KR20240042237A - 결합 및 용리 크로마토그래피 정제의 부피 부하 유량을 감소시키고 생산성을 증가시키기 위한 인-라인 생성물 농축 - Google Patents
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Abstract
관심 생체 분자를 생물반응기에서 발현시켜 상기 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 생성물 샘플을 형성하고; 상기 생성물 샘플을 단일 통과 접선 유동 여과에 적용하여 농축 생성물 샘플을 형성하며; 상기 농축 생성물 샘플을 친화성 크로마토그래피에 적용하여 상기 농축 생성물 샘플로부터 불순물을 제거하는, 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 샘플을 정제하는 방법 및 시스템.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/782,671에 기초하여 우선권을 주장하며, 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시는 치료용 항체 및 Fc-함유 단백질을 포함하는 생물학적 분자의 정제를 위한 효율적인 공정 및 시스템에 관한 것이다.
단백질, 특히 재조합 단백질과 같은 생체 분자의 제조를 위한 일반적인 공정은 전형적으로 두 개의 주요 단계를 포함한다: (1) 숙주 세포에서의 단백질의 발현, 이어서 (2) 단백질의 정제. 제1 단계는 목적하는 숙주 세포를 생물반응기에서 성장시켜 단백질을 발현시키는 것을 수반한다. 이와 같은 목적을 위해 사용되는 세포주(cell line)의 일부 실시예는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 대장균(e-coli)과 같은 골수종(NSO) 박테리아 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 단백질이 목적하는 수준으로 발현되면, 단백질은 숙주 세포로부터 제거되고 수확된다. 세포, 세포 단편, 지질(lipid)과 같은 현탁(suspended)된 입자 및 다른 불용성 물질은 통상적으로 다운스트림 정제 공정에서 단백질-함유 유체로부터 제거되어, 용액 중 관심 단백질 뿐만 아니라 다른 가용성 불순물을 함유하는 정화된 유체가 생성된다.
제2 단계는 수확된 단백질을 정제하여 공정에 고유한 불순물을 제거하는 것을 포함한다. 수확 및 다운스트림 공정의 주요 목표는 가용성/불용성 불순물로부터 생성물(예컨대, 발현된 단백질)을 분리하는 것이다. 불순물의 예는 숙주 세포 단백질(HCP, 목적하는 또는 표적 단백질 이외의 단백질), 핵산, 내독소, 바이러스, 단백질 변이체, 단백질 응집체 및 세포 배양 배지 성분/첨가제를 포함한다. 이러한 정제는 통상적으로 여러 크로마토그래피 단계를 수반하며, 다공성 아가로스, 폴리머릭 또는 유리와 같은 고체 매트릭스 상에 또는 멤브레인 기반 흡착제에 의한, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 결합/용리(bind/elute) 모드의 양이온-교환(cation-exchange) 크로마토그래피, 유통 모드(flow through mode)의 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
공정 템플릿의 일 실시예는 원심분리에 의한 1차 정화, 여과에 의한 2차 정화 및 결합/용리 모드의 단백질-A 친화도, 이어서 결합/용리 모드의 양이온 교환, 이어서 유통 모드의 음이온 교환을 수반하는 크로마토그래피 공정 트레인을 포함한다. 단백질-A 칼럼(column)은 친화도 메카니즘에 의해 관심 단백질 또는 표적 단백질을 포획하는 한편, 대부분의 불순물은 칼럼을 통과하여 폐기된다. 그 후 단백질은 칼럼으로부터의 용리에 의해 회수한다. 대부분의 관심 단백질은 염기성 범위(8-9)의 등전점(PI)을 갖고, 따라서 정상 공정 조건 (단백질의 PI 미만의 pH) 하에 양으로 하전되기 때문에, 이들은 제2 칼럼에서 양이온 교환 수지에 결합된다. 다른 양으로 하전된 불순물이 또한 이 수지에 결합된다. 그 후 관심 단백질은 불순물이 수지에 결합된 채로 유지되면서 단백질이 용리되는 조건(pH, 염 농도) 하에서, 이러한 칼럼으로부터 용리에 의해 회수된다. 양으로 하전된 관심 단백질이 유통 스트림에서 회수되는 동안, 임의의 음으로 하전된 불순물이 수지에 결합되도록 하기 위해, 음이온 교환 칼럼은 통상적으로 유통 모드로 작동된다. 다운스트림 정제 공정 후, 버퍼 시스템을 컨디셔닝하고, 최종 충전 유닛 작업 전에 생성물을 농축시켜 제조 공정을 완료하기 위해 한외여과(ultrafiltration)/정용여과(diafiltration)를 사용될 수 있다. 이와 같은 공정은 고도로 정제되고 농축된 단백질 용액을 생성하며, 이는 치료 단백질이 인간에게 사용되기 위해 의도되고, 미국 식품의약품청(FDA)과 같은 규제 기관에 의해 승인되어야 하는 경우에 특히 중요할 수 있다.
