KR20200115467A - 치료용 단클론 항체에 대한 새로운 산성 번역 후 변형으로서의 글루쿠로닐화 - Google Patents

치료용 단클론 항체에 대한 새로운 산성 번역 후 변형으로서의 글루쿠로닐화 Download PDF

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Abstract

글루쿠로닐화된 단백질 생성물을 식별하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

치료용 단클론 항체에 대한 새로운 산성 번역 후 변형으로서의 글루쿠로닐화
본 발명은 일반적으로 치료 단백질에 대한 번역 후 변형을 식별하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
제약 산업에서, 재조합 단클론 항체(mAb)는 단백질 치료제의 주된 클래스를 구성한다. mAb 구조에 대한 변화는 치료 mAb의 치료 효능, 생체이용 가능성과 제거, 및 면역원성 특성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, mAb의 변화는 약물의 안전성 및 효능을 변경할 수 있다. 약물의 효능과 안전성 평가 뿐만 아니라 구조/기능 관계를 이해하는 데 있어서도 mAb의 일차 구조, 번역 후 변형(PTM) 및 이황화 결합을 포괄적으로 특징 분석하는 것이 중요하다.
생성물과 공정의 일관성을 확보하기 위해 사용되는 다양한 검정법 중에서, 이온 교환 크로마토그래피(IEX)는 mAb 분자의 전하 이질성을 평가하는 데 흔히 사용되는 기술이다. mAb 전하 변이체는 흔히 mAb 분자의 표면 전하를 변경시킬 수 있는 번역 후 변형(PTM)에 종종 기인할 수 있다. 나날이 진보하는 LC-MS 기술 덕분에 알려져 있거나 신규한 PTM이 식별되었다. 또한, 전하 이질성에 대한 이들의 기여가 설명되었다. 기술의 진보로 인해 수많은 신규한 PTM이 제공되었지만, mAb 활성과 안정성을 변경시키는 PTM을 추가로 특징 분석하고 발견할 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 PTM을 식별하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
글루쿠로닐화된 단백질 생성물을 식별하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일 구현예는 단백질 약물 생성물을 탈당질화하고, 탈당질화된 단백질 생성물을 효소(예: FabRICATOR®)로 처리하여 1개의 Fc* 단편(비공유 상호작용을 통해 함께 결합된 2개의 동일한 Fc/2 단편) 및 1개의 Fab2를 생성함으로써 단백질 약물의 글루쿠로닐화를 식별하는 방법을 제공한다. 그런 다음, Fc* 및 Fab2 단편을 Fc* 및 Fab2의 산성 분획으로 분리한다. 일 구현예에서 Fc* 및 Fab2 단편을 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 강양이온 교환 크로마토그래피를 사용해 분리한다. 분리한 후, 산성 분획을 수집하고, 건조시키고 변성시킨다. 건조되고 변성된 산성 분획을 알킬화한 다음 트립신으로 분해하여 샘플을 형성한다. 그런 다음, 샘플을 NaBH4로 처리하여 환원된 샘플을 형성한다. 그런 다음, 환원된 Fc* 샘플과 환원된 Fab2 샘플 둘 다에 대해 역상 액체 크로마토그래피/질량 분광 분석을 수행하여 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화를 식별한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 환원된 샘플과 환원되지 않은 샘플 간의 질량 분광 분석 결과를 비교하여 환원된 샘플과 환원되지 않은 샘플 간의 질량 차이를 식별한다. 약물 생성물은 단클론 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 글루쿠로닐화는 단백질 약물 생성물의 리신 잔기 상에서 검출된다.
일 구현예에서 Fc* 및 Fab2 단편은 FabRICATOR® 상표명으로 판매되는, 화농 연쇄구균(Streptocoocus pyogenes)에서 유래된 IdeS의 재조합적으로 변형된 형태를 사용해 형성된다.
