용 어셈블리 처리된 물의 여과는 추출물/침출물의 수준 (FIA-MS-ESI+;ESI- 방법에 따름) 을 10X 의 세기로 감소시켰다.
Millistak+® CR40 필터를 통한 일회용 어셈블리 처리된 물의 여과는 MilliQ 수질애 해당하는 추출물/침출물의 수준 (FIA-MS-APCI-,APCI+ 방법에 따름) 을 감소시켰다.
따라서, 일회용 어셈블리 사용 후 추출물/침출물 제거를 위한 Millistak+® CR40 장치의 사용은 추출물/침출물을 거의 완전히 제거했다.
일회용 바이오프로세싱 어셈블리 (Mobius ® Chromatography Assembly) 용 활성탄 및 Clarisolve 필터 적용
하기 실시예에 대해 일회용 어셈블리를 순수한 물을 사용하여 시험했다:
Mobius ® Disposable Assembly (감사 조사됨 (최소 25-40kGy; TF20020LGE1, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 의 20L 용액 백을 Lynx ST 커넥터 (STC21THN01, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 로 튜빙 (Pharma 50, 7486040801PU-6, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 에 연결하고, SHC 멤브레인을 갖는 Optical XL 600 필터 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 를 포함하는 Smart Flexware® Assembly for Chromatography (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 를 피메일 루어(female lure) (5621000821, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 를 사용하여 Mobius ® Disposable Assembly (감사 조사됨 (최소 25-40kGy; TF20020LGE1, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 의 20L 용액 백에 연결했다;
어셈블리를 Mobius ® 크로마토그래피 유닛 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 에 설치하고, 20L 의 순수한 물을 유닛의 연동 펌프를 사용하여 2L/시간 유속으로 유동시켰다. 처리된 물을 실온에서 Mobius ® Disposable Assembly 20L 용액 백에 수집하였다. 그 다음, 20L 물을 함유하는 백을 활성탄 (100772, Blucher GmbH, Erkrath) 이 패킹된 평형 Superformance® 유리 칼럼 (10*150mm, Gotec Labortechnik, Bickenbach, Germany) 에 연결하고, 연동 펌프를 사용하여 4ml/min 에서 작동시켰다. 물을 통과하는 유동을 개별 유리 용기에 수집하고, 전자분무 이온화 (ESI+) 방법을 사용하여 FIA-MS (유동 주입 질량 분석법 200μl/min 에서 Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) 에 적용했다. 결과를 도면 9 에 나타냈다.
활성탄이 패킹된 유리 칼럼을 통한 일회용 어셈블리 처리된 물의 여과는 추출물/침출물의 수준 (FIA-MS-ESI+ 방법에 따름) 을 <ppm 범위로 감소시켰으며, 급증(break through) 프로파일을 나타내지 않았다.
그 다음, 20L 물 함유 백을 활성탄을 함유하는 uPOD™ 포맷 CR40 23 ㎠ 의 평형 Millistak+® 미디어 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 에 연결하고, 연동 펌프를 사용하여 4ml/min 에서 작동시켰다. 물을 통과하는 유동을 개별 유리 용기에 수집하고, 전자분무 이온화 (ESI+, ESI-) 및 대기압 화학적 이온화 (APCI-, APCI+) 방법을 사용하여 FIA-MS (유동 주입 질량 분석법 200μl/min 에서 Bruker Esquire 3000+, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) 에 적용했다. 결과는 도면 10- 도면 13 에 나타냈다.
Millistak+® CR40 필터를 통한 일회용 어셈블리 처리된 물의 여과는 추출물/침출물의 수준 (FIA-MS-ESI+;ESI- 방법에 따름) 을 10X 의 세기로 감소시켰다.
Millistak+® CR40 필터를 통한 일회용 어셈블리 처리된 물의 여과는 MilliQ 수질에 해당하는 추출물/침출물의 수준 (FIA-MS-APCI-,APCI+ 방법에 따름) 을 감소시켰다.
따라서, 일회용 어셈블리 사용 후 추출물/침출물 제거를 위한 Millistak+® CR40 장치의 사용은 추출물/침출물을 거의 완전히 제거했다.

Claims (13)

  1. 표적 분자의 정제 방법으로서, 표적 분자를 포함하는 액체를 활성탄과 접촉시킴으로써 표적 분자가 침출물 및/또는 추출물로부터 분리되고,
    표적 분자는 10000 이상의 분자량을 갖는 단백질이고,
    활성탄은 유기 중합체성 물질의 열분해에 의해 수득되고, 유기 중합체성 물질은 폴리스티렌, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리메틸펜텐, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리비닐 또는 폴리프로필렌으로부터 선택되고,
    침출물 및/또는 추출물은, 표적 분자의 제조 및/또는 정제 방법에서 사용되는 일회용 기구와, 표적 분자와의 또는 표적 분자를 포함하는 액체와의 접촉에서 기인하며, 상기 일회용 기구는 엘라스토머 또는 플라스틱 성분을 포함하는 물질로 제조되는 것인, 정제방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 표적 분자가 당단백질인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 표적 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 침출물 및/또는 추출물이 하기 성분 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 정제 방법: 아세트알데하이드, 톨루엔, 2-헥산온, 아세톤, 2-부탄온, 에틸 아세테이트, 비스페놀 A, 벤질 알콜, 트리메틸 실라놀, 포름알데하이드, 비스 (2-에틸헥실) 프탈레이트, 1-메틸에틸 에스테르 아세트산, 2,4-디-t-부틸 페놀, 2-옥타논, 2-펜타논, 3,3-디메틸-2-부탄온, 3-에톡시-프로판, 3-헥산온, 3-메톡시-1-부탄올, 부탄알, 시클로헥산온, 에탄올, 포름산, 헵타에틸렌 글리콜, 헥산알, 메틸 이소부틸 케톤, 펜탄알, t-부탄올, 테트라하이드로푸란, 메틸 포르메이트.
  5. 제 1 항에 있어서, 표적 분자를 포함하는 액체의 pH 가, 활성탄과 접촉할 때 pH 3 내지 9 인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성탄이 5 내지 40 μm 의 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 상기 활성탄을 포함하는 필터 하나 이상을 통한 여과에 의해 침출물 및/또는 추출물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 제조 및/또는 정제 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 정제 방법:
    - 바이오리액터에서의 세포 배양
    - 정화
    - 크로마토그래피 정제
    - 여과.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가, 일회용 기구가 25℃ 초과의 온도 및/또는 일회용 기구의 기계적 변형과 조합으로 사용되고/되거나 일회용 기구에서의 표적 분자의 체류 시간이 1 시간 초과인 방법 단계 후에, 활성탄과 접촉되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
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