도 3은 하나의 관습적인 공정을 도시한다. 이러한 공정은 세포 배양 브로쓰로부터 세포 및 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리의 사용, 이어서 심층 여과를 수반할 수 있는, 세포 수확 단계를 포함한다. 세포 수확 단계 후에는 보통 단백질 A 친화성 정제 단계와 같은 포획 단계(capture step)가 이어지고, 그 후에는 바이러스 불활성화가 이어진다. 바이러스 불활성화 후에는 통상적으로, 보통 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 및/또는 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함하는, 연마 단계(polishing step)로도 지칭되는 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 이어진다. 연마 단계 후 바이러스 여과(virus filtration) 및 한외여과/정용여과가 이어지고, 공정이 완료된다.
포획 단계는, 단백질-A 수지, 예컨대 에쉬무노(Eshmuno)® A 수지, 둘 다 이엠디 밀리포어 코포레이션(EMD Millipore Corporation)으로부터 상업적으로 입수가능한, 경질 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지 또는 프로셉(ProSep)® 울트라 플러스 배지를, 특히 Fc 영역을 포함하는 항체에 대해 사용할 수 있다. 결합 및 용리 모드로 작동되는 다른 수지가 또한 포획에 적합할 수 있다. 결합 및 용리 크로마토그래피는 (1) 표적 결합 능력(target binding capacity)에 대한 생성물 로딩, (2) 칼럼으로부터의 생성물의 용리 및 (3) 재사용을 위해 수지를 준비하기 위한 세정을 포함한다.
본 출원에 적합한 크로마토그래피 수지와 연관된 고비용과 관련된 상대적으로 낮은 결합 능력은, 공정을 비용 효율적으로 만들기 위해, 제조업체가 크로마토그래피 매질을 사용하여 수많은 결합/용리 및 칼럼 재생 사이클을 수행하는 것을 요구한다. 재생 공정은 생성물 처리량 감소, 버퍼 및 세정제 소비의 증가, 검증 비용 및 자본 장비 요구 사항 증가로 인해, 생산 비용을 추가적으로 증가시킨다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 크로마토그래피 수지의 동적 결합 용량(DBC)과 부피 부하 유량 사이에 중요한 관계가 존재한다. DBC는 주어진 로딩에서 수지에 결합된 생성물의 질량으로서 정의된다. 부피 유량은 체류 시간(보유되지 않은 분자가 칼럼을 통해 이동하는데 걸리는 시간)에 반비례한다. 더 낮은 유량에서는, 표적 분자가 수지 세공 구조 내로 확산되는 시간이 더 길고, 따라서 DBC는 통상적으로 더 높다. 보다 높은 유량에서는, 로딩된 생성물의 상당한 부분이 비결합을 통해 흐르므로, DBC는 보다 낮다. 도 2는 일정 범위의 부피 유동에 대한 질량 로딩의 함수로서의 비결합 생성물 파과(unbound product breakthrough)의 퍼센트를 플롯팅 한다.
단백질 결합 능력은 크로마토그래피 매질에 대한 중요한 파라미터이며; 이는 주어진 양의 단백질을 정제하는데 필요한 매질의 양을 결정한다. 이상적으로는, 각각의 크로마토그래피 칼럼이 수지의 최대 용량인 수지의 정적 결합 용량(SBC) 근처의 DBC에서 작동될 것이다. 수지의 SBC는 유량과 독립적이다. DBC 대 SBC의 비는 수지 이용률이다.
포획 칼럼(들)을 낮은 부피 유량(들)에서 작동하는 것이 선호된다는 것을 도 1 및 2에서 알 수 있다. 그러나, 낮은 부피 유동 작업이 언제나 실용적인 것은 아니고, 이는 상응하는 질량 유량의 감소 및 감소된 생산성(크로마토그래피 수지의 부피 및 공정 시간당 처리된 질량으로서 정의됨)을 초래할 것이기 때문이다.