개시된 방법은 단백질 약물 생성물, 예를 들어 단클론 항체 또는 다른 치료 단백질의 순도를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예는 단백질 약물 생성물을 분석하여 단백질 약물 생성물의 하나 이상의 아미노산의 1차 아민 상에서 글루쿠로닐화를 식별하고, 단백질 약물 생성물로부터 글루쿠로닐화된 단백질을 제거하여 정제된 단백질 약물 생성물을 생산함으로써 단백질 약물 생성물의 순도을 증가시키는 방법을 제공한다. 글루쿠로닐화는 상기 및 실시예에서 기술된 방법을 사용해 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 글루쿠로닐화된 단백질은 질량 분광 분석과 임의로 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 기술에 의해 검출된다. 대표적인 크로마토그래피 기술은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 초고성능 액체 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 일반적으로, 글루쿠로닐화는 단백질 약물 생성물의 리신 잔기 상에서 일어난다.
또 다른 구현예는 글루쿠로닐화를 위한 포유류 세포 배양물로부터 수득된 단백질 약물을 분석함으로써 번역 후 변형된 단백질 약물 생성물을 확인하는 위한 방법을 제공하며, 여기서 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화가 존재한다는 것은 단백질 약물 생성물이 번역 후 변형을 포함한다는 것을 나타낸다. 포유류 세포 배양물은 일반적으로 차이니즈 햄스터 난소 세포를 함유한다.
또 다른 구현예는 치료 단백질을 함유하는 단백질 약물 생성물을 제공하며, 여기서 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0% 또는 10% 미만의 치료 단백질의 아미노산이 글루쿠로닐화되어 있다. 일 구현예에서, 아미노산은 리신(lysine)이다. 일반적으로, 치료 단백질은 단클론 항체, 재조합 단백질, 또는 융합 단백질이다.
도 1a 내지 도 1f는 예시적인 mAb에 대한 Fab2 전하 변이체 분석을 보여주는 크로마토그램이다. 도 1g 내지 도 1p는 예시적인 mAb에 대한 Fab2 전하 변이체 분석을 보여주는 크로마토그램이다.
도 2는 산성 Fc, 염기성 Fc 및 산성 Fab2의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 3a는 NaBH4 처리가 되지 않은 샘플에 대한 MS2 단편화 패턴(fragmentation pattern)을 보여준다. 도 3b는 NaBH4 처리된 샘플에 대한 MS2 단편화 패턴을 보여준다.
도 4a는 WCX 컬럼을 사용하는 크로마토그램이다. 화살표는 강제 글루쿠론산 처리를 나타낸다. 도 4b는 Fab2 대조군의 결과를 보여주는 그래프이다. 도 4c는 글루코론산으로 처리된 Fab2에 대한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 4d는 Fc 대조군에 대한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 4e는 글루코론산으로 처리된 Fc에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a는 원시 샘플의 크로마토그램으로서, 글루쿠로닐화가 이미 존재함을 보여준다. 도 5b는 글루쿠론산으로 처리된 샘플의 크로마토그램으로서, 강제 글루쿠로닐화를 보여준다. 도 5c는 이미 존재하는 글루쿠로닐화에 대한 M2 단편화 패턴의 결과를 보여준다. 도 5d는 글루쿠론산으로 처리된 샘플에 대한 M2 단편화 패턴의 결과를 보여준다.
도 6a는 제2 샘플의 크로마토그램이다. 도 6b는 글루쿠론산으로 처리된 제2 샘플의 크로마토그램으로서, 강제 글루쿠로닐화를 보여준다. 도 6c는 이미 존재하는 글루쿠로닐화에 대한 M2 단편화 패턴의 결과를 보여준다. 도 6d는 글루쿠론산으로 처리된 샘플에 대한 M2 단편화 패턴의 결과를 보여준다.
도 7a는 제3 샘플의 크로마토그램이다. 도 7b는 글루쿠론산으로 처리된 제3 샘플의 크로마토그램으로서, 강제 글루쿠로닐화를 보여준다. 도 7c는 이미 존재하는 글루쿠로닐화에 대한 M2 단편화 패턴의 결과를 보여준다. 도 7d는 글루쿠론산으로 처리된 샘플에 대한 M2 단편화 패턴의 결과를 보여준다.
I. 정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체(antibody)"는 "가변 영역" 항원 인식 부위를 갖는 면역글로불린 분자를 나타내고자 하는 것이다. 용어 "가변 영역(variable region)"은 면역글로불린의 이러한 도메인을 항체에 의해 광범위하게 공유되는 도메인(예컨대, 항체 Fc 도메인)과 구별하기 위한 것이다. 가변 영역은 항원 결합을 담당하는 잔기를 가진 "초가변 영역(hypervariable region)"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region 또는 CDR)"으로부터의 아미노산 잔기(일반적으로는, 대략적으로 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24~34 (L1), 50~56 (L2) 및 89~97 (L3) 및 대략적으로 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 27~35 (H1), 50~65 (H2) 및 95~102 (H3); Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조) 및/또는 "초가변 루프(hypervariable loop)"로부터의 잔기들(경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26~32 (L1), 50~52 (L2) 및 91~96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26~32 (H1), 53~55 (H2) 및 96~101 (H3); Chothia 및 Lesk의 문헌[1987, J. Mol. Biol. 196:901-917] 참조)을 포함한다. "프레임워크 영역(Framework Region 또는 FR)" 잔기는 본원에서 정의된 것과 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기들이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단클론 항체(mAb)"는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 고유 부모 세포의 모든 클론인 동일한 면역 세포에 의해 만들어지는 항체를 지칭한다. mAb는 암, 관절염, 천식, 대장염, 자가면역 질환, 및 감염증 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 다양한 질환에 대한 치료제로서 점차 대중화되어 왔다. mAb는 150 kDa에 가까운 분자량을 갖는 큰 단백질로서, 2개의 동일한 약 50 kDa 중쇄(HC) 및 2개의 동일한 약 25 kDa 경쇄(LC)로 이루어진다. 이들은 또한 3차원 구조 및 생물학적 활성을 유지하는 적어도 16개의 이황화 결합을 포함한다. 상이한 mAb는 비록 유사한 이차 단백질 구조를 공유하지만, 가변 영역의 서열, 특히 항체-항원 결합의 다양성 및 특이성을 담당하는 상보성 결정 영역(CDR)에 있어서 크게 상이하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"이라는 용어는 항체의 상보성 결정 영역("CDR") 및 임의로 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위를 포함하는 프레임워크 잔기를 함유하고 항원에 면역특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 이러한 단편은 Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄(ScFv) 및 이들의 돌연변이체, 자연 발생 변이체, 및 항체 "가변 영역" 항원 인식 부위 및 이종 단백질(예를 들어, 독소, 상이한 항원에 대한 항원 인식 부위, 효소, 수용체 또는 수용체 리간드 등)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이온 교환 크로마토그래피(IEX)"는 이온화 가능한 분자를 이들의 총 전하에 기초하여 분리하는 방법을 지칭한다. 단백질은 양으로 하전되고 음으로 하전된 화학물질의 군으로 이루어진다. 단백질은 환경의 pH에 따라 순 양전하(net positive charge) 또는 순 음전하(net negative charge)를 가지거나, 전하를 가지지 않을 수 있다. 분자가 순 전하를 갖지 않는 pH는 등전점(pI)이라 불린다. 