다중-칼럼 포획 접근법에서, 적어도 1 개의 칼럼이 생성물 로딩에 항상 이용가능하도록(용리 및 재생이 다른 칼럼 또는 칼럼들에서 발생하는 동안) 2-6 개의 동일한 칼럼을 교대하여 사용할 수 있다. 수지 이용을 최대화하기 위해, 2 개 이상의 칼럼이 직렬로 로딩될 수 있다. 직렬 로딩 접근법은 시리즈의 제1 칼럼으로부터의 비결합 생성물 파과를 포획하여 수율을 최대화하는데 사용된다.
현재의 연속 바이오 처리 방법에서, 업스트림 생물반응기는 다중-칼럼 포획 단계에 직접 연결되고, 두 단계의 유속은 조화가 이루어져야 한다. 생물반응기 생산 속도를 감소시키는 것은 실용적인 선택이 아니기 때문에, 생물반응기 수확 속도는 통상적으로 후속 단계에 대한 공정 속도를 지시한다. 관습적인 작동에서 높은 단백질 A 결합 능력을 유지하기 위해, 주어진 부피 유량에서의 체류 시간을 증가시키고/거나 사이클링되는 칼럼의 수를 증가시키기 위해, 비교적 큰 칼럼 부피를 사용하는 것이 일반적이다. 그러나, 칼럼의 수 또는 칼럼 크기의 증가는 공정 생산성에 부정적인 영향을 미친다.
따라서, 생산성에 유해한 영향을 미치지 않으면서, 연속적 바이오 처리 작업에서 포획 크로마토그래피를 최적화하는 것이 바람직할 것이다. 효율적이고 비용-효율적인, 모노클로날 항체(Mab)와 같은 생체 분자의 제조를 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것이 또한 바람직할 것이다.
선행 기술의 문제점은, 생성물 질량 유량에 영향을 미치지 않으면서 바이오 제조 공정에서 낮은 부피 유동 크로마토그래피 로딩을 가능하게 하는 방법 및 시스템을 제공하는 본원에 개시된 실시태양에 의해 극복되었다. 특정 실시태양에서, 인-라인 생성물 농축은 예컨대 포획 크로마토그래피의 업스트림에서 단일 통과 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 수행된다. 인-라인 농축의 추가는 할당된 공정 시간에 영향을 미치지 않아, 크로마토그래피 단계가 보다 낮은 부피 유량(동일한 시간 내에 보다 적은 부피가 처리됨)으로 작동되도록 한다. 더욱이, 인-라인 농축은 부피를 비례적으로 감소시키면서 생성물 농도를 동시에 증가시키기 때문에, 생성물 질량 유량은 변화되지 않는다. 도 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 이러한 낮은 부피 유동 작업은 비결합 생성물 파과량 감소시키면서 표적 로딩에서 DBC를 증가시킨다. 그 결과, 크로마토그래피 수지를 보다 효율적으로 사용할 수 있다.
본원에 개시된 실시태양은 세포 배양액으로부터 유래된 관심 생체 분자의 정제 및 분리를 포함한다. 특정 실시태양에서, 개시된 방법 및 시스템은 인-라인 농축 후 이어지는 다운스트림 정제 공정을 포함한다. 특정 실시태양에서, 다운스트림 정제 공정은 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼에 의한 순차적 정제를 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 샘플을 정제하는 방법이 개시되며, 이와 같은 방법은, 관심 생체 분자를 생물반응기에서 발현시켜 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 생성물 샘플을 형성하고; 생성물 샘플을 단일 통과 접선 유동 여과에 적용하여 농축된 생성물 샘플을 형성하고; 농축된 생성물 샘플을 친화성 크로마토그래피에 적용하여 그로부터 불순물을 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 생물반응기로부터의 생성물 샘플(예컨대, 수확된 세포 배양물)은 단일 통과 접선 유동 여과에 적용되기 전에 하나 이상의 정화 단계에 적용된다. 하나 이상의 정화 단계는 원심분리, 접선 유동 여과, 심층 여과 및 멸균 여과 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단일 통과 접선 유동 여과 작업에서 배출되는 농축된 생성물 샘플은 친화성 크로마토그래피에 적용되기 전에 한 개 이상의 멸균 필터를 통과하거나 또는 탱크에 들어간다.