관심 단백질의 순 전하는, 분자의 일차 서열에 기초하여 계산될 수 있는 등전점, 및 완충액의 pH를 조합함으로써 계산된다. IEX 컬럼에 특정 pH의 샘플이 첨가될 때, 적절하게 하전된 모든 단백질은 컬럼 내 수지에 결합하게 된다. 예를 들어, 순 음전하를 갖는 단백질은 음이온 교환 수지 컬럼에 의해 포획될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전하 변이체(charge variant)"는 변형되지 않은 형태와 비교했을 때 등전점(pI) 또는 전하가 변경된 이소형 및 단백질 변이체를 지칭한다. pI가 상대적으로 낮은 전하 변이체는 "산성 변이체"로서 지칭되는 반면, pI가 상대적으로 높은 전하 변이체는 "염기성 변이체"로서 지칭된다. 전하 변이체는 단백질 또는 세포막 표적에 결합하는 mAb의 능력을 변화시키는 것을 포함하여, 항체의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 이는 항체의 약동학, 조직 침투 및 조직 분포에 영향을 미칠 수 있다. 전하 변이체의 예시는 탈아미드화(deamidation), N-말단 피로글루타메이트의 형성, 응집, 이성질화, 시알릴화 글리칸, 항체 단편화, 및 리신 잔기에서의 당화를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "번역 후 변형(post-translational modification, PTM)"은 단백질 생합성 후 단백질 상의 하나 이상의 아미노산에 발생하는 생화학적 변형을 지칭한다. PTM은 단백질 접힘의 조절, 특정 세포 구획에 대한 단백질의 표적화, 또는 리간드와 다른 단백질 간의 상호 작용 조절을 통해 세포의 기능에 주요 역할을 한다. 가장 흔한 변형은 전구체 단백질의 특이적 절단; 이황화 결합의 형성; 또는 저-분자량 그룹의 공유 첨가 또는 제거이며, 따라서 이러한 변형은 아세틸화, 아미드화, 비오티닐화, 시스테인닐화, 탈아미드화, 파르네실화, 포르밀화, 제라닐화, 글루타티오닐화, 당화(탄수화물과의 비효소적 접합), 당질화(탄수화물과의 효소적 접합), 히드록실화, 메틸화, 모노-ADP-리보실화, 미리스토일화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 폴리(ADP-리보실화), 스테아로일화, 또는 황산화로 이어진다. 유비퀴틴화는 단백질 분해 경로에 중요한 또 다른 흔한 PTM이다. 일부 PTM은 탈접합 효소의 작용에 의해 가역적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "N-연결된 당질화(N-linked glycosylation)"는 번역 후 단백질 변형을 지칭한다. N-연결된 당질화는 올리고당을 질소 원자, 일반적으로는 아스파라긴 잔기의 N4에 부착하는 것이다. 모든 N-연결된 탄수화물은 N-아세틸글루코사민과 아미노산 아스파라긴을 통해 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "펩티드 맵핑(peptide mapping)"은 단백질의 특징을 분석하고 이들의 일차 아미노산 구조를 밝히는 기술을 지칭한다. 이는 단클론 항체 및 기타 재조합 단백질 약제의 특징을 분석하는 데 널리 사용되는 기술이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "글루쿠로니드화(glucuronidation)"는, 공인자 UDP-글루쿠론산으로부터 유래된 글루쿠론산이 친핵성 작용기를 함유하는 기재에 공유 연결되는 접합 반응을 지칭한다.
II. 글루쿠로닐화를 식별하는 방법 및 이를 사용하는 방법
A. 글루쿠로닐화의 식별
글루쿠로닐화된 단백질 약물 생성물을 식별하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 실시예 1 내지 3은 치료 단백질에서 글루쿠로닐화된 아미노산을 검출하고 식별하는 데 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 일반적으로, 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화를 식별하기 위한 하나의 방법은, 단백질 약물 생성물을 탈당질화하는 단계, 및 탈당질화된 단백질 약물 생성물을 FabRICATOR®로 처리하여 1개의 Fc* 단편(비공유 상호 작용을 통해 함께 결합된 2개의 동일한 Fc/2 단편) 및 1개의 Fab2 단편을 생성하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, Fc* 단편 및 Fab2 단편은 FabRICATOR® 상표명으로 판매되는, 화농 연쇄구균에서 유래된 재조합 IdeS 효소를 사용해 형성된다.