특정 실시태양에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 리간드를 사용한다.
특정 실시태양에서, 상기 방법은 농축된 생성물 샘플을 바이러스 불활성화 단계에 적용하는 것을 추가적으로 포함한다.
특정 실시태양에서, 상기 방법은 농축된 생성물 샘플을 친화성 크로마토그래피에 의한 포획의 다운스트림에 있는 연마 단계에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 연마 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바이러스 활성화 및 연마 둘 다가 수행될 수 있다.
특정 실시태양에서, 생체 분자는 재조합 항체, 재조합 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다. 일부 실시태양에서, 생체 분자는 단백질이다.
특정 실시태양에서, 관심 생체 분자를 정제하기 위한 시스템이 개시되며, 상기 시스템은 생물반응기; 생물반응기로부터 배출되는 생성물 샘플을 연속적으로 농축하기 위한 생물반응기의 다운스트림에 있는 인-라인 단일 통과 접선 유동 여과 유닛; 인-라인 단일 통과 접선 유동 여과 유닛으로부터 농축된 생성물 스트림을 수용하기 위한, 인-라인 단일 통과 접선 유동 여과 유닛의 다운스트림에서 직렬로 구성된 적어도 두 개의 친화성 크로마토그래피 칼럼; 적어도 두 개의 친화성 크로마토그래피 칼럼의 다운스트림에 위치한 바이러스 불활성화 필터; 및 바이러스 불활성화 필터의 다운스트림에 위치한 하나 이상의 음이온 교환, 양이온 교환 또는 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피 칼럼을 포함한다.
일부 실시태양에서, 시스템은 생물반응기의 다운스트림 및 SPTFF 유닛의 업스트림의, 원심분리기, 접선 유동 여과 유닛, 심층 여과 유닛 및 멸균 여과 유닛 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시태양에서, 시스템은 SPTFF 유닛의 다운스트림 및 친화성 크로마토그래피 칼럼의 업스트림의, 하나 이상의 멸균 필터 및/또는 하나 이상의 탱크 또는 용기를 포함한다.
일부 실시태양에서, 적어도 두 개의 친화성 크로마토그래피 칼럼은 각각 단백질 A 친화성 리간드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 정확히 두 개의 친화성 크로마토그래피 칼럼이 존재한다.
도 1은 상이한 공급 유량에서의 질량 로딩 대 동적 결합 용량(DBC)의 그래프이다.
도 2는 상이한 공급 유량에서의 질량 로딩 대 비결합 생성물 파과 %의 그래프이다.
도 3은 산업에서 사용되는 관습적인 정제 공정의 개략도이다.
도 4는 특정 실시태양에 따른 정제 시스템의 개략도이다.
도 2는 상이한 공급 유량에서의 질량 로딩 대 비결합 생성물 파과 %의 그래프이다.
도 3은 산업에서 사용되는 관습적인 정제 공정의 개략도이다.
도 4는 특정 실시태양에 따른 정제 시스템의 개략도이다.
하기 설명에서, 용어 "선택된 생체 분자", "표적 생체 분자" 또는 "분자", "표적 단백질", "관심 생체 분자 또는 단백질" 또는 유사한 용어는 모두 생체 분자 제조 공정의 생성물을 지칭한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있는 용어 "오염물", "불순물" 및 "파편"은 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 내독소, 지질, 단백질 응집체 및 하나 이상의 외래 또는 불쾌한 분자로부터 분리되는 관심 생성물을 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 거대분자를 포함하는 임의의 외래 또는 불쾌한 분자를 지칭한다. 뿐만 아니라, 이러한 오염물은 분리 공정 전에 일어날 수 있는 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 정제될 표적 단백질과 같은 표적 분자를 함유하는 임의의 조성물 또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은 생물학적 또는 다른 공급원으로부터 유래할 수 있다. 생물학적 공급원은 식물 및 동물 세포, 조직 및 기관과 같은 진핵 및 원핵 공급원을 포함한다. 일부 실시태양에서, 샘플은 정제될 관심 단백질을 함유하는 바이오 제약 제제를 포함한다. 특정 실시태양에서, 샘플은 정제될 관심 단백질을 함유하는 세포 배양 공급물이다. 샘플은 또한 표적 단백질 또는 관심 단백질들과 혼합되어 발견되는 희석제, 버퍼, 세제 및 오염 종, 파편 등을 포함할 수 있다. 샘플은 "부분적으로 정제"될 수 있거나(즉, 여과 단계와 같은 하나 이상의 정제 단계에 적용), 또는 표적 분자를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다(예컨대, 샘플은 수확된 세포 배양 유체를 포함할 수 있음).