그런 다음, Fc* 단편 및 Fab2 단편은 Fc* 및 Fab2의 산성 분획으로 분리된다. 일 구현예에서 Fc* 및 Fab2 단편은 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 강양이온 교환 크로마토그래피를 사용해 분리된다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 탈당질화된 mAb 샘플(약 50 μg)의 부분 표본을 Thermo Exactive Plus EMR 질량 분석기 또는 질량 측정용 Thermo Q Exactive plus 질량 분석기에 결합된 YMC-BiOpro SP-F 강양이온 교환(SCX) 컬럼 (100 Х 4.6 mm) 상에 주입하였다. 샘플을 분리하고, 암모늄 아세테이트계 완충액(완충액 A: 20 mM 암모늄 아세테이트, pH 5.8; 완충액 B: 200 mM 암모늄 아세테이트, pH 7.6)의 pH 구배로 20분에 걸쳐 용리하였다. SCX 칼럼 다음에 분석 흐름을 약 2 μL/분으로 감소시키기 위한 분석 스플리터(약 200:1 비율)를 질량 검출용 질량 분석기 전에 연결하였다. 스플리터로부터의 높은 흐름을 동시 UV 검출용(280 nm) Waters ACQUITY 광다이오드 어레이(PDA) 검출기로 우회시켰다. 그 결과, 산성 숄더 피크가 검출되었는데, 이는 약 176 Da의 질량 증가를 수반하는 항체의 변이체에 기인한 것이었다.
분리한 후, 산성 분획을 수집하고, 건조시키고 변성시킨다. 일 구현예에서, 수집된 산성 분획을 SpeedVac??에서 먼저 건조시킨 다음, 50℃에서 30분 동안 가열함으로써 5 mM 디티오트레이톨(DTT), 8 M 우레아 및 100 mM 트리스-HCl(pH 7.5)이 포함된 20 μL의 용액에서 변성시키고 환원한다. 당업자는 산성 분획을 건조시키고 변성시키는 데 다른 환원제, 변성제 및 온도가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
건조되고 변성된 산성 분획을 알킬화된 다음 효소적으로 (예를 들어 트립신으로) 분해하여 샘플을 형성한다. 산성 분획을 30분 동안 실온의 암소에서 10 mM 요오드아세트아미드(IAA) 중에서 인큐베이션함으로써 이들 산성 분획을 알킬화할 수 있다. 분획의 분해는 175 μL의 100 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 희석하고, 4시간 동안 37°C에서 1:10(w/w)의 효소 대 기질 비율로 트립신을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
그런 다음, 트립신으로 분해한 산성 분획을 1시간 동안 37℃에서 50 mM NaBH4로 인큐베이션한 후 10% 포름산(FA)으로 켄칭하여 환원된 샘플을 형성한다. 그런 다음, 환원된 샘플을 대상으로 역상 액체 크로마토그래피/질량 분광 분석을 수행하여 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화를 식별한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 환원된 샘플과 환원되지 않은 샘플 간의 질량 분광 분석 결과를 비교하여 환원된 샘플과 환원되지 않은 샘플 간의 질량 차이를 식별한다. 약물 생성물은 단클론 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 글루쿠로닐화는 단백질 약물 생성물의 리신 잔기 상에서 검출된다.
B. 단백질 약물 생성물의 순도를 증가시키기 위한 방법
개시된 방법은 단백질 약물 생성물, 예를 들어 단클론 항체 또는 다른 치료 단백질의 순도를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예는 단백질 약물 생성물을 분석하여 단백질 약물 생성물의 하나 이상의 아미노산의 1차 아민 상에서 글루쿠로닐화를 식별하고, 단백질 약물 생성물로부터 글루쿠로닐화된 단백질을 제거하여 정제된 단백질 약물 생성물을 생산함으로써 단백질 약물 생성물의 순도을 증가시키는 방법을 제공한다. 글루쿠로닐화는 상기 및 실시예에서 기술된 방법을 사용해 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 글루쿠로닐화된 단백질은 질량 분광 분석과 임의로 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 기술에 의해 제거된다. 대표적인 크로마토그래피 기술은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 초고성능 액체 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 일반적으로, 글루쿠로닐화는 단백질 약물 생성물의 리신 잔기 상에서 일어난다.