본원에 사용된 용어 "결합 및 용리 모드" 및 "결합 및 용리 공정"은 샘플에 함유된 적어도 1 종의 표적 분자(예컨대, Fc 영역 함유 단백질)가 적합한 수지 또는 매질(예컨대, 친화성 크로마토그래피 매질 또는 양이온 교환 크로마토그래피 매질)에 결합되고, 후속적으로 용리되는 분리 기술을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "파과(break-through)"는 표적 분자를 함유하는 샘플을 패킹된 크로마토그래피 칼럼 또는 분리 유닛 상에 로딩하는 동안, 표적 분자가 칼럼 또는 분리 유닛으로부터의 산출물에 처음 나타나는 시점을 지칭한다. 다시 말해서, 용어 "파과"는 표적 분자의 손실이 시작되는 시점이다.
본원에 사용된 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 기술 내용의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 상기 용어는 고려 중인 장치, 시스템 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소 또는 단계의 포함을 허용한다. 따라서, 상기 표현 "본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 이루어진"은 언급된 실시태양, 특색, 성분, 단계 등이 존재해야 하고, 다른 실시태양, 특색, 성분, 단계 등이 존재할 수 있으며, 단 그의 존재는 언급된 실시태양, 특색, 성분, 단계 등의 성능, 특징 또는 효과에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 샘플 또는 생성물에 대해 물질 효과를 갖지 않는 작업 또는 단계의 존재는 허용된다. 예컨대, 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 샘플을 정제하는 것으로 본질적으로 이루어지고, 상기 관심 생체 분자를 생물반응기에서 발현시켜 상기 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 생성물 샘플을 형성하고; 생성물 샘플을 정화하고; 상기 정화된 생성물 샘플을 단일 통과 접선 유동 여과에 적용하여 농축된 생성물 샘플을 형성하고; 상기 농축된 생성물 샘플을 친화성 크로마토그래피에 적용하여 상기 농축된 생성물 샘플로부터 불순물을 제거하는 것으로 본질적으로 이루어진 방법은, 정화와 단일 통과 접선 유동 여과 작업 사이에 수행되는 다른 단계 또는 유닛 작업을 배제하고, 생성물 샘플의 조성을 실질적으로 변화시킬, 단일 통과 접선 유동 여과와 친화성 크로마토그래피 작업 사이에 수행되는 다른 단계 또는 유닛 작업을 배제한다. SPTFF 유닛의 다운스트림 및 포획 크로마토그래피의 업스트림에 위치하는 멸균 여과 단계 또는 탱크 또는 용기는 생성물 샘플의 조성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다.
특정 실시태양에서, 공정의 출발 물질인 샘플은, 그것이 성장한 세포주 뿐만 아니라 그것이 성장하고 수확되는 조건에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 대부분의 CHO 세포 공정에서, 세포는 세포벽 외부의 분자를 배지 내로 발현시킨다. 혼합물 중 불순물의 양을 감소시키기 위해 수거 동안 세포를 파열시키지 않으려고 한다. 그러나, 성장 및 수확 동안의 일부 세포는, 전단(shear) 또는 다른 취급 조건으로 인해 파열되거나 또는 죽고 용해되어, 그의 내용물을 혼합물 내로 유출시킬 수 있다. 박테리아 세포 시스템에서, 생체 분자는 종종 세포벽과 함께 유지되거나 또는 실제로 세포벽의 일부일 수 있다(단백질 A). 이들 시스템에서, 세포벽은 관심 생체 분자를 회수하기 위해 파괴 또는 용해될 필요가 있다.