또 다른 구현예는 글루쿠로닐화를 위한 포유류 세포 배양물로부터 수득된 단백질 약물을 분석함으로써 번역 후 변형된 단백질 약물 생성물을 확인하는 위한 방법을 제공하며, 여기서 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화가 존재한다는 것은 단백질 약물 생성물이 번역 후 변형을 포함한다는 것을 나타낸다. 포유류 세포 배양물은 일반적으로 차이니즈 햄스터 난소 세포를 함유한다.
C. 단백질 약물 생성물
또 다른 구현예는 치료 단백질을 함유하는 단백질 약물 생성물을 제공하며, 여기서 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0% 또는 10% 미만의 치료 단백질의 아미노산이 글루쿠로닐화되어 있다. 글루쿠로닐화 백분율은 개시된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산은 리신이다. 일반적으로, 치료 단백질은 단클론 항체 또는 융합 단백질이다.
단백질 약물 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 재조합 단백질, 또는 융합 단백질일 수 있다. 항체는 바람직하게는 단클론 항체이다.
실시예
실시예 1: 항체가 온전한 수준에서 변형의 식별
방법
mAb를 대상으로 온라인 IEX-MS 분석을 수행하였다. 탈당질화된 mAb 샘플(약 50 μg)의 부분 표본을 Thermo Exactive Plus EMR 질량 분석기 또는 질량 측정용 Thermo Q Exactive plus 질량 분석기에 결합된 YMC-BiOpro SP-F 강양이온 교환(SCX) 컬럼 (100 Х 4.6 mm) 상에 주입하였다. 샘플을 분리하고, 암모늄 아세테이트계 완충액(완충액 A: 20 mM 암모늄 아세테이트, pH 5.8; 완충액 B: 200 mM 암모늄 아세테이트, pH 7.6)의 pH 구배로 20분에 걸쳐 용리하였다. SCX 칼럼 다음에 분석 흐름을 약 2 μL/분으로 감소시키기 위한 분석 스플리터(약 200:1 비율)를 질량 검출용 질량 분석기 전에 연결하였다. 스플리터로부터의 높은 흐름을 동시 UV 검출용(280 nm) Waters ACQUITY 광다이오드 어레이(PDA) 검출기로 우회시켰다.
결과
그 결과, 산성 숄더 피크가 검출되었는데, 이는 약 176 Da의 질량 증가를 수반하는 항체의 변이체에 기인한 것이었다. 그러나, 온전한 수준에서의 질량 측정은, 동일한 산성 숄더 피크에서 용출되고 질량이 비슷한(162 Da) 당화 변형에 기인하는 문제(complications)로 인해 정확하지 않았다.
실시예 2: 항체 서브-도메인 수준에서 새로운 산성 변형의 검출
방법
산성 피크의 해상도를 메인 피크까지 증가시키고 질량 측정 정확도를 개선하기 위해, 탈당질화된 mAb 샘플을 FabRICATOR, 즉 2개의 힌지 영역의 이황화 결합의 C-말단에서 중쇄를 절단하는 효소로 처리하였다.
결과
이 처리를 통해 1개의 Fab2 단편 및 비공유 상호 작용을 통해 함께 결합되는 2개의 동일한 Fc/2 단편(Fc*)을 생성하였다. 분해물의 부분 샘플을 대상으로 전술한 바와 같은 온라인 IEX-MS 분석을 수행하였다. 예상대로, Fab2 및 Fc*의 산성 피크에서 약 176 Da의 질량 증가를 수반하는 동일한 산성 변이체가 검출되었다(도 1a 내지 도 1p).
실시예 3: 새로운 산성 변형의 식별 및 확인
방법
추가로 아미노산 잔기에 대한 변형 부위를 식별하고, 이러한 알려지지 않은 변형의 정확한 질량을 얻기 위해, 펩티드 맵핑 분석용 SCX 컬럼으로부터 Fc* 및 Fab2 단편의 산성 분획을 수집하였다. 수집된 산성 분획을 SpeedVac??에서 먼저 건조시킨 다음, 50℃에서 30분 동안 가열함으로써 5 mM 디티오트레이톨(DTT), 8 M 우레아 및 100 mM 트리스-HCl(pH 7.5)이 포함된 20 μL의 용액에서 변성시키고 환원하였다. 그런 다음, 샘플을 30분 동안 실온의 암소에서 10 mM 요오드아세트아미드(IAA)로 인큐베이션함으로써 알킬화하였다. 그런 다음, 환원되고 알킬화된 샘플을 175 μL의 100 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 희석하고, 4시간 동안 37°C에서 1:10(w/w)의 효소-대-기재 비율의 트립신으로 분해하였다. 4 μL의 10% FA를 첨가하여 분해를 중단시켰다. 그런 다음, 각각의 분해된 단백질 샘플의 부분 샘플을 RP-UPLC에 의해 분리한 후 온라인 MS 분석을 수행하였다. MS 및 MS/MS 실험을 Thermo Q Exactive Plus MS 시스템을 이용해 수행하였고, MS/MS 실험 도중의 펩티드 단편화를 위해 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용하였다. 그런 다음, 질량이 170 내지 180 Da인 가변 와일드카드 변형 및 mAb 서열을 함유하는 데이터베이스에 대해 MS 원시 데이터 파일을 검색하였다.
결과
결과는, 이러한 알려지지 않은 변형이 +176.03 Da의 단일동위원소 질량을 나타냈고, mAb 서열 내의 다수의 Lys 잔기에서 낮은 수준으로 발생하였음을 보여주었다(도 2). 정확한 델타 질량에 기초하여, 이러한 변형이 글루쿠로니드화와 동일한 원소 조성(C6H8O6)을 가진 적이 있었던 것으로 가정하였지만, 이는 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제에 의해 촉매된 O-결합을 통해 Ser 및 Thr에서 발생하는 것으로 보고되었다.
그런 다음, 트립신으로 분해한 산성 분획을 1시간 동안 37℃에서 50 mM NaBH4로 인큐베이션한 후 10% 포름산(FA)으로 켄칭하였다. 그런 다음, NaBH4로 처리한 샘플을 대상으로 RP LC/MS 분석을 수행하였다. 결과는, 이 변형(+176 Da)이 NaBH4에 의해 환원(+ 178 Da)될 수 있음을 보여주었는데, 이는 쉬프 염기(Schiff base) 구조가 변형에 존재함을 시사한다(도 3a 내지 3b).
mAb 샘플을 24시간 동안 37℃에서 100 mM 글루쿠론산으로 인큐베이션함으로써 강제 글루쿠로닐화(forced glucuronylation)를 수행하였다. 후속하는 트립신 분해 및 펩티드 맵핑 분석은, 강제 변형된 샘플에서 훨씬 더 많이 존재하는 것으로 나타나는 일련의 글루쿠로닐화된 펩티드가, 미처리 샘플에서 발견된 것과 동일한 정확한 질량, MS2 단편화 패턴, 및 보유 시간을 나타냈음을 보여주었다(도 4a 내지 도 4e, 도 5a 내지 도 5d, 도 6a 내지 도 6d, 및 도 7a 내지 도 7d).

Claims (24)

  1. 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화를 식별하기 위한 방법으로서,
    단백질 약물 생성물을 탈당질화하는 단계;
    탈당질화된 단백질 약물 생성물을 처리하여, 비공유 상호 작용을 통해 함께 결합된 2개의 동일한 Fc/2 단편을 포함하는 1개의 Fc* 단편, 및 1개의 Fab2 단편을 포함하는 1개의 Fab2 단편을 생성하는 단계;
    이온 교환 크로마토그래피를 사용해 Fc* 및 Fab2 복합체를 Fc* 및 Fab2의 산성 분획들로 분리하는 단계;
    산성 분획을 건조시키고 변성시키는 단계;
    산성 분획을 알킬화하는 단계;
    트립신으로 산성 분획을 분해하여 샘플을 형성하는 단계;
    NAbH4로 샘플을 인큐베이션하여 환원된 샘플을 형성하는 단계; 및
    환원된 샘플을 대상으로 역상 액체 크로마토그래피/질량 분광 분석을 수행하여 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화를 식별하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 환원된 샘플과 환원되지 않은 샘플 간의 질량 분광 분석을 비교하여 환원된 샘플과 환원되지 않은 샘플 간의 질량 차이를 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 약물 생성물은 단클론 항체를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Fc* 및 Fab는2 단편은 화농 연쇄구균(Streptocoocus pyogenes)에서 유래된 IdeS의 재조합적으로 변형된 형태를 사용해 형성되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 강양이온 교환 크로마토그래피(strong cation exchange chromatography)인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 분획은 요오드아세트아미드로 알킬화되는, 방법.