정제될 표적 분자는 임의의 생체 분자, 바람직하게는 단백질, 특히, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 네덜란드의 크루셀(Crucell)로부터 입수가능한 Per.C6® 세포주, NSO 세포와 같은 골수종 세포, 쥐 세포와 같은 기타 동물 세포, 곤충 세포 또는, 대장균 또는 효모와 같은 미생물 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 뿐만 아니라, 혼합물은 관심 생체 분자를 함유하는, 우유 또는 혈액과 같은 트랜스제닉 유체를 생산하도록 변형된 동물로부터 유래된 유체일 수 있다. 최적의 표적 단백질은 항체, 면역접합체 및 다른 항체-유사 분자, 예컨대 CH2/CH3 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 예컨대, 이러한 생성물 및 방법은 RhuMAb를 발현시키는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 성장시킨 조절된 수확된 세포 배양 유체(HCCF)로부터의 (RhuMAb)와 같은 재조합 인간화 모노클로날 항체를 정제하는데 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 다운스트림 정제 공정에서, 목적하는 화학적 기능을 갖는 일련의 정제 매질을 사용하여, 생성물이 용액 중에 남아 정제 매질을 통해 유동하는 동안 가용성 불순물을 제거하여, 생성물을 함유하는 정제된 스트림을 생성한다. 정제 매질의 적합한 형태는 유도체화 된 막, 기능화 된 크로마토그래피 매질 또는, 매질이 정전기적, 소수성 또는 친화성 상호작용에 의해 불순물을 포획할 수 있도록 다양한 불순물과 상호작용하기 위해 목적하는 화학적 기능을 갖는 임의의 다른 다공성 물질을 포함한다. 불순물의 복잡하고 다양한 성질의 관점에서, 상이한 화학적 특성을 갖는 다양한 불순물을 제거하기 위해, 상이한 화학적 기능을 갖는 다수의 정제 매질을 직렬로 배열할 수 있다.
특정 실시태양에서, 샘플로부터 표적 분자를 정제하는 공정이 개시되며, 공정은 (a) 생물반응기에서 단백질을 발현시켜 단백질 샘플을 형성하는 단계; (b) 단백질 샘플을 인-라인 농축 단계에 적용하여 농축된 단백질 샘플을 형성하는 단계; (c) 생성된 농축된 단백질 샘플을, 하나 이상의 친화성 크로마토그래피 유닛을 이용하는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질 샘플은 인-라인 농축 단계에 적용되기 전에 하나 이상의 정화 단계에 적용된다. 또한 도 4에서 도시된 바와 같이, 또한, 생물반응기, 인-라인 단일 통과 접선 유동 필터 및 인-라인 단일 통과 접선 유동 필터와 유체 연통하는 하나 이상의 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼을 포함하는, 샘플로부터 표적 분자를 정제하기 위한 시스템이 개시된다. 특정 실시태양에서, 시스템은 생물반응기의 다운스트림 및 단일 통과 접선 유동 필터의 업스트림에서의 원심분리기, 접선 유동 필터, 심층 필터 및 멸균 필터 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 시스템은 단일 통과 접선 유동 필터의 다운스트림 및 친화성 크로마토그래피 칼럼의 업스트림에서의 멸균 필터 및 탱크 또는 용기 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 탱크 또는 용기는 서지 탱크 또는 용기일 수 있다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 바이러스 불활성화 유닛은 친화성 크로마토그래피 칼럼의 다운스트림에 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 연마 단계는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼의 다운스트림일 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼, 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 시스템은 연마 단계의 다운스트림에 바이러스 필터, 멸균 필터, 및 농축/정용여과 장치 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 시스템 내의 다양한 장치 사이에 연결 라인이 있다. 장치들은, 시스템 내의 장치의 앞 뒤에 있는 장치와, 시스템 내의 각각의 장치가 유체 연통하도록 일렬로 연결된다. 특정 실시태양에서, 단일 통과 접선 유동 여과 유닛은 하나 이상의 정화 유닛, 예컨대 원심분리기, 접선 유동 여과 유닛(예컨대, 하나 이상의 TFF 모듈), 밀리포어 시그마(MilliporeSigma)로부터 상업적으로 입수가능한 클라리솔브(Clarisolve®) 심층 필터와 같은 심층 여과 유닛 및/또는 멸균 여과 유닛(예컨대, 멸균 여과 막)의 바로 다운스트림에 있고, 최종 정화 단계와 단일 통과 접선 유동 여과 사이에 유닛 작업이 수행되지 않는다. 특정 실시태양에서, 단일 통과 접선 유동 여과 유닛은, 바람직하게는 단백질 A 칼럼 또는 칼럼들인 친화성 크로마토그래피 칼럼 또는 칼럼들의, 바로 업스트림에 있고, 그 사이에 유닛 작업이 수행되지 않는다. 다른 실시태양에서, 단일 통과 접선 유동 여과 유닛은 멸균 여과 막 및/또는 탱크의 바로 업스트림에 있고, 멸균 여과 막 및/또는 탱크는 바람직하게는 단백질 A 칼럼 또는 칼럼들인 친화성 크로마토그래피 칼럼 또는 칼럼들의 바로 업스트림에 있다. 탱크는, 연속 공정에서 유닛 작동들 사이의 펌프 변동성으로부터 보호하기 위해, 또는 공정 중간 풀에 작업자 샘플링 지점을 제공하기 위해, 서지 용기로서 사용될 수 있다. 탱크는 또한, 하기에 보다 상세히 논의될 단일 칼럼 작동을 가능하게 하는 서지 용기로서 사용될 수 있다. 탱크는 또한, 예컨대 직렬 다운스트림 공정에 연결된 배치식 업스트림 공정의 경우에, 생성물 보관 용기로서 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 시스템에서 사용되는 생물반응기는, 사용 후 버릴 수 있는, 또는 일회용 생물반응기이다. 일부 실시태양에서, 시스템은 멸균 환경에 둘러싸여있다.
일부 실시태양에서, 출발 샘플은 세포 배양물이다. 이러한 샘플은 생물반응기에 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 생물반응기는 관류 생물반응기이다.
특정 실시태양에 따르면, 인-라인 생성물 농축은 공급물로부터 과잉의 수분 및 버퍼를 제거함으로써, 인-라인 농축의 다운스트림에서 크로마토그래피 칼럼 또는 칼럼들에 로딩된 부피를 감소시킨다.
일부 실시태양에서, 결합 및 용리 크로마토그래피 장치는 적어도 두 개의 분리 유닛을 포함하며, 각각의 유닛은 동일한 크로마토그래피 매질, 예컨대 단백질 A 친화성 매질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질 A 매질은 강성 친수성 폴리비닐에테르 폴리머 매트릭스에 커플링된 단백질 A 리간드를 포함한다. 다른 실시태양에서, 단백질 A 리간드는 아가로스 또는 제어된 세공 유리에 커플링될 수 있다. 단백질 A 리간드는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터의 단백질 A의 자연 발생 도메인을 기반으로 할 수 있거나, 또는 자연 발생 도메인의 변이체 또는 단편일 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질 A 리간드는 황색포도상구균 단백질 A의 C 도메인으로부터 유래된다. 분리 유닛은, 액체가 하나의 분리 유닛에서 다음 분리 유닛으로 유동할 수 있도록, 서로 직렬로 유체 연통되도록 연결된다.
다른 실시태양에서, 결합 및 용리 크로마토그래피 장치는 적어도 세 개의 분리 유닛을 포함한다. 분리 유닛은, 액체가 하나의 분리 유닛으로부터 다음 분리 유닛으로 유동할 수 있도록, 서로 직렬로 유체 연통되도록 연결된다. 일부 실시태양에서, 결합 및 용리 크로마토그래피 장치는 서로 직렬로 유체 연통되도록 연결된 네 개 이상의 분리 유닛 또는 다섯 개 이상의 분리 유닛, 또는 여섯 개 이상의 분리 유닛을 포함한다.
단일 통과 접선 유동 여과(SPTFF)는 연속 모드에서 필터 어셈블리를 통한 단일 통과에서 생성물의 충분한 농축을 허용하고, 따라서 배치 모드에서 잔류물 반환 및 필터를 통한 다중 통과를 요구하지 않는다. 이는 다중 통과 TFF에 비해, 보다 낮은 공급 플럭스 및/또는 보다 긴 채널을 통해, 장치 내 막 채널에서의 유체 체류 시간을 증가시킴으로써 가능해질 수 있다. 추가의 이점은, 일정한 공급물 유동 및 잔류물 압력을 사용하는 능력 및 보다 작은 펌프 및 보다 작은 설비 설치 공간을 포함한다. SPTFF에 적합한 막은 1-1000 kD 공칭 분자량 한계 범위의 한외여과 막을 포함한다. 예컨대, 밀리포어 시그마로부터 상업적으로 입수가능한 펠리콘(Pellicon)® 2 또는 펠리콘® 3 카세트가 사용될 수 있다. 단일 카세트가 사용될 수 있거나, 또는 전환을 개선하기 위해 직렬로 배열된 다수의 카세트가 사용될 수 있다. 접선 유동 여과 단계가 생성물 샘플을 충분히 농축시키기 때문에, 잔류물 재순환은 요구되지 않는다. 특정 실시태양에서, SPTFF는 TFF 카세트를 직렬로 구성함으로써 증가된 샘플 체류 시간을 달성한다.