  7. 치료 단백질을 포함하는 단백질 약물 생성물로서, 치료 단백질의 아미노산의 10% 미만이 글루쿠로닐화된 것인, 단백질 약물 생성물.
  8. 제7항에 있어서, 치료 단백질의 아미노산의 5% 미만이 글루쿠로닐화된 것인, 단백질 약물 생성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 아미노산은 리신 아미노산인, 단백질 약물 생성물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질은 항체 또는 융합 단백질인, 단백질 약물 생성물.
  11. 제10항에 있어서, 항체는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 단백질 약물 생성물.
  12. 치료 단백질을 포함하는 단백질 약물 생성물로서, 치료 단백질의 리신 아미노산의 3% 미만이 글루쿠로닐화된 것인, 단백질 약물 생성물.
  13. 단백질 약물 생성물의 순도를 증가시키기 위한 방법으로서,
    단백질 약물 생성물을 분석하여 단백질 약물 생성물의 하나 이상의 아미노산의 일차 아민 상에서 글루쿠로닐화를 식별하는 단계; 및
    단백질 약물 생성물로부터 글루쿠로닐화된 단백질을 제거하여 정제된 단백질 약물 생성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 글루쿠로닐화된 단백질은 고성능 액체 크로마토그래피 기술에 의해 제거되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 크로마토그래피 기술은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 크로마토그래피 기술은 질량 분광 분석법과 결합되는, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산은 리신 아미노산인, 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질은 항체 또는 융합 단백질인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항체는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  20. 번역 후 변형된 단백질 약물 생성물을 식별하기 위한 방법으로서,
    글루쿠로닐화용 포유류 세포 배양물로부터 수득된 단백질 약물을 분석하는 단계를 포함하되, 단백질 약물 생성물의 글루쿠로닐화가 존재한다는 것은 단백질 약물 생성물이 번역 후 변형을 포함한다는 것을 나타내는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 포유류 세포 배양물은 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) 세포를 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 글루쿠로닐화는 단백질 약물 생성물의 리신 아미노산 상에 존재하는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 약물 생성물은 항체 또는 융합 단백질인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 항체는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
JP7301054B2 (ja) 2018-01-31 2023-06-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化
IL303510A (en) * 2020-12-11 2023-08-01 Genentech Inc Methods for determining the relative distribution of glucuronidation, iduronidation, and galacturonidation of polypeptides
IL309833A (en) * 2021-07-13 2024-02-01 Regeneron Pharma Characterization of proteins using anion exchange chromatography mass spectrometry (AEX-MS)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102308216B (zh) 2009-02-09 2014-07-09 罗切格利卡特公司 免疫球蛋白糖基化模式分析
AU2010305150A1 (en) 2009-10-09 2012-04-05 Symphogen A/S Multiplex quantitation of individual recombinant proteins in a mixture by signature peptides and mass spectrometry
KR101902225B1 (ko) 2011-07-08 2018-09-28 이엠디 밀리포어 코포레이션 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터
CN104704499B (zh) 2012-06-21 2018-12-11 菲利普莫里斯生产公司 与基于网络的生物标记签名相关的系统和方法
RU2016107435A (ru) 2013-09-13 2017-10-18 Дженентек, Инк. Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты
EP3400248A4 (en) * 2016-01-10 2019-09-04 Sorrento Therapeutics, Inc. IMPROVED SAFETY FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH GLYCOSYLATED CHIMERIC ANTIBODY AGAINST EGFR
JP7301054B2 (ja) 2018-01-31 2023-06-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化

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