특정 실시태양에서, SPTFF 장치는 단백질 A 크로마토그래피 칼럼과 같은 포획 크로마토그래피 칼럼의 바로 업스트림에 위치한다. 다른 실시태양에서, 멸균 필터 및/또는 탱크는 SPTFF 장치와 포획 크로마토그래피 칼럼 사이에 위치할 수 있다. 특정 실시태양에서, SPTFF 장치는 수확된 세포 배양 정화 유닛 작동, 예컨대 하나 이상의 원심분리기, 접선 여과 모듈, 심층 여과 유닛, 또는 멸균 여과 유닛의 바로 다운스트림에 놓인다. SPTFF 장치를 사용한 관심 생체 분자의 사전-농축은, 전체 공정 시간 또는 생성물 질량 유량을 변화시키지 않으면서, 포획 크로마토그래피 단계로 진행하는 생물반응기로부터의 전체 공정 부피를 감소시킨다.
특정 실시태양에서, 친화성 크로마토그래피의 업스트림에 단일 통과 접선 유동 여과 유닛을 포함시키는 것은, 목적하는 수율을 유지하기 위해 직렬로 로딩되어야 하는 친화성 크로마토그래피 칼럼의 수를 감소시킨다. 부피 유량이 감소하기 때문에, 친화성 크로마토그래피 매질(예컨대, 단백질 A 친화성 리간드를 함유)은 최소의 파과로 보다 낮은 질량 로딩에서 표적 동적 결합 능력에 도달하고, 그렇게 함으로써 그렇지 않은 경우 요구되었을 칼럼의 수의 감소를 가능하게 한다. 특정 실시태양에서, 두 개의 직렬의 친화성 크로마토그래피 칼럼(예컨대, 단백질 A 친화성 리간드를 함유)만이 필요하다. 일부 실시태양에서, 서지 용기 등이 칼럼 세척, 용리 및 세정 동안, 로드 물질을 수집하는데 사용되는 경우에, 단일 친화성 크로마토그래피(예컨대, 단백질 A 친화성 리간드를 함유) 칼럼만이 요구된다.
보다 적은 칼럼이 사용되는 경우에, 칼럼은 가공 동안 보다 빈번하게 사이클링 되어야 하며, 이는 최종 사용자가 크로마토그래피 매질의 전체 수명 및 비용을 실현하는 것을 보다 용이하게 한다. 사이클링 된 칼럼의 수를 감소시키는 것은 또한, 25 %의 감소와 같이 시스템 압력을 낮추고, 시스템 크기 및 복잡성을 감소시키며; 보다 적은 밸브 및 밸브 스위칭이 요구된다.
단일 통과 접선 유동 여과 장치의 사용은 또한, 크로마토그래피 수지의 보다 효율적인 이용을 가능하게 하고, 따라서 동일한 양의 물질을 동일한 시간 내에 가공하는데 보다 적은 수지가 요구되어, 생산성을 개선하고 비용을 감소시킨다. 감소된 부피 유량은 시스템 내의 펌프에 대한 부담을 감소시켜, 더 작은 시스템이 더 많은 제품 질량을 처리할 수 있게 한다.
Claims (1)
- 관심 생체 분자를 생물반응기 내에서 발현시켜 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 생성물 샘플을 형성하는 단계;
상기 생성물 샘플을 정화 작업에 적용하고, 생성된 정화된 생성물을 단일 통과 접선 유동 여과에 적용하여, 농축 생성물 샘플을 형성하는 단계; 및
상기 농축 생성물 샘플을 친화성 크로마토그래피에 적용하여 상기 농축 생성물 샘플로부터 불순물을 제거하는 단계를 포함하는, 관심 생체 분자 및 불순물을 포함하는 샘플을 정제하는 방법.
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